JPH0348766A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、免疫学的測定法に関する。より詳細には、臨
床検査等の分野で使用され、生体成分などの微量成分を
測定する免疫学的測定法に関する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉免疫学
的測定法は、抗原抗体反応の特異性を利用して、生体成
分（例えば、抗原、抗体、ハブテン、ホルモン等）、薬
剤等の微量成分を測定する方法であり、信頼性及び測定
精度が高いうえ、種々の抗原に対する抗体が容易に取得
し得ること等から、微量生体成分等の測定（定量）法と
して広く用いられている。このような免疫学的測定法と
しては、使用される標識物質の差異により、放射免疫測
定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、螢光
免疫測定法（ＦＩＡ法）等が知られている。

免疫学測定法には、その測定様式の相違により、抗原抗
体反応物と非反応物との分離操作（いわゆるＢ／Ｆ分離
）を必要とする方法と、Ｂ／Ｆ分離を必要としない方法
がある。Ｂ／Ｆ分離を必要としない方法は測定操作が簡
便ではあるが、検体中の測定対象物質が極微量の場合に
は測定精度が劣り、適切な方法とはいえない。かかる問
題から、Ｂ／Ｆ分離を行う方法が汎用されるが、この方
法の一種として、抗原又は抗体を固定化した固相を用い
てＢ／Ｆ分離を行う固相法が知られている。

固相法は、抗原抗体反応を固相上で行い、標識物質を含
む抗原抗体反応物を固相上に結合させる方法、抗原抗体
反応を液相で行い、標識物質を含む抗原抗体反応物を生
成させ、次いで該反応生成物を固相上に結合させる方法
等により行われる。標識物質を含む抗原抗体反応物は固
相上に固定化されているので、反応終了後、担体を水洗
する方法、遠心分離法等により、容易にＢ／Ｆ分離を行
うことができ、操作が簡便であると共に測定精度の向上
が図れる。

しかし、免疫学的測定法においては、抗原抗体反応が緩
慢に進行するため、長時間の反応時間（通常、数時間〜
１日程度）を要するという問題があり、特に不均一反応
である固相法の場合にはこの傾向は著しい。従来、かか
る問題を解消するため、標識化抗体等の反応試薬を高濃
度で使用し、抗原抗体反応速度を高める方法が用いられ
ているが、標識化抗体等の反応試薬を高濃度で使用する
と、固相上への非特異的結合が生じ、ブランクの測定値
の上昇、いわゆるバックグランドの上昇が認められ、そ
の結果、Ｓ／Ｎ比が低くなり、測定感度が低下するとい
う問題がある。

本発明は上記の従来技術の欠点を解決するために創案さ
れたもので、本発明者らが種々の検討を重ねた結果、二
種類の固相を組み合わせることにより、反応時間を短縮
し得ると共にバックグランドが低下し、測定感度を向上
させ得ることを見出して完成した。すなわち、本発明の
目的は測定精度及び感度に優れると共に迅速ｎ１定を可
能にする免疫学的測定法を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 上記の課題を解決すべくなされた本発明の免疫学的測定
法は、二種類の固相を用いた免疫学的測定法で、第一の
固相は溶解可能な材料からなり、少なくとも、 ■標識物質を含む抗原抗体反応物（以下、標識化抗原抗
体反応物という）が固定化された第一の固相を調製する
工程、 ■上記■で得られた第一の固相を溶解する工程、■上記
■で得られた溶解物中の標識化抗原抗体反応物を第二の
同相に固定化する工程、及び■上記■の工程により、第
二の固相に固定化された標識化抗原抗体反応物の標識活
性を測定する工程、 を含むことを特徴とするものである。

上記構成からなる本発明の免疫学的測定法には、例えば
、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法等
の種々の測定法が包含される。また、上記各測定法にお
いて、測定様式として、例えば、競合法、サンドイツチ
法、固定化第二抗体を用いる方法などの様々な方法が知
られているが、これらのいずれの方法も包含される。こ
れらの免疫学的測定法及びその実施方法については、石
川ら編「酵素免疫７ＩＪｊ定法Ｊ　　（１９７８年医学
書院刊行）、入江編「ラジオイムノアッセイＪ　　（１
９７４年講詳社刊行）等に詳細に記載されている。

本発明は前記■〜■の工程を少なくとも包含する免疫学
的測定法であり、その方法を以下に詳述する。

本発明の第一の工程は、標識化抗原抗体反応物が固定化
された第一の固相を調製するものである。

ここで使用される第一の固相は、温度変化、ｐＨ変化等
の雰囲気変化又は酵素、キレート剤等の試薬の作用によ
り、溶解（ゾル状態を含む）可能な材料からなり、例え
ば、温度変化により溶解可能な材料としては、例えば、
アガロース、ゼラチン、ポリアクリルアミド等が挙げら
れ、ｐＨ変化により溶解可能な材料としては、例えば、
ヒドロキシアパタイト等が挙げられ、酵素の作用により
溶解可能な材料としては、例えば、デキストラン、キト
サン、キチン等が挙げられ、キレート剤の作用により溶
解可能な材料としては、例えば、アルギン酸カルシウム
等が挙げられる。これらの材料は置換基を有していても
まく、置換基としては、例えば、アミノ基、カルボキシ
基、チオール基、スルホ基等が挙げられ、これらの置換
基の導入は慣用の方法にて行うことができる。

かかる材料からなる第一の固相の形状は特に限定されな
いが、操作性の点から粒状とするのが好ましく、また溶
解性の点から微粒子状とするのが好まＥ７い。

、」二記第−の固相上には、検体中の測定対象物質（例
えば、抗原、抗体、ハブテン、薬剤等）と抗原抗体反応
可能な物質（以下、免疫反応性物質という）が固定化さ
れている。すなわち、検体中の測定対象物質が抗原、ハ
プテン、薬剤等の場合にはその抗体が、また測定対象物
質が抗体の場合にはその抗原が固定化される。第一の固
相上への免疫反応性物質の固定化は、従来から慣用の方
法で行うことができ、物理化学的結合法（例えば、吸ｎ
法１．イオン結合法等）、化学結合法等が挙げられる。

物理化学的方法による固定化は、０．０１〜ＩＭ程度の
適当な緩衝液に免疫反応性物質を溶解し、ここに第一の
固相を、室温又は冷却下、１〜１０時間程度浸漬し、次
いで水又は緩衝液で洗浄することにより行われる。

一方、化学結合法としては、結合剤を用いる方法、反応
性官能基を有する固相を用いる方法等が挙げられる。結
合剤を用いる方法における結合剤としでは、例えば、グ
ルグルアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンジア
ルデヒド等のジアルデヒド類；ヘキサメチレンジイソシ
アネート等のジイソシアネート類；Ｎ、Ｎ−−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、Ｎ、Ｎ−−ｍ−フェニレンジマレ
イミド等のシマレイミド類、Ｎ、Ｎ′−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド類な
どが挙げられる。これらの結合剤を用いることにより、
免疫反応性物質と第一の固相上の官能基とを反応させて
結合させることができる。また、反応性官能基を有する
固相を用いる方法で使用される反応性官能基を有する固
相としては、例えば、ブロムシアン活性化アガロース等
のブロムシアン活性化多糖類、ジアルデヒド化アガロー
ス等のジアルデヒド化多糖類などが例示される。これら
の化学結合法の反応は慣用の方法にて行うことができ、
例えば、千畑編「固定化酵素Ｊ　　（１９７５年講談社
刊行）等に記載されている。

免疫反応性物質が固定化された第一の固相は、標識化抗
体等の反応試薬の非特異的結合を防止するため、ブロッ
キング剤（例えば、脱脂粉乳、牛血清アルブミン、ゼラ
チン及びその加水分解物、カゼイン及びその加水分解物
、デキストラン、ポリエチレングリコール等）で処理し
てもよいが、本発明においては、かかるブロッキング剤
処理をしなくとも、非特異的結合に起因するＳ／Ｎ比の
低下を防止できるという特長を有する。

本発明の第一工程は、標識化抗原抗体反応物が固定化さ
れた第一の固相を調製することにより行われる。この工
程は、免疫学的方法の種類により種々の方法にて行うこ
とができる。例えば、免疫学的測定法がサンドイツチ法
の場合、測定対象物質を含む検体と、該測定対象物質に
対応する免疫反応性物質を固定化した第一の固相とを混
合し、第一の固相上に免疫反応性物質を介して測定対象
物質を結合させ、次いで、標識物質（例えば、酵素、放
射性物質、螢光物質、発光物質、発色物質等）が結合し
た免疫反応性物質を加え、第一の固相上の測定対象物質
をサンドイッチ状に挾むことにより、第一の固相上に標
識化抗原抗体反応物を固定化し、必要に応じて洗浄する
ことにより行われる。

また、免疫学的測定法が競合法による固相化第二抗体法
の場合には、ｎ１定対象物質に対応する免疫反応性物質
に対して、検体中の測定対象物質と標識化測定対象物質
とを競合反応させ、次いで、上記免疫反応性物質に対す
る抗体（第二抗体）が固定化された第一の固相を加え、
標識化測定対象物質を含む抗原抗体反応物を第一の固相
上に固定化し、必要に応じて洗浄することにより行われ
る。

かくして標識化抗原抗体反応物が固定化された第一の固
相は、次いで、第一の固相を溶解する工程に付される（
第二工程）。この工程は、第一の固相を形成する材料に
応じて、適宜の方法が用いられ、例えば、第一の固相が
、アガロース、ゼラチン、ポリアクリルアミド等の場合
には、膨潤状態又は適当な溶媒中で加熱することにより
ゲル状態からゾル状態へ変化させて溶解することができ
、ヒドロキシアパタイトの場合には、適当な溶媒中でｐ
Ｈ調整剤（例えば３、塩酸、クエン酸、リンゴ酸等の酸
類）を用いてｐＨを低下させることく例えば、ｐＨ６〜
８をｐＨ３程度にする）により溶解することができ、デ
キストラン、キトサン及びキチンの場合には、適当な溶
媒中でそれぞれを基質とする酵素、すなわちデキストラ
ナーゼ、キトサナーゼ及びキチナーゼを作用させること
により溶解でき、アルギン酸カルシウムの場合には、適
当な溶媒中でＥＤＴＡ等のキレート剤を作用させること
により溶解することができる。

この第二工程により第一の固相は溶解され、標識化抗原
抗体反応物を含有する溶液が得られる。

この溶液に第二の固相を加え、第二の固相上に標識化抗
原抗体反応物を固定化する（第三工程）。

ここで使用される第二の固相の材料は特に限定されず、
従来から免疫学的測定法の固相として使用されているも
のが使用でき、例えば、アガロース、セルロース、デキ
ストラン等の多糖類、ポリスチレン、ナイロン、エチレ
ン−無水マレイン酸共重合体、ポリヒドロキシエチルメ
タアクリレート等のプラスチック類、ガラス等が例示さ
れる。

また、第二の固相の形状も特に限定されず、例えば、ビ
ーズ状、プレート状、チューブ状等の適宜な形状とする
ことができる。

第二の固相上に標識化抗原抗体反応物を固定化する方法
としては、例えば、第二の固相上に、該抗原抗体反応物
を構成する成分のいずれかと結合し得る抗体を固定化し
ておき、該抗体を介して第二の固相上に固定化する方法
等、種々の方法が採用できる。より好ましくは、結合性
を有する物質の対（以下、結合性物質対という）の−万
物質を第一の固相上に固定化されるいずれかの成分（例
えば、第一の固相上に固定化されている免疫反応性物質
若しくは第二抗体、標識化された免疫反応性物質又は標
識化された測定対象物質）に結合させ、また結合性物質
対の他方の物質を第二の固相に固定化し、該結合性物質
対を介して第二の固相上に標識化抗原抗体反応物を固定
化する方法が用いられる。かかる結合性物質対の例とし
ては、例えば、アビジン（又はストレプトアビジン）−
ビオチン（又はデスチオビオチン）対、コンカナバリン
Ａ−糖類対、抗原−抗体対等が挙げられる。

より詳細には、例えば、第一の固相上の免疫反応性物質
に導入されている物質がビオチンの場合には、第二の固
相上には対応する結合性物質であるアビジン又はストレ
プトアビジンが固定化される。

同様に、第一の固相上の免疫反応性物質に導入されてい
る物質が、例えば、コンカナバリンＡ、、ＦＩＴＣ（フ
ルオレセイン　イソチオシアネート）又はＤＮＰ　（２
，４−ジニトロフェノール）の場合には、第二の固相上
にはそれぞれ対応する結合性物質である糖類、抗ＦＩＴ
Ｃ抗体又は抗ＤＮＰ抗体が固定化される。

結合性物質対の一方の物質を第一の固相上の免疫反応性
物質又は第二抗体に結合させる方法としては、該物質を
予め導入した免疫反応性物質又は第二抗体を第一の固相
に固定化する方法、第一の固相に固定化された免疫反応
性物質又は第二抗体に該物質を導入する方法等により行
うことができる。免疫反応性物質又は第二抗体への該物
質の導入及び第一の固相に固定化された免疫反応性物質
又は第二抗体への該物質の導入は、いずれも前記の結合
剤を用いる化学結合法で行うことができる。

また、結合性物質対の一方の物質を、標識化された免疫
反応性物質又は標識化された測定対象物質に結合させる
方法としては、前記の結合剤を用いる化学結合法で行う
ことができる。

第二の同相に、結合性物質対の他方の物質を固定化する
する方法としては、前記の物理化学的方法又は化学結合
法を用いることができる。また、かくして得られた第二
の固相は、非特異的結合を防止するため、前記のブロッ
キング剤で処理されていてもよい。

このように、第一の固相上の免疫反応性物質若しくは第
二抗体、標識化された免疫反応性物質又は標識化された
測定対象物質には結合性物質対の一方の物質が導入され
ているので、第一工程により形成された第一の固相上に
は、結合性物質の一方の物質が、直接又は間接的に結合
している標識化抗原抗体反応物が固定化される。また、
第二の固相上には結合性物質対の他方の物質が固定化さ
れているので、第二工程で溶解された第一の固相と第二
の固相を反応させると、結合性物質によって形成される
結合対を介して、標識化抗原抗体反応物を第二の固相上
に固定化することができる。

この反応は、前記第二工程により得られた標識化抗原抗
体反応物溶液と第二の固相とを、必要に応じて適当な緩
衝液を用い、室温〜冷却下で反応させることにより行わ
れ、反応終了後、必要に応じて第二の固相を洗浄し、未
反応物を除去する。かくして、標識化抗原抗体反応物は
第二の固相上に固定化される。

次いで、第二の固相上に固定化されている標識化抗原抗
体反応物の標識活性を測定する（第四工程）。標識活性
の測定は、標識物質の種類に応じて適宜の方法を用いる
ことができる。例えば、標識物質が放射性物質の場合に
はその放射能をカウントすることにより行われ、また標
識物質が酵素の場合には該酵素の基質を作用させ、常法
に従って該基質の減少量若しくは酵素反応生成物の増加
量又はそれらの変化速度を、吸光度測定等の方法で求め
ることにより行われる。かがる標識酵素と基質の組み合
わせの例としては、例えば、ペルオキシダーゼと過酸化
水素及び０−フェニレンジアミンとの組み合わせ、β−
ガラクトシダーゼと〇ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラク
トシドとの組み合わせ、アルカリホスファターゼとｐ−
二トロホスフェートとの組み合わせ等が挙げられる。標
識物質が螢光物質及び発色物質の場合には、それぞれ螢
光強度測定及び発色強度測定等により行われる。このよ
うにして求められた標識活性の測定値を常法に従って処
理することにより、検体中の測定対象物質の量を求める
ことができる。

次に、本発明の免疫学的測定法を、より詳細に説明する
。

その−例として、サンドイツチ法により、測定対象物質
としての抗原を測定（定量）する例をもって説明する。

この方法においては、結合性物質対の一方が結合してい
る抗体が固定化された第一の固相を、測定対象物質であ
る抗原を含有する検体に加え、検体中の抗原を第一の固
相上の抗体で捕捉した後、洗浄することによりＢ／Ｆ分
離を行う。次いで、得られた固相に標識化抗体を加え、
固相上に捕捉された抗原をサンドイッチ状に挟み、過剰
の標識化抗体を洗浄により除去し、Ｂ／Ｆ分離を行う。

かくして、標識化抗体を含む抗原抗体反応物は第一の固
相上に固定化される。次いで、得られた固相を、必要に
応じて適当な溶媒中に加え、第一の固相を形成する材料
に応じて適宜の方法（例えば、前記の温度変化、ｐＨ変
化、酵素やキレート剤の作用等）で第一の固相を溶解す
る。

この溶液に、結合性物質対の他方が固定化された第二の
固相を加え、結合性物質対を介して、標識化抗体を含む
抗原抗体反応物を第二の固相上に固定化し、固定化され
た標識化抗体の標識活性を測定する。一方、上記の抗原
含有検体の代りに、濃度既知の抗原標準試料を用いて、
同様な方法により標識活性を測定し、抗原濃度に対する
標識活性の検量線（標準曲線）を作成する。この検量線
と抗原含有検体の標識活性とを対比することにより、抗
原含有検体中の抗原量を定量することができる（以下、
便宜上、測定法Ｉという）。

また、他の例として、第二抗体固定化固相を用いた競合
法に基いて、抗原（測定対象物質）の測定（定量）法を
説明する。この方法においては、測定対象物質である抗
原を含有する検体と一定量の標識化抗原とを第一抗体（
測定対象物質である抗原に対する抗体）に対して競合反
応させる。次いで、結合性物質対の一方が結合している
第二抗体（第一抗体に対する抗体）が固定化された第一
の固相を加え、標識化抗原を含む抗原抗体反応物を固相
上に固定化し、水洗することにより、Ｂ／Ｆ分離を行う
。かくして、標識化抗原を含む抗原抗体反応物は第一の
固相上に固定化される。次いで、得られた固相を、必要
に応じて適当な溶媒に加え、第一の固相を形成する材料
に応じて適宜の方法（例えば、前記の温度変化、ｐＨ変
化、酵素やキレート剤の作用等）で第一の固相を溶解す
る。

この溶液に、結合性物質対の他方が固定化された第二の
固相を加え、結合性物質対を介して、標識化抗原を含む
抗原抗体反応物を第二の固相上に固定化し、固定化され
た標識化抗原の標識活性を測定する。一方、上記の抗原
含有検体の代りに、濃度既知の抗原標準試料を用いて、
同様な方法により標識活性を測定し、抗原濃度に対する
標識活性の検量線を作成する。この検量線と抗原含有検
体の標識活性とを対比することにより、抗原含有検体中
の抗原量を定量することができる（以下、便宜上、測定
法■という）。

上記の測定法Ｉ及びＨにおいて、第一の固相上に固定化
される抗体、標識化される抗体及び第二抗体は、ポリク
ローナル抗体（抗血清）及びモノクローナル抗体のいず
れであってもよく、マたそのＦ（ａｂ＝）ｚ画分も使用
することができる。

これらの抗体は従来から慣用の方法にて得ることができ
る。なお、測定対象物質がハブテン等の免疫原性のない
物質の場合には、アルブミン、グロブリン、ヘモグロビ
ン等の慣用のキャリヤーと結合させて免疫抗原を調製し
た後、常法の抗体産生法により抗体を得ることができる
。

また、標識化抗体及び標識化抗原は公知の方法にて調製
することができ、例えば、標識が酵素の場合には、前述
の結合剤を用いて酵素と抗体（又は抗原）とを反応させ
ることにより得られる。標２５ 識が放射性物質、例えば、　　　■の場合には、常法の
クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼと過酸化水素
を用いる酵素法等により、抗体（又は抗原）を標識化す
ることができる。更に、標識が螢光物質の場合には、上
記の酵素標識と同様な方法にても行うことができるが、
螢光物質をマイクロカプセル中に封入し、このマイクロ
カプセルと抗体（又は抗原）とを吸着法、化学結合法等
により結合させて標識化する方法が好ましい。

標識活性の測定は前述の方法にて行われる。

なお、上記の測定法ｌ及び■は、本発明の測定法のある
種の態様を示したものであり、これらの方法に限定され
るものではなく、測定対象物質等に応じて適宜変更する
ことができる。例えば、測定法Ｉにおいて、測定対象物
質が抗体の場合には、抗原が固定化された第一の同相及
び標識化抗原を用いればよく、また同様に、測定法■に
おいては、第一抗体の代りに抗原を用いると共に標識化
抗体を用いればよい。

次に、本発明の免疫学的測定法の一例を、第一の固相と
してアガロース、また結合性物質対としてビオチン−ア
ビジン対を用いて、サンドイツチ法を用いた酵素免疫測
定法により、測定対象物質としての抗原を測定する例に
基き、より具体的に説明する。

まず、結合性物質対の一方（例えば、ビオチン）が結合
している抗体が固定化されたアガロース固相及び結合性
物質対の他方（すなわち、アビジン）が固定化された第
二の固相を調製する。上記のアガロース固相は種々の方
法により調製することができるが、例えば、アガロース
ゲル微粒子を適当な緩衝液（例えば、０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐｕ７．０）中で膨潤・懸濁させた後、常法に準
じて過ヨウ素酸類（例えば、過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素
酸カリウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウム等）で酸化し、
ジアルデヒド化アガロースゲル微粒子を調製する。得ら
れたジアルデヒド化アガロースゲル微粒子に、測定対象
抗原に対応する抗体［又はそのＦ（ａｂ″）ｚ画分コを
水又は適当な緩衝液（例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ７，０）中で反応させ、抗体が結合したアガロース
ゲル微粒子が得られる。次いでビオチン化剤（例えば、
ビオチンスクシンイミド等）を反応させてビオチン化抗
体固定化アガロースゲル微粒子が得られる。

一方、アビジンが固定化された第二の固相も種々の方法
で調製することができるが、例えば、ブロムシアン活性
化多糖類担体を、常法に準じて、適当な緩衝液で膨潤・
懸濁させた後、アビジンを反応させることにより得られ
る。

次いで、かくして得られたアガロースゲル微粒子及び第
二の固相を用いて抗原を測定する。この測定操作として
は、まず、測定対象物質である抗原を含有する検体を、
そのまま又は水若しくは適当な緩衝液で濃度調整をした
後、上記で得られたアガロースゲル微粒子に加え、検体
中の抗原を該固相上の抗体で捕捉する。この反応は、冷
却下〜加温下、通常、室温程度で行われ、１〜１０分間
程度、通常、２〜５分間程度で終了する。次いで、該固
相を適当な緩衝液で洗浄しでＢ／Ｆ分離を行った後、適
当な濃度の酵素標識化抗体溶液を添加し、固相上に固定
化された抗原と反応させることにより、抗原を介して酵
素標識化抗体を固相上に固定化する。この反応は、冷却
下〜加温下、通常、。

室温程度で行われ、１〜１０分間程度、通常、２〜５分
間程度で終了する。かくして、酵素標識抗体を含む抗原
抗体反応物が固定化された固相は、は新液で洗浄するこ
とによりＢ／Ｆ分離を行う。

Ｂ／Ｆ分離された固相を、膨潤状態で又は必要に応じて
適当な緩衝液（例えば、０．１ＭＩＪン酸緩衝液、ｐＨ
７，０）中に分散させ、５０℃程度に加熱してアガロー
スゲルをゾル化させて溶解する。

ｉすられた溶液に、アビジンが固定化された第二の固相
を加え、ビオチン−アビジン結合対を介して１゜酵素標
識抗体を含む抗原抗体反応物を第二の固相に固定化し５
、適当な緩衝液で洗浄し、Ｂ／Ｆ分離を行う。この固定
化は冷却下〜室温程度で行われ、１〜１０分間程度、通
常、１〜３分間程度で終了する。次いで、酵素標識抗体
を含む抗原抗体反応物が固定化された第二の同相に酵素
の基質溶液を添加し、所定時間（通常、１〜１０分間程
度）反応させた後、基質の減少量、酵素反応生成物の増
加量等を吸光度測定等の方法で測定Ｉ７、担体上の標識
酵素の酵素活性を測定する。得られた測定値に基き、予
め作成した検ｆｆｉ線から、検体中の抗原量を求めるこ
とができる。なお、検量線の作成は、上記の測定方法に
おいて、検体の代りに濃度既知の抗原標準試料を用い、
同様な操作により酵素活性を求め、抗原濃度に対して酵
素活性をプロットすることにより得られる。

本発明の免疫学的測定法は種々の微量成分の測定（定量
）に用いることができ、測定対象物質としては、例えば
、α−フェトプロティン、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）　、
ガン胎児性抗原、ハプトグロビン、免疫グロブリン類等
の血清蛋白質、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、成長
ホルモン等のホルモン、ステロイドホルモン、ＨＢａ抗
原等のウィルス抗原、カナマイシン、テオフィリン等の
薬剤などが挙げられ、これらの物質を含む検体としては
、例えば、血清、血漿、尿、髄液、リンパ液等が挙げら
れる。

〈発明の作用・効果〉 以上のように、本発明の免疫的測定法によれば、標識化
抗原抗体反応物が固定化された第一の固相を調製した後
、第一の固相を溶解して標識化抗原抗体反応物を第二の
固相に固定化しているので、第一の固相に非特異的に結
合した標識化抗体等の反応試薬が第二の固相に非特異的
に結合する割合は大きく減少し、第二の固相には標識化
抗原抗体反応物を選択的に固定化することができる。そ
のため、抗原抗体反応の反応速度を上げるために標識化
抗体等の反応試薬の濃度を高めても、非特異的な結合に
起因するバックグランドの上昇を抑制でき、Ｓ／Ｎ比が
高まり、測定感度を上昇させることができる。

従って、本発明の免疫学的測定法によれば、短時間に測
定が終了し、測定精度及び測定感度を著しく向上させる
ことができるという効果を奏し、反応の迅速性、Ｂ／Ｆ
分離の容易性等から、自動分析化にも適した測定法であ
る。

〈実施例〉 以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

実施例 （１）アガロースゲル微粒子の調製 アガロース（シグマ社製タイプＩＸ）３ｇを精製水１０
０１１に分散させ、液温を６０℃に保ちながらゾルを調
製する。調製したゾル５１！をオリーブ油１０１！と界
面活性剤ＭＹＳ−２（日光ケミカルズ社製）Ｉｇの混合
液に加えて激しく混合し、アガロースゲル微粒子を調製
した。調製したゲル微粒子は遠心分離洗浄し、ゲル微粒
子固相として用いた。

上記（１）で調製したアガロースゲル微粒子１０ｖを０
．１ＭＩＪ：／酸緩新液（ｐＨ７，０）１０１１１：懸
濁させ、メタ過ヨウ素酸ナトリウム０．１ｇを加え、水
冷下で３００分間反応せてジアルデヒド化アガロースゲ
ル微粒子を作製した。このジアルデヒド化アガロースゲ
ル微粒子に抗ＣＲＰ抗体のＦ（ａｂ”）ｚ画分１■を加
え、室温で２時間反応させて抗体固定化アガロースゲル
微粒子を得た。

このとき未反応の抗体はゲルを、上記緩衝液で洗浄する
ことにより除去した。次いで、抗体固定化アガロースゲ
ル微粒子を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７、０）　１
０１１１に懸濁させ、ビオチンスクシンイミド１０■を
加え、室温で２時間反応させて、ビオチン化抗ＣＲＰ抗
体固定化アガロースゲル微粒子を調製した。

（３）アビジン固定化セファロース固相の調製ブロムシ
アン活性化セファロース（ファルマシア社製）３１！を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）３ｙｆに懸濁させ
た後、アビジン１０■を加え、室温で２時間反応させて
、アビジン固定化セファロース固相を調製した。

（４）　ＣＲＰの測定 ビオチン化抗ＣＲＰ抗体固定化アガロースゲル微粒子０
．１１７に、検体として各種濃度のＣＲＰ抗原水溶液（
０，３１，６３，１２５，２５０，５００ｎＥ／１１＞
５０ｕｆｌを加え３分間室温で反応させてから洗浄し、
さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体
液（ＩＵ／１ｆ）５０μｇを加えて室温で３分間反応さ
せた。次いで、これを洗浄後、固相を５０℃で加温して
融解した。

次に、融解した固相を、アビジン固定化セファロース固
相０．１１Ｚを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）０
．　１ｘｌに懸濁させた液に加え、反応させた後洗浄し
た。この洗浄したアビジン固定化セファロース固相に結
合したＰＯＤの活性を、０−フェニレンジアミン（１８
，５ｍＭ）と過酸化水素水（６ｍＭ）を含む基質液０．
１１ｆを加えて室温で３分間反応させ、更に２Ｎ−硫酸
１１！を添加し反応を停止させ、呈色液の吸光度を波長
４９２ｎｍで測定した。検体のＣＲＰ抗原濃度と吸光度
の関係を第１図に示す。第１図から明らかなように、吸
光度はＣＲＰ抗原の濃度に比例して増加［７、ＣＲ，Ｐ
抗原の濃度を定量する検量線が得られた。比較例 実施例と同様にして、ビオチン化抗ＣＲＰ抗体固定化ア
ガロースゲル微粒子と検体（ＣＲＰ抗原抗原４及Ｏ１２
５０ｇ／ｌ！水溶液）とを反応させて洗浄した後、同相
を５０℃で加温して溶解した。

次いで、アビジン固定化セファロース固相を用いないで
基質液を加える方法（直接法という）と、実施例と同様
にアビジン固定化セファロース固相に固定化した後に基
質液を加える方法（本発明法という）により吸光度を測
定した。

その結果を第１表に示す。第１表に示されるように、本
発明法であるアビジン固定化セファロース固相を用いた
方法は、直接法に比べ、感度の指標であるＳ／Ｎ比が約
２．５倍となり、測定対象物質を高感度で分析する方法
として有利であることが判った。

第　　１ 表

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の測定法によりＣＲＰを測定したとき
の検量線を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、二種類の固相を用いた免疫学的測定法で、第一の固
   相は溶解可能な材料からなり、少なくとも、 （１）標識物質を含む抗原抗体反応物が固定化された第
   一の固相を調製する工程、 （２）上記（１）で得られた第一の固相を溶解する工程
   、 （３）上記（２）で得られた溶解物中の標識物質を含む
   抗原抗体反応物を第二の固相に固定化する工程、及び （４）上記（３）の工程により、第二の固相に固定化さ
   れた標識物質を含む抗原抗体反応物の標識活性を測定す
   る工程、 を含むことを特徴とする免疫学的測定法。 ２、第一の固相上には、検体中の測定対象物質に対して
   抗原抗体反応可能な物質が固定化され、更に該物質には
   結合性を有する物質対の一方の物質が結合しており、ま
   た第二の固相上には上記結合性を有する物質対の他方の
   物質が固定化されており、 （１）上記第一の固相と測定対象物質を含む検体とを反
   応させて第一の固相上に抗原抗体反応物を結合させ、次
   いで、測定対象物質に対して抗原抗体反応可能であり且
   つ標識物質が結合した物質を反応させた後、第一の固相
   を溶解し、得られた溶液を上記第二の固相と反応させて
   、結合性を有する物質対を介して、第二の固相上に標識
   物質を含む抗原抗体反応物を固定化し、次いで、第二の
   固相上に固定化された標識物質を含む抗原抗体反応物の
   標識活性を測定するか、 又は （２）上記第一の固相に対して、測定対象物質を含む検
   体及び標識物質が結合した測定対象物質を競合反応させ
   て、第一の固相上に標識物質を含む抗原抗体反応物を結
   合させ、 次いで、第一の固相を溶解し、得られた溶液を上記第二
   の固相と反応させて、結合性を有する物質対を介して、
   第二の固相上に標識物質を含む抗原抗体反応物を固定化
   し、次いで、第二の固相上に固定化された標識物質を含
   む抗原抗体反応物の標識活性を測定する、 請求項１記載の免疫学的測定法。 ３、第一の固相が、置換基を有することのあるアガロー
   ス又はヒドロキシアパタイトからなる請求項１又は２記
   載の免疫学的測定法。 ４、結合性を有する物質対がアビジン−ビオチン対であ
   る請求項２記載の免疫学的測定法。