JP2002250727A - 生物由来微量成分の検出方法およびそのための装置 - Google Patents
生物由来微量成分の検出方法およびそのための装置Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検体中の微量成分を効率的に検出および／ま
たは定量するための方法を提供する。 【解決手段】 微量成分に抗体結合物質を結合させ、そ
れを免疫測定法により検出および／または定量する。
たは定量するための方法を提供する。 【解決手段】 微量成分に抗体結合物質を結合させ、そ
れを免疫測定法により検出および／または定量する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗原抗体反応を利用
する、生物由来の微量成分、詳細にはタンパク質、糖
質、脂質、核酸等およびそれらの複合体の中から選ばれ
る成分の検出および／または定量方法に関し、生物、医
学分野の基礎研究から食品科学、環境科学、医療などの
分野の研究開発や応用研究に有用である。
する、生物由来の微量成分、詳細にはタンパク質、糖
質、脂質、核酸等およびそれらの複合体の中から選ばれ
る成分の検出および／または定量方法に関し、生物、医
学分野の基礎研究から食品科学、環境科学、医療などの
分野の研究開発や応用研究に有用である。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質を検出、定量する方法として
は従来から、紫外部吸収測定法（"Handbook of Biochem
istry and Molecular Biology", Vol.2, Fasmann, G.D.
ed.,CRC press, Ohio (1976), p383）、ビュレット法
（Gornoll, A.G. et al., (1949): J.Biol.Chem.177,75
1）またはLowry法（Lowry, O.H. et al., (1951): J.Bi
ol.Chem.193, 265）等が知られているが、いずれの方法
も、多量の試料が必要であったり、妨害物質の存在によ
り測定不能となったりと何らかの欠点を有しており、特
に微量タンパク質を検出、定量する方法としては適して
いない。
は従来から、紫外部吸収測定法（"Handbook of Biochem
istry and Molecular Biology", Vol.2, Fasmann, G.D.
ed.,CRC press, Ohio (1976), p383）、ビュレット法
（Gornoll, A.G. et al., (1949): J.Biol.Chem.177,75
1）またはLowry法（Lowry, O.H. et al., (1951): J.Bi
ol.Chem.193, 265）等が知られているが、いずれの方法
も、多量の試料が必要であったり、妨害物質の存在によ
り測定不能となったりと何らかの欠点を有しており、特
に微量タンパク質を検出、定量する方法としては適して
いない。
【０００３】一方、ポリアクリルアミドゲル中などの微
量タンパク質を検出する方法として、クーマシー・ブリ
リアント・ブルー等の色素を用いる微量定量法が提案さ
れている（Brambhal, S. et al., (1969): Anal. Bioch
em. 31,146）。しかし、この方法では大量のタンパク質
が必要となり、タンパク質の検出限界は１００ｎｇであ
る。他に銀染色によるタンパク質の測定方法もあるがこ
れは再現性に乏しく、ｎｇレベル（正確には０．２ｎ
ｇ）のタンパク質を検出するのが限界である（Oakley,
B.r., et al., (1980): Anal. Biochem. 105, 261; Mer
ril, C.R., et al., (1981): Science 211, 1437）。
量タンパク質を検出する方法として、クーマシー・ブリ
リアント・ブルー等の色素を用いる微量定量法が提案さ
れている（Brambhal, S. et al., (1969): Anal. Bioch
em. 31,146）。しかし、この方法では大量のタンパク質
が必要となり、タンパク質の検出限界は１００ｎｇであ
る。他に銀染色によるタンパク質の測定方法もあるがこ
れは再現性に乏しく、ｎｇレベル（正確には０．２ｎ
ｇ）のタンパク質を検出するのが限界である（Oakley,
B.r., et al., (1980): Anal. Biochem. 105, 261; Mer
ril, C.R., et al., (1981): Science 211, 1437）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】細菌、カビ、ウイル
ス、原虫、アレルゲン等の空気・水環境汚染物質を検出
するには、それらが極微量でしか存在しないため少なく
とも１０ｐｇレベルでそれらを検出できる方法が求めら
れる（大谷武司ら、(1992): アレルギー41 (3) 411-41
7）。よって、これらの汚染物質は特にアレルゲンの場
合、その殆どがタンパク質で構成されるが、従来のタン
パク質検出方法ではそれらを高精度で検出および定量す
ることはできない。また、糖質、脂質、核酸等の微量検
出についても充分な低レベルでの検出手段を提供するこ
とは、生物・医学分野の基礎研究から食品科学などの分
野の応用研究に役立つ。
ス、原虫、アレルゲン等の空気・水環境汚染物質を検出
するには、それらが極微量でしか存在しないため少なく
とも１０ｐｇレベルでそれらを検出できる方法が求めら
れる（大谷武司ら、(1992): アレルギー41 (3) 411-41
7）。よって、これらの汚染物質は特にアレルゲンの場
合、その殆どがタンパク質で構成されるが、従来のタン
パク質検出方法ではそれらを高精度で検出および定量す
ることはできない。また、糖質、脂質、核酸等の微量検
出についても充分な低レベルでの検出手段を提供するこ
とは、生物・医学分野の基礎研究から食品科学などの分
野の応用研究に役立つ。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、本発明の検出および／
または定量方法を見出した。即ち、本発明は、第１の態
様として、採取した検体中の生物由来目的成分に他の成
分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生
物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体
結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを
特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出し、ま
たは検体中の該生物由来目的成分の総量を定量する方
法；特に、該抗体が結合している該結合物に該抗体に特
異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する
工程をさらに含む本発明方法；また、生物由来目的成分
がタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体
の中から選ばれる、好ましくは生物由来目的成分がタン
パク質である本発明方法；特に、検体が気体または液体
である本発明方法：
解決するため鋭意検討した結果、本発明の検出および／
または定量方法を見出した。即ち、本発明は、第１の態
様として、採取した検体中の生物由来目的成分に他の成
分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生
物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体
結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを
特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出し、ま
たは検体中の該生物由来目的成分の総量を定量する方
法；特に、該抗体が結合している該結合物に該抗体に特
異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する
工程をさらに含む本発明方法；また、生物由来目的成分
がタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体
の中から選ばれる、好ましくは生物由来目的成分がタン
パク質である本発明方法；特に、検体が気体または液体
である本発明方法：
【０００６】第２の態様として、１）抗体結合物質、
２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合さ
せるための試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗
体、および４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から
選ばれる２つまたはそれ以上を含む、検体中の生物由来
目的成分を検出し、または生物由来目的成分の総量を定
量するためのキット：
２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合さ
せるための試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗
体、および４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から
選ばれる２つまたはそれ以上を含む、検体中の生物由来
目的成分を検出し、または生物由来目的成分の総量を定
量するためのキット：
【０００７】第３の態様として、採取した検体中の生物
由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結
合物質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の
結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合
物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来
目的成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分
の総量を定量するための装置；特に、該抗体が結合して
いる該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合さ
せ、標識レベルを測定する工程がさらに存在する本発明
装置；また、生物由来目的成分がタンパク質、糖質、脂
質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる、好ま
しくは生物由来目的成分がタンパク質である本発明装
置；特に、検体が気体または液体である本発明装置、に
関する。
由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結
合物質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の
結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合
物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来
目的成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分
の総量を定量するための装置；特に、該抗体が結合して
いる該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合さ
せ、標識レベルを測定する工程がさらに存在する本発明
装置；また、生物由来目的成分がタンパク質、糖質、脂
質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる、好ま
しくは生物由来目的成分がタンパク質である本発明装
置；特に、検体が気体または液体である本発明装置、に
関する。
【０００８】好ましい態様では、本発明は、採取した検
体中の生物由来タンパク質に他の成分とは反応しない条
件下に抗体結合物質を結合させて生物由来タンパク質−
抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的
な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体
中の該生物由来タンパク質を検出し、または検体中の該
生物由来タンパク質の総量を定量する方法またはそのた
めの装置、要すれば該抗体が結合している該結合物に該
抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを
測定する工程をさらに含む本発明方法またはそのための
装置、に関する。より好ましくは、抗体結合物質が２，
４−ジニトロフェノールである方法または装置である。
体中の生物由来タンパク質に他の成分とは反応しない条
件下に抗体結合物質を結合させて生物由来タンパク質−
抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的
な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体
中の該生物由来タンパク質を検出し、または検体中の該
生物由来タンパク質の総量を定量する方法またはそのた
めの装置、要すれば該抗体が結合している該結合物に該
抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを
測定する工程をさらに含む本発明方法またはそのための
装置、に関する。より好ましくは、抗体結合物質が２，
４−ジニトロフェノールである方法または装置である。
【０００９】従来における抗原抗体反応を利用する測定
方法は、測定しようとする個々の標的物質に対して特異
的な方法であった。これに対し、本発明の方法および装
置は、標的物質が特異的な単一物質ではなく、検体に含
まれる単一の成分、例えばタンパク質などを総合的に、
即ち非特異的に検出および／または定量することを目的
とする。この従来にない目的を達成する手段として、本
発明は上記の各方法および装置を提供するものである。
方法は、測定しようとする個々の標的物質に対して特異
的な方法であった。これに対し、本発明の方法および装
置は、標的物質が特異的な単一物質ではなく、検体に含
まれる単一の成分、例えばタンパク質などを総合的に、
即ち非特異的に検出および／または定量することを目的
とする。この従来にない目的を達成する手段として、本
発明は上記の各方法および装置を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １）検体中の生物由来目的成分を検出および／または定
量する方法 本発明は第１の態様として、採取した検体中の生物由来
目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物
質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合
物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に
結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的
成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総
量を定量する方法に関する。
量する方法 本発明は第１の態様として、採取した検体中の生物由来
目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物
質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合
物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に
結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的
成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総
量を定量する方法に関する。
【００１１】本発明における「検体」には、生体由来の
細胞、組織、形質転換細胞等の抽出物、および食品、気
体や液体など、あらゆる材料が含まれる。これらの材料
は精製品であっても、材料の化学的合成品であっても、
本発明における検出および／または定量の対象とするこ
とができる。よって、検体には食品、細胞・組織から抽
出された粗抽出物、あるいは遺伝子導入された細胞から
の遺伝子導入産物を含む粗抽出物が含まれる。
細胞、組織、形質転換細胞等の抽出物、および食品、気
体や液体など、あらゆる材料が含まれる。これらの材料
は精製品であっても、材料の化学的合成品であっても、
本発明における検出および／または定量の対象とするこ
とができる。よって、検体には食品、細胞・組織から抽
出された粗抽出物、あるいは遺伝子導入された細胞から
の遺伝子導入産物を含む粗抽出物が含まれる。
【００１２】本発明における微量成分たる「生物由来目
的成分」としては、細菌、カビ、ウイルス、原虫、ダニ
あるいは哺乳動物細胞または組織を起源とするタンパク
質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体が挙げられ
る。タンパク質には単純タンパク質あるいはメチル化、
リン酸化などされた修飾タンパク質が含まれる。糖質に
は多糖類や糖鎖などが含まれ、核酸にはデオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などが含まれる。複
合体には、糖または脂質などがタンパク質に結合してい
る複合タンパク質、あるいは糖脂質などが含まれる。。
的成分」としては、細菌、カビ、ウイルス、原虫、ダニ
あるいは哺乳動物細胞または組織を起源とするタンパク
質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体が挙げられ
る。タンパク質には単純タンパク質あるいはメチル化、
リン酸化などされた修飾タンパク質が含まれる。糖質に
は多糖類や糖鎖などが含まれ、核酸にはデオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などが含まれる。複
合体には、糖または脂質などがタンパク質に結合してい
る複合タンパク質、あるいは糖脂質などが含まれる。。
【００１３】本発明における「抗体結合物質」とは抗体
結合能を有しているあらゆる物質を意味し、それ自身は
免疫原性を有していても有していなくてもよい。抗体結
合物質は典型的には、抗体との結合能を有しているが免
疫原性を有していないハプテンなどが例示される。より
具体的には、タンパク質成分を修飾する場合には、免疫
学分野で通常用いられるジニトロフェノール（ＤＮＰ、
2,4-ジニトロフェノール）、トリニトロフェノール（Ｔ
ＮＰ、2,4,6-トリニトロフェノール）、オキサゾロン
（4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-
オン）、ベンジルペニシリン（ＢＰＯ-）K等が抗体結合
物質として好適に使用される。生物由来目的成分がタン
パク質である場合、生化学分野で用いられるタンパク質
の染色剤、例えばクーマシー・ブリリアント・ブルー
（ＣＢＢ）、また絹、羊毛等の動物素材の染色剤（染料
・顔料）等も抗体結合物質として使用できる。生物由来
目的成分が糖質の場合、ジフェニールアミン−アニリ
ン、ニンヒドリンなどの生化学分野で用いられている糖
質の発色剤、および綿、麻などの多糖類繊維の染色剤が
例示される。生物由来目的成分が核酸の場合、エチジウ
ムブロマイド、サイバーゴールドなどの生化学分野で用
いられている核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の蛍光発色剤、お
よび細胞組織染色で用いられている色素類が例示され
る。
結合能を有しているあらゆる物質を意味し、それ自身は
免疫原性を有していても有していなくてもよい。抗体結
合物質は典型的には、抗体との結合能を有しているが免
疫原性を有していないハプテンなどが例示される。より
具体的には、タンパク質成分を修飾する場合には、免疫
学分野で通常用いられるジニトロフェノール（ＤＮＰ、
2,4-ジニトロフェノール）、トリニトロフェノール（Ｔ
ＮＰ、2,4,6-トリニトロフェノール）、オキサゾロン
（4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-
オン）、ベンジルペニシリン（ＢＰＯ-）K等が抗体結合
物質として好適に使用される。生物由来目的成分がタン
パク質である場合、生化学分野で用いられるタンパク質
の染色剤、例えばクーマシー・ブリリアント・ブルー
（ＣＢＢ）、また絹、羊毛等の動物素材の染色剤（染料
・顔料）等も抗体結合物質として使用できる。生物由来
目的成分が糖質の場合、ジフェニールアミン−アニリ
ン、ニンヒドリンなどの生化学分野で用いられている糖
質の発色剤、および綿、麻などの多糖類繊維の染色剤が
例示される。生物由来目的成分が核酸の場合、エチジウ
ムブロマイド、サイバーゴールドなどの生化学分野で用
いられている核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の蛍光発色剤、お
よび細胞組織染色で用いられている色素類が例示され
る。
【００１４】「生物由来目的成分に他の成分とは反応し
ない条件下に抗体結合物質を結合させる」における条件
とは、生物由来目的成分がタンパク質であり、抗体結合
物質がＤＮＰの場合を例に説明すると以下のとおりであ
る。タンパク質と抗体結合物質との反応水素イオン濃
度、反応温度、反応時間、反応気圧等の結合条件は特に
限定されないが、反応温度は大気圧下１０〜１００℃が
良いが室温〜３７℃が使用しやすい。反応時間は１０分
から２４時間が良いが１時間〜１６時間が実行しやす
い。反応水素イオン濃度（ｐＨ）はアルカリ条件下が好
ましい。ＤＮＰをタンパク質に結合させるため２，４−
ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いた場合、
反応時間は３７℃、１時間とすることができ、あるいは
２５℃にて２４時間の反応条件も使用できる。なお、単
純タンパク質は複合タンパク質や修飾タンパク質よりも
その検出感度は高い。
ない条件下に抗体結合物質を結合させる」における条件
とは、生物由来目的成分がタンパク質であり、抗体結合
物質がＤＮＰの場合を例に説明すると以下のとおりであ
る。タンパク質と抗体結合物質との反応水素イオン濃
度、反応温度、反応時間、反応気圧等の結合条件は特に
限定されないが、反応温度は大気圧下１０〜１００℃が
良いが室温〜３７℃が使用しやすい。反応時間は１０分
から２４時間が良いが１時間〜１６時間が実行しやす
い。反応水素イオン濃度（ｐＨ）はアルカリ条件下が好
ましい。ＤＮＰをタンパク質に結合させるため２，４−
ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いた場合、
反応時間は３７℃、１時間とすることができ、あるいは
２５℃にて２４時間の反応条件も使用できる。なお、単
純タンパク質は複合タンパク質や修飾タンパク質よりも
その検出感度は高い。
【００１５】上記のようにして生物由来目的成分と抗体
結合物質との結合物を調製した後、それに抗体を結合さ
せる。本発明における「抗体」としては市販品を使用す
ることができる。例えばジニトロフェノールについては
ウサギ抗−ＤＮＰ（バイオジェネシス社）、トリニトロ
フェノールについてはラット抗−ＴＮＰ（エル・エス・
エル社）がある。しかし、抗体は、例えばMakela, O. a
nd Seppala (1986) In Weir, D.M. (ed), Handbook of
Experimental Immunology, Col. 1. Blackwell Scienti
fic Publications, Oxford, 4th edition, p. 3.1.等に
記載されている方法により抗体結合物質−キャリアー複
合体を調製し、次いでそれを用いる通常の抗体作製手法
に従って、容易に作製することができる。
結合物質との結合物を調製した後、それに抗体を結合さ
せる。本発明における「抗体」としては市販品を使用す
ることができる。例えばジニトロフェノールについては
ウサギ抗−ＤＮＰ（バイオジェネシス社）、トリニトロ
フェノールについてはラット抗−ＴＮＰ（エル・エス・
エル社）がある。しかし、抗体は、例えばMakela, O. a
nd Seppala (1986) In Weir, D.M. (ed), Handbook of
Experimental Immunology, Col. 1. Blackwell Scienti
fic Publications, Oxford, 4th edition, p. 3.1.等に
記載されている方法により抗体結合物質−キャリアー複
合体を調製し、次いでそれを用いる通常の抗体作製手法
に従って、容易に作製することができる。
【００１６】上記のようにして作製された抗体が結合し
た結合物を検出および／または定量することにより、生
物由来目的成分を検出および／または定量する。かかる
結合物の検出および／または定量は、その結合物に結合
している上記抗体を検出および／または定量するための
当業者に既知の種々の方法によって行うことができる。
例えば、抗体の検出および／または定量はラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、
酵素―結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、ウェス
ターン・ブロッティング（ＷＢ）等によって行うことが
できる。好ましくは、抗体に特異的な二次抗体を用いる
方法である。このような二次抗体としては市販品を使用
することができる。通常この二次抗体は標識することに
より検出および／または定量に供する。標識物としては
ＲＩ標識、蛍光標識、酵素標識等を用いることができ
る。以下の実施例では、ＤＮＰ化タンパク質を電気泳動
後、酵素標識二次抗体によるウェスターン・ブロッティ
ングを用いて常法に従い検出方法を行っており、本方法
では全工程を６時間程度で行うことができた。
た結合物を検出および／または定量することにより、生
物由来目的成分を検出および／または定量する。かかる
結合物の検出および／または定量は、その結合物に結合
している上記抗体を検出および／または定量するための
当業者に既知の種々の方法によって行うことができる。
例えば、抗体の検出および／または定量はラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、
酵素―結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、ウェス
ターン・ブロッティング（ＷＢ）等によって行うことが
できる。好ましくは、抗体に特異的な二次抗体を用いる
方法である。このような二次抗体としては市販品を使用
することができる。通常この二次抗体は標識することに
より検出および／または定量に供する。標識物としては
ＲＩ標識、蛍光標識、酵素標識等を用いることができ
る。以下の実施例では、ＤＮＰ化タンパク質を電気泳動
後、酵素標識二次抗体によるウェスターン・ブロッティ
ングを用いて常法に従い検出方法を行っており、本方法
では全工程を６時間程度で行うことができた。
【００１７】検体が気体あるいは液体の場合、本発明方
法では、気体、液体をフィルター等で濾過した後、フィ
ルターに捕捉されている成分を検定する。例えば、空気
中の微量成分である生物由来目的成分を検定するには、
検体である空気をフィルターに通し、目的成分が捕捉さ
れたフィルターを、抗体結合物質を含む反応液に浸し、
上記所定の反応条件により抗体結合物質を目的成分に結
合させて結合物を調製する。次いで、未反応の抗体結合
物質を除去し、抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物
に結合させ、検出／定量を行う。検出／定量は上記のよ
うにＲＩＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＭＡ、ＷＢ等に
よって行うことができる。
法では、気体、液体をフィルター等で濾過した後、フィ
ルターに捕捉されている成分を検定する。例えば、空気
中の微量成分である生物由来目的成分を検定するには、
検体である空気をフィルターに通し、目的成分が捕捉さ
れたフィルターを、抗体結合物質を含む反応液に浸し、
上記所定の反応条件により抗体結合物質を目的成分に結
合させて結合物を調製する。次いで、未反応の抗体結合
物質を除去し、抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物
に結合させ、検出／定量を行う。検出／定量は上記のよ
うにＲＩＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＭＡ、ＷＢ等に
よって行うことができる。
【００１８】本発明検出方法はｐｇ（ピコグラム）の生
物由来目的成分を、殊にタンパク質を検出するのに有用
な方法であり、測定範囲として１００ｎｇから１ｐｇ、
特に１ｎｇから１０ｐｇの生物由来目的成分を検出する
のに好適である。また、本発明方法では、検体中に存在
する生物由来目的成分のすべてを捕捉することが可能で
あるので、検体中に存在する生物由来目的成分の総量を
定量するための方法として有用である。
物由来目的成分を、殊にタンパク質を検出するのに有用
な方法であり、測定範囲として１００ｎｇから１ｐｇ、
特に１ｎｇから１０ｐｇの生物由来目的成分を検出する
のに好適である。また、本発明方法では、検体中に存在
する生物由来目的成分のすべてを捕捉することが可能で
あるので、検体中に存在する生物由来目的成分の総量を
定量するための方法として有用である。
【００１９】２）検体中の生物由来の目的成分を検出お
よび／または定量するためのキット 本発明は第２の態様として、１）抗体結合物質、２）検
体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合させるた
めの試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗体、およ
び４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から選ばれる
２つまたはそれ以上を含む、検体中の生物由来目的成分
を検出し、または生物由来目的成分の総量を定量するた
めのキットに関する。好ましい組み合わせは、１）抗体
結合物質、２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物
質を結合させるための試薬、および３）その抗体結合物
質に特異的な抗体を含むキット、あるいは１）抗体結合
物質、および３）その抗体結合物質に特異的な抗体を含
むキットである。
よび／または定量するためのキット 本発明は第２の態様として、１）抗体結合物質、２）検
体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合させるた
めの試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗体、およ
び４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から選ばれる
２つまたはそれ以上を含む、検体中の生物由来目的成分
を検出し、または生物由来目的成分の総量を定量するた
めのキットに関する。好ましい組み合わせは、１）抗体
結合物質、２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物
質を結合させるための試薬、および３）その抗体結合物
質に特異的な抗体を含むキット、あるいは１）抗体結合
物質、および３）その抗体結合物質に特異的な抗体を含
むキットである。
【００２０】３）検体中の生物由来の目的成分を検出お
よび／または定量するための装置 本発明は第３の態様として、採取した検体中の生物由来
目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物
質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合
物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に
結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的
成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総
量を定量するための装置に関する。本発明装置は、本発
明検出方法に基づくものであり、それはエアコンなどの
一部材を構成し、空気中のアレルギー、喘息等の原因物
質を容易に検出できる手段を提供する。
よび／または定量するための装置 本発明は第３の態様として、採取した検体中の生物由来
目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物
質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合
物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に
結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的
成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総
量を定量するための装置に関する。本発明装置は、本発
明検出方法に基づくものであり、それはエアコンなどの
一部材を構成し、空気中のアレルギー、喘息等の原因物
質を容易に検出できる手段を提供する。
【００２１】
【実施例】実施例１ＤＮＰ化タンパク質マーカーのウェスターン・ブロッテ
ィングによる検出 タンパク質分子量スタンダード・高分子用（GIBCO BRL
Cat#1600-018）を１００ｎｇ／ｍｌから２倍希釈を５
段階行い、サンプル溶液を作製した。それぞれのサンプ
ル溶液における最終タンパク質量は１バンド当たり２５
０ｐｇ、１２５ｐｇ、６２．５ｐｇ、３１．３ｐｇおよ
び１５．７ｐｇとなる。２，４−ジニトロベンゼンスル
ホン酸ナトリウム（東京化成社製）に１Ｍ Ｎａ２ＣＯ
３を加えたアルカリ溶液を作製し、ＤＮＢＳ溶液とし
た。
ィングによる検出 タンパク質分子量スタンダード・高分子用（GIBCO BRL
Cat#1600-018）を１００ｎｇ／ｍｌから２倍希釈を５
段階行い、サンプル溶液を作製した。それぞれのサンプ
ル溶液における最終タンパク質量は１バンド当たり２５
０ｐｇ、１２５ｐｇ、６２．５ｐｇ、３１．３ｐｇおよ
び１５．７ｐｇとなる。２，４−ジニトロベンゼンスル
ホン酸ナトリウム（東京化成社製）に１Ｍ Ｎａ２ＣＯ
３を加えたアルカリ溶液を作製し、ＤＮＢＳ溶液とし
た。
【００２２】サンプル溶液１０μｌとＤＮＢＳ溶液１０
μｌをマイクロチューブに入れ、ピペットチップの中で
良く混和した。次いで３７℃で１時間静置した。ＳＤＳ
サンプル緩衝液（62.5mM トリス-HCL pH6.8、2% SDS、2
5% グリセロール、0.01% ブロムフェノールブルーおよ
び2% 2-メルカプトエタノール）２０μｌを加え、５分
間加熱変性する。それぞれのサンプルを泳動緩衝液（25
mM トリス-HCL pH8.3、192mM グリシンおよび0.1% SD
S）中、５−２０％のポリアクリルアミドグラジエント
ゲル（Bio Rad社製レディーゲル）で電気泳動した。泳
動後のゲルを、転写緩衝液（25mM トリス-HCL pH8.3、1
92mM グリシンおよび15% メタノール）で５分間洗浄し
た。洗浄後のゲルをセミドライ型転写装置でＰＶＤＦメ
ンブレン（ミリポア社製）に転写させた。転写後のメン
ブレンを、洗浄緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ：20mM トリス-HCL
pH7.6、137mM NaClおよび0.1% Tween-20）で３分間洗浄
した。メンブレンをブロッキング溶液（20mM トリス-HC
L pH7.6、137mMNaCl、0.1% Tween-20および5% スキムミ
ルク）に室温で１時間浸した。
μｌをマイクロチューブに入れ、ピペットチップの中で
良く混和した。次いで３７℃で１時間静置した。ＳＤＳ
サンプル緩衝液（62.5mM トリス-HCL pH6.8、2% SDS、2
5% グリセロール、0.01% ブロムフェノールブルーおよ
び2% 2-メルカプトエタノール）２０μｌを加え、５分
間加熱変性する。それぞれのサンプルを泳動緩衝液（25
mM トリス-HCL pH8.3、192mM グリシンおよび0.1% SD
S）中、５−２０％のポリアクリルアミドグラジエント
ゲル（Bio Rad社製レディーゲル）で電気泳動した。泳
動後のゲルを、転写緩衝液（25mM トリス-HCL pH8.3、1
92mM グリシンおよび15% メタノール）で５分間洗浄し
た。洗浄後のゲルをセミドライ型転写装置でＰＶＤＦメ
ンブレン（ミリポア社製）に転写させた。転写後のメン
ブレンを、洗浄緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ：20mM トリス-HCL
pH7.6、137mM NaClおよび0.1% Tween-20）で３分間洗浄
した。メンブレンをブロッキング溶液（20mM トリス-HC
L pH7.6、137mMNaCl、0.1% Tween-20および5% スキムミ
ルク）に室温で１時間浸した。
【００２３】１次抗体（ウサギ抗−DNP（バイオジェネ
シス社製)：ブロッキング溶液にて２０００倍希釈）を
室温１時間反応させ、洗浄緩衝液で３分間×４回洗浄し
た。次いで、２次抗体（ヤギ抗−ウサギIgG-西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＩＣＮ−カペル社製)：ブロッキン
グ溶液にて５０００倍希釈）を室温で３０分反応させ、
洗浄緩衝液で３分間×４回洗浄した。化学発光基質（Lu
mi-Light PLUS: Roche Diagnostics社製）に５分間浸
し、ＥＣＬカメラ（Amersham社製）にて、ポラロイドフ
ィルム（＃６６７）に露光時間１分間にて露光した。
シス社製)：ブロッキング溶液にて２０００倍希釈）を
室温１時間反応させ、洗浄緩衝液で３分間×４回洗浄し
た。次いで、２次抗体（ヤギ抗−ウサギIgG-西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＩＣＮ−カペル社製)：ブロッキン
グ溶液にて５０００倍希釈）を室温で３０分反応させ、
洗浄緩衝液で３分間×４回洗浄した。化学発光基質（Lu
mi-Light PLUS: Roche Diagnostics社製）に５分間浸
し、ＥＣＬカメラ（Amersham社製）にて、ポラロイドフ
ィルム（＃６６７）に露光時間１分間にて露光した。
【００２４】得られた結果を図１に示す。図１中、右か
ら順にレインボーマーカー（非ＤＮＰ化)(バイオラッド
社製）、２５０ｐｇタンパク質、１２５ｐｇタンパク
質、６２．５ｐｇタンパク質、３１．３ｐｇタンパク
質、１５．７ｐｇのバンドをそれぞれ示している。高分
子量タンパク質マーカーの分子量は大きい方から２００
ＫＤａ、９７．４ＫＤａ、６８ＫＤａ、４３ＫＤａ、２
９ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．３ＫＤａである。レ
インボーマーカーのレーンで強く光っているバンドは４
５．２Ｋｄの分子量を持つタンパク質マーカーである。
図１は、本発明方法が、タンパク質を数１０ｐｇまで検
出可能なことを示している。
ら順にレインボーマーカー（非ＤＮＰ化)(バイオラッド
社製）、２５０ｐｇタンパク質、１２５ｐｇタンパク
質、６２．５ｐｇタンパク質、３１．３ｐｇタンパク
質、１５．７ｐｇのバンドをそれぞれ示している。高分
子量タンパク質マーカーの分子量は大きい方から２００
ＫＤａ、９７．４ＫＤａ、６８ＫＤａ、４３ＫＤａ、２
９ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．３ＫＤａである。レ
インボーマーカーのレーンで強く光っているバンドは４
５．２Ｋｄの分子量を持つタンパク質マーカーである。
図１は、本発明方法が、タンパク質を数１０ｐｇまで検
出可能なことを示している。
【００２５】
【発明の効果】本発明方法は、微量成分の検出方法とし
て生物・医学分野の基礎研究から食品科学、環境科学、
医療などの分野の研究開発や応用研究において非常に有
効である。また、本発明検出方法に基づく、検体中の微
量成分、特にタンパク質を検出しまたは該タンパク質の
総量を定量するためのシステムを備えた装置を作製すれ
ば、それはエアコンなどの一部材を構成し、空気中のア
レルギー、喘息等の原因物質になる汚染原を検出するこ
とができる。
て生物・医学分野の基礎研究から食品科学、環境科学、
医療などの分野の研究開発や応用研究において非常に有
効である。また、本発明検出方法に基づく、検体中の微
量成分、特にタンパク質を検出しまたは該タンパク質の
総量を定量するためのシステムを備えた装置を作製すれ
ば、それはエアコンなどの一部材を構成し、空気中のア
レルギー、喘息等の原因物質になる汚染原を検出するこ
とができる。
【図１】 ＤＮＰ化タンパク質マーカーのウェスターン
・ブロッティングによる検出結果を示す電気泳動の図面
に代わる写真である。
・ブロッティングによる検出結果を示す電気泳動の図面
に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Claims (11)
- 【請求項１】 採取した検体中の生物由来目的成分に他
の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させ
て生物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その
抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させるこ
とを特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出
し、または検体中の該生物由来目的成分の総量を定量す
る方法。 - 【請求項２】 該抗体が結合している該結合物に該抗体
に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定
する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 生物由来目的成分がタンパク質、糖質、
脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる請求
項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 生物由来目的成分がタンパク質である請
求項１から３までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 検体が気体または液体である、請求項１
から４までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 １）抗体結合物質、２）検体中の生物由
来目的成分に抗体結合物質を結合させるための試薬、
３）その抗体結合物質に特異的な抗体、および４）該抗
体に特異的な標識二次抗体の中から選ばれる２つまたは
それ以上を含む、検体中の生物由来目的成分を検出し、
または生物由来目的成分の総量を定量するためのキッ
ト。 - 【請求項７】 採取した検体中の生物由来目的成分に他
の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させ
て生物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その
抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させるこ
とを特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出
し、または検体中の該生物由来目的成分の総量を定量す
るための装置。 - 【請求項８】 該抗体が結合している該結合物に該抗体
に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定
する工程がさらに存在する、請求項７記載の装置。 - 【請求項９】 生物由来目的成分がタンパク質、糖質、
脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる請求
項７または８記載の装置。 - 【請求項１０】 生物由来目的成分がタンパク質である
請求項７から９までのいずれかに記載の装置。 - 【請求項１１】 検体が気体または液体である、請求項
７から１０までのいずれかに記載の装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001050140A JP4581266B2 (ja) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | 生物由来微量成分の検出方法およびそのための装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001050140A JP4581266B2 (ja) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | 生物由来微量成分の検出方法およびそのための装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002250727A true JP2002250727A (ja) | 2002-09-06 |
| JP4581266B2 JP4581266B2 (ja) | 2010-11-17 |
Family
ID=18911151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001050140A Expired - Fee Related JP4581266B2 (ja) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | 生物由来微量成分の検出方法およびそのための装置 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4581266B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0348766A (ja) * | 1989-07-18 | 1991-03-01 | Internatl Reagents Corp | 免疫学的測定法 |
| JPH0889296A (ja) * | 1994-09-30 | 1996-04-09 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 核酸検出方法 |
-
2001
- 2001-02-26 JP JP2001050140A patent/JP4581266B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0348766A (ja) * | 1989-07-18 | 1991-03-01 | Internatl Reagents Corp | 免疫学的測定法 |
| JPH0889296A (ja) * | 1994-09-30 | 1996-04-09 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 核酸検出方法 |
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| JP4581266B2 (ja) | 2010-11-17 |
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