JP2006288406A - オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の方法の1実施形態では、オリゴヌクレオチドを結合させた検体、該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させた第1の粒子、オリゴヌクレオチドを結合させた第2の粒子、および第2の粒子に結合しているオリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させた検体の特異的結合補体と提供する。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションならびに検体と検体の特異的結合補体との特異的結合相互作用の結果、検出可能な変化が生じる。本発明はさらに、該方法に使用されるナノ粒子共役体、検体を検出するためのキット、ナノ粒子を含んでなるナノ材料およびナノ構造とナノ粒子を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに選択核酸を他の核酸から分離する方法を提供する。
【選択図】 なし
Description
核酸を検出し、スクリーニングする方法の開発は、遺伝的、細菌性およびウイルス性疾患の診断に重要である。非特許文献1参照。現在、特定の核酸配列の検出に使用されている方法には様々なものがある。同上。しかし、これらの方法は、複雑で、時間がかかり、かつ/または特殊化された高価な装置を必要とする。そのような装置を必要としない簡単で高速の核酸検出法が望ましいことは明らかである。
、ある所定粒子の表面に結び付けることが可能な「捕獲」鎖の数は非常に低い。
で、基板に結び付けられた結合オリゴヌクレオチドと接触させる。最後に、そのようなハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
ドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類には、核酸の配列の第2部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。最後に、基板に結び付けられた核酸を、該核酸と凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、凝集体プローブと接触させ、検出可能な変化を観察する。
リゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供する。第1種類のオリゴヌクレオチドは、該核酸の配列の第2部分に相補的な配列を有する。第2種類のオリゴヌクレオチドは、コアプローブの前記少なくとも2種類のナノ粒子の少なくとも1種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列を有する。核酸、ナノ粒子、基板およびコアプローブを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとおよび基板上のオリゴヌクレオチドと該核酸を有効にハイブリダイズさせ、かつコアプローブ上のオリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
本発明は、核酸を検出するためのキットをさらに提供する。1実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも2種類のナノ粒子を入れた少なくとも1つの容器を含む。第1種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第1部分の配列に相補的な配列を有する。第2種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第2部分の配列に相補的な配列を有する。
オチドは核酸の一部分に相補的な配列を有し、ナノ粒子に付着されないオリゴヌクレオチドの端部には蛍光分子が付いている。
部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
1または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドとを入れた容器を含む。該1または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも2つの部分を含む配列を有する。その第1部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり、そのため、容器内で結合オリゴヌクレオチドはナノ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。第2部分は、核酸の一部分の配列に相補的である。
分と第2部分を有し、両部分は核酸の配列の部分に相補的な配列を有する。サテライトプローブは、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドも含む。プローブオリゴヌクレオチドは第1部分と第2部分を有する。該第1部分は、粒子に付着したオリゴヌクレオチドの第1部分の配列に相補的な配列を有する。また、両部分は、核酸の配列の部分に相補的な配列を有する。プローブオリゴヌクレオチドはさらに、その一端にリポーター分子を有する。
本発明はさらに、ナノ粒子を付着させた基板を提供する。該ナノ粒子には、核酸の第1部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着され得る。
本発明はさらに、ナノファブリケーションの方法を提供する。方法は、選択配列を有する少なくとも1種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも2つの部分を有するステップを含む。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた1または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの配列の部分に相補的な配列を有するステップをさらに含む。連結オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、所望のナノ材料かナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。
本発明は、少なくとも2つの部分を有する選択核酸を他の核酸から分離する方法をさらに提供する。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた1または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、該1または複数のナノ粒子の各々の上のオリゴヌクレオチドは選択核酸の前記少なくとも2つの部分のうちの1つの配列に相補的な配列を有するステップを含む。選択核酸および他の核酸を、選択核酸とハイブリダイズしたナノ粒子が凝集して沈降するように、選択核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、ナノ粒子と接触させる。
酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも1部分に相補的な配列を有する。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、スペーサー部分がナノ粒子に結合可能であるように設計される。ナノ粒子に認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が結合した結果、認識部分はナノ粒子の表面から離れ、その標的とのハイブリダイズのためによりアクセス可能とある。共役体を生成するために、少なくとも認識オリゴヌクレオチドの一部がナノ粒子に結合するのに有効な条件下で、認識オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させる。本発明はさらに、この方法によって生成されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するために該共役体を使用する方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。
、検出可能な変化が、特異的結合相互作用の結果として観察され得る。
リンカーオリゴヌクレオチドの第2部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させる。その後、オリゴヌクレオチドを結び付けたある種類のナノ粒子共役体を提供する。ナノ粒子共役体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。その後、支持体に結び付けた検体を、支持体に結び付けた検体と、ナノ粒子に結び付けた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
リダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。その後、オリゴヌクレオチドを結び付けた検体を提供する。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの第2部分と相補的な配列を有する。次に、支持体に結び付けられたリンカーオリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けられたリンカーオリゴヌクレオチドの第2部分と検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させる。次に、オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類には、ハイブリダイゼーションの結果として検体の特異的結合補体が結び付けられた第2のオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドが取り付けられる。次に支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体と、凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で凝集体プローブと接触させる。この時点で検出可能な変化を観察し得る。
類のナノ粒子共役体を提供する。ナノ粒子共役体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、sbpメンバーの特異的結合補体(例えばストレプトアビジンまたはアビジン)が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。その後、支持体に結び付けられたsbpメンバーを、支持体に結び付けられたsbpメンバーとナノ粒子に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子と接触させ、検出可能な変化を観察する。
る。その後、sbpメンバーを有するオリゴヌクレオチドを、sbpメンバーを有するオリゴヌクレオチドとプローブに取り付けられた核酸との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブに結び付けられた核酸と接触させる。次に、sbpメンバーに対する特異的結合補体(例えばビオチン)を結び付けた支持体を提供する。その後、支持体を、凝集体プローブに結び付けられたsbpメンバーと支持体に結び付けられたsb補体との間に特異的結合相互作用が生じるのを許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブに結び付けられたsbpメンバーと接触させる。検出可能な出来事を観察し得る。
有する。第1のオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの少なくとも第2の部分に相補的な配列を有する。キットは、検出可能な変化を観察するための基質をさらに備えてもよい。
とりわけ問題のホルモンでは、分子量は一般に約5,000〜60,000に及ぶ。
そのような検体は、ホストからの体液等のサンプルに直接見出される分子であり得る。サンプルは、直接検査してもよいし、または検体をより容易に検出できるようにするために予め処理してもよい。更に、問題の検体は、問題の検体に相補的な特異的結合対メンバー等の、問題の検体の存在を証明する作用物質の検出により、決定することができる。作用物質の存在は、問題の検体がサンプル中に存在するときにのみ検出される。したがって、検体の存在を証明する作用物質は、アッセイで検出される検体となる。体液は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、およびその他同種のものであってよい。
1988年);Henglein,Chem.Rev.,第89巻,1861ページ(1989年);Brus,Appl.Phys.A.,第53巻,465ページ(1991年);Bahncmann,Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy(PelizettiおよびSchiavelo編、1991年),251ページ;WangおよびHerron,J.Phys.Chem.,第95巻,525ページ(1991年);Olshavskyら,J.Am.Chem.Soc.,第112巻,9438ページ(1990年);Ushidaら,J.Phys.Chem.,第95巻,5382ページ(1992年)参照。
87年)(金上のジスルフィド);AllaraおよびNuzzo,Langmuir,第1巻,45ページ(1985年)(アルミニウム上のカルボン酸);AllaraおよびTompkins,J.Colloid Interface Sci.,第49巻,410−421ページ(1974年)(銅上のカルボン酸);Iler,The
Chemistry Of Siica,第6章,(Wiley,1979年)(シリカ上のカルボン酸);Timmons and Zisman,J.Phys.Chem.,第69巻,984−990ページ(1965年)(白金上のカルボン酸);SoriagaおよびHubbard,J.Am.Chem.Soc.,第104巻,3937ページ(1982年)(白金上の芳香環化合物);Hubbard,Acc.Chem.Res.,第13巻,177ページ(1980年)(白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の官能化溶剤);Hickmanら,J.Am.Chem.Soc.,第111巻,7271ページ(1989年)(白金上のイソニトリル);MaozおよびSagiv,Langmuir,第3巻,1045ページ(1987年)(シリカ上のシラン);MaozおよびSagiv,Langmuir,第3巻,1034ページ(1987年)(シリカ上のシラン);Wassermanら,Langmuir,第5巻,1074ページ(1989年)(シリカ上のシラン);EltekovaおよびEltekov,Langmuir,第3巻,951ページ(1987年)(二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基);Lecら,J.Phys.Chem.,第92巻,2597ページ(1988年)(金属上の硬質ホスフェート)。
ステロイド残基を含むリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を使用したアッセイは、約10倍アルカンチオールまたは非環式ジスルフィドをリンカーとして使用して調製された共役体を使用したアッセイよりも10倍感度が高いと分かった。
よび解析実験において、特定病原体の存在を検出する分野において、治療薬の処方を支援するために感染症の迅速な同定を必要とする医院において、また費用のかからない最前線のスクリーニングをするために家庭や保険センターにおいて用いるのに特に適している。
Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989年)ならびにB.D.HamesおよびS.J.Higgins編,Gene Probes 1(IRL Press,New York,1995年)参照。ハイブリダイズ用プローブを用いて検出するための核酸の調製法は当該技術分野では周知である。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989年)ならびにB.D.HamesおよびS.J.Higgins編;Gene Probes 1(IRL Press,New
York,1995年)参照。
らのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989年)参照。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いるのが好ましい。
NaClに)高めることにより、増大させることも可能である。
ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とがハイブリダイズすると生じる検出可能な変化は、変色、ナノ粒子凝集体の形成、または凝集したナノ粒子の沈殿であり得る。変色は、肉眼または分光分析により観察し得る。ナノ粒子凝集体の形成は、電子顕微鏡検査または比濁分析によって観察し得る。凝集したナノ粒子の沈殿は、肉眼でも顕微鏡検査によっても観察し得る。好ましいのは、肉眼で観察し得る変化である。特に好ましいのは、肉眼で観察し得る変色である。
す。この技術は、過剰なナノ粒子プローブを使用し得るので、高い感度を提供し得る。残念ながら、ナノ粒子プローブは、試みた他の多くの固体表面(シリカスライド、逆相プレート、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースおよび他のメンブレン)には粘着するために、これらの表面は使用できない。
検出可能な変化を観察し得る任意の基板を用いてよい。適当な基板としては、透明固体表面(例えば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー類)、不透明固体表面(例えば、TLCシリカプレート、濾紙、ガラス繊維フィルター、セルロイドメンブレン、ナイロンメンブレンなどの白色固体表面)、および導電性固体表面(例えば、インジウム−スズ−オキシド(ITO))が挙げられる。基板は、任意の形状または厚さであってよいが、一般的には、平坦で薄い。好ましいのは、ガラス(例えば、ガラス製スライド)またはプラスチック(例えば、マイクロタイタープレートのウエル)などの透明な基板である。
2種類のオリゴヌクレオチドが付着している。2つの種類のナノ粒子それぞれの上に存在する第1種類のオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の一部の配列b′に対して相補的な配列bを有している。第1種類のナノ粒子上の第2種類のオリゴヌクレオチドは、2つの種類のナノ粒子が互いにハイブリダイズして凝集体プローブを形成するように第2種類のナノ粒子上の第2種類のオリゴヌクレオチドの配列a′に対して相補的な配列aを有している(図28B参照)。各種類のナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各種類のナノ粒子は、複数の他の種類のナノ粒子とハイブリダイズして、両種類の多数のナノ粒子を含む凝集体を形成するであろう。
出するため、またはその両方の目的のために、基板にアレイ状に付着させることができる。例えば、1つの基板に、各スポットが標的核酸の一部に結合するように設計された、異なる種類のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を含む幾列ものスポットを設け得る。1種以上の核酸を含有する試料を各スポットに加え、適切なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体、オリゴヌクレオチド−リポソーム共役体、凝集体プローブ、コアプローブおよび結合オリゴヌクレオチドを用いて、上述の方法の1つでアッセイの残りの部分を実施する。
1600(1600×1600dpi)を用い得る。スキャナは、基板をスキャンして得た画像をプロセスするためのソフトウエアをロードしたコンピュータにつなぐ。ソフトウエアは、容易に購入し得る、Adobe Photoshop 5.1およびCorel Photopaint 8.0などの標準ソフトウエアであってよい。グレースケール測定値計算ソフトウエアを用いることにより、アッセイ結果の定量手段が得られる。このソフトウエアで、カラースポットの色数を得ることもできるし、核酸の存在、核酸の量、またはその両方を定量するために観察することができるスキャン画像(例えば、プリントアウト)を生成することができる。また、実施例5に記載したようなアッセイを初めとするアッセイの感度は、陰性結果を表す色(実施例5では赤色)を陽性結果を表す色(実施例5では青色)から減色して改良することができる。コンピュータは、容易に購入し得
る標準パーソナルコンピュータであってよい。このように、標準ソフトウエアがロードされている標準コンピュータにつないだ標準スキャナを用いることにより、アッセイを基板上で実施する際に核酸を検出かつ定量する便利かつ容易で安価な手段が得られる。スキャン画像および計算結果は、その後の参照および使用のために結果の記録を維持するべくコンピュータに記憶させることができる。もちろん、所望の場合には、より精密な機器やソフトウエアを使用することが可能である。
ら,Nucleic Acids Research,第15巻,2911−2926ページ(1987年)(ポリマー/ラテックス)参照。特に、多様な官能基がこれらの粒子上に対して利用可能であり、そのような粒子に組み込むことができる。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などがある。金属および半導体ナノ粒子を含めたナノ粒子を用いてもよい。
のピンク/赤色を検出できる透明またはカラー(例えば、白)でなければならない。また、微孔質材料は、微孔質材料を洗浄したときに、金ナノ粒子が細孔を通過し得る程大きく、かつ微孔質材料表面上のラテックスミクロスフェアを保持するのに十分な程小さい細孔サイズをも有していなければならない。したがって、そのような微孔質材料を用いる場合、ラテックスミクロスフェアのサイズ(直径)は、金ナノ粒子のサイズ(直径)より大きくなければならない。また、微孔質材料は生物媒体に対して不活性でなければならない。多くの適当な微孔質材料は当該技術分野では公知であり、そのような材料としては、種々のフィルターや膜、例えば、改質ポリフッ化ビニリデン(ミリポア社(Millipore Corp.)から市販されているDuraporeTMメンブレンフィルターなどのPVDF)や、(ミクロン・セパレーションズ社(Micron Separations Inc.)から市販されているAcetatePlusTMメンブレンフィルターなどの)純粋酢酸セルロースが挙げられる。そのような微孔質材料は、標的核酸と2種のプローブからなる網目構造を保持し、陽性結果(標的核酸の存在)は、(金ナノ粒子の存在に帰する)赤/ピンク色と、(金ナノ粒子による蛍光の消光に帰する)蛍光の欠如によって証明される(図21参照)。陰性結果(標的核酸の不在)は、微孔質材料を洗浄したときに金ナノ粒子が微孔質材料の細孔を通過し(したがって、蛍光の消光が起こらない)、かつ白色ラテックスミクロスフェアがその上に捕捉されるために、白色および蛍光によって証明される(図21参照)。さらに、陽性結果の場合、蛍光および変色は温度の関数として観察し得る。例えば、温度を上昇させて行くと、デハイブリダイゼーション温度に達すると同時に蛍光が観察されるであろう。したがって、温度の関数として色または蛍光を見れば、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との相補性の程度についての情報を得ることができる。上述のように、この検出法は高感度を示す。長さ24塩基の3fmol(フェムトモル)の一本鎖標的核酸と、長さ24塩基の20fmolの二本鎖標的核酸という少量が、肉眼で検出された。この方法は、その使用法も極めて簡単である。蛍光は、ただUVランプで溶液または微孔質材料を照明するだけで生成させることができ、蛍光シグナルおよび比色シグナルは肉眼でモニターし得る。代わりに、より定量的な結果を得るために、蛍光光度計を前面モード(front−face mode)を用いて、短経路長で溶液の蛍光を測定してもよい。
導体ナノ粒子の消光特性のために、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの蛍光は、この網目構造の一部の間で消光される。したがって、核酸および2つのプローブを含有する溶液の蛍光をモニターして結果を検出することが可能であり、蛍光の減少または排除は陽性結果を示す。しかし、アッセイ結果は、溶液の小滴を微孔質材料上に並べて検出するのが好ましい(図22参照)。微孔質材料は、洗浄したときに、ナノ粒子がその細孔を通過し得る程大きくかつその表面上に網目構造を保持するのに十分な程小さい細孔サイズを有していなければならない(図22参照)。多くの適当な微孔質材料が当該技術分野では公知であり、そのような材料には上述のものが含まれる。そのような微孔質材料は、標的核酸と2つのプローブとからなる網目構造を保持し、陽性結果(標的核酸の存在)は、(金属または半導体ナノ粒子による蛍光の消光に起因する)蛍光の欠如によって証明される(図22参照)。陰性結果(標的核酸の不在)は、微孔質材料を洗浄したときにナノ粒子が微孔質材料の細孔を通過する(したがって、蛍光の消光が起こらない)ために、蛍光によって証明される(図22参照)。結合しなかったプローブが検出領域から洗い流されるので、バックグラウンド蛍光は低い。さらに、陽性結果の場合、蛍光の変化は温度の関数として観察され得る。例えば、温度を上昇させて行くと、デハイブリダイゼーション温度に達すると同時に蛍光が観察されるであろう。したがって、温度の関数として蛍光を見れば、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との相補性度についての情報を得ることができる。蛍光は、UVランプで溶液または微孔質材料を照明するだけで生成させることができ、蛍光シグナルは肉眼でモニターし得る。代わりに、より定量的な結果を得るために、蛍光光度計を前面モードで用いて、短経路長で溶液の蛍光を測定してもよい。
ories)(EstaporTM)を含めたいくつかの調製業者から入手可能であり、シリカコート磁性Fe3O4ナノ粒子は、十分に開発されたシリカ表面化学(Chriseyら,Nucleic Acids Research,第24巻,3031−3039ページ(1996年))を用いて改質し(Liuら,Chem.Mater.,第10巻,3936−3940ページ(1998年)、磁性プローブとしても用い得る。さらに、染料分子、4−((4−(ジメチルアミノ)フェニル)−アゾ)安息香酸(DABCYL)は、オリゴヌクレオチドに付加された多様な発蛍光団に対して有能な蛍光消光物質であることが証明されている(Tyagiら,Nature Biotech.,第16巻,49−53ページ(1998年))。市販のDABCYLスクシンイミジルエステル(分子プローブ)は、第一級アルキルアミノ基と反応すると極めて安定なアミド結合を形成する。このように、任意の磁性粒子または第一級アルキルアミノ基でポリマーコートされた磁性粒子は、両オリゴヌクレオチドに加えてこれらの消光物質分子を用いて改質し得る。あるいは、DABCYL消光物質は、アルキルアミノ改質表面の代わりに、表面結合オリゴヌクレオチドに直接付着させてもよい。プローブオリゴヌクレオチドを含むサテライトプローブを標的と接触させる。デハイブリダイゼーションおよび再ハイブリダイゼーションを起こすように温度を循環させ、それによって、プローブオリゴヌクレオチドを中心粒子から標的に移動させる。磁場を印加、粒子を溶液から除去し、標的にハイブリダイズした溶液中に残留するプローブオリゴヌクレオチドの蛍光を測定することにより検出が達成される。
せると、レドックス活性プローブオリゴヌクレオチドは、サテライトプローブから標的に移動するであろう。一旦これが起こると、磁場の印加により、標的核酸にハイブリダイズしたレドックス活性プローブオリゴヌクレオチドを残して、磁性粒子が溶液から除去されるであろう。次いで、レッドクス活性分子を調べることができるサイクリックボルタンメトリーまたは任意の電気化学的技術により標的の量を定量し得る。
チドは、核酸の第1部分の配列に対して相補的な配列を有している。第2種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第2部分の配列に対して相補的な配列を有している。容器はさらに、核酸の第3部分に対して相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドを含むこともあり、この第3部分は、第1部分と第2部分の間に配置されている。フィラーオリゴヌクレオチドは別個の容器中に入れておいてもよい。
、基板、オリゴヌクレオチドおよび/またはナノ粒子は、キット中に官能基を有さない状態で提供してもよいが、その場合、アッセイ実施前に官能化しなければならない。
含む凝集体プローブが入った第2容器を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも1種類のナノ粒子には、ナノ粒子に付着していない末端に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着している。
の第1部分と第2部分を有するであろう。連結オリゴヌクレオチドの第1、第2またはそれ以上の結合部分は、同一または異なる配列を有し得る。
リゴヌクレオチドを用いることによって増強し得る。完全二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの剛性は、完全二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタに結合して三本鎖オリゴにコネクタを形成するように相補的配列を有する1つ以上の強化オリゴヌクレオチドを用いて増強し得る。デオキシクアノシン(deoxyquanosine)またはデオキシシチジン四重鎖をベースとする四本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの使用も想定される。
ページ(1994年)参照)。
ノ粒子に対する負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力、または負に帯電したナノ粒子からの負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電斥力とを少なくとも部分的に克服するのに十分でなければならない。経時的に漸進的に塩を添加することにより静電引力および静電斥力を漸進的に減少させると、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が最も高くなることが判明した。各塩または塩の組合せに適したイオン強度は経験的に決定し得る。塩化ナトリウムの濃度は経時的に漸進的に増大させるのが好ましく、リン酸緩衝液中約0.1M〜約1.0Mの塩化ナトリウム最終濃度が良好な結果を生じることが判明した。
ド標的の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。この実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは認識部分およびスペーサー部分を含み、認識部分が核酸またはオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、該スペーサー部分がナノ粒子に結合できるように設計される。例えば、スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分が、共有結合によって結び付けられる。これらは上述したのと同じ部分および官能基である。ナノ粒子に対して認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が結合した結果、認識部分はナノ粒子の表面から遠ざかり、その標的とのハイブリダイゼーションのためによりアクセス可能となる。認識部分のナノ粒子からのよい離間性を提供するスペーサー部分の長さと配列は、経験的に決定することが可能である。少なくとも約10ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドを含むスペーサー部分が、好結果を与えることがわかった。スペーサー部分は、認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子への結合能もしくは核酸またはオリゴヌクレオチド標的への結合能に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、スペーサー部分は、認識オリゴヌクレオチドの配列や認識オリゴヌクレオチドの核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列に対し、互い相補的な配列を有するべきではない。好ましくは、スペーサー部分のヌクレオチドの塩基は、すべてアデニン、すべてのチミン、すべてシチジン、またはすべてグアニンであり、そうでなければ上述のような問題が起こる可能性がある。より好ましくは、塩基はすべてアデニンまたはすべてのチミンである。好ましくは、塩基はすべてチミンである。
タンパク質受容体及びその他の特異的結合対メンバーは、オリゴヌクレオチドにより機能化し、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子に固定化されて、DNAよりむしろタンパク質受容体が指図する分子認識特性を備える以外に、オリゴヌクレオチド修飾粒子の高度安定性を呈する新しい分類のハイブリッド粒子(ナノ粒子−受容体共役体)を生成することができる。或いは、受容体修飾オリゴヌクレオチドを備えた多重受容体結合部位を有するタンパク質を機能化し、それにより先に論じた本来のナノ材料組立スキームにおいて、タンパク質受容体複合体を無機ナノ粒子の1つの代わりに部分構造の1つとして用いることができる。検体の検出戦略におけるこれらの新規なナノ粒子−受容体共役体の使用は、ターゲットの同定及びタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングをはじめとする多数の方法で評価されてきた。
命を有し、水溶性が低いタンパク質だけでなく水溶性が高いタンパク質の使用も可能な、新規なハイブリッド粒子又はナノ粒子受容体共役体が提供される。プローブシステム(図47の代表的構造IIを参照)を用いて、表面の別個の部位に固定化したタンパク質のアレイをスクリーニングすることができる(図48)。タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び小分子(図49では、A及びBがタンパク質、ペプチド、炭水化物、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成ポリマー、合成オリゴマー、又は小分子、或いはそれらのいずれかの組み合わせ)など特異的結合対メンバーの組合わせを含む非常に様々な特異的結合反応を研究するために、プローブの構築及び適用のための同様の原理を適応することができる。基本的概念は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに「受容体ユニット」(図49ではA)を結合させることである。その後、ハイブリダイゼーションにより、そのシステムの水溶性を高め凝集に関わるコロイドを安定化させる作用があるナノ粒子マトリックス周辺のオリゴヌクレオチドのシースを含有するナノ粒子プローブが生成する。その後、プローブII’を用いて、固体表面に固定化したターゲット(B)にインターロゲートする。AのBへの結合は、固体表面に結合したナノ粒子の検出によりモニタリングする(例えば比色法、蛍光法、銀染色などによる)。このスキームは、Aをオリゴヌクレオチドに共役でき、Bを表面に固定化できるいずれの分子でも用いることができる。
の方法は、結合したアルデヒド基を有するガラススライド上にタンパク質を「プリント」して、タンパク質チップを生成することを含む。G.MacBeathら,Science,第289巻,1760−1763ページ(2000年);Nature,2000年,405巻,837ページ;及びAnal.Biochem.,第278巻,123ページは全て、引用により完全に援用されている。タンパク質上のアミノ基は、反応してタンパク質の3次構造を有意に破壊することなく共有結合を形成し、それによりタンパク質は、受容体及びその他のターゲット分子とも反応することができる。或いは、特異的ターゲット分子又は検体は、オリゴヌクレオチドに結合して、検体に結合したオリゴヌクレオチドが支持体に結合したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド−検体共役体を形成する。オリゴヌクレオチドにタンパク質及びその他の物質を共有結合させる方法は多数ある。1つの方法は、チオール修飾オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンとを結合させるためのSMPB(スルホスクシンイミジル4−[p−マレイミドフェニル]ブチレート)の使用を含む。Nucleic Acids Research,1994年,第22巻,5530ページは、引用により完全に援用されている。支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション条件下で検体に結合したオリゴヌクレオチドと接触させることにより、検体を支持体と結合させてもよい。
されて、ビオチンナノ粒子共役体を生成することができる。ストレプトアビジンの存在において、ビオチン修飾ナノ粒子は、凝集体を形成し、その凝集体は、その他の粒子から容易に分離することができる。その凝集体は、その後DNAデハイブリダイゼーションにより解離され、レポータDNAがAu粒子及びタンパク質から単離される。各タンパク質結合分子は固有のDNA配列を有しているため、タンパク質は、DNAチップの使用など確立されたDNA検出方法により同定することができる。一旦レポータDNAが単離されると、レポータDNAはPCRにより増幅され得るため、検出限界は非常に低くなり得る。
(実施例)
実施例1: オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子
A: 金ナノ粒子の調製
Frens,Nature Phys.Sci.,第241巻,20ページ(1973年)およびGrabar,Anal.Chem.,第67巻,735ページ(1995年)に記載のように、HAuCl4をクエン酸塩で還元して、金コロイド(直径13nm)を調製した。簡単に説明すると、すべてのガラス器を王水(3部のHCl、1部のHNO3)で洗浄し、NanopureH2Oでリンス、次いで使用前にオーブンで乾燥させた。HAuCl4およびクエン酸ナトリウムはオールドリッチケミカル社(Aldrich
Chemical Company)から購入した。水性HAuCl4(1mM、50
0ml)を攪拌還流させた。次いで、38.8mMのクエン酸ナトリウム(50ml)を素早く添加した。溶液の色は薄黄色から暗紅色に変わったが、還流を15分間継続した。室温に冷ました後、赤色溶液をミクロン・セパレーションズ社(Micron Separations Inc.)の1ミクロンフィルターに通して濾過した。Auコロイドを、Hewlett Packard 8452Aダイオードアレイ分光光度計を用いたUV−可視分光法および日立 8100透過型電子顕微鏡を用いた透過型電子顕微鏡検査(TEM)により特性決定した。直径13nmの金粒子は、標的および10〜35ヌクレオチド範囲のプローブオリゴヌクレオチドと共に凝集させると目に見える変色を生じる。
ホスホロアミダイト化学を用いる単カラムモードのMilligene Expedite DNA合成機を用いて1μmolスケールでオリゴヌクレオチドを合成した。Eckstein,F.(編),Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991年)。すべての溶液はミリジーン社(Milligene)(DNA合成グレード)から購入した。平均カップリング効率は98〜99.8%の範囲であり、最終ジメトキシトリチル(DMT)保護基は精製を支援するためにオリゴヌクレオチドから切断しなかった。
44901所在のグレン・リサーチ社(Glen Research,44901 Falcon Place,Sterling,Va 20166)から購入した。オリゴヌクレオチドを合成し、最終DMT保護を除去した。次いで、100μmolの5′チオール変性剤C6−ホスホロアミダイトに、1mlの無水アセトニトリルを加えた。200μlのアミダイト溶液と200μlの(合成機から出来たばかりの)アクチベーターとを混合し、まだ固相支持体上の合成オリゴヌクレオチドを含有するカラム上にシリンジで導入し、カラム中で10分間往復運動させた。次いで、支持体を無水アセトニトリルで30秒間洗浄(2×1ml)した。カラムに700μlの0.016M I2/H2O/ピリジン混合物(酸化剤溶液)を導入し、次いで、2つのシリンジを用いてカラム中で30秒間往復運動させた。次いで、支持体をCH3CN/ピリジンの1:1混合物(2×1ml)で1分間洗浄した後、無水アセトニトリル(2×1ml)で最終洗浄し、その後、カラムを窒素流で乾燥させた。精製を支援するために、トリチル保護基は除去しなかった。
ハイパーシル(hypersil)カラム(4.6×200mm、5mm粒度)を具備したDionex DX500システムで、逆相HPLCを実施した。流速は1ml/分、UV検出は260nmであった。DMT保護非修飾オリゴヌクレオチドの精製には、分取HPLC(溶離時間27分)を用いた。緩衝液を回収して蒸発させた後、80%酢酸で室温下に30分間処理してオリゴヌクレオチドからDMTを切断した。次いで、溶液を蒸発させてほぼ乾固し、水を加え、酢酸エチルを用いて切断DMTをオリゴヌクレオチド水溶液から抽出した。オリゴヌクレオチドの量は、260nmでの吸光度により定量し、最
終純度を逆相HPLC(溶離時間14.5分)で評価した。
上記パートAに記載のように調製した17nM(150μl)Auコロイドの水溶液を、パートBに記載のように調製した3.75μM(46μl)3′−チオール−TTTGCTGAと混合し、キャップをした1ml容量Eppendorfバイアル中室温下に24時間放置した。第2コロイド溶液を3.75μM(46μl)3′−チオール−TACCGTTGと反応させた。これらのオリゴヌクレオチドは非相補的であることに留意されたい。使用直前に、等量の2種のナノ粒子溶液を合わせた。オリゴヌクレオチドは非相補的であるから、反応は起こらなかった。
実施例2: ナノ粒子凝集体の形成
A.連結オリゴヌクレオチドの作製
実施例1のパートBに記載のように、2種(非チオール化)オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の配列を有していた:
3′ATATGCGCGA TCTCAGCAAA(配列番号1);および
3′GATCGCGCAT ATCAACGGTA(配列番号2)。
この実施例のパートAで作製した連結オリゴヌクレオチド(NaClで希釈後の最終濃度0.17μM)を、室温下に、実施例1のパートCで調製したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体(NaClで希釈後の最終濃度5.1nM)に加えた。次いで、溶液をNaCl水溶液で(1Mの最終濃度に)希釈し、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した条件である10mM リン酸、pH7で緩衝した。その直後に赤から紫への変色が観察され、続いて沈殿反応が生じた。図6参照。数時間の間に、溶液は透明になり、反応容器の底にピンクがかった灰色の沈殿物が沈殿した。図6参照。
して典型的な試料を調製した。次いで、格子を真空乾燥させ、画像を形成した。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを介して結合したAuコロイドのTEM画像は、集合した大きなAuコロイド網目構造を示した(図9A)。何も結合していないAuコロイドは、同等な条件下には凝集せずに、分散するか、または粒子成長反応を起こす。Hayat,Coloidal Gold:Principles,Methods,and Applications(Academic Press,San Diego,1991年
)。今日までに実施された実験ではコロイド粒子の成長の事実は全く存在しないことに留意されたい;ハイブリダイズしたコロイドは、平均直径が13nmの著しく一定したサイズを有するようである。
実施例3: オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
実施例1に記載のように金コロイド(直径13nm)を調製した。チオール−オリゴヌクレオチド[HS(CH2)6OP(O)(O−)−オリゴヌクレオチド]も実施例1に記載のように調製した。
NaCl)および10μlの1%NaN3水溶液中に入れた。溶液をピペットで数回吸い込んだり、吐出したりして溶解を支援した。得られた赤色マスター溶液は、室温下に数ヶ月間放置し、シリカ薄相クロマトグラフィー(TLC)プレート(実施例4参照)上に置き、2M NaCl、10mM MgCl2、または高濃度のサケ精子DNA含有溶液を添加しても、安定であった(すなわち、赤色を保ち、凝集しなかった)。
実施例4: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーションの促進
実施例3に記載のように、図11に示されているオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体IおよびIIを調製した。これら2種の共役体のハイブリダイゼーションは極めて緩慢であった。特に、水性0.1M NaClまたは10mM MgCl2+0.1M NaCl中で共役体IおよびII試料を混合し、混合物を室温下に1日放置しても、変色はほとんどまたは全く生じなかった。
実施例5: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図12A−Fに示されているオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体1および2は実施例3に記載のように作製し、図12Aに示されているオリゴヌクレオチド標的3は、実施例2に記載のように作製した。誤対合標的および欠失標的4、5、6および7は、イリノイ州シカゴ所在のノースウエスタン大学バイオテクノロジー施設(Northwestern University Biotechnology Facility,Chicago,IL)から購入した。これらのオリゴヌクレオチドを40nmolスケールで合成し、逆相C18カートリッジ(OPC)上で精製した。それらの純度は、イオン交換HPLCを実施して定量した。
リン酸、pH7)中で、1nmolの標的3を含有するマスター溶液を調製した。この溶液1μlは、標的オリゴヌクレオチド10pmolに相当する。マスター溶液からアリコートを取り、ハイブリダイゼーション緩衝液で所望の濃度に希釈して、連続希釈を実施した。表3は、プローブ1および2と異なる量の標的3との混合物3μlを用いて得た感度を示している。凍結−解凍条件を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、これらの溶液の3μlアリコートをC−18 TLCプレート上にスポットして、色を定量した。以下の表3において、ピンク色は陰性テストを示し、青色は陽性テストを示す。
実施例6: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図13Bに示されているように、DNA修飾ナノ粒子を修飾透明基板上に吸着させた。この方法は、DNAハイブリダイゼーション相互作用を用いて、DNA修飾ナノ粒子をガラス製基板に付着しているナノ粒子に結合させるステップから成る。
実施例7: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図15A−Gに示されている検出系は、2種のプローブ1および2が相補的標的4上に末端同士で整列するように設計した。これは、2つのプローブが標的鎖上に近接して整列している実施例5に記載の系とは異なる(図12A−F参照)。
の吸光度は極くわずかに増大したことが観察された。
1単塩基挿入標的8が完全相補性標的4から区別し得るという観察結果は、2種のプローブ配列を有する挿入鎖の完全相補性を考えれば、本当に注目すべきことである。8およびナノ粒子プローブから形成された凝集体の不安定化は、2つの短いプローブの使用と、完全相補性標的にハイブリダイズしたときにプローブの末端が出会う2つのチミジン塩基間の塩基の積み重ねの喪失とによるようである。同等条件(Tm=51℃)下に3塩基対挿入(CCC)を含む標的をプローブとハイブリダイズさせると、類似の結果が観察された。実施例5で上述した系において、塩基挿入を有する標的は、完全相補性標的から区別できなかった。したがって、この実施例に記載されている系は選択性の点で極めて好ましい。また、この系は、増幅技術を用いずにおよそ10fmolの実施例5に記載の系と同じ感度を示した。
「充填」二本鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む1式の実験を行った。図16Aに示されているナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体1および2を、図16A−Cに示されているような種々の長さの標的(24、48および72塩基長)および相補的フィラーオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。条件は、その他の点では、実施例7に記載の通りであった。また、オリゴヌクレオチドとナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は実施例7に記載のように調製した。
、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのサイズ、およびナノ粒子を標的核酸にハイブリダイズさせるときのナノ粒子の間隔は、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体が核酸標的とハイブリダイズして凝集体を形成するときに変色が観察可能であるかどうかに影響を与える。例えば、13nmの直径を有する金ナノ粒子は、長さが10〜35ヌクレオチドの標的配列とハイブリダイズするように設計されたナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドを用いて凝集させると、変色を生じるであろう。ナノ粒子を標的核酸にハイブリダイズさせたときに変色を生じさせるのに適したナノ粒子間間隔は、結果が証明しているように、凝集の度合いに応じて異なるであろう。これらの結果はさらに、固体表面が既に凝集している試料の凝集をさらに促進し、金ナノ粒子をさらに近接させることを示している。
実施例9: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
それぞれプローブ1と2(図12A)から5μlを緩衝液(10mM リン酸、pH7)と合わせて0.1M NaClの最終濃度とし、この溶液にヒト尿1μlを添加した。この溶液を凍結、解凍し、次いでC−18 TLCプレート上にスポットしたが、青色は発生しなかった。12.5μlの各プローブと、2.5μlのヒト尿を含有する類似溶液に、0.25μl(10pmol)の標的3(図12A)を加えた。溶液を凍結、解凍し、次いでC−18 TLCプレート上にスポットすると、青色スポットが得られた。
実施例10: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図13Aに示されているようにアッセイを実施した。先ず、フィッシャー・サイエンティフィック社から購入したガラス製顕微鏡スライドを先端にダイヤモンドが付いたけがきペンで約5×15mmの部片に切断した。スライドを50℃の4:1のH2SO4:H2O2溶液中に20分間浸漬して清浄した。次いで、スライドを多量の水、次いでエタノールでリンスし、乾燥窒素流下に乾燥させた。改変した文献記載手順(Chriseyら,Nucleic Acids Res.,第24巻,3031−3039ページ(1996年))を用いてチオール修飾DNAをスライド上に吸着させた。先ず、スライドを、室温下に、Nanopure水中の1mM酢酸中のトリメトキシシリルプロピルジエチルトリアミン1%溶液(DETA、ペンシルベニア州ブリストル所在のユナイテッド・ケミカル・テクノロジー社(United Chemical Technology,Bristol,PA)から購入)中に20分間浸漬した。スライドを水、次いでエタノールでリンスした。乾燥窒素流で乾燥させた後、温度制御加熱ブロックを用いて120℃で5分間焼成した。スライドを冷まし、次いで、室温下に2時間、80:20メタノール:ジメトキシスルホキシド中1mMのスクシンイミジル−4−(マレイミドフェニル)−ブチレート(SMPB、シグマ・ケミカルズ社(Sigma Chemicals)から購入)中に浸漬した。SMPB溶液から取り出して、エタノールでリンスした後、SMPB架橋剤と結合しなかったアミン部位に以下のようにキャップ形成した。先ず、スライドを、10% 1−メチルイミダゾールを含有する8:1 THF:ピリジン溶液中に5分間浸漬した。次いで、スライドを、9:1 THF:無水酢酸溶液中に5分間浸漬した。これらのキャッピング溶液は、ヴァージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ社から購入
した。スライドをTHF、次いでエタノール、最後に水でリンスした。
リン酸緩衝液pH7)溶液中に12時間浸漬した。基板を取り出し、類似緩衝液でリンスした後、基板を、基板に付着している連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていない部分と相補的なオリゴヌクレオチド(TAGGACTTACGC5′チオール[配列番号35])で修飾されている直径13nmの金ナノ粒子を含有する溶液中に浸漬した。12時間浸漬した後、基板を取り出し、ハイブリダイゼーション緩衝液でリンスした。ガラス製基板の色は透明な無色から透明なピンク色に変わっていた。図19A参照。
実施例11: プローブとしてナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたポリリボヌクレオチドアッセイ
これまでの実施例は、アッセイにおける標的としてオリゴ−デオキシリボヌクレオチドを利用した。本実施例は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体をポリリボヌクレオチドアッセイにおけるプローブとして用い得ることを証明する。ポリ(rA)(0.004260単位)の溶液1μlを、5′末端のメルカプトアルキルリンカーを介してdT20(チミジレート残基を含有する20merオリゴヌクレオチド)に結合している100μLの金ナノ粒子(粒子中〜10nM)に加えて、実験を行った。結合手順は、実施例3に記載のものであった。実施例4に記載のように、ドライアイス/イソプロピルアルコール浴
中で凍結し、室温下に解凍し、C18 TLCプレート上にスポットした後、ハイブリダイゼーションによるナノ粒子の凝集の特徴を示す青色スポットが観察された。標的の不在下に実施した対照実験では、青色スポットではなく、ピンク色のスポットを得た。
実施例12: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いた炭疽菌保護抗原セグメントのアッセイ
多くの場合、PCRによる二本鎖DNA標的の増幅にはアッセイに十分な材料を提供することが必要である。本実施例は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が、DNA鎖をその相補体の存在下にアッセイする(すなわち、二本鎖標的の熱デハイブリダイゼーション後に一本鎖に関してアッセイする)ために使用し得、かつPCR反応から得られたアンプリコンを認識して、特異的に結合し得ることを証明する。
実施例12に記載の手順は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブを付加する前にPCR溶液からPCRアンプリコンを分離するステップを含むものであった。多くの目的の
ためには、前以てポリヌクレオチド産物を単離することなく、PCR溶液中で直接アッセイを実施し得ることが望ましいであろう。そのようなアッセイ用のプロトコルが開発されており、それを以下に説明する。このプロトコルは、Amplitaq DNAポリメラーゼを含むGeneAmp PCR
Reagent Kitを用い、標準条件下に誘導されたいくつかのPCR産物を使って首尾良く実施されている。
実施例14: ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の集合体を用いた、デハイブリダイゼーションを行わない二本鎖オリゴヌクレオチドの直接認識
これ以前の実施例では、ナノ粒子に結合している一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと相互作用させる一本鎖を生成するために、二本鎖標的を加熱してデハイブリダイズさせた。本実施例は、三本鎖複合体を形成し得る場合、前以て標的をデハイブリダイズさせなくても、二本鎖オリゴヌクレオチド配列がナノ粒子によって認識され得ることを証明する。
実施例15: 蛍光検出と比色検出とを用いるアッセイ
すべてのハイブリダイゼーション実験は、0.3M NaCl、10mM リン酸、pH7.0、緩衝液中で実施した。AcetatePlusTM濾過メンブレン(0.45μm)は、マサチューセッツ州ウエストボロ所在のミクロン・セパレ−ションズ社(Micron Separations Inc.,Westboro,MA)から購入した。アルキルアミン官能化ラテックスミクロスフェア(3.1μm)は、インディアナ州フィッシャーズ所在のバングス・ラボラトリーズ社(Bangs Laboratories,Fishers,IN)から購入した。Amino−Modifier C7 CPG固相支持体(グレン・リサーチ社)およびExpedite 8909合成機上の5′
−フルオロセインホスホロアミダイト(6−FAM,グレン・リサーチ社)を使う標準ホスホロアミダイト化学(Eckstein編,Oligonucleotides and Analogues,第1版,Oxford University,New York,N.Y.,1991年)を用いて、3′末端をアルキルアミノ基で官能化した発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを合成し、逆相HPLCで精製した。これらのオリゴヌクレオチドを、Charreyreら,Langmuir,第13巻,3103−3110ページ(1997年)に記載のようにジチオ尿素結合を生成するジイソチオシアネートカップリングを用いて、アミン官能化ラテックスミクロスフェアに付着させた。簡単に説明すると、1000倍過剰の1,4−フェニレンジチオシアネートのDMF溶液を、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの水性ホウ酸緩衝液(0.1M、pH9.3)に加えた。数時間後、過剰な1,4−フェニレンジイソチオシアネートをブタノールで抽出し、水溶液を凍結乾燥した。活性化オリゴヌクレオチドをホウ酸緩衝液に再溶解させて、炭酸緩衝液(0.1M、pH9.3、1M NaCl)中でアミノ官能化ラテックスミクロスフェアと反応させた。12時間後、粒子を遠心分離し、緩衝塩類溶液(0.3M NaCl、10mM
リン酸、pH7.0)で3回洗浄した。5′−オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子を実施例3に記載のように調製した。
実施例16: 銀染色法を用いたアッセイ
溶液中の特定のDNA配列の存在を検出するためには、一般に、オリゴヌクレオチド修飾基板上のDNAハイブリダイゼーションテストが用いられる。遺伝子情報を精査するための組合せDNA配列の有望性が増してきていることは、未来の科学に対するこれらの異種配列アッセイの重要性を物語っている。ほとんどのアッセイにおいて、発蛍光団標識標的と表面結合プローブとのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡検査またはデンシトメーター検査によりモニターされている。蛍光検出は極めて感度が良いが、その使用は、実験装置費用とほとんどの慣用基板からのバックグラウンド放射とにより制限される。さらに、1単塩基誤対合を有するものに比べ完全相補性プローブに対する標識オリゴヌクレオチド標的への選択性の方が低いために、一ヌクレオチド多形を検出するための表面ハイブリダイゼーションテストが使用できない。蛍光法の簡易性、感度および選択性が改良された検出計画によって、組合せ配列の全ての可能性を具現化することができる。本発明はそのような改良型検出計画を提供する。
この実施例は、半導体ナノ粒子量子ドット(QD)上の合成一本鎖DNAの固定化を説明する。天然CdSe/ZnSコア/シェルQD(〜4nm)は有機媒質にのみ可溶であるために、アルキルチオールを末端基とする一本鎖DNAと直接反応しにくい。この問題は、先ず、QDに3−メルカプトプロピオン酸でキャップ形成することにより回避された。次いで、カルボン酸基を4−(ジメチルアミノ)ピリジンで脱保護して、粒子を水溶性とし、QDと、3′−プロピルチオールまたは5′−ヘキシルチオール修飾オリゴヌクレオチド配列とを反応し易くした。DNA修飾後、透析により、反応しなかったDNAから粒子を分離した。次いで、「リンカー」DNA鎖を表面結合配列とハイブリダイズさせて、長いナノ粒子集合体を生成した。TEM、UV/可視分光法および蛍光顕微鏡検査により特性決定したQD集合体は、溶液温度を制御することにより可逆的に集合させ得る。新規QD集合体およびQDと金ナノ粒子(〜13nm)間に形成された複合凝集体の温度依存性UV−可視スペクトルを得た。
NANOpure超純水精製系を用いて調製したナノピュア水(18.1MΩ)を一貫して用いた。Perkin Elmer LS 50B蛍光分光計を用いて蛍光スペクトル得た。Hp 9090a Peltier Temperature Controllerを具備したHP 8453ダイオードアレイ分光光度計を用いて融解分析を実施した。Eppendorf 5415遠心機またはBeckman Avanti 30遠心機を用いて遠心を行った。200kVで操作する日立 HF−2000電界放出TEMを用いてTEM画像を得た。
半導体量子ドット(QD)の合成法は最近の数年間に大きく改良されており、ある種の材料、最も注目すべきことにはCdSeに関して、今や予備決定サイズの単分散試料を比較的容易に調製し得る。Murrayら,J.Am.Chem.Soc.,第115巻,8706ページ,1993年;Hinesら,J.Phys.Chem.,第100巻,468ページ,1996年。その結果、QDを発光ダイオード(Schlampら,J.Appl.Phys.,第82巻,5837ページ,1997年;Dabbousiら,Appl.Phys.Lett.,第66巻,1316ページ、1995年)および非放射性生物学的標識(Bruchezら,Science,第281巻,2013ページ,1998年;Chanら,Science,第281巻,2016ページ,1998年)などの多様なテクノロジーに用いるための道を開く可能性があるこれらの粒子の固有の電
子特性および蛍光特性が広範囲に研究されている(Alivisatos,J.,Phys.Chem.,第100巻,13226ページ,1996年、およびその中の参考文献;Kleinら,Nature,699,1997年;Kunoら,J.Chem.Phys.,第106巻,9869ページ,1997年;Nirmalら,Nature,第383巻,802ページ,1996年参照)。しかし、多くの用途では、これらの粒子は表面上に空間的に配列されるか、または三次元物質中に組織化されることが要求されるであろう(Vossmeyerら,J.Appl.Phys.,第84巻,3664ページ,1998年)。さらに、1種以上のナノ粒子を超格子構造(Murrayら,Science,第270巻,1335ページ,1995年)中に組織化する能力があれば、新規かつ潜在的に興味深く有用な特性を有する完全に新しい種類のハイブリッド材料の構築が可能になるであろう。
ピオン酸を以下のように除去して精製した。0.50ml試料を(30,000rpmで4時間)遠心し、上清を除去した。残りの溶液を〜0.3mlのDMFで洗浄し、再遠心した。このステップをさらに2回繰り返してから、FTIRスペクトルを記録した。FTIR(ポリエチレンカード、3M社):1710cm−1(s)、1472cm−1(m)、1278cm−1(w)、1189cm−1(m)、1045cm−1(w)、993cm−1(m)、946cm−1(w)、776cm−1(m)、671cm−1(m)。TOP/TOPO安定化天然QDとは異なり、3−メルカプトプロピオン酸修飾QDは、表面結合プロピオン酸に特徴的な1710cm−1のvcoバンドを示した。
ほぼ等量のこれら2種のオリゴヌクレオチド(それぞれ、200μl、OD530=0.224および0.206)を混合し、次いで、相補的な連結24mer配列(5′−TACGAGTTGAGAATCCT−GAATGCG−3′、配列番号48)の溶液6μl(60pmol)と合わせて、室温下に20〜30分以内でQD集合体を形成した(図
26)。混合物を凍結(−78℃)し、ゆっくり室温まで温めると、連結が速く起こった。
DNA官能化QDが得られたので、多重種類のナノ粒子構築ブロックから作製したハイ
ブリッド集合体の構成が実現可能になった。これらのハイブリッド集合体を作製するために、Eppendorf遠心管中で、〜17nMの3′−ヘキシルチオールで修飾した13nmの金ナノ粒子(30μl、〜5fmol;実施例3に記載のように調製)の溶液を、5′−ヘキシルチオールを末端基とするDNA修飾QD(15μl、530nmでの光学密度は0.206)と混合した。「リンカー」DNA(5μl、50pmol)を加え、混合物を−78℃に冷却し、次いで、ゆっくり室温まで温めると、赤みを帯びた紫色の沈殿物が生成した。両種類の粒子と相補的標的の不在下には、凝集挙動は観察されなかった。遠心(3,000rpmで1分間)し、上清を除去した後、沈殿物を100μlのPBSで洗浄し、再遠心した。
この実施例に記載されている結果は、QD表面へのDNAの固定化が達成され、かつ今やこれらの粒子をハイブリダイゼーション条件下にDNAと組合せて使用し得ることを最も確実に立証している。DNA官能化QDを用いて、最初のDNA誘導QD形成および混合金/QDナノ粒子構造が実証された。半導体QDをDNAで首尾良く修飾することは、材料研究にとって重要な意味を有しており、これらの固有の構築ブロックは新規かつ機能的な多成分ナノ構造およびナノスケール材料に組み込まれるので、今や、これらのブロックの蛍光、電子、および化学特性の広範囲な研究への扉が開かれている。
実施例18: オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の合成法およびそれらの方法により生成された共役体
A. 一般法
HAuCl4・3H2Oおよびクエン酸三ナトリウムは、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のオールドリッチ・ケミカル社(Aldrich Chemical Company、Milwaukee,WI)から購入した。純度99.999%の金ワイヤ、およびチタンワイヤは、イリノイ州エバンストン所在のゴールドスミス社(Goldsmith Inc.,Evanston,IL)から購入した。厚さ1ミクロンの酸化物層を有するシリコンウェーハ(100)は、カリフォルニア州サンタクララ所在のシリコン・クエスト・インターナショナル社(Silicon Quest International,Santa Clara,CA)から購入した。5′−チオール修飾剤C6−ホスホロアミダイト試薬、3′−プロピルチオール修飾剤CPG、フルオレセインホスホロアミダイト、およびオリゴヌクレオチド合成に必要な他の試薬は、ヴァージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ社から購入した。すべてのオリゴヌクレオチドは、標準ホスホロアミダイト化学(Eckstein,F.,Oligonucleotides and Analogues;第1版;Oxford
University Press,New York,1991年)を用いるDNA自動合成機(エキスペダイト社(Expedite))を使って調製した。5′ヘキシルチオール修飾体のみを含むオリゴヌクレオチドを実施例1に記載のように調製した。5−(および6−)−カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステルは、オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス社(Molecular Probes,Eugene,OR)から購入した。NAP−5カラム(Sephadex G−25Medium、DNAグレード)は、ファルマシア・バイオテク社(Pharmacia Biotech)から購入した。すべての実験に、Barnstead NANOpure超純水系を用いて精製したナノピュアH2O(>18.0MΩ)を用いた。Auナノ粒子溶液の遠心には、Eppendorf 5415CまたはBeckman Avanti
30遠心機を用いた。高速液体クロマトグラフィーは、HPシリーズ1100HPLCを用いて実施した。
オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子溶液の電子吸収スペクトルは、Hewlett−Packard(HP)8452aダイオードアレイ分光光度計を用いて記録した。蛍光分光法は、Perkin−Elmer LS50蛍光光度計を用いて実施した。透過型電子顕微鏡検査(TEM)は、200kVで操作する日立8100透過型電子顕微鏡で実施した。ナノ粒子溶液中の金の原子濃度の定量には、誘導結合プラズマ(ICP)源を備えたAtomScan25原子分光計を用いた(金の発光は242.795nmでモニターした)。
C. 蛍光標識したアルカンチオール修飾オリゴヌクレオチドの合成および精製
5′ヘキシルチオール部分および3′フルオレセイン部分を用いて、12塩基を含むチオール修飾オリゴヌクレオチド鎖を調製した。12mer(S12F)の配列は、HS(CH2)65−CGC−ATT−CAG−GAT−3′−(CH2)6−F[配列番号50]であり、32mer(SA2012F)は同じ12mer配列とさらなる20dAスペーサー配列を5′端に有していた[配列番号51]。チオール修飾オリゴヌクレオチドは、Storhoffら,J.Am.Chem.Soc.,第120巻:1959−1964ページ(1998年)に記載のように調製した。自動合成にはアミノ修飾剤C7 CPG固相支持体を用い、5′末端は、先に記載のように、ヘキシルチオールホスホロアミダイトで手で修飾した。3′アミノ、5′トリチルで保護したチオール修飾オリゴヌクレオチドを、254nmでDNAのUVシグナルをモニターしながら、0.03M
トリエチルアンモニウムアセテート(TEAA)、pH7および1%/分勾配の95%CH3CN/5%0.03M TEAAを含むHP ODS Hypersilカラム(5mm、250×4mm)を用いて、1ml/分の流速で逆相HPLCにより精製した。5′−S−トリチル、3′アミノ修飾12塩基および32塩基オリゴヌクレオチドの保持時間はそれぞれ36分、32分であった。
NaCl/10mM NaOHを用いて、0.8ml/分の流速で、Dionex Nucleopac PA−100カラム(250×4mm)を操作した。5′−S−トリチル、3′フルオレセイン修飾12merおよび32merの保持時間はそれぞれ50分、49分であった。オリゴヌクレオチド産物を逆相HPLCで脱塩した。フルオレセイン
を末端基とするトリチルオリゴヌクレオチドのトリチル保護基の除去は、先に記載のように、(Storhoffら,J.Am.Chem.Soc.,第120巻,1959−1964(1998年))、硝酸銀およびジチオトレイトール(DTT)を用いて行った。オリゴヌクレオチドの収率および純度は、アルキルチオールオリゴヌクレオチドに関して先に記載した技術(Storhoffら,J.Am.Chem.Soc.,第120巻:1959−1964ページ(1998年))を用いて評価した。オリゴヌクレオチドは、チオール基のトリチル除去処理直後に使用した。
発蛍光団標識相補体(12′F)は、S12FおよびSA2012Fの12mer配列と相補的な12塩基3′−GCG−TAA−GTC−CTA−5′−(CH2)6−F[配列番号53]から構成した。標準法を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、5′アルキルチオール修飾に関して上述した手順に類似のシリンジベース手順を用いて、フルオレセインホスホロアミダイト(6−FAM、グレン・リサーチ社)とCPG連結オリゴヌクレオチドの5′末端とをカップリングした。上記のような逆相HPLCを用いて精製を実施した。フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの保持時間は18分であった。自動合成機用のアミノ修飾剤C7 CPG固相支持体を用いて発蛍光団標識相補体、3′12F(5′−ATC−CTG−AAT−GCG−F;[配列番号54])を調製し、次いで、上記手順を用いて、5−(6)−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを3′アミンにカップリングした。
金ナノ粒子は、実施例1に記載のように、HAuCl4をクエン酸塩で還元して調製した。得られたナノ粒子のサイズ分布の定量には、日立8100TEMを用いて実施する透過型電子顕微鏡検査(TEM)を用いた。グラフィックソフトウエア(IamgeTool)を用いてTEMネガから少なくとも250粒子を分粒した。典型的な粒子配合物の平均直径は15.7±1.2nmであった。球状ナノ粒子と密度がバルク金の密度(19.30g/cm2)と等しいと仮定して、粒子当たりの平均分子量を計算した(2.4×107g/mol)。金ナノ粒子溶液中の金原子の濃度を、ICP−AES(誘導結合プラズモン原子発光分光法)によって決定した。較正には、金原子吸着標準溶液(オールドリッチ社)を用いた。粒子溶液中の金原子濃度とTEM分析によって得た平均粒子質量とを比較して、所与の配合物中の金粒子のモル濃度、典型的には〜10nMを得た。表面プラズモン周波数(520nm)でのナノ粒子溶液のUV−可視吸光度を測定して、粒子のモル消光係数(520nmでのε)を計算すると、典型的には、直径15.7±1.2nmの粒子では4.2×108M−1cm−1であった。
シリコンウェーハを〜10mm×6mm部片に切断し、50℃下にピラニア腐蝕溶液(
4:1の濃H2SO4:30%H2O2)で30分清浄し、次いで、多量の水、次いでエタノールでリンスした。(警告:ピラニア腐蝕溶液は有機物質と激しく反応するので、取り扱いには厳重な注意が必要である。)Edwards FTM6石英結晶微量天秤を具備したEdwards Auto 306エバポレータ(3×10−7ミリバールの基準圧力)を用いて0.2nm/秒の速度で金属を蒸着させた。シリコンの酸化された側面を、5nmのTi接着層、次いで200nmの金でコートした。
新たに脱保護したオリゴヌクレオチドをナノ粒子水溶液(粒子濃度〜10nM)に3μMの最終オリゴヌクレオチド濃度まで加えて、金ナノ粒子をフルオレセイン−アルキルチオールオリゴヌクレオチドで修飾した。24時間後、溶液をpH7(0.01M リン酸)で緩衝し、NaCl溶液を(0.1Mの最終濃度まで)加えた。これらの条件下にさらに40時間、溶液を「熟成」させた。次いで、14,000rpmで30分間遠心して、過剰な試薬を除去した。上清を除去した後、赤色の油性沈殿物を、0.3M NaCl、10mMリン酸緩衝液、pH7(PBS)で2回洗浄し、連続遠心して、再分散させ、最後に新鮮な緩衝液中に再分散させた。洗浄手順中、常に、少量(UV−可視分光法により測定して〜10%)のナノ粒子が上清と共に廃棄される。したがって、最終ナノ粒子濃度を、TEM、ICP−AES、およびUV−可視分光法(上記参照)で測定した。消光係数および粒度分布は、オリゴヌクレオチド修飾の結果として有意には変化しなかった。
シリコン支持金薄膜を、金ナノ粒子の場合と同じ回数および同じ緩衝条件下に、脱保護したアルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドの蒸着溶液中に浸漬した。オリゴヌクレオチド蒸着の後、膜を0.3M PBSでよくリンスし、緩衝液中に保存した。不動態化されていないケイ素/酸化ケイ素面を残して、片面の金のみを蒸発させた。しかし、アルキルチオール修飾DNAは、PBSに浸漬した何も結合していない酸化ケイ素表面には有意に吸着しなかった。
オリゴヌクレオチドを置換するために、0.3M PBS中の発蛍光団標識オリゴヌクレオチドで修飾したナノ粒子または薄膜に、メルカプトエタノール(ME)を(12mMの最終濃度まで)添加した。間欠的に振とうしながら、室温下に18時間後、金ナノ粒子を遠心するか、または金薄膜を除去して、置換オリゴヌクレオチドを含有する溶液を金から分離した。0.3M PBS、pH7を添加して、上清のアリコートを2倍希釈した。試料および較正標準溶液のpHとイオン強度を、これらの条件に対するフルオレセインの光学的性質の感度によるすべての測定値に関して、同じに維持するように注意した(Zhaoら,Spectrochimica Acta,45A:1113−1116ページ(1989年))。(520nmで測定した)最大蛍光を、標準線形較正曲線からの補間によりフルオレセイン−アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドのモル濃度に変換した。標準曲線は、同一の緩衝液および塩濃度を用いて発蛍光団標識オリゴヌクレオチドの既知濃度を用いて作製した。最後に、測定したオリゴヌクレオチドのモル濃度を元の金ナノ粒子濃度で割って、粒子当たりの平均オリゴヌクレオチド数を得た。次いで、ナノ粒子溶液中の(球状粒子を想定して)予測した粒子表面積で割って、正規表面被覆面積値を計算した。真円度の仮定条件は、計算した0.93の平均真円度に基づく。真円度因数は、Baxes,Gregory,Digital Image Processing,157ページ(1994年)から引用した(4×pi×面積)(周長×2)として計算する。
付着したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション活性を測定するために、蛍光発色団で標識したオリゴヌクレオチド(表面結合オリゴヌクレオチド(12′F)に相補的
)を、ハイブリダイゼーション条件(3μM 相補的オリゴヌクレオチド、0.3M PBS、pH7、24時間)下で、オリゴヌクレオチド修飾表面(金のナノ粒子または薄膜)と反応させた。ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドは、上述したように緩衝塩溶液で2度リンスすることにより金から取り外した。その後、蛍光発色団で標識したオリゴヌクレオチドを、NaOHの添加(最終濃度〜50mM、pH11〜12、4時間)により、デハイブリダイズした。遠心によってナノ粒子溶液から12′F含有溶液を分離した後、1M HClの追加によって溶液を中和し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの濃度とそれに対応するハイブリダイズされた標的表面密度を、蛍光分光法により測定した。
クエン酸塩安定化金ナノ粒子を12merフルオレセイン修飾アルキルチオールDNA(HS−(CH2)65′−CGC−ATT−CAG−GAT−(CH2)4−F[配列番号50])で官能化した。次いで、化学吸着していないオリゴヌクレオチドを完全に洗い流した後で、発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを金表面から除去して表面被覆面積研究を実施し、(上記のような)蛍光分光法を用いてオリゴヌクレオチド濃度を定量した。
オリゴヌクレオチド修飾およびME置換手順を課した。金薄膜のオリゴヌクレオチド置換対時間曲線は、金ナノ粒子に関して測定したものと極めて類似している。これは、これらの薄膜に関して測定した典型的な表面被覆面積値が金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド被覆面積よりいくらか低かったにも拘わらず、薄膜の置換速度は類似していることを示唆している。本発明者らの技術によって測定した金薄膜上のオリゴヌクレオチド表面被覆面積(18±3pmol/cm2)が、既に報告されたオリゴヌクレオチド薄膜上の被覆面積の範囲内(電気化学または表面プラズモン共鳴分光法(SPRS)を用いて測定された金電極上の25塩基オリゴヌクレオチドに関しては10pmol/cm2(Steelら,Anal.Chem.,第70巻,4670−4677ページ(1998年))に含まれることは重要である。表面被覆面積の相違は、オリゴヌクレオチドの配列と長さの違いおよび薄膜の調整方法の違いによるものと考えられる。
S12Fオリゴヌクレオチドの適用範囲が高いことは、ナノ粒子安定化の点から有利であるが、その低いハイブリダイゼーション効率により、本願発明者らは、ハイブリダイズする配列の周囲の立体的混雑を減少させる手段を考案するように促された。アルキルチオール基と最初の12塩基認識配列との間に20dAスペーサー配列が挿入された、オリゴヌクレオチド(32mer)を合成した。このストラテジーを、以下の2つの仮定に基づき選択した。すなわち、1)ナノ粒子表面付近の塩基は、含窒素塩基と金表面間の相互作用の弱さと、鎖間の立体密集との故に、立体的に接近不能であること、および、2)直径
15.7nmの概ね球状の粒子では、概ねその表面に対して垂直な20merスペーサーユニットの端部に付着された12mer配列(Levickyら、J.Am.Chem.Soc.120:9787−9792(1998))は、表面に直接結び付けられた同じ12merから形成されたフィルムに比べてより大きな自由体積を有するフィルムにつながるだろう。
S12F配列を用いた研究において、塩熟成ステップが、安定したオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を得るのに重要であることが判明した(実施例3参照)。純水中S12Fで修飾した金ナノ粒子を不可逆的に融解し、遠心すると、黒色沈殿物が形成されたが、塩中で熟成させたものは、高イオン強度溶液中で遠心しても凝集しなかった。安定性の増大は、立体保護作用および静電保護作用をもたらす高いオリゴヌクレオチド表面被覆面積によるものと考えられる。SA2012F修飾粒子を用いて、オリゴヌクレオチド表面添加に及ぼす電解質条件の効果を調べた。図8に示すように、5′ヘキシルチオールおよび3′フルオレセイン部分を有するチオール修飾オリゴヌクレオチドを調製し、上記のように金ナノ粒子に付着させ、ナノ粒子上のこれらのオリゴヌクレオチドの表面被覆面積を上記のように定量した。結果は以下の表7に示されている。水中のオリゴヌクレオチドに48時間暴露した金ナノ粒子の最終表面被覆面積は、塩で「熟成」させるか、または実験の最後の24時間にわたって漸進的に塩濃度を増大させて(最終濃度は1.0M NaCl)調製したものと比べると、はるかに低かった(7.9±0.2pmol/cm2)(上記参照)。
スペーサーの配列がどのようにAuナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの被覆範囲に影響するかを調べるために、3′プロピルチオールとフルオレセイン標識12mer配列の間に20dAスペーサーおよび20dTスペーサーが挿入されたフルオレセイン修飾32mer鎖を、調製した。S3′T2012FとS3′A2012Fで修飾したナノ粒子に関
する表面被覆範囲とハイブリダイゼーションの研究で最も顕著な結果は、20dAスペーサー(24±1pmol/cm2)と比較して、20dTスペーサー(35±1pmol/cm2)でより大きな表面被覆範囲が達成されたことである。ハイブリダイズした表面結合鎖のパーセンテージはST20l2merナノ粒子(79%)ではSA2012ナノ粒子(「〜94%」より低かったが、ハイブリダイズした鎖の数は匹敵していた。これらの結果は、dT豊富なオリゴヌクレオチド鎖が、dA豊富なオリゴヌクレオチドよりも低い程度でナノ粒子表面と非特異的に相互作用することを示唆している。従って、20dAスペーサーセグメントが粒子表面上で平坦に横渡ることにより金の部位をブロックする一方、20dTスペーサーセグメントは、金の表面から垂直に延びることができ、これはより高い表面被覆範囲を促す。
効率的なハイブリダイゼーションに加えて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子の別の重要な特性は、ハイブリダイゼーション事象の総数を調節する可能性である。これは、認識鎖の表面密度の調節により最も容易に遂行される。他の研究者は、ハイブリダイゼーションを制御するために、金電極上の修飾オリゴヌクレオチドと共に、メルカプトヘキサノールのよう同時吸着される希釈剤アルキルチオールを使用した(Steelら、Anal.Chem.70:4670−4677(1998);Herneら、J.Am.Chem.Soc.119:8916−8920(1997))。しかしながら、保護されていない金ナノ粒子の固有の低い安定性は、希釈剤分子の選択に重大な制約を提起した。チオール修飾20dA配列(SA20)[配列番号55]は、ハイブリダイゼーションに必要な高いイオン強度の緩衝液中での粒子安定性を維持し、かつ非特異的吸着から表面を保護する点で、適切していることがわかった。
本研究は、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を安定化させる程度に高いが、高い割合の鎖が溶液中のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために接近できる程度に低く、オリゴヌクレオチド被覆範囲間のバランスを達成することが重要であることを示している。それは、オリゴヌクレオチドを、高いオリゴヌクレオチド表面被覆範囲を得るためにナノ粒子に付着させたり、静電相互作用を減らすためにオリゴヌクレオチド
スペーサーセグメントに付着させたり、各ナノ粒子に対するハイブリダイゼーション事象の平均数を再現可能に制御するために同時吸着鎖を付着したりしている間に、塩条件を調節させることにより達成される。鎖(スペーサー)の配列の性質が、金ナノ粒子に装填されたオリゴヌクレオチド鎖の数に影響を及ぼすことも示された。この研究は、オリゴヌクレオチドとナノ粒子の間の相互作用の理解ならびにナノ粒子−オリゴヌクレオチド検出方法の感度の最良化に関して重要な意味合いを持つ。
この実施例では、オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子を用いたコンビナトリアルDNAアレイの選択的が非常に高くかつ非常に高感度な分析法を説明する。非常に狭いナノ粒子−標的複合体熱解離温度範囲により、ヌクレオチド誤対合を1つ有する標的から所与のオリゴヌクレオチド配列を、非常に高い選択性で識別することができる。さらに、銀(I)のナノ粒子触媒還元に基づくシグナル増幅法と組合せると、このナノ粒子配列検出系の感度は、慣用の類似発蛍光団系の感度よりも2桁の大きさだけ優れている。
これらの基板に同時ハイブリダイズさせた(図32参照)。したがって、表面のナノ粒子の存在によって、特定の30塩基配列の検出が示された。標的濃度が高い(≧1nM)と、表面上のハイブリダイズした高密度のナノ粒子が、表面を明るいピンク色にした(図33参照)。標的濃度が低い場合、付着しているナノ粒子は、(電界放出走査電子顕微鏡検査では画像が見られたが)肉眼で見ることはできなかった。基板表面にハイブリダイズしたナノ粒子の視覚化を容易にするために、銀イオンをヒドロキノンによって触媒的に還元してスライド表面上に銀金属を形成するシグナル増幅法を用いた。この方法は、組織化学顕微鏡検査研究において、タンパク質−および抗体−結合金ナノ粒子を拡大するために用いられている(Hacker,Colloidal Gold:Principles,Methods,and Applications,M.A.Hayat編(Academic Press,San Diego,1989年),第1巻,第10章;Zehbeら,Am.J.Pathol.,第150巻,1553ページ(1997年))が、その定量的DNAハイブリダイゼーションアッセイにおける使用は新規である(Tomlinsonら,Anal.Biochem.,第171巻,217ページ(1988年))。この方法は、ナノ粒子プローブの極めて低い表面被覆面積を簡単な平台型スキャナや肉眼で視覚化し得た(図33)だけでなく、染色面積の光学密度に基づく標的ハイブリダイゼーションの定量も可能になった(図34)。重要なことには、標的の不在下、または非相補的標的の存在下には、表面の染色は観察されず、これは、ナノ粒子の表面への非特異的結合も、非特異的銀染色も起こらないことを証明している。この結果は、核酸の非常に高い感度かつ非常に選択的な検出を可能にするこれらのナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の優れた特徴である。
アレイは、標的の8位の4つの可能なヌクレオチド(N)それぞれに対応する4つの素子を含んでいた(図32参照)。ハイブリダイゼーション緩衝液中で、合成標的と、蛍光標識またはナノ粒子標識プローブとを段階的にアレイにハイブリダイズさせたが、各ステップの後で、35℃のストリンジェンシー緩衝液洗浄を行った。先ず、2×PBS(0.3M NaCl、10mM Na2H2PO4/Na2HPO4緩衝液、pH7)中の1nM 合成標的溶液20μlとアレイとを、室温下に4時間、ハイブリダイゼーションチャンバ(Grace Bio−Labs Cover Well PC20)中でハイブリダイズさせ、次いで、35℃下に清浄な2×PBS緩衝液で洗浄した。次いで、2×PBS中100pM オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子溶液20μlとアレイとを、室温下に4時間、新鮮なハイブリダイゼーションチャンバ中でハイブリダイズさせた。アレイを35℃下に清浄な2×PBSで洗浄し、次いで、2×PBS(0.3M NaNO3、10mMNaH2PO4/Na2HPO4緩衝液、pH7)で2回洗浄した。次いで、ナノ粒子アレイを銀増幅溶液(シグマ・ケミカル社、Silver Enhanceer Solution)中に5分間浸漬し、水で洗浄した。銀増幅により、アレイ素子はかなり暗色化し、直径200μmの素子は平台型スキャナまたは肉眼でさえ容易に見ることができた。
在的な方法を示している。
実施例20: ナノ粒子構造
ハイブリダイズしたDNAリンカーを媒介としたガラス支持体上への超分子重層金ナノ粒子構造の可逆的集合体を説明する。オリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子を、相補的DNAリンカーの存在下、オリゴヌクレオチド官能化ガラス支持体に連続付着させる。DNAの独特な認識特性により、相補的リンカーの存在下にナノ粒子構造が選択的に集合する。さらに、これらの構造は、溶液の温度、pH、およびイオン強度を含めた連結二本鎖DNAのハイブリダイゼーションを媒介する外部刺激に応答して集合したり、離散したりし得る。この系は、固相支持体上にナノ粒子ベース構造を構築する極めて選択的かつ制御された方法を提供することに加えて、DNAによって連結されたナノ粒子網目構造の光学特性と融解特性とに影響を与える要素の研究を可能にする。
ーションは観察されなかった。さらに、DNAリンカーのハイブリダイゼーションを促進させる条件:中性pH、穏和な塩濃度(>0.05M NaCl)および二本鎖融解温度(Tm)を下回る温度下にのみ多層集合体が観察された。
リダイズするにつれ、オリゴヌクレオチド連結ナノ粒子の融解転移は、溶液中に見出された大きなナノ粒子網目構造集合体の融解転移と同等になるまで連続的に急激さを増した(図39E−F、一次導関数のFWHM=3℃)。(Gittinsら,Adv.Mater.,第11巻:737ページ(1999年);Brustら,Langmuir,第14巻:5425ページ(1998年)。)これらの実験は、最適な急激融解曲線を得るためには、3つ以上のナノ粒子と多重DNAの相互連結体が必要であることを立証している。これらの実験はさらに、この系における光学的変化が融解特性から完全に切り離されている(すなわち、凝集が小さいと、急激な転移は生じ得るが、それでも変色は生じない)ことを示している。
実施例21: 金ナノ粒子集合体の電気的性質
DNAを介した電子的移動は、過去数年にわたり化学の分野で最も広範囲に討議されている問題の1つである。(Kelleyら,Science,第283巻:375−381ページ(1999年);Turroら,JBIC、第3巻:201−209ページ(1998年);Lewisら,JBIC,第3巻:215−221ページ(1998年);Ratner,M.,Nature,第397巻,480−481ページ(1999年);Okahataら,J.Am.Chem.Soc.,第120巻,6165−6166ページ(1998年))。DNAは効率的に電子を移動させ得ると主張するものもいるが、DNAは絶縁体であると考えるものもいる。
Films,第128巻:1−9ページ(1985年))。アルカンジチオールを介して連結された金ナノ粒子の網目構造は類似の温度依存性を示した(Brustら,Adv.Mater.,第7巻:795−797ページ(1995年);Bethellら.J.Electroanal.Chem.,第409巻:137−143ページ(1996年))。電荷移動の活性化エネルギーは、方程式(1)
σ=σoexp[−Eα/kT]] (1)
を用いる1nσ対1/Tのプロットから得ることができる。3つの測定値から計算した平均活性化エネルギーは、それぞれ24、48および72merリンカーに関して、7.4±0.2meV、7.5±0.3meV、7.6±0.4meVであった。これらの計算には、50°Kから150°Kまでの導電率を用いた。
る。確かに、溶媒および塩の除去によって創出された自由体積によって、DNAが表面に圧縮され、凝集体内の粒子が近接する。第3に、DNA保護ナノ粒子を有する凝集体は半導体として挙動するが、クエン酸塩安定化粒子から形成された膜は、不可逆的粒子融合および金属様挙動を示す。最後に、これらの結果は、オリゴヌクレオチドで官能化されたナノ粒子と標的DNAとの間の配列特異的結合事象が回路の閉鎖および導電率の急激な増大(すなわち、絶縁体から半導体へ)を起こすDNA診断用途におけるこれらの材料の使用を示している(次ぎの実施例参照)。
実施例22: 金電極を用いた核酸の検出
金電極を用いた核酸検出法が図39に略図で示されている。Guoら,Nucleic
Acids Res.,第22巻,5456−5465ページ(1994年)の方法に従って、2つの金電極の間のガラス表面を、標的DNA3(5′TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG[配列番号60])と相補的な12merオリゴヌクレオチド1(3′NH2(CH2)7O(PO2 −)O−ATG−CTC−AAC−TCT[配列番号59])で修飾した。オリゴヌクレオチド2(5′SH(CH2)6O(PO2 −)O−CGC−ATT−CAG−GAT[配列番号50])を作製し、実施例1および18に記載のように13nm金ナノ粒子に付着させて、ナノ粒子aを生成した。標的DNA3とナノ粒子aをデバイスに付加した。ガラス表面の色はピンク色に変わったが、これは、標的DNA−金ナノ粒子集合体がガラス基板上に形成されたことを示している。次いで、デバイスを0.3M NaCl、10mM リン酸緩衝液中に浸漬し、40℃で1時間加熱して、非特異的に結合したDNAを除去し、次いで、実施例19に記載のような銀染色溶液で5分間処理した。電極の抵抗は67kΩであった。
この実施例では、調製が簡単で、広く有用で、メルカプトヘキシルリンカーを使用して調製した金−オリゴヌクレオチド共役体よりもDTTに対して大きな安定性を示す金−オリゴヌクレオチド共役体を与える、ステロイドジスルフィド1a(図42)に基づく金表面にオリゴヌクレオチドを結合させる新しい環式ジスルフィドリンカーについて説明する。1,2−ジチアン−4,5−ジオールのエステル誘導体は金表面上で単分子層を形成することが知られているため(Nuzzoら、J.Am.Chem.Soc.105,4481−4483)、環式ジスルフィドを、アンカーユニットの反応部位として選択した。環式ジスルフィドは、両方の硫黄原子を介して立とうに表面に結合し(Ulman,A.、MRS
Bulletin、6月46−51)、向上した安定性を示し得るキレート構造を与えるだろう。リンク要素としては、入手が容易で、容易に誘導退化されるケトアルコールであり、大きな疎水性表面を備えた置換体として、金の表面への水溶性分子の接近を選別するのに役立つよう期待されるため、エピアンドロステロンを選択した(Retsinge
rら、J.Am.Chem.Soc.115、7535−7536―Bioconjugate Chem.9、826−830)。
(a)一般法
NMRスペクトルを、溶媒としてCDCl3、内部(H)標準としてTMS、外部(31P)標準としてH3PO4を使用して、500MHz(1H)および400MHz(31P;161.9MHzの獲得)Varian分光計により記録した。化学シフトはδユニットで表される。MSデータをQuattro II三重四極子質量分析計により得た。自動オリゴヌクレオチド合成を、ミリジーンExpedite DNADNA合成装置で行った。Sの分析は、Oneida研究サービスによって行われた。
合成スキームは図43に示される。エピアンドロステロン(0.5g)、1,2−ジチアン−4,5ジオール(0.28g)およびp−トルエンスルホン酸(15mg)をトルエン(30mL)に溶かした溶液を、脱水条件下で7時間環流した(Dean Stark装置)。その後、トルエンを、減圧下で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解した。この溶液を水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥し、シロップ条の残留物に濃縮した。これをペンタン/エーテル中に一晩静置すると、白色固体(400mg)として化合物laが得られた。Rf値(TLC、シリカプレート、溶離液としてエーテル)は0.5であった。比較として、同じ条件下でのエピアンドロステロンおよびの1,2−ジチアン−4、5−ジオールのRf値は、それぞれ0.4および0.3である。ペンタン/エーテルからの再結晶により、白い粉末(融点110〜112℃)を生じた。1H NMR、δ3.6、(1H,C3OH)3.54−3.39(2H,m ジチアン環の2OCH)、3.2−3.0(4H,m 2CH2S)、2.1−0.7(29H,m ステロイドのH);質量スペクトル(ES+) C23H36O3S2(M+H)に対する計算値425.2179、実測値425.2151 (C23H37O3S2)分析 計算値15.12、実測値15.26。
化合物1a(100mg)をTHF(3mL)に溶解し、ドライアイスアルコール浴で冷却した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(80μL)およびβ−シアノエチルクロロジイソプロピルホスホルアミダイト(80μL)を連続して加えた。その後、混合物を室温まで温め、2時間撹拌し、酢酸エチル(100mL)と混ぜ、5%NaHCO3水溶液で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、干し上がるまで濃縮した。残留物を最小量のジクロロメタンに溶かし、ヘキサンを加えて−70℃で沈降させ、真空下で乾燥させ、100mgを生成した。;31P NMR 146.02。
最後の亜リン酸化工程で化合物1b(図42)を使用した以外には、従来のホスホロアミダイト化学機構を使用して5′修飾オリゴヌクレオチドIc1および1c2をCPG支持体上に構築した。生成物を、濃縮NH4OHで16時間、55℃で処理することにより
支持体から外した。オリゴヌクレオチドを、Hewlett Packard ODS Hypersilカラム(4.6×200nm、5μm粒径)を備えたDionex DX500システムで、TEAA緩衝液(pH7.0)と1%/分勾配の95%CH3CN/5%0.03TEAAを1mL/分の流量で使用して、逆相HPLCにより精製した。疎水性ステロイド基の優れた特徴は、キャップされた誘導体が、キャップが外されたオリゴマーから楽に分離されることである。硫黄で誘導体化したオリゴヌクレオチドIIa、IIc1,およびIIc2(図43)を、市販の「5′−チオール−修飾試薬」(C6Glen Research)と、以前に説明されたような(Storhoff、J.J.ら、J.Am.Chem.Soc.120、1959−1964)硝酸銀によるトリチル保護基の解離とを使用して調製した。ジスルフィドIIc1の調製に関しては、「チオール−修飾C6 S−S」(Glen Research)を最後の亜リン酸化に使用し、末端のジメトキシトリチル基を80%酢酸水溶液中で解離させた。
ジスルフィド−ステロイドアンカーを含むナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブの一体性を評価するために、金ナノ粒子上の修飾オリゴヌクレオチドの固定により、プローブIc1、Ic2、IIc1、IIc2、およびIIIc1を作製した。与えたシリーズ中のオリゴマーは同じヌクレオチド配列を有するが、5′先端基Yの構造が異なっている。Ic1とIc2はステロイド−ジスルフィド先端基を有し;IIc1、IIc2はメルカプトヘキシル先端基を有し、IIIc1は非環式ジスルフィド先端基を有する。(dA)20鎖はハイブリダイゼーションを促進するための、金とオリゴヌクレオチド認識部分との間のスペーサーとして機能する。硫黄で誘導体化されたオリゴマーの多くは各ナノ粒子に結合する。標的オリゴヌクレオチドとのナノ粒子プローブ対のハイブリダイゼーションは3次元のネットワークの生成と、および赤から青灰色への色の変化につながる(Mucic,R.C.ら、J.Am.Chem.Soc.120、12674−12675)。
7、1078−1081;Mucic R.C.ら、J.Am.Chem.Soc.120、12674−12675;Mitchell,G.P.、J.Am.Chem.Soc.121、8122−8123)、反応は可逆的だった。凝集物を90℃(ナノ粒子を一緒にリンクするオリゴマーの解離温度を超える温度)に温め、熱いうちにスポットすると、赤いスポットが得られた。オリゴヌクレオチド標的を省略したかオリゴヌクレオチド標的がプローブに相補的でない対照実験では、すべての条件下で色が赤かった。
金ナノ粒子かメルカプトヘキシル−オリゴヌクレオチドを装填した金ナノ粒子のコロイド溶液へのチオールの追加は、ナノ粒子の凝集につながる。色は赤から紺青まで変化し、静置すると、暗色沈澱物が沈着する。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子の実験で実証されるように、チオールは、金表面に結び付けられたメルカプトアルキル−オリゴヌクレオチドを置換する(Mucic、R.C.(1999) Synthetic Programmable Nanoparticle Assembly Using DNA PhD論文、ノースウェスタン大学)。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体のハイブリダイゼーションによって起こった凝集とは対照的に、そのような反応は不可逆であり、加熱しても、NaOHを加えても、凝集物を分解することはできない。
処理した。30分後に、1μLの79mer標的オリゴヌクレオチド溶液(10pmol)を加えた。サンプルを急速凍結し、解凍し、スポット試験によって測定した。標的を含むサンプルのスポットは青く、標的を欠く対照のスポットは赤かった。これは、ナノ粒子共役体が安定しているだけでなく、メルカプトヘキシルか線形ジスルフィドアンカー基に由来するプローブの凝集を生じさせる条件下でDTTに暴露した後でプローブとして有効であることを実証した。
この環式ジスルフィドリンカーを用いて作られた金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、特定のオリゴヌクレオチド配列を検出するのに有効なプローブとして機能し、従来のメルカプトヘキシル基または非環式ジスルフィドユニットを用いて作製された対応する共役体よりも、ジチオスレイトールへのはるかに大きな安定性を示す。チオール不活性化に対する高い安定性は、少なくとも一部では、2つの硫黄原子によって各オリゴヌクレオチドを金に固定することに因ると考えられる。
この実施例では、本願発明者らは非ステロイド環式ジスルフィドリンカーと、このリンカーからオリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブとを調製し、ステロイド環式ジスルフィドとアルキルチオールリンカーにより調製されたプローブに対する、チオール含有溶液の存在下でのプローブ安定性を評価した。アルキルチオールアンカー基I(図44)[C.A.Mirkinら、Nature、382、607(1996);Storhoffら、J.Am.Chem.Soc.120、1959年(1998)]またはステロイド環式ジスルフィドアンカー基II(図44)[R.L.Letsingerら、Bioconjugate Chemistry、11、289(2000)]を使用して金ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合することにより、DNAまたはRNAの配列を検出するためのプローブの調製方法が記載されている。プローブとしてステロイド環式ジスルフィドリンカーを使用して調製した共役体は、メルカプトエタノールやジチオスレイトール(DTT)のようなチオール化合物の存在下ではるかにより安定している点でアルキルチオールアンカーを使用して調製した共役体よりも遊離であることがわかった。検出するDNAサンプルを増幅するのに使用されるPCR溶液は、酵素を保護するために少量のDTTを含んでいるため、この特徴は重要である。PCR産物の単純かつ迅速な検出の場合、最初に増幅されたDNAを分離せずにPCR溶液中で直接試験を行えるように、DTTへの高い安定性を有するプローブを使用することが望ましい。
り金上の隣接鎖を安定させることが可能なステロイドユニット(例えばR.L.Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.115,7535(1993)参照)である。それらの寄与の重要性を評価するために、本願発明者らは、ステロイド基を欠く環式ジスルフィド化合物IIIc(図44)によって固定された金共役体を調製し、調べた。
(a)化合物2a、2b、2c1、2c2の調製
実施例23に記述したように化合物2aを調製した。2aの亜リン酸化とオリゴヌクレオチド2c1および2c2の合成を、実施例23や他の箇所でステロイド環式ジスルフィド誘導体に関して先に述べたように行った[R.L.Letsingerら、Bioconjugate Chemistry、11、289(2000)、この文献の開示は引用によりその全体が組み込まれる]。CPG支持体上のオリゴマーにIIIbを縮合することに関与するステップの反応時間は、10分であった。
(b)金−オリゴヌクレオチド共役体の調製
1.7μモル/mLの各オリゴヌクレオチドを含む溶液を提供するために、等モル量のオリゴヌクレオチド2c1および2dまたは2c2および2dを13nmの金コロイド(〜10nM)に加えた。該溶液を暗所で24時間保存し、その後、塩類を加えて、該溶液を0.3M NaCl、10mM リン酸塩(pH7.0)、0.01%アジ化ナトリウムとなるようにした。24時間後に、NaCl濃度を0.8Mに増大し、溶液をさらに24時間静置した。その後、凝集物を除去するためにコロイドをろ過し、溶液を遠心してナノ粒子を集める。ペレットを、ナノピュア水で洗浄し、再び遠心し、0.1M NaCl、10mM リン酸緩衝液(pH7.0)、0.01%アジ化ナトリウムに再分散した。(c)ナノ粒子プローブとジチオスレイトールの反応
置換の研究は、20μLの2c1と2c2から得たコロイド共役体の等量混合物に、2μLの0.1M DTTを加えることにより、室温(22℃)で行った。アリコート(3μL)を定期的に取り、白いナイロン膜上にスポットした。最初、スポットは赤かった。DTTによる金からのオリゴヌクレオチド硫黄誘導体の置換により、スポット試験で青灰色のスポットを与える混合物が生じた。DTTによる置換の時間を、混合物がスポット試験で強い青灰色を与える時間として採用した。2c1および2c2に由来する共役体の混合物の場合、この時は10時間だった。
この実施例では、本願発明者らは、チオール含有溶液の存在下での、アルキルチオールおよびステロイド環式ジスルフィドリンカーと比較した、新しい非環式ジスルフィドリンカーであるトリチオールの安定性を評価した。比較のために、メルカプトヘキシルアンカー(化合物5、図45)およびステロイド環式ジスルフィドアンカー(化合物6、図45)を備えたオリゴヌクレオチドを調製した。
図47に示したように、5′−トリメルカプトアルキルチオールオリゴヌクレオチドを合成した。Tremblerホスホロアミダイト7(Glen Research社、バージニア州スターリング)(図45)およびチオール修飾剤C6 S−Sホスホロアミダイトを、CPG支持体に結合された保護オリゴマーの5′端に逐次結合した。生成物をCPGから解離し、上述のように精製した。3つのDMT基を備えたトリチオールオリゴヌクレオチドに対する保持時間は、約64分である。続いて、5′−DMT基を、80%酢酸に30分間オリゴヌクレオチドを溶解し、その後蒸発により取り外した。オリゴヌクレオチドを500μLのナノピュア水に再溶解した、溶液を酢酸エチル(3×300μL)で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチドを白色固体として得られた。DMT基がないこの5′−トリ−ジスルフィドオリゴヌクレオチドの保持時間は、逆相カラムで約35分であり、イオン交換カラムでは24分であった。これらのピークはいずれもスペクトル面積の97%以上であり、オリゴヌクレオチドが高純度であることを示している。オリゴヌクレオチド8(図45)の式量を、エレクトロスプレーMS(計算値12242.85、実測値12244.1)により得た。DNA鎖上の3つのジスルフィド基を5′モノチオールDNAに対して上述したようにトリチオール基に還元し、その後、NAP−5カラムでオリゴヌクレオチドを精製した。
ベクター研究所(カリフォルニア州Burlingame)より購入した金のナノ粒子を使用した。10mLの30nm金コロイドに、5ODのチオール修飾DNAを添加した。溶液を、徐々に0.3M NaCl/10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)(PBS)にした。その後、ナノ粒子を遠心によって沈降させた。無色の上清を除去した後、赤色の油状沈殿物を10mLの新しいPBS緩衝液に再分散した。このプロセスを繰り返すことにより、コロイドを10mLの新しいPBS緩衝液を用いて2回洗浄した。
固体のDTTを、DTT濃度が0.017Mとなるまで、様々な種類のチオールまたはジスルフィドDNAで修飾した30nm金ナノ粒子コロイドの600μL溶液に加えた。DTTがオリゴヌクレオチドを置換するにつれて、コロイドの色は赤から青に代わる。UV/VISスペクトルを時間の関数として取った。分散した30nm金粒子に関連する〜528nmの吸光度は減少し始め、700nmの広幅のバンドが伸び始めた。700nmのバンドはコロイドの凝集に関連している。図48に示されるように、1つのチオールオリゴヌクレオチド(1)で修飾した30nm金の粒子は、0.017M DTTで迅速に凝集物を形成し、1.5時間後にはコロイドが完全に青くなる。ジスルフィドオリゴヌクレオチド(4)で修飾したナノ粒子を含む溶液は、同一条件下では20時間後に青くなる。トリチオール−オリゴヌクレオチド(開裂した6)で修飾したナノ粒子では、溶液が青くなるのに40時間かかった。
実施例26:ナノ粒子−核酸−sfpメンバー共役体を用いた検体の検出
この実施例では、ナノ粒子−ストレプトアビジンプローブを用いて検体(ビオチン)の検出を実証する(図54,56)。
(a)ナノ粒子−核酸−タンパク質共役体の調製
ナノ粒子−核酸共役体を、実施例3に記載したように調製する。これらの共役体を調製するために用いたオリゴヌクレオチド修飾因子は、以下の配列を有する:5’SH(CH
2\~)6\~−A10−CGCATTCAGGAT3’(2)。図56に示すように、ビオチン標識オリゴヌクレオチド(1)[3’−ビオチン−TEG−A10−ATGCTCAACTCT5’]を、ビオチン TEG CPG支持体(グレン・リサーチ社(Glen Research),Sterling,Virginia;カタログ番号20−2955−01)を用いて文献の手順により調製する。ストレプトアビジン/DNA共役体を作製するために、ストレプトアビジンを20mM Tris(pH7.2)、0.2mM EDTA緩衝液中の1当量のビオチン修飾オリゴヌクレオチドと、攪拌器にて室温で2時間反応させた。異なる数のオリゴヌクレオチドと複合化したストレプトアビジンを、20mM
Tris(pH7.2)及び0.5%/分 勾配の20mM Tris、1M NaClによる流速1mL/分のイオン交換HPLCで分離しながら、DNAのUVシグナルを260nM及び280nMでモニタリングした。ストレプトアビジン/ビオチン修飾オリゴヌクレオチド混合物は、45分、56分、67分、及び71分に、それぞれ1:1、2:1、3:1、及び4:1オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体に対応する4つのピークを示した。ストレプトアビジン/オリゴヌクレオチドの1:1複合体(10μM、5μL)を単離して、0.3M PBS(0.3M NaCl、10mM リン酸緩衝液、pH7)中のリンカーDNA[5’TACGAGTTGAGAATCCTGATTGCG3’](3)(10μM、5μL)と予備混合し、その後その混合物を0.3M PBS中のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体(10nM、130μL)に添加して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体を調製した。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、ストレプトアビジン/オリゴヌクレオチド、及びリンカーDNAを含有する溶液を、ドライアイス中で10分間凍結させ、解凍してDNAハイブリダイゼーションを促進させた。12時間後に、その溶液を1000rpmで20分間遠心分離して、上清を除去した。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体の赤色油状沈殿物を、0.3M PBS緩衝液に再分散させた。
(b)ビオチンの検出
ビオチンは、以下の手順に従ってガラススライドに固定化した:オリゴヌクレオチド修飾ガラススライドを、過去に報告された方法(Science,2000年,第289巻,1757−1760ページ)により調製し、その後ビオチン修飾オリゴヌクレオチドを表面DNAにハイブリダイズさせた。(ビオチン修飾ガラススライドは、様々な方法により調製することができる。1つの例は、アミン修飾ガラススライドを調製し、その後表面のアミンを、アミンと反応する様々な市販のビオチン化試薬と反応させることである。)図54に示すように、固定化ビオチンガラススライドは、その後ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンを含有する媒体(0.3M PBS中に2nM)で処理した。洗浄し銀強化溶液で処理した後、灰色又は光沢のある銀色のスポットの発現により、捕獲したプローブの存在が実証された[銀強化溶液A(カタログ番号S5020,シグマ社(Sigma Company),米国ミズーリ州セントルイス)、及び銀強化溶液B(カタログ番号S5145,シグマ社(Sigma Company))、Science,2000年,第289巻、1757ページも参照]。所望なら、オリゴヌクレオチドに連結する蛍光標識した特異的結合対メンバーを用いて、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−spfプローブを調製してもよい。その後、この発蛍光団標識プローブを用いて、検体の存在を検出してもよい。
実施例27:金コロイドストレプトアビジン共役体の特異的結合の比較
この実施例において、実施例26に従って調製したナノ粒子ストレプトアビジンプローブ、及び市販のAuコロイド(20nm)/ストレプトアビジン共役体(フルネーム:金標識ストレプトアビジン標識)(シグマ社(Sigma Company),米国ミズーリ州セントルイスから購入,カタログ番号S6514)の非特異的結合を評価した。共役体を含有する市販の溶液及び本発明のプローブ(0.3M PBS中に2nM)を含有す
る溶液各5μlを、ガラススライド上にスポットした。20時間後に、スライドを水で洗浄して、銀強化溶液[実施例26参照]で処理した。市販の共役体は、発色の5分後に灰色のスポットを示しており、ガラス表面にAuコロイドが存在することが示されたが、実施例3のナノ粒子ストレプトアビジンプローブでは、認識できる銀色染色は示されなかった(図53)。シグナルの差は、銀色染色したスライドに第2のDNA修飾ナノ粒子を載せてそれを再染色することにより高めることができた。これにより、本発明のナノ粒子−オリゴヌクレオチド−sbp共役体が、市販のAuコロイド/ストレプトアビジン共役体よりも非特異的結合に対して抵抗性があることが実証される。
実施例28:ナノ粒子アセンブリの調製
本明細書に論じたように、特異的結合対メンバー、例えば受容体又はリガンドは、オリゴヌクレオチドにより機能化され、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子に固定化されて、DNAよりむしろ特異的結合対メンバーが指向する分子認識特性を備える以外に、オリゴヌクレオチド修飾粒子の高度安定性を呈する新しい分類のハイブリッド粒子を生成することができる。或いは、受容体修飾オリゴヌクレオチドを備えた多重受容体結合部位を有するタンパク質を機能化し、それにより我々の本来の材料の組立スキームにおいて、タンパク質受容体複合体を無機ナノ粒子の1つの代わりに部分構造の1つとして用いることができる。この実施例において、我々は、13nm金ナノ粒子、ストレプトアビジン、及びビオチン化DNAを用いて、新しいナノ粒子アセンブリ(図52)を調製して、得られた新しい生物無機材料の物理的及び化学的特性の幾つかを研究する。
(a)実験
オリゴヌクレオチド修飾13nm Au粒子(2−Au)及びリンカーDNA(3)を調製するための方法は、他の文献で報告されている。これらの共役体を調製するために用いるオリゴヌクレオチド修飾因子は、以下の配列を有する:5’SH(CH2\~)6\~−A10−CGCATTCAGGAT3’。リンカーDNA(3)は、以下の配列を有する:[5’TACGAGTTGAGAATCCTGATTGCG3’]。J.J.Storhoff,R.Elghanian,R.C.Mucic,C.A.Mirkin,R.L.Letsinger,J.Am.Chem.Soc.1998年,第120巻,1959ページを参照されたい。Au粒子(2−Au)及びリンカーDNA(3)は、使用の前に0.3M NaCl、10mMリン酸緩衝液(pH7、0.3M PBS)に保存した。ビオチン修飾DNA(2)は、ビオチン TEG CPG支持体(グレン・リサーチ社(Glen Research))を用いて合成し、文献の方法により精製した。J.J.Storhoff,R.Elghanian,R.C.Mucic,C.A.Mirkin,R.L.Letsinger,J.Am.Chem.Soc.1998年,第120巻,1959ページ;T.Brown,D.J.S.Brown,in Oligonuclieotides and Analogues(F.Eckstein編集),Oxford University Press,New York,1991年を参照されたい。ストレプトアビジンは、シグマ社(Sigma)から購入し、20mM Tris緩衝液(30M、pH7.2)に溶解した。ストレプトアビジン/DNA共役体(1−STV)を作製するために、ストレプトアビジンを20mM Tris(pH7.2)、0.2mM EDTA緩衝液中の8当量のビオチン−オリゴヌクレオチド共役体1と攪拌器にて室温で2時間反応させた。ビオチン−オリゴヌクレオチド共役体は、配列[3−ビオチン−TEG−A10−ATGCTCAACTCT5’]を有している。DNAに対するストレプトアビジンの割合が異なる混合物(1:0.4、1:1、1:4)も、HPLC分析のために調製した。ストレプトアビジン/DNA共役体は、20mM Tris(pH7.2)及び0.5%/分 勾配の20mM Tris、1M NaClによる流速1mL/分のイオン交換HPLCで過剰のDNAから分離しながら、260nm及び280nmでDNAのUVシグナルをモニタリングした。1:0.4ストレプトアビジン/DNA混合物は、45分,56分に2つのピークを、1:1混合物は45分、56分、67分、及び71分に、それぞれ1:1、2:1、3:1、及び4:1オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体に対応する4つのピークを示した。1:4混合物は、3番目の
ピーク(67分)及び4番目のピーク(71分)の強度が増大することを除けば、同様の位置に4つのピークを示した。1:8ストレプトアビジン/DNA混合物のHPLCスペクトルは、2つの主なピーク、つまり1つは59分の未反応のDNAのもの、もう一方は71分の4:1オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体のものを示した。加えて、3:1複合体にあたる67分のショルダーも存在した。精製したストレプトアビジン−ビオチン化DNA共役体は、濃縮して、限外濾過(セントリコン30)により0.3M PBSに分散させた。TEM、熱変性実験、及びSAXS測定用の凝集体は、ストレプトアビジン−オリゴヌクレオチド共役体(1−STV)、金ナノ粒子DNA共役体(2−Au)、及びリンカーDNA(3)を含有する溶液をドライアイス中で10分間凍結することにより調製し、測定する前に解凍して、ハイブリダイゼーションを促進させた。
(b)結果
本明細書に報告したナノ粒子/タンパク質アセンブリ(図52)は、3つの部分構造:4つのビオチン化オリゴヌクレオチドに複合化したストレプトアビジン(1−STV)と、オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子(2−Au)と、1に相補的な配列の半分及び2に相補的なもう半分を有するリンカーオリゴヌクレオチド(3)とに依存する(図52参照)。典型的な実験において、リンカーDNA3(10M、21L)を、2−Au(9.7nM、260L)と1−STV(1.8M、27L)の混合物に導入するか、或いはリンカーDNA3(10M、21L)を、1−STV(1.8M、27L)と予備混合し、その後混合物を0.3M PBS中の2−Au(9.7nM、260L)に添加した。同等の特性を備えた凝集体が、両方の方法から形成し得るが、3及び1−STVの予備混合は、凝集体の形成を促進する。13nm金ナノ粒子は、ストレプトアビジン(4nmx4nmx5nm)よりも実質的に大きいため[P.C.Weber,D.H.Ohlendorf,J.J.Wendoloski,F.R.Salemme,Science,1989年,第243巻,85ページ;N.M.Green,Methods Enzymol.1990年,第184巻,51ページ]、ストレプトアビジンに対するAuナノ粒子のモル比1:20を利用して、数個のナノ粒子を含む小さな凝集体より、又はストレプトアビジンのハイブリダイズされた層に機能化された単一の金ナノ粒子からなる構造よりどちらかといえば伸長した高分子構造の形成を好適化した。
ージを参照]、又は(2)単一ストレプトアビジン上のDNAのほとんど又は全てが単一粒子上のDNAに結合する動力学的構造の初期形成、を原因とする可能性がある。凝集体形成は、溶液の凍結だけでなく加熱により促進することができる。R.Elghanian,J.J.Storhoff,R.C.Mucic,R.L.Letsinger,C.A.Mirkin,Science 1997年,第277巻,1078ページを参照されたい。
u−STV凝集体は、同じリンカーから形成されたAu−Au凝集体よりも小さなs値で回折ピークを呈した。これは、Au−STVシステムでのAu粒子間距離がより大きいことを示唆している。その上、Au−Au及びAu−STVアセンブリの両者でリンカーとして24量体 DNAの代わりに48量体 DNAを用いた場合、回折ピークはより小さなs値にシフトする。
g(r)=1+(1/2B2\~Δr)Iq(s(q)−1)sin(qr)dq 方程式
(1)
ここで、g(r)は、第2の粒子を選択された粒子からの距離rの関数として見出す確率を示している。PDDFから得られた最も近い近接Au粒子間距離(中心から中心までの距離)は、24量体連結Au−Au、48量体連結Au−Au、24量体連結Au−STV、及び48量体連結Au−STVアセンブリで、それぞれ19.3nm、25.4nm、28.7nm、及び40.0nmである。Au−STVシステムとAu−Auシステムの粒子間距離を比較すると、Au−STVアセンブリが予測されたAuナノ粒子/ストレプトアビジン周期性を有し、2つの成分(Auナノ粒子及びストレプトアビジン)が、強固なDNA2本鎖リンカーにより十分に分離されることが明瞭に示される。
(c)結論
この研究は、以下の理由により重要である。1)DNA依存性ナノ粒子アセンブリ(組立)法(DNA-directed\~nanoparticle\~assembly\~method\~)が、これまで研究された無機ナノ粒子に加えて、タンパク質の構造にまで拡張できることが実証される。実際にこれは、Auナノ粒子の可逆的なDNA依存性アセンブリと、DNAにより機能化されたタンパク質性構造とを実証する最初の報告である。2)ストレプトアビジンをはじめとする多くのタンパク質が、コロイド金の表面に吸着し、強力に結合した複合体を形成することは周知である。我々の実験は、ナノ粒子表面の高密度DNA層の安定した影響と、ハイブリダイゼーションを行わない場合のストレプトアビジン吸着への抵抗性を実証している。それ故、それらは、タンパク質の活性を実質的に乱さないような方法で、非常に特異的な相互作用によりナノ粒子表面のタンパク質構造を特異的に固定化する方法に向かうものである。表面に吸着されたタンパク質を備えた粒子は、免疫化学において重要な役割を演じ[M.A.Hayat,Colloidal Gold:Principles,Methods, and Applications,Academic Press, San Diego,1991年]、タンパク質がナノ粒子表面と直接相互作用する安定したタンパク質/粒子共役体の開発により、組織化学的研究及び免疫検査のための改良ナノ粒子プローブが誘導され得る。
Claims (72)
- 検体を検出する方法であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた検体、(ii)検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けた第1種類のナノ粒子、および(iii)オリゴヌクレオチドを結び付けた第2種類のナノ粒子を提供するステップであって、第2種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチド一部が、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体に結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合することを特徴とするステップと、
検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと、第1種類のナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズしてナノ粒子−検体共役体を形成するのに有効な条件下で、検体に結び付けたオリゴヌクレオチドを第1種類のナノ粒子と接触させるステップと、
検体と第2種類のナノ粒子の特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子−検体共役体を第2種類のナノ粒子共役体と接触させるステップと、
検体と検体の特異的結合補体との特異的結合相互作用によってもたらされた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 検体を検出する方法であって、
(ii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチド、(iii)オリゴヌクレオチドであって、その一部が連結オリゴヌクレオチドの第2部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを取り付けた第1種類のナノ粒子、(i)連結オリゴヌクレオチドの第1部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けた検体、および(iv)オリゴヌクレオチドであって、その一部が、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体に結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドを結び付けた第2種類のナノ粒子、を提供するステップと、
第1種類のナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドと、連結オリゴヌクレオチドの第1部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で連結オリゴヌクレオチドを第1種類のナノ粒子と接触させるステップと、
検体に結び付けたオリゴヌクレオチドと、連結オリゴヌクレオチドの第2部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、連結オリゴヌクレオチドを、検体に結び付けたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
第1種類のナノ粒子に結び付けた検体と、第2種類のナノ粒子に結び付けた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、第1種類のナノ粒子に結び付けられた検体と、第2種類のナノ粒子とを接触させるステップと、
検体の、検体の特異的結合補体に対する特異的結合によってもたらされた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 検体は多価であり、2つ以上のナノ粒子共役体に特異的に結合する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記接触条件には凍結と融解が含まれる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記接触条件には加熱が含まれる、請求項1または2に記載の方法。
- 色の変化が固体表面上で観察される、請求項1または2に記載の方法。
- 検体を検出する方法であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体、(ii)支持体に結び付けたオリゴヌ
クレオチドの配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを結び付けた検体、(iii)オリゴヌクレオチドを結び付けたある種類のナノ粒子を提供するステップであって、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイゼーションの結果、連結オリゴヌクレオチドの第1部分に結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分がさらに、ハイブリダイゼーションの結果、前記検体の特異的結合補体に結び付けられたオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに結び付けられるステップと、
支持体に結び付けたオリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けたオリゴヌクレオチドと検体に結び付けたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、検体に結び付けたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
支持体に結び付けた検体を、支持体に結び付けた検体とナノ粒子に結び付けた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子共役体と接触させるステップと、
検体の特異的結合補体に対する検体の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 検体を検出する方法であって、
(i)検体を結び付けた支持体、および(ii)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップであって、凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合し、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類には、ハイブリダイズした結果検体の特異的結合補体を結び付けた第2のオリゴヌクレオチドに結合されるステップと、
支持体に結び付けられた検体と凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、支持体を凝集体プローブと接触させるステップと、
検体の特異的結合補体に対する検体の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 検体を検出する方法であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体、(ii)支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを結び付けた検体、(iii)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップであって、凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合し、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられた第2のオリゴヌクレオチドに結合する提供するステップと、
オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体とオリゴヌクレオチドを結び付けた検体を接触させるステップであって、接触は、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが有効な条件下で起こるステップと、
支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体を凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブと接触させるステップと、
検体の特異的結合補体に対する検体の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 検体を検出する方法であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体、(ii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチド、(iii)オリゴヌクレオチドを結び付けた検体、(iv)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提
供するステップであって、凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合し、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられた第2のオリゴヌクレオチドに結合し、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは連結オリゴヌクレオチドの第1部分に相補的な配列を有し、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは連結オリゴヌクレオチドの第2部分と相補的な配列を有しているステップと、
連結オリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドの第1部分の間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
連結オリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けられた連結オリゴヌクレオチドの第2部分と検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体と凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブと接触させるステップと、
検体の特異的結合補体に対する検体の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 検体を検出する方法であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体、(ii)支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けた検体、(iii)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブとを提供するステップであって、凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合し、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類は、ハイブリダイゼーションの結果、連結オリゴヌクレオチドの第1部分に結合するオリゴヌクレオチドを有し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合するステップと、
オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体を、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体と凝集プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブと接触させるステップと、
検体の特異的結合補体に対する検体の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 多価検体を検出する方法であって、
オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子プローブを提供するステップであって、ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、リポーターオリゴヌクレオチドの第1部分に結合し、リポーターオリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合するステップと、
多価検体を、検体とナノ粒子プローブ間の特異的結合相互作用を許容し、凝集複合体を形成するのに有効な条件下で、ナノ粒子プローブと接触させるステップと、
凝集複合体を分離するステップと、
凝集複合体を、凝集複合体をデハイブリダイズし、レポーターオリゴヌクレオチドをかつレポーターオリゴヌクレオチドを放出するのに有効な条件に供するステップと、
リポーターオリゴヌクレオチドの存在を検出するステップと、から成る方法。 - 核酸を検出する方法であって、
(i)核酸の第1部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けた、1または複数の種類のナノ粒子と、(ii)各々にオリゴヌクレオチドが結び付けられた2つ以上のビオチン分子に対して、特異的結合相互作用により結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンを含む複合体と、を提供するステップと、
核酸、ナノ粒子、および複合体を、核酸の第1部分とナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドとのならびに核酸の第2部分と複合体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させるステップと、
ナノ粒子、複合体および核酸のハイブリダイゼーションから生じた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 核酸を検出する方法であって、
(i)核酸の第1部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けた、1または複数の種類のナノ粒子、(ii)核酸の第2部分と相補的な配列を有するビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチド、および(iii)ストレプトアビジンまたはアビジンを提供するステップと、
核酸を、核酸の第1部分とナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドとのならびに核酸の第2部分とビオチンに取り付けられたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションと、それによる複合体の形成を許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子共役体およびビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
複合体を、複合体に結び付けられたビオチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンとの間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させるステップと、
複合体に結び付けられたビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの特異的結合により生じた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - 核酸を検出する方法であって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた第1種類のナノ粒子共役体であって、ナノ粒子に取り付けた該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が核酸の第1部分に相補的な配列を有する第1種類のナノ粒子共役体を提供するステップと、
核酸を、ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第1部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、第1種類のナノ粒と接触させるステップと、
sbpメンバーを結び付けたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第2部分に相補的な配列を有するステップと、
sbpメンバーに結び付けられた核酸を、sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドをと核酸の第2部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、接触させるステップと、
オリゴヌクレオチドを結び付けた第2種類のナノ粒子共役体を提供するステップであって、第2種類のナノ粒子に結び付けられた該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合するステップと、
第1種類のナノ粒子に結び付けられた核酸およびsbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドを、第1種類のナノ粒子に結び付けられたsbpメンバーと第2種類のナノ粒子に結び付けられたsbp補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、第2種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
ストレプトアビジンまたはアビジンとの特異的結合から生じた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - sbpメンバーはビオチンである請求項15に記載の方法。
- sb補体はストレプトアビジンまたはアビジンである請求項15に記載の方法。
- 核酸を検出する方法であって、
核酸の第1部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けた支持体を提供するステップと、
核酸を、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと、核酸の第1部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体と接触させるステップと、
sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドは核酸の第2部分に相補的な配列を有しているステップと、
支持体に結び付けられた核酸を、sbpメンバーに結び付けられた核酸と核酸の第2部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
オリゴヌクレオチドが結び付けられたある種類のナノ粒子共役体を提供するステップであって、ナノ粒子共役体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、ハイブリダイゼーションの結果、sbpメンバーの特異的結合補体に結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合させるステップと、
支持体に結び付けられたsbpメンバーを、支持体に結び付けられたsbpメンバーとナノ粒子に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下でナノ粒子共役体と接触させるステップと、
支持体に結び付けられたsbpメンバーを、支持体に結び付けられたsbpメンバーとナノ粒子に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子共役体と接触させるステップと、
sbpメンバーと特異的結合補体との間の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - sbpメンバーはストレプトアビジンまたはアビジンである請求項18に記載の方法。
- sb補体はビオチンである請求項18に記載の方法。
- 核酸を検出する方法であって、
オリゴヌクレオチドを取り付けたナノ粒子共役体を提供するステップであって、ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、核酸の第1部分に相補的な配列を有しているステップと、
核酸を、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第1部分とのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
sbpメンバーを結び付けたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第2部分に相補的な配列を有するステップと、
核酸を、sbpメンバーを有するオリゴヌクレオチドと核酸との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、sbpメンバーを有するオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
sbpメンバーの特異的結合補体に結び付けた支持体を提供するステップと、
支持体を、sbpメンバーと支持体に結び付けられたsb補体との間に特異的結合相互作用が起こるのに有効な条件下で、ナノ粒子に結び付けられたsbpメンバーと接触させるステップと、
sbpメンバーとsbpメンバーの補体との特異的結合に基づいて、検出可能な出来事を観察するステップと、から成る方法。 - sbpメンバーはビオチンである請求項21に記載の方法。
- sb補体はストレプトアビジンまたはアビジンである請求項21に記載の方法。
- 核酸を検出する方法であって、
オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体を提供するステップであって、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは核酸の第1部分に相補的な配列を有するステップと、
支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第1部分の間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、核酸と支持体を接触させるステップと、
sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第2部分と相補的な配列を有するステップと、
支持体に結び付けられた核酸の第2部分とsbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、支持体に結び付けられた核酸と、sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドとを接触させるステップと、
オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップであって、凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合し、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類には、ハイブリダイズした結果sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合されるステップと、
支持体に結び付けられたsbpメンバーと凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、支持体に結び付けられたsbpメンバーを凝集体プローブと接触させるステップと、
sbpメンバーとsbpメンバーのsb補体の特異的結合に基づいて、検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。 - sbpメンバーはビオチンである請求項24に記載の方法。
- sb補体はストレプトアビジンまたはアビジンである請求項24に記載の方法。
- 核酸を検出する方法であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブであって、凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合し、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類には、核酸の第1部分に相補的ないくつかのオリゴヌクレオチドが取り付けられた凝集体プローブ、および(ii)核酸の第2部分に相補的な配列を有する、sbpメンバーを有するオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
凝集体プローブに結び付けられたオリゴヌクレオチドの一部と核酸の第1部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブに結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第1部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、核酸を凝集体プローブと接触させるステップと、
核酸を、sbpメンバーを有するオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、sbpメンバーを結び付けたオリゴヌクレオチドは、sbpメンバーを結び付けたオリゴヌクレオチドと核酸の第2部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、核酸の第2部分に相補的な配列を有するステップと、
sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けた支持体を提供するステップと、
凝集体プローブに結び付けられたsbpメンバーと支持体に結び付けられたsb補体との間に生じる特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブに結び付けた特異的結合補体と凝集体に結び付けられたsbpメンバーとを接触させるステップと、
sbpメンバーおよびsb補体の特異的結合に基づいて、検出可能な出来事を観察するステップと、から成る方法。 - sbpメンバーはストレプトアビジンまたはアビジンである請求項27に記載の方法。
- sb補体はビオチンである請求項27に記載の方法。
- 基板には、1つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のナノ粒子が付着されている、請求項7〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項7〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項7〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ナノ粒子が金から形成されている、請求項7〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項7〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項7〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 検体を検出するための凝集体プローブであって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子と、
(ii)検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドと、
を備えた凝集体プローブ。 - 検体を検出するための凝集体プローブであって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子と、
(ii)検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドと、
(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの少なく
とも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチドと、
を備えた凝集体プローブ。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)以下の(i)〜(iii)を含むナノ粒子共役体を保持する少なくとも1つの容器と、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子
(ii)検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドであって、特異的結合対メンバーを有する該オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合し、ハイブリダイゼーションの結果、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に結合するオリゴヌクレオチドと、
(b) 検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)以下の(i)〜(iii)を含むナノ粒子共役体を保持する少なくとも1つの容器と、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子
(ii)検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチド
(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチド
(b) 検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(b)以下の(i)〜(iii)を含む凝集体プローブを保持する少なくとも1つの容器と、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子と、
(ii)検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチド
(b) 検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)以下の(i)〜(iii)を含む凝集体プローブを保持する少なくとも1つの容器であって、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子と、
(ii)検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドと、
(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチドとを備え
た容器と、
(b)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子を含むある種類のナノ粒子を保持する少なくとも1つの容器と、
(b)検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、該特異的結合対メンバーを結び付けたオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結び付けたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有することと、
(c)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子共役体を保持する少なくとも1つの容器と、
(b)検体メンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、
(c)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドを保持する容器と、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的であり、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドと相補的であることと、
(d)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを保持する少なくとも1つの容器と、凝集体プローブは、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結び付けられることと、
(b)検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、該特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドは、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドに相補的であることと、
(c)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを保持する少なくとも1つの容器と、凝集体プローブは、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結び付けられることと、
(b)検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドが保持する容器と、
(c)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドを保持する容器と、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、凝集体プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有することと、
(d) 検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けたある種類のナノ粒子を保持する少なくとも1つの容器と、
(b)検体の特異的結合補体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、該官能基に結合されたオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有すること
と、
(c)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子を保持する少なくとも1つの容器と、
(b)検体の特異的結合補体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、
(c)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドを保持する容器と、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的であり、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、官能基を有するオリゴヌクレオチドに相補的であることと、
(d)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集プローブを保持する少なくとも1つの容器であって、凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合することと、
(b)検体の特異的結合補体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、該官能基に結合されたオリゴヌクレオチドは、凝集体の少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくととも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有することと、
(c)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
(a)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子を含む凝集プローブを保持する少なくとも1つの容器であって、凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合することと、
(b)検体の特異的結合補体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドを保持する容器と、
(c)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドを保持する容器と、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、凝集プローブの少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドに相補的であり、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、官能基が結び付けられたオリゴヌクレオチドに相補的であることと、
(d)検出可能な変化を観察するための任意選択の支持体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、
検体の特異的結合補体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドと、該官能基に結合されたオリゴヌクレオチドは、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有することと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子、(ii)検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドであって、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有し、ハイブリダイゼーションの結果、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に結合する、オリゴヌクレオチドと、を含むナノ粒子共役体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、
検体の特異的結合補体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドと、該官能基に結合されたオリゴヌクレオチドは、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有することと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子、(ii)sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチド、および(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチドとを含むナノ粒子共役体と、を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第1部分に相補的な配列を有していることと、
sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドであって、核酸の第2部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子、(ii)sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドであって、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有し、ハイブリダイゼーションの結果、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に結合するオリゴヌクレオチドと、を含むナノ粒子共役体と、を備えたキット。 - sbpメンバーがビオチンである、請求項52に記載のキット。
- sbpメンバーの特異的結合補体がストレプトアビジンまたはアビジンである、請求項52に記載のキット。
- 核酸を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第1部分に相補的な配列を有していることと、
sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドであって、核酸の第2部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子、(ii)sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチド、および(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチドとを含むナノ粒子共役体と、を備えたキット。 - sbpメンバーはビオチンである、請求項55に記載のキット。
- sbpメンバーの特異的結合補体がストレプトアビジンまたはアビジンである、請求項55に記載のキット。
- 検体を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、
検体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドであって、該官能基に結合されたオリゴヌクレオチドは、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと、
以下の(i),(ii)を含む凝集体プローブと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子
(ii)検体の特異的結合補体に結び付けられたオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの前記少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子のオリゴヌクレオチドがさらに結合するオリゴヌクレオチド
を備えたキット。 - 検体を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、
検体に結合するための官能基が共有結合により結合されたオリゴヌクレオチドであって、該官能基に結合されたオリゴヌクレオチドは、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと、
以下の(i)〜(iii)を含む凝集体プローブと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子
(ii)検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチド
(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの前記少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチド
を備えたキット。 - 核酸を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第1部分に相補的な配列を有していることと、
以下の(i),(ii)を含む凝集体プローブと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子
(ii)sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの前記少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合するオリゴヌクレオチド
を備えたキット。 - sbpメンバーがビオチンである、請求項60に記載のキット。
- sbpメンバーの特異的結合補体がストレプトアビジンまたはアビジンである、請求項60に記載のキット。
- 核酸を検出するためのキットであって、
オリゴヌクレオチドを取り付けた基板と、基板に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第1部分に相補的な配列を有していることと、
sbpメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドであって、核酸の第2部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと、
以下の(i)〜(iii)を含む凝集体プローブと、
(i)オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも2種類のナノ粒子であって、それぞれに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合するナノ粒子
(ii)検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチド
(iii)少なくとも2つの部分を有する連結オリゴヌクレオチドであって、連結オリゴヌクレオチドの第1部分は、ハイブリダイゼーションの結果、凝集体プローブの前記少なくとも2種類のナノ粒子のうちの少なくとも1種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドと結合し、連結オリゴヌクレオチドの第2部分は、ハイブリダイゼーションの結果、sbpメンバーの特異的結合補体を結び付けたオリゴヌクレオチドに結合する連結オリゴヌクレオチド
を備えたキット。 - sbpメンバーがビオチンである、請求項63に記載のキット。
- sbpメンバーの特異的結合補体がストレプトアビジンまたはアビジンである、請求項63に記載のキット。
- ナノファブリケーションの方法であって、
選択配列を有する連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、連結オリゴヌクレオチドの各種類の配列が少なくとも2つの部分を有するステップと、
オリゴヌクレオチドを取り付けた1または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの配列の第2部分に相補的な配列を有するステップと、
2つ以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンより構成された複合体を提供するステップであって、各分子にはオリゴヌクレオチドが結び付けられ、該オリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第2部分に相補的な配列を有するステップと、
連結オリゴヌクレオチド、複合体およびナノ粒子を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドおよびビオチンに結び付けられた第1のオリゴヌクレオチドの連結オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させるステップと、から成る方法。 - ナノファブリケーションの方法であって、
(i)各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも2つの部分を有する、少なくとも1種類の連結オリゴヌクレオチド、(ii)オリゴヌクレオチドが取り付けられた少なくとも2種類のナノ粒子であって、第1種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第2種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と連結オリゴヌクレオチドの配列の第1部分に相補的な配列とを有し、第2種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第1種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と連結オリゴヌクレオチドの配列の第1部分に相補的な配列とを有するナノ粒子と、(iii)2つ以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンより構成された複合体であって、各分子にはオリゴヌクレオチドが結び付けられ、該ビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第2部分に相補的な配列を有する複合体と、を提供するステップと、
第1および第2種類のナノ粒子、連結オリゴヌクレオチド、および複合体を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの互いに対するおよび連結オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションならびに連結オリゴヌクレオチドに対する複合体のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させるステップと、から成る方法。 - ナノファブリケーションの方法であって、
(a)各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも2つの部分を有する、少なくとも1種類の連結オリゴヌクレオチド、(b)オリゴヌクレオチドが取り付けられた1または複数のナノ粒子であって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが、連結オリゴヌクレオチドの配列の第1部分に相補的な配列を有するナノ粒子、(c)オリゴヌクレオチドが結び付けられたビオチンであって、ビオチン分子に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第2部分に相補的な配列を有するビオチン、(d)ストレプトアビジンまたはアビジンを提供するステップと、
連結オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドが結び付けられたビオチン、およびナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドとが連結オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションし、複合体を形成するのに十分な条件下で接触させるステップと、
複合体を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させるステップと、から成る方法。 - ナノ材料であって、
(i)各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも2つの部分を有する、少なくとも1種類の連結オリゴヌクレオチド、(ii)オリゴヌクレオチドが取り付けられた少なくとも2種類のナノ粒子であって、第1種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第2種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と連結オリゴヌクレオチドの配列の第1部分に相補的な配列とを有し、第2種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第1種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と連結オリゴヌクレオチドの配列の第1部分に相補的な配列とを有するナノ粒子と、(iii)2つ以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンより構成された複合体であって、各分子にはオリゴヌクレオチドが結び付けられ、該ビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第2部分に相補的な配列を有する複合体と、を提供するステップと、
第1および第2種類のナノ粒子、連結オリゴヌクレオチド、および複合体を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの互いに対するおよび連結オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションならびに連結オリゴヌクレオチドに対する複合体のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させるステップと、から成る方法によって製造されたナノ材料。 - ナノ材料であって、
(a)各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも2つの部分を有する、少なくとも1種類の連結オリゴヌクレオチド、(b)オリゴヌクレオチドが取り付けられた1または複数のナノ粒子であって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが、連結オリゴヌクレオチドの配列の第1部分に相補的な配列を有するナノ粒子、(c)オリゴヌクレオチドが結び付けられたビオチンであって、ビオチン分子に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第2部分に相補的な配列を有するビオチン、(d)ストレプトアビジンまたはアビジンを提供するステップと、
連結オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドが結び付けられたビオチン、およびナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドとが連結オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションし、複合体を形成するのに十分な条件下で接触させるステップと、
複合体を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させるステップと、から成る方法によって製造された
ナノ材料。 - 少なくとも2つの部分を有する選択標的核酸を、他の核酸から分離する方法であって、
(a)各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第1部分の配列に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドを取り付けた1または複数の種類のナノ粒子、および(b)各分子に第1のオリゴヌクレオチドが結び付けられ、第1のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第2部分の配列に相補的な配列を有する、2つ以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンより構成された複合体、を提供するステップと、
選択核酸および他の核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドおよび複合体の第1のオリゴヌクレオチドの、選択核酸とのハイブリダイゼーションを許容して、続いて凝集体を形成するのを許容するのに有効な条件下でナノ粒子と接触させるステップと、
選択核酸を含む凝集体を分別するステップと、から成る方法。 - 少なくとも2つの部分を有する選択標的核酸を、他の核酸から分離する方法であって、
(a)各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第1部分の配列に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドを取り付けた1または複数の種類のナノ粒子、(b)選択核酸の第2部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結び付けたビオチン、および(c)ストレプトアビジンまたはアビジンを提供するステップと、
選択核酸および他の核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとビオチン構築物のオリゴヌクレオチドの、選択核酸とのハイブリダイゼーションを許容して、複合体を形成するのを許容するのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子およびビオチンと接触させるステップと、
ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの間の特異的結合相互作用を許容し、続いて凝集体を形成するのを許容するのに有効な条件下で、複合体を、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させるステップと、
選択核酸を含む凝集体を分別するステップと、から成る方法。
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