JP2021520423A

JP2021520423A - 蛍光シグナルを増強するための二価金属の使用

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Publication number: JP2021520423A
Application number: JP2020550719A
Authority: JP
Inventors: メリッサジャクソン; クリストファーボイス; 松居　恵理子; 恵理子松居; マイケルヴァンブラント; シャラットシン; トレイシーマトライ
Original assignee: Sony Corp; Sony Group Corp
Current assignee: Sony Corp; Sony Group Corp
Priority date: 2018-03-19
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2021-08-19
Also published as: US20210109104A1; EP3769085B1; WO2019182765A1; KR20200135424A; EP3769085A1; EP4137818A1; US11874280B2; CN112041680A

Abstract

蛍光または発色色素を含む組成物、および試料を分析するため、該組成物を二価の金属塩と組み合わせて使用する方法が開示される。

Description

本発明は、概して、間隔基を有する二量体およびポリマー蛍光または発色色素、ならびに様々な分析法における、二価または三価の金属塩と組み合わせたそれらの使用方法を対象とする。

蛍光および／または発色色素は、非常に感度の高い検出試薬が望ましい用途にとって特に好適であることが知られている。生物学的試料中の特定の成分または構成成分を優先的に標識することが可能な色素によって、研究者は、その特定の成分または構成成分の存在、量および／または位置を判定することが可能となる。さらに、特定の系は、多様な環境における、その空間的および時間的分布に関するモニタリングが行われ得る。
蛍光および比色定量方法は、化学および生物学において、非常に広範囲に普及している。これらの方法は、生体分子に関する、存在、構造、距離、配向、複合体形成および／または位置に関する有用な情報をもたらす。さらに、時間分解法は、動力学および速度の測定に使用されることが次第に増加している。その結果、核酸およびタンパク質などの生体分子の蛍光または着色標識化に関する多数の戦略が開発されてきた。生体分子の分析は、通常、水性環境で行われるので、水溶性色素の開発および使用に重点が置かれてきた。
このような色素の使用により、シグナル対ノイズ比が向上し、他の関連利益が実現するので、高蛍光性の色素または発色色素が非常に望ましい。したがって、既知の蛍光および／または発色部分からのシグナルを増大させる試みが行われてきた。例えば、２つ以上の蛍光および／または発色部分を含む二量体およびポリマー化合物は、このような化合物が、より高輝度な色素となるという期待を込めて調製されてきた。しかし、分子内蛍光が消光する結果として、公知の二量体およびポリマー色素は、輝度の望ましい向上を実現していない。

したがって、モル輝度の向上した水溶性色素を使用する方法が、当分野において必要とされている。理想的には、このような色素およびバイオマーカーを使用する方法は、強い着色または蛍光となるべきであり、様々な色および蛍光波長に利用可能であるべきである。本発明は、この必要性を満足し、さらに関連する利点を実現する。
手短に述べると、本発明の実施形態は、概して、生体分子などの分析対象分子の目視検出を可能にする蛍光および／または発色色素および／またはプローブを使用する組成物および方法、ならびにその調製のための試薬を対象とする。色素を使用する分析対象分子を目視検出する方法もまた記載されている。
実施形態では、本開示は、ａ）ｉ）２つ以上の蛍光または発色部分、ｉｉ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；およびｉｉｉ）反応性基Ｑを含むポリマー色素、ならびにｂ）二価または三価の金属塩を含む組成物を提供する。いずれの好適なポリマー色素も、本開示の任意の方法または組成物において使用され得る。
実施形態では、本開示は、ポリマー色素、標的指向性部分および二価または三価の金属塩を含む混合物を調製するステップ、ならびに共有結合性コンジュゲートを形成させるのに十分な時間および温度で該混合物を熟成させるステップを含む、ポリマー色素および標的指向性部分の共有結合性コンジュゲートを形成する方法であって、ａ）ポリマー色素が、ｉ）２つ以上の蛍光または発色部分；ｉｉ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；およびｉｉｉ）標的指向性部分の相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な反応性基Ｑを含み、ｂ）標的指向性部分が、標的分析対象に対して親和性を有しており、かつ相補性反応性基Ｑ’を含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ａ）二価または三価の金属塩の存在下で、共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させて、分析対象−標的指向性部分複合体を形成するステップであって、共有結合性コンジュゲートが、ｉ）標的分析対象に対して親和性を有しており、かつポリマー色素に対する反応性基Ｑ’の共有結合を含む標的指向性部分；ｉｉ）Ａ）２つ以上の蛍光または発色部分；Ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；およびＣ）反応性基Ｑ’と共有結合した、標的指向性部分の相補性反応性基Ｑへの共有結合を含むポリマー色素を含む、ステップ；ならびにｂ）分析対象−標的指向性部分複合体からの蛍光または発色シグナルを検出するステップを含む、標的分析対象を検出する方法を提供する。

一部の実施形態では、本開示は、ａ）共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させて、分析対象−標的指向性部分複合体を形成するステップであって、共有結合性コンジュゲートが、ｉ）標的分析対象に対して親和性を有しており、かつポリマー色素に対する反応性基Ｑ’の共有結合を含む標的指向性部分；ならびにｉｉ）Ａ）２つ以上の蛍光または発色部分；Ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；およびＣ）標的指向性部分への非共有結合上に反応性基Ｑ’と共有結合した相補性反応性基Ｑを含むポリマー色素を含む、ステップ；ｂ）分析対象−標的指向性部分複合体を二価または三価の金属塩を含む洗浄溶液で処理するステップ；ｃ）分析対象−標的指向性部分複合体からの蛍光または発色シグナルを検出するステップを含む、標的分析対象を検出する方法を提供する。
本発明のこれらの態様および他の態様が、以下の詳細な説明を参照すると明白になろう。

図面では、同一の参照番号は、同様の要素と識別する。図面における要素のサイズおよび相対位置は、必ずしも、縮尺通りに描かれておらず、これらの要素の一部は、任意に、拡大されて、図面の見易さを改善するように配置されている。さらに、図示されている要素の具体的な形状は、その具体的な要素の実際の形状に関するいかなる情報も伝えることを意図しているわけではなく、図面における認識の容易さを理由に単に選択されているに過ぎない。

５μｍおよびｐＨ９における、トリエチレングリコールスペーサーおよび比較化合物を含む代表的な化合物のＵＶ吸光度スペクトルを示すグラフである。５μｍおよびｐＨ９における、ヘキサエチレングリコールスペーサーおよび比較化合物を含む代表的な化合物のＵＶ吸光度データを示すグラフである。５０ｎＭおよびｐＨ９における、トリエチレングリコールスペーサーおよび比較化合物を含む代表的な化合物の蛍光発光スペクトルを示すグラフである。５０ｎＭおよびｐＨ９における、ヘキサエチレングリコールスペーサーおよび比較化合物を含む代表的な化合物の蛍光発光スペクトルを示すグラフである。単一フルオレセイン部分を有する比較化合物と比べた、４つのヘキサエチレングリコールスペーサーおよび２つまたは３つのフルオレセイン部分を含む代表的な化合物の５μｍにおけるＵＶ吸光度データを示すグラフである。単一フルオレセイン部分を有する比較化合物と比べた、４つのヘキサエチレングリコールスペーサーおよび２つまたは３つのフルオレセイン部分を含む代表的な化合物の５μｍにおける蛍光発光データのグラフである。様々なｍ値を有する例示化合物の比較蛍光発光応答を示すグラフである。ｍが１、２または３である「ＨＥＧ」化合物の蛍光発光を、化合物Ａと比較したデータを示すグラフである。化合物Ｉ−３２、化合物Ｉ−４６および化合物Ｂの吸光度データを示すグラフである。ＰＡＧＥによって分析した、化合物Ｉ−４２の三量体化反応の結果を示す図である。免疫蛍光法における、陽イオン構成の略図である。シグナルの増強および消光に関連する、二価金属陽イオンの構成の略図である。この略図は、陽イオンが試薬または方法に存在する方法工程において記号化されており（すなわち、コンジュゲート、溶出、保管、インキュベート、洗浄または可視化時）、例は、Ｓ＋、Ｉ＋Ｗ＋、Ｖ−である。これらの方法は、二価の陽イオンの存在が未知であるか、または微量で、消光に寄与することが知られている標準法とは対照的である。顕微鏡法における、知見、固定化および浸透性ヒトＰＢＭＣの要約を示す図である。細胞外および細胞内ＣＤ３蛍光解像度は、二価の陽イオンであるＭｇＣｌ₂のグラジエント（１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）によるインキュベートによって増強される（次に、消光する）。表面および細胞内ＣＤ３を検出するため、Ｉ−１６ＵＣＨＴ１の場合の５つの蛍光顕微鏡観察実験の一元配置ＡＮＯＶＡ統計解析を使用した解析の要約が示されている。データは、ＭｇＣｌ₂滴定（ｐＨ７．４）（範囲０〜１０００ｍＭ）の存在下での、代表的なＣＤ３発現の積分密度（任意単位）として示されている。統計学的有意性は、共通のまたは異なる文字によって表示されており、例えば；２５０ｍＭ（ａ）は、５０ｍＭ（ｂ）とは有意な差異がある一方、１０００ｍＭ（ａ）は、０ｍＭ（ａ、ｃ）とは有意な差異がない。Ｎ＝５は、同じ試験体に対して２日間で、すなわち、１日目に２回、および２日目に３回、行った個別の実験として記載されている。固定した浸透性ヒトＰＢＭＣの蛍光顕微鏡観察からの最初の例の結果を示す図である。二価の陽イオンであるＭｇＣｌ₂のグラジエント（１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）によるインキュベートによって増強された（次に、消光した）細胞外および細胞内ＣＤ３蛍光解像度。表面および細胞内ＣＤ３を検出するため、標的指向性部分（１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）とのインキュベートの間だけ、ＭｇＣｌ₂滴定（ｐＨ７．４）（範囲０〜１０００ｍＭ）を適用し、次に、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。固定した浸透性ヒトＰＢＭＣの蛍光顕微鏡観察を示す図である。二価の陽イオンであるＭｇＣｌ₂のグラジエント（５ｘＩ−３２ＵＣＨＴ１）によるインキュベートによって増強された（次に、消光した）細胞外および細胞内ＣＤ３蛍光解像度。表面および細胞内ＣＤ３を検出するため、標的指向性部分（５ｘＩ−３２ＵＣＨＴ１）とのインキュベートの間だけ、ＭｇＣｌ₂滴定を適用し（ｐＨ７．４）、次に、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。パラホルムアルデヒドで固定化した、ＣＤ３にも特異的な細胞系であるジャーカットＴ細胞の蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。二価の陽イオンであるＭｇＣｌ₂のグラジエント（１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）によるインキュベートによって増強された（次に、消光した）細胞外ＣＤ３蛍光解像度。表面および細胞内ＣＤ３を検出するため、標的指向性部分（１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）とのインキュベートの間に、ＭｇＣｌ₂滴定（ｐＨ７．４）を適用し、次に、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。表面ＣＤ３を検出するため、標的指向性部分（１０ｘＩ−５１ＵＣＨＴ１および１０ｘＩ−５６ＵＣＨＴ１）とのインキュベートの間に、ＭｇＣｌ₂滴定（ｐＨ７．４）を適用し（０〜１００ｍＭ）、次に、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した、生ジャーカットＴ細胞の結果のフローサイトメトリー結果を示すグラフである。細胞外ＣＤ３蛍光解像度は、二価の陽イオンであるＭｇＣｌ₂のグラジエント（１０ｘＩ−５１ＵＣＨＴ１および１０ｘＩ−５６ＵＣＨＴ１）とのインキュベートによって増強された。陽イオン濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）は、生細胞の完全性を保存するよう、１００ｍＭを超過しなかった。表面ＣＤ３を検出するため、標的指向性部分（１０ｘＩ−５１ＵＣＨＴ１および１０ｘＩ−５６ＵＣＨＴ１、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）とのインキュベートの間に、ＭｇＣｌ₂滴定（ｐＨ７．４）を適用し（０〜１００ｍＭ）、次に、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した、生ジャーカットＴ細胞の結果のフローサイトメトリーの繰り返し試験を示すグラフである。細胞外ＣＤ３蛍光解像度は、二価の陽イオンであるＭｇＣｌ₂のグラジエントとのインキュベートによって増強された（１０ｘＩ−５１ＵＣＨＴ１および１０ｘＩ−５６ＵＣＨＴ１、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）。陽イオン濃度は、生細胞の完全性を保存するよう、１００ｍＭを超過しなかった。抗体コンジュゲート（標的指向性部分を構築する）の新規方法と比較した、陽イオンの構成の概略図である。例えば、Ｃ−Ｅ−Ｓ−対照対Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋として表されている。実際に、これは、抗体のコンジュゲート時、ならびに０．１ＭｇＣｌ₂中での精製および溶出および保管の間に含む、水（＋０．１ＭＭｇＣｌ₂）によりマレイミド活性化部分を再懸濁することである。ヒト全血細胞のフローサイトメトリーに由来する、滴定曲線としてのシグナル増強の知見の要約例を示す図である。２つの構成におけるＣＤ３蛍光解像度が示されている。ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程工程に含まれる場合、二価の陽イオンを含ませることによってＳ／Ｎが増強される。表面ＣＤ３を検出するため、ＭｇＣｌ₂が、標的指向性部分（１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１）のコンジュゲート、溶出（精製）および保管に含まれる場合に、カリウム緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）赤血球が全血細胞（ＷＢＣ）を溶解したときの結果が示されている。結果を、ＢＤＨｏｒｉｚｏｎＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ５１５（商標）ＵＣＨＴ１およびＦＩＴＣＵＣＨＴ１と比較した。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。ヒト全血細胞のフローサイトメトリーに由来する、滴定曲線としてのシグナル増強の知見の要約例を示す図である。２つの構成におけるＣＤ３蛍光解像度が示されている。ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−２１ＡＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程工程に含まれている場合、二価の陽イオンを含ませることによってＳ／Ｎが増強される。表面ＣＤ３を検出するための標的指向性部分（１０ｘＩ−２１ＡＵＣＨＴ１）のコンジュゲート、溶出（精製）および保管にＭｇＣｌ₂が含まれる場合の、カリウム緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）赤血球が全血細胞（ＷＢＣ）を溶解したときの結果が示されている。結果を、ＢＤＨｏｒｉｚｏｎＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ５１５（商標）ＵＣＨＴ１およびＦＩＴＣＵＣＨＴ１と比較した。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。抗体濃度に対するＳ／Ｎ応答のヒストグラムとしての知見の追加例を示す図である。２つの構成におけるＣＤ３蛍光解像度が示されている。ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程工程に含まれている場合、二価の陽イオンを含ませることによってＳ／Ｎが増強される。データは、フローサイトメトリーから導き、２つの構成において、表面ＣＤ３を検出するためのＩ−１６ＵＣＨＴ１のコンジュゲートにＭｇＣｌ₂が含まれている場合、カリウム緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）赤血球はＷＢＣを溶解した：（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）および（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）であり、（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）の以前の試験と比較した。結果をＵＣＨＴ１ＦＩＴＣと比較した。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。可溶性フルオロフォア分子等量（ＭＥＳＦ）を測定するフローサイトメトリーによるビーズ対照と相互関連する蛍光強度応答曲線を示すグラフである。２つの構成における蛍光が示されている。ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程工程に含まれている場合、二価の陽イオンを含ませることによってＳ／Ｎが増強される。データは、２つの構成：（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）および（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）において、表面ＣＤ３を検出するためのＩ−１６ＵＣＨＴ１のコンジュゲートにＭｇＣｌ₂が含まれている場合の、ＷＢＣを溶解したカリウム緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）赤血球のフローサイトメトリーから導く。結果を、ＢＤＨｏｒｉｚｏｎ（商標）ＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ５１５ＵＣＨＴ１およびＦＩＴＣＵＣＨＴ１の２つのロットと比較した。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。抗体濃度に対するＳ／Ｎ応答のヒストグラムを示す図である。データは、２つの構成：（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）および（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）において、表面ＣＤ３を検出するためのＩ−１６ＵＣＨＴ１のコンジュゲートにＭｇＣｌ₂が含まれている場合の、生ジャーカットＴ細胞のフローサイトメトリーから導く。結果をＦＩＴＣＵＣＨＴ１と比較した。この場合、ネガティブ対照（陽イオン不含Ｃ−Ｅ−Ｓ）として、他の標的指向性部分Ｉ−３２、Ｉ−２１Ｂ、Ｉ−１６ＵＣＨＴ１を含ませた。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。２つの系におけるＣＤ３蛍光解像度により、ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程工程に含まれている場合、二価の陽イオンを含ませることによってＳ／Ｎが増強されることが示される。ＷＢＣにおける、抗体濃度に対するＳ／Ｎ応答のヒストグラムを示す図である。Ｉ−５１に類似した（Ｉ−４９およびＩ−１６ＵＣＨＴ１）標的指向性部分の構成（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）の３つのロットを使用して、溶出および保管が必要ではないことがあることを実証する。データは、表面ＣＤ３を検出するためのＩ−１６ＵＣＨＴ１のコンジュゲートにＭｇＣｌ₂が含まれている場合の、ＷＢＣを溶解したカリウム緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）赤血球のフローサイトメトリーから導く。結果をＩ−５１ＵＣＨＴ１およびＦＩＴＣＵＣＨＴ１と比較した。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。Ｃ＋Ｅ−Ｓ系および３つのロットにおける細胞外ＣＤ３蛍光解像度により、ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程に含まれている場合、二価の陽イオンを含ませることによって蛍光効率が増強されることが示される。表面ＣＤ３を検出するための１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１を使用する３つの陽イオン構成：（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋、Ｃ＋Ｅ−Ｓ−および対照のＣ−Ｅ−Ｓ）の比較を示す図である。データは、蛍光効率として表されている［実際のシグナル対ノイズ／理論Ｓ／Ｎ］＊１００。データは、ＭｇＣｌ₂がコンジュゲート過程に含まれている場合の、ＷＢＣを溶解したカリウム緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）赤血球のフローサイトメトリーから導く。このアッセイ物をインキュベートして、陽イオンを含有しない緩衝液で洗浄した。３つの構成における細胞外ＣＤ３発現により、ＭｇＣｌ₂が、１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１の場合のコンジュゲート過程工程に含まれている場合、二価の陽イオンを含ませることによって蛍光効率が増強されることが示される。過程構成と相互作用する場合の、溶液中の消光パターンを実証するための、複数のコンジュゲート結果を使用する２つの実験からの２つの例となる解析を示す図である。様々な陽イオン構成（Ｉ−５１ＵＣＨＴ１に類似する部分）において、ＭｇＣｌ₂を含む、およびＭｇＣｌ₂を含まないで標的指向性部分を処理し、次に、可視化時に０〜１００ｍＭのＭｇＣｌ₂滴定（ｐＨ７．４）と比較した。二価の陽イオンＭｇＣｌ₂の滴定によりすべての構成を消光しながら、ＭｇＣｌ₂で処理した標的指向性部分を事前消光した。第１の例では、Ｎ＝３の反復読取り数、およびＮ＝１の、１つの基あたりのコンジュゲート数の場合についてプロットして、（Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋）を調べる。第２の例では、Ｎ＝３の反復読取り数、Ｎ＝４の、１つの基あたりのコンジュゲート数の場合について解析し、複数の過程構成をＭｇＣｌ₂によるもの、およびＭｇＣｌ₂によらないものに群分けした。エラーバーは、１ＳＤＥＶを表す。コンジュゲート時に回収されたポリマー−色素部分、すなわちコンジュゲート効率は、ＭｇＣｌ₂が、ＭｇＣｌ₂構成Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋およびＣ＋Ｅ−Ｓ−を使用するＩ−１６ＵＣＨＴ１の構築過程に含まれる場合、より高くなることが観察される。データは、ポリマー色素のＭ当量での［測定された実際の標識化度／理論標識化度］＊１００＝回収％として表す。ベースライン過程より上にある回収の改善率（ｐｅｒｅｃｅｎｔ）が記されている。データは、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計を使用する蛍光のインビトロでの測定値から導き、３つのコンジュゲート、および色素濃度を定量するＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの法則の適用からまとめたものである。フローサイトメトリーにおけるジャーカットＴ細胞の取得（可視化）の間に、二価の陽イオンの排除によって増強された細胞外ＣＤ３蛍光解像度を示す図である（１０ｘＩ−５１ＵＣＨＴ１）。図２７Ａは、微量のカルシウムおよびマグネシウムを含有する緩衝溶液（ｐＨ７．４）と比較した、データ取得（蛍光可視化）の間の、フローサイトメトリーによるジャーカットＴ細胞の染色、および二価の陽イオンを排除することにより増強されるＳ／Ｎを示す。図２７Ｂは、二価の陽イオンの排除によって増強される、またはプレートの読み取り（蛍光可視化）中に微量のカルシウムおよびマグネシウムを含有する場合に消光される、溶液中での蛍光発光強度を示す。１０ｘＩ−５１ＵＣＨＴ１をこの分析に使用した。陽イオンを含む緩衝液（ｐＨ７．４）を使用した場合の、消光パターンの結果を示すグラフである。１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１を用いる実験において、２つのＭｇＣｌ₂過程構成（Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋から２つのロットおよびＣ−Ｅ−Ｓ−から１つのロット）を使用した。データは、ＣＤＣｈｅｘＰｌｕｓ（商標）安定化全血細胞（固定）、および溶解物固定溶液で溶解、洗浄および様々な緩衝液中で可視化した赤血球のフローサイトメトリーの蛍光強度中央値から導出したＳ／Ｎとして表す。試験体はすべて、アッセイの終わりまで同様に取り扱い、次に、３つの試料に分割して、洗浄し、３つの典型的なフローサイトメトリー緩衝液（陽イオン不含、陽イオンを微量に含む、または５０ｍＭの陽イオンを含む場合のいずれか）に再懸濁した。取得（可視化）中のＭｇＣｌ₂の二価の陽イオンおよび１０ｘＩ−１６ＵＣＨＴ１（３つのロット）を排除することによって増強された細胞外ＣＤ３蛍光解像度。

以下の記載において、ある種の具体的な詳細は、本発明の様々な実施形態の完全な理解をもたらすために説明される。しかし、当業者は、本発明は、これらの詳細なしに行われ得ることを理解していよう。
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変化形は、オープンな包括的な意味、すなわち、「以下に限定されないが、含む」として解釈されるべきである。
本明細書全体を通じて、「一実施形態」または「ある１つの実施形態」という場合、これらの実施形態に関連して記載されている、特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書の全体における様々な位置における、「一実施形態では」または「ある１つの実施形態では」という言い回しが現れる場合、必ずしも、すべてが、同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１つまたは複数の実施形態における、任意の好適な方法において組み合わされ得る。

「アミノ」とは、−ＮＨ₂基を指す。
「カルボキシ」とは、−ＣＯ₂Ｈ基を指す。
「シアノ」とは、−ＣＮ基を指す。
「ホルミル」とは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ基を指す。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」とは、−ＯＨ基を指す。
「イミノ」とは、＝ＮＨ基を指す。
「ニトロ」とは、−ＮＯ₂基を指す。
「オキソ」とは、＝Ｏ置換基を指す。
「スルフヒドリル」とは、−ＳＨ基を指す。
「チオキソ」とは、＝Ｓ基を指す。

「アルキル」とは、不飽和を含まず、１〜１２個の炭素原子（Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキル）、１〜８個の炭素原子（Ｃ₁−Ｃ₈アルキル）または１〜６個の炭素原子（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）を有する、炭素および水素原子のみからなる直鎖状または分岐状の炭化水素鎖の基であって、単結合によって分子の残りに結合している炭化水素鎖の基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシルなどを指す。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルキル基は、置換されていてもよい。
「アルキレン」または「アルキレン鎖」とは、不飽和を含まず、１〜１２個の炭素原子を有する、炭素および水素のみからなる、分子の残りをラジカル基に連結する、二価の直鎖状または分岐状炭化水素鎖、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレン、プロピニレン、ｎ−ブチニレンなどを指す。アルキレン鎖は、単結合を介して分子の残りに、および単結合を介してラジカル基に結合している。分子の残りおよびラジカル基へのアルキレン鎖の結合点は、この鎖内の１個の炭素または任意の２個の炭素を介することができる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルキレンは、置換されていてもよい。

「アルケニレン」または「アルケニレン鎖」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含み、２〜１２個の炭素原子を有する、炭素および水素のみからなる、分子の残りをラジカル基に連結する、二価の直鎖状または分岐状炭化水素鎖、例えば、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレンなどを指す。アルケニレン鎖は、単結合を介して分子の残りに、および二重結合または単結合を介してラジカル基に結合している。分子の残りおよびラジカル基へのアルケニレン鎖の結合点は、この鎖内の１個の炭素または任意の２個の炭素を介することができる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルケニレンは、置換されていてもよい。
「アルキニレン」または「アルキニレン鎖」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含み、２〜１２個の炭素原子を有する、炭素および水素のみからなる、分子の残りをラジカル基に連結する、二価の直鎖状または分岐状炭化水素鎖、例えば、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレンなどを指す。アルキニレン鎖は、単結合を介して分子の残りに、および二重結合または単結合を介してラジカル基に結合している。アルキニレン鎖の、分子の残りおよびラジカル基への結合点は、この鎖内の１個の炭素または任意の２個の炭素を介することができる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルキニレンは、置換されていてもよい。

「アルキルエーテル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素結合が、炭素−酸素結合により置き換えられている、上で定義されている任意のアルキル基を指す。炭素−酸素結合は、末端（アルコキシ基のように）に存在していてもよく、または炭素酸素結合は内部（すなわち、Ｃ−Ｏ−Ｃ）に存在していてもよい。アルキルエーテルは、少なくとも１つの炭素酸素結合を含むが、１つより多く含むことがある。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、アルキルエーテルの意味の範囲内に含まれている。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルキルエーテル基は置換されていてもよい。例えば、一部の実施形態では、アルキルエーテルは、アルコールまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cにより置換されており、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。
「アルコキシ」とは、式−ＯＲ_aの基を指し、Ｒ_aは、１〜１２個の炭素原子を含有する、上で定義したアルキル基である。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルコキシ基は置換されていてもよい。

「アルコキシアルキルエーテル」とは、式−ＯＲ_aＲ_bの基を指し、Ｒ_aは、１〜１２個の炭素原子を含有する、上で定義したアルキレン基であり、Ｒｂは、本明細書で定義されているアルキルエーテル基である。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アルコキシアルキルエーテル基は置換されていてもよく、例えば、アルコールまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cにより置換されており、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。
「ヘテロアルキル」とは、アルキル基内、またはアルキル基の末端において、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、ＰまたはＳ）を含む、上で定義したアルキル基を指す。一部の実施形態では、ヘテロ原子は、アルキル基内に存在する（すなわち、ヘテロアルキルは、少なくとも１個の炭素−［ヘテロ原子］_x−炭素結合を含み、ｘは、１、２または３である）。他の実施形態では、ヘテロ原子は、アルキル基の末端に存在し、こうして、このアルキル基を分子の残りに結合させるよう働く（例えば、Ｍ１−Ｈ−Ａであり、Ｍ１は、分子の一部であり、Ｈは、ヘテロ原子であり、Ａは、アルキル基である）。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ヘテロアルキル基は置換されていてもよい。例示的なヘテロアルキル基には、ホスホジエステル結合などのリン−酸素結合を含んでもよい、エチレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド）が含まれる。

「ヘテロアルコキシ」とは、式−ＯＲ_aの基を指し、Ｒ_aは、１〜１２個の炭素原子を含有する、上で定義したヘテロアルキル基である。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ヘテロアルコキシ基は、置換されていてもよい。
「ヘテロアルキレン」とは、アルキレン鎖内、またはアルキレン鎖の末端において、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、ＰまたはＳ）を含む、上で定義したアルキレン基を指す。一部の実施形態では、ヘテロ原子は、アルキレン鎖内に存在する（すなわち、ヘテロアルキレンは、少なくとも１個の炭素−［ヘテロ原子］−炭素結合を含み、ｘは、１、２または３である）。他の実施形態では、ヘテロ原子は、アルキレンの末端に存在し、こうして、このアルキレンを分子の残りに結合させるよう働く（例えば、Ｍ１−Ｈ−Ａ−Ｍ２であり、Ｍ１およびＭ２は、分子の部分であり、Ｈは、ヘテロ原子であり、Ａは、アルキレンである）。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ヘテロアルキレン基は置換されていてもよい。例示的なヘテロアルキレン基には、エチレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド）、および以下に例示されている「Ｃ」連結基が含まれる。

「Cリンカー」
ヘテロアルキレンリンカーの様々な実施形態には、上記のＣ−リンカーの多量体が含まれる。
「ヘテロアルケニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、上で定義したヘテロアルキレンである。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ヘテロアルケニレン基は置換されていてもよい。
「ヘテロアルキニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、ヘテロアルキレンである。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ヘテロアルキニレン基は置換されていてもよい。

「ヘテロ原子リンカー」に関連する「ヘテロ原子」とは、１個または複数のヘテロ原子からなる、リンカー基を指す。例示的なヘテロ原子リンカーには、Ｏ、Ｎ、ＰおよびＳからなる群から選択される単一原子、ならびに複数のヘテロ原子、例えば、式−Ｐ（Ｏ^-）（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＰ（Ｏ^-）（＝Ｏ）Ｏ−を有するリンカーおよび多量体、ならびにそれらの組合せが含まれる。
「ホスフェート」とは、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ_a）Ｒ_b基（Ｒ_aは、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ_cであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-、ＯＲ_cである）、チオホスフェート基、またはさらなるホスフェート基（Ｒ_cは、対イオン（例えば、Ｎａ＋など）である）を指す。
「ホスホアルキル」とは、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ_a）Ｒ_b基を指し、Ｒ_aは、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ_cであり、Ｒ_bは、−Ｏアルキルであり、Ｒ_cは、対イオン（例えば、Ｎａ＋など）である。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ホスホアルキル基は置換されていてもよい。例えば、ある種の実施形態では、ホスホアルキル基中の−Ｏアルキル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテル、チオホスホアルキルエーテルまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cのうちの１つまたは複数により置換されていてもよく、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。

「ホスホアルキルエーテル」とは、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ_a）Ｒ_b基を指し、Ｒ_aは、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ_cであり、Ｒ_bは、−Ｏアルキルエーテルであり、Ｒ_cは、対イオン（例えば、Ｎａ＋など）である。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ホスホアルキルエーテル基は置換されていてもよい。例えば、ある種の実施形態では、ホスホアルキルエーテル基中の−Ｏアルキルエーテル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテル、チオホスホアルキルエーテルまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cのうちの１つまたは複数により置換されていてもよく、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。
「チオホスフェート」とは_、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c基を指し、Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＳＲ_d、ホスフェート基、またはさらなるチオホスフェート基であり、Ｒ_dは、対イオン（例えば、Ｎａ＋など）であり、ただし、ｉ）Ｒ_aはＳである、ｉｉ）Ｒ_bはＳ^-もしくはＳＲ_dである、ｉｉｉ）Ｒ_cは、ＳＨ、Ｓ^-もしくはＳＲ_dである、またはｉｖ）ｉ）、ｉｉ）および／もしくはｉｉｉ）の組合せであることを条件とする。

「チオホスホアルキル」とは、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c基を指し、Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、Ｒ_cは、−Ｏアルキルであり、Ｒ_dは、対イオン（例えば、Ｎａ＋など）であり、ただし、ｉ）Ｒ_aはＳである、ｉｉ）Ｒ_bは、Ｓ^-もしくはＳＲ_dである、またはｉｉｉ）Ｒ_aは、Ｓであり、Ｒ_bは、Ｓ^-もしくはＳＲ_dであることを条件とする。本明細書において特に具体的に明記しない限り、チオホスホアルキル基は置換されていてもよい。例えば、ある種の実施形態では、チオホスホアルキル基中の−Ｏアルキル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテル、チオホスホアルキルエーテルまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cのうちの１つまたは複数により置換されていてもよく、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。

「チオホスホアルキルエーテル」とは、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c基を指し、Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、Ｒ_cは、−Ｏアルキルエーテルであり、Ｒ_dは、対イオン（例えば、Ｎａ＋など）であり、ただし、ｉ）Ｒ_aはＳである、ｉｉ）Ｒ_bは、Ｓ^-もしくはＳＲ_dである、またはｉｉｉ）Ｒ_aは、Ｓであり、Ｒ_bは、Ｓ^-もしくはＳＲ_dであることを条件とする。本明細書において特に具体的に明記しない限り、チオホスホアルキルエーテル基は置換されていてもよい。例えば、ある種の実施形態では、チオホスホアルキル基中の−Ｏアルキルエーテル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテル、チオホスホアルキルエーテルまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cのうちの１つまたは複数により置換されていてもよく、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。
「炭素環式」とは、３〜１８個の炭素原子を含む、安定な３〜１８員の芳香族または非芳香族環を指す。本明細書において特に具体的に明記しない限り、炭素環式環は、単環式、二環式、三環式または四環式環系とすることができ、これらは、縮合または架橋環系を含んでもよく、部分または完全飽和であってもよい。非芳香族カルボシクリルラジカルには、シクロアルキルが含まれる一方、芳香族カルボシクリルラジカルには、アリールが含まれる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、炭素環式基は置換されていてもよい。
「シクロアルキル」とは、安定な非芳香族単環式または多環式炭素環式環を指し、これらは、３〜１５個の炭素原子、好ましくは３〜１０個の炭素原子を有する、飽和または不飽和な縮合または架橋環系であって、単結合によって分子の残りに結合している、縮合または架橋環系を含んでもよい。単環式シクロアルキル（ｃｙｃｌｏｃａｌｋｙｌ）には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル（ｃｙｃｌｏｈｅｐｔｌｙ）およびシクロオクチルが含まれる。多環式シクロアルキルには、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７−ジメチル−ビシクロ−［２．２．１］ヘプタニルなどが含まれる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、シクロアルキル基は置換されていてもよい。

「アリール」とは、少なくとも１つの炭素環式芳香族環を含む環系を指す。一部の実施形態では、アリールは、６〜１８個の炭素原子を含む。アリール環は、単環式、二環式、三環式または四環式環系であってもよく、これらは、縮合または架橋環系を含んでもよい。アリールには、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレンおよびトリフェニレンから誘導されるアリールが含まれる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、アリール基は置換されていてもよい。

「複素環式」は、１〜１２個の炭素原子、ならびに窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜６個のヘテロ原子を含む、安定な３〜１８員の芳香族または非芳香族環を指す。本明細書において特に具体的に明記しない限り、複素環式環は、単環式、二環式、三環式または四環式環系であってもよく、これらは、縮合または架橋環系を含んでもよく、複素環式環中の窒素、炭素または硫黄原子は、酸化されていてもよい。窒素原子は四級化されていてもよい。複素環式環は、部分または完全飽和であってもよい。芳香族複素環式環の例は、ヘテロアリールの定義において、以下に列挙されている（すなわち、ヘテロアリールは、複素環式の部分集合である）。非芳香族複素環式環の例には、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾロピリミジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリオキサニル、トリチアニル、トリアジナニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソ−チオモルホリニルおよび１，１−ジオキソ−チオモルホリニルが含まれる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、複素環式基は置換されていてもよい。

「ヘテロアリール」とは、１〜１３個の炭素原子、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜６個のヘテロ原子、および少なくとも１つの芳香族環を含む、５〜１４員の環系を指す。本発明のある種の実施形態の目的のため、ヘテロアリールラジカルは、単環式、二環式、三環式または四環式環系であってもよく、これらは、縮合または架橋環系を含んでもよく、ヘテロアリールラジカル中の窒素、炭素または硫黄原子は、酸化されていてもよく、窒素原子は、四級化されていてもよい。例には、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、ベンゾオキサゾリノニル、ベンゾイミダゾールチオニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、１−オキシドピリジニル、１−オキシドピリミジニル、１−オキシドピラジニル、１−オキシドピリダジニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プテリジノニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリジノニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリミジノニル（ｐｒｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｙｌ）、ピリダジニル、ピロリル、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジノニル、キナゾリニル、キナゾリノニル、キノキサリニル、キノキサリノニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オニル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルおよびチオフェニル（すなわち、チエニル）が含まれる。本明細書において特に具体的に明記しない限り、ヘテロアリール基は置換されていてもよい。

「縮合した」とは、少なくとも２つの環を含む環系を指し、２つの環は、少なくとも１個の共通の環原子、例えば、２つの共通の環原子を共有する。縮合環が、ヘテロシクリル環またはヘテロアリール環である場合、共通の環原子は、炭素または窒素とすることができる。縮合環は、二環式、三環式、四環式（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｃ）などを含む。

本明細書に使用されている用語「置換されている」は、上記の基（例えば、アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ヘテロアルキル、ヘテロアルコキシ、ホスホアルキル、ホスホアルキルエーテル、チオホスホアルキル、チオホスホアルキルエーテル、炭素環式、シクロアルキル、アリール、複素環式および／またはヘテロアリール）のいずれかを意味し、少なくとも１個の水素原子（例えば、１個、２個、３個またはすべての水素原子）が、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩなどのハロゲン原子；ヒドロキシル基、アルコキシ基およびエステル基などの基中の酸素原子；チオール基、チオアルキル基、スルホン基、スルホニル基およびスルホキシド基などの基中の硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミドおよびエナミンなどの基中の窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基およびトリアリールシリル基などの基中のケイ素原子；ならびに様々な他の基中の他のヘテロ原子などの非水素原子への結合によって置き換えられている。「置換されている」はまた、１個または複数の水素原子が、オキソ、カルボニル、カルボキシルおよびエステル基中の酸素、ならびにイミン、オキシム、ヒドラゾンおよびニトリルなどの基中の窒素などのヘテロ原子への高次結合（例えば、二重または三重結合）によって置き換えられている上記の基のいずれかを意味する。例えば、「置換されている」には、１個または複数の水素原子が、−ＮＲ_gＲ_h、−ＮＲ_gＣ（＝Ｏ）Ｒ_h、−ＮＲ_gＣ（＝Ｏ）ＮＲ_gＲ_h、−ＮＲ_gＣ（＝Ｏ）ＯＲ_h、−ＮＲ_gＳＯ₂Ｒ_h、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ_gＲ_h、−ＯＲ_g、−ＳＲ_g、−ＳＯＲ_g、−ＳＯ₂Ｒ_g、−ＯＳＯ₂Ｒ_g、−ＳＯ₂ＯＲ_g、＝ＮＳＯ₂Ｒ_gおよび−ＳＯ₂ＮＲ_gＲ_hによって置き換えられている、上記の基のいずれかが含まれる。「置換されている」はまた、１個または複数の水素原子が、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ_g、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ_g、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_gＲ_h、−ＣＨ₂ＳＯ₂Ｒ_g、−ＣＨ₂ＳＯ₂ＮＲ_gＲ_hによって置き換えられている上記の基のいずれかを意味する。上述において、Ｒ_gおよびＲ_hは、同一であるかまたは異なっており、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリールおよび／またはヘテロアリールアルキルである。「置換されている」は、１個または複数の水素原子が、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、イミノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリールおよび／またはヘテロアリールアルキル基への結合によって置き換えられている、上記の基のいずれかをさらに意味する。一部の実施形態では、任意に用いてもよい置換基は、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cはそれぞれ、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。さらに、上述の置換基のそれぞれも、上記の置換基のうちの１つまたは複数により置換されていてもよい。

「共役」とは、介在するシグマ結合全体に、１つのｐ軌道と別のｐ軌道とに重なりがあることを指す。共役は、環式または非環式化合物に起こり得る。「共役度」とは、介在するシグマ結合全体に、少なくとも１つのｐ軌道と別のｐ軌道とに重なりがあることを指す。例えば、１，３−ブタジエンは、一共役度を有する一方、ベンゼンおよび他の芳香族化合物は、通常、複数の共役度を有する。蛍光および発色化合物は、通常、少なくとも一共役度を含む。
「蛍光」とは、特定の周波数の光を吸収して、異なる周波数の光を放出することが可能な分子を指す。蛍光は、当業者に周知である。
「発色」とは、有色スペクトル（すなわち、赤色、黄色、青色など）内の光を吸収する分子を指す。
「リンカー」とは、炭素、酸素、窒素、硫黄、リンおよびそれらの組合せなどの少なくとも１個の原子の連続鎖であって、分子のある部分を同一分子の別の部分に、または異なる分子、部分もしくは固体支持体（例えば、マイクロ粒子）に連結させる連続鎖を指す。リンカーは、イオン性相互作用または水素結合相互作用などの、共有結合または他の手段を介して分子に連結することができる。

用語「生体分子」は、核酸、炭水化物、アミノ酸、ポリペプチド、グリコタンパク質、ホルモン、アプタマーおよびそれらの混合物を含めた、様々な生体物質のいずれかを指す。より詳細には、この用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾または誘導ヌクレオチド、酵素、受容体、プリオン、受容体リガンド（ホルモンを含む）、抗体、抗原および毒素、ならびに細菌、ウイルス、血液細胞および組織細胞を含むことが意図されている。本発明の目視により検出可能な生体分子（例えば、構造（Ｉ）の化合物に連結した生体分子を有する構造（Ｉ）の化合物）は、本明細書にさらに記載されている通り、生体分子を、該生体分子上のアミノ、ヒドロキシ、カルボキシルまたはスルフヒドリル基などの任意の利用可能な原子または官能基を介して、生体分子を本化合物に結合させることを可能にする反応性基を有する化合物に接触させることによって調製される。

「反応性基」は、例えば、置換、酸化、還元、付加または環化付加反応によって、第２の反応性基（例えば、「相補性反応性基」）と反応して、１つまたは複数の共有結合を形成することができる部分である。例示的な反応性基が、表１に提示されており、例えば、求核剤、求電子剤、ジエン、求ジエン体、アルデヒド、オキシム、ヒドラゾン、アルキン、アミン、アジド、アシルアジド、アシルハライド、ニトリル、ニトロン、スルフヒドリル、ジスルフィド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、イミドエステル、活性化エステル、ケトン、α，β−不飽和カルボニル、アルケン、マレイミド、α−ハロイミド、エポキシド、アジリジン、テトラジン、テトラゾール、ホスフィン、ビオチン、チイランなどを含む。
用語「目視可能な」および「目視により検出可能な」は、本明細書において、事前の照射、または化学的もしくは酵素的活性化なしに、目視検査によって観察可能な物質を指すために使用される。このような目視により検出可能な物質は、約３００〜約９００ｎｍの範囲のスペクトル領域の光を吸収して、放出する。好ましくは、このような物質は、強く色を呈し、好ましくは、少なくとも約４０，０００、より好ましくは少なくとも約５０，０００Ｍ、さらにより好ましくは少なくとも約６０，０００、さらにより好ましくは少なくとも約７０，０００および最も好ましくは少なくとも約８０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1のモル吸光係数を有する。本発明の化合物は、裸眼による観察、または吸収スペクトル光度計、透過型光学顕微鏡、デジタルカメラおよびスキャナを含めた光学に基づく検出デバイスを用いる観察によって検出され得る。目視により検出可能な物質は、可視スペクトルの光を発光および／または吸収するものに限定されない。紫外線（ＵＶ）領域（約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ）、赤外（ＩＲ）領域（約７００ｎｍ〜約１ｍｍ）の光を放出および／または吸収する物質、ならびに電磁スペクトルの他の領域において放出および／または吸収する物質も、「目視により検出可能な」物質の範囲内に含まれる。

本発明の実施形態の目的のため、用語「光安定性可視色素」とは、本明細書の上で定義されている通り、目視により検出可能であり、かつ光への曝露時に有意には改変または分解しない化学部分を指す。好ましくは、光安定性可視色素は、少なくとも１時間の光への曝露後に、有意な脱色または分解を示さない。より好ましくは、可視色素は、少なくとも１２時間、さらにより好ましくは少なくとも２４時間、さらにより好ましくは少なくとも１週間、最も好ましくは少なくとも１か月間の光への曝露後に安定である。本発明の化合物および方法に使用するのに好適な光安定性可視色素の例は、アゾ色素、チオインジゴ色素、キナクリドン顔料、ジオキサジン、フタロシアニン、ペリノン、ジケトピロロピロール、キノフタロンおよびトリアリールカルボニウム（ｔｒｕａｒｙｃａｒｂｏｎｉｕｍ）を含む。

本明細書で使用する場合、用語「ペリレン誘導体」は、目視により検出可能な任意の置換ペリレンを含むことが意図されている。しかし、この用語は、ペリレンそれ自体を含むことを意図するものではない。用語「アントラセン誘導体」、「ナフタレン誘導体」、および「ピレン誘導体」は、類似的に使用される。一部の好ましい実施形態では、誘導体（例えば、ペリレン、ピレン、アントラセンまたはナフタレン誘導体）は、ペリレン、アントラセン、ナフタレンまたはピレンのイミド、ビスイミドまたはヒドラザムイミド（ｈｙｄｒａｚａｍｉｍｉｄｅ）誘導体である。

本発明の様々な実施形態の目視により検出可能な分子は、特定の分析対象（例えば、生体分子）の存在、位置または量を決定することが必要な、生化学的および生物医学的用途などの幅広い種類の分析用途に有用である。したがって、別の態様では、本発明は、生体分子を目視検出する方法であって、（ａ）生体分子に連結している構造（Ｉ）の化合物を含む目視により検出可能な生体分子を生物系に供するステップ、および（ｂ）その可視特性により生体分子を検出するステップを含む方法を提供する。本発明の目的のために、言い回し「その可視特性によって生体分子を検出する」とは、照射、または化学的もしくは酵素的活性化なしに、生体分子を、裸眼により、または吸収スペクトル光度計、透過型光学顕微鏡、デジタルカメラおよびスキャナを含めた光学に基づく検出デバイスを用いて観察されることを意味する。密度計を使用して、存在する目視により検出可能な生体分子の量を定量することができる。例えば、２つの試料中の生体分子の相対量は、相対光学密度を測定することによって決定することができる。生体分子あたりの色素分子の化学量論が既知であり、かつ色素分子の吸光係数が既知である場合、生体分子の絶対濃度は、光学密度の測定値から求めることもできる。本明細書で使用する場合、用語「生物系」は、目視により検出可能な生体分子に加えて、１つまたは複数の生体分子を含む任意の溶液または混合物を指すために使用される。そのような生物系の例には、細胞、細胞抽出物、組織試験体、電気泳動用ゲル、アッセイ混合物およびハイブリッド化反応混合物が含まれる。
「固体支持体」とは、分子の固相支持体のための、当分野で公知の任意の固体基材を指し、例えば、「マイクロ粒子」とは、ガラス製ビーズ、磁気ビーズ、ポリマー製ビーズ、非ポリマー製ビーズなどを含めた、本発明の化合物への結合に有用ないくつかの小型粒子のいずれかを指す。ある種の実施形態では、マイクロ粒子はポリスチレン製ビーズを含む。
「固体支持体残基」とは、分子が固体支持体から開裂すると、分子への結合状態を維持する官能基を指す。固体支持体残基は、当分野で公知であり、固体支持体の構造および固体支持体に分子を連結させる基に基づいて容易に誘導することができる。

「標的指向性部分」とは、分析対象分子などの特定の標的に選択的に結合するか、またはこれと会合する部分である。「選択的に」結合するまたは会合するとは、標的指向性部分が、他の標的に比べて所望の標的に優先的に会合するかまたは結合することを意味する。一部の実施形態では、本明細書において開示されている化合物は、この化合物が目的とする分析対象（すなわち、標的指向性部分の標的）に選択的に結合または会合する目的のための標的指向性部分への連結基を含み、こうして分析対象の検出が可能になる。例示的な標的指向性部分には、抗体、抗原、核酸配列、酵素、タンパク質、細胞表面受容体アンタゴニストなどが含まれる。一部の実施形態では、標的指向性部分は、細胞表面または細胞中の標的特徴部、例えば細胞膜または他の細胞の構造表面の標的特徴部に選択的に結合または会合する抗体などの部分であり、こうして目的細胞の検出が可能となる。所望の分析対象に選択的に結合または会合する低分子は、ある種の実施形態では、標的指向性部分としても企図される。当業者は、様々な実施形態において有用な他の分析対象および対応する標的指向性部分を理解しているであろう。

「塩基対部分」とは、水素結合を介して、相補性複素環式部分とハイブリダイズすることが可能な複素環式部分を指す（例えば、ワトソン−クリック塩基対）。塩基対部分は、天然および非天然塩基を含む。塩基対部分の例は、アデノシン、グアノシン、チミジン、シトシンおよびウリジン、ならびにそれらの類似体などの（ｓｕｃｈ）ＲＮＡおよびＤＮＡ塩基である。
本明細書において開示されている本発明の実施形態はまた、１個または複数の原子が異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられることによって、同位体標識されている構造（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物のすべてを包含することが意図されている。開示されている化合物に組み込まれ得る同位体の例には、それぞれ、²Ｈ、³Ｈ、¹¹Ｃ、¹³Ｃ、¹⁴Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｎ、¹⁵Ｏ、¹⁷Ｏ、¹⁸Ｏ、³¹Ｐ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁸Ｆ、³⁶Ｃｌ、¹²³Ｉおよび¹²⁵Ｉなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、塩素およびヨウ素の同位体が含まれる。
構造（Ｉ）または（ＩＩ）の同位体標識化合物は、一般に、当業者に公知の従来技法によって、または以前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して、以下および以下の実施例に記載されているものに類似した方法によって一般に調製することができる。

「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物から有用な純度の程度までの単離および有効な治療剤への製剤化に分解しない（ｓｕｒｖｉｖｅ）ほど十分に頑強な化合物を示すことが意図されている。
「任意に用いてもよい（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「してもよい（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に記載されている事象または状況が発生することがあるか、または発生しないことがあること、ならびにこの記載が、前記事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「置換されていてもよいアルキル」は、このアルキル基が置換されていてもよいこと、または置換されていなくてもよいこと、およびこの記載は置換アルキル基と置換を有していないアルキル基の両方を含むことを意味する。
「塩」は、酸付加塩と塩基付加塩の両方を含む。
「酸付加塩」とは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、シヨウノウ酸、カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサルチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などの有機酸と共に形成される塩を指す。

「塩基付加塩」とは、無機塩基または有機塩基の遊離酸への付加から調製される塩を指す。無機塩基に由来する塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などが含まれる。有機塩基に由来する塩には、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの、天然置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂を含めた、一級、二級および三級アミン、置換アミンの塩が含まれる。特に、好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。

結晶化は、本明細書において記載されている化合物の溶媒和物を生じることがある。本発明の実施形態は、記載されている化合物の溶媒和物のすべてを含む。本明細書で使用する場合、用語「溶媒和物」とは、本発明の化合物の１つまたは複数の分子と溶媒の１つまたは複数の分子を含む凝集物を指す。溶媒は水であってもよく、この場合、溶媒和物は水和物となり得る。代替的に、溶媒は、有機溶媒であってもよい。したがって、本発明の化合物は、一水和物、二水和物、ヘミ水和物、セスキ水和物、三水和物、四水和物など、ならびに対応する溶媒和物形態を含めた、水和物として存在することがある。本発明の化合物は、真の溶媒和物であってもよい一方、他の場合では、本発明の化合物は、単に偶発的な水または別の溶媒を保持することがあるか、または水とある偶発的な溶媒との混合物であってもよい。

本発明の化合物（例えば、構造ＩまたはＩＩの化合物）、またはその塩、互変異性体もしくは溶媒和物の実施形態は、１個または複数の不斉中心を含むことがあり、したがって、絶対立体化学に関して、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−、またはアミノ酸の場合、（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−と定義され得る、鏡像異性体、ジアステレオマーおよび他の立体異性体が生じることがある。本発明の実施形態は、すべてのこのような可能な異性体、ならびにそのラセミ体および光学的に純粋な形態を含むことが意図されている。光学活性な（＋）および（−）、（Ｒ）−および（Ｓ）−、または（Ｄ）−および（Ｌ）−異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製することができるか、または従来の技法、例えばクロマトグラフィーおよび分別結晶化を使用して分割され得る。個々の鏡像異性体の調製／単離に関する従来の技法には、好適な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、または例えば、キラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用するラセミ体（または、塩もしくは誘導体のラセミ体）の分割が含まれる。本明細書において記載されている化合物が、オレフィン性二重結合または幾何学的不斉の他の中心を含有している場合、および特に指定しない限り、本化合物は、ＥおよびＺ幾何異性体の両方を含むことが意図されている。同様に、互変異性体のすべてが、含まれることも意図されている。

「立体異性体」とは、同じ結合によって結合した同一原子から構成されているが、相互変換することができない異なる三次元構造を有する化合物を指す。本発明は、様々な立体異性体およびそれらの混合物を企図しており、２つの立体異性体であって、それらの分子が互いに重なり合わない鏡像である、２つの立体異性体を指す「鏡像異性体」を含む。
「互変変異性体」とは、分子の１個の原子から同一分子の別の原子へのプロトン移動を指す。本発明は、任意の前記化合物の互変異性体を含む。本化合物の様々な互変異性体は、当業者によって容易に誘導可能である。
本明細書において使用される化学命名プロトコールおよび構造略図は、ＡＣＤ／命名バージョン９．０７ソフトウェアプログラムおよび／またはＣｈｅｍＤｒａｗＵｌｔｒａバージョン１１．０ソフトウェア命名プログラム（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ）を使用する、Ｉ．Ｕ．Ｐ．Ａ．Ｃ．命名法システムの修正版である。当業者が精通している一般名称も使用する。

上記の通り、本発明の一実施形態では、様々な分析法における蛍光および／または発色色素として有用な化合物が提供される。他の実施形態では、蛍光および／または発色色素として有用な化合物を調製する合成中間体として有用な化合物が提供される。一般用語では、本発明の実施形態は、蛍光および／または発色部分の二量体以上のポリマーを対象としている。蛍光および／または発色部分は、連結部分によって連結される。理論に拘泥することを望むものではないが、リンカーは、蛍光および／または発色部分の間に十分な空間距離を維持する一助となり、こうして、分子内消光が低減されるかまたはなくなり、こうして、高モル濃度「輝度」（例えば、高蛍光発光）を有する色素化合物をもたらすと考えられる。
上述の化合物のいずれか、および１つまたは複数の分析対象分子（例えば、生体分子）を含む組成物は、様々な他の実施形態において提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数の分析対象分子を検出するための分析法における、このような組成物の使用も提供される。

有利なことに、本発明者らは、二価または三価の金属塩（例えば、ＭｇＣｌ₂）が、電荷遮蔽および安定化のために、特定のポリマー色素と組み合わせて使用することができることを発見した。ある種の条件下では、１種もしくは複数の二価または三価の金属塩と本開示のポリマー色素とを組み合わせると、コンジュゲート、溶出、保管に使用した場合、またはインキュベートの間の、標的指向性部分の親和性が改善される。驚くべきことに、本発明者らは、二価または三価の金属塩は、溶液中、および試料を取得する間に存在する場合、このようなポリマー色素を消光することができることを見いだした。
理論に拘泥することを望むものではないが、二価または三価の金属塩（例えば、ＭｇＣｌ₂）は、存在する場合、色素および／または標的指向性部分の親和性を改変することができ、こうして、本開示のポリマー色素の抗体コンジュゲート効率を改善し、コンジュゲート、溶出、保管、インキュベートに使用した場合、または洗浄手段として、アッセイの結果（解像度）を改善する。
標的指向性部分（例えば、抗体）へのポリマー色素のコンジュゲートは、一般に、３つの工程、すなわち、コンジュゲート、溶出および保管を有する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩（例えば、ＭｇＣｌ₂）は、ポリマー色素および標的指向性部分のコンジュゲートの間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、コンジュゲートされたポリマー色素および標的指向性部分の溶出の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、コンジュゲートされたポリマー色素および標的指向性部分の保管の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、ポリマー色素および標的指向性部分のコンジュゲートおよび溶出の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、コンジュゲートされたポリマー色素および標的指向性部分の溶出および保管の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、ポリマー色素および標的指向性部分のコンジュゲートおよび保管の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、ポリマー色素および標的指向性部分のコンジュゲート、溶出、および保管の間、存在する。コンジュゲート過程は、色素を復元する工程を含んでもよい。抗体コンジュゲート（標的指向性部分の構築）の間に行われる陽イオンの構成は、例えば、Ｃ＋Ｅ−Ｓ−（すなわち、コンジュゲート中に存在するが、溶出中に存在せず、保管中にも存在しない）として表すことができる。

免疫蛍光染色法は、一般に、少なくとも３つの工程、すなわちインキュベート、洗浄および可視化を含む。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、分析対象−標的指向性部分複合体のインキュベートの間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、分析対象−標的指向性部分複合体の洗浄の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、分析対象−標的指向性部分複合体のインキュベートおよび洗浄の間、存在する。実施形態では、１種または複数の二価または三価の金属塩は、可視化中に存在しない。
本明細書に記載されている様々な方法の特定の実施形態は、図１２および１３に視覚化されている。図１２は、一般化した方法を示す。図１３は、より具体的な例示的方法を示す。図１２および図１３の左端の列は、現在使用されている方法の例を示す。
実施形態では、免疫蛍光法において、シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）は、標的指向性部分が、二価の陽イオンおよび細胞と共にインキュベートされ、次に、洗い流されると向上する。

一部の実施形態では、抗体コンジュゲートが二価の陽イオンで処理されると、過程の増強がある。
実施形態では、抗体コンジュゲートが陽イオンを含まない最終緩衝液（ｐＨ７．４）中で可視化された場合、アッセイの終わりにＳ／Ｎが向上する。
実施形態では、抗体コンジュゲートを二価の陽イオンを含有する緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄すると、Ｓ／Ｎは向上するが、イオンを含まない緩衝液で可視化される。実施形態では、二価の陽イオンでの洗浄は、基質組織により引き起こされる非特異的結合および消光の妨げになるが、陽イオンを含まない可視化緩衝液（ｐＨ７．５）ではシグナルは増大される：（Ｉ−Ｗ＋Ｖ−）または（Ｉ＋Ｗ＋Ｖ−）。

実施形態では、本開示は、
ａ）ポリマー色素であって、
ｉ）２つ以上の蛍光または発色部分
ｉｉ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基、および
ｉｉｉ）反応性基Ｑ
を含むポリマー色素、ならびに
ｂ）二価または三価の金属塩
を含む組成物を提供する。
いずれの好適なポリマー色素も、本開示の任意の方法または組成物に使用され得る。
実施形態では、本開示の方法は、ポリマー色素、標的指向性部分および二価または三価の金属塩を含む混合物を調製するステップ、および該混合物を、共有結合性コンジュゲートを形成するのに十分な時間および温度で熟成させるステップを含む、ポリマー色素と標的指向性部分との共有結合性コンジュゲートを形成する方法であって、
ａ）ポリマー色素が、
ｉ）２つ以上の蛍光または発色部分
ｉｉ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；および
ｉｉｉ）標的指向性部分の相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な反応性基Ｑ
を含み、
ｂ）標的指向性部分が、標的分析対象に親和性を有しており、かつ相補性反応性基Ｑ’を含む、
方法を含む。

一部の実施形態では、本開示の方法は、標的分析対象を検出する方法であって、
ａ）二価または三価の金属塩の存在下で、共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させて、分析対象−標的指向性部分複合体を形成するステップであって、共有結合性コンジュゲートが、
ｉ）標的分析対象に対して親和性を有しており、かつポリマー色素に対する反応性基Ｑ’の共有結合を含む標的指向性部分
ｉｉ）ポリマー色素であって、
Ａ）２つ以上の蛍光または発色部分
Ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；および
Ｃ）反応性基Ｑ’と共有結合した、標的指向性部分である相補性反応性基Ｑへの共有結合
を含むポリマー色素を含む、ステップ、ならびに
ｂ）分析対象−標的指向性部分複合体からの蛍光または発色シグナルを検出するステップ
を含む方法を含む。

実施形態では、本方法は、分析対象−標的指向性部分複合体を二価または三価の金属塩を含む洗浄溶液で処理するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、本開示の方法は、標的分析対象を検出する方法であって、
ａ）共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させて、分析対象−標的指向性部分複合体を形成するステップであって、共有結合性コンジュゲートが、
ｉ）標的分析対象に対して親和性を有しており、かつポリマー色素に対する反応性基Ｑ’の共有結合を含む標的指向性部分、ならびに
ｉｉ）ポリマー色素であって、
Ａ）２つ以上の蛍光または発色部分
Ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基、および
Ｃ）標的指向性部分への非共有結合上に反応性基Ｑ’と共有結合した相補性反応性基Ｑ
を含むポリマー色素を含む、ステップ、
ｂ）ｉ）共有結合性コンジュゲートと標的分析対象とを結合させる間、共有結合性コンジュゲートおよび標的分析対象を、二価または三価の金属塩で処理するステップ、および／または
ｉｉ）共有結合性コンジュゲートと標的分析対象とを結合させた後に、分析対象−標的指向性部分複合体を、二価または三価の金属塩を含む洗浄溶液で処理するステップ、ならびに
ｃ）分析対象−標的指向性部分複合体からの蛍光または発色シグナルを検出するステップ
を含む方法を含む。
実施形態では、共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させるステップは、二価または三価の金属塩の存在下で行われる。実施形態では、本方法は、蛍光または発色シグナルを検出する前に、分析対象−標的指向性部分複合体から二価または三価の塩のすべてを実質的に除去するステップをさらに含む。実施形態では、二価または三価の金属塩は、分析対象−標的指向性部分複合体を含む緩衝液から除去される。

実施形態では、本方法は、共有結合性コンジュゲートを形成するステップをさらに含む。実施形態では、共有結合性コンジュゲートを形成する前に、ポリマー色素および二価または三価の塩を混合して、ポリマー色素および二価または三価の塩を含む組成物を形成する。実施形態では、本方法は、共有結合性コンジュゲートを形成させる前に、ポリマー色素および二価または三価の塩を含む組成物を熟成させるステップをさらに含む。実施形態では、二価または三価の塩は、共有結合性コンジュゲートを形成している間、実質的に存在しない。
実施形態では、本開示の組成物は、共有結合性コンジュゲートおよび二価または三価の塩を含み、共有結合性コンジュゲートは、
ｉ）ポリマー色素への共有結合を含む標的指向性部分
ｉｉ）ポリマー色素であって、
ａ）２つ以上の蛍光または発色部分
ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基、および
ｃ）標的指向性部分への共有結合
を含むポリマー色素を含む。

実施形態では、標的指向性部分は、標的分析対象に対して親和性を有する。実施形態では、標的指向性部分は、抗体を含む。実施形態では、二価または三価の塩は、二価の塩である。実施形態では、二価の塩は、マグネシウム塩である。実施形態では、マグネシウム塩は、塩化マグネシウムである。
実施形態では、蛍光または発色部分は、蛍光部分である。実施形態では、蛍光または発色部分は、出現毎に、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドおよび６−ＦＡＭ部分からなる群から独立して選択される。実施形態では、蛍光または発色部分は、出現毎に独立して、以下の構造のうちの１つを有する：

実施形態では、ポリマー色素は、複数の負の電荷を帯びた基を含む。実施形態では、ポリマー色素は、２つ以上の蛍光または発色部分を含み、２つ以上の蛍光または発色部分はそれぞれ、少なくとも１つの負の電荷を帯びた基を含むリンカーを介して、隣接する蛍光または発色部分に結合している。
実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアルキレンまたはアルキレンオキシド部分をさらに含む。実施形態では、アルキレンオキシド部分は、ポリエチレンオキシド部分を含む。実施形態では、負の電荷を帯びた基は、ホスフェートである。実施形態では、ポリマー色素は、２〜１００の蛍光または発色部分を含み、該蛍光または発色部分は、少なくとも１つの負の電荷を帯びた基を含むリンカーを介して、隣接する蛍光または発色部分に結合している。実施形態では、ポリマー色素は、２〜１０の蛍光または発色部分を含み、該蛍光または発色部分は、少なくとも１つの負の電荷を帯びた基を含むリンカーを介して、隣接する蛍光または発色部分に結合している。

実施形態では、本方法は、共有結合性コンジュゲートを精製するステップをさらに含む。実施形態では、共有結合性コンジュゲートを精製するステップは、共有結合性コンジュゲートから二価または三価の塩のすべてを実質的に除去するステップを含む。
実施形態では、共有結合性コンジュゲートは、二価または三価の塩の非存在下で調製した対応するコンジュゲートよりも少なくとも１．１倍高い蛍光吸光係数を有する。実施形態では、共有結合性コンジュゲートは、二価または三価の塩の非存在下で調製した対応するコンジュゲートよりも少なくとも１．２倍高い蛍光吸光係数を有する。
実施形態では、標的指向性部分は、抗体である。

上記の実施形態のいずれにおいても、ポリマー色素は、構造（Ｉ）または構造（ＩＩ）の化合物とすることができる。
様々な実施形態では、蛍光または発色シグナルを検出するステップは、当業者によって理解されている技法を使用するフローサイトメトリーの使用を含む。
実施形態では、本化合物は、様々な分析法に有用である。例えば、ある種の実施形態では、本開示は、試料を染色する方法であって、前記試料が適切な波長において照射されると光学応答を生じるのに十分な量で、前記試料に、例えば、Ｒ²またはＲ³の一方が分析対象分子（例えば、生体分子）またはマイクロ粒子への共有結合を含むリンカーであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方が、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテルまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである構造（Ｉ）の化合物を添加するステップを含む方法を提供する。

上述の方法の一部の実施形態では、Ｒ²は、生体分子などの分析対象分子への共有結合連結基を含むリンカーである。例えば、核酸、アミノ酸またはそれらのポリマー（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）。さらにより多くの実施形態では、生体分子は、酵素、受容体、受容体リガンド、抗体、グリコタンパク質、アプタマーまたはプリオンである。
上述の方法のさらに他の実施形態では、Ｒ²は、マイクロ粒子などの固体支持体への共有結合連結基を含むリンカーである。例えば、一部の実施形態では、マイクロ粒子は、ポリマー製ビーズまたは非ポリマー製ビーズである。
さらにより多くの実施形態では、前記光学応答は蛍光応答である。
他の実施形態では、前記試料は細胞を含み、一部の実施形態は、フローサイトメトリーによって前記細胞を観察するステップをさらに含む。
さらにより多くの実施形態では、本方法は、蛍光応答を、検出可能な異なる光学特性を有する第２のフルオロフォアの蛍光応答と区別するステップをさらに含む。

他の実施形態では、本開示は、生体分子などの分析対象分子を目視で検出する方法であって、
（ａ）例えば、Ｒ²またはＲ³の一方が分析対象分子への共有結合を含むリンカーであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方が、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテルまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである構造（Ｉ）の化合物を用意するステップ、および
（ｂ）該化合物をその可視特性によって検出するステップ
を含む方法を提供する。
一部の実施形態では、分析対象分子は、核酸、アミノ酸またはそれらのポリマー（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）である。さらにより多くの実施形態では、分析対象分子は、酵素、受容体、受容体リガンド、抗体、グリコタンパク質、アプタマーまたはプリオンである。

他の実施形態では、生体分子などの分析対象分子を目視で検出する方法であって、
（ａ）上述の化合物のいずれかを１つまたは複数の分析対象分子と混合するステップ、および
（ｂ）該化合物をその可視特性によって検出するステップ
を含む方法が提供される。
他の実施形態では、分析対象分子を目視で検出する方法であって、
（ａ）Ｒ²またはＲ³が、Ｑ、またはＱへの共有結合を含むリンカーである請求項１に記載の化合物を分析対象分子と混合するステップ、
（ｂ）該化合物および分析対象分子のコンジュゲートを形成するステップ、および
（ｃ）該コンジュゲートをその可視特性によって検出するステップ
を含む方法が提供される。
他の例示的な方法は、分析対象を検出する方法であって、
（ａ）Ｒ²またはＲ³が分析対象に対する特異性を有する標的指向性部分への共有結合を含むリンカーを含む、構造（Ｉ）の化合物を用意するステップ、
（ｂ）該化合物および分析対象を混合し、それによって、標的指向性部分と分析対象とを結合させるステップ、および
（ｃ）該化合物を、例えば、その可視特性または蛍光特性によって検出するステップ
を含む方法を含む。

上述の方法のある種の実施形態では、分析対象は、細胞などの粒子であり、本方法は、フローサイトメトリーの使用を含む。例えば、本化合物には、所望の細胞と選択的に結合させるために、抗体などの標的指向性部分を提供することができ、こうして、目視または蛍光による検出などの任意の数の技法によって、細胞を検出可能にする。適切な抗体は、所望の最終使用に応じて、当業者によって選択することができる。ある種の実施形態で使用する例示的な抗体は、ＵＣＨＴ１およびＭＯＰＣ−２１を含む。
したがって、本化合物の実施形態は、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出、アポトーシスの定量、細胞生存率の決定、細胞表面抗原の特定、全ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ含量の決定、特異的核酸配列（例えば、核酸プローブとして）の特定、ならびに血液がんなどの疾患の診断を含む、任意の数の方法に利用が見いだされている。
上記の方法に加えて、構造（Ｉ）の化合物の実施形態は、がん組織および他の組織を特定するための内視鏡手順における画像化、単一細胞および／もしくは単一分子の分析法、例えば、増幅をほとんどもしくは全く伴わないポリヌクレオチドの検出、例えば、構造（Ｉ）の化合物中の、がん細胞に優先的に結合する抗体もしくは糖もしくは他の部分などの標的指向性部分を含ませることによるがんの画像化、外科手術における画像化、様々な疾患を特定するためのヒストンの結合、例えば、構造（Ｉ）の化合物中のＭ部分を活性薬物部分によって置き換えることによる薬物送達、ならびに／または歯科作業における造影剤、および例えば、構造（Ｉ）の化合物の様々な微生物叢および／もしくは生物への優先的な結合による他の手順を含めた、様々な分野および方法における利用が見いだされている。

上で説明されている構造（Ｉ）の化合物の任意の実施形態、および上で説明されている構造（Ｉ）の化合物中の可変因子Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｌ’、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｍ、ｍおよび／またはｎに関して本明細書において説明されている任意の具体的な選択は、他の実施形態、および／または構造（Ｉ）の化合物の可変因子と独立して組み合わされて、上で具体的に説明されていない本発明の実施形態を形成してもよいことが理解される。さらに、選択肢のリストが、特定の実施形態および／または特許請求の範囲における任意の特定の可変因子Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｌ’、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｍ、ｍおよび／またはｎに関して一覧表示されている場合、個々の選択肢はそれぞれ、特定の実施形態および／または特許請求の範囲から削除され得ること、ならびに選択肢の残りのリストは、本発明の範囲内にあると見なされることが理解される。

本発明のさらなる実施形態では、様々な方法および本明細書に記載されている組成物に使用される蛍光および／または発色色素は、蛍光および／または発色部分の二量体および高次ポリマーであってもよい。蛍光および／または発色部分は、アッセイが行われるｐＨにおいて、複数の正の電荷を帯びた部分または複数の負の電荷を帯びた部分を有するリンカーによって連結されている。
したがって、一部の実施形態では、本化合物は、以下の構造（Ａ）：

(A)
（式中、Ｌは、１つまたは複数の（例えば、各々の）Ｍ基の間の空間隔離を維持するのに十分なリンカーであり、その結果、分子内消光が低減されるか、またはなくなり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³およびｎは、構造（Ｉ）に関して定義されている通りである）を有する。構造（Ａ）の一部の実施形態では、Ｌは、１つまたは複数のエチレングリコールまたはポリエチレングリコール部分を含むリンカーである。

他の実施形態では、以下の構造（Ｉ）を有する化合物：

(I)
またはその立体異性体、塩もしくは互変異性体（式中、
Ｍは、出現毎に独立して、２つ以上の炭素−炭素二重結合および少なくとも一共役度を含む部分であり、
Ｌ¹は、出現毎に独立して、ｉ）任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンもしくはヘテロ原子リンカー；またはｉｉ）２つの相補性反応性基の反応によって形成することが可能な官能基を含むリンカーのいずれかであり、
Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ原子リンカーであり、
Ｌ⁴は、出現毎に独立して、長さが３個の原子よりも長い、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンおよびヘテロアルキニレンリンカー中のヘテロ原子は、Ｏ、ＮおよびＳから選択され、
Ｒ¹は、出現毎に独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、ヘテロアルキル、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c、ＱまたはＬ’であり、
Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ⁵は、出現毎に独立して、オキソ、チオキソであるか、または存在せず、
Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、
Ｒ_bは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＯＬ’、ＳＲ_d、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、
Ｒ_dは、対イオンであり、
Ｑは、出現毎に独立して、分析対象分子、標的指向性部分、固体支持体または相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な、反応性基またはその保護類似体を含む部分であり、
Ｌ’は、出現毎に独立して、Ｑへの共有結合を含むリンカー、標的指向性部分への共有結合を含むリンカー、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカー、固体支持体残基への共有結合を含むリンカー、ヌクレシチドへの共有結合を含むリンカー、または構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、
ｍは、出現毎に独立して、０以上の整数であり、ただし、出現するｍの少なくとも１つは、１以上の整数であることを条件とし、
ｎは、１以上の整数である）
が提供される。

構造（Ｉ）の化合物の異なる実施形態では、
Ｍは、出現毎に独立して、２つ以上の炭素−炭素二重結合および少なくとも一共役度を含む部分であり、
Ｌ¹は、出現毎に独立して、ｉ）任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンもしくはヘテロ原子リンカー；またはｉｉ）２つの相補性反応性基の反応によって形成することが可能な官能基を含むリンカーのいずれかであり、
Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ原子リンカーであり、
Ｌ⁴は、出現毎に独立して、長さが３個の原子よりも長い、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンおよびヘテロアルキニレンリンカー中のヘテロ原子は、Ｏ、ＮおよびＳから選択され、
Ｒ¹は、出現毎に独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c、Ｑ、Ｑへの共有結合を含むリンカー、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカーまたは構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、Ｒ_bは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＳＲ_d、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、Ｒ_dは、対イオンであり、
Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ⁵は、出現毎に独立して、オキソ、チオキソであるか、または存在せず、
Ｑは、出現毎に独立して、分析対象分子、固体支持体または相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な、反応性基を含む部分であり、
ｍは、出現毎に独立して、０以上の整数であり、ただし、出現するｍの少なくとも１つは、１以上の整数であることを条件とし、
ｎは、１以上の整数である。

構造（Ｉ）の化合物中の様々なリンカーおよび置換基（例えば、Ｍ、Ｑ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ^c、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³およびＬ⁴）は、さらにもう１つの置換基により置換されていてもよい。例えば、一部の実施形態では、任意に用いてもよい置換基は、構造（Ｉ）の化合物の水溶解度または他の特性を最適化するよう選択される。ある種の実施形態では、構造（Ｉ）の化合物中のアルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルおよびチオホスホアルキルエーテルはそれぞれ、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、スルフヒドリル、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルおよびチオホスホアルキルエーテルからなる群から選択される、さらに１つの置換基により置換されていてもよい。ある種の実施形態では、任意に用いてもよい置換基は、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_cは、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りである。

一部の実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ原子リンカーである。他の実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に独立して、２つの相補性反応性基、例えばＱ基の反応により形成可能な官能基を含むリンカーである。
一部の実施形態では、Ｌ⁴は、出現毎に独立して、ヘテロアルキレンリンカーである。他のより具体的な実施形態では、Ｌ⁴は、出現毎に独立して、アルキレンオキシドリンカーである。

実施形態では、ポリマー色素は、以下の構造（Ｉ）：

(I)
またはその立体異性体、塩もしくは互変異性体（式中、
Ｍは、出現毎に独立して、蛍光または発色部分を含む部分であり、
Ｌ¹は、出現毎に独立して、ｉ）任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンもしくはヘテロ原子リンカー；またはｉｉ）２つの相補性反応性基の反応によって形成することが可能な官能基を含むリンカーのいずれかであり、
Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ原子リンカーであり、
Ｌ⁴は、出現毎に独立して、アルキレンまたはアルキレンオキシドリンカーであり、
Ｒ¹は、出現毎に独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、ヘテロアルキル、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c、Ｑもしくはその保護形態、またはＬ’であり、
Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ⁵は、出現毎に独立して、オキソ、チオキソであるか、または存在せず、
Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、
Ｒ_bは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＯＬ’、ＳＲ_d、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、
Ｒ_dは、対イオンであり、
Ｌ’は、出現毎に独立して、Ｑへの共有結合を含むリンカー、標的指向性部分への共有結合を含むリンカー、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカー、固体支持体残基への共有結合を含むリンカー、ヌクレオシドへの共有結合を含むリンカー、または構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、
ｍは、出現毎に独立して、０以上の整数であり、ただし、出現するｍの少なくとも１つは、１以上の整数であることを条件とし、こうして、この化合物は、少なくとも１つのＬ⁴を含み、
ｎは、１以上の整数である）
を有する。

例えば、一部の実施形態では、Ｌ⁴は、ポリエチレンオキシドであり、化合物は以下の構造（ＩＡ）：

(IA)
（式中、ｚは、２〜１００の整数である）を有する。（ＩＡ）の一部の実施形態では、ｚは２〜３０、例えば約２０〜２５、または約２３の整数である。一部の実施形態では、ｚは、２〜１０、例えば３〜６の整数である。一部の実施形態では、ｚは、３である。一部の実施形態では、ｚは、４である。一部の実施形態では、ｚは、５である。一部の実施形態では、ｚは、６である。

任意に用いてもよいリンカーＬ¹は、化合物の残りへのＭ部分の結合点として使用することができる。例えば、一部の実施形態では、構造（Ｉ）の化合物への合成前駆体が調製され、Ｍ部分は、任意の数の、当分野において公知の容易な方法、例えば、「クリックケミストリー」と称される方法を使用して合成前駆体に結合される。この目的の場合、迅速かつ実質的に不可逆な任意の反応を使用して、構造（Ｉ）の化合物を形成するための合成前駆体にＭを結合することができる。例示的な反応には、アジドとアルキンとのトリアゾールを形成する銅触媒反応（Ｈｕｉｓｇｅｎの１，３−双極子環化付加）、ジエンと求ジエンとの反応（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）、歪みにより促進されるアルキン−ニトロン環化付加、歪アルケンとアジド、テトラジンまたはテトラゾールの反応、アルケンとアジドの［３＋２］環化付加、アルケンとテトラジンの逆需要Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ、アルケンとテトラゾールの光反応、ならびに求電子性原子への求核攻撃による脱離基の置換などの様々な置換反応が含まれる。例示的な置換反応は、アミンと活性化エステル；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；イソシアネート；イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｓｃｙａｎａｔｅ）などとの反応を含む。一部の実施形態では、Ｌ¹を形成する反応は、水性環境中で行われてもよい。
したがって、一部の実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に、２つの相補性反応性基の反応によって形成可能な官能基、例えば、上述の「クリック」反応の１つの生成物である官能基を含むリンカーである。様々な実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、官能基は、アルデヒド、オキシム、ヒドラゾン、アルキン、アミン、アジド、アシルアジド、アシルハライド、ニトリル、ニトロン、スルフヒドリル、ジスルフィド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、イミドエステル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ケトン、α，β−不飽和カルボニル、アルケン、マレイミド、α−ハロイミド、エポキシド、アジリジン、テトラジン、テトラゾール、ホスフィン、ビオチンまたはチイラン官能基と、相補性反応性基との反応によって形成され得る。例えば、アミンとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイソチオシアネートとの反応によって形成され得る。

他の実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、官能基は、アルキンおよびアジドの反応によって形成され得る。他の実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、官能基は、アミン（例えば、一級アミン）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイソチオシアネートの反応によって形成され得る。
より多くの実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。より多くの実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、チオウレア、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。他の実施形態では、官能基は、アミドまたはチオウレアを含む。一部のより具体的な実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、Ｌ¹は、トリアゾリル官能基を含むリンカーである。他の実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、Ｌ¹は、アミドまたはチオウレア官能基を含むリンカーである。

さらに他の実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、Ｌ¹−Ｍは、以下の構造：

（式中、Ｌ^1aおよびＬ^1bは、それぞれ独立して、任意に用いてもよいリンカーである）を有する。

異なる実施形態では、出現するＬ¹の少なくとも１つについて、Ｌ¹−Ｍは、以下の構造：

（式中、Ｌ^1aおよびＬ^1bは、それぞれ独立して、任意に用いてもよいリンカーである）を有する。
上述の様々な実施形態では、Ｌ^1aもしくはＬ^1b、またはそれらの両方が、存在しない。他の実施形態では、Ｌ^1aもしくはＬ^1b、またはそれらの両方が存在する。
一部の実施形態では、Ｌ^1aおよびＬ^1bは、存在する場合、それぞれ独立して、アルキレンまたはヘテロアルキレンである。例えば、一部の実施形態では、Ｌ^1aおよびＬ^1bは、存在する場合、独立して、以下の構造の１つ：

を有する。

構造（Ｉ）のさらに他の異なる実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである。ある種の実施形態では、Ｌ¹は、以下の構造の１つ：

を有する。

より多くの実施形態では、Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、Ｃ₁−Ｃ₆アルキレン、Ｃ₂−Ｃ₆アルケニレンまたはＣ₂−Ｃ₆アルキニレンである。例えば、一部の実施形態では、本化合物は、以下の構造（ＩＢ）：

(IB)
（式中、
ｘ¹、ｘ²、ｘ³およびｘ⁴は、出現毎に独立して、０〜６の整数であり、
ｚは、２〜１００、例えば３〜６の整数である）
を有する。

構造（ＩＢ）の化合物のある種の実施形態では、出現するｘ¹、ｘ²、ｘ³またはｘ⁴の少なくとも１つは１である。他の実施形態では、ｘ¹、ｘ²、ｘ³およびｘ⁴は、出現毎に、それぞれ１である。他の実施形態では、ｘ¹およびｘ³は、出現毎に、それぞれ０である。一部の実施形態では、ｘ²およびｘ⁴は、出現毎に、それぞれ１である。さらに他の実施形態では、ｘ¹およびｘ³は、出現毎に、それぞれ０であり、ｘ²およびｘ⁴は、出現毎に、それぞれ１である。
構造（ＩＢ）の化合物の一部のより具体的な実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に独立して、トリアゾリル官能基を含む。構造（ＩＢ）の化合物の一部の他の具体的な実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に独立して、アミドまたはチオウレア官能基を含む。構造（ＩＢ）の化合物の他の実施形態では、Ｌ¹は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである。

構造（Ｉ）の化合物のいずれかのさらに他の実施形態では、Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ_dである。「ＯＲ_d」および「ＳＲ_d」は、陽イオンに結合した、Ｏ^-およびＳ^-を指すことが意図されることが理解される。例えば、ホスフェート基の二ナトリウム塩は、以下の通り表すことができる：

（式中、Ｒ_dは、ナトリウム（Ｎａ⁺）である）。
構造（Ｉ）の化合物のいずれかの他の実施形態では、Ｒ⁵は、出現毎に、オキソである。
上述の化合物のいずれかの一部の異なる実施形態では、Ｒ¹は、Ｈである。
他の様々な実施形態では、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである。一部の異なる実施形態では、Ｒ²またはＲ³は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方は、Ｑ、またはＱへの共有結合を含むリンカーである。

構造（Ｉ）の上述の化合物のいずれかのさらにより多くの異なる実施形態では、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである。これらの実施形態の一部では、Ｒ_cは、ＯＬ’である。
他の実施形態では、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）ＯＬ’であり、Ｌ’は、Ｑ、標的指向性部分、分析対象（例えば、分析対象分子）、固体支持体、固体支持体残基、ヌクレオシドまたは構造（Ｉ）のさらなる化合物へのアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである。
リンカーＬ’は、Ｑ、標的指向性部分、分析対象（例えば、分析対象分子）、固体支持体、固体支持体残基、ヌクレオシド、または構造（Ｉ）のさらなる化合物を、構造（Ｉ）の化合物に結合させるのに好適な任意のリンカーとすることができる。有利には、ある種の実施形態は、化合物の水溶解度を増大させる、または最適化するよう選択される、Ｌ’部分の使用を含む。ある種の実施形態では、Ｌ’は、ヘテロアルキレン部分である。一部の他のある種の実施形態では、Ｌ’は、アルキレンオキシドもしくはホスホジエステル部分、またはそれらの組合せを含む。

ある種の実施形態では、Ｌ’は、以下の構造：

（式中、
ｍ”およびｎ”は、独立して、１〜１０の整数であり、
Ｒ^eは、Ｈ、電子対または対イオンであり、
Ｌ”は、Ｒ^e、またはＱ、標的指向性部分、分析対象（例えば、分析対象分子）、固体支持体、固体支持体残基、ヌクレオシドもしくは構造（Ｉ）のさらなる化合物への直接結合もしくは連結基である）
を有する。

一部の実施形態では、ｍ”は、４〜１０、例えば４、６または１０の整数である。他の実施形態では、ｎ”は、３〜６、例えば３、４、５または６の整数である。
一部の他の実施形態では、Ｌ”は、アルキレンまたはヘテロアルキレン部分である。一部の他のある種の実施形態では、Ｌ”は、アルキレンオキシド、ホスホジエステル部分、スルフヒドリル、ジスルフィドもしくはマレイミド部分、またはそれらの組合せを含む。
上述の実施形態のいくつかでは、標的指向性部分は、抗体または細胞表面受容体アンタゴニストである。

上述の構造（Ｉ）の化合物のいずれかの他のより具体的な実施形態では、Ｒ²またはＲ³は、以下の構造の１つ：

を有する。

構造（Ｉ）の化合物のある種の実施形態は、オリゴヌクレオチドの調製に関して当分野で公知の合成法に類似した固相合成法に準拠して調製することができる。したがって、一部の実施形態では、Ｌ’は、固体支持体、固体支持体残基またはヌクレオシドへの連結基である。活性化デオキシチミジン（ｄＴ）基を含む固体支持体は、容易に入手可能であり、一部の実施形態では、構造（Ｉ）の化合物の調製のための出発物質として使用することができる。したがって、一部の実施形態では、Ｒ²またはＲ³は、以下の構造：

を有する。
当業者は、上で図示されているｄＴ基は、合成を容易にするためおよび経済的効率性だけのために含まれているに過ぎず、必要ではないことを理解していよう。他の固体支持体を使用することができ、Ｌ’上に存在する異なるヌクレオシドもしくは固体支持体残基をもたらすか、またはヌクレオシドもしくは固体支持体残基が、合成後に除去され得るか、もしくは修飾され得る。

さらに他の実施形態では、Ｑは、出現毎に独立して、分析対象分子または固体支持体と共有結合を形成することが可能な反応性基を含む部分である。他の実施形態では、Ｑは、出現毎に独立して、相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な反応性基を含む部分である。例えば、一部の実施形態では、Ｑ’は、構造（Ｉ）のさらなる化合物に存在し（例えば、Ｒ²またはＲ³の位置）、ＱおよびＱ’は、相補性反応性基を含み、こうして、構造（Ｉ）の化合物と構造（Ｉ）のさらなる化合物との反応により、構造（Ｉ）の化合物の共有結合による二量体をもたらす。構造（Ｉ）の多量体化合物もまた、類似の方法で調製することができ、本発明の実施形態の範囲内に含まれる。
Ｑ基のタイプ、および構造（Ｉ）の化合物の残りへのＱ基の結合は、限定されず、ただし、Ｑは、所望の結合を形成するために適切な反応性を有する部分を含むことを条件とする。
ある種の実施形態では、Ｑは、水性条件下で加水分解を受けにくいが、分析対象分子または固体支持体の表面の対応する基（例えば、アミン、アジドまたはアルキン）と結合を形成するのに十分な反応性のある部分である。

構造（Ｉ）の化合物のある種の実施形態は、バイオコンジュゲートの分野において、一般に使用されているＱ基を含む。例えば一部の実施形態では、Ｑは、求核性反応性基、求電子性反応性基または環化付加反応性基を含む。一部のより具体的な実施形態では、Ｑは、スルフヒドリル、ジスルフィド、活性化エステル、イソチオシアネート、アジド、アルキン、アルケン、ジエン、求ジエン体、酸ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル、ホスフィン、α−ハロアミド、ビオチン、アミノまたはマレイミド官能基を含む。一部の実施形態では、活性化エステルは、Ｎ−スクシンイミドエステル、イミドエステルまたはポリフルオロフェニル（ｐｏｌｙｆｌｏｕｒｏｐｈｅｎｙｌ）エステルである。他の実施形態では、アルキンは、アルキルアジドまたはアシルアジドである。

Ｑ基は、保存安定性または他の所望の特性を増大させるため、保護形態で都合よく設けることができ、次に、この保護基は、例えば、標的指向性部分または分析対象とのコンジュゲートにとって適切なときに除去される。したがって、Ｑ基は、上記および以下の表１中の反応性基のいずれかを含めた、反応性基の「保護形態」を含む。Ｑの「保護形態」とは、Ｑに対して所定の反応条件下で、より低い反応性を有するが、好ましくは分解せず、構造（Ｉ）の化合物の他の部分と反応しない条件下で、Ｑへと変換され得る部分を指す。当業者は、特定のＱ、ならびに所望の最終使用および保管条件に基づいた、Ｑの適切な保護形態を誘導することができる。例えば、ＱがＳＨである場合、Ｑの保護形態はジスルフィドを含み、ジスルフィドは、一般的に知られている技法および試薬を使用して還元されると、ＳＨ部分を現すことができる。

例示的なＱ部分が、以下の表１に提示されている。

実施形態では、Ｑは、表１から選択される部分である。
一部の実施形態では、ＱがＳＨである場合、ＳＨ部分は、例えば、構造（Ｉ）の別の化合物の別のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成する傾向があることに留意すべきである。したがって、一部の実施形態は、ジスルフィド二量体の形態にある、構造（Ｉ）の化合物を含み、ジスルフィド結合は、ＳＨであるＱ基から誘導される。

構造（Ｉ）の化合物も、ある種の実施形態の範囲内に含まれ、この場合、Ｒ²およびＲ³の一方またはどちらも、構造（Ｉ）のさらなる化合物への連結基を含む。例えば、Ｒ²およびＲ³の一方またはどちらも、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、ＲｃはＯＬ’であり、Ｌ’は、構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーである。このような化合物は、例えば、約１０の「Ｍ」部分（すなわち、ｎ＝９）を有しており、かつ第２の構造（Ｉ）の化合物上の相補性Ｑ’基との反応にとって適切な「Ｑ」を有する、第１の構造（Ｉ）の化合物を調製することにより調製され得る。この方法では、任意の数、例えば１００以上の「Ｍ」部分を有する、構造（Ｉ）の化合物は、各モノマーを逐次にカップリングする必要なしに調製することができる。このような構造（Ｉ）の化合物の例示的な実施形態は、以下の構造（Ｉ’）：

(I')
（式中、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｍ、ｍおよびｎの各出現は独立して、構造（Ｉ）の化合物に関して定義されている通りであり、
Ｌ”は、Ｑ部分と対応するＱ’部分との反応から生じる官能基を含むリンカーであり、
αは、１より大きな整数、例えば１〜１００、または１〜１０である）
を有する。
構造（Ｉ’）の例示的な化合物は、実施例５に提供されている。構造（Ｉ’）の他の化合物は、当業者によって、例えば、本明細書において提供されている構造（Ｉ）の化合物を二量化または重合することにより誘導可能である。

他の実施形態では、Ｑ部分は、ジスルフィド部分として都合よくマスクされ（例えば、保護される）、この部分は、後に還元されて、所望の分析対象分子または標的指向性部分への結合のための活性化されたＱ部分をもたらすことができる。例えば、Ｑ部分は、以下の構造：

（式中、Ｒは、置換されていてもよいアルキル基である）を有するジスルフィドとしてマスクされ得る。例えば、一部の実施形態では、Ｑは、以下の構造：

（ｎは、１〜１０の整数、例えば６である）
を有するジスルフィド部分として提供される。
一部の他の実施形態では、Ｒ²またはＲ³の一方はＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方は、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、または固体支持体への共有結合を含むリンカーである。例えば、一部の実施形態では、分析対象分子は、核酸、アミノ酸またはそれらのポリマーである。他の実施形態では、分析対象分子は、酵素、受容体、受容体リガンド、抗体、グリコタンパク質、アプタマーまたはプリオンである。さらに異なる実施形態では、固体支持体は、ポリマー製ビーズまたは非ポリマー製ビーズである。

ｍの値は、所望の蛍光および／または発色強度に基づいて選択され得る別の可変因子である。一部の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、１〜１０の整数である。他の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、１〜５の整数、例えば、１、２、３、４または５である。
他の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、２より大きな整数であり、ｚは、３〜１０の整数であり、例えば、一部の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、３、４、５または６などの２より大きな整数であり、ｚは、３〜６の整数である。
蛍光強度もまた、異なるｎの値を選択することによって調節することができる。ある種の実施形態では、ｎは、１〜１００の整数である。他の実施形態では、ｎは、１〜１０の整数である。一部の実施形態では、ｎは１である。一部の実施形態では、ｎは２である。一部の実施形態では、ｎは３である。一部の実施形態では、ｎは４である。一部の実施形態では、ｎは５である。一部の実施形態では、ｎは６である。一部の実施形態では、ｎは７である。一部の実施形態では、ｎは８である。一部の実施形態では、ｎは９である。一部の実施形態では、ｎは１０である。

Ｍは、所望の光学特性に基づいて、例えば、所望の色および／または蛍光の発光波長に基づいて選択される。一部の実施形態では、Ｍは、出現毎に同じである。しかし、Ｍの各出現は、同一のＭである必要はないこと、およびある種の実施形態は、Ｍが出現毎に同じではない化合物を含むことに留意することが重要である。例えば、一部の実施形態では、Ｍはそれぞれ、同じではなく、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法に使用するための、吸光度および／または発光を有するよう、異なるＭ部分が選択される。例えば、このような実施形態では、異なるＭ部分は、１つの波長における放射線の吸光度が、ＦＲＥＴ機構によって、異なる波長での放射線の発光を引き起こすよう選択される。例示的なＭ部分は、所望の最終使用に基づいて、当業者により適切に選択することができる。ＦＲＥＴ法に関する例示的なＭ部分には、フルオレセインおよび５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル）色素が含まれる。
Ｍは、Ｍ上の任意に位置（すなわち、原子）から分子の残りに結合し得る。当業者は、Ｍが分子の残りに結合するための手段を認識していよう。例示的な方法には、本明細書に記載されている「クリック」反応が含まれる。

一部の実施形態では、Ｍは、蛍光または発色部分である。実施形態では、Ｍは、蛍光部分である。実施形態では、Ｍは、発色部分である。任意の蛍光および／発色部分を使用することができ、例えば当分野での公知のもの、および比色分析アッセイ、ＵＶアッセイおよび／または蛍光アッセイに通常使用されるものが使用されてもよい。本発明の様々な実施形態に有用なＭ部分の例には、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンまたはテキサスレッド）；シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンまたはメロシアニン）；スクアライン誘導体および環置換スクアライン（セタ、セタウおよびスクエア色素を含む）；ナフタレン誘導体（例えば、ダンシルおよびポロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールまたはベンゾオキサジアゾール）；アントラセン誘導体（例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫオレンジを含むアントラキノン）；カスケードブルーなどのピレン誘導体；オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）；アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；アリールメチン誘導体：アウラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン；およびテトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニンまたはビリルビン）が含まれる。他の例示的なＭ部分には、シアニン色素、キサンテート色素（例えば、Ｈｅｘ、Ｖｉｃ、Ｎｅｄｄ、ＪｏｅまたはＴｅｔ）；ヤキマイエロー；レッドモンドレッド；タムラ；テキサスレッドおよびａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）色素が含まれる。

上述のいずれかのさらに他の実施形態では、Ｍは、３つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せ、例えば、４つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せ、あるいは５つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せさえも含む。一部の実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、４つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せを含む部分である。一部の実施形態では、Ｍは、６つのアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せを含む。さらなる実施形態では、環は縮合している。例えば、一部の実施形態では、Ｍは、３つ以上の縮合環、４つ以上の縮合環、５つ以上の縮合環、または６つ以上の縮合環さえも含む。実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、少なくとも４つの縮合環を含む、縮合多環式アリール部分を含む。

一部の実施形態では、Ｍは、環式である。例えば、一部の実施形態では、Ｍは、炭素環式である。他の実施形態では、Ｍは、複素環式である。上述のさらに他の実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、アリール部分を含む。これらの実施形態の一部では、アリール部分は、多環式である。他のさらなる具体例では、アリール部分は、縮合多環式アリール部分であり、例えば、この縮合多環式アリール部分は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または４つを超えることさえあるアリール環を含んでもよい。
上記の構造（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）または（Ｉ’）の化合物のいずれかの他の実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、少なくとも１個のヘテロ原子を含む。例えば、一部の実施形態では、ヘテロ原子は、窒素、酸素または硫黄である。
上述のいずれかのさらにより多くの実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、少なくとも１つの置換基を含む。例えば、一部の実施形態では、置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アリールオキシ、フェニル、アリール、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、カルボキシ、スルホネート、アミドまたはホルミル基である。

上述の一部のさらにより具体的な実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、ジメチルアミノスチルベン、キナクリドン、フルオロフェニル−ジメチル−ＢＯＤＩＰＹ、ｈｉｓ−フルオロフェニル−ＢＯＤＩＰＹ、アクリジン、テリレン、セキシフェニル、ポルフィリン、ベンゾピレン（フルオロフェニル−ジメチル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、（ビス−フルオロフェニル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、クアテルフェニル、ビ−ベンゾチアゾール、ター−ベンゾチアゾール、ビ−ナフチル、ビ−アントラシル、スクアライン、スクアリリウム、９，１０−エチニルアントラセンまたはター−ナフチル部分である。他の実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、ｐ−ターフェニル、ペリレン、アゾベンゼン、フェナジン、フェナントロリン、アクリジン、チオキサントレン、クリセン、ルブレン、コロネン、シアニン、ペリレンイミドもしくはペリレンアミド、またはそれらの誘導体である。さらにより多くの実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー移動色素、チアゾールオレンジ色素、ポリメチンまたはＮ−アリール−１，８−ナフタルイミド色素である。
上述のいずれかのさらにより多くの実施形態では、Ｍは、出現毎に、同じである。他の実施形態では、Ｍはそれぞれ、異なる。さらにより多くの実施形態では、１つまたは複数のＭは同じであり、１つまたは複数のＭは異なる。

一部の実施形態では、Ｍは、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドもしくは６−ＦＡＭ、またはそれらの誘導体である。一部の他の実施形態では、Ｍは、以下の構造：

のうちの１つを有する。

カルボン酸基を含むＭ部分は、上記の陰イオン性形態（ＣＯ₂ ^-）で図示されているが、当業者は、これは、ｐＨに応じて様々になること、およびプロトン化形態（ＣＯ₂Ｈ）が、様々な実施形態に含まれることを理解しているであろう。
一部の具体的な実施形態では、本化合物は、表２から選択される化合物である。表２中の化合物は、実施例に説明されている手順に準拠して調製し、それらの構造（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、質量分析法によって確認した。

表２に使用される場合、および本出願全体を通して、Ｒ²、Ｒ³、ｍ、ｎおよびＬ’は、特に示さない限り、構造（Ｉ）の化合物に関して提示されている定義を有しており、Ｆ、Ｆ’およびＦ”は、それぞれ、以下の構造：

を有するフルオレセイン部分を指す。

「ｄｔ」とは、以下の構造：

を指す。

一部の実施形態は、表２に提示されており、抗体などの標的指向性部分にコンジュゲートされている具体的な化合物を含む、上述の化合物のいずれかを含む。
本開示は、概して、以前の公知化合物よりも蛍光発光が増大した化合物を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。したがって、ある種の実施形態は、Ｙ個の蛍光部分Ｍを含む蛍光化合物であって、所定の波長の紫外光により励起すると、同一波長の紫外光により励起した際の単一Ｍ部分のピーク蛍光発光よりも少なくともＹ倍の８５％のピーク蛍光発光を有する、蛍光化合物を対象とする（Ｙは、２以上の整数である）。蛍光化合物は、紫外光などの光による励起時に蛍光シグナルを発光する化合物を含む。
一部の実施形態では、蛍光化合物は、単一Ｍ部分のピーク蛍光発光よりも、少なくともＹ倍の９０％、Ｙ倍の９５％、Ｙ倍の９７％、またはＹ倍の９９％高いピーク蛍光発光を有する。

一部の実施形態では、Ｙは、２〜１００、例えば２〜１０の整数である。
一部の実施形態では、Ｙ個のＭ部分は、独立して、以下の構造の１つ：

（式中、

は、蛍光化合物への結合点を示す）を有する。

他の実施形態では、単一のＭ部分は、独立して、以下の構造の１つ：

を有する。

より具体的な実施形態では、蛍光化合物は、独立して、以下の構造の１つ：

（式中、

は、蛍光化合物への結合点を示し、単一のＭ部分は、以下の構造：

を有する）
を有するＹ個のＭ部分を含む。

他の実施形態では、ピーク蛍光発光は、約５００〜約５５０ｎｍの範囲の波長に存在する。
さらにより多くの実施形態では、蛍光化合物は、少なくとも１つのエチレンオキシド部分を含む。
特許請求の範囲のいずれか１項の蛍光化合物を含む組成物および分析対象も提供される。
現在開示されている化合物は、「調節可能」であり、これは、当業者は、上述の化合物のいずれかにおける可変因子を適切に選択することにより、所望のおよび／または所定のモル蛍光光度（モル輝度）を有する化合物に到達することができることを意味する。本化合物の「調節可能性」により、使用者は、特定のアッセイにおいて使用するためまたは特定の目的分析対象を特定するための所望の蛍光および／または色を有する化合物に容易に到達することが可能となる。すべての可変因子は、本化合物のモル蛍光光度に影響を及ぼし得るが、Ｍ、Ｌ⁴、ｍおよびｎの適切な選択は、本化合物のモル蛍光光度において重要な役割を果たすと考えられる。したがって、一実施形態では、所望のモル蛍光光度を有する化合物を得るための方法であって、既知の蛍光光度を有するＭ部分を選択するステップ、Ｍ部分を含む構造（Ｉ）の化合物を調製するステップ、および所望のモル蛍光光度に到達するためのＬ⁴、ｍおよびｎに関する適切な可変因子を選択するステップを含む方法が提供される。

モル蛍光光度は、ある種の実施形態では、親フルオロフォア（例えば、モノマー）の蛍光発光に比べた、増加倍率または低下倍率に関して表現することができる。一部の実施形態では、本化合物のモル蛍光光度は、親フルオロフォアに比べて、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘまたはさらにより高い。様々な実施形態は、Ｌ⁴、ｍおよびｎの適切な選択によって、親フルオロフォアに比べて、所望の増加倍率の蛍光光度を有する化合物を調製することを含む。
例示を容易にするため、リン部分（例えば、ホスフェートなど）を含む様々な化合物は、陰イオン性状態（例えば、−ＯＰＯ（ＯＨ）Ｏ^-、−ＯＰＯ₃ ^2-）で図示されている。当業者は、電荷はｐＨに依存し、非電荷（例えば、プロトン化されているか、またはナトリウムもしくは他の陽イオンなどの塩）形態も、本発明の実施形態の範囲内に含まれることを容易に理解するであろう。
本記載では、図示されている式の置換基および／または可変因子の組合せは、このような寄与が安定な化合物をもたらす場合のみ許容可能となることが理解される。

本明細書に記載されている方法では、中間化合物の官能基が好適な保護基によって保護される必要があり得ることも、当業者によって理解されよう。このような官能基には、ヒドロキシ、アミノ、メルカプトおよびカルボン酸が含まれる。ヒドロキシに好適な保護基には、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが含まれる。アミノ、アミジノおよびグアニジノに好適な保護基には、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが含まれる。メルカプトに好適な保護基には、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”（式中、Ｒ”は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどが含まれる。カルボン酸に好適な保護基には、アルキル、アリールまたはアリールアルキルエステルが含まれる。保護基は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている、標準技法に準拠して、付加または除去することができる。保護基の使用は、Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wileyに詳述されている。当業者が理解している通り、保護基はまた、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂または塩化２−クロロトリチル樹脂などのポリマー樹脂であってもよい。
さらに、遊離塩基または酸形態で存在する本発明の化合物はすべて、当業者に公知の方法によって、適切な無機または有機の塩基または酸による処理によってその塩に変換することができる。本発明の化合物の塩は、標準技法によってその遊離塩基または酸形態に変換することができる。

以下の反応スキームは、本発明の化合物を作製する例示的な方法を例示している。当業者は、類似の方法により、または当業者に公知の他の方法を組み合わせることにより、これらの化合物を作製することが可能であり得ることが理解される。当業者であれば、適切な出発構成成分を使用し、必要に応じて合成のパラメーターを修正することにより、以下に具体的に例示されていない構造（Ｉ）の他の化合物を、以下に記載されているものと類似の方法で作製することが可能であることも理解される。一般に、出発構成成分は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＬａｎｃａｓｔｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩおよびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍＵＳＡなどの供給元から得ることができるか、または当業者に公知（例えば、Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition (Wiley, December 2000)を参照されたい）の情報源に従い合成することができるか、または本発明において記載されている通り調製することができる。

反応スキームＩ

反応スキームＩは、Ｒ¹、Ｌ²、Ｌ³およびＭが、上で定義されている通りであり、Ｒ²およびＲ³が、上で定義されている通りであるか、またはそれらの保護変形体であり、Ｌが任意に用いてもよいリンカーである、構造（Ｉ）の化合物の調製に有用な中間体を調製する例示的な方法を例示する。反応スキーム１を参照すると、構造ａの化合物は購入することができるか、または当業者に周知の方法により調製することができる。当分野で公知のＳｕｚｕｋｉカップリング条件下でのｘがブロモなどのハロゲンであるＭ−Ｘとの反応により、構造ｂの化合物となる。構造ｂの化合物は、以下に記載されている、構造（Ｉ）の化合物の調製に使用することができる。

反応スキームＩＩ

反応スキームＩＩは、構造（Ｉ）の化合物の調製に有用な中間体の調製の代替法を例示している。Ｒ¹、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、ＧおよびＭが、上で定義されている通りであり、Ｒ²およびＲ³が、上で定義されている通りであるか、またはそれらの保護変形体である、反応スキームＩＩを参照すると、購入することができるか、または周知技法によって調製することができる構造ｃの化合物は、Ｍ−Ｇ’と反応させると、構造ｄの化合物を生成する。ここで、ＧおよびＧ’は、相補性反応性を有する官能基（すなわち、反応して共有結合を形成する官能基）を表す。Ｇ’は、Ｍへのペンダント基、またはＭの構造上の主鎖の一部となり得る。ＧおよびＧ’は、それぞれ、アルキンおよびアジド、それぞれアミンおよび活性化エステル、またはそれぞれアミンおよびイソチオシアネートなどの、本明細書に記載されている任意の数の官能基とすることができる。

構造（Ｉ）の化合物は、構造ｂまたはｄの１つから、周知の自動化ＤＮＡ合成条件下で、以下の構造（ｅ）：

(e)
（式中、Ａは、本明細書で定義されている通りであり、Ｌはそれぞれ、独立して、任意に用いてもよいリンカーである）
を有するホスホロアミダイト化合物との反応によって調製することができる。

ＤＮＡ合成法は、当分野において周知である。手短に述べると、２つのアルコール基、例えば上の中間体ｂまたはｄ中のＲ²およびＲ³は、それぞれ、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト基により官能基化される。ホスホロアミダイト基は、通常、テトラゾールなどの活性化剤の存在下で、アルコール基とカップリングさせて、次いで、ヨウ素によりリン原子を酸化する。ジメトキシトリチル基を酸（例えば、クロロ酢酸）により除去することができ、遊離アルコールを露出させ、これをホスホロアミダイト基と反応させることができる。２−シアノエチル基は、アンモニア水による処理によってオリゴマー化した後に除去することができる。

オリゴマー化法に使用されるホスホロアミダイトの調製もまた、当分野で周知である。例えば、一級アルコール（例えば、Ｒ³）は、ＤＭＴ−Ｃｌとの反応によってＤＭＴ基として保護することができる。次に、二級アルコール（例えば、Ｒ²）を、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（ｄｉｓｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）などの適切な試薬との反応によって、ホスホロアミダイトとして官能基化する。ホスホロアミダイトの調製およびそれらのオリゴマー化の方法は、当分野で周知であり、実施例中にさらに詳細に記載する。

構造（Ｉ）の化合物は、上記の周知のホスホロアミダイト化学反応に従って、中間体ｂまたはｄおよびｅのオリゴマー化により調製する。ホスホロアミダイトカップリングを所望の回数、繰り返すことによって、所望の数の繰り返し単位であるｍおよびｎを分子に組み込む。

一部の他の実施形態では、本化合物は、以下の構造（ＩＩ）：

(II)
またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩（式中、
Ｍは、出現毎に独立して、２つ以上の炭素−炭素二重結合および少なくとも一共役度を含む部分であり、
Ｌ¹、Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ原子リンカーであり、
Ｌ⁴は、出現毎に独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり、
Ｒ¹は、出現毎に独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c、Ｑ、Ｑへの共有結合を含むリンカー、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカーまたは構造（ＩＩ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、Ｒ_bは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＳＲ_d、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、
Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ⁵は、出現毎に独立して、オキソ、チオキソであるか、または存在せず、
Ｑは、出現毎に独立して、分析対象分子、固体支持体または相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な、反応性基を含む部分であり、
Ｒ^dは、陽イオンであり、
ｍは、出現毎に独立して、０以上の整数であり、ただし、出現するｍの少なくとも１つは、３以上の整数であることを条件とし、
ｎは、１以上の整数である）
を有する。

一部の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、３以上の整数である。
一部の実施形態では、Ｌ¹、Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである。

構造（ＩＩ）の化合物の一部の他の実施形態では、
Ｍは、出現毎に独立して、２つ以上の炭素−炭素二重結合および少なくとも一共役度を含む部分であり、
Ｌ¹、Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーであり、
Ｌ⁴は、出現毎に独立して、長さが最大で２０個の原子となる、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり、
Ｒ¹は、出現毎に独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c、Ｑ、Ｑへの共有結合を含むリンカー、分析対象分子への共有結合を含むリンカーまたは固体支持体への共有結合を含むリンカーであり、Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、Ｒ_bは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＳＲ_d、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、
Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ⁵は、出現毎に独立して、オキソ、チオキソであるか、または存在せず、
Ｑは、分析対象分子または固体支持体との結合を可能にする部分であり、
Ｒ_dは、陽イオンであり、
ｍは、出現毎に独立して、０以上の整数であり、ただし、出現するｍの少なくとも１つは、３以上の整数であることを条件とし、
ｎは、１以上の整数である。

一部の実施形態では、本化合物は、以下の構造（ＩＩＡ）：

(IIA)
（式中、ｘ¹、ｘ²およびｘ³は、出現毎に独立して、０〜６の整数である）
を有する。

Ｌ⁴リンカーは、所望の蛍光および／または色を実現するよう、他の可変因子と合わせて選択することができる（蛍光および／または色を「調節する」）。一部の実施形態では、Ｌ⁴は、長さが最大で２０個の原子、長さが最大で１３個の原子、例えば長さが最大で１０個の原子、または長さが最大で６個の原子のリンカーである。ある種の実施形態では、Ｌ⁴は、ジスルフィド結合を含まない。他の実施形態では、Ｌ⁴は、出現毎に独立して、Ｃ₁−Ｃ₆アルキレンまたはＣ₂−Ｃ₆アルキニレンである。一部の実施形態では、Ｌ⁴は、２個の炭素のリンカーである。
一部の他の異なる実施形態では、本化合物は、以下の構造（ＩＩＢ）：

(IIB)
（式中、
ｘ¹、ｘ²およびｘ³は、出現毎に独立して、０〜６の整数であり、
ｙは、出現毎に独立して、１〜６の整数である）
を有する。

上述のある種の実施形態では、ｙは２である。他の実施形態では、ｘ¹、ｘ²およびｘ³は、出現毎に、それぞれ１である。一部の異なる実施形態では、出現毎に、ｘ²は０であり、ｘ³は１である。
さらに他の実施形態では、Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ_dである。「ＯＲ_d」および「ＳＲ_d」は、陽イオンに結合した、Ｏ^-およびＳ^-を指すことが意図されることが理解される。例えば、ホスフェート基の二ナトリウム塩は、以下の通り表すことができる：

（式中、Ｒ^dは、ナトリウム（Ｎａ⁺）である）。

さらに上述の実施形態では、Ｒ⁵は、出現毎に、オキソである。
一部の他の実施形態では、本化合物は、以下の構造（ＩＩＢ’）または（ＩＩＢ”）のうちの１つ：

を有する。
上述のいずれかの実施形態では、Ｒ¹は、Ｈである。
異なる実施形態では、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ^aは、Ｏであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ^dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、Ｏ^-、ＯＲ^d、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、Ｒ^dは、対イオンである。

さらに他の異なる実施形態では、Ｒ²またはＲ³の一方はＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方は、Ｑ、またはＱへの共有結合を含むリンカーである。例えば、一部の実施形態では、Ｒ²またはＲ³の一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方は、Ｑ、またはＱへの共有結合を含むリンカーであり、Ｒ^aは、Ｏであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ^dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、Ｏ^-、ＯＲ^d、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、Ｒ^dは、対イオンである。
さらに他の実施形態では、Ｑは、分析対象分子または固体支持体との結合を可能にする部分であるか、またはこの部分を含む。ある種の実施形態では、Ｑは、構造（ＩＩ）の化合物を分析対象分子または固体支持体に結合させる手段（例えば、共有結合による）を提供する。例えば、一部の実施形態では、Ｑは、分析対象分子または固体支持体との共有結合を可能にする反応性基であるか、またはこの基を含む。この点では、Ｑ基のタイプ、および構造（ＩＩ）の化合物の残りへのＱ基の結合は、限定されない。ある種の実施形態では、Ｑは、水性条件下で加水分解を受けにくいが、分析対象分子または固体支持体の表面の対応する基（例えば、アミン）と結合を形成するのに十分な反応性のある部分である。

構造（ＩＩ）の化合物のある種の実施形態は、バイオコンジュゲートの分野において、一般に使用されているＱ基を含む。例えば、一部の実施形態では、Ｑは、求核性反応性基、求電子性反応性基または環化付加反応性基であるか、またはこれらの基を含む。一部のより具体的な実施形態では、Ｑは、スルフヒドリル、ジスルフィド、活性化エステル、イソチオシアネート、アジド、アルキン、アルケン、ジエン、求ジエン体、酸ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル、ホスフィン、α−ハロアミド、ビオチン、アミノまたはマレイミドであるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、活性化エステルは、Ｎ−スクシンイミドエステル、イミドエステルまたはポリフルオロフェニルエステルである。他の実施形態では、アルキンは、アルキルアジドまたはアシルアジドである。例示的なＱ部分は、上の表１に提示されている。
一部の実施形態では、ＱはＳＨであり、ＳＨ部分は、構造（ＩＩ）の別の化合物上の別のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成する傾向があることに留意すべきである。したがって、一部の実施形態は、ジスルフィド二量体の形態にある、構造（ＩＩ）の化合物を含み、ジスルフィド結合は、ＳＨであるＱ基から誘導される。

一部の他の実施形態では、Ｒ²またはＲ³の一方はＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方は、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、または固体支持体への共有結合を含むリンカーである。一部の異なる実施形態では、Ｒ²またはＲ³の一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方は、分析対象分子への共有結合を含むリンカーまたは固体支持体への共有結合を含むリンカーであり、Ｒ^aは、Ｏであり、Ｒ_bは、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ^dであり、Ｒ_cは、ＯＨ、Ｏ^-、ＯＲ^d、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、Ｒ^dは、対イオンである。例えば、一部の実施形態では、分析対象分子は、核酸、アミノ酸またはそれらのポリマーである。他の実施形態では、分析対象分子は、酵素、受容体、受容体リガンド、抗体、グリコタンパク質、アプタマーまたはプリオンである。さらに異なる実施形態では、固体支持体は、ポリマー製ビーズまたは非ポリマー製ビーズである。
ｍの値は、所望の蛍光および／または発色強度に基づいて選択され得る別の可変因子である。一部の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、３〜１０の整数である。他の実施形態では、ｍは、出現毎に独立して、７〜９の整数である。

蛍光強度はまた、様々な値のｎを選択することにより調節することができる。ある種の実施形態では、ｎは、１〜１００の整数である。他の実施形態では、ｎは、１〜１０の整数である。
Ｍは、所望の光学特性に基づいて、例えば、所望の色および／または蛍光の発光波長に基づいて選択される。一部の実施形態では、Ｍは、出現毎に同じである。しかし、Ｍの各出現が、同一のＭである必要はないこと、およびある種の実施形態は、Ｍが出現毎に同じではない化合物を含むことに留意することが重要である。Ｍは、Ｍ上の任意の位置（すなわち、原子）から分子の残りに結合し得る。当業者は、Ｍが分子の残りに結合するための手段を認識していよう。

一部の実施形態では、Ｍは、蛍光または発色部分である。当分野での公知であり、比色分析アッセイ、ＵＶアッセイおよび／または蛍光アッセイに通常、使用される任意の蛍光および／発色部分が使用されてもよい。本発明の様々な実施形態に有用なＭ部分の例には、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンまたはテキサスレッド）；シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンまたはメロシアニン）；スクアライン誘導体および環置換スクアライン（セタ、セタウおよびスクエア色素を含む）；ナフタレン誘導体（例えば、ダンシルおよびポロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールまたはベンゾオキサジアゾール）；アントラセン誘導体（例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫオレンジを含むアントラキノン）；カスケードブルーなどのピレン誘導体；オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）；アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；アリールメチン誘導体：アウラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン；およびテトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニンまたはビリルビン）が含まれる。他の例示的なＭ部分には、シアニン色素、キサンテート色素（例えば、Ｈｅｘ、Ｖｉｃ、Ｎｅｄｄ、ＪｏｅまたはＴｅｔ）；ヤキマイエロー；レッドモンドレッド；タムラ；テキサスレッドおよびａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）色素が含まれる。

上述のいずれかのさらに他の実施形態では、Ｍは、３つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せ、例えば、４つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せ、あるいは５つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せさえも含む。一部の実施形態では、Ｍは、６つのアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せを含む。さらなる実施形態では、環は縮合している。例えば、一部の実施形態では、Ｍは、３つ以上の縮合環、４つ以上の縮合環、５つ以上の縮合環、または６つ以上の縮合環さえも含む。
一部の実施形態では、Ｍは、環式である。例えば、一部の実施形態では、Ｍは、炭素環式である。他の実施形態では、Ｍは、複素環式である。上述のさらに他の実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、アリール部分を含む。これらの実施形態の一部では、アリール部分は、多環式である。他のより具体的な例では、アリール部分は、縮合多環式アリール部分であり、例えば、この縮合多環式アリール部分は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または４つを超えることさえあるアリール環を含んでもよい。
上述の構造（ＩＩ）の化合物のいずれかの他の実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、少なくとも１個のヘテロ原子を含む。例えば、一部の実施形態では、ヘテロ原子は、窒素、酸素または硫黄である。

上述のいずれかのさらにより多くの実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、少なくとも１つの置換基を含む。例えば、一部の実施形態では、置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アリールオキシ、フェニル、アリール、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、カルボキシ、スルホネート、アミドまたはホルミル基である。

上述の一部のさらにより具体的な実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、ジメチルアミノスチルベン、キナクリドン、フルオロフェニル−ジメチル−ＢＯＤＩＰＹ、ｈｉｓ−フルオロフェニル−ＢＯＤＩＰＹ、アクリジン、テリレン、セキシフェニル、ポルフィリン、ベンゾピレン（フルオロフェニル−ジメチル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、（ビス−フルオロフェニル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、クアテルフェニル、ビ−ベンゾチアゾール、ター−ベンゾチアゾール、ビ−ナフチル、ビ−アントラシル、スクアライン、スクアリリウム、９，１０−エチニルアントラセンまたはター−ナフチル部分である。他の実施形態では、Ｍ¹は、出現毎に独立して、ｐ−ターフェニル、ペリレン、アゾベンゼン、フェナジン、フェナントロリン、アクリジン、チオキサントレン、クリセン、ルブレン、コロネン、シアニン、ペリレンイミドもしくはペリレンアミド、またはそれらの誘導体である。さらにより多くの実施形態では、Ｍは、出現毎に独立して、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー移動色素、チアゾールオレンジ色素、ポリメチンまたはＮ−アリール−１，８−ナフタルイミド色素である。

上述のいずれかのさらにより多くの実施形態では、Ｍは、出現毎に、同じである。他の実施形態では、Ｍはそれぞれ、異なる。さらにより多くの実施形態では、１つまたは複数のＭは同じであり、１つまたは複数のＭは異なる。
一部の実施形態では、Ｍは、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドもしくは６−ＦＡＭ、またはそれらの誘導体である。一部の他の実施形態では、Ｍ¹は、以下の構造：

のうちの１つを有する。

一部の他の実施形態では、Ｍ¹は、以下の構造：

を有する。

一部の具体的な実施形態では、本化合物は、表３から選択される化合物である：

表３において使用される通り、および本出願の全体を通じて、Ｆ、ＥおよびＹは、それぞれ、フルオレセイン、ペリレンおよびピレン部分を指し、以下の構造：

を有する。

現在開示されている色素化合物は、「調節可能」であり、これは、当業者は、上述の化合物のいずれかにおける可変因子を適切に選択することにより、所望のおよび／または所定のモル蛍光光度（モル輝度）を有する化合物に到達することができることを意味する。本化合物の「調節可能性」により、使用者は、特定のアッセイにおいて使用するためまたは特定の目的分析対象を特定するための所望の蛍光および／または色を有する化合物に容易に到達することが可能となる。すべての可変因子は、本化合物のモル蛍光光度に影響を及ぼし得るが、Ｍ、ｍ、ｎおよびＬ⁴の適切な選択は、本化合物のモル蛍光光度において重要な役割を果たすと考えられる。したがって、一実施形態では、所望のモル蛍光光度を有する化合物を得るための方法であって、既知の蛍光光度を有するＭ部分を選択するステップ、Ｍを含む構造（ＩＩ）の化合物を調製するステップ、および所望のモル蛍光光度に到達するためのｍ、ｎおよびＬ⁴に関する適切な可変因子を選択するステップを含む方法が提供される。

モル蛍光光度は、ある種の実施形態では、親フルオロフォア（例えば、モノマー）の蛍光発光に比べた、増加倍率または低下倍率に関して表現することができる。一部の実施形態では、本化合物のモル蛍光光度は、親フルオロフォアに比べて、１．１ｘ、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘまたはさらに高い。様々な実施形態は、ｍ、ｎおよびＬ⁴の適切な選択によって、親フルオロフォアに比べて、所望の増加倍率の蛍光光度を有する化合物を調製することを含む。
例示を容易にするため、リン部分（例えば、ホスフェートなど）を含む様々な化合物は、陰イオン性状態（例えば、−ＯＰＯ（ＯＨ）Ｏ^-、−ＯＰＯ₃ ^2-）で図示されている。当業者は、電荷は、ｐＨに依存し、非電荷（例えば、プロトン化されているか、またはナトリウムもしくは他の陽イオンなどの塩）形態も、本発明の範囲内に含まれることを容易に理解するであろう。
上で説明されている構造（ＩＩ）の化合物の任意の実施形態、および上で説明されている構造（ＩＩ）の化合物中の可変因子Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｍ、ｍおよびｎに関して本明細書において説明されている任意の特定の選択肢は、他の実施形態、および／または構造（ＩＩ）の化合物の可変因子と独立して組み合わされて、上で具体的に説明されていない本発明の実施形態を形成してもよいことが理解される。さらに、選択肢のリストが、特定の実施形態および／または特許請求の範囲における任意の特定の可変因子Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³、Ｌ⁴、Ｍ、ｍおよびｎに関して一覧表示されている場合、個々の選択肢はそれぞれ、特定の実施形態および／または特許請求の範囲から削除され得ること、ならびに選択肢の残りのリストは、本発明の範囲内にあると見なされることが理解される。

本記載では、図示されている式の置換基および／または可変因子の組合せは、このような寄与が安定な化合物をもたらす場合にのみ、許容可能となることが理解される。
本明細書に記載されている方法では、中間化合物の官能基が好適な保護基によって保護される必要があり得ることも当業者により理解されよう。このような官能基には、ヒドロキシ、アミノ、メルカプトおよびカルボン酸が含まれる。ヒドロキシに好適な保護基には、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが含まれる。アミノ、アミジノおよびグアニジノに好適な保護基には、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが含まれる。メルカプトに好適な保護基には、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”（式中、Ｒ”は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどが含まれる。カルボン酸に好適な保護基は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルエステルを含む。保護基は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている、標準技法に準拠して、付加または除去することができる。保護基の使用は、Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wileyに詳述されている。当業者が理解している通り、これらの保護基は、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂または塩化２−クロロトリチル樹脂などのポリマー樹脂であってもよい。

さらに、遊離塩基または酸形態で存在する本発明の化合物はすべて、当業者に公知の方法によって、適切な無機または有機の塩基または酸による処理によってその塩に変換することができる。本発明の化合物の塩は、標準技法によってその遊離塩基または酸形態に変換することができる。
以下の反応スキームは、本発明の化合物を作製する例示的な方法を例示している。当業者は、類似の方法により、または当業者に公知の他の方法を組み合わせることにより、これらの化合物を作製することが可能であり得ることが理解される。当業者は、適切な出発構成成分を使用し、必要に応じて合成のパラメーターを修正することにより、以下に具体的に例示されていない構造（ＩＩ）の他の化合物を、以下に記載されている類似の方法で、作製することが可能であることも理解される。一般に、出発構成成分は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＬａｎｃａｓｔｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩおよびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍＵＳＡなどの供給元から得ることができるか、または当業者に公知（例えば、Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition (Wiley, December 2000)を参照されたい）の情報源に従い合成することができるか、または本発明において記載されている通り調製することができる。

反応スキームＩ

反応スキームＩは、Ｒ¹、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³およびＭが、上で定義されている通りであり、Ｒ²およびＲ³が、上で定義されている通りであるか、またはそれらの保護変形体である、構造（ＩＩ）の化合物の調製に有用な中間体を調製する例示的な方法を例示している。反応スキーム１を参照すると、構造ａの化合物は購入することができるか、または当業者に周知の方法により調製することができる。当分野で公知のＳｕｚｕｋｉカップリング条件下でのｘがブロモなどのハロゲンであるＭ−Ｘとの反応により、構造ｂの化合物をもたらす。構造ｂの化合物は、以下に記載されている、構造（ＩＩ）の化合物の調製に使用することができる。

反応スキームＩＩ

反応スキームＩＩは、構造（ＩＩ）の化合物の調製に有用な中間体の化合物の調製の代替法を例示している。Ｒ¹、Ｌ¹、Ｌ²、Ｌ³およびＭが、上で定義されている通りであり、Ｒ²およびＲ³が、上で定義されている通りであるか、またはそれらの保護変形体である、反応スキームＩＩを参照すると、購入することができるか、または周知技法によって調製することができる構造ｃの化合物を、Ｍ−Ｚと反応させると、構造ｄの化合物が生成する。ここで、ＹおよびＺは、相補性反応性を有する官能基（すなわち、反応して共有結合を形成する官能基）を表す。Ｚは、Ｍへのペンダント基、またはＭの構造上の主鎖、例えば環式無水物の一部となり得る。Ｙはアミノなどの任意の数の官能基であってもよい。

ある種の実施形態では、構造Ｉの化合物は、２〜１００の繰り返し単位を含むオリゴマーである。このようなオリゴマーは、周知の自動化ＤＮＡ合成法と類似の方法を使用して調製することができる。ＤＮＡ合成法は、当分野において周知である。手短に述べると、２つのアルコール基、例えば上の中間体ｂまたはｄ中のＲ²およびＲ³は、それぞれ、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト基により官能基化されている。ホスホロアミダイト基は、通常、テトラゾールなどの活性化剤の存在下で、アルコール基とカップリングさせて、次いで、ヨウ素によりリン原子を酸化する。ジメトキシトリチル基を酸（例えば、クロロ酢酸）により除去することができ、遊離アルコールを露出させ、これをホスホロアミダイト基と反応させることができる。２−シアノエチル基は、アンモニア水による処理によってオリゴマー化した後に除去され得る。

オリゴマー化法に使用されるホスホロアミダイトの調製もまた、当分野で周知である。例えば、一級アルコール（例えば、Ｒ³）は、ＤＭＴ−Ｃｌとの反応によってＤＭＴ基として保護され得る。次に、二級アルコール（例えば、Ｒ²）を、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトなどの適切な試薬との反応によって、ホスホロアミダイトとして官能基化する。ホスホロアミダイトの調製およびそれらのオリゴマー化の方法は、当分野で周知であり、実施例中にさらに詳細に記載する。

中間体ｂまたはｄのオリゴマーは、上記の周知のホスホロアミダイト化学反応に従って調製する。所望の数のｍ個の繰り返し単位は、ホスホロアミダイトカップリングを、適切な中間体、例えば以下の構造：

を有する中間体と所望の回数、繰り返すことによって分子に組み込まれる。

実施形態では、表４に列挙されている色素化合物は、本開示の組成物および／または方法に使用されてもよい。表４に列挙されている色素化合物は、当分野で公知の手順に準拠して調製した（例えば、合成法に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／１８３１８５を参照されたい）。ＵＶおよび蛍光特性は、２ｎＭおよびｐＨ９で求めた。

実施形態では、表５に列挙されている色素化合物は、本開示の組成物および／または方法に使用することができる。表５に列挙されている色素化合物は、当分野で公知の手順に準拠して調製した（例えば、合成法に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／１８３１８５を参照されたい）。

ε_tおよびＦは、上で定義されている通りであり、「Ｃリンカー」は、以下の構造：

「Cリンカー」
を有する。

実施形態では、表６に列挙されている色素化合物は、本開示の組成物および／または方法に使用することができる。表６に列挙されている色素化合物は、当分野で公知の手順に準拠して調製した（例えば、合成法に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／１８３１８５を参照されたい）。ＵＶおよび蛍光特性は、２ｎＭおよびｐＨ９で求めた。

実施形態では、表７に列挙されている色素化合物は、本開示の組成物および／または方法に使用することができる。表７に列挙されている色素化合物は、当分野で公知の手順に準拠して調製した（例えば、合成法に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／１８３１８５を参照されたい）。ＵＶおよび蛍光特性は、２５ｎＭおよびｐＨ９で求めた。

実施形態では、表８に列挙されている色素化合物は、本開示の組成物および／または方法に使用することができる。表８に列挙されている色素化合物は、当分野で公知の手順に準拠して調製した（例えば、合成法に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／１８３１８５を参照されたい）。ＵＶおよび蛍光特性は、１０ｎＭおよびｐＨ９で求めた。

実施形態では、表９に列挙されている色素化合物は、本開示の組成物および／または方法に使用することができる。表９に列挙されている色素化合物は、当分野で公知の手順に準拠して調製した（例えば、合成法に関する教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／１８３１８５を参照されたい）。ＵＶおよび蛍光特性は、５０ｎＭおよびｐＨ９で求めた。

以下の実施例は、限定ではなく、例示目的に提示される。

一般方法
質量スペクトル分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１アクイジションソフトウェアを使用する、Ｗａｔｅｒｓ／ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏマイクロＭＳ／ＭＳシステム（ＭＳモードのみ）で行った。色素に関してＬＣ／ＭＳに使用した移動相は、１００ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）、８．６ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ８とした。ホスホロアミダイトおよび前駆体分子も、アセトニトリル／水の移動相のグラジエントを使用し、４５℃に保持した２．１ｍｍｘ５０ｍｍＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨ−Ｃ１８カラムを備えるＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＨＰＬＣシステムを使用して分析した。モノマー中間体の分子量は、Ｗａｔｅｒｓ／ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏマイクロＭＳ／ＭＳシステム（ＭＳモードのみ）で、トロピリウム陽イオン注入増強イオン化を使用して得た。励起および発光プロファイル実験を、ＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅスペクトル光度計で記録した。
反応はすべて、特に明記しない限り、窒素雰囲気下、オーブン乾燥したガラス器具中で行った。市販のＤＮＡ合成試薬をＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）から購入した。無水ピリジン、トルエン、ジクロロメタン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、酢酸、ピリジンおよびＴＨＦは、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。他の化学品はすべて、ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴＣＩから購入し、さらに精製することなくそのまま使用した。

（実施例１）
エチレングリコールスペーサーを有する色素の合成
エチレンオキシドリンカーを有する化合物は、以下の通り調製した：
オリゴフルオロシド構築物（すなわち、構造（Ｉ）の化合物）は、１μｍｏｌのスケールで、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で合成し、３’−ホスフェート基または３’−Ｓ₂−（ＣＨ₂）₆−ＯＨ基または本明細書に記載されている他の基のいずれかを有した。合成は、標準ホスホロアミダイト（ｐｈｏｐｓｈｏｐｏｒａｍａｄｉｔｅ）化学を使用して、ＣＰＧビーズまたはポリスチレン固体支持体上で直接行った。オリゴフルオロシドは、標準固相ＤＮＡ法を使用して、３’から５’の方向に合成し、カップリングは、標準β−シアノエチルホスホロアミダイト化学反応を使用した。フルオロシドホスホロアミダイトおよびスペーサー（例えば、ヘキサエチルオキシ−グリコールホスホロアミダイト、トリエチルオキシ−グリコールホスホロアミダイト、ポリエチレングリコールホスホロアミダイト）およびリンカー（例えば、５’−アミノ−改変体ホスホロアミダイトおよびチオール−改変体Ｓ２ホスホロアミダイト）をアセトニトリルに溶解して、０．１Ｍ溶液にし、以下の合成サイクルを使用する連続的な順序で加えた。１）ジクロロメタン中、５’−ジメトキシトリチル保護基をジクロロ酢酸で除去する、２）アセトニトリル中、次のホスホロアミダイトを活性剤試薬でカップリングする、３）Ｐ（ＩＩＩ）をヨウ素／ピリジン／水で酸化して、安定なＰ（ｖ）を形成させる、および４）未反応５’−ヒドロキシル基のいずれも無水酢酸／１−メチルイミダゾール（１−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）／アセトニトリルによりキャップする。完全長オリゴフルオロシド構築物が組み立てられるまで、この合成サイクルを繰り返した。鎖の組み立ての終わりに、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）基またはジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を、ジクロロメタン中、ジクロロ酢酸で除去した。

化合物を、ラベルを付けたエッペンドルフ管中、０．２ｕｍｏｌのスケールで、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）支持体表面に供した。２０〜３０％のＮＨ₄ＯＨ４００μＬを加え、穏やかに混合した。開放した管を５５℃で約５分間、または過剰のガスが放出するまで置き、次に、しっかりと密閉して、２時間（＋／−１５分間）、インキュベートした。管を加熱ブロックから取り出し、室温に到達させ、次いで１３，４００ＲＰＭで３０秒間、遠心分離し、上清および固体を固めた。上清を注意深く取り除き、ラベルを付けた管に入れて、次に、１５０μＬのアセトニトリルを加えて、支持体を洗浄した。洗浄液を管に加えた後、乾燥するまで、４０℃のＣｅｎｔｒｉＶａｐ装置に入れた。
生成物は、ＥＳＩ−ＭＳ（表２を参照されたい）、ＵＶ−吸光度および蛍光分光法によって特徴付けを行った。

（実施例２）
化合物のスペクトル試験
乾燥化合物を、１５０μＬの０．１ＭＮａ₂ＣＯ₃緩衝液中で復元し、約１ｍＭの保存溶液を作製した。濃保存溶液を０．１ｘＰＢＳ中で５０×に希釈し、ＮａｎｏＤｒｏｐＵＶ分光計で分析して、吸光度の読取り値を得た。吸光度の読取り値を、吸光係数（各ＦＡＭ単位に関して７５，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1）およびＢｅｅｒの法則と共に使用して、この保存溶液の実際の濃度を求めた。
計算した保存溶液の濃度から、約４ｍＬの５μＭ溶液を０．１ＭＮａ₂ＣＯ₃（ｐＨ９）中で作製し、Ｃａｒｙ６０ＵＶ分光計で、１×１ｃｍの石英キュベット中、３００ｎｍ〜７００ｎｍのスペクトル範囲を使用して分析し、この基に対する全体の吸光度を測定した。ＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計でのスペクトル分析のために、これらの５μＭ溶液から、第２の希釈液を５０ｎＭまたは２５ｎＭ（やはり、０．１ＭＮａ₂ＣＯ₃中、ｐＨ９）のどちらかで作製した。励起を４９４ｎｍに設定し、発光スペクトルを４９９〜７００ｎｍで収集した。

図１および図２は、代表的な構造（Ｉ）の化合物および比較化合物（「化合物Ａ」）のＵＶ吸光度を提示している。図１および２において観察される通り、２つのフルオロセイン部分を含む代表的な構造（Ｉ）の化合物のＵＶ吸光係数は、化合物ＡのＵＶ吸光係数の約２倍である。

化合物A

代表的な構造（Ｉ）の化合物の蛍光発光スペクトルもまた決定し、化合物Ａの発光スペクトルと比較した。図３および４のデータによって実証される通り、代表的な構造（Ｉ）の化合物の蛍光発光は、化合物Ａよりも大きく、発光は、トリエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール単位数が増加するにつれて増大する。理論に拘泥することを望むものではないが、蛍光発光のこのような予期せぬ増大は、Ｌ⁴により設けられる空間距離に関連する内部消光の低減に関連していると考えられる。
化合物のＵＶ吸光度および蛍光発光に及ぼすＭ部分の数の影響を求めるために、化合物Ｉ−１０およびＩ−１１を試験した。図５は、５μｍにおいて、化合物Ｉ−１０およびＩ−１１のＵＶ吸光度を、単一Ｍ部分を有する比較化合物（「化合物Ｂ」）と比較したデータを提示している。５ｕＭでは、単一ＦＡＭ単位を含有する化合物Ｂは、０．４３ＡＵで吸収した一方、化合物Ｉ−１０（３つのＦＡＭ単位）は、１．１７ＡＵで吸収し、化合物Ｉ−１１（５つのＦＡＭ単位）は、２．００ＡＵで吸収した。

化合物B

２５ｎＭにおける、化合物Ｉ−１０、Ｉ−１１およびＢの蛍光発光スペクトルが、図６に示されている。化合物Ｉ−１０およびＩ−１１は、消光（空間がより密なＦＡＭ単位であれば起こる）よりもむしろ、化合物Ｂの値と比べて、それぞれ、２．５ｘおよび４．３ｘ大きな発光応答を示した。

（実施例３）
比較蛍光発光応答
化合物「ＨＥＧ」、「ＴＥＧ」、「Ｃ２」、「Ｃ３」、「Ｃ４」および「Ｃ６」（Ｒ²およびＲ³は、化合物Ｉ−３に関して定義されている通りであり、ｍは、１〜９と様々である）を調製し、それらの蛍光発光スペクトルを求めた。結果が図７に示されている。データは、本発明の実施形態による化合物（すなわち、ＨＥＧおよびＴＥＧ）が、他の色素化合物に比べて、より少ない繰り返しスペーサー部分（すなわち、ｍがより低い値である）で蛍光発光を増大させたことを示す。

図８は、ｍが１、２または３である「ＨＥＧ」化合物の蛍光発光を、化合物Ａ（５０ｎＭ、ｐＨ＝９）と比較したデータを提示している。このデータは、ｍが２より大きい場合、化合物Ａに比べて、ＨＥＧの蛍光発光が増大していることを示している。

（実施例４）
代表的な化合物の調製
化合物Ｉ−２９、Ｉ−３２および代表的な類似体を調製し、Ｌ⁴が長いリンカー（約１，０００ダルトンのＰＥＧ）である化合物が、より短いＬ⁴リンカーを有するが、複数の繰り返し部（すなわち、ｍが１より大きい）を有する化合物と類似した特性を有するかどうかを判定するために試験した。図９は、化合物Ｉ−６０、化合物Ｉ−４６および化合物ＢのＵＶ吸光度データを提示している。このデータは、長いＬ⁴リンカーを有する化合物は、より短いリンカーの複数の繰り返し部を有する化合物のＵＶ吸光度と類似したＵＶ吸光度を有すること、およびどちらの化合物も、対照化合物Ｂに比べて、吸光度が向上していることを示している。

（実施例５）
９９量体色素の調製
３３個のフルオレセイン部分を有する化合物Ｉ−４２は、本明細書に記載されている標準固相オリゴヌクレオチド技法を使用して調製した。Ｉ−４２（以下のスキーム中では、「Ａ」によって表されている）は、以下に例示および記載されている通りに三量体化し、９９量体色素を形成した。

２００μＬポリプロピレン製管中に、リン酸ナトリウム緩衝液（３．５μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ＝６．５）およびＩ−４２ビス−ジスルフィド（５．５μＬ、水中０．１８ｍＭ）の溶液を入れた。ここに、溶液トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１．０μＬ、水中１０ｍＭ）を加えた。この管に栓をして、ボルテックスし、室温で２時間、インキュベートした。この混合物をマイクロＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号８９８７７）に通して脱塩した。この脱塩溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（２．０μＬ、５００ｍＭ、ｐＨ＝７．２）およびビスマレイミドエタンのＤＭＳＯ溶液（ＢＭＯＥ、１．０μＬ、０．２５ｍＭ）で処理し、室温で一晩、インキュベートした。この反応混合物を水（１００μＬ）により希釈し、ＰＡＧＥ（図１０、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＥＣ６８７５、１０％ＴＢＥ−ウレアゲル、１８０Ｖで一定、電気泳動は、最高のＭＷ化学種の分離が完了すると停止した。ＵＶ照射（３６５ｎｍ）によって可視化した）によって分析した。
任意の所望の数の色素部分を有する他のオリゴマー色素を類似の方法で調製する。

（実施例６）
一般的なフローサイトメトリー法
特に明記されていない限り、以下の一般手順を以下の実施例に使用した。
全血の溶解：
緩衝化塩化アンモニウム法。生細胞の染色に関しては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）で抗凝固した正常ヒト血液を、３５ｍＬの溶解液に対して１５ｍＬの血液で、塩化アンモニウム溶液（ＡＣＫ）に、室温（ＲＴ）で１５分間、バルク溶解する。この細胞を、５０％のハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）、および０．０２％のアジ化ナトリウムを含む５０％の１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１ｘダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩水（ＤＰＢＳ）で２回、洗浄した。次に、この細胞をドナー血漿中、１００μＬ／試験品／０．１〜１ｘ１０ｅ６に再懸濁させた。ポリプロピレン製９６ウェルＨＴＳプレートにおいて、１００μＬのＶ_fの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０２％アジ化ナトリウムを含む１×ＤＰＢＳの事前希釈抗体に血漿中の細胞を加えた。室温で４５分間、インキュベートした後、５０％のＨＢＳＳ、および０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０％の１％ＦＢＳ１ｘＤＰＢＳで２回、洗浄した。

溶解／固定法。血液を、３５ｍＬの溶解液に対して１００〜１５ｍＬの血液で、１．０ｍＬのＲＢＣ溶解溶液（塩化アンモニウム）に室温で１５分間、溶解した。次に、５０％のＨＢＳＳ、および０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０％の１％ＦＢＳ１ｘＤＰＢＳで２回、洗浄した。次に、細胞をドナー血漿中、１００μＬ／試験品／１ｘ１０ｅ６に再懸濁させた。事前希釈抗体を、１００μＬの１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む１ｘＤＰＢＳに加えた。１００μＬの細胞をポリプロピレン製９６ウェルＨＴＳプレートに加えた（全量が２００μＬの試験サイズ）。室温で４５分間のインキュベート後、５０％ＨＢＳＳ、および０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０％の１％ＦＢＳ１ｘＤＰＢＳで２回、洗浄した。

抗体コンジュゲートの調製：
抗体コンジュゲートは、以下の構造を有するＱ部分を含む構造（Ｉ）の化合物：

を所望の抗体と反応させることにより調製した。こうして、本化合物および抗体を、Ｑ部分を有する抗体上のＳの反応によってコンジュゲートし、以下の連結構造：

を形成させた。
抗体コンジュゲートは、抗体名の後に化合物番号を付けて表示する。例えば、ＵＣＨＴ１−Ｉ−４５は、化合物Ｉ−４５とＵＣＨＴ１抗体との間で形成されたコンジュゲートを示す。参照する化合物番号が、表２中の上のＱ部分を含まない場合、Ｑ部分が導入され、コンジュゲートは、Ｑ部分を有する生じた化合物から調製したと理解される。

コンジュゲートの希釈
抗体を室温にした。細胞染色用緩衝液（１ＸＤＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）中、抗体コンジュゲートを０．１〜５４０ｎＭ（試験あたり８．０マイクログラム以下）の範囲の濃度に希釈した。いくつかの実施例において、各試料の段階希釈を細胞染色用緩衝液中、２６９ｎＭの抗体で開始し、使用するまで抗体希釈液を光から保護して維持した。他の実験では、希釈は、４．０μｇの抗体／試験のサイズで開始し、試験サイズは、１００〜２００μＬの範囲とした。滴定は、２倍または４倍希釈液で行い、結合曲線を生成した。一部の場合、８．０または２．０μｇ／試験のサイズを希釈シリーズにおける第１のウェルに使用した。

コンジュゲートを用いるフローサイトメトリー：
物理的特徴付けの後に、コンジュゲートの活性および機能（抗体結合親和性および色素の輝度）を試験し、参照抗体染色と比較した。次に、解像度の質は、自動蛍光ネガティブ対照と比較した輝度、およびフローサイトメーターを使用する他の非特異的結合を吟味することによって決定した。以前の試験において、ＵＣＨＴ１−化合物ＣおよびＵＣＨＴ１−Ｉ−４５の試験中にＭＯＰＣ−２１非特異的結合を特徴付けしたので、Ｉ−４５を試験する際、マウスＩｇＧ１、ｋアイソタイプ対照ＭＯＰＣ−２１コンジュゲートの広範囲にわたる検討は含めなかった。ヤギ−抗マウスＩｇでコーティングしたポリスチレン製ビーズを使用して、ＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＲａｍｏｓＢ細胞、およびヒト血液または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の白血球の不均質集団に関して、Ｉ−４５コンジュゲートを試験した。全血スクリーニングは、ＵＣＨＴ１Ｉ−４５およびその類似体を試験する最も常套的な方法とした。新規構築物が形成されたので、橋渡し検討を実施した。コンジュゲート（ＵＣＨＴ１−Ｉ−５６、Ｉ−４８、Ｉ−４９、Ｉ−１６およびＩ−２１Ｂ）を試験する場合、追加のフローサイトメトリー法を使用し、大部分の検討において、ＳｏｎｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに由来する参照抗体コンジュゲート（ＵＣＨＴ１−ＦＩＴＣ）および以前に特徴付けた重要な橋渡し参照物（例えば、ＵＣＨＴ１−Ｉ−４５、ＵＣＨＴ１−Ｉ−４９）と比較した。

化合物C

遊離色素フローサイトメトリーの実施：
分子および物理的特徴付けの後に、参照色素の染色と比べた、これらの色素の細胞への潜在的な親和性についても試験した。色素は、細胞プローブとしても機能し、細胞物質に結合する可能性を有するので、色素は、一般に、高濃度（＞１００ｎＭ対１０，０００ｎＭ）で血液に対してスクリーニングし、特定の特徴を確認することができる。次に、予期されるまたは予期されない標的外結合を、自己蛍光ネガティブ対照および他の色素対照との比較において、フローサイトメーターを使用して、希釈時の輝度および線形性を評価することにより定量した。化合物Ｄの検討（化合物Ｃの遊離色素であるが官能基化されていない）は、色素の高輝度な標的外結合に関するポジティブ対照とし、コンジュゲート形態の場合、以前に特徴付けた。細胞を溶解溶液および固定溶液で処理した場合、ならびに血液を熟成した場合、またはＰＢＭＣ単球集団に適用した場合の、ヒト血液中での不均質な白血球集団についてＩ−４５色素を試験した。化合物Ｄを特徴付ける場合、非常に初期の検討からの色素を含ませると同時に、色素のロット比較を行うため、親和性を順位付ける（化合物Ｄ、Ｉ−４５、Ｉ−４９およびＩ−１６）橋渡し検討を行った。

化合物D

フローサイトメトリーの作業流れ
細胞を培養し、色素のスクリーニングまたは標的外結合に関する代謝負荷の目視による兆候について観察するか（データは示さず）、または新しい健常な細胞をコンジュゲートのスクリーニングに使用した。細胞を定期的に計数し、細胞密度（１ｘ１０ｅ５および１ｘ１０ｅ６生存細胞／ｍＬ）を確認した。抗体コンジュゲートを希釈（好ましくは、プレートまたは管中で）した後、染色用緩衝液（ＤＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）中に細胞を採取した。８０〜８５％の生存率範囲を有する細胞を使用した。遠心分離および緩衝液を用いる細胞の洗浄によって細胞を２回、洗浄し、ｐＨ指示薬を除去し、Ｉｇ、およびＦＢＳに含まれている他のタンパク質を有する細胞をブロッキングした。細胞密度を染色用緩衝液中で試験サイズに調節した。細胞をプレート培養（ウェルあたり１回の試験）するか、または色素（事前希釈済み）をプレート中の細胞に適用した。次に、これらの細胞を２３℃で４５分間、インキュベートした。これらの細胞を遠心分離し、洗浄用緩衝液で洗浄することによって細胞を２回、洗浄し、次に、プレートを吸引した。細胞を取得用緩衝液中に再懸濁した。５０００個の無傷細胞がフローサイトメトリーによって得られた。
これらの色素の蛍光は、５２５／５０バンドパスフィルターを使用して検出した、ピーク発光（５２１ｎＭ）でのフローサイトメトリーによって、４８８ｎＭの青色レーザー線によって検出した。３０００〜５０００個の無傷細胞の取得を目標に、少なくとも１５００個の無傷細胞をフローサイトメトリーによって取得して分析し、細胞調製物中に存在する生存細胞を特定した。

データ解析法：
記述統計学。ＥＣ−８００ソフトウェアにより、使用者は、各試料の取得に関する多数の統計学的データを収集することが可能となる。フローサイトメトリーによって求めた場合、およびノイズを検討する場合、ＦＬ１−Ａチャネルにおける蛍光強度の平均または中央値（ＭＦＩ）を使用して、抗体−色素試薬の輝度を測定した。他の統計学は、シグナル中央値対ノイズおよび絶対蛍光（中央値または幾何平均）を含めた、色素の特徴および総合的な試薬の質を判定するために評価された。
ヒストグラム。フローサイトメトリー事象は、前方対側方散乱（細胞体積対細胞粒度）に関するサイズによってゲート制御した。次に、それらの細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して、５１５ｎｍでの蛍光発光によってゲート制御した。収集したデータをｙ軸対蛍光強度に対する事象の数としてプロットしたデュアルパラメーターヒストグラムとして表し、これを、ｘ軸に対する対数スケールで表す。データは、親和性曲線または相対蛍光強度のヒストグラムによってまとめることができる。
結合曲線。ＭＦＩは、ＦＣＭによって求めた場合、抗体−色素試薬の輝度を最良に測定するパラメーターとなるので、これを選択し、これは、幾何平均、中央値または平均値として表すことができ、絶対蛍光測定値となる。比較のため、ノイズが非常に特徴的となる場合、シグナル対ノイズ比をＭＦＩ、Ｓ／Ｎとして報告する。
二変量デュアルパラメーターヒストグラム。一部の場合、定性的な出力を検討するため、ＦＣＭ事象をゲート制御せず、データを細胞粒度（ＳＳＣ）対色素蛍光によって表す。この方法により、全血中で回収された集団のすべての総合的な評価が可能となる。

（実施例７）
固定したＰＭＢＣをＭｇＣｌ₂グラジエント中、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６を用いて染色し、顕微鏡法によって画像化した。
ＰＢＭＣを２％ｐ．ｆで固定し、２回、１×ＰＢＳにより洗浄し遠心分離した。次に、これらの細胞を透過／ブロッキング用緩衝液と共にインキュベートした。次に、これらの細胞を、ｍＡｂ、ＤＡＰＩおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄＣＤ１４抗体を含む１％ＢＳＡ１ＸＤＰＢＳと１時間、インキュベートして、単球を共染色した。ＵＣＨＴ１は、表面と細胞内ＣＤ３の両方を標識し、固定したタンパク質のＮＳＢを伴うことが予想される。黒色９６フラットウェルプレートにおいて、ＵＣＨＴ１−色素−抗体を、ＭｇＣｌ₂グラジエント（０〜１０００ｍＭ）でインキュベートする。抗体−ＭｇＣｌ₂混合物に細胞を加え、１時間、インキュベートする。次に、細胞を１ｘＰＢＳ（二価の陽イオンを含まない）で２回、洗浄する。１０ｕｌのＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄＤＡＰＩを加え、５分間、インキュベートした。次に、細胞を１ｘＰＢＳで２×、洗浄した。次に、細胞を、１ｘＰＢＳ中、クリア９６フラットウェルプレートにプレート培養し、１０×の対物レンズ（１００×の全拡大率）で画像化した。図１３、１４および１５を参照されたい。類似の方法をＪｕｒｋａｔＴ細胞にも使用した（図１６）。

（実施例８）
ＷＢＣまたはＰＢＭＣをＭｇＣｌ₂グラジエント中、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６を用いて染色し、顕微鏡法によって画像化した。
ウェル毎の、１５０，０００〜２００，０００個のパラホルムアルデヒド固定（２〜８℃で１〜２４時間、１ｘＤＰＢＳ中、２％）して保管した（２〜８℃、＜７日間）ＷＢＣまたはＰＢＭＣを、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）グラジエントで、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６を用いて染色した。細胞を２０００ＲＰＭ（６００ＲＣＦ）で５分間、遠心分離し、１ｘＤＰＢＳで洗浄して、再度、遠心分離し、ブロッキング用緩衝液（１ｘＤＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム）中で再懸濁した。細胞を、室温で４０分間、ブロッキング用緩衝液中でインキュベートした。

それとは別に、１．５ｍＬのエッペンドルフ管中、ＭｇＣｌ₂を１ｘＰＢＳ＋１％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムに、所望の濃度（０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００または１０００ｍＭ）まで希釈し、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６（Ａ４画分、ロットＣ００４２１７０１０５ＭＦＪ、１．３９ｍｇ／ｍＬ、ＤＯＬ３．０７）を０．７μｇまたは１．０μｇで各希釈液に加えた。この混合溶液を暗所中、室温で４０分間、インキュベートした。４０分間のインキュベート後、細胞を遠心分離し、上清を除去した。次に、細胞をＭｇＣｌ₂溶液の各滴定液中で再懸濁させた。試料を、暗所中、室温で、４５分間、インキュベートした。この細胞を６００ＲＣＦで５分間、遠心分離し、８００μＬの１ｘＤＰＢＳにより２回、洗浄した。洗浄後、細胞を１００μＬの１ｘＤＰＢＳに再懸濁させて、画像化するため、９６クリアフラットウェルプレートに入れた。画像は、合計で１００×の拡大率で、１０×の対物レンズを使用して、５００ｍｓの曝露時間で、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（商標）イメージングソフトウェアを使用して撮影した。Ｎｉｋｏｎフィルターキューブ９６３１１Ｂ−２Ｅ／Ｃをフルオレセインの検出に使用した。画像は、ＩｍａｇｅＪイメージングソフトウェア（ＮＩＨによる）を使用して解析した。画像はすべて、同じ方法で加工した。バックグラウンドの差し引きは、５０ピクセルで使用した。画像は、８ビットの画像に変換し、閾値１４を割り当てた。画像毎に細胞数および積分した強度を解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）を使用してヒストグラムをプロットした。明瞭にするため、ＰＢＭＣデータだけを図面中に示しているが、ＷＢＣ実験は、ＰＢＭＣ検討前に行い、類似の結果（データは示さず）となった。

（実施例９）
フローサイトメトリーによる特異的結合および蛍光解像度に関する、ＭｇＣｌ₂溶液中の抗体の評価
ＭｇＣｌ₂溶液（ｐＨ７．５）中のフローサイトメトリーによって、抗体の特異的結合および蛍光解像度を評価した。ＡＴＣＣによって提供された指示書に従い、Ｊｕｒｋａｔ細胞を培養し、生存しているものを採取した。細胞をＭｇＣｌ₂中で保管したコンジュゲート済み抗体に適用する場合、染色を行い、インキュベートし、洗浄して、フローサイトメトリーによって取得した。
ＭｇＣｌ₂を、１ｘＰＢＳ中、１５ｍＬのポリプロピレン製管中で所望の濃度（０、１０、２５、５０または１００ｎＭ）まで希釈し、ｐＨを測定して、ｐＨ７．５の一定に保持した。次に、９０μＬのＭｇＣｌ₂をポリプロピレン製９６ウェルプレートの各ウェルに分配した。抗体を第１のウェルに加えることによって、抗体をＭｇＣｌ₂溶液であらかじめ処理し、ＭｇＣｌ₂の個々の濃度で段階的に希釈し、使用前に、室温で４０分間、保管した。ＵＣＨＴ１−Ｉ−５１、ＵＣＨＴ１−Ｉ−５６およびＵＣＨＴ１−Ｉ−４９抗体の画分を８．０μｇ／試験で一連の希釈を開始した（Ｃを１００μＬのＶ_fに調節した）。Ｔ−２５フラスコから細胞を採取し、次に、洗浄して、１％ＦＢＳ洗浄用緩衝液中、室温で、２回、遠心分離（２２５ＲＣＦ）し、タンパク質を含む細胞をブロッキングし、代謝阻害剤であるアジ化ナトリウムで処理した。上清は、遠心分離後に除去した。インキュベートするため、ＢＳＡ染色用緩衝液中、細胞を１〜３ｘ１０⁵細胞／１０μＬ（試験）に再懸濁し、次に、ＭｇＣｌ₂溶液（９０μＬの抗体および１０μＬの細胞の１００μＬのＶ_f）に加え、ボルテックスし、暗所中、室温で４０分間、インキュベートした。２２５ＲＣＦで５分間、この混合物を遠心分離して、１．６ｍＬのＢＳＡ染色用緩衝液で２回、洗浄し、上清を除去した。細胞を洗浄して、８００μＬの１ｘＤＰＢＳと共に再度、遠心分離し、次に、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有する４００μＬの１×ＤＰＢＳ中で再懸濁し、フローサイトメトリーによって取得した。データを取得して、ＳＯＮＹＥＣ−８００フローサイトメトリー分析器で評価し、記述的分析のためＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにエクスポートした。Ｉ−５１およびＩ−５６の比較の結果を表１７に示す。Ｉ−５１、Ｉ−５６およびＩ−１６の比較結果を図１８に示す。

（実施例１０）
ホスホロアミダイトおよび化合物の調製
例示的な化合物は、標準固相オリゴヌクレオチド合成プロトコール、およびＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（カタログ番号ＣＬＰ−９７８０）から購入した、以下の構造：

を有するフルオレセイン含有ホスホロアミダイトを使用して調製した。

例示的なリンカー（Ｌ⁴）を、やはり市販の以下の構造を有するホスホロアミダイト：

とのカップリングによって化合物中に含めた。

他の例示的な化合物は、以下のスキーム：

に従い調製したホスホロアミダイトを使用して調製した。

最終脱保護により、所望のＦ”部分が生じる。他の市販のホスホロアミダイト試薬を適宜使用して、本化合物の様々な部分を導入した。以下の構造を有するＱ部分：

は、

と遊離スルフヒドリルとの反応によって導入した。他のＱ部分は、当業者の知識に従う同様の方法で導入する。

（実施例１１）
Ｊｕｒｋａｔ細胞、新しい細胞、生細胞。ＭｇＣｌ₂を含まないものとこれを含むＵＣＨＴ１Ｉ−１６画分の比較、および同様にＩ−１２Ｂと右側の他の参照との比較（図２３を参照されたい）。抗体はすべて、同じ試験体を使用して、同じプレートで一緒に試験した。コンジュゲートの間に適用したＭｇＣｌ₂中のフローサイトメトリーによって、Ｉ−１６の特異的結合および蛍光解像度を評価した。（１）マレイミド（水＋０．１ＭＭｇＣｌ₂）コンジュゲートとの反応物を再懸濁させる際、（２）精製および溶出、ならびにＰＢＳ中、０．１ＭｇＣｌ₂中での保管の間の２段階で、コンジュゲートの間にＵＣＨＴ１Ｉ−１６だけにＭｇＣｌ₂を適用した。細胞含有緩衝液へのＭｇＣｌ₂のいかなる追加的な適用も行わないで、抗体をＢＳＡ染色用緩衝液に希釈した。フロー法：ＪｕｒｋａｔＴ細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）により提供された指示書に従い培養し、生細胞を採取した。手短に述べると、細胞をコンジュゲート済み抗体に適用する場合、染色を行い、インキュベートして洗浄し、次に、フローサイトメトリーによって取得した。抗体画分を、２．０μｇ／試験で一連の希釈を開始した（Ｃを１００μＬのＶ_fに調節した）。Ｔ−２５フラスコから細胞を採取し、洗浄して、１％ＦＢＳ洗浄用緩衝液中、室温（ＲＴ）で、２回、遠心分離（２２５ＲＣＦ）し、タンパク質を含む細胞をブロッキングし、代謝阻害剤であるアジ化ナトリウムで処理した。上清を遠心分離後に除去した。インキュベートするため、ＢＳＡ染色用緩衝液中、細胞を１〜３ｘ１０⁵細胞／１００μＬ（試験）に再懸濁し、次に、抗体に加え、ボルテックスし、暗所中、室温で４０分間、インキュベートした。２２５ＲＣＦで５分間、この混合物を遠心分離して、１．６ｍＬのＢＳＡ染色用緩衝液で２回、洗浄し、上清を除去した。細胞を洗浄して、８００μＬの１ｘＤＰＢＳで再度、遠心分離し、次に、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有する４００μＬの１×ＤＰＢＳ中で再懸濁して、フローサイトメトリーによって取得した。データを取得して、ＳＯＮＹＥＣ−８００フローサイトメトリー分析器で評価し、記述的分析のためＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにエクスポートする。２．４７のＤＯＬ、ｆ／ｐ２５を有するＵＣＨＴ１Ｉ−１６画分Ａ５は、ＵＣＨＴ１Ｉ−２１Ｂ、画分Ａ５、ＤＯＬ３．０、ｆ／ｐ３０に等しいか、またはそれより高輝度な蛍光を示した。コンジュゲートの間にＭｇＣｌ₂を添加すると、ＭｇＣｌ₂が存在しない場合のＵＣＨＴ１Ｉ−１６、画分Ａ６、ＤＯＬ４．１８、ｆ／ｐ４２に比べて、ＵＣＨＴ１Ｉ−１６が増大する。以前の実験において、ＵＣＨＴ１Ｉ−１６は、Ｉ−５１とＩ−２１Ｂのどちらよりも暗いが、ここで、ＭｇＣｌ₂を抗体の精製に使用するとより高輝度になることが観察されたので、この知見は実用上、重要である。

（実施例１２）
フローサイトメトリーによるＩ−１６とＢＢ５１５およびＦＩＴＣとの比較
一般に、図１９および２０〜２４は、標識化度（ＤＯＬ）にいくらか差異のある、陽イオンの様々な構成を有するコンジュゲートの３種の構築の結果を示しており、次に、フローサイトメトリー（以前に記載）によって試験した。手短に述べると、Ｉ−１６とＩ−２１Ｂ、ＢＢ５１５およびＦＩＴＣとの比較を行った。新しい血液または細胞の細胞外染色物を染色し、溶解し、洗浄して、次に、室温で４５分間、インキュベートして、次に再度、洗浄した。

比較は、ＷＢＣにおける、ヒトＣＤ３発現に関して標識した場合（既に記載した通りである）の、ＣＤ３＋Ｔ細胞とＪｕｒｋａｔＴ細胞（図２３中のＪｕｒｋａｔＴ細胞）に関するものである。ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６および／またはＩ−２１ＡおよびＩ−５７をＵＣＨＴ１−ＢＢ５１５およびＵＣＨＴ１−ＦＩＴＣと比較した。ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６は、ＵＣＨＴ１−ＢＢ５１５よりも１．７倍高輝度で、ＵＣＨＴ１ＦＩＴＣよりも５．７倍高輝度なことが分かった。上に示した通り、ＭｇＣｌ₂は、生成過程の異なるフェーズにおいて存在した（例えば、コンジュゲート、精製中の溶出、および／または保管、例Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋のように略す）。図１９を参照されたい。
図２０Ａおよび２０Ｂは、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６およびＵＣＨＴ１−１−２１ＡのＣ＋Ｅ＋Ｓ＋とＣ＋Ｅ−Ｓ−との比較を示している。図２１は、コンジュゲートポジティブ対照参照物であるＣ＋Ｅ＋Ｓ＋の第１の試験実施に比べて、Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋、Ｃ＋Ｅ−Ｓ−およびＣ＋Ｅ−Ｓ−構成を使用するＵＣＨＴ１−１−１６の３つのコンジュゲートの実施を実証している。

図２２は、シグナル対ノイズよりもむしろ、絶対蛍光値を決定するために適用した、フローサイトメトリーによる追加の実験手順を示す。較正曲線は、標識化したビーズの集団を使用して、可溶性フルオロフォア等量で滴定により求めた。ビーズは、フルオロフォアの個々の等価なレベルのチャネルを特定するため、フローサイトメトリーによるデータの取得と同じ条件で取得した。ビーズによって生成した標準曲線を評価するため、図２１と同様の実験からのデータを、指数線形回帰を使用する計算によって再度、表した。この方法、すなわち３種の過程構成に対する可溶性フルオロフォア分子等量（ＭＥＳＦ）の推定値を、３つのロットに関して求めることができた。次に、それぞれ、構成Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋、Ｃ＋Ｅ−Ｓ−、Ｃ＋Ｅ−Ｓ−のＵＣＨＴ１−Ｉ−１６ＵＣＨＴ１−１−１６のロット（１番目、２番目、３番目）をＢＢ５１５（１つのロット）およびＦＩＴＣ（２つのロット）と比較した。この方法によりＦＩＴＣよりも８〜１０倍高輝度な絶対輝度であること、およびＢＢ５１５と同等であることが実証される。

図２３は、ネガティブ対照Ｉ−５１、Ｉ−２１ＢおよびＩ−１６として他（Ｃ−Ｅ−Ｓ−）の構成と比較したＵＣＨＴ１−Ｉ−１６（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）、およびポジティブ対照である参照ＦＩＣＴを示している。Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋構成は、３０の目標ｆ／ｐと比べた場合、この例では、理論的な蛍光レベルを超過する一方、Ｃ−Ｅ−Ｓ−構成は、理論が暗示するほど高輝度ではない。
図２４は、コンジュゲートからの２つの画分を示す、３種の試験ロットＡ、ＢおよびＣを示している。理論Ｓ／Ｎは、Ｃ＋Ｅ−Ｓ−構成によって超過した。
全体として、構成中に陽イオンを含むそのようなコンジュゲートは、他のコンジュゲートよりもフローサイトメトリーによるとより高輝度であり、溶出および保管は、インキュベート中の標的指向性部分が高い濃度では、わずかな利点でしかないことが観察された。これは、コンジュゲートの構成間の線形回帰を使用する様々な解析法で決定されるが、データはここでは示していない。

（実施例１３）
オリゴフルオロシド色素は、イオンセンサーとなること、およびマグネシウムとの共適用時に、フローサイトメトリーにより高い解像度となることが実証される。
バイオコンジュゲートに適用した代替反応の生産性を試験した。事前にマレイミドで活性化した凍結乾燥状態の色素からの復元の間に添加し、次に、バイオコンジュゲートを行うため、還元剤処理した抗体（ＴＣＥＰ）に適用した水および０．１Ｍ塩化マグネシウムにより、恐らく、電荷の遮蔽またはルイス酸の配位という同じ効果のため、抗体コンジュゲートが改善されると仮定した。同様に、恐らくは、遊離スルフヒドリル基との反応に入る前の、ポリホスフェート電荷遮蔽による改善もある。要約すると、コンジュゲート試験により、マグネシウムは、マレイミドコンジュゲート反応にさらに使用するため、およびその後のフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を使用する分析手順における染色に抗体コンジュゲートを適用するのに、超高輝度のフルオロフォアポリマーを修飾するのに好適であることが示される。
方法：実験は、３つの手法によって導いた：
１）最終的な標識上の色素（ＤＯＬ）規格が５．０未満となるのを目標にすると同時に、ＵＣＨＴ１抗体コンジュゲートを１０×色素に標識する過程に、マグネシウムを組み込む系を選択する。
２）細胞上のＣＤ３抗原の染色法前およびその最中に、抗体に適用するマグネシウムを選択する。分析手順に対するイオンの干渉検討。
３）溶液中のコンジュゲートの蛍光発光を評価する。
上記は、色素の立体構造およびその後のアッセイの出力に影響を及ぼす抗体発色過程における３つの調査すべき点となる。この系の手法は、本コンジュゲート法が、１）色素が抗体と相互作用する方法を改変する、２）ＤＯＬの標的化を改善する（効率的な標識化）、および３）ＦＣＭによる蛍光解像度を改善する（シグナルおよび抗体親和性を改善する）ことを前提とするものである。

コンジュゲート方法：色素は、水＋０．１ＭＭｇＣｌ₂に再懸濁し、次に、抗体と一緒にして、０℃で１時間、インキュベートする（最終ＭｇＣｌ₂の濃度は、約２５ｍＭ）。このコンジュゲートは、１×ＰＢＳ緩衝液を使用する１０ｘ３００ｎｍＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムで精製して溶出させる。画分をマイクロ遠心分離用バイアルに収集する。一部の画分をプールし、３０ｋＭＷＣＯ濃縮器を使用して濃縮する。マグネシウムでの溶出および保管を適用する場合、溶出用緩衝液は、０．１ＭＭｇＣｌ₂を含み、かつ／または保管用緩衝液を０．１ＭのＣ_fのＭｇＣｌ₂でスパイクした。コンジュゲートの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００を使用して求める。吸収値は、２８０ｎｍおよび４９５ｎｍで記録する。１０ｘ色素の場合、０．１９の補正計数（ＯＤ２８０／０Ｄ４９５）、およびＢｅｅｒの法則の原理を使用して、蛍光色素対タンパク質（ｆ／ｐ）比＝（標識上の色素、ＤＯＬ）を求めた。例えば、３のＤＯＬは、３０のｆ／ｐに等しい。

蛍光検討：生ＪｕｒｋａｔＴ細胞、および／またはカリウム緩衝塩化アンモニウムに溶解した（ＡＣＫ）全血細胞（ＷＢＣ）、および他のＷＢＣモデルを使用して、コンジュゲートが生成した後に、ＦＣＭ中での蛍光解像度を確認した。細胞とインキュベートし、次に洗い流した、ＭｇＣｌ₂を用いた検討を、アッセイへの二価の陽イオンの添加の即時効果をモニタリングするために適用した。図１７および１８を参照されたい。対照的に、二価の陽イオンの存在下および非存在下で、溶液中でのスペクトルの検討を行い（緩衝液中のみ）、吸収および発光スペクトルを出力した。図２５Ｂおよび２７Ｂを参照されたい。同様に、最終的な取得緩衝液の検討（ＦＣＭによる）を使用して、抗体が細胞に結合した際の読み取りの間に、イオンを含ませたまたは含ませなかった実用的結果を表した。図２７Ａおよび２８を参照されたい。

コンジュゲート検討：一般に、３つのロットを異なる構成で連続して調製し、以前の物質を比較した。過程の改善は、本発明者らの標準マレイミドＵＣＨＴ１（抗ＣＤ３）バイオコンジュゲートに、様々な点でＭｇＣｌ₂を組み込むことによって検討した。コンジュゲート系の等価性および橋渡し検討を連続工程で行い、以前に確立した本発明者らのコンジュゲート方法を使用するＦＣＭによって解像度を最適化した。図２１、２０Ｂ、２３、２４および２５Ａを参照されたい。比較のため、マグネシウムを、異なるコンジュゲート系におけるコンジュゲート過程に適用した。試験した系は、（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）、（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）、（Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋）、（Ｃ_onjugation＋Ｅ_lution＋Ｓ_torage＋として略語で表す）とした。ｆ／ｐ（標識上の色素）は、本発明者らの実験室において以前に確立した、ＴＣＥＰおよび非ＭｇＣｌ₂マレイミド反応のマレイミド化学量論に関するこれまでの観察に基づいた各系において、目標標識化度（ＤｅｇｒｅｅｏｆＬａｂｅｌｉｎｇ：ＤＯＬ）よりも高い２〜４当量の初期ＤＯＬから限界最終ＤＯＬ＜５．０までに目標を置いた。一部の実験では、他の連結長さ（４×、６×、１０×）の色素を、１ｘＩ−１６の対照の連結長さと並行して試験した。（データは示さず）。
３つの系のアウトプットのデータ解析は、標識上の色素の効率［コンジュゲート時の実測ＤＯＬ／適用ＤＯＬ］＊１００、蛍光強度（相対発光）（図２５Ａ）、ＦＣＭによるシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）（ＣＤ３＋集団のシグナル中央値／ノイズＣＤ３−集団の中央値）、系間のＳ／Ｎの回帰解析を使用して記載し、他の性能パラメーターを評価した（例えば、非特異的結合度）。

ビーズ標準品（ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にコンジュゲートしたＦＩＴＣを使用するＦＣＭチャネルの追加の定量を使用して、ＦＣＭによる、１０ｘＦＡＭＵＣＨＴ１Ｉ−１６の可溶性蛍光色素分子等量（ＭＥＳＦ）のアウトプットを測定した。図２２を参照されたい。
結果：以前の検討により、ＦＣＭ法の連続として、抗体および抗原のインキュベート、ならびに洗い流しの間に、ＭｇＣｌ₂（０〜１００ｍＭ）が存在すると、２５〜１００ｍＭにおいて、特に高い抗体（色素）濃度において、シグナルの増強効果が観察されることが示された（図１７および１８）。コンジュゲートのすべての段階に、ＭｇＣｌ₂を含む追加の予備検討：色素復元、コンジュゲート、溶出、保管［系（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）としての記号化］により、ＭｇＣｌ₂なしで以前に観察されたものよりも優れた性能となる超高輝度参照抗体が生成することを示した。

ＭｇＣｌ₂は、予備検討において観察される通り、輝度に正の影響を及ぼすと推定し、したがって、本発明者らは、優れた試薬を生成することを期待して、低いＤＯＬ（すなわち、１〜３）［理論色素対タンパク質当量が４．５：１］を目標とすると同時に、追加のロット（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）を調製し、過剰なコンジュゲートを回避して、抗体親和性の変化を制限した。再度、フローサイトメトリーによる明瞭なＳ／Ｎにより、約３０のｆ／ｐの実用的な蛍光アウトプットがもたらされ、ＤＯＬは、１．４〜２．７（ｆ／ｐ１４〜２７）の範囲となった。Ｓ／Ｎは、ｆ／ｐ６．２を有するＦＩＴＣと比較すると、理論値を超え、ＦＩＴＣ対照よりも大きな４．８という理論輝度率（３０／６．２）を超えた。
次に、中間イオン干渉検討を、Ｉ−１６（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）対（Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋）を使用して行い、この過程における条件として溶出を潜在的に除外し、保管が重要であるかどうかを見た。本発明者らは、（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）、（Ｃ＋Ｅ＋Ｓ＋）、および元々の参照試験として使用した保管時のスパイクした配合物（Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋）と比べると、（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）は、予期した通り（高解像度に溶出は必要ではない）働いたことを実証した（図２１）。この結果は、残留量のマグネシウムが、ＦＣＭのために保管物質を希釈する間に存在しても、細胞とのインキュベート時にシグナルに対して、ほとんど追加的な利益がないことを示している。これらの結果は、まとめると、少なくともＭｇＣｌ₂をコンジュゲート時に含めると、溶出および保管の余地を残し得ると同時に、性能に対する実用的な利益となり得ることを示した。

したがって、本発明者らは、７：１という理論色素対タンパク質当量を使用して、より単純な系（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）にマグネシウムを含ませることによって、ＤＯＬを向上し得ると仮定した。そこで、最終的に高いＤＯＬ（３〜５）を目標とする構成（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−）を使用して追加のロットを作製し、保管効果（インキュベート中に存在する残留マグネシウム）を後に再確認するため、スパイクした保管用画分も確保した（Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋）。一般に、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６の場合に予期される通り、シグナルは保持された。以前の通り、保管およびインキュベートのシグナル増大も再確認されたが、系（Ｃ＋Ｅ−Ｓ−〜Ｃ＋Ｅ−Ｓ＋）の総合的な同等性にはほとんど重要ではない。同じ実験における、ＵＣＨＴ１Ｉ−１６の第１および第２のロットの比較により、ＤＯＬが１〜３という低い試薬となることがやはり確認され、ＭｇＣｌ₂を含ませると、ＵＣＨＴ１ＢＢ５１５（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＳ／Ｎ結果の超過の手助けになり、両方の系の場合に、ＦＩＴＣ対照に対して、理論ｆ／ｐが３０に近似した。
理論的な色素対タンパク質当量が４．５：１で、構成Ｃ＋Ｅ−Ｓ−を使用して、第３のロットを生成した。このシステムは、第１のロット（最終ＤＯＬ範囲は１〜３）のＤＯＬに類似したＤＯＬを目標とした。やはり、増大作用を有するＵＣＨＴ１Ｉ−１６が観察された。実際に意味するところは、Ｉ−１６色素コンジュゲートは、ＦＣＭによる解像度が、ＭｇＣｌ₂の使用前の色素標識化効率の約２倍とより高くなるということである（平均絶対標識化効率は、ＭｇＣｌ₂を含む３つの組のコンジュゲート（５３％、５８％、６２％）に比べると、使用前＝２４％である）。

溶液での適用においてシミュレーションした下流において、ｐＨ７．４で、ＭｇＣｌ₂（０〜１０００ｍＭ）のＣを含有するＰＢＳを含む溶液中のコンジュゲートの吸収および発光スペクトルは、シグナルの増大よりもむしろ、イオン濃度依存的消光を示した。予測される通り、溶液中での発光データにより、コンジュゲートした色素をあらかじめ定量したＤＯＬ（ＮａｎｏＤｒｏｐによって求めた）によって順位付けすることができるが、添加物ＥＤＴＡ＜ＭｇＣｌ₂＜ＣａＣｌ₂による順位で溶液中で消光され、各構築物および構成に特有の方法でポリ陽イオンブロッカーによって影響を受けることが示された。データは示されていない。この観察は、マグネシウムを含む、またはマグネシウムを含まない様々な再懸濁用緩衝液を使用して、ＦＣＭによる試料取得時における消光の観察に一致した。図２７Ａ、２７Ｂおよび２８にあるように、いずれの方法でも蛍光可視化の間（溶液中、またはＦＣＭによる取得中のどちらか一方）に存在するＭｇＣｌ₂の添加により、シグナルが消光されたことが示された。これらの観察は、ＭｇＣｌ₂は、細胞とのインキュベートの間に存在するが、その後に、試料を取得する前に洗い流された場合、シグナル／ノイズを増大させることが観察された予備検討のＦＣＭとは対照的である。図１７および１８を参照されたい。

最後に、異なる構成の一連の以前の実験で作製したロットを用い予備検討を確認するため、同一物質および同一精製手順を用いて、同じ日に並行してコンジュゲートを再び作製した。陽イオン構成だけ変えた（Ｃ−Ｅ−Ｓ−対照およびＣ＋Ｅ−Ｓ−、Ｃ＋Ｅ＋Ｓ）。また、以前の実験の知見から、最終ｆ／ｐがすべてのコンジュゲートにわたり、ほぼ同じ（１９．７〜２４．７）となることを目標にして、標識化度の交路解釈を排除した。次に、これらのコンジュゲートをＦＣＭによって試験した。一般に、この実験により、系へのＭｇＣｌ₂の添加効果は、より効率的な蛍光出力を有する標的指向性部分を生成するのに有益であることが確認された。図２５Ａを参照されたい。
最後に、ＭｇＣｌ₂は、コンジュゲート反応に添加する前に、活性化した色素を可溶化するために使用すると、コンジュゲートの標識化効率を改善し、したがって、早期の過程入力、および効率的な標識化、および後の過程出力において観察されたより高い解像度の蛍光との間に質的関係があることを支持するものである。これらの観察はまた、生産性の改善を確認するという第１の検討目的を実現することができたことも支持している。図２６を参照されたい。ＦＣＭチャネルの機器のダイナミックレンジの追加的な定量および特徴付け、ならびに可溶性フルオレセイン分子等量（ＭＥＳＦ）を定量するためにＢａｎｇｓ（商標）ビーズＦＩＴＣ標準品（ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の使用により、コンジュゲートは、ＵＣＨＴ１ＦＩＴＣｆ／ｐ６〜７よりも８〜１０倍高輝度であることが示された。これは、ＦＣＭにおいてシグナル中央値対ノイズによって求めた絶対Ｓ／Ｎによって報告され得るものよりも高輝度である。図２２を参照されたい。

考察：高密度の電荷を有する元々のポリマーは、高度に水溶性となるよう設計されており、その結果、塩が導入された場合、立体構造変化が予期され得る。これは、恐らく、類似の設計のより小さな電荷密度の分子（Ｉ−１６）に当てはまるが、その程度はより小さい。このことは、イオンは、分析手順（この場合、ＣＤ３の蛍光および検出）の干渉をもたらす恐れがあるという共通の場合を示す。手順または試薬自体に対する化学的適応性によりなくすことができる、または制御することができる干渉を使用することができる。
要約すると、マグネシウムは、バイオコンジュゲート済み色素および／または抗体を正に改変する可能性を有すると考えられる。さらに、試験したポリマーは、イオン感知特性を有しており、弱い二価イオンのキレート剤であり、類似のｐＨの様々な緩衝液配合物に対して感受性が高い。この理解は、理論に拘泥しないが、色素は、ＭｇＣｌ₂が適用されると、効率的なコンジュゲートに有利な立体構造にあり、これによって、抗体の等電点の変化が制限され、より低い濃度での抗原結合が改善されるということである。ＭｇＣｌ₂は、コンジュゲート、溶出、保管に、またはインキュベートの間に使用されると、ある種の条件下で、電荷を遮蔽して色素を安定化させ、抗体の親和性を改善するが、溶液中で観察した場合、消光すると推測される。

理想的には、これらの化合物が、消光することなく、および他のポリ陽イオンと相互作用することなく、イオンおよび塩形態で安定化され得る（または、電荷が中和される）かどうかのさらなる検討が必要であるが、色素の利用性およびバイオコンジュゲートの作製がかなり改善され得る。恐らく、染色／溶解／固定化手順の間に、血漿、補充血清、ブロッキング剤またはキレート剤が存在する、ＦＣＭプロトコール、特に全血は溶解し、本発明者らは、色素とイオンのいくらかの相互作用（または、その欠如）があることを予期することができる。本発明者らは、親和性の喪失としてこのような相互作用があること（滴定における親和性曲線によって表される）、ならびに染色／溶解／固定化／洗浄手順を受ける新しい細胞において、固定化したＷＢＣとの非特異的結合が増大することを観察した。（データは示さず）。血漿中に、特に溶解した赤血球からの放出物として、または活性化細胞中、または細胞表面に、二価陽イオンおよびポリ陽イオンが存在するので、類似したイオン性相互作用が予期され得る。実際に、色素を対象とするマグネシウムによるブロッキング、または標的基質を対象とするポリ主鎖のブロッキングは、血漿および複雑な組織における干渉因子に対する保護に好適となり得る。さらに、この効果を活用するために特定した具体的な方法はまた、免疫組織化学、ならびに遮蔽された電荷および非線形のより中性の電荷を帯びた立体構造が、細胞内マトリックスによる効率的な拡散にとって望ましい密集組織の区域では、特に、過酷な固定化／恒久的方法（メタノール）を用いて実施することもできる。最後に、任意の非特異的結合および消光による、高いバックグラウンドおよび低いシグナルもまた、マグネシウム洗浄液、またはインキュベートの間にマグネシウムを含ませることによって妨害することができる可能性がある。このことは、固定化組織および浸透化組織中に存在するポリ陽イオンとの強力なイオン性会合をもたらす染色条件では重要となり得る。実際に、２．０％パラホルムアルデヒドで固定した赤血球が溶解し、分離した全血細胞、ＰＢＭＣおよびＪｕｒｋａｔＴ細胞の場合の観察により、ＵＣＨＴ１−Ｉ−１６および塩化マグネシウムと共にインキュベートした細胞では、Ｓ／Ｎが増大することが示される。この結果はまた、二相効果を示す。低濃度ではＳ／Ｎは低い一方、１００ｍＭ〜２５０ｍＭでは増大し、次に、１０００ｍＭで再度、消光する。やはり、イオン性会合の確認は、予期される立体構造変化による蛍光強度の乱れである。図１３、１４、１５および１６。

この明細書に言及されている、および／または出願データシートに一覧表示されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべてが、２０１８年３月１９日に出願の米国仮特許出願第６２／６４５，１２１号を含め、本記載と矛盾しない程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。

上述から、本発明の具体的な実施形態が、例示目的のために本明細書に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正が行われ得ることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるもの以外の限定は受けない。

Claims

ポリマー色素、標的指向性部分および二価または三価の金属塩を含む混合物を調製するステップ、および混合物を、共有結合性コンジュゲートを形成するのに十分な時間および温度で熟成させるステップを含む、ポリマー色素と標的指向性部分との共有結合性コンジュゲートを形成する方法であって、
ａ）ポリマー色素が、
ｉ）２つ以上の蛍光または発色部分
ｉｉ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基；および
ｉｉｉ）標的指向性部分の相補性反応性基Ｑ’と共有結合を形成することが可能な反応性基Ｑ
を含み、
ｂ）標的指向性部分が、標的分析対象に親和性を有しており、かつ相補性反応性基Ｑ’を含む、
方法。
標的分析対象を検出する方法であって、
ａ）二価または三価の金属塩の存在下で、共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させて、分析対象−標的指向性部分複合体を形成するステップであって、共有結合性コンジュゲートが、
ｉ）標的分析対象に対して親和性を有しており、かつポリマー色素への共有結合を含む標的指向性部分
ｉｉ）ポリマー色素であって、
Ａ）２つ以上の蛍光または発色部分
Ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基、および
Ｃ）標的指向性部分への共有結合
を含むポリマー色素を含む、ステップ
ｂ）分析対象−標的指向性部分複合体からの蛍光または発色シグナルを検出するステップ
を含む方法。
分析対象−標的指向性部分複合体を二価または三価の金属塩を含む洗浄溶液で処理するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
標的分析対象を検出する方法であって、
ａ）共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させて、分析対象−標的指向性部分複合体を形成するステップであって、共有結合性コンジュゲートが、
ｉ）標的分析対象に対して親和性を有しており、かつポリマー色素への共有結合を含む標的指向性部分、ならびに
ｉｉ）ポリマー色素であって、
Ａ）２つ以上の蛍光または発色部分
Ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基、および
Ｃ）標的指向性部分への共有結合
を含むポリマー色素を含む、ステップ、
ｂ）ｉ）共有結合性コンジュゲートと標的分析対象とを結合させる間、共有結合性コンジュゲートおよび標的分析対象を、二価または三価の金属塩で処理するステップ、および／または
ｉｉ）共有結合性コンジュゲートと標的分析対象とを結合させた後に、分析対象−標的指向性部分複合体を、二価または三価の金属塩を含む洗浄溶液で処理するステップ、ならびに
ｃ）分析対象−標的指向性部分複合体からの蛍光または発色シグナルを検出するステップ
を含む方法。
共有結合性コンジュゲートを標的分析対象と結合させるステップが、二価または三価の金属塩の存在下で行われる、請求項４に記載の方法。
蛍光または発色シグナルを検出する前に、分析対象−標的指向性部分複合体から二価または三価の塩のすべてを実質的に除去するステップをさらに含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
二価または三価の金属塩が、分析対象−標的指向性部分複合体を含む緩衝液から除去される、請求項６に記載の方法。
共有結合性コンジュゲートを形成するステップをさらに含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
共有結合性コンジュゲートを形成する前に、ポリマー色素および二価または三価の塩を混合して、ポリマー色素および二価または三価の塩を含む組成物を形成させる、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
共有結合性コンジュゲートを形成する前に、ポリマー色素および二価または三価の塩を含む組成物を熟成させるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
二価または三価の塩が、共有結合性コンジュゲートを形成している間、実質的に存在しない、請求項８または９に記載の方法。
共有結合性コンジュゲートおよび二価または三価の塩を含む組成物であって、共有結合性コンジュゲートが、
ｉ）ポリマー色素への共有結合を含む標的指向性部分
ｉｉ）ポリマー色素であって、
ａ）２つ以上の蛍光または発色部分
ｂ）少なくとも１つの負の電荷を帯びた基、および
ｃ）標的指向性部分への共有結合
を含むポリマー色素
を含む、組成物。
標的指向性部分が標的分析対象に対して親和性を有する、請求項１２に記載の組成物。
標的指向性部分が抗体を含む、請求項１３に記載の組成物。
二価または三価の塩が、二価の塩である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
二価の塩がマグネシウム塩である、請求項１５に記載の方法または組成物。
マグネシウム塩が塩化マグネシウムである、請求項１６に記載の方法または組成物。
蛍光または発色部分が蛍光部分である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
蛍光または発色部分が、出現毎に、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドおよび６−ＦＡＭ部分からなる群から独立して選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
蛍光または発色部分が、出現毎に独立して、以下の構造の１つ：

を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、複数の負の電荷を帯びた基を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、２つ以上の蛍光または発色部分を含み、２つ以上の蛍光または発色部分がそれぞれ、少なくとも１つの負の電荷を帯びた基を含むリンカーを介して、隣接する蛍光または発色部分に結合している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
リンカーが、１つまたは複数のアルキレンまたはアルキレンオキシド部分をさらに含む、請求項２２に記載の方法または組成物。
アルキレンオキシド部分がポリエチレンオキシド部分を含む、請求項２３に記載の方法または組成物。
負の電荷を帯びた基がホスフェートである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、２〜１００の蛍光または発色部分を含み、蛍光または発色部分が、少なくとも１つの負の電荷を帯びた基を含むリンカーを介して、隣接する蛍光または発色部分に結合している、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、２〜１０の蛍光または発色部分を含み、蛍光または発色部分が、少なくとも１つの負の電荷を帯びた基を含むリンカーを介して、隣接する蛍光または発色部分に結合している、請求項２６に記載の方法または組成物。
共有結合性コンジュゲートを精製するステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
精製するステップが、共有結合性コンジュゲートから二価または三価の塩のすべてを実質的に除去するステップを含む、請求項２８に記載の方法または組成物。
共有結合性コンジュゲートが、二価または三価の塩の非存在下で調製した対応するコンジュゲートよりも少なくとも１．１倍高い蛍光吸光係数を有する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
共有結合性コンジュゲートが、二価または三価の塩の非存在下で調製した対応するコンジュゲートよりも少なくとも１．２倍高い蛍光吸光係数を有する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
標的指向性部分が抗体である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、以下の構造（Ｉ）：

(I)
またはその立体異性体、塩もしくは互変異性体（式中、
Ｍは、出現毎に独立して、蛍光または発色部分を含む部分であり、
Ｌ¹は、出現毎に独立して、ｉ）任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンもしくはヘテロ原子リンカー；またはｉｉ）２つの相補性反応性基の反応によって形成することが可能な官能基を含むリンカーのいずれかであり、
Ｌ²およびＬ³は、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ原子リンカーであり、
Ｌ⁴は、出現毎に独立して、アルキレンまたはアルキレンオキシドリンカーであり、
Ｒ¹は、出現毎に独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり、
Ｒ²およびＲ³は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、ヘテロアルキル、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_c、Ｑもしくはその保護形態、またはＬ’であり、
Ｒ⁴は、出現毎に独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ⁵は、出現毎に独立して、オキソ、チオキソであるか、または存在せず、
Ｒ_aは、ＯまたはＳであり、
Ｒ_bは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_dまたはＳＲ_dであり、
Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ^-、Ｓ^-、ＯＲ_d、ＯＬ’、ＳＲ_d、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり、
Ｒ_dは、対イオンであり、
Ｌ’は、出現毎に独立して、Ｑへの共有結合を含むリンカー、標的指向性部分への共有結合を含むリンカー、分析対象分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカー、固体支持体残基への共有結合を含むリンカー、ヌクレオシドへの共有結合を含むリンカー、または構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、
ｍは、出現毎に独立して、０以上の整数であり、ただし、出現するｍの少なくとも１つは、１以上の整数であることを条件とし、こうして、化合物は、少なくとも１つのＬ⁴を含み、
ｎは、１以上の整数である）
を有する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、以下の構造（ＩＡ）：

(IA)
（式中、ｚは、２〜１００の整数である）
を有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ｚが、３〜６の整数である、請求項３４に記載の方法または組成物。
Ｌ¹が、以下の構造の１つ：

を有する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法または組成物。
出現するＬ¹の少なくとも１つについて、Ｌ¹−Ｍが、以下の構造：

（式中、Ｌ^1aおよびＬ^1bは、それぞれ独立して、任意に用いてもよいリンカーである）
を有する、請求項３４または３５に記載の方法または組成物。
出現するＬ¹の少なくとも１つについて、Ｌ¹−Ｍが、以下の構造：

（式中、Ｌ^1aおよびＬ^1bは、それぞれ独立して、任意に用いてもよいリンカーである）
を有する、請求項３４、３５または３７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ^1aまたはＬ^1b、またはどちらも存在しない、請求項３７または３８に記載の方法または組成物。
Ｌ^1aまたはＬ^1b、またはどちらも存在する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ^1aおよびＬ^1bが、存在する場合、それぞれ独立して、アルキレンまたはヘテロアルキレンである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ^1aおよびＬ^1bが、存在する場合、独立して、以下の構造の１つ：

を有する、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ¹が、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ²およびＬ³が、出現毎に独立して、Ｃ₁−Ｃ₆アルキレン、Ｃ₂−Ｃ₆アルケニレンまたはＣ₂−Ｃ₆アルキニレンである、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の方法または組成物。
化合物が、以下の構造（ＩＢ）：

(IB)
（式中、
ｘ¹、ｘ²、ｘ³およびｘ⁴は、出現毎に独立して、０〜６の整数であり、
ｚは、２〜１００の整数である）
を有する、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
出現するｘ¹、ｘ²、ｘ³またはｘ⁴の少なくとも１つが１である、請求項４５に記載の方法または組成物。
ｘ¹、ｘ²、ｘ³およびｘ⁴が、出現毎に、それぞれ１である、請求項４５または４６に記載の方法または組成物。
Ｌ¹が、出現毎に独立して、トリアゾリル官能基を含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ¹が、出現毎に独立して、任意に用いてもよいアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである、請求項３４〜４８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ⁴が、出現毎に独立して、ＯＨ、Ｏ^-またはＯＲ_dである、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ⁵が、出現毎に、オキソである、請求項３３〜５０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ¹が、出現毎に、Ｈである、請求項３３〜５１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ²およびＲ³が、それぞれ独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである、請求項３３〜５２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ²またはＲ³の一方が、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cであり、Ｒ²またはＲ³のもう一方が、ＱまたはＱへの共有結合を含むリンカーである、請求項３３〜５３のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ²およびＲ³が、それぞれ独立して、−ＯＰ（＝Ｒ_a）（Ｒ_b）Ｒ_cである、請求項３３〜５４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ_cがＯＬ’である、請求項５５に記載の方法または組成物。
Ｌ’が、Ｑ、標的指向性部分、分析対象分子、固体支持体、固体支持体残基、ヌクレオシドまたは構造（Ｉ）のさらなる化合物へのヘテロアルキレンリンカーである、請求項３３〜５６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ’が、アルキレンオキシドもしくはホスホジエステル部分、またはそれらの組合せを含む、請求項３３〜５７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｌ’が、以下の構造：

（式中、
ｍ”およびｎ”は、独立して、１〜１０の整数であり、
Ｒ^eは、Ｈ、電子対または対イオンであり、
Ｌ”は、Ｒ^e、またはＱ、標的指向性部分、分析対象分子、固体支持体、固体支持体残基、ヌクレオシドもしくは構造（Ｉ）のさらなる化合物への直接結合もしくは連結基である）
を有する、請求項３３〜５８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ²またはＲ³が、以下の構造の１つ：

を有する、請求項３３〜５９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｒ²またはＲ³が、以下の構造：

を有する、請求項３３〜６０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｑが、求核性反応性基、求電子性反応性基または環化付加反応性基を含む、請求項３３〜６１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｑが、スルフヒドリル、ジスルフィド、活性化エステル、イソチオシアネート、アジド、アルキン、アルケン、ジエン、求ジエン体、酸ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル、ホスフィン、α−ハロアミド、ビオチン、アミノまたはマレイミド官能基を含む、請求項３３〜６２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
活性化エステルが、Ｎ−スクシンイミドエステル、イミドエステルまたはポリフルオロフェニルエステルである、請求項６３に記載の方法または組成物。
アジドが、アルキルアジドまたはアシルアジドである、請求項６３に記載の方法または組成物。
Ｑが、表１から選択される部分である、請求項３３〜６５のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ｍが、出現毎に独立して、１〜１０の整数である、請求項３３〜６６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ｍが、出現毎に独立して、１〜５の整数である、請求項３３〜６７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ｎが、１〜１００の整数である、請求項３３〜６８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ｎが、１〜１０の整数である、請求項３３〜６９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、４つ以上のアリールもしくはヘテロアリール環、またはそれらの組合せを含む部分である、請求項３３〜７０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが発色性である、請求項３３〜７１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが蛍光性である、請求項３３〜７１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、少なくとも４つの縮合環を含む、縮合多環式アリール部分を含む、請求項３３〜７３のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、ジメチルアミノスチルベン、キナクリドン、フルオロフェニル−ジメチル−ＢＯＤＩＰＹ、ｈｉｓ−フルオロフェニル−ＢＯＤＩＰＹ、アクリジン、テリレン、セキシフェニル、ポルフィリン、ベンゾピレン、（フルオロフェニル−ジメチル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、（ビス−フルオロフェニル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、クアテルフェニル、ビ−ベンゾチアゾール、ター−ベンゾチアゾール、ビ−ナフチル、ビ−アントラシル、スクアライン、スクアリリウム、９，１０−エチニルアントラセンまたはター−ナフチル部分である、請求項３３〜７４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、ｐ−ターフェニル、ペリレン、アゾベンゼン、フェナジン、フェナントロリン、アクリジン、チオキサントレン、クリセン、ルブレン、コロネン、シアニン、ペリレンイミドもしくはペリレンアミド、またはそれらの誘導体である、請求項３３〜７５のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー移動色素、チアゾールオレンジ色素、ポリメチンまたはＮ−アリール−１，８−ナフタルイミド色素である、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドもしくは６−ＦＡＭ、またはそれらの誘導体である、請求項３３〜７７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
Ｍが、出現毎に独立して、以下の構造の１つ：

を有する、請求項３３〜７８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
ポリマー色素が、表２から選択される構造を有する、請求項３３〜７９のいずれか１項に記載の方法または組成物。