JP6461973B2 - 2以上の疎水性ドメインおよびpeg部分を含む親水性ドメインを含む化合物の、細胞の安定化のための使用 - Google Patents
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Description
1態様において、本発明は、親水性ドメインに結合した2以上の疎水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、2以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、2以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、親水性ドメインはポリエチレングリコール(PEG)部分を含む化合物の、細胞の安定化のための使用に関する。
さらなる好ましい態様において、安定化は、細胞が遠心分離、大規模細胞培養、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング、および/またはビーズ−ベースの細胞分離による剪断力を受ける際の安定化である。
好ましくは、2、3、4、5、6、7、8、9または10の疎水性ドメインが親水性ドメインに共有結合している。
特に有利には、特定の態様において、少なくとも1つの脂質疎水性ドメインがステロイド、よりいっそう好ましくはコレステロールを含む。
本明細書における一般的理解のために、“疎水性部分”は“疎水性ドメイン”に含まれ、それの主要部を形成し、よってその疎水性を決定する。
使用の好ましい態様において、その化合物は下記の化合物またはその塩である:
2以上の疎水性ドメインおよび親水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、
2以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、
2以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、
親水性ドメインは式(I)の化合物を含み:
X1−[A1−(L1)n]k1−Z−[A2−(L1)n]k2−X2 (I)
{式中:
Zは、1〜100、好ましくは1〜50、より好ましくは4〜30の−O−CH2−CH2−部分を含む線状ポリエチレングリコール(PEG)部分であり、その際、ポリエチレングリコール部分は2つの−O−CH2−CH2−部分を連結する1以上のスペーサー部分SPを含んでもよく、線状PEG部分は一端または両端にリンカー部分L3を含んでもよく、
各L1は、互いに独立して選択されるリンカー部分であり、
各nは、0または1のいずれかであり、互いに独立して選択され、
A1およびA2は、互いに独立して選択される2官能性または3官能性の部分であり、ただし、少なくとも1つのA1またはA2は3官能性であり、
k1およびk2は、0〜10の整数であり、互いに独立して選択され、ただし、k1およびk2のうち少なくとも1つは0ではなく、
X1およびX2は、独立して水素または保護基から選択され、
L3は、独立して、1〜10個のC原子を含む線状アルキルまたはアルケニル鎖から選択され、それは(i)1〜3個のN、OまたはS原子により中断されていてもよく、および/または(ii)1〜4個のヒドロキシル、カルボニル、アミノまたはチオール基により置換されていてもよい}、
2以上の疎水性ドメインは、親水性ドメインに3官能性ドメインにより共有結合している。
脂質は、脂肪、ろう、ステロール、脂溶性疎水性ビタミン、たとえばビタミンA、D、EおよびK、脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ならびにリン脂質から選択される疎水性小分子である。
線状脂質(単数または複数)、ステロイド(単数または複数)または疎水性ビタミン(単数または複数)は、3官能性部分に直接に、またはリンカーL2を介して結合していてもよい。線状脂質が3官能性部分に直接結合している化合物の例は、化合物ミリスチン酸−ミリスチン酸−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEGである。ステロイドがリンカーL2を介して3官能性部分に結合している化合物の例は、化合物コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEGである。この後者の例においてTEG(テトラエチレングリコール)がリンカーL2である。
安定化効果を得るために、本発明に従って使用するための化合物は2もしくは3またはそれ以上、より好ましくは2または3つの疎水性部分を含む。
本発明によれば、“コレステロール−二重リンカー分子”は、2つの疎水性部分を含み、それらが両方ともコレステロールである、本発明に従って使用するための化合物であると解釈される。したがって、“ミリスチン酸−三重リンカー分子”は、3つの疎水性部分を含み、それらがすべてミリスチン酸である、本発明に従って使用するための化合物であると解釈される。
さらに、2つの疎水性部分を含み、それらが両方ともミリスチン酸である化合物の使用が特に好ましい。
本発明によれば、“非対称二重リンカー分子”は、2つの疎水性部分を含み、それら2つの疎水性部分が互いに異なる、本発明に従って使用するための化合物であると解釈される。
本発明によれば、図6A)に示す化合物“コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEG”は、疎水性部分としての2つのコレステロール部分がTEG(テトラエチレングリコール)を介して3官能性部分に結合している化合物であると解釈される。
本発明によれば、“ビオチン−TEG”はリンカーTEGを介して3官能性部分A2に結合したビオチン部分であると解釈される。
よりいっそう模式的様式で、“コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEG”は構造“5’−XXYYYYYYYFZ−3’”のものであると記載することができ、その際、YはPEG+スペーサー部分であり、Xは3官能性リンカーを介して親水性部分に結合した疎水性部分であり、Fは蛍光標識フルオレセインであり、Zは連結基(ビオチン)である。5’および3’は、ヌクレオチドと同様に、実施例に示す自動合成による合成の方向を示す。
実験の部に記載する本発明化合物において、そうではないと明確に指摘しなければ、L1が存在し(n=1)、それはホスフェートである。
さらに、親水性ドメインに共有結合した2または3つの疎水性分子を含む本発明に従って使用するための化合物は、細胞への緊密な結合を示し、それはおそらく協同結合効果の利用によるものであろう。細胞へのそのような分子の結合は、疎水性分子を1つだけ含む化合物を用いる結合または固定化と比較して100〜1000倍強い。
そのような好ましい態様において、n=1であり、したがってL1が存在する。
本発明に従って使用するための化合物の末端疎水性部分(単数または複数)に続いて長いフレキシブル親水性ドメインがある。
他の塩類も可能であり、当業者に知られている。 好ましくは、細胞の生存性または機能に全くまたは実質的に影響を及ぼさない塩類を使用する。
−(L3)n2−[O−CH2−CH2]y−(SP)n1]m−[O−CH2−CH2]y1−(L3)n2−
式中:
SPは、スペーサー部分であり、
各スペーサー部分SPは互いに独立して選択され、
各n1は、0または1のいずれかであり、m個の部分それぞれについて独立して選択され、
各n2は、0または1のいずれかであり、互いに独立して選択され、
mは、1から100、好ましくは1から50、より好ましくは4から30の整数であり、
yは、1から100、好ましくは1から50、より好ましくは4から30の整数であり、
y1は、0から30、好ましくは0から10、より好ましくは0から4の整数であり、
ただし、y*m+y1≦100であり、
L3は、前記に定めたものである。
例から分かるように、n1は一般に、本発明に従って使用するための化合物において常に0であり、あるいは本発明に従って使用するための化合物において常に1である。
n1=0の代表的化合物は、コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−PEG2000−Fluos−ビオチン−TEGである。
y1=0の代表的化合物は、コレステリル−TEG−スペーサーC12−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEGである。
y1=1の代表的化合物は、5’−コレステリルTEG−コレステリルTEG−(スペーサーC18)7−スペーサーC3−dT−ビオチンTEG−3’である。
本発明のさらなる好ましい態様において、スペーサー部分SPは互いに独立してホスフェートおよび2官能性部分からなる群から選択される。
本発明による2官能性部分は本発明に従って使用するための化合物の合成前に2つの官能基を含む部分であると解釈される。したがって、そのような2官能性部分は線状化合物の合成に適切である。適切な2官能性基は、好ましくは下記のものからなる群から選択される:ホスフェート基、カルバメート基、アミド基、核酸塩基を含む部分、よりいっそう好ましくはdT、および1〜10個のC原子、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の原子を含む線状アルキル基であって、末端C原子に、特に、独立してアミン、カルボニル、ヒドロキシル、チオール、炭酸基から選択される官能基を含むアルキル鎖。末端官能基をもつ適切な線状アルキル基の例は、ジアミノアルキル部分、たとえばH2N−(CH2)5−NH2またはヒドロキシル−カルボニル部分、たとえば−C(O)−(CH2)4−O−である。
(a)飽和もしくは不飽和脂肪酸、および/または
(b)8から26個のC原子、好ましくは12から22個のC原子、より好ましくは14から18個のC原子をもつ脂肪酸
である。
飽和脂肪酸の例は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、およびセロチン酸である。
ステロイドは、互いに連結した特徴的配列の4つのシクロアルカン環を含むタイプの有機化合物である。ステロイドのコアは17個の炭素原子からなり、それらが互いに結合して4つの縮合環の形をとる:3つのシクロヘキサン環(環A、BおよびCと表記する)および1つのシクロペンタン環(D環)。ステロイドは、この4環コアに結合する官能基およびそれらの環の酸化状態により変異する。ステロールは特殊な形のステロイドであり、位置3のヒドロキシル基およびコレスタンから誘導された骨格をもつ。
(a)ステロイドはステロールである、または
(b)ステロイドは、コレステロール;ステロイドホルモン、好ましくは生殖腺ステロイド、より好ましくはアンドロゲン、たとえば同化ステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、またはテストステロン、エストロゲン、たとえばエストラジオール、エストリオール、またはエストロン;黄体ホルモン物質、たとえばプロゲステロンまたはプロゲスチン、コルチコステロイド、特にグルココルチコイドまたはミネラルコルチコイド;エクジステロイド(ecdysteroid)、たとえばエクジステロン(ecdysterone);フィトステロール;ブラシノステロイド(brassinosteroid);ホパノイド(hopanoid);およびエルゴステロールからなる群から選択される、
より好ましくは、ステロイドはコレステロールである、または
(c)疎水性ビタミンはα−トコフェロールである。
本発明のさらなる好ましい態様において、親水性ドメインに共有結合している2以上の疎水性ドメインは異なるかまたは同一である。
本発明のさらなる好ましい態様において、疎水性ドメインは3官能性部分A1にリンカー部分L2を介して共有結合した線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、好ましくはそれからなる。
リンカーL2は、独立して、疎水性部分を親水性部分に共有結合させるのに適したいずれかのリンカー部分であり、そのリンカーは疎水性部分とそれぞれA1またはA2との間に50、30もしくは20原子またはそれ未満の長さをもつ。
−[O−CH2−CH2]y2−(SP)n]m1−
{式中:
SPおよびnは前記に定めたものであり、好ましくはn=0であり、
y2は、1から30、好ましくは3から10の整数であり、
m1は、1から10、好ましくは1から3の整数である}
からなる群から選択され、
より好ましくは、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンはリンカー部分テトラエチレングリコール(TEG)またはホスフェートを介して3官能性部分A1に結合している。
本発明の特に好ましい態様において、疎水性ドメインは、3官能性部分A1のみを介して、または前記のドメインX1−[A1−(L1)n]k1を介して、その親水性ドメインに共有結合している。そのような態様に、本発明に従って使用するための化合物のさらなる好ましい態様も適用される。そのような化合物において、疎水性ドメインは専ら分子の一方の末端部に位置し、これに対し、さらなる基、たとえば連結基または標識部分が存在すれば、それらはそこから空間的に離れた他方の末端部に位置する。
本発明に従って使用するための化合物がdT部分を2官能性部分A2として含む場合、k2は好ましくは3、4、5または6である。
本発明のさらなる好ましい態様において、本発明に従って使用するための化合物はさらに標識部分および/または連結基を含む。
そのような化合物はさらに細胞標識化の目的に有用である。本発明に従って使用するための代表的化合物は5’−コレステリルTEG−コレステリルTEG−PEG2000−Fluos−3’である。
本発明の他のいっそう好ましいさらなる態様において、化合物はさらに連結基を含む。代表的化合物は5’−コレステリルTEG−コレステリルTEG−PEG2000−ビオチンTEG−3である。
本発明の他のより好ましい態様において、化合物はさらに標識部分および連結基を含む。
好ましい1態様において、標識部分は下記のものから選択される:(a)色原体、化学発光性グループ(たとえば、アクリジニウムエステルまたはジオキセタン)、電気化学発光性化合物、色素、蛍光色素(たとえば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、およびその誘導体)、発光性金属錯体、たとえばルテニウムまたはユーロピウムの錯体、および放射性同位体からなる群から選択される直接標識化部分;(b)あるいは間接検出系の一方のパートナー、好ましくは標識部分が下記のものからなる群から選択される結合対のメンバーのうちの一方であるもの:(i)ハプテンまたは抗原/抗体、(ii)ビオチンまたはビオチンアナログ、たとえばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン/アビジンまたはストレプトアビジン、(iii)糖/レクチン、(iv)核酸または核酸アナログ/相補的核酸、および(v)受容体または受容体フラグメント/リガンド、たとえばステロイドホルモン受容体/ステロイドホルモン。
好ましい態様において、標識部分は直接標識化のための標識部分であり、よりいっそう好ましくは標識部分は蛍光性部分または色素である。
本発明の特に好ましい態様において、疎水性ドメインは親水性ドメインに3官能性部分(単数または複数)A1のみを介して(または前記のドメインX1−[A1−(L1)n]k1を介して)共有結合しており、連結基および/または標識部分は部分[A2−(L1)n]k2−X2に結合している。これにより、細胞膜内への挿入のための疎水性ドメインと固定化および/または標識化のための部分(存在するならば)との空間的分離が確実になる。
そのような化合物は、安定化に加えて、標識部分が存在する場合には標識化および検出にも適切である。
本発明のいっそうさらなる特に好ましい態様において、疎水性ドメインは親水性ドメインに3官能性部分(単数または複数)A1のみを介して(または前記のドメインX1−[A1−(L1)n]k1を介して)共有結合しており、連結基が部分[A2−(L1)n]k2−X2に結合しているが、標識部分は結合していない。
連結基は、化合物を支持体、特に固体支持体に可逆的もしくは不可逆的に、および/または共有結合もしくは非共有結合により固定化するのに適した部分である。好ましい態様において、連結基は抗体もしくは抗原結合性抗体フラグメント、受容体もしくはその結合部位、受容体に対するリガンド、酵素もしくはその結合部位、酵素に対する基質、タグ結合部位、タグ、または官能基である。
ストレプトアビジンへのビオチンの結合、または抗体もしくは抗原結合性抗体フラグメントの結合は、非共有結合性かつ可逆的である。固体支持体への非共有結合を用いるそのような連結基は、−安定化に加えて−細胞をさらに使用するために、たとえば動物モデルに投与するために、再び離脱させることを意図する場合に好ましい。
よりいっそう好ましい態様において、本発明に従って使用するための化合物は連結基を含み、それはビオチンである。
より好ましい態様において、標識部分および/または連結基が存在する場合、それ/それらは前記のように3官能性部分A2を介して共有結合している。
本発明のさらなる好ましい態様において、部分A1およびA2は、独立して、下記のものから選択される:ホスフェート基、カルバメート基、アミド基、核酸塩基を含む部分、よりいっそう好ましくはdT、および1〜10個のC原子を有する線状アルキル基であって末端C−原子に、特に、独立してアミン、カルボニル、ヒドロキシル、チオール、炭酸基から選択される官能基を含むアルキル鎖からなる群から選択される2官能性基;ならびに1〜10個のC原子を有し、少なくとも1つの−OH、−SH、および/または少なくとも1つの−NH2基を含み、好ましくはリジン、セリン、セリノール、−O−CH2−CH((CH2)4−NH2)−CH2−、グリセロール、および1,3 ジアミノグリセロール部分から選択される3官能性部分。
−[O−CH2−CH2]y2−(SP)n]m1−
{式中:
SPおよびnは前記に定めたものであり、好ましくはn=0であり、
y2は、1から30、好ましくは3から10の整数であり、
m1は、1から10、好ましくは1から3の整数である}
からなる群から選択される。
本発明に従って使用するための他の化合物を当技術分野で知られている方法に従って同様に製造できる。
したがって、他の態様において、本発明は、細胞を安定化するための、本発明に従って使用できる少なくとも3種類の異なる化合物を含む組成物の使用に関するものであり、その際、異なる化合物は少なくともそれらの疎水性ドメインにおいて異なる。
その水溶液は、好ましくは緩衝化されている。たとえば、本発明の溶液はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、トリス、および/またはHepes緩衝液であってもよい。
さらなる態様において、本発明は、細胞を安定化する方法であって、
a)前記に定めた化合物を用意する;そして
b)化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞をその化合物と接触させ、それにより細胞を安定化する;そして
c)所望により細胞に剪断力を付与する
ことを含む方法に関する。
さらなる好ましい態様において、安定化は、細胞が遠心分離、大規模細胞培養、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティングおよび/またはビーズ−ベースの細胞分離による剪断力を受ける際の安定化である。
2種類以上の前記化合物を含む組成物も本発明方法に使用できる。そのような組成物および本発明に従ったそれらの使用は前記に述べられている。
細胞の生存性を維持するために、混合を穏やかに行なうことができる。
一般に、接触は一般に約1℃〜45℃、好ましくは10℃〜30℃、より好ましくは22℃〜38℃の温度で行なわれる。
同様に、細胞を化合物と共に、細胞に結合させるのに十分な時間、インキュベートすることが好ましい。一般に、細胞を化合物と共に、1分〜3日間、好ましくは5分〜24時間、よりいっそう好ましくは10分〜8時間、インキュベートすることが好ましい。
そのような条件により化合物は細胞の膜と相互作用でき、それにより細胞を安定化する。
しかし、好ましい態様において、本発明方法の工程b)の後に細胞に剪断力または剪断応力が適用される。
そのような遠心分離工程は、たとえば培地などの周囲液体から細胞を分離するために用いられる。細胞は遠心分離されなければならず、したがって剪断応力を受ける。きわめて繊細で脆い細胞集団はそのようなプロセスにより損傷を受ける可能性がある。本発明の方法および使用はそのような細胞集団の取扱いを改善する。好ましい態様において、細胞は本発明方法の工程b)の後に遠心分離される。好ましくは、それらはたとえば100g、200g、500g、1000gまたはそれ以上で、5分間以上、たとえば1時間または5時間、遠心分離される。
フローサイトメトリーは特定の細胞集団を分離するためにごく一般的に用いられる方法である。このプロセスに際して、細胞は流速に応じた高い剪断応力を受ける。本発明の方法はこの剪断応力を低減する。
異なる表現型をもつ細胞集団を、磁性ビーズに結合した特異的抗体により分離することができる。このプロセスに際して、細胞はビーズのサイズに応じた高い剪断応力を受ける。本発明の方法はこの剪断応力を低減する。
キットはさらに、個別に、たとえば容器または注射器に保存された、本発明に従って使用するための2種類以上の化合物を含むことができる。それらは乾燥形態、たとえば凍結乾燥もしくは乾燥した状態で、または溶液として、または凍結形態で、たとえば凍結溶液として保存できる。
さらに連結基を含む化合物は、生細胞を固体表面に結合させ、続いてその表面から離脱させ、そしてマウスモデルに移植するために、さらに有用である。これらの種類の機能アッセイは、たとえば循環型の異常細胞の腫瘍誘発可能性を調べるためにきわめて重要である。
a)本発明に従って使用するための化合物であってさらに標識部分を含む化合物を用意する;そして
b)化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞をその化合物と接触させ、それにより標識を細胞に固定化する;そして
c)所望により標識を検出する
ことを含む方法を開示する。
同様に、細胞生存性を維持するために、接触は約900〜1100mbarの圧力で行なわれる。
そのような条件により化合物は細胞の膜と相互作用できる。それにより、標識部分は細胞に固定化される。
細胞を標識する方法であって、
a)本発明に従って使用するための少なくとも3種類の異なる化合物を含み、異なる化合物が少なくともそれらの疎水性ドメインにおいて異なりかつ異なる化合物が標識部分を含む組成物を用意する、
b)化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞をその組成物と接触させ、それにより細胞を標識する、そして
c)所望により標識を検出する
ことを含む方法を開示する。
連結基を細胞の表面に固定化する方法であって、
a)本発明に従って使用するための化合物であって連結基を含む化合物を用意する;そして
b)化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞をその化合物と接触させ、それにより連結基を固定化する
ことを含む方法を開示する。
すべての抗体の一般構造がきわめて類似するが、特定抗体の固有の特性は前記に詳述したように可変(V)領域により決定される。より具体的には、それぞれ軽鎖(VL)上に3つ、重鎖(VH)上に3つの可変ループが、抗原への結合、すなわちそれの抗原特異性に関与する。これらのループは相補性決定領域(CDR)と呼ばれる。VHとVLの両ドメインからのCDRが抗原−結合部位に寄与するので、最終的な抗原特異性を決定するのは重鎖と軽鎖の組合わせであって、いずれか単独ではない。
タグは、バイオテクノロジーにおける認識のために用いられるペプチドモチーフである。周知のタグは、Ni2+−カラムに結合させることができるHis−タグ(6×ヒスチジン)である。
レクチンは、糖部分に対して高特異的な炭水化物結合性タンパク質である。適切なレクチンとして、コンカナバリンAを使用でき、これはα−D−マンノシルおよびα−D−グルコシル残基、分岐α−マンノシド型(mannosidic)構造体(高α−マンノースタイプ、またはハイブリッドタイプ、および二アンテナ型複合体(biantennary complex)タイプのN−グリカンに結合する。
本発明方法に有用な下記の化合物を合成した:
本発明方法に有用な代表的化合物および合成副産物の化学構造を図6AおよびBに示す。
本発明のビオチン−PEG−Lys−(C18)2の合成を図6Cに示す。
F)本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびにその中間体の構造
本発明方法に有用な化合物および参照化合物の合成のために下記の中間体を用いた:
コレステリル−TEG−CE−PA(GlenResearch 10−1975),
ミリスチン酸−CE−PA(社内製造),
ビオチン−TEG−CE−PA(GlenResearch 10−1955),
ビオチン−dT−CE−PA(GlenResearch 10−1038),
dT−CE−PA(GlenResearch 10−1030),
対称doubler−CE−PA(GlenResearch 10−1920),
PEG−200−CED−PA(ChemGenes CLP−2119),
6−フルオレセイン−CE−PA(GlenResearch 10−1964)および
universal−CPG(Proligo 1000A M401010)
本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を図12に示す。
下記を以下の化合物のモジュール型記載に適用する:
X=疎水性部分,Y=PEG2000,Z=ビオチン−TEG,F=Fluos=フルオレセイン
下記の実験において細胞の回収率を決定した。
下記に示すように、異なるインキュベーション時間、実験を実施した:
化合物ビオチン−PEG−lys−(C14)2について下記の回収率が決定された:
M=2708,90g/mol
5,4mg/10ml EtOH
c=n/V=m/M*V
c=5,4g/(2708,9g/mol*10 l)=1,99 10e−4mol/l
1,99*10e−4mol/l=7,96nmol/4μl
4μl=4,5*10e6細胞
→1,77nmol/10e6細胞
この実験における回収率:85,72%
実施例4:本発明方法に有用な1つの疎水性部分を含む化合物と2つの疎水性部分を含む化合物との比較
この実験の目的:ストレプトアビジン−コートした表面への本発明方法に有用な異なる分子を用いる白血球固定化の試験。特に、単一コレステロール−分子および異なる二重リンカー分子(すなわち、2つの疎水性部分を含むもの)の性能を試験した。詳細には、ストレプトアビジン−コートした表面への異なるリンカー分子を用いる白血球(WBC)の固定化を、12−ウェルプレートで試験した:300000 WBC/ウェル。これに続いて、細胞の固定化および洗浄の後の細胞回収率をCellavista計測器(10xNuclei Operator s9s5)により測定した。
本発明方法に有用な化合物が細胞の安定化および固定化に及ぼす効果を判定した。
A)異なる分子を用いた遠心分離および細胞固定化の後のWBC回収率
図13に示すように、分子プローブHH1749*、HH1750*およびHH1755*(* ビオチン−PEG−リジン−(C18)2)は遠心分離後の回収率に関して異なる性能を示す:分子の濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率は高くなる。遠心分離特性:10分、300×g。図14から分かるように、分子プローブHH1749*、HH1750*およびHH1755*は、異なる濃度での細胞固定化率に関して異なる性能を示す。リンカー濃度が高いほど、細胞固定化率は高くなる。
図15から分かるように、分子AおよびB(A:コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEG;B:ビオチン−PEG−リジン−(C18)2)は遠心分離後の回収率に関して異なる性能を示す。分子濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率は高くなる。分子Bは3.5時間以内は細胞を固定化できる。遠心分離特性:10分、300×g。A:コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEG。B:ビオチン−PEG−リジン−(C18)2。
図16から分かるように、分子濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率は高くなる。さらに、細胞安定化は実験者とは無関係である。遠心分離特性:10分、300×g。分子:コレステリル−TEG−コレステリル−TEG−(スペーサーC18)7−Fluos−ビオチン−TEG。
第1実験の結果を図17に示す。下記の分子を試験した:
・ 1234: 5’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−dT−ビオチン−TEG−3’
・ 1248: 3’−(コレステリル−TEG)2−PEG2000−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS 1254: 3’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
・ 1255: 3’−(ミリスチン酸)2−PEG2000−dT−ビオチン−TEG−5’ INVERS
・ すべての分子が2時間以内は細胞を固定化できる
・ PBS中におけるWBCは300×gで20分間の遠心分離に際して損傷を受ける
・ 分子1234は最良の性能を示し、化合物1255および1254がそれに続く。
これに関する第2実験の結果を図18に示す。下記の分子を試験した:
1255: 3’−(ミリスチン酸)2−PEG2000−dT−ビオチン−TEG−5’ INVERS 1234: 5’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−dT−ビオチン−TEG−3’
1248: 3’−(コレステリル−TEG)2−PEG2000−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
1254: 3’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
結果は下記のとおりである:
・ すべての分子が2時間以内は細胞を固定化できる
・ PBS中におけるWBCは500×gで20分間の遠心分離に際して損傷を受ける
・ 分子1234は最良の性能を示し、分子1255および1254がそれに続く。
・ 1255: 3’−(ミリスチン酸)2−PEG2000−dT−ビオチン−TEG−5’ INVERS
・ 1234: 5’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−dT−ビオチン−TEG−3’
・ 1248: 3’−(コレステリル−TEG)2−PEG2000−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
・ 1254: 3’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
結果は下記のとおりである:
・ すべての分子が2時間以内は細胞を固定化できる
・ PBS中におけるWBCは1000×gで20分間の遠心分離に際して損傷を受ける
遠心分離特性:20分、500×g。
この実験の結果を図20に示す。下記の分子を試験した:
・ 1255: 3’−(ミリスチン酸)2−PEG2000−dT−ビオチン−TEG−5’ INVERS
・ 1234: 5’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−dT−ビオチン−TEG−3’
・ 1248: 3’−(コレステリル−TEG)2−PEG2000−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
・ 1254: 3’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−Fluos−ビオチン−TEG−5’ INVERS
結果は下記のとおりである:
・ ジャーカット培養細胞は、PBS中および異なる分子を用いた遠心分離プロセスに際して5.5時間以内は安定である
遠心分離特性:20分、500×g。
これに関する第1実験の結果を図21AおよびBに示す。
3官能性リンカー部分が異なる、本発明方法に有用な異なる化合物を用いて、WST−1増殖キット(RAS)を用いる細胞生存性試験を実施した。
これに関する第2実験の結果を図22AおよびBに示す。本発明方法に有用な被験分子(No.1244および1274)は、4.5時間のリンカーインキュベーション時間中に細胞形態に影響を及ぼさないことが見出された。
この実験の結果を図23に示す。下記のことが見出された:
・ 本発明方法に有用な分子を添加しない場合、細胞は4.5時間のインキュベーション時間中に離散する
・ インキュベーション時間中に残った細胞の細胞形態は影響を受けていない。
この実験の結果を図24に示す。本発明方法に有用な下記の分子を試験した:
・ 1234: 5’−(コレステリル−TEG)2−スペーサーC18−dT−ビオチン−TEG−3’
・ 1255: 3’−(ミリスチン酸)2−PEG2000−dT−ビオチン−TEG−5’ INVERS
下記のことが見出された:
・ MDA−MB468培養細胞は、PBS中における、および本発明方法に有用な異なる分子を用いた遠心分離プロセスに際して、5時間以内は安定である
遠心分離特性:20分、500×g。
出発物質として5’−(コレステリル−TEG)2−PEG2000−Fluos−ビオチン_TEG−3’ INVERS(14530pmol/μl)(社内参照No.:29.891250)、およびストレプトアビジン処理したMTP(Microcoat)、12ウェルプレートを用いた。
−EDTA−全血59.423 6.400 WBC/μl(Ambulanz Roche)
細胞溶解緩衝液:100mM NH4Cl+5mM Hepes+0,5mM KHCO3+0,1mM EDTA−K
Ca 1×8mlの全血を細胞溶解緩衝液と共に50ml Falconチューブに充填し、室温で10分間インキュベートした。
250gで15分間遠心分離し、ペレットをPBSで再懸濁し、50mlまでPBSを充填し、250gで15分間遠心分離し、50mlまでPBSを充填した。
1:37.100のWBC/μl
− プレート上での実験のデザインを以下に説明する(参照:図2):
3×12ウェル MTP:本発明方法に有用な化合物によるWBCの処理:
4×判定:
横列A:200μlのPBSを導入し、それぞれ1nmolの化合物をそれに添加し、混合し、約30分間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、800μlのPBSを導入し、300.000のWBC(非処理)を添加した;
横列B:800μlのPBSを導入し、300.000のWBC(非処理)を添加した;
横列C:1ml中の10×10^6のWBCを10nmの本発明方法に有用な化合物と共に10分間インキュベートし、それぞれ800μlのPBS/ウェル、300.000の処理済みWBCを導入した。
−第3プレートを150分後に測定した。
計算した結果を図3に示す。これらの結果を表わすグラフを図4に示す。実験のプレートを図5に示す。
Claims (13)
- 親水性ドメインに結合した2、3、または4つの疎水性ドメインを含みまたはそれらからなる化合物の、剪断応力条件に対する細胞の安定化のための使用であって、
該2、3、または4つの疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、該2、3、または4つの疎水性ドメインはそれぞれ、12から22個のC原子を有する飽和脂肪酸である線状脂質、またはステロイドコレテロールを含み、そして該親水性ドメインはポリエチレングリコール(PEG)部分を含む、ここで、該細胞の安定化とは、前記化合物を適用しない対照細胞の生存性よりも、細胞の生存性が高いことであり、そして該剪断力を細胞に付与する、
そして、
該親水性ドメインは式(I)の化合物を含み:
X1−[A1−(L1) n ] k1 −Z−[A2−(L1) n ] k2 −X2 (I)
{式中:
Zは、2〜100または2〜50の−O−CH 2 −CH 2 −部分を含む線状ポリエチレングリコール(PEG)部分であり、その際、該ポリエチレングリコール部分は2つの−O−CH 2 −CH 2 −部分を連結する1以上のスペーサー部分SPを含んでもよく、該SPはホスフェート部分であり、そして、該線状PEG部分は一端または両端にリンカー部分L3を含んでもよく、
各L1は、互いに独立して、ホスフェート、アミド、カルバメートおよびエステル基からなる群から選択されるリンカー部分であり、
各nは、0または1のいずれかであり、互いに独立して選択され、
A1およびA2は、互いに独立して選択される2官能性または3官能性の部分であり、ただし、少なくとも1つのA1またはA2は3官能性であり、
ここで、該2官能性部分は、ホスフェート基、カルバメート基、アミド基、核酸塩基を含む部分、および1〜10個のC原子を有する線状アルキル基:そのアルキル鎖は末端C−原子に官能性基を含む、からなる群から選択され、そして、該3官能性部分は、リジン、セリン、セリノール、−O−CH 2 −CH((CH 2 ) 4 −NH 2 )−CH 2 −、グリセロール、および1,3ジアミノグリセロール部分、からなる群から選択される、
k1およびk2は互いに独立して選択される整数であり、k1は1、2、3、4、または5であり、そしてk2は1、2、3、4、5、または6であり、
X1およびX2は、独立して水素、保護基、および疎水性ドメインから選択され、
L3は、独立して、1〜10個のC原子を含む線状アルキルまたはアルケニル鎖から選択され、それは(i)1〜3個のN、OまたはS原子により中断されていてもよく、および/または(ii)1〜4個のヒドロキシル、カルボニル、アミノまたはチオール基により置換されていてもよい}、
そして
該2以上の疎水性ドメインは、該3官能性部分を介して該親水性ドメインに共有結合している、
または該化合物の塩である、
前記使用。 - 請求項1の使用であって、
式(I)中のZは、下記の構造:
−(L3)n2−[[O−CH2−CH2]y−(SP)n1]m−[O−CH2−CH2]y1−(L3)n2
{式中:
SPは、ホスフェート部分であるスペーサー部分であり、
各n1は、0または1のいずれかであり、m個の部分それぞれについて独立して選択され、
各n2は、0または1のいずれかであり、互いに独立して選択され、
mは2から100または2から50の整数であり、
yは1から100または2から50の整数であり、
y1は0から30または0から10の整数であり、
ただし、y×m+y1≦100であり、
L3は、独立して、1〜10個のC原子を含む線状アルキルまたはアルケニル鎖から選択され、それは(i)1〜3個のN、OまたはS原子により中断されていてもよく、および/または(ii)1〜4個のヒドロキシル、カルボニルまたはチオール基により置換されていてもよい}
を有する、前記使用。 - (a)n1はm個の部分−[[O−CH2−CH2]y−(SP)n1]−について同一である、および/または
(b)y1は0である、および/または
(c)yは4、5または6であり、n1は1である、および/または
(d)n2は両方とも0である、または
(e)一方または両方のn2=1であり、L3は1〜10個のC原子をもつアルキル基であり、それはアミド基、カルボニル基、カルバメートおよび/またはNH基を含んでもよい、
請求項2に記載の使用。 - 前記12から22個のC原子を有する飽和脂肪酸である線状脂質は、ミリスチン酸、ステアリン酸およびベヘン酸からなる群から選択される請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 親水性ドメインに共有結合している2、3、または4つの疎水性ドメインが異なるかまたは同一である、請求項1に記載の使用。
- 疎水性ドメインは
(a)12から22個のC原子を有する飽和脂肪酸である線状脂質、またはステロイドコレステロールからなる、または
(b)3官能性部分A1にリンカー部分L2を介して共有結合した12から22個のC原子を有する飽和脂肪酸である線状脂質、またはステロイドコレステロールを含み、その際、L2は下記のものを含む:ホスフェート基、部分
−[[O−CH2−CH2]y2−(SP)n] m1 −
{式中:
SPおよびnは前記に定めたものであり、y2は1から30の整数であり、m1は1から10の整数である}、グリセロール部分、カルバメート基、アミド基、1〜10個のC原子を有する線状アルキル基:そのアルキル鎖は末端C原子に官能基を含み、それは1、2、3、4または5つの部分R1により置換されていてもよく、その際、R1は独立してC1−C4アルキル、C1−C4ヒドロキシアルキル、C1−C4アミノアルキル、C1−C4シアノアルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノまたはカルボニル部分である、
請求項2〜5のいずれか1項に記載の使用。 - 前記L2は、ホスフェート基、部分
−[[O−CH2−CH2]y2−(SP)n]m1−
{式中:
SPおよびnは請求項1で定義したものであり、y2は1から30の整数であり、そしてm1は1から10の整数である}、
グリセロール部分、カルバメート基、アミド基、1〜10個のC原子を有する線状アルキル基:そのアルキル鎖は末端C原子に官能基を含み、それは1、2、3、4または5つの部分R1により置換されていてもよく、その際、R1は独立してC1−C4アルキル、C1−C4ヒドロキシアルキル、C1−C4アミノアルキル、C1−C4シアノアルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノまたはカルボニル部分であり、
前記12から22個のC原子を有する飽和脂肪酸である線状脂質、またはステロイドコレステロールは前記リンカー部分テトラエチレングリコール(TEG)またはホスフェートを介して3官能性部分A1に結合している、
請求項6に記載の使用。 - 疎水性ドメインは、3官能性部分A1のみを介して親水性ドメインに共有結合している、請求項2〜7のいずれか1項に記載の使用。
- 前記化合物はさらに標識部分および/または連結基を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用であって、
前記標識部分および/または前記連結基は3官能性部分A2を介して共有結合している、
前記1以上の部分A2は標識部分または連結基であってもよい、前記使用。 - リンカーL2は、独立してホスフェート、アミド、カルバメート、エステル基、および部分
−[[O−CH2−CH2]y2−(SP)n]m1−
{式中:
SPおよびnは前記に定めたものであり、
y2は1から30の整数であり、
m1は1から10の整数である}からなる群から選択される、
請求項2〜8のいずれか1項に記載の使用。 - 剪断応力条件に対して細胞を安定化する方法であって、
a)請求項1〜10のいずれか1項に定義される化合物を用意する;
b)該化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞を該化合物と接触させ、それにより細胞を安定化する;そして
c)細胞に剪断力を付与する;
ことを含み、
該細胞の安定化とは、該化合物を適用しない対照細胞の生存性よりも、細胞の生存性が高いことである、
前記方法。 - 細胞に対する剪断力の前記付与が、遠心分離、大規模細胞培養、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティングおよび/またはビーズ−ベースの細胞分離によるものである、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞が懸濁状態の細胞であり、および/または細胞が動物もしくはヒトの細胞である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用または請求項11または12に記載の方法。
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