CN102245765B - 细胞移植 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于防止脂肪移植物中细胞膜损伤的聚合物。业内认为，将诸如泊洛沙姆(poloxymer)P 188等三嵌段共聚物与欲移植到个体体内的脂肪细胞或脂肪组织混合可使所述细胞的膜稳定，由此在软组织重建或填充中进行较为成功的脂肪移植。所述方法还可用于成体干细胞或来源于脂肪组织的其它细胞的移植。也可将诸如硫辛酸等其它试剂添加到所述聚合物/细胞组合物中以进行细胞移植。

Description

细胞移植
相关申请案
本申请案依据35 U.S.C.§119(e)主张2008年10月21日申请的美国临时专利申请案USSN 61/107,023的优先权，所述专利以引用的方式并入本文中。
背景技术
外伤、先天性缺陷、感染和肿瘤切除继发的软组织损伤和畸形是造成患者发病的重要原因。目前，自体游离皮瓣(free flap)重建或局部推进皮瓣是重大软组织和骨缺损重建模态的主要工具(workhorse)。尽管带蒂皮瓣(pedicled flap)和游离皮瓣重建提供了进行重建的有力工具，但其有可能引起严重副作用和供体部位发病。
曾经在软组织重建中使用自体脂肪移植，但这项技术是不可预测的。使用抽脂的脂肪具有两个优点：1)极低的供体部位发病，由此提供一个安全且易于获得的自体细胞来源；和2)这些程序相对易于进行，同时不会出现缺血性并发症以及与血管化游离皮瓣有关的早期移植失败的问题。然而，到目前为止，游离脂肪移植受到不可预测的再吸收水平和由此引起的不规则性问题的困扰。游离脂肪移植失败和体积减小似乎与采集时产生的机械应力导致膜损伤、早期缺血性改变以及营养缺失和移植物供血不足有关。这些应激子导致细胞凋亡和细胞死亡。接下来，在再血管化后去除死亡的细胞碎片将引起移植物再吸收。这一过程导致不协调且不合需要的软组织修复结果。由于脂肪移植最初是由纽博(Neuber)在1893年描述的，致使很少改善游离脂肪移植结果。迄今为止，有关在建立充足的血管分布之前减少初始缺血损伤的细胞的尝试已经取得了适度的成果。因此，只改善脂肪移植物的供血不足以显著改善脂肪移植的结果。在脂肪移植物取得、处理和/或移植期间，防止细胞损伤也很重要。
仍需要能在美容手术和重建手术中较为成功地移植脂肪组织或来源于脂肪组织的细胞(例如脂肪细胞、干细胞)。在软组织重建中转移大量自体脂肪组织的能力将为约数百万患者提供一个新颖的重建选择，同时不会伴随供体部位发病。此外，还为供体部位选择较少的患者以及不能耐受进行皮瓣重建所需的长时间手术的患者提供一个有利工具。
发明内容
本发明基于可预测地成功移植脂肪组织和脂肪细胞的需求。本发明至少部分基于以下发现：脂肪移植物中的受损细胞逐渐凋亡，并最终被接受者的身体所吸收。防止这些移植物的细胞，尤其是细胞膜损伤，将允许更成功地进行可预测的脂肪移植。为防止移植物细胞损伤，在本发明中，在移植物取得、移植物处理(例如洗涤、存储)和/或最终移植程序期间，将保护细胞膜免受损伤。已经研究了各种膜稳定剂，由此鉴别出使脂肪移植物中细胞的死亡随时间而减少的试剂。人们发现，疏水性部分侧接两个亲水性部分构成的三嵌段共聚物(例如泊洛沙姆P188(Poloxamer P188)，如图1中所示)可使细胞膜稳定，并且使脂肪移植物中细胞的死亡随时间而减少。将这些聚合物与欲移植的脂肪组织或脂肪细胞混合，会引起可预测且持久的脂肪移植。其它聚合物，诸如二嵌段共聚物、四嵌段共聚物和聚乙二醇，也经过测试，并且发现其不能保护细胞免受损伤，或者会溶解细胞。因此，本发明提供在软组织重建或填充的脂肪移植过程中使用三嵌段共聚物，尤其P188的组合物、方法和试剂盒。
细胞膜包括磷脂，其具有疏水性和亲水性结构域。这些磷脂形成一个连续的脂质双层，包围细胞。这一脂质双层的完整性对于防止细胞损伤极为重要。本发明提供三嵌段共聚物的组合物，其使细胞膜密封和/或稳定，并防止细胞受损。通常，这些聚合物与细胞的磷脂双层相互作用，并填塞损伤细胞膜中的孔。此外，经显示，这些聚合物还降低膜粘度。细胞粘度降低将使损伤的细胞变得更易溶解，而这样又会降低受损膜上的张力。本发明还提供在脂肪组织和脂肪细胞或其它组织和细胞(例如干细胞)移植过程中使用所述组合物的方法。
一方面，本发明提供三嵌段共聚物，其有助于使细胞膜密封和/或稳定。本发明中所用聚合物优选为生物可相容和/或生物可降解的。这种聚合物不应导致细胞溶解。在某些实施例中，所述聚合物是非离子性聚合物。在某些实施例中，所述聚合物是聚醚。在某些实施例中，所述聚合物是聚烷基醚。在某些实施例中，所述聚合物是聚烷基醚与另一聚合物(例如聚烷基醚)的共聚物。具体说来，已经发现，泊洛沙姆可用于使细胞膜密封和稳定。如以下化学结构中所示，泊洛沙姆是由中央疏水性聚氧丙烯(polyoxypropylene，POP)(也称为聚丙二醇)链侧接两个亲水性聚氧乙烯(polyoxyethylene，POE)(也称为聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG))链构成的非离子性三嵌段共聚物。在某些实施例中，优选将疏水性核心侧接两个亲水性尾构成的三嵌段共聚物用于脂肪移植。
在某些实施例中，使用泊洛沙姆P188来使脂肪移植物的细胞膜密封和/或稳定。已经发现，泊洛沙姆P188能特别有效地修复受损的脂肪细胞膜，并改善受损脂肪细胞的活力和存活可能性。不希望受特定理论的束缚，图2中说明一种用P188修复细胞膜的推荐机制。受损细胞膜的一部分中央脂质层(即，细胞膜的疏水性部分)暴露于其周围环境。P188的中央疏水性部分与细胞膜的这一疏水层相互作用，并且P188的侧接亲水端本身沿细胞膜的外部亲水性表面定位。这一密封/修复过程类似于常见的汽车轮胎补洞胶塞修补(plug repair)，在轮胎修补过程中，柔性橡胶塞的中央被塞入轮胎的小孔中以使其密封，同时橡胶塞的末端沿外胎面定位。可能需要不止一个P188分子来密封受损膜中的孔。在某些实施例中，泊洛沙姆P188防止脂肪移植物细胞损伤。泊洛沙姆是巴斯夫公司(BASF)以商品名PLURONIC销售的产品。具体点说，泊洛沙姆188(P188)是PLURONICF68。由于可以定制构成聚合物的嵌段的长度，故存在许多具有不同特性的不同泊洛沙姆。这些共聚物常用有关在室温下泊洛沙姆的状态的字母(“P”表示粉末，“L”表示液体，“F”表示薄片)后接三个数字命名。前两个数字×100得到疏水性聚氧丙烯核心的近似分子量，且最后一个数字×10得到聚氧乙烯含量的百分比。泊洛沙姆188是聚氧丙烯分子质量为1800g/mol且聚氧乙烯含量为80％的泊洛沙姆，并且泊洛沙姆188的平均分子量为7680-9510g/mol。为了将“Pxxy”名称转换成商品名“Fzz”，将“Pxxy”中的xx乘以约3，即，P188为F68。适用于本发明中的其它泊洛沙姆包括泊洛沙姆P108(PLURONICF38)、P184(PLURONICL64)、P401、P402、P407(PLURONICF127)和P408(PLURONICF108)。具有较低分子量和大致相当或较低PEG含量的其它泊洛沙姆可用于本发明中。聚合物通常是在从供体取出细胞后立即添加到细胞中，以尽快地防止和/或修复膜损伤。添加到移植物细胞中的聚合物的浓度范围为每毫升细胞约1mg到约20mg聚合物。在某些实施例中，在供移植的聚合物/细胞组合物中使用毫摩尔浓度的聚合物。通常使用达到所需膜稳定性的最低聚合物浓度。所属领域技术人员应理解，组合物中聚合物的浓度将视用于使移植细胞稳定的聚合物而定。
将欲移植的细胞或组织与适宜浓度的聚合物混合，随后移植到接受者(例如人类)的所需移植部位(例如面部、唇、乳房)中。可以使用本发明技术移植任何细胞或组织。在某些实施例中，所述组织是脂肪组织。在某些实施例中，所述细胞是来源于脂肪组织。在某些实施例中，所述细胞是脂肪移植物(即，脂肪组织)的一部分，所述脂肪移植物含有不同类型的细胞，包括(但不限于)脂肪细胞、基质细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和血细胞。在某些实施例中，细胞是脂肪细胞。在某些实施例中，细胞是成纤维细胞。在某些实施例中，细胞是基质细胞。在某些实施例中，细胞是内皮细胞。在某些实施例中，细胞是干细胞。在某些实施例中，细胞是来源于脂肪组织的干细胞。在采集时，可将细胞与聚合物混合。在某些实施例中，在从供体取出脂肪组织之前，将包括聚合物的组合物注射到欲取出组织的部位。在其它实施例中，在从供体取出细胞后，将聚合物添加到细胞中。也可在加工或存储时将聚合物添加到细胞中，或者可在即将移植前，将细胞与聚合物混合。可用包括聚合物的组合物洗涤或以其它方式加工细胞或组织。在某些实施例中，在移植前，洗掉移植物中的聚合物。
细胞/聚合物组合物还可包括其它试剂。举例来说，组合物可包括进一步保护或稳定欲移植细胞的试剂，或可保护聚合物的试剂。在某些实施例中，组合物包括维生素、矿物质、抗氧化剂、渗透保护剂、增粘剂、辅酶、膜稳定剂、脂质、碳水化合物、激素、生长因子、消炎剂、聚核苷酸、蛋白质、肽、醇、有机酸、有机小分子等。特别适用于脂肪移植的组合为P188和硫辛酸(下文以还原和氧化形式显示)。在某些实施例中，使用还原形式的硫辛酸。在其它实施例中，使用氧化形式的硫辛酸。在其它实施例中，使用两种形式的混合物。
本发明提供用于脂肪移植的脂肪细胞与聚合物(例如P188)的组合物。在某些实施例中，本发明提供干细胞与聚合物(例如P188)的组合物。干细胞可为来源于脂肪组织的成体干细胞。来源于脂肪组织的其它细胞(例如干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、基质细胞)也可用于本发明中。本发明细胞/聚合物组合物可包括本文中所论述的使膜破坏和/或自由基形成减到最少的其它试剂(例如抗氧化剂、维生素、脂质、蛋白质、肽、激素、生长因子、碳水化合物、医药剂)。
另一方面，本发明提供适用于使用本发明组合物和方法移植脂肪的试剂盒。所述试剂盒可包括将脂肪或脂肪源性细胞移植到个体体内必需的所有组分或所有组分的子集。所述试剂盒可包括例如聚合物(例如P188)、用于洗涤细胞的缓冲溶液、用于洗涤细胞的装置、细胞、注射器、针、杯、容器、酒精擦片、麻醉剂、抗生素、抗氧化剂、维生素、脂质、碳水化合物、激素、生长因子等。在某些实施例中，用于采集细胞的容器或注射器中可具有聚合物(例如P188)，以使采集的细胞与膜稳定剂立即接触。在某些实施例中，细胞是从接受这些细胞的患者获取(即，自体移植)。在某些实施例中，试剂盒的组分经无菌包装以便利外科医生或其它专业保健人员使用。试剂盒还可包括有关使用聚合物(例如P188)和其它试剂进行采集/移植程序的说明。试剂盒可提供单次使用必需的组件。试剂盒还可包括管理医药品和/或医疗装置的政府管理机构所需的包装和信息。
附图说明
图1.A.聚合物P188的聚氧乙烯(POE)亲水性亚单位。B.三嵌段P188结构，其具有跨接两个POE亲水性尾的疏水性聚氧丙烯(POP)亚单位。
图2.推定的P188膜插入过程。认为P188的疏水区插入受损膜的孔中，使细胞粘度降低并使膜离子渗漏稳定，所述受损膜具有水合亲水性长尾，延伸超过膜。
图3.A.单一完整脂肪细胞的电子显微镜检术(EM)图像，其描述了完整的脂质双层。B.沿膜表面具有膜孔的脂肪细胞双层的特写EM，且其尺寸以纳米标注(箭头)。
图4.细胞/泊洛沙姆P188、细胞/葡聚糖或细胞/生理盐水的1mL组合物植入6周后的再吸收情况。
图5.细胞/泊洛沙姆P188、细胞/葡聚糖或细胞/生理盐水的0.6mL组合物植入6周后的再吸收情况。
图6.经生理盐水与经P188处理过的脂肪移植物(1.0cc，1.0g)的第6天共聚焦显微镜检术图像的比较。使用免疫化学FLIVO-红聚卡斯帕酶活化的细胞凋亡特异性染料标记细胞。所示生理盐水处理对照组(上图)显示大量标为红色的凋亡小泡。相反，第6天经P188处理过的样品显示相对较少量的标为红色的凋亡液泡(绿色细胞质是正常自体荧光的结果)。
图7.早期移入期间的细胞凋亡事件。在早期移入期间脂肪移植物中的细胞凋亡水平。当与生理盐水处理对照组相比较时，P188第6天显示细胞凋亡事件的统计学显著降低。
图8.与P188相比较，利用各种试剂进行围移植(peri-transplant)期间细胞凋亡事件增加。将各种聚合物和添加剂与P188相比较。上述系列显示四个为期10天的独立实验，其中各试剂的表现都不如P188。在早期移入期间增加细胞凋亡的试剂对脂肪细胞有毒，并且不适于移植增强。(注意：PEG 8000、T1107实验(左下图)使用MitoPT细胞凋亡标记，而其它实验使用普洛麦格公司(Promega)的Apo-One细胞凋亡分析法。Apo-One细胞凋亡分析法产生的信号平均起来是Mito-Pt信号的10倍，以致Mito-Pt信号不如这种分析方法的亮。这一结果只是分析法差异，并不代表细胞凋亡量值的差异。)
图9.硫辛酸在减少早期细胞凋亡方面具有附加作用。当与生理盐水处理对照组相比较时，经硫辛酸处理过的脂肪移植物在移入期间显示较少的细胞凋亡。细胞凋亡方面的这些改善使得为期6周的长期移植物性能得到改善。
图10.重量与处理和植入后时间的关系。在植入后的前10天期间，每日称取脂肪移植物的重量。第1天后，移植物脱去约25％的水，所有组的重量在无血管期间保持稳定；尽管在相同时间段期间细胞凋亡活性存在显著差异。误差棒表示标准偏差，早期的标准偏差为约0.05g；在研究过程中，重量的总标准偏差为约0.10g。葡聚糖用作早期对照物，因为其分子量类似于P188和PEG8000。证实与葡聚糖不存在差异后，在进一步实验中，将生理盐水用作唯一的对照组。
图11.累积的六周重量(P188对生理盐水)。当与生理盐水处理对照组相比较时，经P188处理过的脂肪移植物的重量显示统计学显著的增加。
图12.6周时以重量计的再吸收情况。在6周时观察到，当与生理盐水处理对照组相比较时，用P188处理脂肪移植物导致移植物再吸收减少50％。
图13.6周时P188与各种聚合物的再吸收情况的比较。进行P188与多种不同尺寸普流尼克以及各种尺寸PEG和PEG混合物的比较测量。以重量计，P188是表现最好的聚合物，尽管仅以重量计，P188与某些其它普流尼克(Pluronics)之间的差异较小。这些小叶的组织学试样显示，一些样品出现严重炎性浸润，而在其它样品中出现严重纤维化。因此，仅仅重量不能作为脂肪移植物性能改善的清楚指示。
图14.处理和植入(1.0cc/1.0g)后6周使用各种聚合物的活细胞信号。利用Cell-TiterBlue活力分析法，在6周时，与其它普流尼克相比较，P188显示出优良的活细胞信号。F127和L64显示与生理盐水相当或高于生理盐水的活力水平，但未达到统计学显著程度。
图15.植入和处理后2个月的活细胞信号。在处理和植入后2个月后，当与各种尺寸和组合的PEG相比较时，P188显示出优良的细胞活力。应注意，当与生理盐水处理对照组相比较时，PEG显示较低的细胞活力水平。
图16.植入和处理(1.0cc/1.0g)后6周的DNA含量。测量并比较6周时的DNA含量。高DNA含量与细胞计数较高和脂肪细胞较多有关。当与其它普流尼克相比较时，P188在6周时显示最高的DNA水平。尽管在6周时观察到某些重量略有差异，但就DNA含量来说，P188胜过测试的所有其它聚合物。
图17.生理盐水处理对照组和经P188处理过的脂肪移植物的6周组织学。
图18.生理盐水对照组、P188和其它普流尼克在6周时的组织学评分。4名检查人在不知情的情况下针对样品中正常脂肪、炎性浸润和纤维化的存在进行评分。左图为P188与生理盐水对照组的比较。图中显示出正常脂肪含量的统计学显著增加以及纤维化减少。当与其它聚合物相比较时，L64和F127得到类似分数，但不存在统计学显著的差异，且其余聚合物显示的结果为从优于生理盐水的某些改善到出现明显毒性。
图19.处理后6周的再吸收百分比(以重量计)。
具体实施方式
定义
本文中使用的“脂肪组织”是指由脂肪细胞构成的组织。脂肪组织通常是由脂肪细胞构成的松散的结缔组织。其在体内的主要作用是以脂肪形式存储能量；但是，脂肪组织也隔离和保护身体，并充当内分泌器官。脂肪组织可以是白色脂肪组织或褐色脂肪组织。术语“脂肪组织(adipose tissue)”可与“脂肪组织(fat tissue)”互换使用。
本文中使用的“消炎剂”是指抑制炎症的一种或一种以上病征或症状的任何物质。
除非另作规定，或另外从上下文中显而易见，否则关于数字的术语“约”一般包括在所述数字的任一方向(大于或小于所述数字)的5％范围内的数字(所述数字将超过可能值的100％的情形除外)。
“生物可相容”是指某种物质按所用量在所用位置对接受者的细胞实质上无毒，并且也不会在接受者身体上的所用位置引发或引起明显有害或不利的影响，例如不可接受的免疫或发炎反应、形成不可接受的疤痕组织等。
“生物可降解”意思指物质能够例如通过在生理条件下水解，和/或通过天然生物过程(例如细胞内或体内存在的酶作用)，和/或通过例如溶解、分散等过程，在细胞内或在个体体内以物理和/或化学方式分解，从而形成通常可被身体代谢且任选使用和/或排泄或以其它方式处置的较小化学物质。为本发明起见，分子量在体内因单体数量减少而随时间降低的聚合物或水凝胶可视为生物可降解的。
术语“聚核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”是指核苷酸聚合物。术语“聚核苷酸”、“核酸”与“寡核苷酸”可互换使用。通常，聚核苷酸包含至少两个核苷酸。DNA和RNA都是聚核苷酸。聚合物可包括：天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)、插入的碱基、经修饰的糖(例如2′-氟核糖、2′-甲氧基核糖、2′-氨基核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己醣)；，或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5′-N氨基磷酸酯键)。也可使用天然或经修饰核苷的对映异构体。核酸还包括基于核酸的治疗剂，例如核酸配体、siRNA、短发夹RNA、反义寡核苷酸、核糖酶、适体和SPIEGELMERSTM，沃特扎卡(Wlotzka)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，2002，99(13)：8898(其完整内容以引用的方式并入本文中)中所述的寡核苷酸配体。
“多肽”、“肽”或“蛋白质”包含至少三个氨基酸通过肽键连接在一起形成的链。术语“多肽”、“肽”与“蛋白质”可互换使用。肽可以指个别肽或肽集合。本发明的肽优选只含有天然氨基酸，但另外可使用此项技术中已知的非天然氨基酸(即，自然界中不存在但可并入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物。另外，可例如通过添加化学实体，例如碳水化合物基团、磷酸酯基、法呢基(farnesyl group)、异法呢基、脂肪酸基团、供连结、官能化或其它修饰的连接基团等，来修饰肽中的一个或一个以上氨基酸。在一个实施例中，修饰肽将产生更为稳定的肽(例如，更长的体内半衰期)。这些修饰可包括肽环化、并入D-氨基酸或其它修饰。所述修饰都不应实质上干扰肽的所需生物活性。
术语“多糖”与“碳水化合物”可互换使用。大部分的碳水化合物是具有许多羟基(常常在分子的每一碳原子上具有一个羟基)的醛类或酮类。碳水化合物的分子式一般为CnH2nOn。碳水化合物可为单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。最基本的碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是连接在一起的两个单糖。示范性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，寡糖包括介于3与6个之间的单糖单元(例如棉子糖、水苏糖)，且多糖包括6个或6个以上单糖单元。示范性多糖包括淀粉、糖原和纤维素。碳水化合物可含有经修饰的糖单元，例如去除了羟基的2′-脱氧核糖、羟基经氟置换的2′-氟核糖，或N-乙酰基葡糖胺，即含氮的葡萄糖形式。(例如，2′-氟核糖、脱氧核糖和己糖)。碳水化合物可以许多不同形式存在，例如构象体、环状形式、无环形式、立体异构体、互变异构体、异头物和异构体。
“小分子”是指天然存在或人工创造(例如，经由化学合成)的有机化合物，其具有相对较低的分子量且不为蛋白质、多肽或核酸。小分子通常不是具有重复单元的聚合物。在某些实施例中，小分子的分子量小于约1500g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量小于约1000g/mol。小分子通常还具有多个碳-碳键，并且可具有多个立体中心和官能团。
本文中使用的“个体(subject)”是指欲传递药剂例如以达到实验、诊断和/或治疗目的的个体(individual)。优选个体为哺乳动物，尤其家养哺乳动物(例如狗、猫等)、灵长类动物或人类。在某些实施例中，个体为人类。在某些实施例中，个体是实验动物，例如小鼠或大鼠。处于医师或其它健康护理人员护理下的个体可称为“患者”。
“医药剂”，也称为“药物”，在本文中用于指投予个体以治疗疾病、病症或其它临床上公认的对个体有害的病状，或用于预防目的的药剂，并且其对身体疾病、病症或病状的治疗或预防具有临床上显著的作用。治疗剂包括(但不限于)以下文献中所列的药剂：美国药典(United States Pharmacopeia，USP)、古德曼(Goodman)和吉尔曼(Gilman)治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第10版，(麦克劳希尔出版社(McGraw Hill))，2001；卡卓恩B.(Katzung，B.)(编)基础与临床药理学(Basicand Clinical Pharmacology)，麦克劳希尔/阿普尔顿和兰格(Appleton & Lange)出版社；第8版(2000年9月21日)；医师桌上手册(Physician′s Desk Reference)(汤姆逊出版公司(Thomson Publishing))，和/或默克诊疗手册(The Merck Manual of Diagnosis andTherapy)，第17版(1999)或其后出版的第18版(2006)，马克H.比尔(Mark H.Beers)和罗伯特·贝尔考(Robert Berkow)(编)，默克出版集团(Merck Publishing Group)，或在动物的情况下，默克兽医手册(The Merck Veterinary Manual)，第9版，卡恩C.A.(Kahn，C.A.)(编)，默克出版集团(Merck Publishing Group)，2005。
本发明特定实施例的具体描述
本发明认识到，在美容和重建手术中，通过添加使移植物中的细胞膜稳定的聚合物，可改善脂肪组织或脂肪细胞的移植。不希望受特定理论的束缚，认为聚合物与细胞膜相互作用，并密封或防止膜缺损，由此防止细胞损伤(例如离子渗漏)或使之减到最少。防止细胞损伤将降低移植物中细胞凋亡和细胞死亡的程度，并有助于改善软组织修复、重建或填充过程中脂肪移植的成功率和一致性。本发明提供用于改善个体(例如人类)脂肪移植的聚合物、组合物、方法和试剂盒。
聚合物
本发明是基于发现某些聚合物可使脂肪移植物中的细胞或来源于脂肪组织的细胞(例如干细胞、基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞)的细胞膜稳定。将足够浓度的聚合物与细胞混合，可使细胞膜稳定，并保护细胞膜免受损伤和/或密封已经受损的膜。这些聚合物可与其它改善脂肪移植成功率的方法结合使用，包括例如改善移植物供血，或添加有助于防止欲移植的细胞损伤的其它试剂(例如硫辛酸)。
与细胞膜相互作用并使细胞膜稳定的任何聚合物都可添加到脂肪移植所用细胞中；然而，人们发现，具有疏水性中央部分侧接两个亲水性尾的三嵌段共聚物特别适用于改善脂肪移植物。在某些实施例中，聚合物是合成聚合物(即，非自然界产生的聚合物)。在其它实施例中，聚合物是天然聚合物(例如蛋白质、多糖、橡胶)。在某些实施例中，聚合物是表面活性聚合物。在某些实施例中，聚合物是非离子性聚合物。在某些实施例中，聚合物是非离子性嵌段共聚物。
在某些实施例中，聚合物包括聚醚部分。在某些实施例中，聚合物包括聚烷基醚部分。在某些实施例中，聚合物包括聚乙二醇尾。在某些实施例中，聚合物包括聚丙二醇中央部分。在某些实施例中，聚合物包括聚丁二醇作为中央部分。在某些实施例中，聚合物包括聚戊二醇作为中央部分。在某些实施例中，聚合物包括聚己二醇作为中央部分。在某些实施例中，聚合物是由本文中所述的一种聚合物构成的三嵌段共聚物。
在某些实施例中，聚合物是由聚烷基醚(例如聚乙二醇、聚丙二醇)与另一聚合物构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是由聚烷基醚与另一聚烷基醚构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是由聚乙二醇与另一聚烷基醚构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是由聚丙二醇与另一聚烷基醚构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是具有至少一个聚烷基醚单元的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是由两个不同的聚烷基醚构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是包括聚乙二醇单元的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是包括聚丙二醇单元的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物是由一个疏水性较强的单元侧接两个亲水性较强的单元构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，亲水性单元是相同类型的聚合物。在某些实施例中，聚合物包括一个聚丙二醇单元侧接两个亲水性较强的单元。在某些实施例中，聚合物包括两个聚乙二醇单元侧接疏水性较强的单元。在某些实施例中，聚合物是一个聚丙二醇单元侧接两个聚乙二醇单元构成的三嵌段共聚物。在某些实施例中，聚合物具有下式：
其中n是介于包括2与包括200之间的整数，且m是介于包括2与包括200之间的整数。在某些实施例中，n为介于包括10与包括100之间的整数。在某些实施例中，n为介于包括5与包括50之间的整数。在某些实施例中，n是m的约2倍。在某些实施例中，n为约70，且m为约35。在某些实施例中，n为约50，且m为约30。在某些实施例中，聚合物是泊洛沙姆P188，其为巴斯夫公司(BASF)以商品名PLURONICF68销售的产品。其它适用于本发明中的PLURONIC聚合物包括(但不限于)PLURONICF108、PLURONICF127、PLURONICF38、PLURONICF68、PLURONICF77、PLURONICF87、PLURONICF88、PLURONICF98、PLURONICL10、PLURONICLI01、PLURONICL121、PLURONICL31、PLURONICL35、PLURONICL43、PLURONICL44、PLURONICL61、PLURONICL62、PLURONICL64、PLURONICL81、PLURONICL92、PLURONICN3、PLURONICP103、PLURONICP104、PLURONICP105、PLURONICP123、PLURONICP65、PLURONICP84和PLURONICP85。泊洛沙姆一般是通过首先环氧丙烷且接着环氧乙烷连续添加到丙二醇中而合成。
如下文的实例部分中所述，三嵌段聚合物能够自身插入到损伤的脂肪细胞膜中，使膜稳定(参看图2)。此外，已知这些聚合物因具有高度水合的聚乙二醇尾，而能够降低膜粘度。细胞粘度降低将使损伤的细胞变得更易溶解，由此降低损伤膜上的张力。具体点说，经显示，市售三嵌段共聚物P188对于修复受损的细胞膜以及改善受损脂肪细胞的活力和存活率特别有效。下文的实例中将从组织学、脂肪移植物随时间的重量变化、细胞凋亡事件、细胞活力和原始DNA含量方面描述P188用于拯救围移植期(从采集到稳定移入的时间)中受损的脂肪细胞的功效。经显示，P188比测试的任何其它聚合物都更有效，即使具有相同嵌段次序的较小和较大三嵌段共聚物表现也没这么好。二嵌段和四嵌段共聚物甚至对移植物有毒。
经显示，P188在脂肪组织中具有弱溶解性，并且其不会被充分吸附到未受损的完整细胞膜上。P188使经受采集过程引起的机械切变(mechanical sheer)损伤的脂肪细胞保持其正常的膜力学。一旦这些细胞能够通过增加双层中磷脂的量来修复其细胞膜，P188就会被机械挤出[艾格瓦J.(Agarwal，J.)，A.瓦尔希(A.Walsh)和R.C.李(R.C.Lee)，使受损细胞复苏的多模式策略(Multimodal strategies for resuscitating injured cells).纽约科学院年报(Ann N Y Acad Sci)，2005.1066：295-309；以引用的方式并入本文中]。通过增加跨膜表面压力，可挤出P188。一旦从移植的细胞中挤出，P188就会基本上不变地被肾排出，其中少量是经由胆肠系统排出[辛格-乔伊S.D.(Singh-Joy，S.D.)和V.C麦克莱恩(V.C.McLain)，泊洛沙姆101、105、108、122、123、124、181、182、183、184、185、188、212、215、217、231、234、235、237、238、282、284、288、331、333、334、335、338、401、402、403和407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯当用于美容中时的安全性评估(Safety assessment of poloxamers 101，105，108，122，123，124，181，182，183，184，185，188，212，215，217，231，234，235，237，238，282，284，288，331，333，334，335，338，401，402，403，and 407，poloxamer 105 benzoate，andpoloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics).国际毒理学杂志(Int J Toxicol)，2008.27增刊2：93-128；以引用的方式并入本文中]。没有证据证明使用适用于脂肪移植的浓度的P188会引起不良作用或安全性问题。
本发明所用聚合物的分子量可在约500g/mol到多达约50,000g/mol的范围内。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约1,000g/mol到约30,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约2,000g/mol到约15,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约2,000g/mol到约12,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约1,000g/mol到约5,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约5,000g/mol到约10,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约7,500g/mol到约10,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约10,000g/mol到约15,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量范围为约15,000g/mol到约20,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的分子量为约20,000g/mol到约25,000g/mol。在某些实施例中，聚合物的平均分子量为约5,000g/mol、约5,500g/mol、约6,000g/mol、6,500g/mol、7,000g/mol、约7,500g/mol、约8,000g/mol、约8,500g/mol、约9,000g/mol、约9,500g/mol或约10,000g/mol。在某些实施例中，P188的平均分子量为约8,400g/mol。此项技术中已知其它市售泊洛沙姆的平均分子量。
本发明中所用聚合物组合物通常为用于人类和/或其它动物的医药级物质。在某些实施例中，聚合物被批准用于人类和兽医应用。在一些实施例中，聚合物获美国食品和药品管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些实施例中，聚合物为医药级物质。在一些实施例中，聚合物满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。在某些实施例中，聚合物为至少90％纯。在某些实施例中，聚合物为至少95％纯。在某些实施例中，聚合物为至少98％纯。在某些实施例中，聚合物为至少99％纯。在某些实施例中，聚合物为至少99.5％纯。在某些实施例中，聚合物为至少99.9％纯。在某些实施例中，聚合物为至少99.99％纯。在某些实施例中，聚合物不含有毒或非生物相容性物质。
适用于本发明中的聚合物通常在体内降解成无毒降解产物，或被身体安全排出。聚合物优选为生物可相容的，并且不会导致任何实质性的不必要副作用。聚合物的体内半衰期可在约1天到约1个月的范围内。在某些实施例中，聚合物的体内半衰期在约1天到约1周的范围内。在某些实施例中，聚合物的体内半衰期在约1周到约2周的范围内。在某些实施例中，聚合物的体内半衰期在约3周到约4周的范围内。
可通过将测试化合物与欲移植的脂肪细胞混合，并将所得组合物移植到小鼠或其它啮齿动物体内，测定随时间变化脂肪植入物的成功率，以此测试用于脂肪移植中的聚合物(如下文实例中所述)。脂肪植入物可借助各种生物化学和病理学测量法评估，例如植入物的重量、植入物的体积、组织学、评估细胞凋亡和/或细胞死亡的标记物、测量活细胞数量、评估线粒体ATP水平、评估DNA水平，或进行实时PCR以测定瘦素(leptin)、PPARγ2或其它标记物的水平。在某些实施例中，测试是在裸小鼠体内进行。也可通过将细胞与测试聚合物混合，并分析细胞的细胞凋亡或细胞死亡标记物、分析细胞毒性等，在体外筛选聚合物。在某些实施例中，将使用测试聚合物得到的结果与由对照组得到的结果相比较。在某些实施例中，对照聚合物是P188。在某些实施例中，对照聚合物是葡聚糖。在某些实施例中，对照脂肪移植物经生理盐水处理。
聚合物可与其它生物活性剂和/或医药学上可接受的赋形剂组合，以形成适用于添加到欲移植细胞中的组合物。这些生物活性剂也可用于防止脂肪移植物中的细胞死亡。所用赋形剂应有助于将聚合物与欲移植的细胞混合，或有助于处理和存储所得聚合物/细胞组合物。
可与聚合物一起添加到欲移植的细胞中的生物活性剂包括(但不限于)抗氧化剂、维生素、膜稳定剂、矿物质、渗透保护剂、辅酶、增粘剂、激素和生长因子。多种机制牵涉到移植细胞的细胞死亡，例如，膜破坏和自由基形成。抗氧化剂可用于脂肪移植中以减少自由基形成。抗氧化剂可清除自由基，并防止由活性氧物质引起的损伤。在某些实施例中，聚合物/细胞组合物进一步包含抗氧化剂。据悉，聚合物和抗氧化剂可改善细胞的防护，并由此改善脂肪移植的结果。抗氧化剂可以是酶促或非酶促抗氧化剂。酶促抗氧化剂包括例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和催化酶。示范性非酶促抗氧化剂包括α-生育酚(维生素E)、维生素A、谷胱甘肽、类胡萝卜素(例如番茄红素、叶黄素、多酚类、β-胡罗卜素)、类黄酮、黄酮、黄酮醇、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、硫辛酸、泛醇(ubiquinal)(辅酶Q)、泛醌(辅酶Q10)、褪黑激素、番茄红素、丁基化苯甲醚、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、苯甲酸酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、花青素原(proanthocyanidin)、甘露醇和乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)。在某些实施例中，抗氧化剂是金属抗氧化剂。在某些实施例中，抗氧化剂是硒。在某些实施例中，抗氧化剂是锌。在某些实施例中，抗氧化剂是铜。在某些实施例中，抗氧化剂是锗。
在某些实施例中，聚合物/细胞组合物进一步包含维生素。维生素可以是一种抗氧化剂。在某些实施例中，维生素是α-生育酚(维生素E)。在某些实施例中，维生素是辅酶Q10。在某些实施例中，维生素是β-胡罗卜素。可添加到本发明聚合物/细胞组合物中的其它维生素包括维生素A、维生素B1(硫胺)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、维生素B4(腺嘌呤)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰钴胺)、维生素D(钙化醇)和维生素K。
在某些实施例中，聚合物/细胞组合物进一步包含激素或生长因子。在某些实施例中，激素或生长因子是胰岛素、格列酮类(glitazones)、胆固醇、VEGF、FGF、EGF、PDGF等。在某些实施例中，聚合物/细胞组合物进一步包含有机酸(例如硫辛酸)。在某些实施例中，聚合物/细胞组合物进一步包含含硫醇或含二硫化物的分子(例如硫辛酸、谷胱甘肽)。在某些实施例中，聚合物/细胞组合物进一步包含有机小分子(例如花青素、辣椒素)。
在某些实施例中，脂肪细胞与P188和谷胱甘肽组合移植到个体体内。在某些实施例中，脂肪细胞与P188和硫辛酸组合移植到个体体内。在某些实施例中，脂肪细胞与P188和维生素E组合移植到个体体内。
本文中所述聚合物的调配物可借助医药学领域中已知或此后开发的任何方法制备。一般说来，所述制备方法包括以下步骤：使聚合物与一种或一种以上赋形剂和/或一种或一种以上其它生物活性剂缔合。本发明组合物中聚合物、医药学上可接受的赋形剂和/或任何其它试剂的相对量可视聚合物身份、聚合物尺寸、植入部位和/或个体而变化。举个例子，打算与欲移植的细胞混合的组合物可包含介于1％与99％(重量比)之间的聚合物。
聚合物的调配物可包含医药学上可接受的赋形剂，如本文中所用，所述赋形剂包括适于所需特定调配物的任一种和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。雷氏药学大全(Remington′s The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.吉纳罗(A.R.Gennaro)，(利平科特·威廉斯&威尔金斯工作室(Lippincott，Williams & Wilkins)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)，2006；以引用的方式并入本文中)中揭露了用于调配医药组合物的各种赋形剂以及其已知的制备技术。除非任何常规赋形剂与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不合需要的生物学作用或者另外以有害的方式与医药组合物中的任何其它组分相互作用，否则赋形剂的使用都涵盖在本发明的范围内。
在一些实施例中，医药学上可接受的赋形剂为至少95％、96％、97％、98％、99％或100％纯。在一些实施例中，赋形剂被批准用于人类和兽医应用。在一些实施例中，赋形剂获美国食品和药品管理局批准。在一些实施例中，赋形剂为医药级。在一些实施例中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制造聚合物组合物的医药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。所述赋形剂可任选包括在本发明的调配物中。根据配方设计师的判断，组合物中可存在例如着色剂等赋形剂。
示范性稀释剂包括(但不限于)碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和其组合。
示范性分散剂包括(但不限于)马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵(naturalsponge)、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯吡咯烷酮)(交联聚维酮(crospovidone))、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(维格姆(Veegum))、月桂基硫酸钠、季铵化合物等，和其组合。
示范性防腐剂可包括抗氧化剂、螯合剂、杀菌防腐剂、杀真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其它防腐剂。示范性抗氧化剂包括(但不限于)α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠。示范性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、单水合柠檬酸、依地酸二钠(disodium edetate)、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。示范性杀菌防腐剂包括(但不限于)苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯胺(benzethonium chloride)、苯甲醇、布罗泊尔(bronopol)、西曲溴铵(cetrimide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪唑烷脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和硫柳汞(thimerosal)。示范性杀真菌防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和山梨酸。示范性醇防腐剂包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚系化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和苯乙醇。示范性酸性防腐剂包括(但不限于)维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和植酸。其它防腐剂包括(但不限于)生育醇、生育醇乙酸酯、甲磺酸迪特奥希姆(deteroxime mesylate)、西曲溴铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(sodium lauryl sulfate，SLS)、月桂基乙醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate，SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、Glydant Plus、Phenonip、对羟基苯甲酸甲酯、杰马115(Germall 115)、极美II(Germaben II)、NeoloneTM、KathonTM和Euxyl。在某些实施例中，防腐剂为一种抗氧化剂。在其它实施例中，防腐剂是一种螯合剂。
示范性缓冲剂包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、碱式磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗生理盐水、林格氏溶液、乙醇等，和/或其组合。
除与欲移植的细胞组合外，本发明聚合物还可与一种或一种以上生物活性剂组合。在某些实施例中，聚合物与抗氧化剂组合。在某些实施例中，聚合物与维生素组合。在某些实施例中，聚合物与脂质组合。在某些实施例中，聚合物与膜稳定剂组合。在某些实施例中，聚合物与医药剂组合。在某些实施例中，聚合物与消炎剂组合。在某些实施例中，聚合物与抗生素组合。在某些实施例中，聚合物与蛋白质或肽组合。在某些实施例中，聚合物与激素组合。在某些实施例中，聚合物与生长因子组合。在某些实施例中，聚合物与碳水化合物组合。在某些实施例中，聚合物与液体赋形剂组合以投予聚合物/细胞组合物。在某些实施例中，赋形剂是一种水溶液。在某些实施例中，赋形剂是一种缓冲水溶液。在某些实施例中，赋形剂是磷酸盐缓冲生理盐水溶液。在某些实施例中，赋形剂与细胞外流体等渗。
用途
本发明提供在移植前使聚合物或聚合物组合物与欲移植的细胞缔合的方法。本发明系统特别适用于改善脂肪移植的成功率，或改善脂肪组织或来源于脂肪组织的细胞的移植成功率。将欲移植的细胞与足够浓度的聚合物混合，以在移植期间使细胞膜稳定并防止细胞损伤。普遍认为，聚合物通过与细胞膜缔合，来固定细胞膜或防止细胞膜损伤。细胞或细胞组合物在移植到个体体内之前，与聚合物或包含聚合物的组合物混合。聚合物可在取得细胞时、存储或处理细胞期间或者在细胞即将植入个体体内之前与细胞混合。
聚合物可与欲移植的组织或细胞在取得、处理、加工或植入移植物期间的任意时间混合。在某些实施例中，在从供体部位采集细胞或组织之前，在打算获取细胞或组织的部位注射聚合物组合物。举例来说，在脂肪采集期间，可将聚合物包括在肿胀性注射液(tumescent injection solution)(即，在抽脂前注射到供体部位的流体)中。在某些实施例中，在采集到打算移植的细胞或组织后，使其立即与聚合物接触，以保护其免受损伤。举例来说，在从供体采集脂肪组织(例如通过抽脂或通过针抽吸)后，可使其立即与聚合物接触。在某些实施例中，聚合物是包括在抽脂收集容器中。在某些实施例中，从接受欲移植细胞的同一人采集打算移植的细胞(即，自体捐赠)。在某些实施例中，从供体的胃部、大腿或臀部采集细胞。在某些实施例中，将脂肪组织采集到已经包括了聚合物或聚合物组合物的注射器或其它容器中。在其它实施例中，采集脂肪组织，并立即添加到聚合物组合物中，或将聚合物组合物添加到脂肪组织中。在植入个体前，所得聚合物/细胞组合物可经进一步加工。举例来说，在植入个体之前，可对细胞进行洗涤、纯化、萃取或其它方式的处理。在某些实施例中，在供移植细胞的整个加工过程中，使细胞或组织与过量聚合物保持接触。在某些实施例中，例如通过离心，从欲移植的组织或细胞去除过量的聚合物或聚合物溶液。在某些实施例中，在移植前，洗掉移植物中的聚合物。
在某些实施例中，在即将移植前，使欲移植的细胞与聚合物接触。举例来说，可在即将植入个体之前，在手术室或诊所中将细胞与聚合物混合。将无菌聚合物或其组合物与欲移植的细胞混合。
与细胞混合的聚合物的浓度通常在每毫升细胞约1到20mg聚合物的范围内。所属领域技术人员应理解，使欲移植细胞的细胞膜足够稳定所需的聚合物浓度可视所用聚合物、个体、植入部位等而变化。在某些实施例中，浓度在每毫升细胞约1到10mg聚合物的范围内。在某些实施例中，浓度在每毫升细胞约1到5mg聚合物的范围内。在某些实施例中，浓度在每毫升细胞约5到10mg聚合物的范围内。在某些实施例中，浓度在每毫升细胞约10到15mg聚合物的范围内。在某些实施例中，浓度在每毫升细胞约15到20mg聚合物的范围内。在某些实施例中，浓度为每毫升细胞约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg聚合物。在某些实施例中，当使用泊洛沙姆P188时，浓度为每毫升细胞约10mg聚合物。
在细胞与聚合物接触后，将细胞/聚合物组合物投予或植入个体中。在某些实施例中，在采集后0.5到6小时内，将细胞移植入接受者体内。在某些实施例中，个体为人类。在某些实施例中，个体为哺乳动物。在某些实施例中，个体是测试动物，例如小鼠、大鼠、兔或狗。通常将细胞/聚合物组合物投予需要脂肪移植的患者。个体可经历重建或美容手术。在某些实施例中，在除皱过程中，使用脂肪移植。在某些实施例中，在软组织置换或填充过程中，使用脂肪移植。在某些实施例中，在唇、脸颊、乳房、面部、臀部、小腿、胸和阴茎填充中使用脂肪移植。通常，将自体脂肪细胞移植回供体与获取细胞处不同的部位。细胞或组织可以使用任何方法或技术(例如注射、手术植入)植入或投予。
除脂肪细胞外，已发现脂肪组织也是干细胞的来源(基姆博(Gimble)等人，“用于再生医学的脂肪源性干细胞(Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine)”，循环研究(Circulation Research)100：1249-1260，2007；以引用的方式并入本文中)。因此，本发明系统可用于使来源于脂肪组织的干细胞或其它细胞稳定并防止这些细胞受损。在某些实施例中，本发明系统可用于移植成体干细胞。在某些实施例中，本发明系统可用于移植成纤维细胞。脂肪组织中发现的其它细胞包括(但不限于)基质细胞、平滑肌细胞、血细胞(例如巨噬细胞)、上皮细胞和内皮细胞。本发明提供任何所述细胞的移植。
试剂盒
本发明还提供包装或试剂盒，其在容器中包含一种或一种以上本文中所述的聚合物或聚合物组份。举例来说，容器可包括备用于脂肪移植的聚合物或聚合物组合物。包装还可包括与容器联合的通知，其通常呈管理医疗装置和/或医药品制造、使用或销售的政府机构规定的形式，因此，所述通知将反映政府机构批准组合物用于人类或兽医投药进行组织移植。还可包括有关聚合物使用的说明。所述说明可包括有关投予患者聚合物或聚合物/细胞组合物的信息。具体点说，这些说明可包括关于使聚合物与细胞或组织接触以及投予患者细胞/聚合物组合物的信息。所述包装还可包括一个或一个以上容器，这些容器含有在投予前包括在聚合物/细胞组合物中的生物活性剂。
包装可包括供制备聚合物/细胞组合物的装置或贮藏器(receptacle)。所述装置可例如为测量或混合装置。
包装也可任选包括用于投予本发明聚合物/细胞组合物的装置。示范性装置包括专用注射器、针和与多种喉镜设计相配的导管。
试剂盒中各组件可提供于相对紧密封闭的单一较大容器(例如塑料或泡沫聚苯乙烯(styrofoam)盒)中。通常，试剂盒宜经包装以供专业保健人员使用。在某些实施例中，试剂盒中各组件经无菌包装以用于无菌环境中，例如手术室或医师的诊所。
实例
实例1：在脂肪移植过程中通过用泊洛沙姆P188处理增强脂肪保护和增加存活率
引言.自体脂肪移植是软组织重建中的基本工具。然而，受损细胞和凋亡细胞最终被体内所吸收，并且使软组织修复产生不一致且不合需要的结果。泊洛沙姆P188是一种与受损的细胞膜相互作用并将自身插入脂质单层中的试剂。这种非离子性表面活性剂可有效密封受损细胞的膜，并且经显示，其可提供针对损伤和细胞凋亡的防护。泊洛沙姆与脂质膜相互作用的能力使人们得出一个假说，即，通过密封脂肪细胞在脂肪采集期间损伤的部分，可以修复受损细胞和保护受损细胞的结构完整性，并由此改善细胞存活率。本实例将研究P188有效恢复和保护受损组织、改善细胞存活率并改善移植结果的能力。
方法.从手术室抽脂吸出物中获得脂肪，并在采集的1小时内移植到裸小鼠体内。将0.6mL体积的脂肪经皮下放入每只小鼠的右侧背部。研究包括三个小组：(1)用浓度为10mg/mL P188处理过的脂肪；(2)用浓度为10mg/mL的葡聚糖处理脂肪；和(3)用生理盐水处理脂肪。在6周时间后，对小鼠实行安乐死，并采集脂肪植入物。使用重量、体积、活/死亡分析、线粒体ATP水平和针对瘦素和PPARγ2水平的实时PCR评价植入之前和之后的脂肪植入物。
结果.6周时间后，移植的脂肪在每只动物体内长成划分清晰边界的结节。根据重量和体积，生理盐水对照组展现多达30％的吸收。葡聚糖处理过的脂肪移植物展现类似的吸收率。用P188处理过的脂肪移植物显示吸收下降67％。参看图5。这是统计学显著的降低(p＜0.001)。在分子水平和组织学方面也观察到差异，其中脂肪细胞比例明显增加，且空泡面积或纤维化形成减少。
结论.在本实例中，使用裸小鼠移植模型研究人类脂肪移植物的功效和存活率。泊洛沙姆P188，一种非离子性表面活性剂，使脂肪移植物吸收明显减少并且改善细胞存活率。相比之下，用葡聚糖(一种分子量相当的对照物)处理得到与生理盐水类似的结果。使用P188可修复和保护脂肪移植物，改善细胞存活率并减少脂肪移植物吸收。
实例2：在脂肪移植中P188与其它试剂的比较
引言
外伤、先天性缺陷、感染和肿瘤切除继发的软组织损伤和畸形是造成患者显著发病的原因。目前，自体游离皮瓣重建或局部推进皮瓣是重大软组织和骨缺损重建模态的主要工具。尽管带蒂皮瓣和游离皮瓣重建提供了进行重建的有力工具，但其有可能引起严重副作用和供体部位发病。转移大量自体脂肪组织重建这些缺损的能力将为约数百万患者提供一个新颖的重建选择，同时不会伴随供体部位发病。此外，还为供体部位选择较少的患者以及不能耐受进行皮瓣重建所需的长时间手术的患者提供一个有利工具。
使用抽脂的脂肪具有两个优点：1)最少的供体部位发病，由此提供一个安全且易于获得的自体细胞来源；和2)这些程序相对易于进行，同时不会出现缺血并发症以及与血管化游离皮瓣有关的早期移植失败的问题。然而，到目前为止，游离脂肪移植物受到不可预测的再吸收水平和由此引起的不规则性问题的困扰。游离脂肪移植失败和体积减小似乎与采集时产生的机械应力、早期缺血性改变以及营养缺失有关。这些应激子导致细胞凋亡。接下来，在再血管化后去除死亡细胞的碎片将引起移植物再吸收。
迄今为止，有关在建立充足的血管分布之前减少初始缺血损伤和保护细胞的尝试已经取得了适度的成果。再吸收是长期脂肪移植物存活和较大软组织创口重建工作的主要障碍。为此，人们已经深入研究了包括聚合物在内的膜稳定剂。在实验室中已经显示，这些聚合物中有一些可以减少凋亡细胞的死亡，由此随时间产生大量脂肪移植物。这些聚合物的混合物可提供一个细胞复苏方案，这一方案将产生可预测且持久的游离脂肪移植。
P188是一种三嵌段聚合物，其中央聚氧丙烯疏水区(POP单元，参看图1A)跨接两个较长的聚氧乙烯亲水性尾(POE单元，参看图1B)。相信机械外伤和缺血性应力会导致正常脂肪细胞的细胞膜破裂。这一破裂首先表现为孔隙度增加，并且使正常膜离子梯度丧失。已知膜电性完整性的丧失是细胞凋亡级联的有效活化因素。接着细胞经历程序性细胞死亡，并以脂质液滴集合的形式保留在移植物中，随后被再吸收，导致移植物体积减小。因此，P188能够插入受损的脂肪细胞膜中，从而使膜稳定(参看图2)。此外，已知P188因具有高度水合的POE尾，而能够降低膜粘度。所述POE尾通过降低细胞粘度而使受损细胞变得更易溶解，由此降低受损膜上的张力。
已经证实，泊洛沙姆P188在修复受损的膜以及改善受损脂肪细胞的活力和存活率方面特别有效。这一修复机制的可能构造在图2中予以说明。受损细胞膜的一部分中央脂质层可能暴露于周围环境。附近P188链的中央疏水性部分可与这一疏水性脂质层相互作用，并且P188链可“折叠”，从而使这条链的亲水端沿细胞膜的外部亲水性表面定位。这一密封/修复过程类似于常见的汽车轮胎胶塞修补，在轮胎修补过程中，将柔性橡胶塞的中央塞入轮胎的小孔中以使其密封，而橡胶塞的末端沿外胎面定位。多个P188链可聚集起来，帮助密封具有不同尺寸受损区域的受损膜。
除抽脂细胞凋亡模型外，研究已在电穿孔模型[李(Lee)等人，体内电渗透化骨骼肌膜的表面活性剂诱导密封(Surfactant-induced sealing of electropermeabilized skeletalmuscle membranes in vivo).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，1992.89(10)：4524-8；以引用的方式并入本文中]和电离辐射模型[汉尼格(Hannig)等人，电离辐射渗透化膜的表面活性剂密封(Surfactant sealing of membranes permeabilized byionizing radiation).辐射研究(Radiat Res)，2000.154(2)：171-7；以引用的方式并入本文中]二者中证实这一细胞膜补救方法。此外，研究钝性外伤后神经元损伤的新研究显示，用P188进行膜保护可通过提供机械膜稳定作用来使剪切伤(sheer injury)早期的细胞复苏[马克(Marks)等人，两亲三嵌段共聚物提供有效的膜靶向神经保护(Amphiphilic，tri-block copolymers provide potent membrane-targeted neuroprotection).FASEB杂志(FASEB J)，2001.15(6)：1107-9；塞斯特G.(Serbest，G.)，J.霍维兹(J.Horwitz)和K.巴比(K.Barbee)，泊洛沙姆188对神经元细胞机械损伤恢复的影响(The effect ofpoloxamer-188 on neuronal cell recovery from mechanical injury).神经外伤杂志(JNeurotrauma)，2005.22(1)：119-32；塞斯特等人，机械外伤后的细胞死亡和泊洛沙姆188神经保护机制(Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 aftermechanical trauma).FASEB杂志，2006.20(2)：308-10；各以引用的方式并入本文中]。与本发明研究类似，这项研究显示损伤后细胞凋亡减少且细胞活力增加。有趣的是，在这项研究中，与未经处理过的受损细胞相比较，经处理细胞同样看起来更像是未受损的，即原始神经元。
在本实例中，描述了在围移植期(从采集到稳定移入的时间)，P188对于拯救受损的脂肪细胞的功效。此外，还证实，尺寸和结构与P188密切相关的聚合物具有类似的作用，但不如P188有效。
方法
细胞凋亡鉴别.使用免疫化学细胞凋亡特异性荧光标记FLIVOTM和MT MitoTM来鉴别脂肪细胞中的细胞凋亡情况。外植脂肪移植物，在38℃下用Blendzyme(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)Liberase Blendzyme 3)处理20分钟，并使其通过100微米的细胞粗滤器(用以去除消化后残留的细胞外基质成分)。随后，在标记后，于38℃下培育这些细胞1小时，并洗涤1次。接着，将这些细胞放入96孔黑色板中，并在读板器上，在其染料特异性发射和激发波长(FLIVO-红激发波长565/发射波长＞590；MITO-PT激发波长488/发射波长绿色530，红色590)下读取。
PICO绿色.使用购自英杰公司(Invitrogen)的Quant-iT PicoGreendsDNA分析试剂盒作为细胞计数的代用品，来定量DNA。在38℃下，在1.0cc Blendzyme中消化每一外植的小叶30分钟。接着，利用含有1.0cc FBS的细胞培养基停止Blendzyme反应。为进行定量，取出75微升消化的脂肪，并使用Qiagen Mini-prep离心吸附柱分离试剂盒加工。随后，根据试剂盒方案，将提取的DNA样品与试剂A(PicoGreen荧光团)、B(Tris缓冲液)和对于标准品用组分C(λdsDNA标准品，100μg/ml浓度)一起培育。接着使用黑色96孔板，在读板器上读取这些样品。
脂肪加工.从手术室直接获取脂肪抽出物。将其分成数等分30cc试样，并用等体积生理盐水洗涤1次，以去除血液和细胞碎片。随后，在200G下离心管，并分离中间层，且用各种试剂处理。在37℃下，在含有30cc脂肪的30cc洗涤液中处理这些试剂30分钟。选择这种培育方法使缺血时间最少，同时允许与处理剂充分混合。培育和洗涤后，再在200G下离心脂肪。再分离中间脂肪层，并放入1.0cc 1.0g等分试样中，以便注射到裸小鼠的肋腹中。这是依据批准使用除去鉴别(de-identified)的丢弃的组织的内部评级法(IRB)进行。应注意，采集套管和采集压力随病例和外科医师不同而不同。在从手术室收集到脂肪的2小时内，将脂肪移入动物体内，以便使热缺血时间减到最少。
实验模型.将1.0cc/1.0g(+/-0.01gm)脂肪移植物植入裸小鼠的单一小叶中。用14号血管导管对这些小鼠进行注射，以模拟临床上相关的1cc注射。将两个小叶植入本研究中所用每一裸小鼠的两侧肋腹中。选择14号血管导管以使注射期间脂肪移植物外伤减到最少。许多临床医生目前使用16号和14号导管进行脂肪移植，因此使用这种尺寸的导管接近临床实践。
最初，每天外植小叶，并测量重量和细胞凋亡活性。产生早期曲线后，在第3、第6和第9天外植小叶，以初步测量细胞凋亡水平。此外，对这些样品称重，送交组织学检测，并测量DNA含量。将前10天的终点与6周时的终点相比较，以确定早期细胞凋亡和细胞死亡是否能准确预测移植物性能。
每一实验都由早期小鼠组和晚期小鼠组组成。每一组都在某一天注射来自某一患者的相同脂肪。对于早期时间点，在每一取样日，对每一组的两只动物实行安乐死(每一早期时间点n＝4个小叶)。此外，接着在6周时对这些相同组的动物实行安乐死，以检查晚期终点(对于晚期时间点的每一组，使用8只动物产生的16个小叶)。一旦对动物实行安乐死，就收集两个小叶进行分析，并将动物从研究中去除。
测试的试剂.在本研究中，测试一系列各种试剂。具体点说，选择多种聚合物来研究不同普流尼克亚单位链长度和构造的作用。
普流尼克.测试多种尺寸、不同PEG组成(亲水性)和嵌段构造的普流尼克。这些普流尼克是市面上销售最广泛的非工业应用的泊洛沙姆。其测试剂量都为50μM的25cc生理盐水溶液。所检查的试剂为P188(约8,000KDa/80％PEG含量)、F38(4,700KDa/80％PEG含量)、F108(14,600KDa/80％PEG含量)、F127(12,600KDa/70％PEG含量)、L64(2,900KDa/40％PEG含量)、T1107(70％PEG，较长的四嵌段泊洛沙姆)和P31R1(3250KDa，逆嵌段次序)。还对二嵌段(PEG嵌段-聚己内酯嵌段)进行测试。
非普流尼克表面活性剂
非离子性.测试摩尔浓度与P188相同(50μM的25cc生理盐水溶液)聚山梨醇酯80(吐温80(Tween 80))，这是一种具有长疏水性尾(油酸)和亲水性头(聚乙氧基脱水山梨糖醇)的聚合物。也测试相同摩尔浓度的胆固醇。
阳离子性与阴离子性.测试50μM非普流尼克型带电表面活性剂溴化十六碳烷基三甲铵(Hexadecyltrimethylammonium bromide，HCTA；阳离子性)和氯化鲸蜡基三甲铵(cetyltrimethylammonium chloride，CTA；阴离子性)的25cc生理盐水溶液。这些分子的尺寸在约360KDa范围内，并具有短疏水性链和带电铵盐头。
两性离子.测试某些正常细胞膜中存在的磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC；790kDa)，一种两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂可视pH值而具有带电或不带电性。
聚乙二醇(PEG).测试10mg/ml的PEG 8000，因为其分子量与P188相同。此外，如有关细胞保存应用中软骨细胞膜保护的文献中所公开，单独测试PEG 600和PEG 3350以及其组合，分别为1.3％和1.5％。PEG后的数字表示其分子量。PEG是泊洛沙姆的一种组分，并且完全为亲水性的。
添加剂.测试用于P188的数种添加剂。测试浓度为10％到1％的维生素C，测试每100mg/kg脂肪500mM的硫辛酸(大鼠缺血再灌注模型中所用剂量)、白藜芦醇(50μM的25cc生理盐水溶液)、果聚糖(经显示可保护经受广泛温度变化的植物膜的有机分子)。还检查环孢霉素(cyclosporine，CsA)(有效的免疫抑制药物)。
统计学.使用ANOVA或学生T检验分析样品以测定各组之间的统计学显著性。显著性设置在95％的置信区间，P＜0.05视为统计学显著的。
结果
电子显微镜检术.将来自新鲜脂肪抽出物的脂肪细胞固定，并在透射型电子显微镜下研究。检查这些样品中由抽脂采集引起的膜损伤的存在。采集后立即在电子显微镜下检查，注意到完整脂肪细胞的膜中具有小孔。所注意到的这些小孔在30到600nm的范围内(参看图3)。还注意到这些小孔与脂肪细胞线粒体非常接近。
细胞凋亡
共聚焦显微镜检术.将来自早期实验的样品外植用于共聚焦显微镜检查。利用Blendzyme消化这些小叶，并用细胞凋亡特异性标记FLIVO-红标记；培育后，将这些细胞固定于4％三聚甲醛中，并在共聚焦显微镜下检查以定量评估细胞凋亡水平。当使用FLIVO-红SR(激发波长560nm且发射波长590nm)观察脂肪细胞时，注意到处理组与未处理组之间存在显著差异(参看图6)。生理盐水处理样品在整个细胞膜中显示较大的红色凋亡小泡。相比之下，第6天时，经P188处理过的样品显示出相对较少的红色凋亡小泡。
细胞凋亡定量.最初，每天外植小叶，并使用Mito-PT测量细胞凋亡水平。每日测试后，注意到在第5天到第7天之间出现细胞凋亡峰值水平，随后细胞凋亡水平回落。这些值大致符合钟形曲线。一旦确定了这一曲线，随后在第0天、第3天、第6天和第9天测试样品，以进行早期细胞凋亡取样(参见图7)。
当使用细胞凋亡特异性标记，来比较P188与生理盐水处理过的对照组时，在第6天时注意到细胞凋亡事件统计学显著减少。假定各样品之间无差异，使用学生t检验，这一差异显示p值为0.03。第6天，生理盐水(NS)显示41,000相对荧光单位(relativefluorescence units，RFU)，而P188为24,000RFU(对于NS，平均值的标准误差+/-5,720RFU；对于P188，+/-4485RFU)。这表示当与生理盐水处理对照组相比较时，经P188处理过的脂肪移植物中细胞凋亡事件平均减少40％。
还比较P188与数种其它治疗剂对细胞凋亡水平的影响(参看图8)。当将P188与以HCTA和CTA为代表的阴离子性和阳离子性聚合物相比较时，其显示细胞凋亡水平显著减少(第6天：HCTA 41,037RFU，CTA 35,338RFU且P188 32,158RFU)。此外，在较早时间点时，HCTA和CTA显示的细胞凋亡水平比生理盐水对照组高(第3天：NS 25,987RFU对HCTA 31,076RFU、CTA 35,338RFU)。这些结果与利用阴离子性和阳离子性聚合物使早期细胞死亡和总体脂肪移植物毒性增加相符。
接下来，将P188与倒转的三嵌段共聚物P31R1相比较。这一聚合物的尺寸与P188大致相同；但其是由疏水性尾和亲水性核心构成(与P188相反)。当将经P31R1处理过的脂肪与P188处理组和生理盐水处理过的对照组相比较时，在第3天、第6天和第9天时也发现P31R1使细胞凋亡事件增加(分别为第3天34,000RFU，第6天44,000RFU和47,000RFU对NS：8000RFU、57,000RFU和11,000RFU，以及P188：8,000RFU、16,000RFU和10,000RFU)。在这一相同实验中，评价磷脂酰胆碱(非离子性表面活性磷脂并且是许多细胞膜的组分)对细胞凋亡的影响。与P188相比较，磷脂酰胆碱也使细胞凋亡水平升高。与生理盐水相比较，磷脂酰胆碱不显示细胞凋亡增加(PC第3天：52,000RFU，第6天：29,000RFU，参看图8，右上图)。应注意，还测试了免疫抑制剂环孢霉素(CsA)的细胞凋亡活性。CsA也无法使脂肪移植物中的细胞凋亡水平降低。在第1天到第9天，当与生理盐水处理对照组相比较时，CsA显示始终较高的细胞凋亡水平。P31R1和CsA似乎对脂肪移植物有毒，且当与生理盐水相比较时，PC可显示细胞凋亡略有降低，但不如P188。
P188也与聚乙二醇8000(PEG 8000)和四嵌段共聚物T1107相比较。在这一系列实验中，使用较老的细胞凋亡分析方法(MitoPt对Apo-one)。较老的MitoPT分析方法得到的RFU值约是Apo-One法的1/10。当与P188相比较时，P188再次显示细胞凋亡减少(参看图8，左下图)。当P188与具有类似尺寸和构造的聚合物的组合相比较时，这些组合也无法进一步改善细胞凋亡水平。当与单独P188和生理盐水处理对照组相比较时，P188、F127与L64的组合显示较高的细胞凋亡水平。这些研究结果表明，利用PEG 8000、T1107以及聚合物P188、F127与L64的组合具有早期毒性。
此外，还研究P188与硫辛酸以及与维生素C对细胞凋亡的影响。P188与维生素C的组合显示细胞凋亡增加；但单独维生素C也产生较高细胞凋亡水平(参看图8，左下图)。当与单独维生素C相比较时，P188与维生素C的组合显示细胞凋亡减少。当与生理盐水处理对照组相比较时，P188与硫辛酸的组合显示细胞凋亡减少(这些实验也使用亮度较低的Mito-PT标记，参看图9)。
重量
早期阶段.在前10天实验期间，研究脂肪小叶的重量变化。注意到，在植入后立即测量，在这一阶段期间，所有组的重量都损失20％到25％。在最初24小时中，这些研究得到以重量计总共23.6％再吸收，且平均重量为0.75g(+/-0.8g)。在第1天出现这一重量损失后，没有鉴别出显著差异，且在前10天中，各处理组之间的重量具有极小变化(参看图10)。
P188.6周时，P188与生理盐水相比较，显示重量的统计学显著的改善。6周时，在分析的每一组65个小叶中，经P188处理过的移植物显示平均重量为0.70g，与生理盐水处理移植物的0.64g形成比较，其中标准偏差分别为0.08g和0.12g(参看图11)。此外，在早期取样期结束时，比较再吸收百分比与脱水移植物重量，P188相比对照组显示出50％的再吸收减少(参看图12)。
其它普流尼克聚合物.当与其它普流尼克相比较时，6周时的重量如下：F127：0.74+/-0.07g；L64：0.68+/-0.06g；F38：0.61+/-0.22g；F108：0.76+/-0.10g；T1107：0.62+/-0.15g；P31R1：0.74+/-0.05g；二嵌段：0.44+/-0.16g；吐温80：0.30+/-0.12g。再吸收百分比显示于图13中。
聚乙二醇.当与PEG 600、PEG 3350、PEG 8000和PEG 600+3350相比较时，P188显示重量的统计学显著改善。6周时，经PEG 600处理过的样品重量为平均0.64+/-0.11g(生理盐水为0.64+/-0.12g)，PEG 3350重0.58+/-0.21g，PEG 8000重0.53+/-0.06g，且PEG 600+3350混合物重0.58+/-0.22g。再吸收百分比显示于图13中。
硫辛酸.在本研究中，平均10天重量为生理盐水0.76g+/-0.09g；P188 0.76g+/-0.09g；且硫辛酸0.72g+/-0.09g(1.0g+/-0.10g初始植入物)。随后在6周时再检查处理组；此处注意到重量的显著差异。6周时，每组平均重量为生理盐水0.58+/-0.07g；P1880.71+/-0.06g；硫辛酸0.65+/-0.09g；且P188+LA 0.61+/-0.16g。在比较早期与晚期改变时，使用在前10天内样品的脱水重量比6周最终重量计算再吸收百分比。与生理盐水相比较，P188和硫辛酸显示再吸收的统计学显著差异(p值＜0.05)(参看图19)。
各种添加剂.当在P188下，测试其它试剂的潜在附加作用时，6周时的重量如下：白藜芦醇：0.73+/-0.03g；胆固醇：0.73+/-0.04g；胰岛素：0.47+/-0.21g；果寡糖(oligofructosaccharide)：0.72+/-0.08g(在这一组实验中，生理盐水表现良好，其中平均重量为0.74+/-0.04g)。在实验中，这些试剂的表现不如生理盐水对照组，且根据组织结构(参看下文)发现，其通常为有毒的。
细胞活力
利用Cell-Titer Blue分析6周时采集的样品，Cell-Titer Blue是一种浓缩蓝色染料，其在活的代谢活性细胞中转化成发红色荧光的染料。染料转化显示代谢活性，并与样品中的细胞数量相关。在6周后，当将P188与各种链长度的其它普流尼克相比较时，其显示信号的统计学显著增加(参看图14)。P188显示12,971+/-2785RFU，而生理盐水对照组显示4727+/-768RFU。其余聚合物如下：F127：4301+/-2785RFU；F108：3529+/-373RFU；F38：3188+/-346RFU；L64：6137+/-1933RFU；T1107：5063+/-1496RFU；吐温80：4346+/-1231RFU。也分析二嵌段共聚物(聚乙二醇甲基醚嵌段聚己内酯)和倒转的三嵌段普流尼克(P31R1)。这些聚合物也劣于P188：二嵌段：1,666+/-1283RFU；P31R1：1453+/-703RFU。
在本模型中，再针对细胞活力比较P188与各种尺寸的聚乙二醇(PEG)，这些聚乙二醇在其它研究中显示出保护软骨细胞的作用。6周时，P188又显示出优良的细胞活力(参看图15)。PEG显示出以下细胞活力信号：PEG 600：2892+/-1110RFU；PEG 3350：1109+/-301RFU；PEG 600+3350：1291+/-289RFU(参看图15)。
DNA含量
分析外植样品的DNA含量，作为细胞计数的间接量度。在早期和晚期时间点时，研究消化的样品。与重量测量值类似，在前10天中各样品之间的DNA含量不存在显著差异。
P188对生理盐水对照组.在6周时，针对DNA含量比较P188与生理盐水对照组，结果如下：生理盐水对照组：0.129+/-0.052μg DNA；P188：0.320+/-0.060μg DNA。利用学生t检验发现，这些结果为统计学上显著的，P＝0.03。
普流尼克.接着，当将P188与其它普流尼克相比较时，注意到P188与其它聚合物之间的统计学显著差异(ANOVA分析p＝0.0004，F临界＝2.299)。DNA含量如下：F127：0.236+/-0.043μg DNA；F108：0.082+/-0.033μg DNA；F38：0.025+/-0.007μg DNA；L64：0.168+/-0.062mcg DNA；T1107：0.124+/-0.048μg DNA；吐温80：0.134+/-0.023μg DNA。
PEGs.当针对DNA含量检查PEGs时，PEG 8000显示0.280+/-0.024μg DNA。同样检查PEG 600、PEG 3350和PEG 600+3350。
组织学
将外植的脂肪小叶固定，并使用H&E染色以对脂肪组织架构进行评分。与生理盐水处理对照组相比较，在经P188处理过的样品中注意到正常脂肪含量统计学显著改善。当针对正常脂肪、炎性浸润和纤维化进行评分时，P188的得分为：平均起来，58％正常脂肪、30％浸润和13％纤维化(10个小叶，每个小叶2个载片)。生理盐水对照组得分为：平均起来，41％正常脂肪、38％浸润和21％纤维化(10个小叶，每个小叶2个载片)。当进行学生t检验时，P＝0.04。
其它普流尼克.在其它泊洛沙姆中，L64和F127得分最佳：L64：65％正常脂肪、31％浸润和4％纤维化；F127：52％正常脂肪、38％浸润和10％纤维化。当与P188相比较时，这些差异未达到统计学显著性。其余泊洛沙姆得分如下：F38：45％正常脂肪、44％浸润、11％纤维化；F108：50％正常脂肪、42％浸润、7％纤维化；T1107：15％正常脂肪、41％浸润、43％纤维化；吐温80：17％正常脂肪、67％浸润、16％纤维化(参看图18，右图)。
聚乙二醇.用PEG处理过的脂肪移植物显示较高的炎性浸润水平和破坏的脂肪组织架构。PEG 8000得分为：42％正常脂肪、45％浸润、14％纤维化。
硫辛酸.同样检查P188加硫辛酸(PLA)并进行评分。PLA得分为：90％正常脂肪、9％浸润、1％纤维化(n＝2)。
各种添加剂.检查的所有剩余添加剂显示毒性以及重度纤维化和炎性浸润。
讨论
P188是一种三嵌段聚合物，其中央聚氧丙烯疏水区(POP单元，参看图1)跨接两个较长的聚氧乙烯亲水性尾(POE单元)。相信机械外伤和缺血性应力会导致正常脂肪细胞的细胞膜破裂。这一破裂首先表现为孔隙度增加，并且使正常膜离子梯度丧失。已知膜电性完整性的丧失是细胞凋亡级联的有效活化因素。经历程序性细胞死亡的细胞在移植物中呈脂质液滴集合的形式。随后，这些液滴被再吸收，导致移植物体积减小。三嵌段共聚物能够将自身插入损伤的脂肪细胞膜中，由此使膜稳定。此外，还已知三嵌段共聚物因具有高度水合的POE尾，而能够降低膜粘度。细胞粘度降低将使损伤的细胞变得更易溶解，由此降低损伤膜上的张力。
经显示，P188在脂肪组织中具有弱溶解性，并且其不会被充分吸附到未受损的完整细胞膜上。P188使经受采集过程引起的机械切变损伤的脂肪细胞保持其正常的膜力学。一旦这些细胞能够通过增加双层中磷脂的量来修复其细胞膜，P188就被机械挤出[艾格瓦J.(Agarwal，J.)，A.瓦尔希(A.Walsh)和R.C.李(R.C.Lee)，使受损细胞复苏的多模式策略(Multimodal strategies for resuscitating injured cells).纽约科学院年报(Ann NY Acad Sci)，2005.1066：295-309]。通过增加跨膜表面压力，可挤出P188。还应注意到，P188似乎接着基本上不变地被肾排出，其中少量是经由胆肠系统排出。相信没有证据证实这些剂量的P188会对人类使用带来不利影响或安全性问题[辛格-乔伊S.D.(Singh-Joy，S.D.)和V.C麦克莱恩(V.C.McLain)，泊洛沙姆101、105、108、122、123、124、181、182、183、184、185、188、212、215、217、231、234、235、237、238、282、284、288、331、333、334、335、338、401、402、403和407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯当用于美容中时的安全性评估(Safety assessment of poloxamers101，105，108，122，123，124，181，182，183，184，185，188，212，215，217，231，234，235，237，238，282，284，288，331，333，334，335，338，401，402，403，and 407，poloxamer 105benzoate，and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics).国际毒理学杂志(Int.J.Toxicol.)，2008.27增刊2：93-128]。
另外，在用于评价P188安全性的毒理学分析中，对狗静脉内投予多达50mg/kg剂量P188，并分析这些狗的器官中的P188[辛格-乔伊S.D.(Singh-Joy，S.D.)和V.C麦克莱恩(V.C.McLain)，泊洛沙姆101、105、108、122、123、124、181、182、183、184、185、188、212、215、217、231、234、235、237、238、282、284、288、331、333、334、335、338、401、402、403和407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲酸酯当用于美容中时的安全性评估(Safety assessment of poloxamers 101，105，108，122，123，124，181，182，183，184，185，188，212，215，217，231，234，235，237，238，282，284，288，331，333，334，335，338，401，402，403，and 407，poloxamer 105 benzoate，andpoloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics).国际毒理学杂志(Int J Toxicol.)，2008.27增刊2：93-128]。在这些实验中，看起来P188不溶于脂肪组织中，并且在脂肪组织中几乎注意不到放射性标记的P188。这进一步支持了所提出的作用机制，即，P188被吸附于受损的脂肪细胞膜上，而不是进入脂肪细胞中。此外，还有许多研究表明，一旦这些细胞膜自密封，并且表面压力增加，P188就会从细胞膜中挤出[吴(Wu)等人，脂质单层与泊洛沙姆188之间的相互作用：X射线反射和衍射研究(Interaction between lipidmonolayers and poloxamer 188：an X-ray reflectivity and diffraction study).生物物理学杂志(Biophys J)，2005.89(5)：3159-73；张Z.(Zhang，Z.)，M.al-雷拜(M.al-Rubeai)和C.R.托马斯(C.R.Thomas)，普流尼克F-68对哺乳动物细胞机械特性的影响(Effect ofPluronic F-68 on the mechanical properties of mammalian cells).酶与微生物技术(Enzyme Microb Technol)，1992.14(12)：980-3；马斯卡尼(Maskarinec)等人，泊洛沙姆188插入脂质单层中的直接观察结果(Direct observation of poloxamer 188 insertion intolipid monolayers).生物物理学杂志，2002.82(3)：1453-9；艾格瓦尔J.(Agarwal，J.)，A.瓦尔希(A.Walsh)和R.C.李(R.C.Lee)，使受损细胞复苏的多模式策略(Multimodalstrategies for resuscitating injured cells).纽约科学院年报(Ann N Y Acad Sci)，2005.1066：295-309；各以引用的方式并入本文中]。
这种防止离子丧失和防止受损细胞进展到细胞凋亡阶段的能力使脂肪细胞能保持其充当软组织填充物的能力。如果不使细胞膜稳定，则这些细胞会渗漏离子，并最终死亡[汉尼格(Hannig)等人，表面活性剂密封电离辐射渗透的膜(Surfactant sealing ofmembranes per meabilized by ionizing radiation).辐射研究(Radiat Res)，2000.154(2)：171-7；塞斯特(Serbest)等人，机械外伤后泊洛沙姆188的细胞死亡和神经保护机制(Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma).FASEB杂志(FASEB J)，2006.20(2)：308-10；米娜(Mina)等人，泊洛沙姆188共聚物膜密封剂在体外拯救淀粉样寡聚物的毒性(Poloxamer 188 copolymer membrane sealantrescues toxicity of amyloid oligomers in vitro).分子生物学杂志(J Mol Biol)，2009.391(3)：577-85；各以引用的方式并入本文中]。结果，脂肪移植物以不可预测的速率再吸收。游离脂肪移植中这一固有的不可预测性将降低脂肪移植物在软组织重建和填充中的效用[寇勒曼(Coleman)，结构性脂肪移植物：理想的填充物？(Structural fat grafts：theideal filler？)整形外科临床(Clin Plast Surg)，2001.28(1)：111-9；格托瓦斯基(Gutowski)，当前自体脂肪移植物的应用和安全性：ASPS脂肪移植专题研究小组的报告(Currentapplications and safety of autologous fat grafts：a report of the ASPS fat graft task force).整形外科(Plast Reconstr Surg)，2009.124(1)：272-80；各以引用的方式并入本文中]。
当与其它脂肪移植组相比较时，经P188处理过的脂肪移植物看起来像非移植的正常脂肪。这最好由6周时的组织结构证实，其中经P188处理过的脂肪组织看起来最像原生脂肪(并且通过Cell-Titer Blue和噻唑蓝溴化四唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)发现，其显示高细胞活力)。如由大量纤维化所证实，生理盐水处理过的脂肪组织看起来有损伤。PEG(P188的一种组分且借助其它分析法显示其有效保护某些细胞类型)和四嵌段共聚物(类似于P188，具有亲水性极强的尾)导致炎性浸润和重度到中等水平的纤维化。
在围移植期机械防护脂肪细胞的能力将使脂肪移植物在组织学和生物化学分析中看起来像正常脂肪。另一方面，未处理过的对照脂肪移植物变得纤维化，且其正常脂肪组织架构变松散(参看图17)。在用神经元进行的类似研究中，显示在细胞受到机械损伤后，经P188处理过的细胞表现得更像未受损的神经元[马克(Marks)等人，两亲三嵌段共聚物提供有效的膜靶向神经保护(Amphiphilic，tri-block copolymers provide potentmembrane-targeted neuroprotection).FASEB杂志(FASEB J)，2001.15(6)：1107-9；塞斯特G.(Serbest，G.)，J.霍维兹(J.Horwitz)和K.巴比(K.Barbee)，泊洛沙姆188对神经元细胞机械损伤恢复的影响(The effect of poloxamer-188 on neuronal cell recovery frommechanical injury).神经外伤杂志(J Neurotrauma)，2005.22(1)：119-32；各以引用的方式并入本文中]。基本上，机械膜稳定化会保护神经元信号传导和轴突功能，而且不会对细胞正常功能造成生理性改变。
如由实验数据所证实，与经生理盐水洗涤的细胞相比较，经P188处理过的脂肪移植物在很大程度上保留了其初始重量、细胞功能(借助代谢活性、ATP水平等评估)和正常架构。这表明在移植期间，细胞得到保护，使得其在新的位置中起到正常脂肪细胞的作用。具体点说，当与生理盐水处理对照组相比较时，P188在6周时显示重量的统计学显著增加，而这与再吸收降低50％相关(n＝170，P＝0.03)。此外，P188在前10天里显示细胞凋亡事件的统计学显著减少，在6周时显示细胞活力的显著增加，在6周时显示DNA含量的显著增加且在6周时由组织结构所示的正常脂肪的统计学显著增加。
当将P188与其它普流尼克相比较时，其也显示优良的结果。在本研究中研究的其它两种聚合物的表现类似于P188，但总体上仍劣于P188。这些聚合物为L64和F127。L64在室温下呈液态，分子量为2900kDa，由40％PEG和60％POE构成。F127是P407，因此F127为12600kDa，且具有70％PEG含量。这两种试剂都显示与P188类似的再吸收特征(参看图13)，以及改善的细胞活力(L64对生理盐水，参看图14；F127倾向于高于生理盐水，但平均起来与对照组类似)，当与生理盐水对照组相比较时其不存在统计学显著性。此外，当与生理盐水对照组相比较时，L64和F127显示DNA含量的某种改善(接近但当前n值不显著)，但仍劣于经P188处理过的样品(参看图16)。当通过组织学方法检查时，针对正常脂肪、纤维化和浸润的存在对这些试剂进行评分，表现接近P188。然而，由于显示出较低细胞活力和较低DNA含量，故这些移植物仍劣于P188。这些移植物具有总体较少的脂肪细胞计数，尽管根据组织结构，其相对比较健康，并且具有与P188类似的重量。
这些聚合物显示不同三嵌段共聚物的尺寸范围和不同三嵌段共聚物对膜密封特性的影响。L64较小(2900kDa)且疏水性较强；F127较大(约13,000kDa)且亲水性较强。P188在这两种试剂中间，重量为约8000kDa，且具有80％PEG含量。因此，其具有比F127长的亲水性尾和略微较短的疏水区。L64是较轻的分子，具有较短的PEG链。疏水区对于在膜小孔暴露的疏水区处膜密封活性至关重要。然而，一旦将分子放到暴露的小孔中，亲水链就可能提供额外的保护。这些链通过增加表面溶解性来帮助降低膜张力(参看图2)。
当将P188与泊洛沙姆F38和F108(P98和P308)相比较时，这些试剂显示较强的再吸收、较低的细胞活力和较低的DNA含量。尽管这些试剂都具有80％PEG，但其尺寸差异极大。F38的重量是P188的一半，但保持相同的PEG含量。这样就保持了疏水性与亲水性比，以致F38尽管较小，但仍具有与P188相同的PEG(亲水性)含量。F108为约15,000kDa，且因此较大，但仍具有相同的亲水性组成。因此，链长度的两种变化都实现在脂肪细胞中的膜密封作用。通过组织结构发现，与P188和生理盐水对照组相比较，这些试剂都诱导较高的损伤水平。对于F108，链长度增加可导致较高的膜溶解，最终产生清洁剂作用(细胞膜溶解)，而F38则可能太小。尽管L64甚至更小，但其疏水含量较高，可能使其聚集在敞开的小孔中。
在亲水性含量较高的泊洛沙姆中观察到的这一膜溶解作用转化成在用纯PEG处理过的脂肪移植物中观察到的结果。测试PEG 600、3350和8000。这些PEG代表着PEG重量范围(例如PEG 600＝600kDa聚乙二醇)。在先前的研究中显示，PEG 600与3350的混合物可保护冷冻的软骨细胞。美国专利申请公开案US2009/0017438。在本研究中，脂肪细胞看起来比软骨细胞更易受到清洁剂作用影响。当与P188和生理盐水对照组相比较时，所有PEG处理组(和多种PEG的组合)都显示出较差的结果。PEG 3350和PEG 8000显示比生理盐水处理对照组高的再吸收(参看图13)和较低的细胞活力(参看图15)。另外，根据组织结构发现，这一样品显示严重的浸润和受损的脂肪组织架构。PEG 600是毒性最小的。其显示与生理盐水对照组类似的再吸收(以重量计)和类似的细胞活力(参看图13和15)。因此，在软骨细胞保护中所述的剂量下，PEG 600可能太小而无法产生有毒作用。较大的PEG 3350和PEG 8000缺乏如三嵌段共聚物那样的疏水区，并且可能溶解细胞膜，导致细胞溶解。
当分析其它共聚物，即二嵌段共聚物、倒转的三嵌段共聚物(例如P31R1)和四嵌段共聚物(例如T1107)时，这些聚合物也显示细胞毒性(二嵌段和倒转的三嵌段)或无作用(四嵌段)。倒转的三嵌段共聚物P31R1(3,300kDa)具有中央亲水性嵌段和两个侧接的疏水性尾。当与P188和生理盐水相比较时，其在围移植期的大部分时间中诱导细胞凋亡(参看图8，右上图)。此外，尽管以重量计具有相对较低的再吸收，其还显示较低的活细胞信号(1454RFU对生理盐水对照组中的4,000RFU)和较差的组织结构(参看图13)。当根据组织结构分析时，重量增加代表纤维化和炎性浸润和少量的正常脂肪。因此，聚合物的构造对于其膜密封特性很重要。二嵌段共聚物具有与肥皂相同的构造：亲水性头和疏水性尾。这些共聚物似乎可充当清洁剂，并以重量计具有最高的再吸收水平。非离子性非普流尼克型吐温80也具有类似结果(参看图13)。根据组织学评分，吐温80引起最高的损伤水平，并且明显对脂肪移植物有毒(参看图18B)。四嵌段共聚物T1107具有4个PEG链以放射方式附接到4个POE链(像车轮上的轮辐)。就重量、DNA含量和细胞活力来说，这一聚合物的表现不如生理盐水对照组。然而，当根据组织学对T1107评分时，存在最少的正常脂肪。因此，在移植物内，看起来相对正常的活力和DNA含量只不过反映炎性细胞置换了正常脂肪。临床上曾使用两性离子性磷脂酰胆碱作为抽脂过程中的脂肪溶解剂。在本发明为期10天的分析中，利用与P188相同的浓度，其似乎具有某种保护作用，但作用的量值与P188不同(参看图8，右上图)。
由于L64和F127看起来具有某种保护作用，故将其与P188混合，并在早期细胞凋亡模型中进行分析。人们认为，可能是有效聚合物的组合会对脂肪移植物产生协同作用。但事实并非如此，当组合时，这一聚合物混合物似乎有毒。在10天的取样期中，注意到较高的细胞凋亡水平(参看图8，右下图)。因此，在进一步研究中排除所述聚合物混合物。
同样对P188的添加剂进行研究。果聚糖是植物来源的寡糖，经显示，其可保护植物细胞膜免受较大温度变化影响。然而，在本发明研究中，这些试剂诱导大量脂肪细胞损伤(根据组织结构)和以重量计较高的再吸收水平。维生素C(抗坏血酸)在一系列剂量下也显示细胞毒性。有趣的是，在10天模型中，P188似乎对经维生素C处理过的细胞提供某种保护作用(参看图6，右下图)。第6天，在维生素C处理过的样品与维生素C加P188之间注意到细胞凋亡减少。
最后，也作为P188添加剂的硫辛酸进行测试。当添加硫辛酸时，似乎对细胞凋亡的减少具有协同作用(参看图7)。第6天时，这一组合引起的细胞凋亡事件比单独P188少。硫辛酸是一种有效的抗氧化剂，并在氧化应力(缺血再灌注损伤)下具有线粒体保护作用。如通过电子显微镜检术注意到，脂肪细胞线粒体与脂肪细胞膜小孔极为接近(参看图3)。因此，当利用P188使膜稳定时，硫辛酸对受损的线粒体提供额外的保护作用。6周时，这一混合物也引起再吸收(以重量计)的显著改善和DNA含量的改善。
结论
在本实例中，检查基于聚合物的膜保护作用对脂肪移植的影响。实验测试了多种泊洛沙姆尺寸(约2500kDa到约14,000kDa)、多种疏水性(40％PEG到80％PEG)、各种其它共聚物(二嵌段、三嵌段、倒转的三嵌段和四嵌段)、阴离子性、阳离子性和两性离子性聚合物，加单独PEG、组合和各种添加剂。在早期终点和晚期终点中，当与所有其它组和生理盐水处理对照组相比较时，P188显示优良的细胞凋亡减少、以重量计改善的再吸收、较高的DNA含量和细胞架构的改善。
似乎P188的尺寸是一个重要因素；F38(较小)和F108(较大)没有同样的表现。疏水性增加有助于较小的泊洛沙姆(L64)和较大的亲水性略微较弱的泊洛沙姆(F127)；但P188仍然是最佳的。结构和次序也至关重要，倒转的三嵌段共聚物P31R1和二嵌段共聚物PEG-聚己内酯也对移植物有毒。另外，四嵌段共聚物T1107似乎会产生毒性并引起严重炎性浸润。
当聚合物都为亲水的并且较大时(PEG 3350、PEG 8000)，其对脂肪移植物有毒。较小PEG(PEG 600)不如生理盐水。非嵌段型非离子表面活性剂(吐温80)也对脂肪有毒。在PEGs中观察到的高亲水性会由清洁剂作用引起膜溶解。吐温80具有长疏水性尾和较小的亲水性头。这一分子也可能充当经典清洁剂，并溶解细胞膜。
各种添加剂或是有毒，或是无作用，但硫辛酸除外。在本研究中，发现果聚糖、白藜芦醇、胆固醇和维生素C都有毒。有趣的是，P188似乎对维生素C诱导的损伤提供某种保护作用。此外，硫辛酸当与P188组合使用时，似乎提供潜在的协同作用。因此，当其用于经P188处理过的脂肪移植物中时，似乎提供额外的线粒体保护作用。
这一研究表明了P188在密封脂肪细胞膜损伤方面的功效。尺寸变化过大的分子看起来不起作用，除非增加其疏水性；但当这些分子的表现不如P188好时，尺寸仍然很重要，且组合可能会有毒。在完全不同的机制下起作用的硫辛酸当与P188组合时，可能具有协同作用。
等效内容和范围
所属领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范围不打算局限于上述描述，而是如所附权利要求书所述。
在权利要求书中，除非另作相反说明，或另外由上下文显而易见，否则例如“一”和“所述”等词可以指一种或一种以上。除非另作相反说明或另外从上下文显而易见，否则如果一组中一个、一个以上或所有组内成员存在于、用于或以其它方式相关于指定产物或方法，那么认为在所述组中一个或一个以上成员之间包括“或”的权利要求项或描述得到满足。本发明包括所述组的正好一个成员存在于、用于或以其它方式相关于指定产物或方法的实施例。本发明还包括所述组的一个以上或所有成员都存在于、用于或者以其它方式相关于给定产物或方法的实施例。此外，应了解，本发明涵盖将来自一个或一个以上权利要求项或者来自相关描述部分的一个或一个以上限定、要素、条款、描述性术语等引入另一权利要求项中的所有变化、组合和重排。例如，可对附属于另一权利要求项的任一权利要求项加以修改，以使其包括一个或一个以上在附属于同一基础权利要求项的任何其它权利要求项中所见的限定。此外，当权利要求书描述组合物时，应了解，除非另作指示，或者除非所属领域技术人员显而易见会引起矛盾或不一致，否则包括出于本文所揭示的任一目的而使用所述组合物的方法，并且包括根据本文中所揭示的制备方法或此项技术中已知的其它方法中的任一种来制备所述组合物的方法。举例来说，应了解，本发明任一组合物都可用于软组织修复或填充。还应了解，根据本文中揭示的组合物制备方法制备的任一组合物都可用于软组织修复或填充。此外，本发明涵盖根据本文中揭示的供制备组合物的方法中的任一种制备的组合物。
在要素是以例如马库西群(Markush group)格式等列表呈现的情况下，应了解，也揭示所述要素的各个亚群，并且可从所述群中去除任何要素。还应注意，术语“包含”拟为开放式的，并且容许包括其它要素或步骤。应了解，一般来说，在本发明或本发明各方面提到包含特定要素、特征、步骤等时，本发明的某些实施例或本发明各方面是由或基本上由所述要素、特征、步骤等组成。为简洁起见，在本文中这些实施例并未用这些文字特别说明。因此，对于包含一个或一个以上要素、特征、步骤等的本发明各实施例来说，本发明还提供由或基本上由这些要素、特征、步骤等组成的实施例。
当给定范围时，包括端点。此外，应了解，除非另作指示，或者另外从上下文和/或所属领域技术人员的理解显而易见，否则以范围表示的值在本发明不同实施例中可采用所述范围内的任何特定值，除非上下文中另外清楚指示，否则精确到所述范围下限单位的十分之一。还应了解，除非另作指示，或者另外从上下文和/或所属领域技术人员的理解显而易见，否则以范围表示的值可假定为在指定范围内的任何子范围，其中所表示的子范围的端点的精确度与所述范围下限单位的十分之一相同。
此外，应了解，本发明的任何特定实施例可明确地从一个或一个以上权利要求中排除。本发明组合物和/或方法的任一实施例、要素、特征、应用或方面都可从任一个或一个以上权利要求项中排除。为简短起见，排除一个或一个以上要素、特征、目的或方面的所有实施例都未在本文中明确陈述。

Claims (15)

1.一种脂肪源性细胞与泊洛沙姆P188的组合物的用途，所述组合物用于制备供个体移植脂肪源性细胞的药物，其中在移植后所述组合物在所述个体内形成脂肪移植物，以及所述泊洛沙姆P188防止脂肪移植物再吸收、保护所述细胞免受损伤、和/或防止细胞死亡；以及所述组合物包含每毫升细胞1mg到20mg泊洛沙姆P188。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述泊洛沙姆P188密封所述细胞的膜。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述泊洛沙姆P188使所述细胞的膜稳定。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述脂肪源性细胞是脂肪细胞。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述脂肪源性细胞是干细胞。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述脂肪源性细胞是自体细胞。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物进一步包含硫辛酸。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含每毫升细胞5mg到15mg泊洛沙姆P188。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含每毫升细胞15mg泊洛沙姆P188。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含每毫升细胞10mg泊洛沙姆P188。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述泊洛沙姆P188为至少95％纯。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述泊洛沙姆P188为至少98％纯。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述泊洛沙姆P188为至少99％纯。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述个体为哺乳动物。
15.根据权利要求1所述的用途，其中所述个体为人类。
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