DE102009022346B4

DE102009022346B4 - Automatisches Abtrennen von Fettgewebe

Info

Publication number: DE102009022346B4
Application number: DE200910022346
Authority: DE
Inventors: Frank Pretzsch; Ulrike Koropp; Andrea Dr.rer.nat. Heymer
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2011-05-19
Anticipated expiration: 2029-05-16
Also published as: DE102009022346A1; EP2429425A1; WO2010130304A1

Abstract

Vorrichtung zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängendem Fettgewebe, enthaltend:
– Mittel zum Beaufschlagen des flächig auf einem Bodenelement aufliegenden Gewebestücks in einem ersten Bereich innerhalb der Ausdehnung des Gewebestücks mit Flächendruck, so dass dadurch Fettgewebe aus dem mit Druck beaufschlagten ersten Bereich in einen angrenzenden nicht mit Druck beaufschlagten zweiten Bereich austritt; und
– Mittel zum Abtrennen des ausgetretenen Fettgewebes von dem Gewebestück.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von an Spendergewebe des tierischen oder menschlichen Körpers anhaftendem Gewebe, besonders Fettgewebe sowie eine Vorrichtung zur automatischen Durchführung dieses Verfahrens.
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft das technische Gebiet des Tissue Engineering. Das Prinzip des Tissue Engineering besteht im Wesentlichen darin, aus Spendergewebe, das in einem separaten Verfahrensablauf aus dem menschlichen oder tierischen Körper in Form von Spendergewebe als sogenannte Biopsate gewonnen werden kann, vitale Zellen oder Zellverbände zu isolieren und daraus neue Gewebe zu konstituieren. Die isolierten Zellen werden vermehrt und im Anschluss zum Aufbau neu konstituierter dreidimensionaler Gewebestrukturen, beispielsweise neu konstituierter Hautäquivalente, aufgebracht. Solche neu konstituierten Gewebe können dann als Testsysteme in der Forschung, insbesondere zur Wirkstofferforschung oder als Transplantate in der Medizin eingesetzt werden, um verlorene Organfunktionen zu ersetzen. Beispielsweise werden zweischichtige Hautmodelle bevorzugt als Testsysteme für Wirkstoffe, Chemikalien und Kosmetika eingesetzt und stellen eine Alternative zum Tierversuch dar.
Der hohe Bedarf an Hauttestsystemen aus humanen primären Zellen und die Anforderungen an deren Reproduzierbarkeit kann letztlich nur durch eine Automatisierung des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Für den Aufbau von Hauttestsystemen werden zwei unterschiedliche primäre Zelltypen, und zwar Fibroblasten und Keratinozyten, benötigt, die bekanntermaßen aus mehrschichtigem Hautgewebe (insbesondere Präputiumbiopsate) isoliert werden.
Ein besonderes Anwendungsgebiet ist die Abtrennung von an Hautgewebe anhaftendem Fettgewebe, sodass ein im Wesentlichen von Fettgewebe befreiter Gewebeverband erhalten werden kann, woraus Einzelzellen isoliert werden können.
Stand der Technik
Besonders im Zusammenhang mit der regenerativen Medizin besteht der Bedarf, biologische Laborprozesse unter Reinraumbedingungen GMP-konform zu automatisieren. Dadurch soll eine höhere Ausbeute, eine höhere Prozesssicherheit sowie eine standardisierbare Prozessoptimierung und Prozesskontrolle erreicht werden.
Eine Schwierigkeit besteht vorallem darin, die Vielzahl an unterschiedlichen vorbekannten manuellen Schritten und Handlungsabläufen der Gewebeaufbereitung und Zellisolation in zweckmäßig automatisierten Handhabungen umzusetzen. Eine besondere Herausforderung an die Automatisierung solcher Abläufe stellt dabei die Trennung von Spendergewebe dar, insbesondere die Abtrennung von Fettgewebe von Hautbiopsaten.
In der bekannten manuellen Aufbereitung von Spendergewebe, insbesondere Hautbiopsaten, wird das daran anhaftende Fettgewebe mit Hilfe einer definiert greifenden Pinzette und einem Skalpell manuell vom Biopsat abgetrennt. Die Unterscheidung des Fettgewebes von anderen Gewebeschichten des Spendergewebes erfolgt während des Schneidens rein unter laufender Sichtkontrolle. Bei Hautbiopsaten ist das Fettgewebe in der Regel fest mit der Dermis verbunden und lässt sich nur manuell mit hohem Zeitaufwand abtrennen.
Da Hautbiopsate dazu neigen, sich einzurollen, ist die Handhabung von Spendergewebe zusätzlich erschwert. Durch die Fettabtrennung nimmt diese Neigung ab und das Biopsat ist dazu einfacher handhabbar.
Bisherige Lösungsansätze zur Automatisierung im Bereich der Zellkulturtechnik und des Tissue Engineering beschränken sich hauptsächlich auf die Kultivierung von Einzelzellen: Automatisierte Robotersysteme sind bekannt, die Zellkulturflaschen oder Bioreaktoren, insbesondere im Format standardisierter Multiwellplatten, handhaben können. Alle für die Zellkultur erforderlichen Schritte, Inkubation, Medienwechsel, Passagier- und Ernteprozesse werden automatisiert und gegebenenfalls auch unter GMP-konformen Bedingungen durchgeführt. Weder für die Zellextraktion der zu kultivierenden Zellen, noch für die Weiterverarbeitung der kultivierten Zellen stehen bisher automatisierbare Verfahren oder Mittel bereit.
Aufgabenstellung
Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein automatisierbares Verfahren zum Abtrennen von Fettgewebe von einem biologischen Gewebestück, wobei das Gewebestück bevorzugt ein Spendergewebe ist, besonders bevorzugt menschliches oder tierisches Hautgewebe, welches bevorzugt zumindest eine Epidermis und zumindest eine Dermisschicht aufweist sowie eine spezielle Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen, welches vor allem technisch aufwändige und schlecht realisierbare Handhabungsschritte, wie diese aus der manuellen Bearbeitung von Spendergewebe bekannt sind, vermeidet und eine einfache technische Realisierung in automatisierten robotergestützten Systeme ermöglicht.
Das technische Problem wird gelöst durch eine Vorrichtung, welche zumindest die folgenden Elemente aufweist:

– Hülse (10) mit oberem Ende (14) und unterem Ende (12);
– Bodenelement (40), welches das untere Ende (12) der Hülse überdeckt und von der Hülse (10) beabstandet ist, so dass zwischen Bodenelement (40) und unterem Ende (12) der Hülse ein umlaufender Spalt (50) gebildet ist; und
– Stempel (30), welcher in der Hülse (10) bevorzugt verschiebbar beweglich angeordnet ist und die Hülse (10) zum oberen Ende (14) hin dichtend abschließt und zwischen dem die Hülse (10) an ihrem unteren Ende (12) überdeckenden Bodenelement (40), der Innenwand der Hülse (16) und dem Stempel (30) innerhalb der Hülse ein Raum (60) zur Aufnahme des Spendergewebes gebildet ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängenden Fettgewebe.
Das technische Problem wird auch gelöst durch ein Verfahren zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängenden Fettgewebe, wobei das Gewebestück bevorzugt ein Spendergewebe ist, besonders bevorzugt menschliches oder tierisches Hautgewebe, welches bevorzugt zumindest eine Epidermis und zumindest eine Dermisschicht aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren weist zumindest die folgenden Schritte auf, die bevorzugt in der angegebenen Reihenfolge, bevorzugt unmittelbar hintereinander, durchgeführt werden:

b) Beaufschlagen eines im Wesentlichen flächig auf einem Bodenelement aufliegenden Gewebestücks in einem ersten Bereich innerhalb der Ausdehnung des Gewebestücks mit Flächendruck, so dass dadurch Fettgewebe aus dem mit Druck beaufschlagten Bereich in einen angrenzenden zweiten nicht mit Druck beaufschlagten Bereich austritt; und
c) Abtrennen des in dem zweiten Bereich ausgetretenen Fettgewebes von dem Gewebestück.

In bevorzugt vorgeschalteten Handlungsschritten a) wird das Gewebestück bevorzugt mittels Unterdruck, das heißt durch Ansaugen an oder in die erfindungsgemäße Vorrichtung gehalten und bevorzugt auf das Bodenelement verbracht.
Das automatisierbare Ansaugen des Gewebestücks erlaubt einfachere Handlungsoptionen und ermöglicht es, gegebenenfalls mehrere Gewebetrennschritte in Folge durchzuführen.
In bevorzugter Ausführung wird das Verfahren mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt, die dazu speziell ausgebildet ist.
Bevorzugt wird der mit Druck beaufschlagte erste Bereich von dem angrenzenden nicht mit Druck beaufschlagten zweiten Bereich durch eine über dem Gewebestück angeordnete Hülse abgetrennt, die von dem Bodenelement beabstandet ist und an ihrem unteren Ende mit dem Bodenelement einen umlaufenden Spalt bildet. Über dem Spalt zwischen dem Bodenelement und Hülse stehen die Bereiche in Verbindung, so dass das Innere der Hülse druckbeaufschlagte Gewebestück zumindest teilweise aus dem Spalt austreten kann.
In bevorzugter Ausführung erfolgt die Druckbeaufschlagung durch Absenken eines bevorzugt innerhalb einer über dem Gewebestück angeordneten Hülse beweglich geführten Stempels auf das am Bodenelement aufliegenden Gewebestück.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Isolation von Fettgewebe aus Spendergewebe des menschlichen oder tierischen Körpers. Dieses Verfahren dient vorzugsweise zur Gewinnung von Stammzellen aus dem vom Spendergewebe abgetrennten isolierten Fettgewebe. Das erfindungsgemäße Verfahren ist charakterisiert durch die Schritte:

– Bereitstellen des Spendergewebes;
– Durchführen der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängendem Fettgewebe; und vorzugsweise
– Sammeln des dabei von dem Spendergewebe abgetrennten Fettgewebes.

In einem bevorzugten weiteren Schritt dieses Verfahrens werden aus dem abgetrenntem Fettgewebe adulte Stammzellen in an sich bekannter Weise isoliert.
Die Erfindung erlaubt auf diese erfindungsgemäße Weise aus Spendergewebe Fettgewebe sowie adulte Stammzellen zu erhalten.
Die Erfindung erlaubt die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Gewinnung von Fettgewebe aus Spendergewebe des menschlichen oder tierischen Körpers, und bevorzugt die nachfolgende Gewinnung von Stammzellen, besonders adulter Stammzellen aus dem Fettgewebe.
Die Erfindung erlaubt auch die Bereitstellung einer Anordnung zur automatischen Isolierung von biologischen Zellen aus einem biologischen Gewebestück, welche zumindest die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Abtrennen von Fettgewebe von dem Gewebestück enthält und insbesondere durch diese charakterisiert ist. Die Anordnung enthält für den vollen Funktionsumfang bevorzugt weiter:

– Mittel zur automatischen mechanischen und enzymatischen Trennung von Gewebeschichten in dem vom Gewebestück, insbesondere von Fettgewebe reduziertem oder befreitem Spendergewebe;
– Mittel zur automatischen enzymatischen Vereinzelung der Zellen aus den getrennten Gewebeschichten;
– Mittel zum automatischen Resuspendieren der vereinzelten Zellen und Mittel zum Abtrennen der vereinzelten Zellen von gegebenenfalls vorliegenden Geweberesten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung macht sich die Erkenntnis zunutze, dass die mechanischen Eigenschaften von dem Gewebestück einerseits und dem daran anhaftenden Fettgewebe andererseits derart verschieden sind, dass durch Druckbeaufschlagung des im wesentlichen flächig aufliegenden Gewebestücks das Fettgewebe dann räumlich separat und anschließend abgetrennt werden kann.
Das Gewebestück insbesondere ein Hautgewebe, vor allem aufgebaut aus Epidermis und Dermisschicht, weist eine vergleichsweise unelastische zähe Struktur auf. Das anhaftende Fettgewebe ist vergleichsweise elastisch und weicht einer Druckbelastung, ähnlich einer elastischen flüssigen Masse, aus.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren und das Ausführungsbeispiel näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen sind.
1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Abtrennen von Fettgewebe von biologischem Gewebe in der seitlichen Schnittansicht (1A) und in der Draufsicht (1B). Das Ausführungsbeispiel nach 1 weist eine bevorzugt zylindrische Hülse (10) mit einem oberen Ende (14) und einem unteren Ende (12) auf. An das untere Ende (12) der Hülse (10) schließt sich ein Bodenelement (40) an, welches das untere Ende (12) der Hülse (10) zumindest vollständig überdeckt. Das Bodenelement (40) ist von der Hülse (10) derart beabstandet, dass zwischen dem Bodenelement (40) und dem unteren Ende (12) der Hülse (10) ein Spalt (50) gebildet ist. In der Hülse (10) ist ein Stempel (30) bevorzugt verschiebbar beweglich angeordnet. Der Stempel (30) schließt die Hülse (10) zum oberen Ende (14) der Hülse hin dichtend ab. Auf diese Weise wird bevorzugt im unteren Bereich der Hülse ein Raum (60) gebildet, der nach oben hin durch den dichtenden Stempel (30) zur Seite durch die Wand der Hülse (10) und nach unten hin durch das Bodenelement (40) begrenzt ist. Der Raum (60) steht über den bevorzugt umlaufenden Spalt (50) mit der Hüllenaußenseite in Kommunikation (Fluidverbindung). Die Vorrichtung ist derart ausgestaltet, dass eine Druckbeaufschlagung im Raum (60) über den Spalt (50) ausgleichbar ist. Der Raum (60) dient der Aufnahme des biologischen Gewebes, welches bevorzugt im Wesentlichen flächig auf dem Bodenelement (40) anliegt.
Die in 1 dargestellte bevorzugte kreisrunde konzentrische Anordnung kann durch eine andere Querschnittsform, beispielsweise ellipsoid, quadratisch oder rechteckig, ersetzt werden, ohne dass diese alternativen Ausführungen außer dem Erfindungsgedanken entgegenstehen würden. Solche Ausführungen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist bevorzugt weiter einen an der Außenseite der Hülle (10) umlaufenden Schneidring (20) auf, welcher an der Hülse (10) zumindest verschiebbar beweglich angeordnet ist. In bevorzugter Ausgestaltung weist der Schneidring (20) an seiner Unterseite, das heißt der dem Bodenelement (40) und dem unteren Ende (12) der Hülse zugewandten Seite, einen umlaufenden Schneidkeil (25) auf. Dieser dient zum verbesserten Abtrennen des bei Druckbeaufschlagung sich im Raum (60) befindlichen biologischen Gewebes (100) aus dem Spalt (50) austretenden Fettgewebes (110) (2B). Dazu ist der Schneidring (20) auf das Bodenelement (40) absenkbar (2C).
Bevorzugt bildet der umlaufende Schneidring (20) im Bereich des Spalts (50) mit dem unteren Ende (12) der Hülse ein scherschneidendes Wirkelement oder Werkzeug, welches dazu dient, das austretende Fettgewebe abzutrennen. Alternativ bevorzugt bildet der Schneidring (20) im Bereich des Spalts (50) mit dem Bodenelement (40) ein messerschneidendes Wirkelement beziehungsweise Werkzeug, das dem Abschneiden des austretenden Fettgewebes dient, wobei das Bodenelement (40) die Auflage und der Schneidring (20), bevorzugt in Verbindung mit dem Schneidkeil (25) ein messerschneidendes Werkzeug bildet. Bevorzugt ist ein umlausender Ringmesser ausgebildet.
Der Schneidkeil ist in bevorzugter Ausführung an der Schneidkante strukturiert, bevorzugt gezahnt oder gezackt, um die Schneidwirkung zu verbessern. In einer bevorzugten Variante dieser Ausführung ist die Schneidkante angeschrägt, um beim Absenken des Schneidrings im abzutrennenden Gewebe einen Schrägschnitt zu bewirken.
Bevorzugt ist der Schneidring (20), insbesondere zur Unterstützung der Schneidwirkung um die Hülsenachse koaxial rotierbar angeordnet und übt bevorzugt während des Schneidvorgangs eine vorzugsweise im Wesentlichen senkrecht zur Hülsenachse verlaufende Drehbewegung aus, wodurch am austretenden Fettgewebe ein ziehender Schnitt bewirkt wird.
Der im Inneren der Hülse bevorzugt verschiebbar beweglich angeordnete Stempel (30) ist zur Druckbeaufschlagung des im Raum (60) aufgenommenen Gewebes zum Bodenelement (40) hin, das heißt zum unteren Ende (12) der Hülse (10) absenkbar. Durch das Absenken des Stempels (30) wird der Druck auf das Gewebe erhöht. Bevorzugt ist ein senkrecht auf das bevorzugt auf dem Bodenelement (40) im Wesentlichen flächig aufliegendes Gewebe wirkender Flächendruck.
In einer alternativen Anordnung ist, bevorzugt anstelle eines verschiebbar beweglichen Stempels (30), eine unmittelbare fluidische, bevorzugt pneumatische und/oder hydraulische, Druckaufbringung in den Raum (60) vorgesehen. Die fluidische Druckaufbringung erfolgt bevorzugt durch einen Zulauf in den Raum (60), der bevorzugt mit einer Druckpumpe oder Druckvorlage in Fluidverbindung steht.
Der erfindungsgemäß vorgesehene Spalt (50) weist eine durch die Beabstandung von Hülse (10) und Bodenplatte (40) bedingte Spaltbreite auf. Diese beträgt 1 mm oder weniger, bevorzugt weniger als 1 mm und mehr als 0,4 mm.
In einer Variante ist vorgesehen, dass im Bereich des Spalts (50) zumindest ein Steg (55) vorgesehen ist, welcher die Hülse (10) mit der Bodenplatte (40) beabstandet verbindet, um im Wesentlichen als Abstandselement die Spaltbreite festzulegen. Bevorzugt sind mehrere Stege (55), bevorzugt gleichmäßig beabstandet entlang des Spalts (50), das untere Ende (12) der Hülse umlaufend vorgesehen. In dieser bevorzugten Ausgestaltung ist der umlaufende Spalt (50) als Durchbrechungen der Hülse (10) an deren unteren Ende (12) vorgesehen.
In einer bevorzugten Ausführung weist die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich mindestens ein Mittel zur Erzeugung eines Unterdrucks, insbesondere eine Absaugleitung, welche bevorzugt mit einer Vakuumvorlage oder Vakuumpumpe in Fluidverbindung steht, auf. Dadurch kann das Gewebestück in der Vorrichtung, insbesondere in dem Raum (60) gehalten werden und so insbesondere robotergestützt an andere Stellen verbracht werden. Dies erlaubt außerdem die einfache Isolation des Restgewebes vom abgetrennten Fettgewebe. Das Fettgewebe, kann in dem bevorzugt als Gewebeschale, vorzugsweise als Petrischalenunterteil, ausgebildete Bodenelement (40) verbleiben. Das von Fettgewebe befreite Restgewebestück kann bevorzugt in der Hülse (10) gehalten und vom Bodenelement (40) abgehoben werden.
In 2 ist die Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängendem Fettgewebe illustriert: Das biologische Gewebestück (100) liegt zusammen mit dem anhängenden Fettgewebe (110) auf der Bodenplatte (40) im Wesentlichen flächig auf (2A). Beabstandet zur Bodenplatte (40) ist die Hülse (10) über dem Gewebestück (100) angeordnet. Die Hülse weist einen inneren bevorzugt verschiebbar beweglich angeordneten Stempel (30) und den bevorzugt einen am äußeren Umfang der Hülse (10) angeordneten Schneidring (20); der bevorzugt einen umlaufenden Schneidkeil (25) aufweist, auf. Durch Hülse (10) und Bodenplatte (40) wird ein Spalt (50) gebildet, der einen ersten Bereich (120) innerhalb der Hülse von einem benachbarten zweiten Bereich (130) außerhalb des Hülseninneren abtrennt.
In 2B ist illustriert, wie das Gewebestück (100) durch Aufpressen des Stempels (30) im Bereich (120) erfindungsgemäß mit Flächendruck beaufschlagt wird. Das Gewebestück (100) wird an die Bodenplatte (40) angepresst, wobei gleichzeitig das am Gewebestück (100) anhaftende Fettgewebe (110) durch den Spalt (50) in den nicht mit Druck beaufschlagten Bereich (130) ausgepresst wird. Bevorzugt ist vorgesehen, dass das Gewebestück mit dem anhängenden Fettgewebe so auf der Bodenplatte angeordnet ist, dass das Fettgewebe beziehungsweise Fettgewebeschicht zur Bodenplatte hin weist.
In dem erfindungsgemäßen zweiten Schritt wird durch Absenken des Schneidrings (20) das im Bereich des Spalts (50) ausgetretene Fettgewebe von dem Gewebestück abgetrennt. Bevorzugt ist zur Unterstützung des Schneidvorgangs vorgesehen, dass sich der Schneidring, bevorzugt innerhalb der Schneidvorgänge, um die Längsachse der Hülse (10) bevorzugt zusätzlich drehend bewegt, um durch den ziehenden Schnitt die Abtrennung des ausgetretenen Fettgewebes zu verbessern oder zu erleichtern (2C).
In bevorzugter Ausführung des Verfahrens erfolgt die Druckbeaufschlagung durch unmittelbare fluidische Druckbeaufschlagung, ausgewählt aus pneumatischem und hydraulischem Druck, auf das Gewebestück. In bevorzugter Ausführung des Verfahrens erfolgt das Abtrennen des ausgetretenen Fettgewebes durch ein umlaufendes Ringmesser.
Beispiel: Vollautomatisierte Isolation von Fibroblasten und Keratinozyten aus Epidermis- und Dermisschichten von Hautbiopsaten.
In einem gegebenenfalls vorangehenden separaten Verfahrensablauf, der unabhängig von dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird, werden bevorzugt manuell operativ Hautgewebestücke (Biopsate) aus dem menschlichen oder tierischen Körper, bevorzugt aus dem lebenden menschlichen Körper, entnommen. Bevorzugt sind dies Präputien.
Die Gewebestücke befinden sich zu Prozessbeginn bevorzugt in einem Transportbecher in ca. 20 ml Transportmedium (bevorzugt DMEM + 1% Gentamycin). Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Biopsat zunächst durch einen Greifer, welcher das Biopsat aus dem Transportbecher nimmt und auf eine Verarbeitungsplattform ablegt, erfasst. Um das Biopsat zum automatisierten Greifen in eine definierte Lage zu bringen, wird der Transportbecher bevorzugt um ca. 40° aus der senkrechten Achse gekippt. Durch die Schwerkraft sinkt das Biopsat in die so entstandene Senke im Transportbecher ab, und damit in eine reproduzierbar definierte Lage. Das Biopsat kann so von einem entsprechend ausgelegten Greifer erfasst werden. Das Biopsat wird mit dem Greifer auf einer Verarbeitungsplattform abgelegt und für die Trennung der Gewebeschichten vorbereitet.
Zur Fettreduktion, das heißt zur Abtrennung von am Biopsat anhaftendem Fettgewebe, wird auf die mechanischen Eigenschaften des Fettgewebes gegenüber dem Dermis- und Epidermisgewebe, insbesondere das Elastizitätsmodul, zurückgegriffen. Das Biopsat wird mittels in der Vorrichtung angelegtem Unterdruck automatisch in eine zylinderförmige Hülse überführt, welche so über dem Boden eines Einweggefäßes (Petrischale) positioniert ist, das zwischen Gefäßboden und Zylinderwand ein Spalt von weniger als 1 mm entsteht. Durch einen in der Zylinderhülse laufenden Kolben oder Stempel, wird das Biopsat auf den Boden gepresst. Dabei kann der enge Spalt zwischen Zylinder und Boden nur von dem zur Seite gepressten Fettgewebe durchdrungen werden, welches so durch den Spalt nach außen gedrückt und vom übrigen Gewebe (Epidermis- und Dermisschicht) räumlich getrennt wird.
Das ausgetretene Fettgewebe wird durch Abschneiden entfernt. Dazu wird an der Außenseite der Zylinderhülse ein Schneidring abgesenkt, der das unter der Zylinderhülse hervorquellende Fettgewebe abschneidet. Der Schneidring rotiert um die Achse der Zylinderhülse, um durch den ziehenden Schnitt die Schneidwirkung zu verbessern.
Der Schneidring ist mit dem im Inneren der Zylinderhülse verlaufenden Stempel mechanisch gekoppelt, sodass zeitlich unmittelbar nach dem Herunterpressen des Biopsats auf den Gefäßboden in einem Arbeitsgang das Schneiden des nach außen hervorquellenden Fettgewebes erfolgt: Das Quetschen und Schneiden wird innerhalb einer einzigen Hubbewegung über eine speziell ausgelegte Mitnehmerhülse, die mit dem Stempel und dem Schneidring gekoppelt ist, realisiert. Zur Beabstandung der Zylinderhülse vom Gefäßboden sind Abstandshalter oder Stege vorgesehen, welche die Breite des Spalts bestimmen. Der Spalt hat eine Breite von ca. 0,8 mm.
Zur automatisierten Aufnahme und Handhabung des Biopsats verfügt der Fettseparator über eine Ansaugleitung zum Anlegen eines Unterdrucks, worüber das Biopsat in der Zylinderhülse festgehalten werden kann. Dadurch kann das Biopsat aus einer defilierten Lage angesaugt werden, bearbeitet werden und durch Positionierung des Fettseparators wieder an einen definierten Ort abgelegt werden. Es zeigt sich, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung neben der Reduktion des Fettgewebeanteils im Biopsat eine für die weitere Bearbeitung günstige Abflachung und flächige Ausbreitung des Biopsats erreicht wird. Diese hat einen überraschend positiven Einfluss auf die Effizienz der weiteren Bearbeitung, insbesondere der Trennung der Gewebeschichten (Dermisschicht, Epidermisschicht).
Für die getrennte Isolierung der beiden Zelltypen Keratinozyten und Fibroblasten aus dem Hautbiopsat werden die beiden Hautschichten Epidermis und Dermis voneinander getrennt. Dies geschieht enzymatisch über das Enzym Dispase oder ein analog wirkendes Enzym, welches eine Auflösung der zwischen Epidermis- und Dermisschicht angeordneten Basalmembran bewirkt. Dazu wird das Biopsat so vorbereitet, dass das Enzym bis zur Basalmembran in das Gewebe eindringen kann. Bevorzugt wird dazu ein Gewebehacker eingesetzt, welcher ein Schneiden des flächig ausgebreiteten Biopsats mit definierter Schnitttiefe ermöglicht. Dabei wird die Oberfläche des Biopsats, welches aus der Epidermis besteht, nur bis zum darunterliegenden Dermisgewebe durchtrennt, das heißt, das darunterliegende Dermisgewebe bleibt durch das mechanische Schneiden bevorzugt unbeeinflusst. Aufgrund der vergleichsweise höheren Sprödigkeit der obenliegenden Epidermisschicht gegenüber der zäheren darunterliegenden Dermisschicht wird durch die Hackbewegung der Klinge von oben auf die Epidermis mechanisch mit hohem Impuls eingewirkt, sodass diese quasi „zerspringt” während die tieferliegende Dermisschicht im Wesentlichen intakt bleibt.
Die Größe der Epidermisstücke wird insbesondere durch das Verhältnis aus Hackfrequenz des Messerkopfs und der Bewegungsgeschwindigkeit des Messerkopfs über dem Biopsat sowie durch die Dauer des Hackvorganges bestimmt.
Die Schneid- oder Hackwirkung des wiederkehrend bevorzugt mit einer Frequenz von ca. 1 bis 5 Hz hackenden Messers wird bevorzugt durch Verschieben des Gewebestücks auf einem Kreuztisch, welcher mit dem Hackmesser gekoppelt betrieben wird, ist auf das gesamte Gewebestück verteilt. Die Schnittführung ist damit regelmäßig, bevorzugt aber quasi-stochastisch auf der gesamten Gewebeoberfläche verteilt, sodass eine bevorzugt enge Verteilung der Größen der geschnittenen Epidermisstücke entsteht.
Anschließend wird für einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37°C in einer Enzymlösung, Dispase (4 U/mL, 20 mL) inkubiert. Das Enzym kann durch die eingeschnittene Epidermisschicht leicht zur Basalmembran vordringen. Durch die enzymatische Zerstörung der Baselmembran löst sich die eingeschnittene Epidermis in Stücken von der darunterliegenden im Wesentlichen intakten zusammenhängenden Dermis.
Die in Dispase suspendierten Epidermisstücke werden in dem nachfolgenden Schritt von der als zusammenhängendes Gewebestück erhaltenen Dermis abgetrennt. Dazu wird zunächst das Volumen der Dispaselösung durch Auffüllen mit Pufferlösung verdoppelt oder verdreifacht (auf 40 bis 60 ml) und die Dermis aus der Suspension der Epidermisstücke mittels eines Gewebegreifers automatisch entnommen und in ein separates Gefäß abgelegt. Epidermisgewebe und Dermisgewebe liegen nun in getrennten Gefäßen vor.
Zur Aufbereitung der Epidermisschicht zu vereinzelten Keratinozyten werden die Epidermisstücke mit Hilfe eines Gewebefilters, welcher an der Unterseite eines automatisierten Pipettenkopfs angebracht ist, abgetrennt, indem die Suspension über den Gewebefilter durch den Pipettenkopf abgesaugt wird, wobei die Epidermisstücke am Gewebefilter haften bleiben. Die Erhöhung des Lösungsvolumens durch das Auffüllen mit Pufferlösung unmittelbar vor der Filtration verbessert die Ausbeute an Epidermis erheblich.
Anschließend werden die am Gewebefilter festgehaltenen Epidermisstücke mittels Puffer (10 ml oder 20 ml PBS) durch Rückspülen des Gewebefilters über den Pipettenkopf in ein weiteres Gefäß überführt und dort mit einer weiteren Enzymlösung (Trypsin/EDTA, 1 mL beziehungsweise 2 ml, 0,5%, 1:10) versetzt und mechanisch durchgemischt (Vortex). Das Trypsin bewirkt, dass sich die Einzelzellen aus dem Gewebeverband der Epidermisstücke lösen. Nach Inkubation liegt (für circa 5 Minuten) eine Einzelzellsuspension aus Epidermiszellen vor.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die Enzymreaktion des Trypsins durch Zugabe von 10% FCS gestoppt. Da durch den optionalen Hackprozess bedingt schon kleine Epidermisstücke vorliegen können, kann der im manuellen Verfahren übliche Schritt der Homogenisierung der Gewebestücke vor der enzymatischen Behandlung ausbleiben. Die dadurch erreichte reduzierte mechanische Belastung der Zellen und die Verkürzung der Inkubationszeit in Trypsin auf circa 5 min führen zu einer gesteigerten Zellausbeute und Vitalität im Vergleich zum konventionellen manuellen Prozess.
Zur Unterstützung der Zellisolation wird die erhaltene Suspension in einem nachfolgenden Schritt gegebenenfalls für ca. 20 sek mechanisch durchmischt (Vortex). Zur Abtrennung von eventuell vorhandenen Geweberesten wird die Suspension zunächst über dem Gewebefilter mit 100 μm Porengröße, welche die Einzelzellen passieren lässt, abgetrennt. Dazu wird an dem automatisierten Pipettenkopf ein zweiter dem Gewebefilter in Saugströmungsrichtung nachgeschalteter Einzelzellenfilter eingesetzt. Die Suspension wird in den Pipettenkopf gesaugt, wodurch die in der Suspension gegebenenfalls noch enthaltenen Gewebereste am Gewebefilter zurückgehalten und die Einzelzellen am nachgeschalteten Einzelzellenfilter festgehalten werden. Anschließend wird der Gewebefilter zusammen mit den daran anhaftenden Geweberesten von dem automatischen Pipettenkopf abgetrennt und gegebenenfalls verworfen. Die im Einzelzellenfilter im Pipettenkopf verbleibenden Einzelzellen werden durch Rückspülen des Einzelzellenfilters aus dem Pipettenkopf gespült. Dazu wird auf den Pipettenkopf anstelle des Gewebefilters eine Pipettenspitze gesetzt und die Einzelzellen durch Rückspülen des Einzelzellenfilters in die Pipettenspitze verbracht. Optional wird die Zellzahl in der Suspension bestimmt. Dazu wird ein Teil der Einzelzellsuspension aus der Pipettenspitze in eine Zellzählkammer dosiert und aus der in diesem Teilvolumen gefundenen Zellzahl auf die Gesamtzellzahl in der Pipettenspitze geschlossen. Gegebenenfalls wird durch Austausch der Suspendierlösung im Pipettenkopf in Abhängigkeit von der gefundenen Zellzahl neues Medium zudosiert, sodass eine Zellsuspension aus Epidermiszellen mit definierter Zellkonzentration erhalten wird.
Zur Aufbereitung der Dermisschicht zu Fibroblasten wird die Dermisschicht in einer Kollagenaselösung (20 ml) für einen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellausbeute ist unter anderem abhängig von der Inkubationsdauer. Mit zunehmender Inkubationsdauer steigt der Grad der Auflösung des Dermisgewebes. Die Fibroblasten, die sich bei der Enzymbehandlung aus dem Gewebe herauslösen, werden durch analoge Filtrationsschritte mit Gewebefilter und Einzelzellenfilter, die optional mit dem automatisierten Pipettenkopf, wie vorstehend für die Epidermiszellen dargestellt, abgetrennt. Alternativ werden nicht aufgelöste Dermisgewebeteile bevorzugt mittels eines automatisierten Greifers entnommen. Die Dermiszellen werden anschließend optional mittels des automatisierten Pipettenkopfs auf eine bestimmte Zellkonzentration eingestellt.
Das automatisierte Verfahren ist so ausgelegt, dass es GMP-konform betrieben werden kann. Die Modularität der Einzelautomatisierungsschritte erlaubt eine hohe Flexibilität bezüglich des eingesetzten Gewebes und der gewünschten Anwendung, einschließlich der Möglichkeit, einzelne Verarbeitungsschritte auszuführen.

Claims

Vorrichtung zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängendem Fettgewebe, enthaltend: – Mittel zum Beaufschlagen des flächig auf einem Bodenelement aufliegenden Gewebestücks in einem ersten Bereich innerhalb der Ausdehnung des Gewebestücks mit Flächendruck, so dass dadurch Fettgewebe aus dem mit Druck beaufschlagten ersten Bereich in einen angrenzenden nicht mit Druck beaufschlagten zweiten Bereich austritt; und – Mittel zum Abtrennen des ausgetretenen Fettgewebes von dem Gewebestück.
Vorrichtung nach Anspruch 1, enthaltend: – Hülse (10) mit oberem Ende (14) und unterem Ende (12); – Bodenelement (40), das das untere Ende (12) der Hülse überdeckt, und von der Hülse (10) beabstandet ist und zwischen Bodenelement (40) und unterem Ende (12) der Hülse ein umlaufender Spalt (50) gebildet ist; und – Stempel (30), der in der Hülse (10) verschiebbar beweglich angeordnet ist und die Hülse (10) zum oberen Ende (14) hin dichtend abschließt und damit innerhalb der Hülse ein Raum (60) zur Aufnahme des Gewebes gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend: – Schneidring (20), der die Hülse (10) an deren Außenseite um läuft und an der Hülse verschiebbar beweglich angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Schneidring (20) einen nach unten zum Bodenelement (40) hin weisenden umlaufenden Schneidkeil (25) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Schneidring (20) auf das Bodenelement (40) absenkbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei der Schneidring (20) im Bereich des Spalts (50) mit dem unteren Ende (12) der Hülse ein scherschneidendes Wirkelement bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der Schneidring (20) im Bereich des Spalts (50) mit dem Bodenelement (40) ein messerschneidendes Wirkelement bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei der Schneidring (20) zur Unterstützung der Schneidwirkung um die Hülsenachse koaxial rotierbar angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei der Spalt (50) eine Breite von 1 mm oder weniger aufweist
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei eine unmittelbare fluidische (pneumatische, hydraulische) Druckaufbringung vorgesehen ist, um ein aufgenommenes Gewebe mit komprimierendem Druck zu beaufschlagen.
Verfahren zum Abtrennen von an einem biologischen Gewebestück anhängendem Fettgewebe, enthaltend die Schritte: – Beaufschlagen des flächig auf einem Bodenelement aufliegenden Gewebestücks in einem ersten Bereich innerhalb der Ausdehnung des Gewebestücks mit Flächendruck, so dass dadurch Fettgewebe aus dem mit Druck beaufschlagten ersten Bereich in einen angrenzenden nicht mit Druck beaufschlagten zweiten Bereich austritt; und – Abtrennen des ausgetretenen Fettgewebes von dem Gewebestück.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der mit Druck beaufschlagte erste Bereich von dem angrenzenden nicht mit Druck beaufschlagten zweiten Bereich durch eine Hülse abgetrennt wird, die von dem Bodenelement beabstandet ist und an ihrem unteren Ende mit dem Bodenelement einen umlaufenden Spalt bildet, worüber der erste Bereich mit dem zweiten Bereich in Verbindung steht.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Druckbeaufschlagung durch Absenken eines Stempels auf das Gewebestück erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Druckbeaufschlagung durch unmittelbare fluidische Druckbeaufschlagung, ausgewählt aus pneumatischem und hydraulischem Druck, auf das Gewebestück erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Abtrennen des ausgetretenen Fettgewebes durch ein umlaufendes Ringmesser erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das Gewebestück menschliches oder tierisches Hautgewebe, zumindest aufweisend Epidermis- und Dermisschicht, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, enthaltend die Schritte: – Bereitstellen von Spendergewebe; – Durchführen der Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 16; und – Sammeln des von dem Spendergewebe abgetrennten Fettgewebes.