DE69624483T2

DE69624483T2 - Umkehrbarer membraneinsatz zur kultivierung von zellen

Info

Publication number: DE69624483T2
Application number: DE69624483T
Authority: DE
Inventors: Gregory Mathus
Original assignee: Corning Inc
Current assignee: Corning Inc
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2003-06-18
Anticipated expiration: 2016-08-03
Also published as: CN1192233A; US5759851A; DE69624483D1; CN1093562C; EP0842262A1; AU6645396A; EP0842262B1; JPH11510394A; WO1997006240A1

Description

EINFÜHRUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vorrichtungen und Verfahren zur Kultivierung von Zellen oder Geweben in vitro. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Kultivierung von Geweben, Zellen oder Zellinien auf einander gegenüberliegenden Flächen eines sterilen Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils, das in einem Gewebekulturmedium eingetaucht ist und/oder in der Schnittstelle Medium/Luft angeordnet ist.
Bei Laboruntersuchungen besteht die Notwendigkeit, in Gewebekulturen die Wechselwirkung von Zelle zu Zelle mit verschiedenen Zellpopulationen zu studieren, die durch mikroporöse Membranen voneinander getrennt sind. Man ist der Ansicht, daß die Wechselwirkung von Zelle zu Zelle bei der Steuerung des zellulären Wachstums und der zellulären Differenzierung eine wichtige Rolle spielt. Während des Vorgangs der embryonalen Determinierung ist der Kontakt von Zelle zu Zelle für viele Zelltypen wichtig. Über die embryonale Entwicklung hinaus glaubt man, daß das Wachstum und die embryonale Differenzierung vieler anderer Zelltypen von der Wechselwirkung zwischen den Zellen abhängig ist. Zum Beispiel glaubt man, daß die Differenzierung von Myoplasten zu Myotuben von dem Kontakt zwischen undifferenzierten Zellen abhängt. Die Entwicklung und Aktivierung von Lymphozyten hängt ebenso von dem Kontakt von Zelle zu Zelle ab. Eine große Vielzahl von Zelltypen und Geweben wird von dieser Wechselwirkung von Zelle zu Zelle bestimmt.
Obwohl es nicht bekannt ist, warum ein Kontakt von Zelle zu Zelle Veränderungen in der zellulären Entwicklung und Differenzierung verursachen kann, untersuchen Wissenschaftler verschiedene Hypothesen in der Hoffnung, diese Frage beantworten zu können. Eine der vorgeschlagenen Hypothesen ist, daß der Kontakt an der Oberfläche einer Zelle mit einer anderen zu Veränderungen in der Genexpression führt als Ergebnis einer Wechselwirkung mit einem Oberflächenrezeptor oder einem anderen Signalmechanismus. Eine andere Hypothese besteht darin, daß eine Zelle eine Schicht aus einer auf der Zelloberfläche befindlichen extrazellulären Matrix erzeugen könnte und daß gerade diese extrazelluläre Matrix, die mit einer zweiten Zelle in Berührung steht die sich daraus ergebenden Veränderungen der Genexpression der zweiten Zelle verursacht. Andererseits haben einige Forscher die Hypothese aufgestellt, daß die Wechselwirkung von Zelle zu Zelle nicht so sehr von dem physischen Kontakt zwischen den Zellen abhängt, sondern viel eher von dem Kontakt mit Faktoren, die von den Zellen produziert und in die Umgebung freigesetzt werden. Einige Zellen erzeugen Faktoren, die in der Lage sind unmittelbar in der Umgebung zu wirken, während andere Zellen Faktoren erzeugen, die langlebig sind und zu entfernten Orten im Körper transportiert werden können.
Gegenwärtig werden unterschiedliche Techniken benutzt, um die Wechselwirkung von Zelle zu Zelle zu untersuchen, aber keine davon ist völlig befriedigend, weil sie eine große Zahl von Manipulationen erfordern und mit dem Risiko von Verunreinigungen verbunden sind. Bei einer dieser Techniken schwimmt eine mikroporöse Membran in einem Medium für eine Gewebekultur und ein erster Zelltyp wird auf einer der Oberflächen gezüchtet. Die Membran wird dann umgedreht und ein zweiter Zelltyp wird auf der anderen Oberfläche gezüchtet. Bei vielen Anwendungen ist diese Technik ungeeignet, weil es darauf ankommt, die Zellkultur und das Medium auf der einen Oberfläche der Membran vollständig von der Zellkultur und dem Medium auf der anderen Seite zu isolieren.
Eine allgemein angewandte Technik zum Studium der Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle, bei der die Freisetzung eines Faktors durch eine Zellgruppe Veränderungen in einer anderen Zellgruppe bewirkt, macht die Verwendung eines konditionierten Mediums notwendig. Ein konditioniertes Medium ist ein Medium, das in der Gegenwart einer ersten Zellgruppe während eines so langen Zeitraumes bebrütet wird, bis die Zellen Faktoren in das Medium abgesondert haben. Dann wird eine zweite Zellgruppe als einschichtige Lage mit geringer Dichte aufgebracht; anschließend wird die dünn aufgebrachte, einschichtige Lage von Zellen mit dem konditionierten Medium bebrütet, um die Wirkung der Faktoren auf die Zellen zu untersuchen. Ein Problem ist dabei das Risiko der Verunreinigung verursacht durch häufige Manipulationen und eine größere Dauer der Bebrütung. Ein anderes Problem besteht darin, daß einige der Faktoren nur während sehr kurzer Zeitabschnitte wirksam sind (machmal nur für Bruchteile von Minuten) und es somit notwendig ist, sie mit der zu beeinflussenden Zelle unmittelbar in Berührung zu bringen, um irgendein Ergebnis zu erhalten. Bei der Anwendung traditioneller Techniken auf konditionierte Medien ist es sehr schwierig oder unmöglich kurzlebige oder instabile Faktoren zu untersuchen.
Eine andere, in der Vergangenheit angewandte Technik bestand darin, eine Membran zwischen zwei Ringe aus Plastik oder Metall einzuklemmen und diese Einheit bis zu einer Tiefe einzutauchen, die größer ist als die Membran. Der erste Zelltyp wird auf der oben liegenden Fläche gezüchtet; dann wird die Einheit gedreht und ein zweiter Zelltyp wird auf der gegenüber liegenden Seite der Membran gezüchtet. Bei dieser Technik begegnet man häufig Schwierigkeiten, weil der erste Zelltyp die mikroporöse Membran verstopft, was eine Blockade durch Luft und entsprechende Luftblasen unter der Membran und im Inneren des Klammerrings erzeugt, wenn die Einheit umgewendet wird, um den zweiten Zelltyp zu züchten. (Eine Luftblase kann die Zellkultur auf der Membran zerstören oder kann verhindern, daß Transportuntersuchungen korrekt durchgeführt werden können). Um dieses Problem zu vermeiden, verwendet man manchmal eine Bohrung und einen Stopfen in der Seitenwand der Klammer derart, dass man die Bohrung öffnen kann um Luft entweichen zu lassen. Anschließend wird die Bohrung wieder durch den Stopfen geschlossen, um die Trennung zwischen den beiden Zelltypen aufrecht zu erhalten. Diese Lösung ist unbefriedigend, weil es schwierig ist, den Stopfen herauszunehmen und wieder einzusetzen und dabei die ganz wesentlichen sterilen Bedingungen aufrecht zu erhalten; außerdem ist es schwierig festzustellen, ob alle Luft entfernt wurde.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, die es dem Benutzer möglich macht, Zellen auf beiden Seiten einer Membran unter sterilen Bedingungen zu züchten derart, dass man die Wechselwirkung von Zelle zu Zelle bestimmen kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung besteht in einer leicht herzustellenden Einrichtung, die ein rohrförmiges Gehäuse umfasst, das an beiden Enden offen ist und das dazu geeignet ist, auf jedem seiner Enden in einem Kulturbehälter zu stehen. Ein Rahmen weist eine solche Größe auf, dass er innerhalb des rohrförmigen Gehäuses gleiten kann. In diesem ist ein Kultur-Retentionsteil, wie z. B. ein mikroporöses Zellen- oder Gewebe-Retentionsteü über dessen Innendurchmesser und eine Dichtung an dessen Aussenumfang angebracht. Das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil umfaßt eine mikroporöse Membran. Die Dichtung dichtet den Rahmen gegen die Innenfläche des Gehäuses ab und verhindert, daß Medium über den ringförmigen Rahmen von einer Seite auf die andere fließt. Der Rahmen ist in dem Gehäuse nahe dessen einem Ende angeordnet und das Gehäuse steht auf diesem Ende in dem Behälter. Der untere Teil des Gehäuses und ebenso die obere und untere Fläche des Zellen- oder Gewebe- Retentionsteils sind in das Medium eingetaucht, wobei Zellen auf der oberen Fläche gezüchtet werden können. Wenn eine einlagige Schicht gezüchtet wird, wird das Gehäuse gedreht und der Rahmen wird an das entgegengesetzte Ende bewegt (das andere Ende auf dem der Körper jetzt steht). Dies erlaubt es, Zellen auf der anderen Seite des Zellen oder Gewebe-Retentionsteils zu züchten.
In einem Ausführungsbeispiels der Erfindung wird eine Festhaltevorrichtung vorgesehen. Die Festhaltevorrichtung ist so dimensioniert, dass sie innerhalb des Gehäuses angeordnet und den Rahmen so fassen kann, dass sie diesen mit seinem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil in dem gewünschten Abstand von dem Ende des Gehäuses positionieren kann, auf dem das Gehäuse steht. Es ist ein Stoppmechanismus vorgesehen derart, dass der Rahmen durch die Festhaltevorrichtung in eine genaue Lage gebracht werden kann. Bei einem Ausführungsbeispiel besteht der Stoppmechanismus aus der Festhaltevorrichtung und ist in Form eines Zylinders ausgebildet, der an einem Ende einen Flansch aufweist, der über den Durchmesser des rohrförmigen Körpers hinaussteht und am anderen Ende einen Zylinder aufweist, der so groß ist, dass er in den rohrförmigen Körper paßt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel hat das Gehäuse an einem Ende Fortsätze, die sich nach innen gegen das Zentrum des Gehäuses erstrecken und auf denen der Rahmen ruhen kann. In diesem Ausführungsbeispiel ist die Festhaltevorrichtung innerhalb des rohrförmigen Körpers so eingepaßt, dass sie mit dem Rahmen in Eingriff treten und den Rahmen in Kontakt mit den Fortsätzen bewegen kann. Dieser Stoppmechanismus ist so angeordnet, dass der Rahmen in eine geeignete Position am anderen Ende des Gehäuses bewegt wird.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung hat jedes Ende des Körpers Unterbrechungen, wie z. B. Kerben oder Füße, die das Ende des Gehäuses von der Oberfläche des das Medium enthaltenden Behälters abheben. Dies erlaubt eine Bewegung und einen Austausch des Mediums unterhalb des Zellen- oder Gewebe- Retentionsteils.
Ein anderes Merkmal der Erfindung besteht darin, dass der Rahmen, der das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil abstützt, aus dem Gehäuse herausgenommen werden kann, um es in eine andere Vorrichtung, wie z. B. in eine Durchströmkammer einzusetzen oder in einem ständigen Register aufzubewahren.
Diese Erfindung ist auch für in Schichten angeordnete Zellkulturen nützlich, um die Wechselwirkung von Zelle zu Zelle zu untersuchen. Dies kann durchgeführt werden, indem man zuerst Zellen auf einem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil züchtet (oder unterschiedliche Zellen auf beiden Seiten eines ersten Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils), und zusätzliche Rahmen mit getrennten Zellen- oder Gewebe-Retentionsteilen in dem Gehäuse anordnet und einschichtige Kulturen auf dem zusätzlichen Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil züchtet.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt einen Bausatz zum Züchten von Zellen oder Geweben, um die Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle zu untersuchen.
Die Erfindung kann durch die folgende, detaillierte Beschreibung eines beispielhaften Ausführungsbeispiels, das in den Zeichnungen dargestellt ist, besser verstanden und bewertet werden:

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Es zeigen:
Fig. 1 eine Explosionsdarstellung eines beispielsweisen Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Kulturvorrichtung;
Fig. 2 eine vertikale Schnittansicht der Gehäuseabstützung und der Zellen- Retentionsmembran mit ihrem Tragrahmen, der einen Teil der Vorrichtung gemäß Fig. 1 enthält;
Fig. 3 einen Vertikalschnitt ähnlich dem der Fig. 2 mit einer Festhaltevorrichtung zum Gebrauch mit daran montierten Teilen, um das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil innerhalb des Gehäuses zu positionieren;
Fig. 4 einen Vertikalschnitt des montierten Gehäuses und Rahmens mit seinem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil, das in einem Kulturbehälter angeordnet ist und das Wachstum von Zellen auf der oberen Fläche des Zellen- oder Gewebe- Retentionsteils zeigt;
Fig. 5 einen der Fig. 4 ähnlichen Vertikalschnitt, der den umgedrehten Körper in dem Kulturbehälter zeigt;
Fig. 6 einen Vertikalschnitt ähnlich dem der Fig. 5, der den Gebrauch der Festhaltevorrichtung zeigt, um den Rahmen und das Zellen- oder Gewebe- Retentionssteil in der gewünschten Stellung zu positionieren, um Zellen auf der gegenüberliegenden Seite des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils zu züchten;
Fig. 7 einen Vertikalschnitt, der das Wachstum des zweiten Zelltyps auf der gegenüberliegenden Seite des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils zeigt;
Fig. 8A einen vergrößerten Vertikalschnitt eines zweiten Ausführungsbeispiels des Rahmens und des Zellen-Retentionsteils;
Fig. 8B eine schematische Ansicht von Gehäuse und Abstützung, der den erzielten Vorteil des Ausführungsbeispiels der Fig. 8A zeigt;
Fig. 9 den Vertikalschnitt eines anderen Ausführungsbeispiels von Gehäuse und Festhaltevorrichtung gemäß der Erfindung;
Fig. 10 einen Vertikalschnitt einer Mehrzahl von Rahmen in dem Gehäuse; und
Fig. 11 einen Vertikalschnitt einer Mehrzahl von Rahmen in einer anderen Ausrichtung innerhalb des Gehäuses.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

In Fig. 1 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung für das Wachstum von Geweben oder Zellen dargestellt. Die drei Hauptziele der Vorrichtung gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel umfassen ein rohrförmiges Gehäuse 10, einen Rahmen 12 mit seinem Zellen-Retentionsteil in Form einer multiporösen Membran 14 und eine Festhaltevorrichtung. Das Gehäuse 10 und der Rahmen 12 werden beim Gebrauch der Vorrichtung zusammengesetzt, während die Festhaltevorrichtung dazu verwendet wird, den Rahmen an geeigneter Stelle in dem Gehäuse so anzuordnen, daß das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil oberhalb des Bodens des Zuchtbehälters den gewünschten Abstand hat, wie dies ausführlicher unten beschrieben wird.
Das Gehäuse 10 besteht aus einer zylindrischen Seitenwand 18 und kann aus irgendeinem Material hergestellt werden, das als Flüssigkeitsbarriere genügend Festigkeit aufweist. Beispiele von verwendbaren Materialien sind Thermoplaste (wie z. B. Styrol, Lexan und Polyester) und Aluminium. Bei der Verwendung von Thermoplasten kann das Gehäuse durch übliche Spritzgussverfahren hergestellt werden. Jedes Ende 20 und 22 des Gehäuses hat eine Abstützung, die aus einer Anzahl von mit Abstand angeordneten Füßen 24 besteht und die durch Einkerbungen voneinander getrennt sind. In dem in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiel sind drei Füße 24 an jedem Ende vorgesehen, obwohl nur zwei in der gezeigten Ansicht dargestellt sind. Die Füße dienen dazu, das Gehäuse in einem Kulturbehälter W abzustützen, wie dies in Fig. 4 dargestellt ist, wobei die Einkerbungen 26 Durchflußöffnungen darstellen, durch die das Medium von der Außenseite des Gehäuses 10 in den Raum unterhalb des Rahmens 12 des Zellen- und Gewebe-Retentionsteil 14 und oberhalb der Bodenwandung 58 des Behälters W durchtreten kann, wie dies weiter unten in Verbindung mit dem Gebrauch der Vorrichtung näher beschrieben wird. Die an jedem Ende angebrachten Füße 24 können das Gehäuse an jedem nach unten gerichteten Ende innerhalb des Behälters vertikal abstützen, wobei die Einkerbungen 14 es dem Medium in jeder Stellung ermöglichen in den Raum unterhalb des Rahmens 12 und dem Zellen- und Gewebe- Retentionsteil und oberhalb des Gehäusebodens einzutreten.
Der Rahmen 12, der ebenso aus thermoplastischem Material, wie z. B. Styrol oder einigen anderen, mit der durchgeführten Untersuchung oder dem Experiment verträglichen Materialien hergestellt sein kann, weist einen äußeren Durchmesser auf, der gerade klein genug ist, um innerhalb des Gehäuses 10 leicht zu gleiten. Die äußeren Kanten 32 des Rahmens 12 können abgeschrägt sein, wie dies in den Zeichnungen gezeigt ist, um das Einsetzen des Rahmens in das Gehäuse zu erleichtern. Eine O-Ring Aufnahme 34 mit einem O-Ring 38 ist in der Umfangsfläche 36 des Rahmens 12 vorgesehen, die eine Dichtung um den Rahmen herum bilden und verhindern, daß Kulturmedium vom Boden des Rahmens aus nach oben und damit an dem Zellen- und Gewebe-Retentionsteil 14 vorbei zu seiner oberen Fläche innerhalb des Gehäuses fließen kann. Es können auch andere Methoden zur Abdichtung eingesetzt werden. Eine Seite 40 des Rahmens trägt eine kurze Auflage 42, auf der ein Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil befestigt sein kann. Der Rahmen wirkt als Abstützung, der innerhalb des Gehäuses axial gleiten kann. In dem in den Zeichnungen dargestellen Ausführungsbeispiel ist das Gehäuse im wesentlichen zylindrisch und der Rahmen ist als Kreisring ausgebildet.
Der Rahmen weist eine zentrale Bohrung 43 auf, die sich von der ersten Seite 40 des Rahmens zu der zweiten Seite 45 des Rahmens erstreckt. Die Bohrung kann im wesentlichen zylindrisch ausgebildet sein. In einem anderen in Fig. 8A gezeigten Ausführungsbeispiel ist die Bohrung 43a in dem Rahmen 12 abgeschrägt ausgebildet in der Weise, daß der Innendurchmesser auf der ersten Seite 40a des Rahmens kleiner ist als der Innendurchmesser der Bohrung auf der zweiten Seite 45a des Rahmens. Der Vorteil einer abgeschrägten Bohrung wird weiter unten beschrieben.
Das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil 14, das auf dem Rahmen angebracht ist, kann aus irgendeinem Material geformt sein, das dazu geeignet ist, Zellen oder Gewebe im wesentlichen isoliert von einem direkten Kontakt mit dem Medium in dem Behälter zu tragen, während es wenigstens ausgewählten Stoffen erlaubt, hindurchzudringen und die Zellen zu berühren. Solche Materialien umfassen mikroporöse Membranen, wäßrige Gele, Ultrafiltrationsmembranen oder mehrschichtige Kombinationen, wie ein auf ein Sieb aufgebrachtes Gel. Das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil 14 kann eine mikroporöse, geätzte oder gegossene Membran sein, die durch Heißschmelzen, Bindung mit einem Lösemittel, Ultraschallschweißen, Klemmung oder eine andere Methode mit dem Rahmen 12 verbunden ist, die die Eigenschaften des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil oder das Wachstum der Zellen auf dem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil nicht nachteilig beeinflussen darf Das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil kann auch behandelt werden, um verschiedene Oberflächen zum Festhalten der Zellen zu erhalten. Unterschiedliche Zelltypen legen sich vorzugsweise an unterschiedlichen Oberflächen fest. Wenn man somit unterschiedliche Oberflächen zum Festlegen der Zellen vorsieht, kann der Vorgang der Festlegung von Zellen manipuliert und untersucht werden, wobei unterschiedliche Oberflächen eingesetzt werden können, um die Bindungseigenschaften besonderer Zelltypen zu untersuchen. Es kann sich beispielsweise ein besonderer Zelltyp an einem besonderen Typ von Integrin binden, aber nicht an einen anderen. Wenn man somit die Oberfläche des Zellen- Retentionsteils mit unterschiedlichen Typen von Integrin behandelt, dann kann man die Übereinstimmung des Integrin-Rezeptors, der sich auf dem besonderen untersuchten Zelltyp ausprägt, bestimmen, indem man den Typ von Integrin feststellt, mit der die Zelle in Wechselwirkung getreten ist.
Die behandelte Oberfläche des Zellen-Retentionteils kann mit einem besonderen Zelltyp in Wechselwirkung treten, um sich entweder an der Oberfläche festzusetzen, oder in dem man die Zellen daran hindert sich festzusetzen. Die Oberfläche des Zellen-Retentionsteils kann behandelt werden, indem man diese mit einer Stoffzusammensetzung behandelt, die die erwünschten Eigenschaften zum Festsetzen der Zellen aufweist. Der hier verwendete Begriff der Zellfestsetzeigenschaften umfasst jede Eigenschaft einer Stoffzusammensetzung, die Zellen veranlaßt, sich an der Stoffzusammensetzung festzusetzen oder Zellen daran hindert, sich an der Stoffzusammensetzung festzusetzen. Beispiele von eingesetzten Stoffzusammensetzungen umfassen, aber sind nicht eingegrenzt auf extrazelluläre Matrixproteine, Integrine und Antikörper. Die extrazellulären Matrixproteine können natürlich oder synthetisch sein. Natürliche, extrazelluläre Matrixproteine umfassen z. B. Kollagen, Laminin und Fibronectin. Synthetische extrazelluläre Matrixproteine umfassen synthetische Analoge und definierte Peptide.
Eine behandelte Oberfläche kann auch vorteilhaft sein, um einen einzigen Zelltyp von einer Gewebeprobe, die eine Mischung von Zelltypen enthält, zu isolieren. Oft ist es erwünscht einen Zelltyp von anderen innerhalb einer gemischten Gewebeprobe zu isolieren. Wenn der erwünschte Zelltyp Bindungseigenschaften aufweist, die von denjenigen, mit denen er vermischt ist verschieden sind, dann kann die Oberfläche des Zellen-Retentionsteils so beeinflußt werden, daß sie selektiv den erwünschten Zelltyp bindet, aber nicht den anderen.
Die Oberfläche des Zellen-Retentionsteils kann auch behandelt werden, um ganz allgemein die Zellbindung zu verbessern in der Weise, daß sich der Zelltyp vorzugsweise an das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil bindet, aber nicht an andere Teile der Vorrichtung. Dies kann erreicht werden, indem man das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil so behandelt, daß es eine hydrophile Oberfläche erhält, d. h. durch eine chemische oder Plasmabehandlung.
Das Zellen-Retentionteil kann auch in Bereiche aufgeteilt werden, wobei jeder Bereich mit einem anderen Mittel behandelt wird, um eine Mehrzahl von Haftoberflächen auf dem Zellen-Retentionsteil zu erhalten derart, daß jeder Bereich einen anderen Zelltyp aufnimmt.
Die Festhaltevorrichtung 16 kann aus einem Thermoplast bestehen, wie z. B. Styrol, wie auch die anderen Teile der Vorrichtung. In einem Ausführungsbeispiel kann die Festhaltevorrichtung aus einem Tauchkolben 50 und einer Handhabe oder einem Flansch 52 mit einer gerändelten äußeren Fläche bestehen. Die Handhabe oder der Flansch weisen einen Durchmesser auf, der größer als der Innendurchmesser des Gehäuses 10 ist; in der dargestellten Form ist er ebenso größer als der Außendurchmesser des Gehäuses. Die Unterseite des Handhabe 52 bildet eine Schulter 54, die mit demjenigen Ende des Behälter in Eingriff steht, durch das der Tauchkolben 50 eingeführt wird, um den Rahmen 12 und das dazugehörige Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil 14 in dem Gehäuse zu orientieren. Der Außendurchmesser des Tauchkolbens 50 ist etwas kleiner, als der Innendurchmesser des Gehäuses 10, sodaß er in das Gehäuse eingeführt und mit dem Rahmen 12 in Eingriff kommen und ihn axial in das Gehäuse in die gewünschte Stellung eingeschieben kann. Der Innendurchmesser des Tauchkolbens ist vorzugsweise größer als der Durchmesser der Auflage 42, sodaß das Ende 56 des Tauchkolbens nicht mit dem Zellen- oder Gewebe-Retentionteil 14 in Eingriff kommt, das mit dem Rahmen verbunden ist, wenn die Festhalteeinrichtung in das Gehäuse 10 eingeführt wird, um den Rahmen und sein Zellen- oder Gewebe-Retentionteil in die richtige Stellung zu bringen. Diese Beziehung ist in Fig. 3 deutlich dargestellt.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 9 ist ein Anschlag 60 vorgesehen, wobei Vorsprünge 64 vom einen Ende des Gehäuses 62 und zu dessen Zentrum hin in dieses hineinragen, auf denen der Rahmen 12 aufliegen kann. In diesem Ausführungsbeispiel, hat die Festhaltevorrichtung 66 eine Form, die der des rohrförmigen Gehäuses entspricht derart, daß sie mit dem Rahmen in Eingriff kommen und diesen in Berührung mit den Vorsprüngen 64 am anderen Ende des Gehäuses 62 bringen kann. Dieser Anschlag 60 ist so ausgebildet, daß der Rahmen durch die Festhaltevorrichtung nur in eine genau vorgegebene Stellung bewegt werden kann.
In den Fig. 4-7 ist der Gebrauch der Vorrichtung zum Züchten von Zellen oder Geweben auf beiden Seiten des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils dargestellt. Gemäß Fig. 4 besteht die Anordnung aus dem Gehäuse 10, dem Rahmen 12, und dem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil 14 und ist gezeigt, wie er mit den Füßen 24 auf den Ende 20 des Gehäuses W steht und dabei mit der Bodenwandung 58 in Eingriff ist. Der Rahmen 12 ist in seiner ausgerichteten Lage und das Zellen- oder Gewebe- Retentionsteil 14 ist auf der Oberseite des Rahmens (auf der Seite 40) angeordnet, wobei der Rahmen nahe dem unteren Ende 20 des Gehäuses angeordnet ist. Die genaue Lage des Rahmens kann mit Hilfe der Festhalteeinrichtung 16 erreicht werden. Eine Zellen- oder Gewebeprobe wird auf der Oberfläche des Zellen- oder Gewebe- Retentionsteils 14 aufgebracht und ein Kulturmedium wird in den Behälter W auf der Außenseite des Gehäuses eingegeben. Es sollte darauf geachtet werden, daß das Medium nur auf der Außenseite des Gehäuses eingegeben wird, um die Möglichkeit von Lufteinschlüssen an der Unterseite des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils möglichst klein zu halten. Das Medium fließt dabei durch die Einkerbungen 26 zwischen den Füßen 24, auf denen das Gehäuse steht und benetzt die Unterseite des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils. Wenn das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil benetzt ist, wird ein zusätzliches Medium und die Zellen auf der Oberfläche des Teils aufgebracht. Die Zellen werden durch das Medium genährt, das diese sowohl durch das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil erreicht, als auch durch das Medium oberhalb des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils. Dies kommt den Bedingungen, unter denen normale Zellen und Gewebe in einem lebenden Körper wachsen sehr nahe.
Wenn die Bohrung, wie in Fig. 8A bei 43a und 43b gezeigt, abgeschrägt ist, kann die Vorrichtung zur Züchtung von Gewebe- oder Zellen in dem Behälter mit Kulturmedium mit einem Minimum an Lufteinschlüssen angeordnet werden. Wenn die Vorrichtung in das Kulturmedium mit einem Winkel abgesenkt wird derart, daß die abgeschrägte Wand der Bohrung 43b im wesentlichen parallel mit der Oberfläche des Kulturmediums 11 ist, dann kann die Luft entweichen und man vermeidet, das sie unter dem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil eingeschlossen wird. Dies ist in der schematischen Darstellung von Fig. 8B gezeigt.
Wenn sich die Zellen ausgebildet haben, wird das Gehäuse 10 mit dem Rahmen und dem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil in dem Behälter W gedreht (oder es kann in einem anderen Behälter eingebracht werden) und der Rahmen wird bis zu dem unteren Ende des Gehäuse bewegt, wie dies in den Fig. 5 und 6 dargestellt ist. Die Festhalteeinrichtung 16 wird dazu verwendet, um den Rahmen 12 in seine genaue Stellung zu bringen. Die Länge des Tauchkolbens 50 wird, gemessen von der Schulter 54 bis zum Ende 56, so vorgegeben, daß die gewünschte Stellung des Rahmens erreicht wird. Nachdem die Festhalteeinrichtung entfernt ist, wird eine zweite Probe auf die neue Oberfläche des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils aufgebracht und es kann ein zusätzliches Medium in den Behälter eingebracht werden. Die Probe auf der neuen Oberfläche wird in erster Linie von dem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil genährt. Diese Schichtung von zwei Zelltypen, die durch ein Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil voneinander getrennt sind, simuliert die Bedingungen in vitro.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die Wahrscheinlichkeit, daß Luftblasen unter dem Teil eingeschlossen werden, dadurch auf ein Minimum beschränkt, daß das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil auf einer Seite des Rahmens angeordnet wird. Die Zellen sollten zuerst auf der Seite des Zellen- oder Gewebe- Retentionsteils aufgebracht werden, die von der Bohrung des Rahmens abgewandt ist. Wenn das Teil in einer solchen Lage ist, daß es sich oberhalb der Bohrung des Rahmens befindet, und wenn Medium von der Unterseite des Teils vor dem Zufügen von Zellen zugegeben wird, dann ist der Einschluß von Luftblasen auf ein Minimum beschränkt, weil Luft durch das trockene Teil entweichen kann. Nachdem die Zellen eine einschichtige Lage auf dem Retentionsteil bilden, kann die Vorrichtung so gedreht werden, daß die Oberfläche des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils, die gegen die Bohrung positioniert ist, nach oben zeigt und ein zweiter Satz von Zellen auf diese Oberfläche aufgebracht werden kann. In der gedrehten Stellung bilden der Rahmen und die Oberfläche des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils eine ebene Oberfläche ohne Bohrung. Wenn die ebene Oberfläche des Zellen-Retentionsteils durch die Festhalteeinrichtung in eine Stellung geschoben wird, in der es mit den Einkerbungen auf dem Gehäuse fluchtet, dann wird ein Lufteinschluß unter dem Zellen-Retentionsteil vorgebeugt, weil die Luft durch die Einkerbungen entweichen kann.
Der Begriff "Zelle" soll in dem hier verwendeten Sinn alle Arten von Zellen einschließen, z. B. bestehende Zellinien, primäre Kulturzellen und isolierte Gewebe. Somit soll eine Bezugnahme auf eine Vorrichtung oder ein Teil zur Kultivierung oder zum Zurückhalten von Zellen stets auf eine Vorrichtung zum Gebrauch für jede Art von Zellen oder Geweben hinweisen.
Viele Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle können mit Hilfe der Kulturvorrichtung und des Verfahrens gemäß der Erfindung bei Zellen oder Geweben untersucht werden. Jede Wechselwirkung von Zelle zu Zelle ist eine Kontakt zwischen einer ersten und einer zweiten Zelle. Wechselwirkungen von Zelle zu Zelle können direkt oder indirekt sein. Bei einer direkten Wechselwirkung von Zelle zu Zelle ist die Oberfläche der ersten Zelle in direktem Kontakt mit der Oberfläche der zweiten Zellen. Eine direkte Wechselwirkung von Zelle zu Zelle kann eine Transmigration von Zellen, d. h. eine Zellbewegung, einschließen. Bei einer indirekten Wechselwirkung von Zelle zu Zelle kommt eine erste Zelle in Kontakt mit den Faktoren, die von einer zweiten Zelle erzeugt und abgegeben werden. Die Oberfläche der Zelle umfaßt die Zellmembran, jede Art von Oberflächen-Rezeptoren oder andere Proteine, ebenso jede Art von extrazellulärer Matrix, die von der Zelle erzeugt und auf ihrer Oberfläche abgeschieden werden.
Die Poren des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils haben einen Durchmesser der so bemessen ist, daß eine Wechselwirkung von Zelle zu Zelle möglich ist. Der Durchmesser der Poren hängt von der speziellen zu untersuchenden Wechselwirkung ab und kann vom durchschnittlichen Fachmann leicht bestimmt werden.
Wenn einmal unterschiedliche Zelltypen auf gegenüberliegenden Seiten der Membran kultiviert wurden, können die Auswirkungen einer von Zelle zu Zelle stattfindenden Wechselwirkung untersucht werden. Der Rahmen kann aus dem Gehäuse entfernt werden und nach Wunsch behandelt oder aufbewahrt werden. Eine Methode, mit der die Zellen untersucht werden können ist das Elektronenmikroskop.
Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung kann ebenso für die Untersuchung der zellulären Migration verwendet werden. Es kann eine einschichtige Lage von Zellen auf einer Seite der Membran aufgebracht und ein zweiter Zelltyp kann dann auf dem ersten Zelltyp abgelagert werden. Die Migration kann dann dadurch untersucht werden, daß man das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil entfernt und die Lage der Zellen bestimmt.
Die Vorrichtung und das Verfahren zum Kultivieren von Geweben oder Zellen gemäß der Erfindung kann, entsprechend der obigen Diskussion, mit einem einzigen Rahmen 12 oder mit einer Mehrzahl von Rahmen 67 eingesetzt werden, wie dies in den Fig. 10 und 11 gezeigt ist. Die größte Anzahl von Rahmen 67, die eingesetzt werden können, bestimmt sich nach der kombinierten Höhe derjenigen Anzahl von Rahmen, die gleich oder kleiner ist als die Höhe des Gehäuses 68, die durch die Höhe der einzelnen Rahmen bestimmt wird. Die Rahmen 67 können innerhalb des Gehäuses 68 so positioniert werden, daß das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil eines Rahmens mit Bezug auf das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil der anderen Rahmen eine unterschiedliche Orientierung aufweist. Das Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil 70 des ersten Rahmens 69 kann gemäß Fig. 10 dem Zellen- oder Gewebe- Retentionsteil 71 des zweiten Rahmens 72 benachbart sei, oder alternativ, wie in Fig. 11 gezeigt, dem anderen Ende 73 des zweiten Rahmens 72 so benachbart sein, daß die Zellen- oder Gewebe-Retentionsteile 70 und 71 der beiden Rahmen durch einen Abstand voneinander getrennt sind, der gleich der Höhe eines Rahmens ist.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel ist ein Bausatz zur Kultivierung von Zellen in einem Kulturbehälter vorgesehen. Der Bausatz umfaßt ein rohrförmiges Gehäuse und wenigstens einen ersten Rahmen, der in das Gehäuse paßt und ein Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil mit einer Vielzahl von Poren aufweist. Die Poren des Zellen- oder Gewebe-Retentionsteils weisen einen Durchmesser auf, der eine Wechselwirkung von Zelle zu Zelle zuläßt. Der Durchmesser der Poren hängt von der besonderen zu untersuchenden Wechselwirkung ab und kann leicht durch eine durchschnittlichen Fachmann bestimmt werden.
Der Bausatz kann auch wahlweise ein elektronenmikroskopisches Puffer- Analysesysten enthalten. Ein elektronenmikroskopisches Puffer-Analysesystem umfaßt die Puffer, die für eine elektronenmikroskopische Untersuchung an einem Zellen- oder Gewebe-Retentionsteil, auf dem Zellen kultiviert wurden, notwendig sind; die einzelnen Stoffe sind dem durchschnittlichen Fachmann wohl bekannt. Die Reagentien können beispielsweise mit Phosphat abgepufferte Salzlösungen (PBS), Paraformaldehy/Glutaraldehyd in einem Kakodylatpuffer, Osmiumtetroxyd und eine abgestufte Serie von Ethanolen enthalten.
Aus der obigen Beschreibung kann der durchschnittliche Fachmann den Wert der vielen Vorteile der Erfindung erkennen.

Claims

1. Zellwachstumsvorrichtung für eine Anordnung innerhalb eines Kulturbehälters mit:

einem Körper (10), der ein erstes und ein zweites Ende (20,22) und eine Innenfläche aufweist, welche ein Lumen bestimmt, das sich wenigstens teilweise durch den Körper erstreckt, wobei der Körper erste und zweite Öffnungen an den ersten und zweiten Enden (20, 22) aufweist, die mit dem Lumen zusammenwirken;

wenigstens einem Rahmen (12), der eine Außenfläche aufweist, welche in das Lumen einsetzbar ist, wobei der wenigstens eine Rahmen eine erste Seite (40) und eine zweite Seite aufweist und für eine Anordnung zwischen den ersten und zweiten Öffnungen ausgebildet ist;

einer Dichtung (38), welche wirkungsvoll zwischen dem wenigstens einen Rahmen und der Innenfläche des Körpers zum Verhindern einer Strömung eines Kulturmediums zwischen den Rahmen und die Innenfläche des Körpers vorgesehen ist; und mit

einem Zellen-Retentionsteil (14), welches für eine Zurückhaltung von Zellen an der ersten Seite (40) des Rahmens angebracht ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Rahmen für ein Gleiten in dem Lumen zwischen einer ersten der ersten Öffnung des Körpers benachbarten Position und einer zweiten der zweiten Öffnung des Körpers benachbarten Position ausgebildet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper einen ersten Träger an einem ersten Ende und einen zweiten Träger an einem zweiten Ende aufweist, wobei die ersten und zweiten Träger (24) jeweils für ein Tragen der Zellwachstumsvorrichtung derart ausgebildet sind, dass diese sowohl auf dem ersten als auch auf dem zweiten Ende in dem Kulturbehälter gestellt werden kann.

4. Verfahren für einen Zellwachstum auf wenigstens einer Seite eines Zellen-Retentionsteils, wobei das Zellen- Retentionsteil einen Teil einer Zellwachstumsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bildet, mit folgenden Schritten:

(A) Sichern des Zellen-Retentionsteils an dem Trägerrahmen;

(B) Anordnen des Trägerrahmens innerhalb des Lumens des Körpers in einer ersten Position;

(C) Anordnen des Körpers in einem Behälter, der für eine Aufnahme eines Kulturmediums derart ausgebildet ist, dass der Körper von einem ersten Ende getragen wird;

(D) Entfernen des Körpers aus dem Behälter;

(E) Einstellen der Position des Rahmens in eine zweite Position; und

(F) Anordnen des Körpers derart in den Behälter, dass der Körper von einem zweiten Ende getragen wird.

5. Verfahren für einen Zellwachstum auf wenigstens einer Seite eines Zellen-Retentionsteils, wobei das Zellen- Retentionsteil einen Teil einer Zellwachstumsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bildet, mit folgenden Schritten:

(A) Sichern des Zellen-Retentionsteils an den Trägerrahmen;

(B) Anordnen des Trägerrahmens innerhalb des Lumens des Körpers;

(C) Gleiten des Trägerrahmens innerhalb des Lumens bis der Trägerrahmen an einer ersten vorbestimmten Position in dem Lumen angeordnet ist; und

(D) Anordnen des Körpers in einem Kulturmedium, das den Wachstum der Zellen unterstützt.

6. Verfahren für einen Zellwachstum auf ersten und zweiten Zellen-Retentionsteilen, wobei die Zellen-Retentionsteile einen Teil einer Zellwachstumsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bilden, mit folgenden Schritten:

(A) Tragen der jeweils ersten und zweiten Zellen- Retentionsteile jeweils von ersten und zweiten Trägerrahmen;

(B) Anordnen der ersten und zweiten Trägerrahmen innerhalb des Lumens des Körpers; und

(C) Anordnen des Körpers in einem Kulturmedium, das den Zellwachstum auf den ersten und zweiten Zellen- Retentionsteilen unterstützt.

7. Verfahren für einen Zellwachstum auf wenigstens einer Seite eines Zellen-Retentionsteils, wobei das Zellen- Retentionsteil einen Teil einer Zellwachstumsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bildet, mit folgenden Schritten:

(A) Ausbilden des Trägerrahmens mit einer Innenfläche, die eine Bohrung bestimmt, welche sich von einer ersten Öffnung auf einer ersten Fläche des Trägerrahmens zu einer zweiten Öffnung auf einer zweiten Fläche des Trägerrahmens erstreckt, wobei der Trägerrahmen die Bohrung mit wenigstens einer schrägen Seitenwand derart festlegt, dass ein Durchmesser der ersten Öffnung kleiner ist als ein Durchmesser der zweiten Öffnung;

(B) Anordnen des Zellen-Retentionsteils auf der ersten Fläche des Trägerrahmens derart, dass das Zellen- Retentionsteil wenigstens teilweise über die erste Öffnung angeordnet ist; und

(C) Einsetzen des Trägerrahmens in einen Behälter eines Kulturmediums, wobei die zweite Fläche des Trägerrahmens in das Kulturmedium vor der ersten Fläche eintritt und wobei die zweite Öffnung in einem Winkel angeordnet ist, der bezüglich einer Fläche des Kulturmediums größer 0º ist, derart, dass Luft nicht in der Bohrung eingeschlossen wird, wodurch das Kulturmedium den Zellwachstum auf dem Zellen- Retentionsteil unterstützt.

8. Mittel für einen Zellwachstum in einem Kulturbehälter mit:

einem Körper (10), der ein erstes und ein zweites Ende (20, 22) und eine Innenfläche aufweist, welche ein Lumen bestimmt, das sich wenigstens teilweise durch den Körper erstreckt, wobei der Körper erste und zweite Öffnung an den ersten und zweiten Enden (20, 22) aufweist, die mit dem Lumen zusammenwirken;

wenigstens einem Rahmen (12), der eine Außenfläche aufweist, welche in das Lumen passt, wobei der wenigstens eine Rahmen eine erste Seite (40) und eine zweite Seite aufweist, wobei der Rahmen für eine Anordnung zwischen den ersten und zweiten Öffnungen ausgebildet ist;

einem Zellen-Retentionsteil (40), das an der ersten Seite (40) des Rahmens für ein Zurückhalten von Zellen angebracht ist; und mit

einer Kopplungseinrichtung (16), die einen Kolben aufweist, der für ein Aufgenommen werden in dem Lumen und für einen Eingriff mit dem Rahmen derart ausgebildet ist, dass der Rahmen bezüglich den ersten und zweiten Öffnungen des Körpers gleitend eingestellt werden kann.

9. Verfahren für einen Zellwachstum auf wenigstens einer Seite eines Zellen-Retentionsteils, wobei das Zellen- Retentionsteil als Teil einer Zellwachstumsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 gebildet ist, mit folgenden Schritten:

(A) Sichern des Zellen-Retentionsteils an den Trägerrahmen;

(B) Anordnen des Trägerrahmens in dem Lumen des Körpers, der eine Öffnung aufweist;

(C) Anordnen des Körpers in einem Behälter, der kein Kulturmedium enthält; und

(D) Zufügen eines Kulturmediums derart zu dem Behälter, dass das Kulturmedium in das Lumen durch die Öffnung in dem Körper eintreten und eine Fläche des Zellen- Retentionsteils berühren kann.