DE10223536A1

DE10223536A1 - Verfahren zur Trennung nicht-adhärenter Zellen von adhärenten Zellen

Info

Publication number: DE10223536A1
Application number: DE2002123536
Authority: DE
Inventors: J Hinrich Peters; Dirk Reinhold Lorenzen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-05-27
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2003-12-18

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Trennung nicht-adhärenter Zellen von adhärenten Zellen durch Nutzung der selektiven Adhärenz und der Schwerkraft, wobei bei der Trennung das Auftreten von Schwerkräften im wesentlichen vermieden wird. Das Verfahren kann z. B. mittels einer hängenden (inversen) Zellkultur oder nach dem Prinzip des "hängenden Tropfens" durchgeführt werden. Vorzugsweise dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Abtrennung von Monozyten oder NK-Zellen von nicht-adhärenten Lymphozyten, Erythozyten oder Thrombozyten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung nicht-adhärenter Zellen von adhärenten Zellen durch Nutzung der selektiven Adhärenz und der Schwerkraft, wobei bei der Trennung das Auftreten von Scherkräften im wesentlichen vermieden wird. Das Verfahren kann z. B. mittels einer hängenden (inversen) Zellkultur oder nach dem Prinzip des "hängenden Tropfens" durchgeführt werden. Vorzugsweise dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Abtrennung von Monozyten oder NK-Zellen von nicht adhärenten Leukozyten.

Generell überleben und wachsen Zellen in der Kultur unabhängig von der Schwerkraft. Gewisse Zellen (Bindegewebe, Epithelien, Endothelien) benötigen ein festes Substrat zum Anheften, andere (Knochenmarkabkömmlinge sowie die meisten Blutzellen) benötigen kein solches Substrat. Will man Zellen zur Adhärenz bringen, läßt man sie sich durch die Schwerkraft auf das untenliegende Kultursubstrat absenken, wo sie dann anheften. Von da an können sie in jeder beliebigen, räumlichen Position weiterkultiviert werden. Wird eine Kulturflasche ohne Luftblasen mit Zellkulturmedium vollständig gefüllt, können Zellen prinzipiell auch an allen Wänden der Flasche adhärieren und wachsen. Dies wird üblicherweise aber nur dann gemacht, wenn das Kulturgefäß aus gaspermeablem Kunststoff besteht, so dass die Gasversorgung der Zellen von außen durch die Kunststoffmembran hindurch gewährleistet wird. Eine solche Technik dient der Oberflächenvergrößerung und ist in der Patentschrift DE 31 05 861 beschrieben. Werden in die Kultur Filterscheiben (WO 97/06240) oder Mikrocarrier eingelegt, so heften Zellen auf allen Seiten an, so dass sie ebenfalls unabhängig von der Ausrichtung zur Schwerkraft wachsen. Alle diese Maßnahmen dienen der Vergrößerung der zur Verfügung stehenden Wachstumsfläche. Die Umwendung der Kultur in WO 97/06240 hat allein den Zweck, eine weitere Kulturoberfläche zur Verfügung zu stellen.

In der Immuntherapie mit dendritischen Zellen werden dendritische Zellen aus Monozyten, einer Untergruppe der weißen Blutkörperchen, durch Kulturtechniken hergestellt. Präparationen von weißen Blutkörperchen werden hergestellt, aus denen in weiteren Anreicherungsschritten Monozyten gewonnen werden, die in die Kultur genommen werden, um sie dort mit Zytokinen zu behandeln, was zur Entwicklung neuer Phänotypen (dendritische Zelle) führt, die später geerntet und dann zur Therapie eingesetzt werden. Im einzelnen wird dabei das Blut bei der Blutentnahme gerinnungsgehemmt und dann in einer Gradientenzentrifugation in zwei Hauptgruppen von Zellen aufgetrennt. Die hier interessante Bande enthält hauptsächlich Monozyten und Lymphozyten.

Verfahren, um unterschiedliche Zelltypen voneinander trennen zu können, bedienen sich immunologischer Bindungs- und Markierungstechniken, wie der Immunadhärenz, der Immuno- Magnettechnik, der Sortierung über einen Fluoreszenz- aktivierten Zellsorter. Die am wenigsten aufwendige Methode ist die der selektiven Adhärenz. Dabei werden z. B. zur Trennung von Monozyten von Lymphozyten beide gemeinsam auf eine Zellkulturplatte gebracht, wobei die Monozyten an die Oberfläche adhärieren, während die Lymphozyten unter üblichen Kulturbedingungen überwiegend nicht-adhärent bleiben. Wenn sie adhärieren, so ist diese Adhärenz vorübergehend. Nach wenigen Minuten beginnt dagegen schon die Adhärenz der Monozyten, die auch über Stunden und Tage erhalten bleiben kann (abhängig von den Kulturtechniken und zugegebenen Wirkstoffen). Während der Adhärenz können die nicht adhärenten Zellen von ihnen entfernt werden. Dies geschieht durch "Waschen", d. h. Aufwirbeln, Abspülen und Fluten mit neuem Medium, wobei das Waschen nach Zugabe von weiterem Medium auch mehrfach, auch unter Nutzung von Puffer anstelle von Medium, wiederholt werden kann.

"Natürliche Killerzellen" (NK-Zellen), die als eine Subpopulation der Lymphozyten gelten, können aus der Gesamtpopulation der Leukozyten dadurch gewonnen werden, dass zunächst Monozyten durch selektive Adhärenz abgereichert werden. Die verbleibenden, nicht adhärenten Zellen enthalten u. a. Lymphozyten, Erythrozyten und NK-Zellen. Letztere können wiederum durch selektive Adhärenz von den anderen Zellen getrennt werden. Hierzu gibt man in hohen Dosen Interleukin-2 hinzu, wodurch die NK-Zellen binnen 24 Stunden zu adhärenten Zellen werden. Nachdem sie adhäriert sind, können sie wiederum von den weiterhin nicht-adhärent gebliebenen Lymphozyten u. a. durch selektive Adhärenz getrennt werden. Sie werden dann als Adhärenz-gereinigte Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen (A-LAK- Zellen) bezeichnet.

Der Nachteil der Methode der selektiven Adhärenz, wie sie bisher üblich ist, liegt darin, dass beim Spülen mit der Pipette oder durch Schwenken oder Durchströmen der Kultur der Vorgang immer ungleichmäßig abläuft, so dass bei zu schwachem Spülen Lymphozyten zurückbleiben, während bei zu starkem Spülen auch Monozyten mit abgelöst werden. Innerhalb einer Kulturschale können beide Phänomene gleichzeitig auftreten, da die Spülung lokal unterschiedlich ist und insbesondere die Ecken von Kulturschalen vernachlässigt. Die Ergebnisse sind also innerhalb einer Kulturschale, von Schale zu Schale, von ausführender Person zu Person und von Spender zu Spender unterschiedlich.

Im technischen Maßstab sollen diese Prozesse möglichst automatisiert sowie im weitgehend geschlossenen System durchgeführt werden, so dass die Produktsicherheit erhöht wird. In dem weitgehend geschlossenen, automatisierten System "Aastrom Replicell" der Firma Aastrom Biosciences wird dieses Ziel ebenfalls durch mechanisches Spülen (automatisiertes Wippen und Waschen der Kultur) erreicht. Die o. g. Probleme werden dabei aber nur unvollständig gelöst, so dass ein anderes, geschlossenes System der Firma IDM ganz auf die Auftrennung der beiden Zellpopulationen verzichtet und die Nebeneffekte akzeptiert, die sich durch begleitende Lymphozyten für die Kultur ergeben können.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, die vorstehend beschriebenen Nachteile der im Stand der Technik angewandten Verfahren zu überkommen, d. h. ein Verfahren zur Abtrennung von nicht-adhärenten, von adhärenten Zellen bereitzustellen, das effizient, reproduzierbar und zellschondend ist.

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass das Phänomen der selektiven Adhärenz genutzt werden kann, um adhärente von nicht-adhärenten Zellen zu trennen, wobei in der vorliegenden Erfindung das Prinzip der selektiven Adhärenz mit dem der Trennung durch Schwerkraft kombiniert wird, um hierdurch unterschiedliche Zellpopulationen voneinander zu trennen. Dabei wird auf das Trennprinzip des "Waschens", bei dem vor allem Scherkräfte die Trennung der Zellpopulationen bewirken, weitgehend verzichtet, so dass geringfügig auftretende Scherkräfte als Begleitphänomen praktisch keine Rolle mehr spielen. Da aber durch das Drehen der Kultur Scherkräfte dennoch geringfügig auftreten und nicht verhindert werden können, wird in einer bevorzugten Ausführungsart das Zellkulturgefäß so konfiguriert und derart bewegt, dass die u. U. beim Wenden der Kultur zwangsläufig auftretenden, geringfügigen Scherkräfte jedenfalls kontrolliert, gleichmäßig verteilt und gezielt dosiert werden können.

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1 Kulturgefäß für Massenzellkultur

Das Kulturgefäß ist aus starrem Material (z. B. Glas, Polystyrol), besitzt einen ungeteilten Innenraum und 2 Stutzen, typischerweise an entgegengesetzten Seiten.

1 Einlaß
2 Auslaß
3 Boden 1
4 Boden 2

Fig. 2 Kulturgefäß für Massenzellkultur

Kulturgefäß wie in Fig. 1, jedoch besitzt der Boden 2 eine umgekehrte Dachform, wodurch sich eine Rinne in Längsrichtung des Bodens 2 bildet, die scharfkantig oder weich gerundet sein kann. Der Auslaßstutzen sitzt an der dann tiefsten Stelle am einen Ende der Rinne.

1 Einlaß
2 Auslaß
3 Boden 1
4 Boden 2

Fig. 3 Kulturgefäß für Massenzellkultur

Eine Sammelrinne befindet sich angrenzend an Boden 1, also ihm nicht gegenüber. In dieser Ausführungsform braucht das Kulturgefäß um weniger als 180 Grad, typischerweise um 90 Grad, gewendet zu werden, um eine Sedimentation der nicht adhärenten Zellen annähernd tangential zum Boden 1 zu erreichen.

1 Einlaß
2 Auslaß
3 Boden 1
4 Boden 2

Fig. 4 Kulturgefäß für Massenzellkultur
Das Kulturgefäß ist weitgehend zylindrisch gehalten, wobei von alleine eine Rinne gebildet wird, worin sich die nichtadhärenten Zellen sammeln und abgeführt werden können. Diese Röhrenform erlaubt zusätzlich noch, kontrollierte Scherkräfte zum schonenden "Abwaschen" der schwach adhärenten Zellen einzusetzen.

1 Einlaß
2 Auslaß
3 Boden 1
4 Boden 2

Fig. 5 Verformbares Kulturgefäß für Massenzellkultur

Es handelt sich um einen Kunststoffbeutel, der von außen verformbar ist. Typisch ist ein Zellkulturbeutel aus Teflon, dessen Membran gaspermeabel ist, wie z. B. in der Patentschrift DE 31 05 861 beschrieben. Der Beutel kann initial eine Kissen- oder eine Kastenform aufweisen, kann aber auch entsprechend der Fig. 3 zylindrisch geformt sein. Für die vorliegende Erfindung wird die Verformbarkeit des Kulturgefäßes genutzt. Es besitzt 2 Einfüllstutzen (E1, E2) und 2 Auslaßstutzen (A1, A2). Durch Anlagen von 2 Leisten (K) von außen kann der Beutel so komprimiert werden, dass sich zwei Kompartimente bilden. Die beiden Kompressionsleisten (K) können mit elastischen Lippen und korrespondierenden, rillenförmigen Vertiefungen ausgestattet werden, so dass der Abdichtungseffekt verstärkt wird. Der Ort der Kompression kann frei gewählt werden, so dass sich nach Kompression nach Wunsch entweder zwei annähernd gleich große oder zwei ungleich große Kompartimente bilden.

Fig. 6 Verformbares Kulturgefäß mit Dreikammersystem für Massenzellkultur

Der flexible Beutel gemäß Fig. 5 ist mit 3 Einlaß- (E1, E2, E3) und 3 Auslaßstutzen (A1, A2, A3) versehen. Entsprechend werden zwei Andruckleistenpaare (K1, K2) auf verschiedener Höhe des Beutels angesetzt, um den Beutel in 3 Kompartimente aufzuteilen, denen jeweils ein Einlaß- und Auslaßstutzen zugeordnet ist. Die drei Kompartimente können annähernd gleich groß oder unterschiedlich groß sein, je nach Position der Andruckleistenpaare zueinander und zum Beutel.

Fig. 7(a-d) Zellkulturgefäß für Miniaturkulturen

Das Zellkulturgefäß enthält einen oder multiple Näpfe im Durchmesser von Kapillaren bis zu 1 cm, wobei sich der typische Durchmesser eines Mikrotiternapfes von 6 mm besonders eignet. Die Wände des Napfes sind parallel oder konisch, der Querschnitt rund, mehreckig oder mit Ausstülpungen und Einziehungen versehen. Die gemeinsame Eigenschaft ist die, dass die Näpfe auf einer Seite offen sind. Diese Seite wird die Oberseite genannt.

Fig. 8 Zellkulturgefäß für Miniaturkulturen

Die Form dieses Gefäßes entspricht der von Fig. 7, außer dass der Deckel der Zellkulturplatte so konfiguriert ist, dass er beim Aufsetzen auf die Platte eine größere Distanz zum oberen Rand der Näpfe freiläßt. Hierdurch können die Näpfe auch übervoll gefüllt werden, ohne dass der konvex aufgewölbte Flüssigkeitsspiegel die Deckelunterseite berührt.

Fig. 9 Zellkulturgefäß für Miniaturkulturen

Die Form dieses Gefäßes entspricht der von Fig. 7, außer dass der Deckel der Zellkulturplatte so konfiguriert ist, dass er über Führungsschienen oder Führungsstangen (nicht dargestellt) planparallel zur Platte verschoben werden kann, so dass er zwischen einer engen und einer weiten Position bewegt und gehalten werden kann. Der Rand des Deckels ist so ausgelegt, dass er in beiden Positionen so weit überhängt, dass die Sterilität der Kultur in beiden Positionen des Deckels gesichert bleibt. Der Deckel (D) enthält weiterhin Näpfe, die nach unten hin offen sind und den Näpfen der darunterliegenden Zellkulturplatte gegenüberliegen. Dabei müssen sie nicht deckungsgleich gegenüberliegen, sondern können soweit gegen die Näpfe der Zellkulturplatte verschoben sein, dass sie sich nur teilweise gegenüberstehen. Zusätzlich kann ein Vorsprung (V) oder eine Lippe angebracht sein, der/die zum Einfangen von Flüssigkeit dienen kann. Dieser Vorsprung geht vom Innenraum oder vom inneren Rand des jeweiligen Deckel-Napfes aus und überragt ihn soweit und ist so ausgerichtet, dass bei der Annäherung des Deckels an die Platte dieser Vorsprung zuerst Kontakt mit dem konvexen Flüssigkeitsspiegel bekommt. Er ist so ausgeführt, dass die Flüssigkeit an dieser Leitstruktur entlang nur in den korrespondierenden Napf des Deckels fließt. Im einzelnen kann der Vorsprung fingerförmig oder als einfache oder multiple Rinne oder als Röhre ausgeführt sein, die auch konisch ausgeführt sein kann, wobei die Öffnung auch kapillar sein kann, der Ausfluß aber den weiteren Teil des Konus darstellt, damit hier die Flüssigkeit nach unten ausfließen kann:

a) Gefäß bereits umgedreht. Deckel mit Dorn in der entfernten Position. Zellen in den Meniskus sedimentiert.
b) Deckel wird genähert, so daß der Abflußdorn den Meniskus berührt.
c) Medium mit den suspendierten, sedimentierten Zellen fließt am Dorn ab.
d) Medium mit den suspendierten, sedimentierten Zellen sammelt sich in der Sammelvertiefung des ursprünglichen Deckels.
e) Sedimentieren der suspendierten Zellen.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung nicht-adhärenter Zellen von adhärenten Zellen, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Züchten eines beide Zelltypen enthaltenden Zellgemischs in einem Kulturgefäß und unter Bedingungen, die ein Adhärieren der adhärenten Zellen am Boden des Kulturgefäßes erlauben;
b) Abtrennen der nicht adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen durch Drehen des Kulturgefäßen so, dass aufgrund der Schwerkraft die nicht adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen absedimentieren, und
c) Isolieren der nicht adhärenten Zellen.

Dem Fachmann sind geeignete Kulturgefäße (und Gefäßmaterialien) bekannt, die eine Adhärenz der adhärenten Zellen erlauben. Der Fachmann kann auch den Zeitraum leicht ermitteln, der für die Zellen nötig ist, um adhärieren zu können. Allgemein hängt der Zeitraum von der Sedimentationsdauer ab, und, sobald die Zelle das Substrat erreicht hat, von der Ladung und Beschichtung der Substrat-Oberfläche. Ladungen und besonders positive Ladungen sowie Beschichtungen mit biologischen Matrixmaterialien (z. B. Kollagen) beschleunigen die Adhärenz. Die Geschwindigkeit der Adhärenz liegt zwischen Minuten (z. B. Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, aktivierte Lyphozyten) bis zu wenigen Stunden (Muskel- und Knorpelzellen). Geeignete Medien zum Züchten der Zellen sind ebenfalls allgemein bekannt und hängen vom verwendeten Zelltypus ab. Für die Züchtung von Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen kann z. B. RPMI 1640-Medium (Life Technologies, Paisley, Schottland) verwendet werden. Geeignete Kulturbedingungen, beispielsweise hinsichtlich geeigneter Temperatur, relativer Luftfeuchte, O₂-Gehalt und CO₂-Gehalt der Gasphase sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Vorzugsweise werden Säugerzellen unter den folgenden Bedingungen kultiviert:
(a) 37°C, (b) 100% rel. Luftfeuchte, (c) 10% O₂ und (d) 5% CO₂.

Der hier verwendete Begriff "ein beide Zelltypen enthaltendes Zellgemisch" bezieht sich auch auf Zellgemische, die nur unterschiedliche Arten von nicht adhärenten Zellen enthalten, wobei aber eine bestimmte Zellart durch entsprechende Manipulation, z. B. Zugabe bestimmter Wirkstoffe in das Medium, zu einer adhärenten Zellart gemacht werden kann, z. B. werden nicht-adhärente NK-Zellen durch Zugabe hoher Dosen von IL-2 zu adhärenten Zellen. Zellen können aber auch in ihrer Adhärenz dadurch variiert werden, daß ein gewisser Adhärenz-Verlust gewünscht ist, z. B. durch Calcium-Entzug oder durch Enzymbehandlung. Außerdem lösen sich sich ganz oder teilweise vom Substrat während der Mitose. Monozyten verlieren ihre Adhärenz weitgehend, wenn sie sich zu dentritischen Zellen umdifferenzieren. Wenn Monozyten aber stattdessen zu Makrophagen differenziert werden, bleibt deren Adhärenz erhalten oder verstärkt sich sogar noch, so daß sie nur sehr schwer vom Substrat abgelöst werden können.

Das Isolieren der nicht adhärenten Zellen kann durch jedes Verfahren erfolgen, bei dem Scherkräfte möglichst vermieden werden, z. B. über Ausfließenlassen der nicht adhärenten Zellen über eine Sammelrinne, die sich am Boden des umgedrehten Kulturgefäßes befindet (siehe z. B. Fig. 2 bis 4). Die Zellen können dann aus der Suspension durch übliche Verfahren, z. B. Zentrifugation, gewonnen werden.

Prinzipiell kann das für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Kulturgefäß starr sein und aus Plastik oder Glas bestehen oder aus einem flexiblen Plastikbeutel. Geeignete Materialien, die eine ausreichende Adhärenz der Zellen an eine Kulturgefäßwand ermöglichen, sind z. B. Glas, Polystyrol, Cellulose, Polyethylen, Polycarbonat oder PTFE (Teflon), wobei Glas und Polystyrol bevorzugt sind. Das Kulturgefäß besitzt mehrere verschließbare Zu- und Abflußstutzen, durch die Zellsuspensionen, Medium, Puffer und Reagenzien zu- und abgelassen werden können. Die Schlauchansätze zum Einpumpen und zum Auslassen des Spülpuffers befinden sich z. B. auf Höhe der Böden 1 und 2 (siehe Figuren) an entgegengesetzten Seiten.

Der Innenraum des Kulturgefäßes ist so gestaltet, dass einerseits genügend Fläche zur Adhärenz der Zellen besteht, andererseits die absedimentierten Zellen mit dem Flüssigkeitsstrom abgeführt werden können. Der Raum wird vollständig mit Medium und der zu trennenden Zellsuspension gefüllt, so dass er möglichst frei von Gasblasen ist.

Dem Kulturmedium könnten zusätzliche Faktoren wie z. B. Zytokine, Antigene etc. zu jedem beliebigen Zeitpunkt zugesetzt werden, abhängig vom Zweck und Ziel der weiteren Kultur. Die Kultur kann ohne oder mit Mediumwechsel sowie auch unter kontinuierlicher Zufuhr von frischem Medium fortgeführt werden, wobei jeweils das überschüssige Medium durch den Ablaßstutzen abgeführt wird.

In der Position 1 (siehe Figuren) senken sich die Zellen auf den Boden 1, wobei adhärente Zellen adhärieren (Typische Zeiten hierfür sind: Sedimentation ca. 2 cm pro Stunde, Adhärenz 0,5 bis 3 Stunden.) Im Anschluß daran wird das Kulturgefäß soweit gekippt, dass die nicht adhärenten Zellen der Schwerkraft folgend sich vom Boden 1 lösen und absedimentieren. Dieser Zweck wird in der Regel auch schon erreicht, wenn das Kulturgefäß nur um 80-90 Grad gewendet wird. Im typischen Beispiel wird es um etwa 180 Grad auf den Kopf gestellt, so dass die am Boden 1 adhärenten Zellen jetzt oben hängen bleiben, und die nicht adhärenten Zellen sich nach unten hin auf den Boden 2 absetzen. Die Sedimentationsdauer ist wiederum von der Weglänge abhängig.

Die Form von Boden 1 und 2 kann flach sein; sie kann aber auch durch eine oder mehrere rillenförmige Vertiefungen das Sammeln und Ausströmenlassen von nicht adhärenten Zellen begünstigen. Das Herausspülen der nicht adhärenten Zellen kann in dieser Position des Kulturgefäßes erfolgen; es kann aber auch noch einmal um bis zu etwa 90 Grad gekippt werden, so dass sich der Ausfluß nun am tiefsten Punkt befindet.

Das Zellkulturgefäß kann in eine Halterung eingespannt werden, die es erlaubt, auch maschinell und automatisch gesteuert die mechanische Drehung vorzunehmen. Die Ports der Zu- und Abflußstutzen können mit Ventilen ausgestattet sein, die manuell oder auch elektromagnetisch oder motorgesteuert geöffnet und geschlossen werden können. Das zuzuführende Medium sowie die zuzugebenden Wirkstoffe können manuell oder durch Motorpumpen infundiert werden. Medien und Wirkstoffe können in separaten Vorratsbehältern angeflanscht sein, so dass jeder von ihnen mit einem eigenen Absperrventil versehen ist und unabhängig voneinander manuell oder motorgesteuert geöffnet und somit der Inhalt des Vorratsgefäßes in das Kulturgefäß infundiert werden kann. Ein elektronisches oder mechanisches Steuergerät kann das Öffnen und Schließen der Ventile, das Infundieren der Flüssigkeiten nach einem vorgegebenen Programm automatisieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Kulturgefäß aus starrem Material, vorzugsweise Glas oder Polystyrol.

Besonders bevorzugt sind Kulturgefäße mit einem ungeteilten Innenraum und mindestens einem Einlaß- und einem Auslaßstutzen, die sich an entgegengesetzten Seiten des Kulturgefäßes befinden, was beispielhaft in Fig. 1 dargestellt ist.

Noch mehr bevorzugt sind Kulturgefäße:

a) bei denen der nach Drehen des Kulturgefäßes zustandekommende Boden eine umgekehrte Dachform aufweist, wodurch sich eine Rinne in Längsrichtung des Bodens bildet und der Auslaßstutzen an der tiefsten Stelle an einem Ende der Rinne sitzt; oder
b) bei denen der nach Drehen des Kulturgefäßes zustandekommende Boden mit der Sammelrinne an den ursprünglichen Boden angrenzt, oder
c) die zylindrisch sind, wobei sich der Einlaß- und Auslaßstutzen jeweils an den sich gegenüberliegenden Enden des Zylinders gegeneinander versetzt befinden.

Beispiele für die Ausführungsformen hinsichtlich (a), (b) und (c) sind in den Fig. 2, 3 bzw. 4 dargestellt.

In einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Kulturgefäß ein verformbarer Kunststoffbeutel mit einer Kasten-, Kissen- oder zylindrischen Form, wobei ein Kunststoffbeutel aus einem gaspermeablen Kunststoff, z. B. Polyethylen oder PTFE, besonders bevorzugt ist.

Am meisten bevorzugt ist ein Kunststoffbeutel:

a) der 2 Einfüllstutzen und 2 Auslaßstutzen aufweist und der durch Anlegen von zwei Leisten von außen so komprimiert werden kann, dass sich zwei Kompartimente bilden, oder
b) der 3 Einfüllstutzen und 3 Auslaßstutzen aufweist und durch Anlegen von zwei Leistenpaaren von außen so komprimiert werden kann, dass sich drei Kompartimente bilden.

Beispiele für a) und b) sind in den Fig. 5 und 6 dargestellt. Die entstandenen (z. B. zwei oder drei) Kompartimente können einzeln oder getrennt voneinander über die ihnen zugeordneten Einlaßstutzen und Auslaßstutzen gespült werden sowie durch unterschiedliche Zugaben von z. B. Zytokinen unter unterschiedlichen Bedingungen weiterkultiviert werden können. Zu jedem beliebigen Zeitpunkt kann die Aufteilung der Kammern wieder rückgängig gemacht werden und die Kultur auch ohne räumliche Trennung einheitlich fortgesetzt werden.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Kulturgefäß ein Mikrotitergefäß mit mindestens einem Napf. Geeignete Mikrotitergefäße (z. B. Mikrotiterplatten) sind kommerziell erhältlich.

Diese Mikrotitergefäße eignen sich besonders für Miniaturkulturen unter Verzicht auf einen zweiten Boden nach dem Prinzip des "hängenden Tropfens"; siehe dazu die in den Fig. 7, 8 und 9 gezeigten Beispiele. Die Technik des "hängenden Tropfens" diente bisher der Kultivierung von Zellen, die keinen Kontakt mit einem künstlichen (oder natürlichen) Substrat haben sollen. Hierfür wird ein Tropfen einer Zellsuspension in Kulturmedium auf einen Objektträger oder eine Kulturschale gebracht, dann sanft umgedreht, so dass der Tropfen am festen Substrat hängt. Die suspendierten Zellen senken sich daraufhin nach unten und können im tiefsten Punkt des Tropfens an der Grenzfläche zur Gasatmosphäre kultiviert werden.

Diese Technik eignet sich nicht für Flüssigkeitsmengen, die größer als ein Tropfen sind, da diese dann abtropfen würden. Die in den Figuren beispielhaft gezeigten Vorrichtungen sind dafür gedacht, diese Technik in größerem Maßstab zu nutzen. Die Fähigkeit, ein Volumen einer wässrigen Flüssigkeit daran zu hindern, entgegen der Schwerkraft abzutropfen, hängt von der Oberflächenspannung und der Wechselwirkung mit dem Substrat, sowie, damit verbunden, von der Kapillarität ab, sofern das Substrat nicht aus einer flachen Fläche besteht. Es zeigt sich, dass eine wässrige Flüssigkeit auch in einer Röhre hält, die oben verschlossen ist. Der Effekt wird verstärkt, wenn die Röhre eine hydrophobe Oberfläche hat. Der Durchmesser der Röhre kann dann einen Durchmesser von bis zu einem Zentimeter haben. Der Querschnitt kann rund, oval, kantig oder unregelmäßig sein. In der praktischen Anwendung wird man vorzugsweise einen Durchmesser von 6-9 mm wählen, da bei größerem Durchmesser die Handhabung erschwert ist, so dass die Kulturflüssigkeit beim Umdrehen der Platte schon durch eine leichte, zusätzliche Erschütterung abtropfen würde.

Eine Zellkulturplatte aus Plastik mit typischen Vertiefungen (üblicherweise runder Querschnitt, aber nicht notwendigerweise) erfüllt diesen Zweck und erlaubt zusätzlich Parallelkulturen in den multiplen Näpfen und eine Multiplikation der Einzelkulturen.

Bevorzugt man einen konkaven Meniskus des Zellkulturmediums, wird das Gefäß wie üblich nur unvollständig gefüllt werden. Wünscht man einen konvexen Meniskus, wird das Gefäß bis über den Rand gefüllt (je nach Herstellungsform ca. 360 bis 370 Mikroliter). Serielle Kulturen können mit geeigneten, vorhandenen Multipipetten bis hin zu Pipettierautomaten beschickt werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Mikronäpfe (z. B. Mikrotiterplatten) als Kulturgefäße für inverse Kulturen benutzt, um mit der Anordnung des "hängenden Tropfens" adhärente Zellen und nicht-adhärente Zellen durch Schwerkraft voneinander zu trennen; siehe dazu Fig. 7 bis 9. Als Material eignet sich jedes Material, das üblicherweise für Zellkulturschalen und -Platten verwendet wird (Glas, Kunststoff). Die Oberflächen können hydrophil oder hydrophob ausgelegt sein, wobei die hydrophobe Variante bevorzugt wird, da die hydrophile Kulturflüssigkeit hierbei weniger leicht abtropft, wenn das Zellkulturgefäß mit der Öffnung nach unten gedreht wird. Bedeckt wird das Zellkulturgefäß mit einem üblichen Plastikdeckel, der locker aufgesetzt ist, so dass die Kulturen durch die Öffnung, die sich durch den klaffenden Überhang des Deckels bildet, begast werden können.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Miktotiternäpfen kann z. B. so vorgegangen werden, dass diese mit der Zellsuspension gefüllt werden, die ein Gemisch aus adhäsionsfähigen und nicht-adhäsionsfähigen Zellen enthält. Das Füllvolumen ist typischerweise etwa 200 Mikroliter, kann aber auch weniger oder mehr betragen (Fig. 7a). Die Zellen werden aufgrund der Schwerkraft sedimentieren. Die adhäsionsfähigen Zellen heften sich am Boden des Napfes an (Fig. 7b, wobei die Zellen symbolisch übermäßig vergrößert sind, die adhärenten Zellen flach und die nicht adhärenten rund dargestellt sind). Danach wird die Schale mit einer sanften Bewegung umgedreht, so dass die Öffnung der Näpfe nach unten zeigt (Fig. 7c). Die Bewegung wird sanft abgestoppt, damit die Flüssigkeit nicht aus den Näpfen heraustropft. Die Platte wird in dieser umgedrehten Form weiterinkubiert, so dass sich die nicht adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen durch Sedimentation entfernen. Am Ende der Sedimentation befinden sich die nicht adhärenten Zellen am jetzt unten liegenden Flüssigkeitsspiegel (Fig. 7d). Sollen die nicht adhärenten Zellen entfernt werden, wird die Flüssigkeit entweder von unten her mit einer geeigneten Pipette abgesaugt oder aber durch eine schlagende Bewegung aus der Platte abgeschüttelt. Anschließend werden die in den Näpfen adhärierenden Zellen wieder mit Medium überschichtet, und diese können dann in jeder der beiden Positionen weiter inkubiert werden.

Bei einer Vorgehensweise unter Verwendung eines wie in Fig. 8 gezeigten Mikrotiternapfes sammeln sich die Zellen in der Mitte des konvexen Meniskus an dessen tiefstem Punkt (Fig. 8d), wodurch das Abernten der Zellen erleichtert wird.

Schließlich kann auch, wie in Fig. 9 dargestellt, vorgegangen werden. Nach dem Einfüllen der Zellsuspension wird der Deckel auf den Mikrotiternapf so aufgesetzt, dass er sich in der entfernten Position befindet (nicht dargestellt). Die folgenden Schritte entsprechen den vorstehend bezüglich Fig. 7 bzw. 8 beschriebenen Schritten. Zum Absammeln der inversen Kultur wird die Platte in der umgedrehten Position belassen(Fig. 9a), und dann werden Platte und Deckel über die Führungsschienen (nicht dargestellt) aneinander angenähert, so dass sich der Deckel in die nahe Position bewegt (Fig. 9b). Dabei kommt die Einfließlippe des im Deckel befindlichen Napfes in Kontakt mit dem Flüssigkeitsspiegel des gegenüberliegenden Napfes der Zellkulturplatte. Hierdurch fließt das Kulturmedium aus dem Zellkulturnapf in den gegenüberliegenden Sammelnapf im Deckel (Fig. 9c und 9d) und können hier sedimentieren (Fig. 9e). Durch diesen Aufbau können multiple Näpfe gleichzeitig und schnell abgesammelt werden, wobei der Inhalt der Näpfe getrennt voneinander in korrespondierenden Einzelnäpfen des Deckels gesammelt wird.

In Prinzip eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren alle nicht-adhärente und adhärente Zellen enthaltende Zellgemische gemäß der vorstehenden Definition, wobei Zellgemische bevorzugt sind, bei denen die adhärenten Zellen Monozyten und die nicht- adhärenten Zellen Leukozyten, Erythrozyten oder Thrombozyten, oder die adhärenten Zellen NK-Zellen und die nicht adhärenten Zellen Leukozyten, Erythrozyten oder Thrombozyten sind.

Vorzugsweise sind die Kulturgefäße für das erfindungsgemäße Verfahren so gestaltet, dass eine Trennung der nicht adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen durch eine Drehung des Kulturgefäßes um nicht mehr als 180 Grad, vorzugsweise um etwa 90 Grad, erreicht wird, so dass der ursprüngliche Boden des Kulturgefäßes mit dem Gemisch aus beiden Zelltypen zur Seitenwand oder zur Decke des Gefäßes wird.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Gewinnung von Monozyten aus einem Gemisch von Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten

In diesem Beispiel wurden Monozyten aus einer Ausgangspopulation von Monozyten, Lymphozyten, Erythrozyten und Thromboyzten durch Adhärenz gewonnen, um anschließend, in Abwesenheit der nicht adhärenten Zellen, weiterinkubiert und nach Zugabe geeigneter Zytokine zu dendritischen Zellen differenziert zu werden.

In das leere, sterile Kulturgefäß gemäß den Fig. 1, 2 oder 3 wurde durch den Einlaßstutzen (E) Zellkulturmedium (RMPI 1640 plus 10% fötales Käberserum) mit der zu bearbeitenden Zellsuspension von Monozyten, Lymphozyten, Erythrozyten und Thrombozyten eingegeben. Dies erfolgte wahlweise manuell oder durch automatisierte Pump- und Ventilsysteme. Aus dem Auslaßstutzen (A) wurde die verdrängte Luft entlassen; überflüssiges Medium wurde dort ebenfalls entlassen. Das Kulturgefäß wurde vollständig gefüllt, so dass keine größere Gasphase innerhalb des Kulturgefäßes zurückblieb. In der Position 1 (Boden 1 befindet sich auf der Unterseite) wurde das Kulturgefäß in einem begasten, beheizten und luftfeuchten Brutschrank inkubiert, bis die Zellen sich auf dem Boden 1 abgesetzt hatten und die adhäsionsfähigen Zellen sich am Boden 1 angeheftet hatten.

Sodann wurde das Kulturgefäß soweit umgewendet, dass der Boden 1 jetzt um 90 bis 180 Grad aufgerichtet bzw. umgekehrt wurde. Daraufhin lösten sich die nicht adhärenten Zellen vom Boden 1 und sedimentierten in Richtung auf die Sammelrinne. (Nach den Gesetzen der Geschwindigkeitssedimentation ist die Sinkgeschwindigkeit abhängig von Größe, Form und spezifischem Gewicht der Zellen; die Sinkdauer ist noch zusätzlich abhängig vom zurückzulegenden Weg.)

Nachdem sich die nicht-adhärenten Zellen (Lymphozyten, Erythrozyten, Thrombozyten) in der Abflußrinne abgesetzt hatten, wurden sie durch Zufuhr von Medium oder Puffer aus dem Kulturgefäß herausgespült und durch anschließende Zentrifugation gewonnen. Die Zellen können für wissenschaftliche Studien weiter analysiert werden oder für therapeutische Zwecke dem Patienten injiziert werden. Anschließend wurde das Kulturgefäß wieder mit Medium geflutet, wobei die weitere Kultur der adhärenten Zellen in jeder beliebigen Position des Kulturgefäßes vollzogen werden konnte. Das Kulturgefäß konnte wieder vollständig mit Medium gefüllt (ohne Gasphase) oder auch nur teilweise geflutet werden, so dass sich eine Gasphase bildete.

Durch Zugabe von Zytokinen differenzieren dann aus den adhärenten Monozyten dendritischen Zellen. Mit der Differenzierung verloren die Monozyten zunehmend ihre Adhärenz, so daß sie anschließend durch einfaches Auswaschen gewonnen und weiterbenutzt werden konnten.

Die Auswertung der Versuche ergab, dass sich mit diesem Verfahren Zellen äußerst schonend, ohne zu spülen oder sie mechanisch zu schädigen, sehr rein voneinander trennen lassen.

Die Vitalität der Zellen war höher als mit jedem anderen Verfahren, da die Zellen geringeren physikalischen und chemischen Belastungen ausgesetzt waren. Zusätzlich wurden auch transient adhärente Zellen entfernt, so dass sich Monozytenpopulationen von hoher Reinheit ergaben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Zur Auswertung wurden die Ausgangspopulation, die konventionell über Spülprozesse angereicherte Kultur sowie die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens getrennten Zellen durchflußzytometrisch analysiert. Es wurden die adhärenten Monozyten auf kontaminierende Lymphozyten durch anti-CD2/CD3-Antikörper (Fa. DAKO, Hamburg) und tote Zellen durch Propidiumjodid angefärbt (nicht dargestellt). Aufgrund der Nachweisgrenze der Durchflußzytometrie von 1% wurden zusätzlich noch morphologische Auswertungen vorgenommen. Tabelle 1 Reinheitsgrad der adhärenten Zellpopulation, verglichen mit der Ausgangspopulation

Beispiel 2 Gewinnung von Monozyten aus einem Gemisch von Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten

Es wurde in Beispiel 1 das Zellgemisch in Medium und Serum angesetzt, aber zusätzlich noch das Antigen Tetanus-Toxoid zugegeben (10 µg/ml). Im Anschluß wurde wie in Beispiel 1 die Adhäsion vorgenommen. Dabei band sich zusammen mit den adhärenten Monozyten auch eine geringe Anzahl Lymphozyten, nämlich diejenigen, die gegen das Antigen Tetanus-Toxoid spezifisch reagieren können, da sie durch die Bindung des Antigens aktiviert wurden und damit eine schwache, eigene Adhärenz entwickelten. Während der Sedimentationsphase hafteten sie nun sowohl an Monozyten als auch direkt am Substrat und gehörten nunmehr zu der Mischpopulation von adhärenten Zellen. Nach Entfernen der nicht adhärenten Zellen konnten durch Zugabe von Zytokinen (z. B. 50-1000 U/ml GM-CSF oder 15-1000 U/ml IL-4) die Zellen weiter inkubiert werden, wobei sich die Monozyten zu dendritischen Zellen differenzierten, während die verbliebenen, geringen Mengen von adhärent gewordenen Lymphozyten durch die dann antigen-präsentierenden Monozyten/dendritischen Zellen immunologisch aktiviert wurden und in die Proliferation gebracht wurden.

Bei diesem Beispiel liegt der Vorteil darin, daß eine Immunselektion der gegen das gegebene Antigen spezifisch reagierenden Lymphozyten auf der Basis der neu entstandenen Adhärenzfähigkeit stattfindet, während potentiell inhibitorische Zellen (z. B. regulatorische T-Zellen, Suppressor-T-Lymphozyten) mit den nicht-adhärenten Lymphozyten aus dem Ansatz entfernt werden.

Beispiel 3 Gewinnung von Monozyten aus einer Kultur dendritischer Zellen unter Einsatz kontrollierter Scherkräfte

Hierbei wurde wie in Beispiel 1 vorgegangen, wobei allerdings der Schritt des Umwendens des Kulturgefäßes durch Einsatz von kontrollierten Scherkräften ergänzt wurde. Hierbei konnten weitere Lymphozyten, die schwach adhärent waren und sich nicht spontan von der Schicht der adhärenten Monozyten lösten, durch zusätzliche Scherkräfte zur Ablösung gebracht werden. Hierfür wurde das zylindrische Kulturgefäß gemäß Fig. 4 mit definierter und der Situation angepaßter Geschwindigkeit in die Position 2 um die Längsachse gedreht. Hierbei folgt der im Kulturgefäß befindliche Flüssigkeitszylinder aufgrund der Trägheit wesentlich langsamer der Drehbewegung. Die Drehbewegung benötigt nur wenige Grad Drehung und kann in beiden Drehrichtungen auch mehrfach wiederholt werden, so daß die Scherkräfte kontrolliert dosiert werden konnten und sich annähernd gleich stark über den gesamten Zellfilm auswirkten.

Der Vorteil dieser Konfiguration des Kulturgefäßes lag darin, dass der Schervorgang über die gesamte Fläche des Kulturgefäßes im wesentlichen gleich stark ablief, da die Wand des Kulturgefäßes und damit der Zell-Monolayer sich gegen die trägere Flüssigkeitssäule als im wesentlichen einheitlicher Zylinder bewegte. Diese kontrollierte Strömung steht damit im Gegensatz zu allen Spülvorgängen, bei denen über ein Inlet- Outlet Spülflüssigkeit ausgetauscht wird und die Strömungsintensität über die Fläche ungleich stark verteilt ist.

Beispiel 4 Gewinnung von Monozyten aus einer Mischung von Blutzellen mittels beutelartiger Kulturgefäße

Dabei wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen, außer dass Kunststoffbeutel gemäß Fig. 5 als Kulturgefäße verwendet wurden. Außerdem wurde nach dem Absenken der nicht-adhärenten Zellen (Lymphozyten, Erythrozyten, Thrombozyten) das beutelartige Zellkulturgefäß horizontal in zwei Kompartimente aufgeteilt. Der bei der Kompression des Beutels entstehende Überdruck wurde durch Ablassen von überschüssigem Kulturmedium über die Auslaßstutzen (A) abgebaut.

Beispiel 5

Abtrennen von NK-Zellen von Lymphozyten

In dem Dreikammersystem gemäß Fig. 6 ist es möglich, zeitversetzt 2 unterschiedliche Populationen von adhäsionsfähigen Zellen in getrennten Kammern zur Adhäsion zu bringen, wobei die mittlere Kammer 3 als Sammelrinne und Ausflußkammer dient. Hier wurde dazu eine Zellsuspension verwendet, die neben NK-Zellen hauptsächlich Lymphozyten enthielt. Es wurde dazu eine Zellsuspension von Blutzellen verwendet, die innerhalb der Fraktion der Leukozyten auch Vorstufen von NK-Zellen enthält. Als Vorstufen von NK-Zellen werden Knochenmarkszellen der lymphoiden und/oder myeloiden Reihe angenommen. Sie sind in jeder Ausgangspopulation von Blutleukozyten enthalten. Die Ausgangs-Zellpopulation wurde wie in Beispiel 4 beschrieben zur Adhäsion gebracht, die nichtadhärenten Zellen wie vorher auf die Gegenseite sedimentiert. Sodann wurde der Zellkulturbeutel wie in Beispiel 4 beschrieben in 2 Kompartimente getrennt, wobei die suspendierten Zellen sich wiederum in der Kammer 2 befanden. Durch Zugabe von Zytokinen in die Kammer 2 wurden die suspendierten Zellen derartig stimuliert, dass unter ihnen weitere Subpopulationen adhäsionsfähig wurden, d. h., die Zellen durch dauerhafte Zugabe von Interleukin-2 (500-1000 IU/ml) stimuliert, so dass die unter ihnen befindlichen, natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) oder ihre Vorstufen, die vorher nicht adhäsionsfähig waren, innerhalb etwa einer Stunde die Eigenschaft der Adhärenz entwickelten und adhärierten. Sie adhärierten am Boden 2 der Kammer 2 nach einer Inkubation von 2-20 Stunden. Anschließend wurde die gesamte Zellkulturkammer wiederum um ca. 180 Grad gedreht, so dass die weiterhin nicht-adhärent gebliebenen Zellen (überwiegend Lymphozyten) wiederum vom Zellfilm der Kammer 2 wegsedimentierten. Anschließend wurde das zweite Paar von Klemmleisten geschlossen, so dass sich die suspendierten Zellen nun in der neu geformten Kammer 3 befanden. Aus dieser Kammer wurden sie über die Ein- und Ausflußstutzen 3 herausgespült oder, getrennt von den Kammern 1 und 2, weiterkultiviert. Durch Öffnen der Klemmleisten konnten auch wieder die Zellen in den Kammern 1 und 3, 2 und 3 oder in allen drei Kammern gemeinsam weiterkultiviert werden.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung nicht-adhärenter Zellen von adhärenten Zellen, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Züchten eines beide Zelltypen enthaltenden Zellgemischs in einem Kulturgefäß und unter Bedingungen, die ein Adhärieren der adhärenten Zellen am Boden des Kulturgefäßes erlauben;

b) Abtrennen der nicht-adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen durch Drehen des Kulturgefäßen so, dass aufgrund der Schwerkraft die nicht-adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen absedimentieren, und

c) Isolieren der nicht-adhärenten Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kulturgefäß aus Glas oder Polystyrol besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Kulturgefäß aus starrem Material besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Kulturgefäß einen ungeteilten Innenraum aufweist und mindestens einen Einlaß- und einen Auslaßstutzen, die sich an entgegengesetzten Seiten befinden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der nach Drehen des Kulturgefäßes zustande kommende Boden eine umgekehrte Dachform aufweist, wodurch sich eine Rinne in Längsrichtung des Bodens bildet und der Auslaßstutzen an der tiefsten Stelle an einem Ende der Rinne sitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der nach Drehen des Kulturgefäßes zustande kommende Boden mit der Sammelrinne an den ursprünglichen Boden angrenzt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Kulturgefäß zylindrisch ist und sich der Einlaß- und Auslaßstutzen jeweils an den sich gegenüberliegenden Enden des Zylinders gegeneinander versetzt befinden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Kulturgefäß ein verformbarer Kunststoffbeutel mit einer Kasten-, Kissen- oder zylindrischen Form ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kunststoffbeutel gaspermeabel ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Kunststoffbeutel 2 Einfüllstutzen und 2 Auslaßstutzen aufweist und durch Anlegen von zwei Leisten von außen so komprimiert werden kann, dass sich zwei Kompartimente bilden.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Kunststoffbeutel 3 Einfüllstutzen und 3 Auslaßstutzen aufweist und durch Anlegen von zwei Leistenpaaren von außen so komprimiert werden kann, dass sich drei Kompartimente bilden.

12. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Kulturgefäß eine Mikrotiterplatte mit mindestens einem Napf ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die adhärenten Zellen Monozyten sind und die nicht-adhärenten Zellen Lymphozyten, Erythroyzten oder Thrombozyten sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die adhärenten Zellen NK-Zellen sind und die nicht-adhärenten Zellen Lymphozyten, Erythrozyten oder Thrombozyten sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Kulturgefäß um nicht mehr als 180 Grad gewendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Kulturgefäß um ungefähr 90 Grad gewendet wird.