JPH11510394A - 組織培養物を増殖させるための両面使用型膜挿入物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 膜の表面で組織または細胞を増殖させる装置および方法が、培養ウェル内のいずれの端部に位置していてもよい円筒状本体を含んでいる。フレームが本体内に摺動可能に取り付けられ、組織または細胞を増殖させるべき両面で膜を担持している。組織または細胞試料が膜の上面に配置され、培地が本体の外側のウェルに供給される。本体の底部の通路により、培地が膜まで流動し、試料に栄養を与えて増殖させる。第１の単層が増殖したときに、本体を反転させて、好ましくは、この目的のために供給されるジグにより、フレームを本体の他方の端部に押し込む。第２の細胞試料を膜の上面となっている膜の他方の面に付着させ、主に上面のリザーバから、補助的に膜を通して供給される培地により栄養が与えられる。

Description

【発明の詳細な説明】 組織培養物を増殖させるための両面使用型膜挿入物 序論 本発明は、生体外で細胞または組織を増殖させる装置および方法に関するもの である。より詳しくは、本発明は、組織培養培地内に沈水したおよび／または培 地／空気界面に位置した組織保持部材または無菌細胞の対向する面で組織、細胞 または細胞株を増殖させることに関するものである。 研究所で行われる研究では、微細多孔性膜により分離された異なる細胞個体に よる細胞培養における細胞対細胞の相互作用を研究する必要がある。細胞対細胞 の相互作用は、細胞増殖および分化の調整において重要であると考えられている 。胚測定の工程の際中には、細胞対細胞の接触が多くの細胞型にとって必須であ る。発生発達以外に、多くの他の細胞型の増殖および分化もまた細胞対細胞の相 互作用に依存していると考えられている。例えば、筋芽細胞の筋管中への分化は 、未分化細胞間の接触に依存すると考えられている。リンパ球の発生および活性 化も同様に細胞対細胞の接触に依存している。様々な細胞型および組織はこれら の細胞対細胞の相互作用に依存している。 何故細胞対細胞の接触により細胞の細胞発達および分化における変化が生じ得 るかは知られていないが、研究者達は、この問題に答えることを期待していくつ かの仮説を積極的に試験している。提案されている仮説の１つは、ある細胞の細 胞表面に別の細胞が接触することによって、表面受容体または他の信号機構との 相互作用の結果として遺伝子発現が変化するというものである。提案されている 別の仮説は、ある細胞がその表面に細胞外基質の層を生成すること、および実際 に第２の細胞に接触して、第２の細胞の遺伝子発現における続いての変化を生じ るのは、細胞外基質であるというものである。あるいは、ある研究者は、細胞対 細胞の相互作用は細胞間の物理的接触にはそれほど依存しないが、むしろ、細胞 により生成されて、外部環境中に放出される因子との接触に依存するということ を仮定している。いくつかの細胞は、局所的環境内で直ちに作用できる因子を生 成するが、他の細胞は、寿命が長く、体内の離れた部位に移送され得る因子を生 成する。 細胞対細胞の相互作用を研究するために様々な技術が現在用いられているが、 それには、汚染の危険性が付随する多くの操作を必要とするので、どの技術も全 面的に満足のいくものではない。ある技術において、微細多孔性膜を組織培養培 地のプールに浮かべ、第１の細胞型をその一方の面で増殖させている。次いで、 膜を裏返しにして、第２の細胞型を他方の面で増殖させる。この技術は多くの用 途では許容されない。なぜならば、膜の一方の面にある細胞培養物および培地を 他方の面にある細胞培養物および培地から全体的に単離することが重要であるか らである。 ある組の細胞により因子が放出され、別の組の細胞を変化させる細胞対細胞の 相互作用を研究するのに用いられる通常の技術には、調整培地を使用することが ある。調整培地は、細胞が培地中に分泌される因子を有するように十分に長い期 間に亘り第１組の細胞の存在下で保温されている培地である。第２組の細胞は単 層として平板培養され、次いで、まばらに平板培養された細胞の単層は調整培地 により保温され、因子の細胞への効果を決定する。この方法に関する問題の１つ として、過剰な操作および長期間の保温による汚染の危険がある。別の問題には 、ある因子は非常に短い期間（ときには、数分間のみ）しか効果的ではなく、し たがって、いかなる結果のためにも直ちに効果器細胞に接触させる必要があるこ とがある。短命の不安定な因子は、不可能ではないにしろ、調整培地の従来の技 術を用いることにより研究するのは非常に困難である。 過去に用いられた別の技術には、２つのプラスチック製リングまたは金属製リ ングの間に膜を留めて、このユニットを膜よりも深い深さまで培地中に沈める各 工程が含まれている。第１の細胞型を頂面で増殖させ、次いで、ユニットを反転 させて、第２の細胞型を膜の反対の面で増殖させる。この技術には頻繁に困難が 付きまとう。なぜならば、第１の増殖した細胞型は微細多孔性膜を密封し、この 膜は、ユニットを反転させて第２の細胞型を増殖させるときに、クランプリング の内側で膜の下側にエアロックおよび対応する気泡を生じるからである。（気泡 は、膜上の培養物を殺すかまたは移送の研究を適切に行うのを妨げるかもしれな い。）この問題を避けるために、ときには、孔を開けて空気を逃がし、次いで、 栓により再度閉じて、２つの細胞型の間の分離を維持するように、クランプの側 壁に孔および栓を設けている。この解決方法は、栓を取り外して再度取り付ける こと、および実質的に無菌の状態に維持することが困難であり、全ての空気が除 去されているか否かを決定することも困難であるので、満足のいくものではない 。 本発明の目的は、細胞対細胞の相互作用を測定できる無菌状態で膜の両側に細 胞を増殖させることのできる方法および装置を提供することにある。 発明の概要 本発明は、各々の端部で開いている管状体を備え、培養ウェル内のいずれかの 端部に配置できるアセンブリを製造することに具体的に表現されている。管状体 内に摺動可能に適合するような大きさのフレームが、内径に亘る、微細多孔性の 細胞または組織保持部材のような培養保持部材および外径の周りのシールを担持 している。細胞または組織保持部材は、微細多孔性膜を備えている。シールは、 本体の内面に対してフレームを密封し、培地が部材の一方の側から他方の側にフ レームリングの周りに流動するのを防いでいる。フレームは、その一方の端部に 隣接した本体内に位置し、本体は、ウェル内のその端部に配置されている。本体 の下側部分および細胞または組織保持部材の頂面と底面の両方がウェル内の培地 に沈められ、細胞が頂面で増殖する。単層を実施する場合には、本体を反転させ 、フレームを反対の端部に移動させる（本体が配置されている他方の端部）。こ れにより、細胞または組織保持部材の他方の側で細胞が増殖する。 本発明の実施の形態において、ジグが設けられている。ジグは、本体の端部か ら所望の距離に細胞または組織保持部材を有するフレームを配置するように、本 体内に適合し、フレームと噛み合うような大きさである。フレームがジグにより 正確な位置のみに移動されるように、停止機構が設けられている。ある実施の形 態において、停止機構は、一方の端部に管状体の直径より大きいフランジを有し 、他方の端部に管状体内に適合するような大きさのシリンダを有するシリンダの 形態で設けられているジグである。別の実施の形態において、本体は、一方の端 部に、本体の中央に向かって内側に延在する突出物を有している。この突出物上 に、 フレームが静止していてもよい。この実施の形態においては、ジグは、フレーム と噛み合い、フレームを移動させて突出物に接触させられるように、管状体内に 適合する。この停止機構は、フレームが本体の他方の端部の適切な位置に移動さ れるように設けられている。 本発明の別の実施の形態においては、本体の各々の端部は、本体の端部を、培 地を含有するウェルの表面から効果的に上昇させるノッチまたは脚部のような中 断部を有している。これにより、細胞または組織保持部材の下で培地を移動させ 、交換することができる。 本発明のさらなる別の特性は、細胞または組織保持部材を支持するフレームが 、環流チャンバのような他の装置内に使用するために本体から滑らせて外せるこ と、または永久的な記録として貯蔵できることにある。 本発明はまた、細胞対細胞の相互作用を研究するための層状の細胞培養物にも 有用である。これは、第１の細胞または組織保持部材上で細胞（または第１の細 胞または組織保持部材の両側に異なる細胞）を増殖させ、本体内の別々の細胞ま たは組織保持部材を有する追加のフレームを配置して、追加の細胞または組織保 持部材上に単層を増殖させる各工程により行うことができる。 本発明のさらなる実施の形態としては、組織および細胞を増殖させて、細胞対 細胞の相互作用を研究するキットが挙げられる。 本発明は、図面に示す実施の形態の詳細な記載から理解され、認識されよう。 図面の簡単な説明 図１は、本発明により構成した培養装置の実施の形態を示す拡大透視図である 。 図２は、図１に示した装置の一部を構成する担持フレームを有する細胞保持膜 および本体支持部材の断面立面図である。 図３は、図２と同様であるが、組み立てられた部品とともに用いられ、本体内 に細胞または組織保持部材を配置するジグを示す断面図である。 図４は、細胞または組織保持部材が培養ウェル内に配置され、細胞または組織 保持部材の上面に細胞を増殖させることを示す組み立てられた本体およびフレー ムの断面図である。 図５は、図４と同一の、培養ウェル内で反転された本体を示す断面図である。 図６は、図５と同様であるが、ジグをどのように用いて、細胞または組織保持 部材の反対側に細胞を増殖させるためにフレームおよび細胞または組織保持部材 を所望の位置に配置するかを示す断面図である。 図７は、細胞または組織保持部材の反対側で増殖する第２の細胞型を示す断面 図である。 図８Ａは、フレームおよび細胞保持部材の第２の実施の形態を示す拡大断面図 である。 図８Ｂは、図８Ａの実施の形態から望まれる利点を示す本体および支持体の図 である。 図９は、本発明により構成された本体およびジグの別の実施の形態を示す断面 図である。 図１０は、本体内の複数のフレームを示す断面図である。 図１１は、本体内の別の方向にある複数のフレームを示す断面図である。 発明の詳細な説明 図１は、本発明による組織または細胞増殖装置を示している。図１に示した実 施の形態の装置の３つの主要部品は、管状体10、多孔性膜14の形態にある細胞保 持部材を備えたフレーム12、およびジグ16である。本体10およびフレーム12は、 装置が用いられるときに互いに組み立てられるが、ジグは、以下により詳しく記 載されているように、細胞または組織保持部材が培養ウェルの底部から所望の距 離にあるように、本体内にフレームを適切に配置するのに用いられる。 本体10は、円筒側壁18からなり、液体バリアとして機能するのに十分な強度を 有するいかなる材料から作成されていてもよい。許容される材料の例としては、 熱可塑性樹脂（スチレン、レキサン、およびポリエステルのような）およびアル ミニウムが挙げられる。熱可塑性樹脂を用いる場合には、本体10は従来の射出成 形技術により形成することができる。本体の各々の端部20および22は、ノッチ26 により分離された間隔の離れた多くの脚部24からなる支持体を有している。図面 に示した実施の形態においては、３つの脚部24が各々の端部に設けられているが 、 そのうちの２つのみが図示されている。脚部は、図４に示すように培養ウェルＷ 内に本体を支持することを意図したものであり、ノッチ26は、装置の使用に関し て以下詳細に記載するように、培地が本体10の外側からフレーム12および細胞ま たは組織保持部材14の下であり、ウェルＷの底壁58の上である空間に通過させる 流路を提供する。各々の端部にある脚部は、いずれの端部が下にある場合にも、 ウェル内に本体を垂直に支持することができ、両方の位置において、ノッチによ り、媒質がフレーム12および細胞または組織保持部材14の下であって、ウェルの 底壁の上である空間に進入することができる。 フレーム12は、本体10中に都合よく滑って入るほどちょうど小さい外径を有し ている。このフレームもまた、スチレンのような熱可塑性樹脂または実施される 試験または実験に適合した他の材料から作成されていてもよい。フレーム12の外 側の角32は、図に示したように面取りされ、本体内へのフレームの挿入を容易に するようにしてもよい。オーリング座部34がフレーム12の外面36に設けられ、フ レームの周りにシールを形成して、フレームの底部から本体10内の上面へ上方に 培養培地が流動し、細胞または組織保持部材14を迂回するのを防ぐオーリング38 を担持している。他のシーリング方法を用いてもよい。フレームの一方の側40が 、細胞または組織保持部材が固定される短いプラットホーム42を担持している。 フレームは、本体内で軸方向に摺動可能な支持体として機能する。図に示した実 施の形態において、本体は実質的に円筒であり、フレームは円形リングである。 フレームは中央に、フレームの第１の側40からフレームの第２の側45まで延在 する内腔43を有している。内腔は実質的に円筒である。図８Ａに示す別の実施の 形態においては、フレーム12aの内腔43aは、フレーム第１の側40aの内腔の内径 が、フレームの第２の側45aの内腔の内径よりも小さくなるように傾斜している 。傾斜した内腔の利点を以下に記載する。 フレームにより担持された細胞または組織保持部材14は、ウェル内の培地と直 に接触しないように細胞または組織を実質的に離して支持するが、少なくとも選 択された材料を通過させて細胞に接触させることのできるいかなる材料から形成 されていてもよい。そのような材料の例としては、微細多孔性膜、水和ゲル、限 外濾過膜、およびスクリーン上に支持されたゲルのような層状組合体が挙げられ る。細胞または組織保持部材14は、微細多孔性の、トラックのエッチングされた 、またはキャストされた膜であってもよく、ヒートシール、溶剤接着、超音波溶 接、締付け、または細胞または組織保持部材の特性あるいは細胞または組織保持 部材上の細胞の増殖に悪影響を及ぼさない他の方法によりフレーム12に取り付け られている。細胞または組織保持部材を必要に応じて処理して、細胞を付着させ るために様々な表面を形成してもよい。異なる細胞型は選択的に、異なる表面に 付着する。このように、細胞を付着させるための異なる表面を設けることにより 、細胞を付着させる工程を操作して、研究することができ、異なる表面を用いて 特定の細胞型の結合特性を研究する。例えば、特定の細胞型はある種のインテグ リン(integrin)に結合するが、別のものには結合しない。このように、細胞保持 部材の表面を異なる種類のインテグリンで処理することにより、研究される特定 の細胞型上に発現されるインテグリン受容体の同定が、細胞が相互作用するイン テグリンの種類を同定することにより決定することができる。 細胞保持部材の処理表面は、特定の細胞型と相互作用して、細胞を表面に付着 させるか、あるいは細胞を付着させないようにする。細胞保持部材の表面は、こ の表面を、所望の細胞付着特性を有する組成物に曝すことにより処理してもよい 。ここで用いているように、細胞付着特性という用語は、細胞を組成物に付着さ せるか、または細胞を組成物に付着させないようにする組成物のいかなる特性を も意味するものである。使用してもよい組成物の例としては、以下に限定される ものではないが、細胞外基質タンパク質、インテグリン、および抗体が挙げられ る。細胞外基質タンパク質は、天然または合成であってもよい。天然の細胞外基 質タンパク質の例としては、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンが 挙げられる。合成の細胞外基質タンパク質の例としては、合成類似体および限定 されたペプチドが挙げられる。 処理表面もまた、細胞型混合物を含有する組織試料から１つの細胞型を単離す るのに有用である。混合組織試料内にある細胞型を他のものから単離することが 望ましい場合がしばしばある。所望の細胞型が、混合されている他のものとは異 なる結合特性を有する場合、細胞保持部材の表面は、所望の細胞型に選択的に結 合するが、他の細胞型には結合しないように処理することができる。 細胞保持部材の表面を処理して、細胞の結合を向上させて、一般的に、いかな る細胞型も、装置の他の部品ではなくむしろ細胞または組織保持部材に選択的に 結合するようにしてもよい。これは、細胞または組織保持部材を処理して、親水 性表面を提供することにより、すなわち、化学処理またはプラズマ処理により行 うことができる。 細胞保持部材を複数の領域に分割しても差し支えなく、各々の領域は、異なる 化合物により処理されて、各々の領域が異なる種類の細胞を引きつけるように細 胞保持部材上に多数の細胞付着表面が作成される。 ジグ16もまた、装置の他の部品のようにスチレンのような熱可塑性樹脂から形 成してもよい。ある実施の形態において、ジグは、プランジャ50およびぎざぎざ の付いた外面53を有するハンドルまたはフランジ52を備えている。ハンドルまた はフランジは、本体10の内径よりも大きい外径を有しており、図示されている形 態においては、その外径は、同様に本体の外径よりも大きい。ハンドル52の底部 は、本体の端部と噛み合う肩部54を限定している。この本体の端部を通って、プ ランジャ50が挿入されて、フレーム12およびその細胞または組織保持部材14を本 体内に適応させている。プランジャ50の外径は、本体内に挿入され、フレーム12 と噛み合い、フレームを所望の位置まで本体内の軸方向に押せるように、本体10 の内径よりもわずかに小さい。プランジャの内径は好ましくは、ジグが本体10内 に挿入されてフレームおよび細胞または組織保持部材を配置するときに、プラン ジャの端部56が、フレームに取り付けられる細胞または組織保持部材14と噛み合 わないように、プラットホーム42の直径よりも大きい。この関係は図３に明らか に示されている。 図９に示した別の実施の形態において、本体62が一方の端部に、本体の中央に 向かって内側に延在する突出部64を有している停止機構60が設けられている。こ の突出部上に、フレーム12が配置されてもよい。この実施の形態において、ジグ 66は、フレームと噛み合い、フレームを移動させて本体62の他方の端部で突出部 64と接触させるように管状体内に適合する形状を有している。この停止機構60は 、フレームがジグにより正確な位置まで移動されるように設けられている。 図４−７において、細胞または組織保持部材の両側に細胞または組織を増殖さ せる装置を使用する様子が示されている。図４において、本体10、フレーム12お よび細胞または組織保持部材14から構成されるアセンブリが、ウェルの底部壁58 と接する本体の端部20の脚部24によりウェルＷ内に配置されているのが示されて いる。フレーム12は、フレームの上側（側部40）にある細胞または組織保持部材 14に関して位置合わせされ、フレームは本体の下側端部20に隣接して配置されて いる。フレームの正確な位置は、ジグ16を使用することにより設定してもよい。 細胞または組織の試料を細胞または組織保持部材14の上面に付着させ、培養培地 を本体の外側にあるウェルＷに供給する。細胞または組織保持部材14の底面に空 気が溜まる可能性を最小にするために、本体の外側のみに培地を供給するように 注意しなければならない。培地は、本体が配置されている脚部24の間のノッチ26 を通って流動し、細胞または組織保持部材の底面を濡らす。細胞または組織保持 部材が一度濡れたら、追加の培地および細胞を部材の上面に付着させる。細胞に は、細胞または組織保持部材14を通って細胞に到達する培地、並びに細胞または 組織保持部材の上からの培地の両方により栄養が与えられる。これは、生体内で 増殖する通常の細胞および組織における条件に非常に似ている。 図８Ａに示すように、内腔が43aおよび43bで傾斜している場合、組織または細 胞増殖装置は、培養培地を含有するウェル中に空気溜まりを最小にして配置して もよい。内腔43bの傾斜壁が培養培地の表面11と実質的に平行となるような角度 で装置を培養培地中に下降させる場合、空気が逃げて、細胞または組織保持部材 の下に空気が溜まるのが避けられる。このことが図８Ｂに示されている。 一度細胞が定着したら、フレームおよび細胞または組織保持部材を備えた本体 10をウェルＷ内で反転させ（あるいは、新しいウェル内に配置してもよい）、図 ５および６に示したように、本体の下方の端部に移動させる。ジグ16を用いてフ レーム12を正確に配置する。肩部54から端部56までの測定されたプランジャ50の 長さを選択して、所望のフレームの位置を達成する。ジグを取り外した後、第２ の試料を細胞または組織保持部材の新しい上面に施す。追加の培地をウェルに供 給してもよい。新しい上面の試料は主に、細胞または組織保持部材から栄養が供 給される。細胞または組織保持部材により分離された２つの細胞型のこの層形成 は、生体内で見られる条件に擬態している。 本発明のある実施の形態において、気泡が部材の下に捕捉される可能性は、細 胞または組織保持部材をフレームの片側に配置することにより最小となる。細胞 は、フレームの内腔とは反対の細胞または組織保持部材の側面に最初に付着すべ きである。部材が、フレームの内腔の上にあるような位置にあり、培地が、細胞 を加える前に部材の下側から加えられる場合、空気が乾燥した膜を通って逃げる 結果として、気泡が捕捉されるのが最小となる。第１組の細胞が保持部材上の単 層を形成した後、内腔に向かって位置する細胞または組織保持部材の面が上方に 向くように装置を反転させ、第２組の細胞をこの面に付着させても差し支えない 。反転された方向において、フレームおよび細胞または組織保持部材の表面は、 内腔のない平らな表面を形成する。細胞保持部材の平らな表面が、本体のノッチ と同じ高さの位置にジグによりスライドさせた場合、空気がノッチを通って逃げ るので、空気が細胞保持部材の下に捕捉されない。 ここで用いているように、細胞という用語は、例えば、定着した細胞株、一次 培養細胞、および単離細胞のようないかなる種類の細胞をも含む。このように、 細胞を増殖または保持する装置または部材は、そのようないかなる細胞または組 織にも使用する装置を示すことを意図する。 本発明の組織または細胞増殖装置および方法を用いて、多くの細胞対細胞の相 互作用を研究してもよい。細胞対細胞の相互作用は、第１の細胞と第２の細胞と の間の接触である。細胞対細胞の相互作用は、直接的であっても間接的であって もよい。直接的な細胞対細胞の相互作用は、第１の細胞の表面が、第２の細胞の 表面と直接的に接触するものである。直接的な細胞対細胞の相互作用は、細胞の 移行、すなわち、細胞移動を含んでもよい。間接的な細胞対細胞の相互作用は、 第１の細胞が、第２の細胞により生成されて、放出される因子と接触するもので ある。細胞の表面としては、細胞膜、表面受容体または他のタンパク質、および 細胞により生成され、その表面上に層状となった細胞外基質が挙げられる。 細胞または組織保持部材の内腔は、細胞対細胞の相互作用が生じるような直径 を有している。内腔の直径は、研究すべき特定の相互作用に依存し、当業者によ り容易に決定される。 一度異なる細胞型が膜の反対の側で増殖したら、細胞対細胞の相互作用の影響 を研究してもよい。フレームを本体から取り外して、所望なように処理または貯 蔵してもよい。細胞を研究する機構の１つは、電子鏡検法によるものがある。 本発明の装置および方法を用いて、細胞移行を研究してもよい。単層の細胞を 膜の片側に平らに付着させ、次いで、第２の細胞型を第１の細胞型の頂面に積層 させてもよい。次いで、移行は、細胞または組織保持部材を取り外して、細胞の 位置を決定することにより求めてもよい。 本発明の組織または細胞増殖方法および装置を、上述した１つのフレーム12に 用いても、あるいは図１０および１１に示すような多数のフレーム67に用いても よい。使用してもよいフレーム67の最大数は、本体68の高さ以下であり、使用す る個々のフレームの高さにより決定される組合せ高さを有するフレームの数であ る。フレーム67は、あるフレームの細胞または組織保持部材が、他のフレームの 細胞または組織保持部材に関して様々な方向にあるように、本体68内に位置して もよい。第１のフレーム69の細胞または組織保持部材70は、図１０に示すように 、第２のフレーム72の細胞または組織保持部材に隣接していても、あるいは、図 １１に示すように、２つのフレームの細胞または組織保持部材70および71がある フレームの高さと等しい距離だけ離れているように第２のフレーム72の他方の端 部73に隣接していてもよい。 別の実施の形態において、培養ウェル内で組織または細胞を増殖させるキット を提供する。このキットは、管状体およびこの本体内に適合し、複数の内腔を有 する細胞または組織保持部材を有する少なくとも１つのフレームを備えている。 細胞または組織保持部材の内腔は、細胞対細胞の相互作用が生じるような直径を 有している。内腔の直径は、研究すべき特定の相互作用に依存し、当業者により 容易に決定される。 必要に応じて、キットは、電子鏡検法緩衝剤アッセイ装置を備えていてもよい 。電子鏡検法緩衝剤アッセイ装置は、細胞が増殖する細胞または組織保持部材に ついて電子鏡検法を行うのに必要な緩衝剤を備えており、特定の構成部材が当業 者によく知られている。例えば、試薬としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ）、カコジル酸塩緩衝液中のパラホルムアルデヒド／グルタルアルデヒド、四酸 化オスミウム、および等級のエタノール(a graded series of ethanol)が挙げら れる。 以下の記載から、当業者は、本発明の多くの利点を認識し、本発明の精神から 逸脱せずに説明の実施の形態に変更を行えることも認識されよう。したがって、 本発明の範囲は、図示して記載した特定のものに限定されず、むしろ、請求の範 囲およびその同等のものにより決定されることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．培養ウェル内に配置する細胞増殖装置において、 少なくとも部分的に本体を通って延在する管腔を限定する内面を有する本体 であって、該管腔とつながっている第１と第２の開口部を有する本体、 前記管腔内に適合する外面を有する少なくとも１つのフレームであって、第 １と第２の面を有し、前記第１と第２の開口部との間に配置されるように適用さ れる少なくとも１つのフレーム、 前記少なくとも１つのフレームと前記本体の内面との間に効果的に接続され た、該フレームと該本体の内面との間の培養培地の流動を妨げるシール、および 前記フレームの第１の面に固定された、細胞を保持する細胞保持部材からな ることを特徴とする装置。 ２．前記少なくとも１つのフレームが、前記本体の第１の開口部に隣接した第１ の位置と、該本体の第２の開口部に隣接した第２の位置との間の前記管腔内で摺 動するように適用されていることを特徴とする請求の範囲１記載の装置。 ３．前記本体が第１の端部に第１の支持部を、第２の端部に第２の支持部を有し 、該第１の第２の支持部の各々が、前記細胞増殖装置を前記培養ウェル内の第１ と第２の端部のいずれかの上に配置できるように、該細胞増殖装置を支持するよ うに適用されることを特徴とする請求の範囲１記載の装置。 ４．前記第１と第２の支持部の各々が、前記管腔とつながっている少なくとも１ つのノッチを有することを特徴とする請求の範囲３記載の装置。 ５．前記本体が第１の端部に第１の支持部を、第２の端部に第２の支持部を有し 、該第１の第２の支持部の各々が、前記細胞増殖装置を前記培養ウェル内の第１ と第２の端部のいずれかの上に配置できるように、該細胞増殖装置を支持するよ うに適用されることを特徴とする請求の範囲２記載の装置。 ６．前記管腔内に収容され、前記フレームが前記本体の第１と第２の開口部に関 して摺動可能に位置できるように該フレームと組み合うように適合されたプラン ジャを有するジグをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲１記載の 装置。 ７．前記本体の管腔内に配置され、前記フレームと組み合って該フレームが停止 部を越えて摺動するのを妨げるように適用された停止部をさらに備えていること を特徴とする請求の範囲６記載の装置。 ８．前記プランジャが、前記細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞 を有することを特徴とする請求の範囲６記載の装置。 ９．前記管腔内に収容され、前記フレームが前記本体の第１と第２の開口部に関 して摺動可能に位置できるように該フレームと組み合うように適合されたプラン ジャを有するジグをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲２記載の装置 。 10．前記管腔内に収容され、前記フレームが前記本体の第１と第２の開口部に関 して摺動可能に位置できるように該フレームと組み合うように適合されたプラン ジャを有するジグをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲３記載の装置 。 11．前記管腔が実質的に円筒であり、前記フレームがリングであることを特徴と する請求の範囲１記載の装置。 12．前記フレーム、前記細胞保持部材および前記シールが、前記管腔を２つの異 なる流体区画に区切っていることを特徴とする請求の範囲１記載の装置。 13．前記フレームが、前記細胞保持部材が第１の開口部に少なくとも部分的に亘 って配置されるように、該フレームの第１の面の第１の開口部から該フレームの 第２の面の第２の開口部まで延在する内腔を限定する内面を有していることを特 徴とする請求の範囲１記載の装置。 14．前記内腔が傾斜していることを特徴とする請求の範囲13記載の装置。 15．前記内腔が、前記フレームの第２の面にある内腔の直径よりも小さい、該フ レームの第１の面にある直径を有することを特徴とする請求の範囲14記載の装置 。 16．前記フレームが、該フレームの第１の面の第１の開口部から該フレームの第 ２の面の第２の開口部まで延在する内腔を限定する内面を有し、前記細胞保持部 材が前記第１の開口部に少なくとも部分的に亘って配置されていることを特 徴とする請求の範囲３記載の装置。 17．前記シールおよび前記細胞保持部材が、細胞が前記２つの異なる流体区画の 一方から他方に通過するのを防ぐことを特徴とする請求の範囲12記載の装置。 18．前記細胞保持部材が親水性であることを特徴とする請求の範囲１記載の装置 。 19．前記フレームの高さが、前記本体の高さよりも実質的に小さいことを特徴と する請求の範囲１記載の装置。 20．前記少なくとも１つのフレームが、第１と第２のフレームを含むことを特徴 とする請求の範囲１記載の装置。 21．前記第２のフレームが、該第２のフレームの第１の面が該第１のフレームの 第１の面に隣接して位置するように方向付けられていることを特徴とする請求の 範囲20記載の装置。 22．前記第２のフレームが、該第２のフレームの第１の面が該第１のフレームの 第２の面に隣接して位置するように方向付けられていることを特徴とする請求の 範囲20記載の装置。 23．前記第２のフレームが、該第２のフレームの第２の面が該第１のフレームの 第２の面に隣接して位置するように方向付けられていることを特徴とする請求の 範囲20記載の装置。 24．前記少なくとも１つのフレームが少なくとも３つのフレームを含むことを特 徴とする請求の範囲１記載の装置。 25．細胞保持部材の少なくとも１つの面で細胞を増殖させる方法であって、 (A) 該細胞保持部材を支持フレームに固定し、 (B) 該支持フレームを第１の位置で本体の管腔内に配置し、 (C) 該本体が第１の端部から支持されるように、培養培地を受容するように適 用されたウェル内に該本体を配置し、 (D) 該本体を該ウェル内から取り出し、 (E) 前記フレームの位置を第２の位置に調節し、 (F) 前記本体が第２の端部から支持されるように、前記ウェル内に該本体を配 置する各工程からなることを特徴とする方法。 26．前記工程(C)が、 前記ウェルに前記培養培地を加える前に、該ウェル内に前記本体を配置し、 該ウェルに該培養培地を加え、 前記細胞保持部材の下にある前記管腔内の空気を、該細胞保持部材を通して 逃がす各工程からなることを特徴とする請求の範囲25記載の方法。 27．前記工程(B)が、管腔とつながっている少なくとも１つのノッチを有する本 体の管腔内に前記支持フレームを配置する工程を含み、前記ウェルに前記培養培 地を加える工程が、該ウェルと前記本体との間に該培養培地を加える工程を含む ことを特徴とする請求の範囲26記載の方法。 28．前記工程(E)が、ジグを用いて前記フレームの位置を前記第２の位置に調節 する工程を含むことを特徴とする請求の範囲25記載の方法。 29．前記工程(E)が、前記細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞を 有するジグを用いて、前記フレームの位置を前記第２の位置に調節する工程を含 むことを特徴とする請求の範囲25記載の方法。 30．前記工程(A)が、前記細胞保持部材が傾斜した内腔に少なくとも部分的に亘 り配置されるように傾斜した内腔を限定する傾斜壁を有するフレームに該細胞保 持部材を固定する工程を含み、前記工程(C)が、 前記ウェルに培養培地を加え、 前記フレームの傾斜壁が前記培養培地の表面に対して実質的に平行となるよ うな角度で該培養培地中に前記本体を配置する各工程を含むことを特徴とする請 求の範囲25記載の方法。 31．前記工程(B)が、前記管腔中に延びる停止部を有する本体の管腔内に前記フ レームを配置する工程を含み、前記工程(E)が、前記支持フレームが前記停止部 と接触するまで、前記管腔内で該支持フレームを摺動させる工程を含むことを特 徴とする請求の範囲25記載の方法。 32．細胞保持部材の少なくとも１つの面で細胞を増殖させる方法であって、 (A) 前記細胞保持部材を支持フレームに固定し、 (B) 該支持フレームを本体の管腔内に配置し、 (C) 該支持フレームが該管腔内の第１の所望の位置に配置されるまで、該管腔 内で該支持フレームを摺動させ、 (D) 前記細胞の増殖を促進させる培養培地中に前記本体を配置する各工程から なることを特徴とする方法。 33．前記工程(D)が、 前記本体が第１の端部から支持されるように、ウェルに前記培養培地を加え る前にウェル中に該本体を配置し、 該ウェルに該培養培地を加え、 前記細胞保持部材の下にある前記管腔内の空気を、該細胞保持部材を通して 逃がす各工程を含むことを特徴とする請求の範囲32記載の方法。 34．前記工程(D)が、 前記ウェルから前記本体を取り出し、 前記本体の管腔内の第２の所望の位置に前記フレームを摺動させ、 該本体が第２の端部から支持されるように該ウェル内に該本体を配置する各 工程を含むことを特徴とする請求の範囲33記載の方法。 35．前記工程(A)が、前記管腔とつながっている少なくとも１つのノッチを有す る本体の管腔内に前記フレームを配置する工程を含み、前記方法が、 前記フレームが、前記少なくとも１つのノッチに隣接する前記本体の第２の 端部に配置されるまで、前記管腔内で該フレームを摺動させる工程を含むことを 特徴とする請求の範囲34記載の方法。 36．前記工程(C)が、ジグを用いて、前記本体の管腔内の第１の所望の位置に前 記フレームを摺動させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲32記載の方法。 37．前記工程(C)が、前記細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞を 有するジグを用いて、前記本体の管腔内の第１の所望の位置内に前記フレームを 摺動させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲32記載の方法。 38．前記工程(A)が、前記細胞保持部材が傾斜した内腔に少なくとも部分的に亘 って配置されるように、傾斜した内腔を限定する傾斜壁を有するフレームに該細 胞保持部材を固定する工程を含み、前記工程(D)が、 前記ウェルに培養培地を加え、前記フレームの傾斜壁が該培養培地の表面に 対して実質的に平行になる角度で該培養培地中に前記本体を配置する各工程から なることを特徴とする請求の範囲32記載の方法。 39．前記工程(B)が、前記管腔中に延びる停止部を有する本体の管腔内に前記フ レームを配置する工程を含み、前記工程(C)が、 前記フレームが前記停止部と接触するまで、前記管腔内で該フレームを摺動 させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲32記載の方法。 40．第１と第２の細胞保持部材上に配置された細胞を増殖させる方法であって、 (A) 該第１と第２の細胞保持部材をそれぞれ第１と第２の支持フレームから支 持し、 (B) 該第１と第２の支持フレームを本体の管腔内に配置し、 (C) 該本体を、前記第１と第２の細胞保持部材上の細胞の増殖を促進させる培 養培地中に配置する各工程からなることを特徴とする方法。 41．前記工程(B)が、前記第１と第２の支持フレームの各々が前記本体に対して 所望の位置に配置されるまで、該第１と第２の支持フレームを前記管腔内で摺動 させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲40記載の方法。 42．前記第１と第２の支持フレームを摺動させる工程が、 ジグを用いて、該第１と第２の支持フレームを前記本体の管腔内の所望の位 置に摺動させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲41記載の方法。 43．前記第１と第２の支持フレームを摺動させる工程が、 前記第１の細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞を有するジグを 用いて、該第１と第２の支持フレームを前記本体の管腔内の所望の位置に摺動さ せる工程を含むことを特徴とする請求の範囲41記載の方法。 44．前記工程(C)が、 前記培養培地を加える前に、前記本体をウェル中に配置し、 該ウェルに該培養培地を加え、 前記第１と第２の細胞保持部材の下にある管腔内の空気を、該培養培地が該 管腔に進入するときに該第１と第２の細胞保持部材を通して逃がす各工程を含む ことを特徴とする請求の範囲40記載の方法。 45．前記工程(B)が、 前記第１の細胞保持部材が前記第２の細胞保持部材と接触するように前記第 １と第２のフレームを配置する工程を含むことを特徴とする請求の範囲40記載 の方法。 46．細胞保持部材の少なくとも１つの面上で細胞を増殖させる方法であって、 (A) 支持フレームの第１の表面の第１の開口部から該支持フレームの第２の表 面の第２の開口部まで延在する内腔を限定する内面を有する支持フレームを提供 し、該支持フレームが、前記第１の開口部の直径が前記第２の開口部の直径より も小さいように傾斜した少なくとも１つの側壁を有するように前記内腔を限定し ており、 (B) 前記細胞保持部材が前記第１の開口部に少なくとも部分的に亘って配置さ れるように前記支持フレームの第１の表面上に該細胞保持部材を配置し、 (C) 前記支持フレームを培養培地のウェル中に挿入し、このとき、該支持フレ ームの第２の表面が、第１の表面の前に該培養培地に進入し、前記第２の開口部 が、空気が前記内腔内に捕捉されないように前記培養培地の表面に対してゼロ度 より大きい角度で配置されており、それによって、該培養培地が前記細胞保持部 材上で細胞の増殖を促進させる各工程からなることを特徴とする方法。 47．前記工程(C)が、 前記支持フレームを本体の管腔内に配置し、該本体が第１の端部から支持さ れるように、培養培地のウェル中に該本体を挿入する工程を含むことを特徴とす る請求の範囲46記載の方法。 48．前記工程(C)が、 前記支持フレームが前記本体に対して所望の位置に配置されるまで、該支持 フレームを前記内腔内で摺動させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲47記 載の方法。 49．前記工程(C)が、 ジグを用いて、前記フレームを前記本体の管腔内の所望の位置に摺動させる 工程を含むことを特徴とする請求の範囲48記載の方法。 50．前記工程(C)が、 前記細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞を有するジグを用い て、前記フレームを前記本体の内腔内の所望の位置に摺動させる工程からなる ことを特徴とする請求の範囲48記載の方法。 51．前記工程(C)が、前記管腔中に延びる停止部を有する本体の管腔内に前記フ レームを配置する工程を含み、前記方法が、 前記フレームが前記停止部と接触するまで、前記管腔内に該フレームを摺動 させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲48記載の方法。 52．前記工程(C)が、 前記本体を前記ウェルから取り出し、 該フレームを前記本体の管腔内の第２の所望の位置に摺動させ、 前記本体が第２の端部から支持されるように該本体を前記ウェル内に配置す る各工程を含むことを特徴とする請求の範囲48記載の方法。 53．培養ウェル内で細胞を増殖させるキットにおいて、 少なくとも部分的に本体を通って延びる管腔を限定する内面を有する本体で あって、前記管腔とつながっている第１と第２の開口部を有する本体、 前記管腔内に適合する外面を有する少なくとも１つのフレームであって、第 １と第２の面を有し、該第１と第２の開口部との間に配置されるように適用され る少なくとも１つのフレーム、 該フレームの第１の面に固定された、細胞を保持する細胞保持部材、および 前記管腔内に収容されるように適用され、前記フレームが前記本体の第１と 第２の開口部に関して摺動可能に位置できるように該フレームと噛み合うプラン ジャを有するジグからなることを特徴とするキット。 54．前記少なくとも１つのフレームおよび前記本体の内面が、シールにより効果 的に接続されて、該フレームと該本体の内面との間で培養培地が流動しないよう にすることを特徴とする請求の範囲53記載のキット。 55．前記本体が第１の端部に第１の支持部を、第２の端部に第２の支持部を有し 、該第１と第２の支持部の各々が、前記本体を前記培養ウェル内の第１と第２の 端部のいずれかの上で位置できるように該本体を支持するように適用されている ことを特徴とする請求の範囲53記載のキット。 56．前記本体の管腔内に配置され、前記フレームと噛み合って該フレームが停止 部を越えて摺動するのを防ぐように適用された停止部を備えていることを特徴 とする請求の範囲53記載のキット。 57．前記プランジャが、前記細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞 を有することを特徴とする請求の範囲53記載のキット。 58．前記フレームが、前記細胞保持部材が第１の開口部に少なくとも部分的に亘 って配置されるように、該フレームの第１の面の第１の開口部から該フレームの 第２の面の第２の開口部まで延在する内腔を限定する内面を有することを特徴と する請求の範囲53記載のキット。 59．前記内腔が傾斜していることを特徴とする請求の範囲58記載のキット。 60．前記細胞保持部材が、前記第１の面上の第１の細胞試料が前記第２の面上の 第２の細胞試料と相互作用して、細胞対細胞の相互作用を生じることのできるよ うな大きさの直径を有する内腔を有することを特徴とする請求の範囲53記載のキ ット。 61．電子鏡検法緩衝アッセイ装置を備えていることを特徴とする請求の範囲53記 載のキット。 62．細胞保持部材の少なくとも１つの面で細胞を増殖させる方法であって、 (A) 前記細胞保持部材を支持フレームに固定し、 (B) 該支持フレームを、開口部を有する本体の管腔内に配置し、 (C) 該本体を、培養培地を含んでいないウェル内に配置し、 (D) 該培養培地が前記本体内の開口部を通って前記管腔に進入して、前記細胞 保持部材の表面と接触できるように、前記ウェル内に該培養培地を加える各工程 からなることを特徴とする方法。 63．前記工程(B)が、前記開口部を限定する少なくとも１つのノッチを有する第 １の支持部を有する本体の管腔内に前記フレームを配置する工程を含み、前記工 程(C)が、前記第１の支持部が前記ウェルと組み合うように前記本体を配置する 工程を含み、前記工程(D)が、 前記ウェルと前記本体との間で該ウェルに培養培地を加える工程を含むこと を特徴とする請求の範囲62記載の方法。 64．前記細胞を、前記本体の管腔を通して前記細胞保持部材に加える工程を含む ことを特徴とする請求の範囲63記載の方法。 65．前記フレームを前記第２の所望の位置に摺動させる工程が、 ジグを用いて、前記本体の管腔内の第２の所望の位置に前記フレームを摺動 させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲63記載の方法。 66．前記フレームを前記第２の所望の位置に摺動させる工程が、 前記細胞保持部材の直径よりも大きい直径を有する空洞を有するジグを用い て、前記フレームを前記本体の管腔内の第２の所望の位置に摺動させる工程を含 むことを特徴とする請求の範囲63記載の方法。