CN108697641A - 临床制剂 - Google Patents

Abstract

本公开内容的一些方面提供了在多达48小时或更久的储存过程中支持细胞和组织的生存力、重新铺板效率和再增殖能力的临床介质。本文提供的临床介质也可用于临床冲洗。还提供了包含细胞群体或组织和本文提供的临床介质的细胞或组织制品，以及用于制备这样的制品的方法。还公开了使用本文提供的临床介质和细胞和组织制品的方法，例如，将有效量的细胞或组织施用给有此需要的受试者。

Description

临床制剂

相关申请

本申请要求2015年8月18日提交的标题为“临床制剂”的美国临时申请系列号62/206,821在美国法典第35篇第119(e)条下的权益，其整个内容通过引用并入本文。

背景

目前可得到的用于储存和运送(transport)待移植的细胞和组织的临床介质不会支持细胞生存力(viability)和功能超过相对短的时间段(例如，4-6小时的最大值)，并且甚至在那些短储存时间中，通常观察到显著的细胞和细胞功能的损失。另外，当前的包含碳酸氢根阴离子的临床介质不可耐受热灭菌，并且经常甚至在环境温度储存期间形成碳盐沉淀，从而导致短储存期限。

发明内容

多种医学操作依赖于临床溶液的应用，例如，用于冲洗外科手术区域、创伤清洁、外科手术后粘着阻止、和从外科手术区域除去碎片。在细胞或组织植入或移植的背景下，将临床溶液用于配制所述细胞或组织，在配制后、在施用给受试者之前储存所述细胞或组织，和用作在施用过程中(例如，在注射细胞或组织过程中)携带细胞或组织构建体(construct)的介质。在临床背景下(例如，在冲洗、创伤清洁、注射等过程中)与细胞或组织发生接触的溶液通常是无菌的、无热原的，在生理pH缓冲，并表现出生理学摩尔渗透压浓度(osmolarity)。

与目前可得到的用于在外科手术过程中使用以防止对敏感细胞或组织的创伤的外科冲洗溶液有关的一个问题是，碳酸氢根阴离子作为缓冲剂与可以与碳酸氢根阴离子形成沉淀物的盐(例如，通常用作药物赋形剂的基本上所有的钙和镁的离子盐)一起的应用。当将含有碳酸氢盐和钙和/或镁的溶液热灭菌时，碳酸盐的形成和随后的沉淀可以快速地发生，并且也经常在环境储存条件随时间发生。

沉淀问题的一个可能的解决方案是，提供外科冲洗溶液作为双部分试剂盒，其中一个部分含有碳酸氢盐缓冲剂且另一个部分含有钙盐和/或镁盐。通常在即将使用前将所述部分混合在一起以形成单一溶液。这样的双部分溶液的应用与几个缺点有关，包括需要制备两个单独溶液，代表混合错误风险的不方便混合步骤，和混合溶液的通常短的半衰期。因此，单部分冲洗溶液将是有利的且是非常合乎需要的。

已经尝试来制备单部分冲洗溶液。参见，例如，欧洲专利申请EP1067907B1(Armitage)。这样的尝试通常依赖于两性离子有机缓冲剂诸如N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(通常被称作HEPES)用于防止上面讨论的碳酸盐沉淀问题的用途。但是，在这样的单部分冲洗溶液中使用的两性离子有机缓冲剂通常与细胞或组织培养基不相容，且因而不会提供在细胞储存过程中的沉淀物形成问题的广泛适用解决方案。

除了如上面所指出的形成沉淀物和与常见细胞培养组分的不相容性的问题以外，常用的外科冲洗溶液还通常包含不可经受蒸汽灭菌的组分的组合，例如，某些碳水化合物或谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。

不同于以前开发的单部分冲洗溶液，本公开内容提供了不需要使用两性离子有机缓冲剂的单部分溶液。本发明的稳定化的冲洗溶液解决了当前冲洗溶液的沉淀和有关的短储存期限的问题。本文提供的溶液具有与目前可得到的溶液的储存期限相比极大地改善的储存期限。

本文提供的溶液可用于冲洗、细胞重构(reconstitution)(例如，冷冻保存的或沉淀的细胞的细胞重构)、细胞储存(例如，在配制后用于装运或移植)、运送和/或将细胞施用给受试者(例如，在细胞植入或移植的背景下)。本文提供的溶液可以与不同的细胞类型和不同的施用部位结合使用。尽管眼科学应用是优选的，其它应用也被预见到且被本公开内容包括。

本公开内容的一些方面提供了用于细胞重构、储存、运送和/或施用给受试者的溶液。在某些实施方案中，所述溶液包含(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂；和(b)至少2mM葡萄糖；和(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂(osmoticallyactive agent)。在某些实施方案中，所述溶液包含2-150mM葡萄糖，例如，5-150mM、10-150mM、15-150mM、2-100mM、2-50mM、5-30mM、10-100mM、10-50mM、10-30mM、10-20mM、12-18mM、14-17mM、15-17或16-17mM。在某些实施方案中，所述溶液包含至少2.5mM、至少3mM、至少5mM、至少7.5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM或至少30mM葡萄糖。在某些实施方案中，所述葡萄糖由右旋糖(dextrose)组成或包含右旋糖。在某些实施方案中，所述溶液包含至少2.5mM、至少3mM、至少5mM、至少6mM、至少7.5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM或至少30mM右旋糖。在某些实施方案中，所述溶液包含至少0.03％(w/v)、至少0.05％(w/v)、至少0.1％(w/v)、至少0.125％(w/v)、至少0.15％(w/v)、至少0.175％(w/v)、至少0.2％(w/v)、至少0.225％(w/v)、至少0.25％(w/v)、至少0.275％(w/v)、至少0.28％(w/v)、至少0.29％(w/v)、至少0.3％(w/v)、至少0.35％(w/v)、至少0.4％(w/v)、至少0.45％(w/v)、至少0.5％(w/v)、至少0.55％(w/v)、至少0.6％(w/v)、至少0.65％(w/v)、至少0.7％(w/v)、至少0.75％(w/v)、至少0.8％(w/v)、至少0.9％(w/v)、至少1％(w/v)、至少1.25％(w/v)、至少1.5％(w/v)、至少1.75％(w/v)、至少2％(w/v)、至少2.125％(w/v)、至少2.5％(w/v)、至少2.75％(w/v)或至少3％(w/v)葡萄糖。在某些实施方案中，所述溶液还包含二价阳离子的来源。在某些实施方案中，所述二价阳离子包含钙和/或镁阳离子。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源。在某些实施方案中，所述溶液包含钙源。在某些实施方案中，所述溶液包含镁源。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂。

本公开内容的一些方面提供了用于细胞重构、储存、运送和/或施用给受试者的溶液，其中所述溶液包含(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂；和(b)葡萄糖；和(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂；和(d)二价阳离子的来源。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含乙酸盐和/或柠檬酸盐缓冲剂。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述葡萄糖是D-葡萄糖(右旋糖)。在某些实施方案中，所述葡萄糖的浓度是5-50mM。在某些实施方案中，所述葡萄糖的浓度是10-25mM。在某些实施方案中，所述葡萄糖的浓度是10-20mM。在某些实施方案中，所述葡萄糖的浓度是约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含药学上可接受的二价阳离子的盐。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含药学上可接受的钙盐。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含药学上可接受的镁盐。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含药学上可接受的钙盐和/或药学上可接受的镁盐，所述盐选自与选自乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、盐酸、马来酸、草酸、磷酸、硬脂酸、琥珀酸和硫酸的酸形成的钙盐和/或镁盐。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含钙源。在某些实施方案中，所述钙源包含氯化钙。在某些实施方案中，所述钙源包含氯化钙二水合物。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含镁源。在某些实施方案中，所述镁源包含氯化镁。在某些实施方案中，所述镁源包含氯化镁六水合物。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述钙源的浓度是0.25-0.75mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是0.4-0.65mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是0.5-0.6mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是约0.6mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是0.5-0.9mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是0.6-0.8mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是约0.7mM。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述镁源的浓度是0.05-5mM。在某些实施方案中，所述镁源的浓度是0.1-0.3mM。在某些实施方案中，所述镁源的浓度是约0.3mM。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，以柠檬酸盐或乙酸盐的形式提供所述柠檬酸盐或乙酸盐缓冲剂。在本文提供的溶液的某些实施方案中，将所述柠檬酸盐缓冲剂提供为柠檬酸钠。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.1-5mM。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.5-2mM。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是约1mM。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液的pH是6.8-7.8。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液的pH是7.2-7.6。在某些实施方案中，所述溶液的pH是7.4-7.5。在某些实施方案中，所述溶液的pH是约7.5。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述渗透压活性剂是盐。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂是钠盐。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂是氯化钠。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂的浓度是约100-250mM。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂的浓度是约125-175mM。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂的浓度是约150mM。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液是等渗的。在某些实施方案中，所述溶液是高渗的。在某些实施方案中，所述溶液表现出约270-345mOsm/l的摩尔渗透压浓度。在某些实施方案中，所述溶液表现出约300-330mOsm/l的摩尔渗透压浓度。在某些实施方案中，所述溶液的摩尔渗透压浓度是约315mOsm/l。

在某些实施方案中，所述溶液还包含钾盐。在某些实施方案中，所述钾盐是氯化钾。在某些实施方案中，所述KCl的浓度是0.2-5mM。在某些实施方案中，所述KCl的浓度是1-2.5mM。在某些实施方案中，所述KCl的浓度是约2mM。

在某些实施方案中，所述溶液还包含粘弹性聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物是合成的聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物以有效地减少溶液中的细胞暴露于剪切应力(shear stress)的浓度存在。在某些实施方案中，所述聚合物的浓度是0.001-5％w/v。在某些实施方案中，所述聚合物的浓度是约0.05％w/v。在某些实施方案中，所述聚合物是透明质酸或其盐或溶剂化物。在某些实施方案中，所述聚合物是透明质酸钠。在某些实施方案中，所述透明质酸或其盐或溶剂化物是Healon(Abbott)、(Novozymes)或Pro-(Alcon)。在某些实施方案中，所述透明质酸或其盐或溶剂化物的浓度是约0.001％-0.05％w/v，例如，0.01％-0.05％w/v、约0.02％-0.05％w/v、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％或约0.05％w/v。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠和葡萄糖(例如，D-葡萄糖)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖(例如，D-葡萄糖)和氯化钾或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖和约145mM NaCl或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的约0.5-0.9mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖和约116-174mM NaCl或基本上由其组成。

在某些实施方案中，所述溶液还包含约2mM KCl。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约2mM KCl或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的约0.5-0.9mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖、约116-174mM NaCl和约1.6-2.4mM KCl或基本上由其组成。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖(例如，D-葡萄糖)和粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖(例如，D-葡萄糖)、氯化钾和粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mMNaCl和约1-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水溶液中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl、约2mM KCl和约0.01-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，约0.01-0.05％w/v透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约2mMKCl、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约0.05％透明质酸或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含约0.5-0.8mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约1.6-2.4mM KCl、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖、约116-174mM NaCl和约0.04-0.06％透明质酸或基本上由其组成。

在某些实施方案中，所述溶液是无菌的。在某些实施方案中，所述溶液是基本上无热原的。

在某些实施方案中，所述溶液不包含碳酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，所述溶液不包含谷胱甘肽或谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。在某些实施方案中，所述溶液不包含两性离子有机缓冲剂。

在某些实施方案中，本文提供的溶液可以在25℃储存至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月，而没有可测量的溶质沉淀和/或可测量的所述溶液支持在所述溶液中储存的细胞的存活和生存力的能力的损失。在某些实施方案中，本文提供的溶液可以在2-8℃储存至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月，而没有可测量的溶质沉淀和/或可测量的所述溶液支持在所述溶液中储存的细胞的存活和生存力的能力的损失。

本公开内容的一些方面提供了包含在本文提供的溶液中的细胞群体的制品(preparation)。在某些实施方案中，所述细胞群体适合用于移植进受试者。在某些实施方案中，所述细胞群体适合用于移植进受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述细胞群体包含RPE细胞。在某些实施方案中，所述细胞群体包含感光细胞。在某些实施方案中，所述细胞群体包含间充质细胞。在某些实施方案中，所述细胞群体包含视网膜神经节细胞。在某些实施方案中，所述细胞群体包含视网膜祖细胞。在某些实施方案中，所述细胞群体包含造血干细胞或造血祖细胞(hematopoietic stem or progenitor cell)、神经干细胞或神经祖细胞(neural stem or progenitor cell)、神经细胞、星形胶质细胞或星形胶质细胞祖先(progenitor)、神经胶质细胞或神经胶质细胞祖先和/或胰腺细胞。在某些实施方案中，将所述制品冷藏。在某些实施方案中，将所述制品在约2-8℃冷藏。在某些实施方案中，在所述制品的储存过程中，所述制品支持所述细胞群体中的细胞的存活。在某些实施方案中，所述细胞群体中的至少70％的细胞在将所述制品在2-8℃储存24小时、48小时、72小时、96小时、120小时以后或144小时以后是活的(viable)。在某些实施方案中，所述细胞群体中的至少80％的细胞在将所述制品在2-8℃储存24小时、48小时、72小时、96小时、120小时以后或144小时以后是活的。在某些实施方案中，所述细胞群体中的至少90％的细胞在将所述制品在2-8℃储存24小时、48小时、72小时、96小时、120小时以后或144小时以后是活的。在某些实施方案中，在所述制品的储存过程中，所述制品支持所述细胞群体的铺板效率的维持。在某些实施方案中，在将所述制品在2-8℃储存24小时、48小时、72小时、96小时、120小时以后或144小时以后，所述细胞群体表现出它的原始(original)铺板效率的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％，其中所述原始铺板效率表示所述细胞群体在储存阶段开始时的铺板效率。在某些实施方案中，所述制品是在储存容器内。在某些实施方案中，所述制品是在注射器内。

本公开内容的一些方面提供了用于制备本文提供的制品(例如，包含在本文提供的溶液中的细胞群体的制品)的方法，其中所述方法包括使所述细胞群体与所述溶液接触。在某些实施方案中，所述方法包括使冷冻保存的或沉淀的细胞群体与所述溶液接触，从而重构所述细胞。

本公开内容的一些方面提供了适合用于施用给受试者的药物组合物，其中所述药物制品包含本文提供的溶液或包含在本文提供的溶液中的细胞群体的制品。

本公开内容的一些方面提供了方法，所述方法包括将本文提供的溶液或制品施用给有此需要的受试者。在某些实施方案中，所述方法包括将所述溶液或所述制品施用至所述受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述方法包括在将所述制品储存至少4、至少6、至少12、至少24、至少36、至少24、至少48、至少60、至少72、至少96、至少120或至少144小时以后将所述制品施用至所述受试者。在某些实施方案中，所述受试者具有或被诊断出视网膜疾病。在某些实施方案中，所述视网膜疾病是视杆(rod)或视锥营养不良(cone dystrophy)、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇、与视网膜神经节细胞有关的疾病、青光眼或Stargardt病。在某些实施方案中，所述制品包含有效地改善所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状的大小的细胞群体。在某些实施方案中，所述细胞群体包含RPE细胞、感光细胞或间充质干细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括监测所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状。

本公开内容的一些方面提供了方法，其包括：(a)使细胞群体与本文提供的溶液接触，从而产生细胞制品。在某些实施方案中，所述方法还包括(b)将(a)的细胞制品储存至少4、至少6、至少12、至少18、至少24、至少36、至少48、至少60、至少72、至少96、至少120或至少144小时。在某些实施方案中，所述方法还包括(c)在(b)的储存阶段以后将(a)的细胞制品施用给受试者。在某些实施方案中，(c)的施用包括将所述细胞注射进受试者的眼睛。在某些实施方案中，其中所述方法还包括在(b)的储存阶段以后确定(a)的细胞制品中的细胞生存力。在某些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)的储存阶段中冷藏(a)的细胞制品。在某些实施方案中，冷藏包括在2-8℃的温度储存所述细胞制品。在某些实施方案中，所述方法还包括将在(a)中产生的制品运送至某个位置，所述位置不同于在(b)的储存阶段内产生所述制品的位置。在某些实施方案中，所述运送包括将所述制品运送至临床或手术室，在此处发生(c)的施用。

本公开内容的一些方面提供了用于治疗视网膜疾病的方法，其中所述方法包括将有效量的本文提供的细胞制品施用给具有视网膜疾病的受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述受试者具有或被诊断出视网膜疾病。在某些实施方案中，所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、病理性近视、利伯先天性黑矇、青光眼或Stargardt病。在某些实施方案中，所述制品包含有效地改善所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状的大小的细胞群体。在某些实施方案中，所述细胞群体包含RPE细胞、感光细胞、视网膜神经节或间充质干细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括监测所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状。

本公开内容的一些方面提供了试剂盒，其包含：(a)本文提供的溶液；和(b)关于使细胞群体与(a)的溶液接触以产生细胞制品的说明书；和(c)用于(b)的接触和/或用于储存(b)的细胞制品的容器。在某些实施方案中，(a)的溶液和(c)的容器适合于(b)的细胞制品用于移植给受试者的用途。

上面的概述意在以非限制性的方式解释本文中公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。本文中公开的技术的其它实施方案、优点、特征和用途将从详细描述、附图、实施例和权利要求显而易见。

附图说明

图1.可以将RPE细胞在HypoThermosol中维持24小时(而不是48小时)，随后铺板和在培养物中生长的能力没有明显损失。

图2.在GS2(2-8℃)中的RPE稳定性。可以将RPE细胞在GS2中维持至少48小时，活细胞数目或随后铺板和在培养物中生长的能力没有明显损失。

图3.在GS2(2-8℃)中的RPE稳定性。可以将RPE细胞在GS2中维持4-5天，细胞生存力仅稍微损失，且活细胞密度没有显著下降。

图4.在GS2(2-8℃)中的RPE稳定性。RPE细胞的铺板和在培养物中生长的能力在GS2冷藏5天以后开始下降。

图5.在GS2(2-8℃)中的RPE稳定性。GS2是与当前的注射系统相容的。

图6.显示了来自三份试管的平均活细胞密度±标准差。使用血球计数器确定人RPE细胞密度。通过锥虫蓝排除获取细胞生存力。从为每种条件制备的三份试管的细胞计算平均值，从三份计数确定每个试管的活细胞浓度。对于每种条件，在每组值上面显示了穿过MedOne#3233插管的细胞挤出以后观察到的细胞数目的变化百分比(δ)。

图7.显示了对于试验的每种条件来自6个孔的人RPE细胞/孔的平均数和标准差(±SD)。对于每种条件，将约20,000个细胞/孔接种到明胶包被的96-孔平板上并在5％CO2、37-摄氏度控湿培养箱中在RPE生长培养基(含有EGM2Single Quots的EBM-2，Stem Cell,Inc.)中培养3天。为了确定3-天生长以后的细胞数目，将细胞用胰蛋白酶(Sigma)和基于HEPES的解离介质(Gibco.)的1:1混合物升起(lifted)。一旦将细胞升起，将胰蛋白酶用含有10％胎牛血清的介质中和并使用血球计数器计数细胞。

图8.用于储存MSC的不同介质的对比.使人胚胎干细胞-衍生的MSC生长至70％汇合，用0.05％胰蛋白酶收获，再悬浮于aMEM+15％FCS(MSC介质)中并在200×g离心5min。将细胞沉淀物再悬浮于小体积的MSC介质中并使用锥虫蓝排除计数生存力。然后，将500万个MSC放入4个Eppendorf管中的每一个，离心并再悬浮于各1ml的指示缓冲液中。将管放入设定在4℃的冷藏室中指定的时间量。CS:犬血清；FBS:胎牛血清。

图9.当在较高密度在GS2中储存时会增强MSC生存力，尽管FBS的存在对在24小时中在GS2中增强生存力贡献甚少。

图10.当通过26G针头/注射器储存和除去时(在GS2中在4℃)，维持MSC生存力。

图11.与用单独的BSS-Plus或GS2运送介质(transport medium)(无细胞)治疗或进行假治疗或无治疗的动物的眼睛相比，用悬浮于BSS-Plus或GS2运送介质的RPE细胞治疗的一组16个大鼠眼睛在治疗后60天的视网膜电流图(ERG)。

详细描述

前言

尽管许多高级外科手术与较旧技术相比使对细胞和组织的损伤最小化，某些精巧手术仍然对使用的技术和材料非常敏感。例如，眼外科手术诸如白内障外科手术和玻璃体切割术外科手术涉及非常脆弱的细胞和组织(诸如角膜内皮层)，且因此几乎没有错误余地并具有损害这样的视觉组织和患者视力的巨大可能性。另外，细胞的移植，例如，在再生医学方案的背景下，经常需要配制、储存、运送和/或注射纤弱或脆弱细胞，其在不适当操作或暴露于非生理条件后可以受到损伤或丧失再增殖(repopulation)能力。

本公开内容提供了用于冲洗、细胞重构、细胞储存、细胞运送、和/或将细胞施用给受试者的溶液。与目前可得到的用于冲洗、细胞重构、配制、储存和/或移植的溶液相比，本文提供的溶液具有几个优点。例如，不同于目前可得到的介质，本文提供的溶液支持多种细胞和组织类型(包括脆弱的细胞和组织)的存活，并甚至在延长的储存阶段中维持提高水平的细胞和组织生存力、重新铺板效率、和种群恢复(repopulating)能力。如在本文别处更详细地解释的，目前可得到的用于冲洗或外科手术前细胞配制的介质具有短的半衰期(例如，基于碳盐的沉淀)和/或不会在长时间段(例如，超过4-6小时)中支持储存的细胞的存活、重新铺板效率和再增殖能力。因为短半衰期和超过相对短的时间段的细胞生存力和功能的支持缺乏，目前可得到的介质的应用需要非常接近使用(例如，移植)介质或细胞制品的临床场所，例如，在诊所内部或在非常接近的实验室配制介质和/或在各种介质中的细胞和组织。因此，目前可得到的溶液限制了配制的细胞或组织向允许在短时间跨度(在此期间，细胞生存力、重新铺板效率和/或种群恢复能力是可接受的)内的施用的那些应用的临床应用。对非常接近临床场所的配制的要求会产生额外的支出、风险和额外的场所外(off-site)处理的限制。

相反，本文提供的溶液具有与目前可得到的溶液相比延长的储存期限，并且也支持多种细胞类型(包括脆弱细胞，诸如RPE和感光细胞和间充质干细胞)的细胞功能、生存力、重新铺板效率和种群恢复能力，即使在长储存阶段(例如，多达24小时、多达48小时或更长的储存阶段)中。本文提供的溶液是进一步生物相容的，且因而适合用于施用给受试者。在本文提供的溶液中配制的细胞或组织因而可以直接地施用给受试者，无需介质替换。

本文提供的溶液的增强特征允许将配制的溶液、细胞和组织运送至远离配制场所的临床场所，这会实现最终产品的中心处理和配制并消除对非常接近临床场所的配制的需要。本文提供的溶液的改善的储存和运送能力进一步允许更远离最终产品的配制场所的临床场所使用，并且也会增加安排临床应用(例如，安排用于施用在本文提供的溶液中配制的细胞或组织的外科手术)的灵活性。扩大的储存时间窗进一步提供了配制的产品的额外质量控制机会，例如，在临床手术开始之前，例如，在外科手术团队开始外科手术准备之前或在受试者准备外科手术之前，试验病原性污染物在最终的配制产品中的存在。

临床溶液

本公开内容的一些方面提供了用于冲洗和用于配制、储存、运送和施用细胞和组织的临床溶液。

不同于目前可得到的用于冲洗和细胞配制的介质(例如，平衡盐溶液或盐水)，本文描述的临床溶液支持敏感细胞或组织的长期存活和功能，容易制备和灭菌，并具有延长的储存期限。

简单的盐溶液(诸如磷酸盐缓冲盐水或0.9％氯化钠溶液)可以用于细胞的短期储存，但是这些溶液不会在更长期储存中充分支持细胞生存力或细胞功能，从而导致细胞生存力、重新铺板效率和再增殖能力的显著的且经常不可接受的下降，甚至在仅短暂的储存阶段以后。

更复杂的平衡盐溶液可用于临床目的，诸如临床冲洗或细胞和组织储存，其通常包含用于维持摩尔渗透压浓度的试剂、钙源、镁源和缓冲剂。

氯化钠通常用于维持溶液的摩尔渗透压浓度。钙离子在维持细胞间连接(例如，在角膜内皮中)中起作用。象钙离子一样，镁离子存在于房水中且是许多细胞过程(cellularprocess)所必需的。

碳酸氢根阴离子通常用作缓冲剂，因为它们代表许多组织的生理学缓冲剂，并且与其它溶质广泛相容。但是，某些形式的钙和镁可以与碳酸氢盐反应以形成碳酸钙或碳酸镁，其可以在某些情况下沉淀出溶液。当将含有碳酸氢盐和钙和/或镁的溶液热灭菌时，反应和沉淀可以快速地发生，且可以在环境储存条件随时间发生。对于通常用作药物赋形剂的基本上所有的钙和镁离子盐，钙或镁和碳酸氢盐之间的反应似乎都会发生。

一个避免沉淀的方案是，使用碳酸氢盐缓冲液作为两种单独的储备溶液(其在应用之前不久混合)，提供临床溶液。例如，一种广泛使用的临床介质是BSS无菌眼内冲洗溶液(Alcon Laboratories,Inc.)。BSS无菌眼内冲洗溶液是一种双部分溶液。在即将外科手术之前将所述部分混合到一起以形成单一溶液。该混合步骤可以是不方便的，且代表在忙碌的手术室中混合错误的风险。另外，制备两种单独溶液是比制备单部分制剂更复杂的和昂贵的。因此，单部分临床溶液可以是有利的非常合乎需要的。

BSS无菌眼内冲洗溶液的部分I含有溶解在注射用水中的氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠和磷酸氢二钠。部分I的pH接近中性，且它具有就生理学流体而言接近等渗的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)。BSS无菌眼内冲洗溶液的部分II含有溶解在注射用水中的氯化钙、氯化镁、右旋糖和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。将部分II的pH调至3-5之间，且所述溶液具有低渗的重量摩尔渗透压浓度。

重构的BSS无菌眼内冲洗溶液具有中性pH和等渗的重量摩尔渗透压浓度。如果组合BSS无菌眼内冲洗溶液的两个部分，部分II中的二价阳离子诸如钙和镁将与部分I中的碳酸氢盐和磷酸盐反应以形成沉淀物。如果将组合的溶液蒸汽灭菌，该反应几乎立即进行，且在室温更缓慢地进行，通常经历几小时至几天的阶段。为了防止该沉淀，重构的BSS无菌眼内冲洗溶液的标签储存期限是6小时，在此期间必须使用该溶液。

以前已经尝试制备在性能上与双部分BSS无菌眼内冲洗溶液可比较的单部分临床溶液。欧洲专利申请EP 1067907B1(Armitage)教导了两性离子有机缓冲剂诸如N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(通常被称作HEPES)用于防止如上面讨论的沉淀的用途。由Armitage公开的制剂不含有已知在高压灭菌或掺入生理pH溶液中时不稳定的组分诸如右旋糖和GSSG。由Armitage公开的制剂也不含有通常存在于组织培养基中的类型的组分，诸如氨基酸。Armitage的教导因而没有提供沉淀物形成问题的解决方案。

不同于以前开发的单部分溶液，本公开内容的一些方面提供了不需要使用两性离子有机缓冲剂诸如HEPES、BES、MOPS、TES、EPPS和TRICINE来将溶液维持在生理pH范围内的单部分临床溶液。本发明的临床溶液解决了短储存期限的问题。本文提供的临床溶液具有与目前可得到的临床介质相比极大地改善的储存期限，并且支持细胞的生存力、重新铺板效率和再增殖能力，甚至在24、48、60、72、96、120、144或168小时或更久的长期储存以后。

本文中使用的术语“溶液”表示这样的水性介质：其包含作为主要溶剂的水和一种或多种溶解在溶液中的溶质，例如，缓冲剂、渗透压活性剂、葡萄糖、盐、聚合物等。在某些实施方案中，本文提供的溶液是用于临床应用，且因而是无毒的、基本上无热原的和无菌的。

在某些实施方案中，本文提供的溶液表现出生理pH和生理学渗透压，也被称作生理学摩尔渗透压浓度。生理pH表示这样的pH：其没有细胞毒性并且类似于所述溶液施用的细胞或组织的pH或在所述溶液中配制的细胞或组织在它的天然环境中遇到的pH。对于大多数细胞和组织，生理pH是约6.8-7.8的pH，例如，7-7.7的pH，7.2-7.6的pH，7.2-7.4的pH，或7.4-7.5的pH。因此，在某些实施方案中，本文提供的溶液表现出约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7.或约7.8的pH。生理学渗透压表示这样的渗透压：其没有细胞毒性并且类似于所述溶液施用的细胞或组织的渗透压或在所述溶液中配制的细胞或组织在它的天然环境中遇到的渗透压。对于大多数细胞和组织，生理学渗透压是约270-345mOsm/l，例如，280-330mOsm/l、290-325mOsm/l、300-315mOsm/l。在某些实施方案中，生理学渗透压是约300、约305、约310、约315、约320或约325mOsm/l。

术语溶液的“渗透压”或“摩尔渗透压浓度”是停止穿过半透膜向溶液中的溶剂流动所需的压力，所述半透膜隔离在一侧的纯溶剂和在另一侧的溶液，其中所述半透膜是溶剂分子可渗透的，但是溶质分子不可渗透的。溶液的渗透压与溶液中的溶质颗粒的摩尔浓度成比例，且以mOsm/l或mOsm/kg为单位测量。在某些实施方案中，本文提供的溶液表现出在约290mOsm/l和约320mOsm/l之间、或在约300mOsm/l和310mOsm/l之间或约305mOsm/l的摩尔渗透压浓度。在某些实施方案中，所述溶液表现出约300-330mOsm/l的摩尔渗透压浓度。在某些实施方案中，所述溶液的摩尔渗透压浓度是约300、约305、约310、约315、约320或约325mOsm/l。

在某些实施方案中，本文提供的溶液的摩尔渗透压浓度以它的渗涨度(tonicity)的方式提及，其中高渗溶液是造成细胞收缩的溶液，低渗溶液是造成细胞膨胀的溶液，且等渗溶液不会产生细胞体积的变化。术语“高渗的”、“低渗的”和“等渗的”通常就所述溶液发生接触的细胞、细胞群体或组织而言使用。例如，在实施方案中，在提供冲洗溶液的情况下，等渗性表示在冲洗过程中不会造成与所述溶液发生接触的细胞或组织的体积的变化的渗透压。类似地，在实施方案中，在将所述溶液用于配制用于临床应用(例如，用于移植给受试者)的细胞、细胞群体或组织的情况下，等渗性表示当在所述溶液中配制时不会造成细胞的体积、细胞群体的细胞或组织的细胞的变化的渗透压。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液是等渗的。在某些实施方案中，所述溶液是高渗的。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述渗透压活性剂是盐。在某些实施方案中，所述盐是药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂是钠盐。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂是氯化钠。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂的浓度是约100-200mM、125-175mM或140-160mM。在某些实施方案中，所述渗透压活性剂的浓度是约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175、约180、约185、约190、约195或约200mM。

本文中使用的术语“生理学摩尔渗透压浓度”表示这样的渗透压：其没有细胞毒性(例如，其不会造成给定的细胞或细胞类型破裂或以其它方式造成所述细胞的损伤)，并且类似于所述溶液施用的组织的渗透压或在所述溶液中配制的细胞或组织在它的天然环境中遇到的渗透压。对于大多数应用而言，生理学摩尔渗透压浓度的范围是在约280mOsm/l和约325mOsm/l之间，在约290mOsm/l和约320mOsm/l之间，或在约300mOsm/l和310mOsm/l之间，或约305mOsm/l。

在某些实施方案中，本文提供的用于细胞重构、储存、运送和/或施用给受试者的溶液包含：(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂；和(b)至少2mM葡萄糖；和(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂。在某些实施方案中，所述溶液还包含二价阳离子的来源。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源。在某些实施方案中，所述溶液包含钙源。在某些实施方案中，所述溶液还包含镁源。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，所述溶液包含至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少7.5mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少40mM或至少50mM葡萄糖。在某些实施方案中，所述溶液包含至少0.5mM、至少1mM、至少2mM、至少2.5mM、至少3mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少7.5mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少15mM、至少16mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少40mM或至少50mM右旋糖。在某些实施方案中，所述溶液包含不超过3mM、不超过4mM、不超过5mM、不超过6mM、不超过7mM、不超过7.5mM、不超过8mM、不超过9mM、不超过10mM、不超过15mM、不超过17mM、不超过20mM、不超过25mM、不超过30mM、不超过40mM或不超过50mM葡萄糖。在某些实施方案中，所述溶液包含不超过0.5mM、不超过1mM、不超过2mM、不超过2.5mM、不超过3mM、不超过4mM、不超过5mM、不超过6mM、不超过7mM、不超过7.5mM、不超过8mM、不超过9mM、不超过10mM、不超过15mM、不超过20mM、不超过25mM、不超过30mM、不超过40mM或不超过50mM右旋糖。

在某些实施方案中，本文提供的用于细胞重构、储存、运送和/或施用给受试者的溶液包含：(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂；和(b)葡萄糖；和(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂；和(d)钙源；和(e)镁源。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含乙酸盐和/或柠檬酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，所述溶液包含至少0.5mM、至少1mM、至少2mM、至少2.5mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少7.5mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少15mM、至少16mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少40mM或至少50mM葡萄糖。在某些实施方案中，所述溶液包含至少0.5mM、至少1mM、至少2mM、至少2.5mM、至少3mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少7.5mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少15mM、至少16mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少40mM或至少50mM右旋糖。在某些实施方案中，所述溶液包含不超过0.5mM、不超过1mM、不超过2mM、不超过2.5mM、不超过3mM、不超过4mM、不超过5mM、不超过6mM、不超过7mM、不超过7.5mM、不超过8mM、不超过9mM、不超过10mM、不超过15mM、不超过17mM、不超过20mM、不超过25mM、不超过30mM、不超过40mM或不超过50mM葡萄糖。在某些实施方案中，所述溶液包含不超过0.5mM、不超过1mM、不超过2mM、不超过2.5mM、不超过3mM、不超过4mM、不超过5mM、不超过6mM、不超过7mM、不超过7.5mM、不超过8mM、不超过9mM、不超过10mM、不超过15mM、不超过17mM、不超过20mM、不超过25mM、不超过30mM、不超过40mM或不超过50mM右旋糖。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述葡萄糖或所述右旋糖的浓度是0.5-150mM、0.5-50mM、2.5-50mM、5-50mM、10-50mM、0.5-25mM、2.5-25mM、5-25mM、10-25mM或10-20mM。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述葡萄糖或所述右旋糖的浓度是约0.5mM、约1mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约7.5mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约12.5mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约22.5mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM。

在某些实施方案中，本文提供的溶液包含二价阳离子的来源。合适的二价阳离子包括、但不限于，例如，Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Cr²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺和Sr²⁺。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含钙源。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含镁源。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含两种或更多种不同的二价阳离子的来源，例如，钙源和镁源。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含钙源，例如，钙离子的来源。在某些实施方案中，所述钙源包含药学上可接受的钙盐。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含镁源，例如，镁离子的来源。在某些实施方案中，所述镁源包含药学上可接受的镁盐。

本文中使用的术语“药学上可接受的盐”表示被认为适合于施用给人受试者的盐。在某些实施方案中，药学上可接受的盐是用选自乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、盐酸、马来酸、草酸、磷酸、硬脂酸、琥珀酸和硫酸的酸配制的盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的二价阳离子的来源选自用选自乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、盐酸、马来酸、草酸、磷酸、硬脂酸、琥珀酸和硫酸的酸形成的钙盐和/或镁盐。例如，该组实施方案的药学上可接受的钙盐将包括乙酸钙、抗坏血酸钙、柠檬酸钙、氯化钙、马来酸钙、草酸钙、磷酸钙、硬脂酸钙、琥珀酸钙和硫酸钙。本领域技术人员显而易见，在实施方案中，在溶液包含两种或更多种药学上可接受的盐(例如，钙、镁和钾盐)的情况下，一些或所有盐可以用相同酸形成(例如，氯化钙、氯化镁和氯化钾)，或两种或更多种盐可以用不同酸形成(例如，氯化钙、氯化镁和乙酸钾；氯化钙、柠檬酸镁和马来酸钾等)。

在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐，例如，所述药学上可接受的钙盐或镁盐，是选自以下酸的盐：1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基乙磺酸、2-氧代戊二酸、4-乙酰氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸、抗坏血酸(L)、天冬氨酸(L)、苯磺酸、苯甲酸、樟脑酸(+)、樟脑-10-磺酸(+)、发酸(capric acid)(癸酸)、羊油酸(caproic acid)(己酸)、羊脂酸(caprylic acid)(辛酸)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡萄庚糖酸(D)、葡糖酸(D)、葡糖醛酸(D)、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、羟乙酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、异丁酸、乳酸(DL)、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸(-L)、丙二酸、扁桃酸(DL)、甲磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、烟酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、丙酸、焦谷氨酸(-L)、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸(+L)、硫氰酸、甲苯磺酸(p)和十一烯酸。另外的合适的药学上可接受的盐将是本领域技术人员显而易见的，且应当理解，本公开内容在这方面不受限制。

在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含0.1-20mM(例如，约0.5-10mM、0.5-5mM、1-10mM或2-10mM)的二价阳离子的总浓度。在某些实施方案中，所述二价阳离子来源的浓度是约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM。在某些实施方案中，所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述钙源包含氯化钙。在某些实施方案中，所述钙源包含氯化钙二水合物。在某些实施方案中，所述镁源包含氯化镁。在某些实施方案中，所述镁源包含氯化镁六水合物。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述钙源的浓度是0.1-1.2mM、0.25-0.75mM、0.4-0.65mM或0.5-0.7mM。在某些实施方案中，所述钙源的浓度是约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM或约1.2mM。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述镁源的浓度是0.05-5mM、0.1-0.5mM、0.25-2.5mM、0.1-1mM或0.1-0.3mM。在某些实施方案中，所述镁源的浓度是约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM。

在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含缓冲剂。术语“缓冲试剂”在本文中与术语“缓冲剂”可互换地使用，表示通过中和加入的酸或碱可以维持溶液的pH相对稳定的试剂。通常，缓冲剂包含弱共轭酸-碱对，即，弱酸和它的共轭碱，或弱碱和它的共轭酸。

在某些实施方案中，在本文提供的溶液中包含的缓冲剂是柠檬酸盐或乙酸盐缓冲剂，例如，以柠檬酸盐或乙酸盐的形式提供。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述柠檬酸盐缓冲剂作为柠檬酸钠提供。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.1-5mM。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.5-2mM。在某些实施方案中，所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是约0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.9mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。

在某些实施方案中，所述溶液还包含钾盐，优选药学上可接受的钾盐。在某些实施方案中，所述钾盐是氯化钾。在某些实施方案中，所述KCl的浓度是0.2-5mM或1-2.5mM。在某些实施方案中，所述KCl的浓度是约0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM或5mM。

在某些实施方案中，所述溶液还包含粘弹性聚合物。不希望受理论的约束，据信，粘弹性聚合物的添加会在储存于本文提供的溶液中以后和/或在施用给受试者(例如，通过包含套管插入的施用途径)以后通过保护细胞和组织免于剪切应力而增强细胞和组织生存力、重新铺板效率、和种群恢复能力。粘弹性聚合物是本领域技术人员众所周知的，示例性的合适的粘弹性聚合物包括、但不限于：透明质酸(例如，Healon(Abbott)、(Novozymes)和Pro-(Alcon))、海藻酸盐(包括海藻酸钠)、聚(乙二醇)(PEG)(也被称作聚(环氧乙烷)(PEO))、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)(PVA)、羟基乙基纤维素(HEC)、聚(N-羟基乙基丙烯酰胺)(PHEA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)(pHEMA)、聚甲基丙烯酸(卡波姆)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、葡聚糖、硫酸软骨素、聚(2-异丁烯酰基氧基乙基磷酰胆碱)(PMPC)和三嵌段共聚物，例如，泊洛沙姆188泊洛沙姆P108泊洛沙姆P184泊洛沙姆P401、泊洛沙姆P402、泊洛沙姆P407和泊洛沙姆P408羟基丙基瓜耳胶(guar)聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)或其盐或混合物，包括(但不限于)透明质酸和海藻酸盐的混合物或其盐。在某些实施方案中，所述聚合物是非离子聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物是聚醚。在某些实施方案中，所述聚合物是聚烷基醚。在某些实施方案中，所述聚合物是聚烷基醚和另一种聚合物(例如，聚烷基醚)的共聚物。在某些实施方案中，所述聚合物是泊洛沙姆(也被称作poloxymer)。Poloxymer是由侧接两个聚氧乙烯(POE)亲水链(也被称作聚乙二醇(PEG))的聚氧丙烯(POP)(也被称作聚丙二醇)的中央疏水链组成的非离子三嵌段共聚物。本领域技术人员会明白用于用在基于本公开内容的本文提供的溶液中的另外的合适粘弹性聚合物，且应该理解，本公开内容在这方面不受限制。本领域技术人员会理解，适合用于用在本文提供的溶液和制品中的粘弹性聚合物的量将取决于所述聚合物的粘弹性性能，例如，尤其取决于使用的聚合物的分子量。在某些实施方案中，所述粘弹性聚合物以0.001％w/v-5％w/v的浓度用在本文提供的溶液和制品中。在某些实施方案中，所述粘弹性聚合物以特定浓度使用，所述浓度提供的本文提供的溶液或制品的粘度对应于包含0.01％-0.05％透明质酸的相同溶液或制品的粘度，例如，对应于包含0.01％-0.05％Healon的相同溶液或制品所表现出的粘度。

在某些实施方案中，含有粘弹性聚合物的转移介质具有大于1,000、10,000、50,000或甚至100,000Pas的零剪切粘度，且优选地具有在1,000-200,000Pas范围内的零剪切粘度，和更优选地在1,000-20,000Pas范围内。在某些实施方案中，相对于不含粘弹性聚合物的运送介质，所述粘弹性聚合物使得到的运送介质的零剪切粘度增加5％、10％、15％、25％或甚至40％。

在实施方案中，在将所述溶液施用给受试者的情况下(例如，以包含在所述溶液中的细胞或组织的制品的形式)，在本发明中利用的聚合物是生物相容的和/或可生物降解的。

在某些实施方案中，所述聚合物是透明质酸或其盐或溶剂化物。在某些实施方案中，所述聚合物是透明质酸钠。在某些实施方案中，所述聚合物以有效地减少溶液中的细胞暴露于剪切应力的浓度存在。在某些实施方案中，所述聚合物的浓度是0.01-5％w/v。在某些实施方案中，所述聚合物的浓度是约0.01％-0.05％w/v。在某些实施方案中，所述聚合物是Healon

在某些实施方案中，所述溶液不包含碳酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，所述溶液不包含谷胱甘肽或谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。在某些实施方案中，所述溶液不包含两性离子有机缓冲剂。

本公开内容包括组合两种或更多种或任意数目的标准(例如，pH、摩尔渗透压浓度、溶质(缓冲剂、葡萄糖、渗透压活性剂、镁、钙、钾、聚合物)、浓度等)的溶液。例如，本公开内容包括包含缓冲剂、葡萄糖和渗透压活性剂的溶液(含有或不含添加的聚合物)，包含钾的溶液和不包含钾的溶液，以及包含为各种溶质提供的任何浓度的溶质的任意组合的溶液。还应当理解，本公开内容包括包含列出的溶质的溶液，以及基本上由列出的溶质和溶剂(例如，水)组成或由列出的溶质和溶剂(例如，水)组成的溶液。为了简洁的目的，在这里没有详述这些替代方案。

例如，在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含在水中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠和葡萄糖(例如，D-葡萄糖)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖(例如，D-葡萄糖)和氯化钾或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.03mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖和约145mM NaCl或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液还包含约2mM KCl。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.03mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约2mM KCl或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mMNaCl和约2mM KCl或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液还包含粘弹性聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物是透明质酸或其盐或溶剂化物。在某些实施方案中，所述聚合物是透明质酸钠。在某些实施方案中，所述聚合物以有效地减少溶液中的细胞暴露于剪切应力的浓度存在。在某些实施方案中，所述聚合物的浓度是0.01-5％w/v。在某些实施方案中，所述聚合物的浓度是约0.01-0.05％w/v。在本文提供的溶液的某些实施方案中，所述溶液包含在水中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖(例如，D-葡萄糖)和粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖(例如，D-葡萄糖)、氯化钾和粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.03mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约0.005-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.03mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl、约2mM KCl和约0.005-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.85％NaCl、约0.015％KCl、约0.01％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.006％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.035％柠檬酸钠二水合物和约0.29％右旋糖或基本上由其组成，且任选地包含约0.01-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)，例如，0.01-0.05％Healon在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.68-1.02％NaCl、约0.008-0.012％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.0048-0.0072％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.028-0.042％柠檬酸钠二水合物和约0.23-0.35％右旋糖或基本上由其组成，且任选地包含约0.01-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)，例如，0.01-0.05％Healon在某些实施方案中，所述溶液包含在水中的约0.68-1.02％NaCl、约0.012-0.018％KCl、约0.008-0.012％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.0048-0.0072％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.028-0.042％柠檬酸钠二水合物和约0.23-0.35％右旋糖或基本上由其组成，且任选地包含约0.01-5％w/v的粘弹性聚合物(例如，透明质酸或其盐或溶剂化物)，例如，0.01-0.05％Healon

细胞和组织制品

本公开内容的一些方面提供了包含在本文提供的溶液中的细胞群体或组织的制品。在某些实施方案中，所述细胞群体适合用于移植进受试者。在某些实施方案中，将本文提供的制品配制用于施用给受试者，例如，用于经由注射或冲洗(irrigation)施用。本文提供的制品可以包含在本文描述的溶液(例如，GS2)中的所述细胞群体或所述组织，无论是单独的还是与一种或多种另外的化合物或试剂组合，例如，与抗氧化剂、细菌抑制剂或药学活性剂组合。示例性的药物制品包含如在本公开内容的实施例1中描述的在GS2中的细胞或组织。

在本文提供的溶液中的示例性细胞或组织制品可以配制成适合用于治疗人患者，例如，无热原的或基本上无热原的，无病原体的，无菌的，且在生理pH和摩尔渗透压浓度。在某些实施方案中，将本文提供的制品配制成用于注射进特定部位，例如，在用于治疗视网膜疾病或障碍的眼科学制品的情况下，注射进玻璃体液中用于递送至视网膜或脉络膜损伤部位。

本公开内容提供的制品可以包括另外的治疗剂，例如，免疫抑制剂、促血管生成剂、或支持所述制品中的细胞的存活和/或植入的营养物或生长因子。

所述制品的体积和所述制品中的细胞的数目将取决于具体应用。通常，对于细胞移植应用，合乎需要的是，尽可能多地减小施用的体积。因此，可以配制所述制品，使得可以递送最小化的体积。用于注射的细胞浓度可以是在有效且无毒的任何量。例如，在某些实施方案中，提供了用于移植的细胞制品，其包含在本文提供的溶液中(例如，在GS2中)的至少约10⁴个细胞/ml。在某些实施方案中，在至少约10³、至少约10⁴、至少约10⁵、至少约10⁶、至少约10⁷、至少约10⁸、至少约10⁹或至少约10¹⁰个细胞/ml的剂量配制用于移植的细胞制品。

在某些实施方案中，通过计数活细胞和排除非活细胞，可以确定在本文提供的制品中的细胞的数目和/或细胞的浓度。例如，通过不能排除活体染料(诸如锥虫蓝)，或使用功能测定(诸如附着于培养基底(substrate)的能力、吞噬作用等)，可以检测非活细胞。另外，可以如下确定期望的细胞类型的细胞数目或细胞浓度：计数表达该细胞类型特有的一种或多种细胞标志物的细胞，和/或排除表达指示期望的细胞类型以外的细胞类型的一种或多种标志物的细胞。

在某些实施方案中，本文提供了一种细胞制品，其包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000或9,000个细胞。在某些实施方案中，所述细胞制品可以包含至少约1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰个细胞。在某些实施方案中，所述细胞制品可以包含至少约1×10²至1×10³、1×10²至1×10⁴、1×10⁴至1×10⁵或1×10³至1×10⁶个细胞。在某些实施方案中，所述细胞制品可以包含至少约10,000、20,000、25,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000或200,000个细胞，例如，所述细胞制品可以包含在约50-200μl本文提供的溶液(例如，GS2)体积中的至少约20,000-200,000个细胞。

在某些实施方案中，所述细胞群体适合用于移植进受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述适合用于移植给受试者的眼睛的细胞群体包含RPE细胞、RPE祖细胞、虹膜色素上皮(IPE)细胞和其它视觉相关的神经细胞，诸如联络神经元(例如，内核层(INL)的“中继”神经元)和无长突细胞、视网膜细胞、视杆、视锥和角膜细胞、神经细胞、感光细胞和间充质细胞，例如，间充质干细胞(MSC)。

在某些实施方案中，提供的制品包含在本文提供的溶液中(例如，在实施例1描述的GS2介质中)的RPE细胞群体。合适的RPE细胞可以从多能干细胞(诸如人胚胎干细胞或iPS细胞)分化出，且可以在分子上不同于胚胎干细胞、成年人衍生的RPE细胞和胎儿衍生的RPE细胞。在某些实施方案中，使用成年人衍生的RPE细胞和胎儿衍生的RPE细胞。

在使用ES细胞衍生的RPE细胞的情况下，在某些实施方案中，所述制品不包含可检测的量的残余ES细胞，使得本文提供的制品不会在RPE细胞培养物和制品中产生不可接受的污染风险。

在某些实施方案中，包含适合用于移植进受试者的眼睛的细胞群体的制品适合用于注射进所述受试者的眼睛。在某些实施方案中，这样的制品可以用于治疗视网膜变性疾病或障碍，包括、但不限于，视网膜脱离、视网膜发育异常、血管样条纹症、近视性黄斑变性、或视网膜萎缩或与许多导致光感受器损伤和失明的改变视觉的病症有关，例如，无脉络膜、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性)、色素性视网膜炎和Stargardt病(眼底黄色斑点症)。

所述RPE细胞可以是稳定的、最终分化的RPE细胞，其不会去分化为非-RPE细胞类型。本文描述的RPE细胞可以是功能性RPE细胞，其特征在于在通过角膜、视网膜下或其它方式施用进人或非人动物后整合进视网膜中的能力。

所述RPE细胞可以表达RPE细胞标志物。例如，标志物诸如RPE65、PAX2、PAX6、酪氨酸酶、bestrophin、PEDF、CRALBP、Otx2和/或MITF的表达水平可以与在天然存在的RPE细胞中的表达水平等同。通过测量PAX2、PAX6和酪氨酸酶中的至少一种的表达，或它们各自的表达水平，可以评估RPE细胞的成熟水平。

在某些实施方案中，基于细胞的色素沉着程度，可以鉴别和表征本文描述的在本文提供的制品中包含的RPE细胞。通过培养和维持RPE细胞的密度和在培养物中维持RPE的持续时间，可以控制色素的变化。快速分裂的分化的RPE细胞具有更浅的色素沉着。相反，更缓慢地分裂的或不分裂的RPE呈现它们特有的多角形或六角形形状并通过积累黑色素和脂褐素而增加色素沉着水平。例如，静止的RPE培养物(例如，由于汇合)通常随时间增加它们的色素沉着水平。这样，色素沉着的积累充当RPE分化的指示剂，并且与细胞密度有关的增加的色素沉着充当RPE成熟度的指示剂。例如，可以在较低密度传代培养成熟的RPE细胞，使得色素沉着减少。在该背景下，可以培养成熟的RPE细胞以产生更少成熟的RPE细胞。这样的RPE细胞仍然是表达RPE分化的标志物的分化的RPE细胞。

例如，在某些实施方案中，提供了一种包含RPE细胞的制品，所述包含RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞或小于5pg/细胞，例如，在0.1-8pg/细胞之间、在0.1-7pg/细胞之间、在0.1-6pg/细胞之间、在0.1-5pg/细胞之间、在0.1-4pg/细胞之间、在0.1-3pg/细胞之间、在0.1-2pg/细胞之间、在0.1-1pg/细胞之间、在1-8pg/细胞之间、在1-7pg/细胞之间、在1-6pg/细胞之间、在1-5pg/细胞之间、在1-4pg/细胞之间、在1-3pg/细胞之间、在1-2pg/细胞之间、在2-6pg/细胞之间、在3-5pg/细胞之间或在4-5pg/细胞之间，例如，在4.2-4.8pg/细胞之间或在0.1-5pg/细胞之间。在另一个实施例中，所述平均黑色素含量可以小于5pg/细胞，例如，在0.1-5pg/细胞之间、在0.2-5pg/细胞、0.5-5pg/细胞、1-5pg/细胞、2-5pg/细胞、3-5pg/细胞、4-5pg/细胞或4.5-5pg/细胞之间。

在某些实施方案中，提供了一种制品，其包含在本文描述的溶液(例如，GS2)中的RPE细胞，其中所述RPE细胞在将所述RPE细胞移植给受试者以后(例如，在将所述制品注射进所述受试者的眼睛以后)维持它们的表型。所述RPE细胞可以在移植以后在接受者的寿命中维持它们的表型。例如，所述RPE细胞可以在移植以后维持它们的表型至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。此外，所述RPE细胞可以在移植以后维持它们的表型至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。所述RPE细胞可以在移植以后维持它们的表型至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。所述RPE细胞可以在移植以后维持它们的表型至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年或更多年。

在某些实施方案中，本公开内容提供了用于注射进受试者的眼睛中的在本文提供的溶液中的RPE细胞的制品。在这样的实施方案中，所述制品是用于眼内注射的药学上可接受的眼用制剂。当通过玻璃体内注射施用所述制品时，例如，可以配制所述制品，使得可以递送最小化的体积。注射浓度可以是在有效且无毒的任何量。可以在至少约10⁴个细胞/ml本文提供的溶液的剂量配制用于治疗患者的RPE细胞的制品。在至少约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰个RPE细胞/mL的剂量配制用于治疗患者的RPE细胞制品。

本文描述的RPE细胞的制品可以包含在本文描述的溶液中(例如，在实施例1描述的GS2中)的至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、或9,000个RPE细胞。RPE细胞的药物制品可以包含至少约1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰个RPE细胞。RPE细胞的药物制品可以包含至少约1×10²至1×10³、1×10²至1×10⁴、1×10⁴至1×10⁵或1×10³至1×10⁶个RPE细胞。RPE细胞的药物制品可以包含至少约10,000、20,000、25,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000或200,000个RPE细胞。例如，RPE细胞的药物制品可以包含在至少约50-200μL体积中的至少约20,000-200,000个RPE细胞。此外，RPE细胞的药物制品可以包含在150μL体积中的约50,000个RPE细胞，在150μL体积中的约200,000个RPE细胞，或在至少约150μl体积中的至少约180,000个RPE细胞。

可以将RPE细胞配制在本文提供的制品中用于在药学上可接受的眼媒介物中递送，使得所述制品维持与眼睛表面接触足够的时间段以允许所述细胞穿透受影响的眼睛区域，例如，前房、后房、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体(ciliary)、晶状体、脉络膜、视网膜、巩膜、脉络膜上隙、结膜、结膜下隙、巩膜上隙、角膜内隙、角膜表隙(epicornealspace)、睫状环(par plana)、外科手术地诱导的无血管区域或黄斑(macula)。

在某些实施方案中，本文提供了一种细胞制品，其中将RPE细胞包含在细胞片层(sheet)中。例如，可以如下制备包含RPE细胞的细胞片层：在可以从其释放完整细胞片层的基底上培养RPE细胞，例如，热响应性的聚合物诸如热响应性的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)移植的表面，细胞附着于其上面并在培养温度繁殖，然后在温度变换后，改变表面特征从而造成释放培养的细胞片层(例如，通过冷却至低于低临界溶液温度(LCST)(参见da Silva等人,Trends Biotechnol.2007Dec；25(12):577-83；Hsiue等人,Transplantation.2006年2月15日；81(3):473-6；Ide,T.等人(2006)；Biomaterials 27,607-614,Sumide,T.等人(2005),FASEB J.20,392-394；Nishida,K.等人(2004),Transplantation 77,379-385；和Nishida,K.等人(2004),N.Engl.J.Med.351,1187-1196，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。可以将细胞片层附着于适合用于移植的基底，诸如当将所述片层移植进宿主生物中时可以在体内溶解的基底，例如，通过在适合用于移植的基底上培养所述细胞或将所述细胞从另一个基底(诸如热响应性的聚合物)释放到适合用于移植的基底上来制备。可能适合用于移植的一种示例性基底可以包含明胶(参见Hsiue等人,出处同上)。可能适合用于移植的备选基底包括基于纤维蛋白的基质和其它。所述细胞片层可以用于制备药物，所述药物用于预防或治疗视网膜变性疾病。可以如下将RPE细胞片层配制在细胞或组织制品中用于引入有此需要的受试者的眼睛：使它与本文描述的溶液(例如，GS2溶液)接触。在某些实施方案中，通过中心凹下膜切除术(subfovealmembranectomy)并移植RPE细胞片层可以将所述细胞片层引入有此需要的受试者的眼睛，或可以用于制备药物，所述药物用于在中心凹下膜切除术以后移植。

由本公开内容的一些实施方案提供的制品的体积取决于多种因素诸如施用模式、要递送的细胞的数目、患者的年龄和重量、和正在治疗的疾病的类型和严重程度。例如，如果通过注射施用，本公开内容的RPE细胞的药物制品的体积可以是约1、1.5、2、2.5、3、4或5ml。所述体积可以是约1-2mL。例如，如果通过注射施用，本公开内容的RPE细胞的药物制品的体积可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、100、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200μL(微升)。例如，本公开内容的制品的体积可以是约10-50、20-50、25-50或1-200μL。本公开内容的制品的体积可以是约10、20、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μL或更高。

在某些实施方案中，本文提供的制品可以包含约1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴或9×10⁴个RPE细胞/μL。例如，在某些实施方案中，所述制品可以包含2000个RPE细胞/μL，例如，100,000个RPE细胞/50μL或180,000个RPE细胞/90μL。

在某些实施方案中，将所述制品冷藏。在某些实施方案中，将所述制品在约2-8℃冷藏。

在某些实施方案中，在所述制品的储存过程中，所述制品支持所述细胞群体中的细胞的存活。在某些实施方案中，所述细胞群体中的至少70％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。在某些实施方案中，所述细胞群体中的至少80％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。在某些实施方案中，所述细胞群体中的至少90％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。在某些实施方案中，在所述制品的储存过程中，所述制品支持所述细胞群体的铺板效率的维持。在某些实施方案中，在将所述制品在2-8℃储存48小时以后，所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％，其中所述原始铺板效率表示所述细胞群体在储存阶段开始时的铺板效率。在某些实施方案中，所述制品是在储存容器内。在某些实施方案中，所述制品是在注射器内。

本公开内容的一些方面提供了在本文提供的溶液中的细胞和组织的药物制品。这样的制品适合用于施用给受试者。在某些实施方案中，所述药物制品基本上由细胞、细胞群体或组织和本文提供的溶液组成。在某些实施方案中，所述药物制品包含一种或多种药学活性成分，例如，防腐剂、抗氧化剂、自由基清除剂、免疫抑制剂、促血管生成因子、抗血管生成因子、生长激素或支持细胞生长、存活和植入的细胞营养物或基底。

本公开内容也包括药物包和/或试剂盒。提供的药物包和/或试剂盒可以包含本文提供的细胞或组织制品和容器(例如，小瓶(vial)、安瓿、瓶子、注射器和/或冷却器包或其它合适的容器)。在某些实施方案中，提供的试剂盒可以任选地还包括第二容器，其包含用于配制所述制品的溶液，所述溶液用于稀释、洗涤和/或重构所述细胞或组织制品。在某些实施方案中，提供的制剂容器和溶剂容器的内容物组合以形成至少一个单元剂型。

本公开内容的一些方面提供了用于制备本文提供的制品(例如，包含在本文提供的溶液中的细胞群体的制品)的方法，其中所述方法包括使所述细胞群体与所述溶液接触。在某些实施方案中，所述方法包括使冷冻保存的或沉淀的细胞群体与所述溶液接触，从而重构所述细胞。

例如，本公开内容的一些方面提供了方法，其包括：(a)使细胞群体与本文提供的溶液接触，从而产生细胞制品。在某些实施方案中，所述方法还包括(b)将(a)的细胞制品储存至少4、至少6、至少12、至少18、至少24、至少36、至少48、至少60、至少72或至少96小时。在某些实施方案中，所述方法还包括(c)在(b)的储存阶段以后将(a)的细胞制品施用给受试者。在某些实施方案中，(c)的施用包括将所述细胞注射进受试者的眼睛。在某些实施方案中，其中所述方法还包括在(b)的储存阶段以后确定(a)的细胞制品中的细胞生存力。在某些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)的储存阶段中冷藏(a)的细胞制品。在某些实施方案中，冷藏包括在2-8℃的温度储存所述细胞制品。在某些实施方案中，所述方法还包括将在(a)中产生的制品运送至某个位置，所述位置不同于在(b)的储存阶段内产生所述制品的位置。在某些实施方案中，所述运送包括将所述制品运送至临床或手术室，在此处发生(c)的施用。

示例性的应用和方法

本文公开的溶液可以用于多种临床应用。这样的应用包括临床冲洗、细胞的重构或配制(例如，在沉淀或冷冻保存以后)、以及细胞的配制，例如，用于临床应用，包括、但不限于在施用给受试者之前的细胞储存和运送，和/或用作用于将细胞、细胞单层或组织施用给受试者的载体介质。

例如，在某些实施方案中，本文公开的溶液可以用作用于细胞重构的溶液。本文中使用的术语“细胞重构”表示使细胞群体与溶液(例如，本文提供的溶液)接触以便产生包含所述细胞群体的溶液的过程。在某些实施方案中，重构细胞群体包括从细胞沉淀(例如，通过抛弃上清液在离心步骤以后得到的细胞沉淀)产生包含细胞群体的溶液。在某些实施方案中，用本文提供的溶液重构细胞群体包含稀释或替换所述细胞最初悬浮在其中的任何介质以得到在基本上由本文提供的溶液组成或由本文提供的溶液组成的介质中的细胞群体。在某些这样的实施方案中，可以将悬浮于本文提供的溶液以外的介质中的细胞群体用本文提供的溶液洗涤一次或多次。在某些实施方案中，洗涤步骤可以包含使所述细胞与本文提供的溶液接触，沉淀所述细胞(例如，通过离心)，抛弃上清液，和用所述溶液重构细胞沉淀物。取决于使用的溶液的体积和细胞沉淀物的体积，可以在单个洗涤-重构循环以后或2、3、4、5、6、7、8、9或10个这样的循环以后基本上用所述溶液替换最初介质。

在某些实施方案中，本文提供的溶液可以用于细胞和组织配制。在细胞和组织的背景下，本文中使用的术语“配制”表示使细胞、细胞群体或组织与一定体积的本文提供的溶液接触以得到适合用于临床应用(例如，用于施用给受试者)的细胞或组织制品。本文提供的溶液与多种细胞类型、细胞群体和组织广泛相容，包括、但不限于，成年干细胞和祖细胞、分化的细胞和包含这样的细胞的群体和组织。在某些实施方案中，如此配制在本文提供的溶液中的细胞、细胞群体或组织是治疗性细胞、细胞群体或组织，例如，用于在再生医学方案中临床应用。例如，在某些实施方案中，配制在本文提供的溶液中的细胞、细胞群体或组织可以包含这样的细胞群体：其可以替代在受试者中损失或退化的细胞，或修复或替代在受试者中已经损伤或功能失调的组织。例如，在某些实施方案中，配制在本文提供的溶液中的细胞、细胞群体或组织可以包含多潜能干细胞或祖细胞、或功能性分化细胞、或包含这类细胞或这类细胞的组合的群体或组织。在某些实施方案中，本文提供的溶液用于配制RPE细胞、感光细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经或神经元干细胞或祖细胞、神经胶质干细胞或祖细胞、胰腺干细胞或祖细胞、β细胞、角质形成细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、或包含这类细胞或基本上由这类细胞组成的群体或组织，例如，RPE细胞单层、胰岛或皮肤移植物。在某些实施方案中，可以将在本文提供的溶液中的细胞制剂在临床应用之前(例如，在施用给受试者之前)储存和/或运送至临床场所，并以提供状态或仅经过微小处理(诸如将所述制剂稀释至期望的体积或期望的细胞浓度)施用给受试者。

在某些实施方案中，本文提供的溶液可用于细胞或组织储存。在细胞和组织的背景下，本文中使用的术语“储存”表示在本文提供的溶液中配制细胞或组织和另一个处理步骤或细胞或组织的临床应用之间的时间段。不同于以前可得到的溶液，本文提供的溶液支持将多种细胞和组织类型(包括敏感细胞和组织诸如RPE细胞、光感受器和MSC)储存延长的时间段，例如，至少4、至少6、至少8、至少12、至少18、至少24、至少30、至少36、至少48小时、至少60小时或至少72小时，并且细胞生存力、重新铺板效率或种群恢复能力仅微小下降。例如，在某些实施方案中，将细胞、细胞群体或组织(例如，RPE细胞、感光细胞或MSC)在本文提供的溶液中储存至少4、至少6、至少8、至少12、至少18、至少24、至少30、至少36、至少48、至少60或至少72小时的时间段所产生的细胞生存力、重新铺板效率和/或再增殖能力为在储存阶段开始时的生存力、重新铺板效率和/或再增殖能力的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。在某些实施方案中，所述储存时间段，例如，在细胞或组织的配制和它们的临床应用之间的时间段不会超过4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时或72小时。通常，将配制在本文提供的溶液中的细胞或组织冷藏储存，例如，至2-8℃之间的温度。因此，在某些实施方案中，在低于环境温度的温度，例如，在2-8℃之间的温度，在本文提供的溶液中储存细胞和组织。但是，在某些实施方案中，预见到在较高温度的储存，例如，在8℃和16℃之间的温度，在16-22℃，或在环境温度(通常约25℃)。

本文提供的溶液也用于将细胞、细胞群体和组织在它们配制以后运送至临床场所。本文提供的溶液在运送过程中支持细胞存活和使代谢应激和物理应激(包括剪切应力)最小化。细胞或组织运送通常将在所述细胞或组织的储存阶段内完成，且因而在储存的合适条件下，如上面所述。在实施方案中，当将配制在本文提供的溶液中的细胞或组织在冷藏条件下(例如，在低于环境温度的温度)运送时，可移动的冷藏设备的应用对于运送而言是优选的。这样的设备包括，但不限于，绝缘的运送或装运容器、湿冰袋、冷却凝胶、冷却容器和可移动的冷冻单元。在本文别处更详细地描述了用于冷藏运送的一些示例性的合适运送方法、容器和装置，并且本领域技术人员考虑到本公开内容会明白另外的合适的方法、容器和装置。

本公开内容的一些方面提供了通过将有效量的如本文中所述的临床溶液或细胞或组织制品施用给受试者来治疗有此需要的受试者的方法。在某些实施方案中，所述受试者具有或被诊断出疾病或障碍，其可以通过施用细胞、细胞群体或组织(例如，以本文描述的细胞或组织制品的形式)来治疗。在某些实施方案中，施用给受试者的制品包含有效地改善所述受试者的疾病或障碍的至少一种症状的大小的细胞群体。在某些实施方案中，所述受试者正在经历外科手术，并施用本文描述的溶液或制品来冲洗外科手术部位。在某些实施方案中，所述方法还包括监测所述受试者中的疾病的至少一种症状。

术语“治疗”和“处理”表示临床干预，其目的是逆转、减轻或抑制如本文中所述的疾病或障碍或其一种或多种症状的进展，逆转、减轻、延迟如本文中所述的疾病或障碍或其一种或多种症状的发作。在某些实施方案中，可以在一种或多种症状已经形成以后和/或在已经诊断出疾病以后施用治疗。在其它实施方案中，可以在没有症状存在下施用治疗，例如，以预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展。例如，可以在症状的发作之前将治疗施用给易感个体(例如，考虑到症状的历史和/或考虑到遗传因素或其它易感性因素)。在症状已经消退以后，也可以继续治疗，例如，以预防或延迟它们的复发。

本文中使用的术语“受试者”表示单个生物体，例如，单个哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者是非人哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是非人灵长类动物。在某些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。在某些实施方案中，所述受试者是绵羊、山羊、牛、猫或狗。在某些实施方案中，所述受试者是研究动物。在某些实施方案中，所述受试者是遗传工程改造的，例如，遗传工程改造的非人受试者。所述受试者可以是任一种性别且处于任意发育阶段。

本文中使用的术语“有效量”表示，足以引起期望的生物应答的生物活性剂的量。例如，在某些实施方案中，如本文中所述的细胞或组织制品的有效量可以表示包含许多细胞的制品的量或组织的量，其足以改善与疾病或障碍有关的症状(例如，足以改善具有视网膜疾病或障碍的受试者的视觉)。熟练的技术人员会明白，本文提供的溶液或制品的有效量可以随多种因素而变化，例如，期望的生物应答，例如，正在治疗的具体疾病，要减轻的具体症状，正在靶向的细胞或组织，和受试者的年龄、性别和一般健康状况。

本公开内容的一些方面提供了方法，所述方法包括将本文提供的溶液或制品施用给有此需要的受试者。在某些实施方案中，所述方法包括将所述溶液或所述制品施用至所述受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述方法包括在将所述制品储存至少4、至少6、至少12、至少24、至少36或至少48小时以后将所述制品施用至所述受试者。在某些实施方案中，所述受试者具有或被诊断出视网膜疾病。在某些实施方案中，所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇或Stargardt病。在某些实施方案中，所述制品包含有效地改善所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状的大小的细胞群体。在某些实施方案中，所述细胞群体包含RPE细胞、感光细胞或间充质干细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括监测所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状。

本公开内容的一些方面提供了用于治疗视网膜疾病的方法，其中所述方法包括将有效量的本文提供的细胞制品施用给具有视网膜疾病的受试者的眼睛。在某些实施方案中，所述受试者具有或被诊断出视网膜疾病。在某些实施方案中，所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇或Stargardt病。在某些实施方案中，所述制品包含有效地改善所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状的大小的细胞群体。在某些实施方案中，所述细胞群体包含RPE细胞、感光细胞或间充质干细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括监测所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状。

本文中使用的术语“监测疾病的症状”表示在一个时间段内的多个时间点评估疾病的症状的严重程度。例如，可以在受试者的治疗开始之前在受试者中评估症状的严重程度，并然后在治疗以后的一个时间段以后再次评估。在某些实施方案中，所述监测可以包括在一定时间以后评估症状的严重程度，已知或预期所述时间足够治疗在类似受试者(例如，相同物种、性别、年龄、一般健康状况等的受试者)中产生症状的可测量的改善。在某些实施方案中，所述监测可以包括定期评估症状的严重程度。例如，在治疗视网膜障碍的受试者中，可以执行受试者的视觉的初步评估。本领域技术人员会理解，该评估是示例性的，并且可以在受试者的视觉的评价之外或替代性地执行其它评估。这样的评估可以包括视网膜变性水平、视网膜消融、黄斑变性、诸如此类。通过施用本文提供的细胞制品(例如，包含在本文提供的GS2介质中的有效数目的RPE细胞的制品)治疗受试者以后，可以再次评估受试者的视觉，理想地在外科手术后已经过去允许施用细胞植入和实现它们的功能的时间段以后，例如，在约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月以后，或在约1年以后。可以记录外科手术后评估的结果，并与外科手术前评估对比以确定症状是否已经改善，例如，受试者中的视觉水平是否已经恢复。可以将评估重复一次或多次以确定症状的改善是否仍然在进行中或是否已经到达终点。取决于外科手术后监测的结果，可以计划另外的外科手术以(进一步)改善评估的症状。如果在最初的外科手术以后没有观察到改善，可以增加细胞或组织制品的剂量以便促进症状的改善。

视网膜疾病的治疗方法可以包含施用单剂量的有效量的本文提供的RPE细胞制品，例如，包含在本文描述的GS2介质中的有效量的RPE细胞的制品。并且，本文描述的治疗方法可以包含这样的疗程：其中将RPE细胞在某个阶段中施用多次，且其中每个剂量的细胞可有效地减轻疾病的症状，或其中多个剂量累积地递送有效量。示例性的疗程可以包含每周、每2周、每月、每季、每半年或每年治疗。可替换地，治疗可以分阶段进行，其中最初施用多剂量(例如，第一周的每日剂量)，并随后需要更少和更低频率的剂量。

如果通过眼内注射施用如本文中所述的RPE细胞制品，例如，包含在GS2溶液中的RPE细胞的制品，可以在患者的寿命中周期性地递送RPE细胞制品一次或多次。例如，可以每年一次、每6-12个月一次、每3-6个月一次、每1-3个月一次、或每1-4周一次递送RPE细胞制品。可替换地，更高频率的施用对于某些病症或障碍可以是合乎需要的。如果通过植入物或装置施用，可以将RPE细胞施用一次，或者在必要时针对正在治疗的特定患者和障碍或病症在患者的寿命中周期性地递送一次或多次。类似地预见到随时间变化的治疗方案。例如，在开始可能需要更高频率的治疗(例如，每天或每周治疗)。随着时间的过去，由于患者的状况改善，可能需要更低频率的治疗或甚至不需要进一步治疗。

本文所述的方法可以进一步包含通过测量受试者中的视网膜电流图应答、视动敏锐度阈值或亮度阈值来监测治疗或预防的效力的步骤。所述方法还可以包含通过监测所述细胞的免疫原性或所述细胞在眼睛中的迁移来监测治疗或预防的效力。

所述RPE细胞或包含RPE细胞和本文提供的临床溶液(例如，GS2溶液)的制品可以用于制备药物以治疗视网膜变性。本公开内容也包括本文中公开的包含RPE细胞的制品在治疗失明中的用途。例如，包含人RPE细胞的制品可以用于治疗与许多改变视觉的病症(其导致光感受器损伤和失明)有关的视网膜变性，例如，糖尿病性视网膜病变、黄斑变性(包括年龄相关的黄斑变性，例如，湿性年龄相关的黄斑变性和干性年龄相关的黄斑变性)、色素性视网膜炎和Stargardt病(眼底黄色斑点症)。所述制品可以包含至少约5,000-500,000个RPE细胞(例如，100,00个RPE细胞)，其可以施用至视网膜以治疗与许多改变视觉的病症(其导致光感受器损伤和失明)有关的视网膜变性，例如，糖尿病性视网膜病变、黄斑变性(包括年龄相关的黄斑变性)、色素性视网膜炎和Stargardt病(眼底黄色斑点症)。

在用于治疗受试者的制品中使用的细胞(例如，在本文提供的RPE细胞制品中使用的RPE细胞)可以是人细胞。可以将人细胞用在人患者中，以及用在动物模型或动物患者中。例如，可以在视网膜变性的小鼠、大鼠、猫、狗或非人灵长类动物模型中试验人细胞。另外，可以将人细胞在治疗上用于治疗有此需要的动物，诸如在兽医学中。

在某些实施方案中，所述治疗视网膜疾病的方法可以进一步包含与本文提供的临床制品的施用在时间上靠近的免疫抑制剂的施用。可以使用的免疫抑制剂包括、但不限于抗-淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗-胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、 (抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢素(环孢素A)、(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、麦考酚酸、(抗-CD20抗体)、西罗莫司和他克莫司。可以施用至少约1、2、4、5、6、7、8、9或10mg/kg的免疫抑制剂。当使用免疫抑制剂时，可以全身性地或局部地施用它们，并且可以在施用RPE细胞之前、同时或之后施用它们。免疫抑制疗法可以持续数周、数月、数年，或在施用RPE细胞以后无限期地持续。例如，在施用RPE细胞以后，可以给患者施用5mg/kg环孢素6周。

在某些方面，本文提供的溶液可以用作临床冲洗溶液。这样的溶液可用于临床冲洗，例如，用于冲洗创伤或外科手术部位。在本文中与术语“冲洗”可互换地使用的术语“临床冲洗”通常表示，将溶液(通常水溶液)施用至创伤或外科手术部位。如本文提供的冲洗溶液可以为多种目的而施用，例如，为了组织水合、清洁、除去碎片或表面病原体、润滑、避免组织附着或辅助目检。在某些实施方案中，冲洗包含在开放性创伤或外科手术部位上施用冲洗溶液的稳定流。在某些实施方案中，间歇地施用所述冲洗溶液。施用的方式、以及施用的冲洗溶液的体积和流速将取决于具体情况，例如，创伤的大小、正在冲洗的组织、和创伤或外科手术部位的状态(例如，碎片的存在、暴露于表面病原体)。本领域技术人员将能够确定适合于施用的适当方法和装置、以及合适的体积和流速。

尽管在某些情况下，简单的冲洗溶液可能足以实现一些冲洗目的，但是常规冲洗溶液(诸如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、杀菌剂或抗生素)在某些外科手术场合中不可能支持敏感细胞或组织的存活或对敏感细胞或组织有细胞毒性，因而会消极地影响外科手术的结果。

由于它的低毒性、生理学性质(pH和摩尔渗透压浓度)、容易制备和灭菌(包括蒸汽灭菌)、和在环境温度的长储存期限，一种常用的临床冲洗液，即生理盐水(0.9％的NaCl在水中的溶液)，是等渗的且经常用于创伤冲洗。生理盐水的一个缺点是，它不支持敏感细胞或组织的长期存活，并且已经报道在用生理盐水冲洗以后与其它冲洗溶液相比相对高的伤口感染率。

为了冲洗敏感的外科手术部位或创伤，例如，通过用生理盐水或其它简单冲洗溶液冲洗可能消极地影响的部位或创伤，例如，在眼外科手术过程中，已经开发了许多商购可得的外科冲洗溶液。在目前可得到的外科冲洗溶液(其用于用在外科手术中防止对敏感细胞或组织的创伤，例如，在眼外科手术过程中)中通常存在四种关键成分：用于维持摩尔渗透压浓度的试剂、钙源、镁源和缓冲剂。

本公开内容的一些实施方案提供了用本文提供的溶液(例如，用GS2溶液)冲洗外科手术部位的方法。在某些实施方案中，所述外科手术部位是受试者的眼睛。

用于冲洗外科手术部位的方法和装置是本领域普通技术人员众所周知的。熟练的技术人员会理解，递送方法、体积和使用的压强将取决于外科手术部位的性质和状况。用于临床冲洗的合适装置包括、但不限于，球注射器、活塞注射器、压力罐、漩涡搅拌器、漩涡软管喷雾器、在具有倾倒帽或喷嘴的塑料容器中的冲洗流体、和脉冲灌洗装置(例如，喷射灌洗、机械灌洗、脉动灌洗、机械冲洗、高压冲洗装置)。

在某些实施方案中，冲洗是连续的，其中将冲洗液的连续流施用至外科手术部位。在其它实施方案中，采用脉冲的或间歇的冲洗，其中执行冲洗液的间歇或间断递送。冲洗体积将取决于外科手术部位的特征和冲洗的目的(创伤清洁、水合等)。

试剂盒

本公开内容的一些方面提供了试剂盒，其包含(a)本文提供的溶液；和(b)关于使细胞群体与(a)的溶液接触以产生细胞制品的说明书；和(c)用于(b)的接触和/或用于储存(b)的细胞制品的容器。在某些实施方案中，(a)的溶液和(c)的容器适合于(b)的细胞制品用于移植给受试者的用途。

因此，本公开内容尤其提供了以下内容：

条款1.一种溶液，其包含

(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂；和

(b)至少2mM或至少0.05％(w/v)葡萄糖；和

(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂。

条款2.条款1的溶液，其中所述溶液包含至少5mM或至少0.1％(w/v)葡萄糖。

条款3.条款1的溶液，其中所述溶液包含至少7.5mM或至少0.14％(w/v)葡萄糖。

条款4.条款1的溶液，其中所述溶液包含至少10mM或至少0.2％(w/v)葡萄糖。

条款5.条款1的溶液，其中所述溶液包含至少15mM或至少0.25％(w/v)葡萄糖。

条款6.条款1的溶液，其中所述溶液包含至少20mM或至少0.4％(w/v)葡萄糖。

条款7.条款1的溶液，其中所述溶液包含至少25mM或至少0.5％(w/v)葡萄糖。

条款8.条款1-7中的任一项的溶液，其中所述溶液还包含二价阳离子的来源。

条款9.条款8的溶液，其中所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源。

条款10.条款1-9中的任一项的溶液，其中所述缓冲剂包含乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂。

条款11.一种溶液，其包含

(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂，其中所述缓冲剂不是碳酸氢盐缓冲剂；和

(b)葡萄糖；和

(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂；和

(d)二价阳离子的来源。

条款12.条款11的溶液，其中(d)的二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源。

条款13.条款11-12中的任一项的溶液，其中所述缓冲剂包含乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂。

条款14.条款9-10或12-13中的任一项的溶液，其中所述钙源包含药学上可接受的钙盐。

条款15.条款9-10或12-14中的任一项的溶液，其中所述镁源包含药学上可接受的镁盐。

条款16.条款14-15中的任一项的溶液，其中所述药学上可接受的钙和/或所述药学上可接受的镁盐选自与选自乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、盐酸、马来酸、草酸、磷酸、硬脂酸、琥珀酸和硫酸的酸形成的钙盐和/或镁盐。

条款17.条款9-10或12-16中的任一项的溶液，其中所述钙源包含氯化钙。

条款18.条款9-10或12-17中的任一项的溶液，其中所述钙源包含氯化钙二水合物。

条款19.条款9-10或12-18中的任一项的溶液，其中所述镁源包含氯化镁。

条款20.条款9-10或12-18中的任一项的溶液，其中所述镁源包含氯化镁六水合物。

条款21.条款10或13-20中的任一项的溶液，其中所述柠檬酸盐缓冲剂作为柠檬酸钠提供。

条款22.条款1-21中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖是D-葡萄糖(右旋糖)。

条款23.条款1-22中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂是盐。

条款24.条款1-23中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂是钠盐。

条款25.条款1-24中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂是氯化钠。

条款26.条款1-25中的任一项的溶液，其中所述溶液包含氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠和葡萄糖。

条款27.条款1-26中的任一项的溶液，其中所述溶液的pH是6.8-7.8。

条款28.条款1-27中的任一项的溶液，其中所述溶液的pH是7.4-7.5。

条款29.条款1-28中的任一项的溶液，其中所述溶液的pH是约7.5。

条款30.条款1-29中的任一项的溶液，其中所述溶液是等渗的。

条款31.条款1-29中的任一项的溶液，其中所述溶液是高渗的。

条款32.条款1-31中的任一项的溶液，其中所述溶液表现出约270-345mOsm/l的摩尔渗透压浓度。

条款33.条款1-32中的任一项的溶液，其中所述溶液的摩尔渗透压浓度是约315mOsm/l。

条款34.条款9-10或12-33中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是0.25-0.75mM。

条款35.条款9-10或12-34中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是0.4-0.65mM。

条款36.条款9-10或12-35中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是0.5-0.6mM，或条款9-10或12-35中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是0.5-0.9mM，或其中所述钙源的浓度是0.6-0.8mM。

条款37.条款9-10或12-36中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是约0.6mM，或条款9-10或12-36中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是约0.7mM。

条款38.条款9-10或12-37中的任一项的溶液，其中所述镁源的浓度是0.05-5mM。

条款39.条款9-10或12-38中的任一项的溶液，其中所述镁源的浓度是0.1-0.3mM。

条款40.条款9-10或12-39中的任一项的溶液，其中所述镁源的浓度是约0.3mM。

条款41.条款1-40中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖的浓度是5-50mM。

条款42.条款1-41中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖的浓度是10-25mM。

条款43.条款1-42中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖的浓度是10-20mM。

条款44.条款1-43中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖的浓度是约16mM。

条款45.条款1-44中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂的浓度是约100-200mM。

条款46.条款1-45中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂的浓度是约125-175mM。

条款47.条款1-46中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂的浓度是约150mM。

条款48.条款10或13-47中的任一项的溶液，其中所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.1-5mM。

条款49.条款10或13-48中的任一项的溶液，其中所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.5-2mM。

条款50.条款10或13-39中的任一项的溶液，其中所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是约1mM。

条款51.条款1-51中的任一项的溶液，其中所述溶液还包含钾盐。

条款52.条款51的溶液，其中所述钾盐是氯化钾。

条款53.条款51或52的溶液，其中所述KCl的浓度是0.2-5mM。

条款54.条款53的溶液，其中所述KCl的浓度是1-2.5mM。

条款55.条款54的溶液，其中所述KCl的浓度是约2mM。

条款56.条款1-55中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.03mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖和约145mM NaCl，或条款1-55中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖和约145mM NaCl，或条款1-55中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.5-0.9mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖和约116-174mM NaCl。

条款57.条款1-55中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.85％NaCl、约0.01％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.006％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.035％柠檬酸钠二水合物和约0.29％右旋糖，或条款1-55中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.68-1.02％NaCl、约0.008-0.012％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.0048-0.0072％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.028-0.042％柠檬酸钠二水合物和约0.23-0.35％右旋糖。

条款58.条款1-57中的任一项的溶液，其中所述溶液还包含约2mM KCl。

条款59.条款1-58中的任一项的溶液，其中所述溶液还包含粘弹性聚合物。

条款60.条款59的溶液，其中所述聚合物是透明质酸或其盐或溶剂化物。

条款61.条款59或60的溶液，其中所述聚合物是透明质酸钠。

条款62.条款59-61中的任一项的溶液，其中所述聚合物以有效地减少溶液中的细胞暴露于剪切应力的浓度存在。

条款63.条款59-62中的任一项的溶液，其中所述聚合物的浓度是0.005-5％w/v。

条款64.条款63的溶液，其中所述聚合物的浓度是约0.05％w/v。

条款65.条款1-64中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.03mM MgCl(氯化镁)、约2mM KCl、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约0.05％透明质酸，或条款1-64中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约2mM KCl、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约0.05％透明质酸，或条款1-64中的任一项的溶液，其中所述溶液包含约0.5-0.8mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约1.6-2.4mM KCl、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖、约116-174mM NaCl和约0.04-0.06％透明质酸。

条款66.条款1-65中的任一项的溶液，其中所述溶液不包含碳酸盐缓冲剂。

条款67.条款1-66中的任一项的溶液，其中所述溶液不包含谷胱甘肽或谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。

条款68.条款1-67中的任一项的溶液，其中所述溶液不包含两性离子有机缓冲剂。

条款69.条款1-68中的任一项的溶液，其中所述溶液可以在25℃储存至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月，而没有可测量的溶质沉淀和/或可测量的所述溶液支持在所述溶液中储存的细胞的存活和生存力的能力的损失。

条款70.条款1-69中的任一项的溶液，其中所述溶液可以在2-8℃储存至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月，而没有可测量的溶质沉淀和/或可测量的所述溶液支持在所述溶液中储存的细胞的存活和生存力的能力的损失。

条款71.条款1-70中的任一项的溶液，其中所述溶液适合用于施用给受试者、适合用于施用给受试者的眼睛和/或适合用于将细胞移植进受试者的眼睛。

条款72.条款1-71中的任一项的溶液，其中所述溶液是基本上无热原的。

条款73.条款1-72中的任一项的溶液，其中所述溶液是无菌的。

条款74.条款1-73中的任一项的溶液，其中所述溶液用于冲洗、细胞重构、细胞储存、细胞运送和/或施用给受试者。

条款75.一种制品，其包含在条款1-74中的任一项的溶液中的细胞群体。

条款76.条款75的制品，其中所述细胞群体适合用于移植进受试者。

条款77.条款76的制品，其中所述细胞群体适合用于移植进受试者的眼睛。

条款78.条款75-77中的任一项的制品，其中所述细胞群体包含RPE细胞。

条款79.条款75-78中的任一项的制品，其中所述细胞群体包含感光细胞。

条款80.条款75-79中的任一项的制品，其中所述细胞群体包含间充质细胞。

条款81.条款75-80中的任一项的制品，其中将所述制品冷藏。

条款82.条款81的制品，其中将所述制品在约2-8℃冷藏。

条款83.条款75-82中的任一项的制品，其中在所述制品的储存过程中，所述制品支持所述细胞群体中的细胞的存活，且其中所述细胞群体中的至少70％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。

条款84.条款83的制品，其中所述细胞群体中的至少80％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。

条款85.条款83的制品，其中所述细胞群体中的至少90％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。

条款86.条款75-85中的任一项的制品，其中在所述制品的储存过程中所述制品支持所述细胞群体的铺板效率的维持，且其中在将所述制品在2-8℃储存48小时以后所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少70％，其中所述原始铺板效率是所述细胞群体在储存阶段开始时的铺板效率。

条款87.条款86的制品，其中在将所述制品在2-8℃储存48小时以后所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少80％。

条款88.条款86的制品，其中所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少90％。

条款89.条款75-88中的任一项的制品，其中所述制品是在储存容器内。

条款90.条款75-89中的任一项的制品，其中所述制品是在注射器内。

条款91.一种用于制备条款75-90中的任一项的制品的方法，其中所述方法包括使细胞群体与条款1-74中的任一项的溶液接触。

条款92.条款91的方法，其中所述方法包括使冷冻保存的或沉淀的细胞群体与条款1-74中的任一项的溶液接触，从而重构所述细胞。

条款93.一种药物组合物，其包含条款1-74中的任一项的溶液或条款75-90中的任一项的制品，其中所述药物组合物适合用于施用给受试者。

条款94.一种方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用条款1-74中的任一项的溶液或条款75-90中的任一项的制品或条款88的药物组合物。

条款95.条款94的方法，其中所述方法包括将所述溶液或所述制品施用至所述受试者的眼睛。

条款96.条款94或95的方法，其中所述方法包括在将所述制品储存至少4、至少6、至少12、至少24、至少36或至少48小时以后将所述制品施用至所述受试者。

条款97.条款96的方法，其中所述受试者具有或被诊断出视网膜疾病。

条款98.条款97的方法，其中所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇或Stargardt病。

条款99.条款97或98的方法，其中所述制品包含有效地改善所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状的大小的细胞群体。

条款100.条款97-99中的任一项的方法，其中所述方法还包括监测所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状。

条款101.一种方法，其包括

(a)使细胞群体与条款1-74中的任一项的溶液接触从而产生细胞制品。

条款102.条款101的方法，所述方法还包括

(b)将(a)的细胞制品储存至少4、至少6、至少12、至少18、至少24、至少36、至少48、至少60或至少72小时。

条款103.条款102的方法，其中所述方法还包括

(c)在(b)的储存阶段以后将(a)的细胞制品施用给受试者。

条款104.条款103的方法，其中(c)的施用包括将所述细胞注射进受试者的眼睛。

条款105.条款101-104中的任一项的方法，其中所述方法还包括在(b)的储存阶段以后确定(a)的细胞制品中的细胞生存力。

条款106.条款101-105中的任一项的方法，其中所述方法包括在步骤(b)的储存阶段中冷藏(a)的细胞制品。

条款107.条款106的方法，其中冷藏包括在2-8℃的温度储存所述细胞制品。

条款108.一种用于治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括

将有效量的条款75-90中的任一项的制品或条款93的药物组合物施用至具有视网膜疾病的受试者的眼睛。

条款109.条款108的方法，其中所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇或Stargardt病。

条款110.一种试剂盒，其包含

(a)条款1-74中的任一项的溶液；

(b)关于使细胞群体与(a)的溶液接触以产生细胞制品的说明书；和

(c)用于(b)的接触和/或用于储存(b)的细胞制品的容器。

条款111.条款110的试剂盒，其中(a)的溶液和(c)的容器适合于(b)的细胞制品用于移植给受试者的用途。

实施例

简介

使用Alcon BSS作为RPE细胞配制、储存和移植介质，进行关于将RPE细胞施用至具有SMD和AMD的受试者的眼睛的1期临床试验。BSS是一种被批准用于用在眼内外科手术中的生理上相容的(摩尔渗透压浓度～310mOs,pH～7.4)溶液。当在临床施用(注射)之前在2-8℃储存时，在BSS中配制的RPE细胞的储存期限被限制为约4小时。由于该有限的产品储存期限，必须在参与试验的每个临床场所的紧邻处建立附属(satellite)细胞处理实验室。

开发显著地延长最终产品储存期限(例如，至48小时或更多)的介质会赋予众多优点。增强的储存期限将允许最终产品制剂在单个位置联合(consolidate)，从该位置可以将最终产品装运至美国的所有临床场所。以此方式，可以扩大临床场所的数目，其目前限于位于cGMP处理场所紧邻处的那些。延长的产品储存期限也会消除与维持多物质存货单、训练人员和监督多个附属处理场所有关的逻辑复杂性。延长的储存期限会增强安排移植的灵活性，所述移植目前必须发生在紧密的4小时窗口内。

延长最终产品储存期限将允许充裕的时间来刚好在患者准备外科手术或进入手术室(OR)之前通知任何延迟或取消。另外，如果最终产品在质量释放试验中失败，可能在当天制备另外的最终产品制剂，而不延迟或取消外科手术。延长储存期限允许将另外的时间用于补充最终产品释放试验诸如使用pan引物的DNA qPCR以检测下面提出的微生物污染物的存在。

穿过MedOne REF 3233Cannula 23/38递送在BSS中配制的RPE最终产品。使用当前的BSS制剂，观察到～23％的活细胞密度平均损失。该损失在试验的所有细胞密度是一致的，并且在生存力或随后在培养物中接种、繁殖和分化的能力方面对穿过插管挤出的剩余77％的细胞没有明显影响。尽管可以预见到归因于附着的一些细胞损失，但是随后的实验与细胞损失和可能的细胞裂解(可归因于在插管挤出过程中产生的剪切力)是一致的。

为了补偿预期的损失，相应地增加插管负载密度以确保递送的所需剂量。除了增加储存期限以外，具有合适粘弹性性能的最终配制介质会使在插管递送过程中的细胞损失最小化。使细胞损失最小化会减少细胞碎片的递送，从而减轻对细胞内组分的潜在免疫反应。

实施例1:介质组成

GS2介质

制备了一种用于细胞重构、储存、运送和/或施用给受试者的介质。如下制备命名为“GS2”的介质：

组合

48.75ml 0.9％的NaCl在水中的溶液；

13.10ml Alcon平衡盐溶液300mOsm在水中；和

3.75ml 5％右旋糖在0.9％NaCl(在水中)中(560mOsm)

以得到65.6mL介质，其具有0.29％右旋糖的终浓度和315mOsm的摩尔渗透压浓度。

基础GS2介质因而包含在水中的

约145mM NaCl(约0.85％NaCl)，

约2mM KCl(约0.015％KCl)，

约0.7mM CaCl(氯化钙)(约0.01％CaCl二水合物(氯化钙二水合物))，

约0.3mM MgCl(氯化镁)(约0.006％MgCl六水合物(氯化镁六水合物))，

约1mM柠檬酸钠(约0.035％柠檬酸钠二水合物)，和

约16mM葡萄糖(约0.29％右旋糖)。

任选地，所述GS2介质还可以包含有效地减少对细胞的剪切应力的量(例如，在约0.005-5％w/v的终浓度)的粘弹性聚合物。在某些实施方案中，所述粘弹性聚合物是透明质酸或其盐或溶剂化物。

Alcon平衡盐溶液

Alcon平衡盐溶液(无菌冲洗溶液)是一种无菌平衡盐溶液，其含有

0.64％氯化钠(NaCl)，

0.075％氯化钾(KCl)，

0.048％氯化钙二水合物(CaCl₂·2H₂O)，

0.03％氯化镁六水合物(MgCl₂·6H₂O)，

0.39％乙酸钠三水合物(C₂H₃NaO₂·3H₂O)，

0.17％柠檬酸钠二水合物(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)，

氢氧化钠和/或盐酸(以调节pH)，

和注射用水。

的pH是大约7.5，且重量摩尔渗透压浓度是大约300mOsm/Kg。

Alcon BSS因而包含

约109mM NaCl，

约10mM KCl

约3mM CaCl(氯化钙)

约0.1mM MgCl(氯化镁)

约5mM柠檬酸钠

Alcon平衡盐溶液PLUS

Alcon平衡盐溶液PLUS(BSS)是一种用于在眼内外科手术过程中使用的无菌眼内冲洗溶液。它在使用之前从命名为“部分I”和“部分II”的两个部分重构。

部分I是在500mL单次剂量瓶子中的无菌480mL溶液，向其中加入部分II浓缩物。BSS的部分I含有

7.440mg/ml氯化钠，

0.395mg/ml氯化钾，

0.433mg/ml磷酸氢二钠，

2.190mg/ml碳酸氢钠，

盐酸和/或氢氧化钠(以调节pH)，和

注射用水。

部分II是在20ml单次剂量小瓶中的无菌浓缩物，用于加入到部分I中。BSS的部分II含有：

3.85mg/ml氯化钙二水合物，

5mg/ml氯化镁六水合物，

23mg/ml右旋糖，

4.6mg/ml谷胱甘肽二硫化物(氧化的谷胱甘肽)，和

注射用水。

将BSS部分II加入部分I瓶子中以后，重构的产品含有在注射用水中的：

7.14mg/ml氯化钠，

0.38mg/ml氯化钾，

0.154mg/ml氯化钙二水合物，

0.2mg/ml氯化镁六水合物，

0.42mg/ml磷酸氢二钠，

2.1mg/ml碳酸氢钠，

0.92mg/ml右旋糖，

谷胱甘肽二硫化物(氧化的谷胱甘肽)0.184mg/ml，

盐酸和/或氢氧化钠(以调节pH)。

重构的产品具有大约7.4的pH和大约305mOsm的重量摩尔渗透压浓度。

实施例2:在BSS-中配制的RPE最终产品的储存期限

在BSS中配制的RPE最终产品在冷藏(2-8℃)中维持它的生存力4小时。已经完成了最终产品储存期限的更综合评价。在该研究中，将RPE块状产品(Bulk Product)融化并在支持2,000活细胞/μl的最终储存密度的2个活细胞密度配制。对于制备的所有剂量，该储存密度是恒定的。在即将加载注射器之前的OR中执行用预先测量的体积的BSS对细胞的最终稀释。该稀释步骤决定了在150μL注射体积中递送的最终细胞密度(对于所有剂量也是恒定的)。

在配制时(0小时)和在冷储存(2-8℃)4和6小时以后，评估冷储存的最终的BSS-配制的RPE细胞产品的细胞生存力、活细胞密度、纯度和效力(potency)。表明活细胞密度和细胞生存力在冷储存中恒定6小时。另外，给储存了0、4和6小时的配制的RPE细胞接种，并培养进行随后的纯度和效力评估。对于每个接种的时间点(0、4和6小时)，通过MITF和PAX6免疫染色评估纯度，并通过测量吞噬的颗粒的FACS分析来评估效力。数据表明，试验的所有产品属性在评价的6小时时段中保持恒定。

在BSS中储存12小时的RPE细胞通常表现出小于70％的活力，并且在BSS-Plus中储存24小时以后，RPE细胞生存力通常小于20％。

实施例3:改进的细胞重构、储存、运送和/或移植介质的开发

开发了改进的用于细胞重构(例如，从冷冻保存状态、细胞储存(例如，在重构或从细胞培养物收获和运送至移植设备或施用给受试者之间冷储存))、细胞运送和细胞移植的介质。得到的介质(GS2)的组分列出在下面表1中。提供了示例性的卖主。本领域技术人员会理解，存在所述列出的组分的另外来源，并且将能够确定这些试剂的合适来源：

GS2最终制剂在pH(7.2-7.6)和摩尔渗透压浓度(计算的摩尔渗透压浓度315)方面是生理学的。

配制GS2介质并在Iso-5BSC内的专用RPE细胞最终产品Iso-7洁净室中分配。将表1中的无菌组分加入无菌蓄池(reservoir)中并放在旋转振荡器(30-40RPM)上。最小3小时以后，将样品从蓄池取出，并测量pH和用0.1N NaOH的递增添加调至7.4±0.2的pH。用于填充的GS2没有与pH探针发生接触。将溶液用膜滤器除菌并重新检查pH。

将GS2的3ml等分试样分配进γ-照射的冷冻小瓶中，所述冷冻小瓶由满足USPClass VI限度的新鲜聚丙烯树脂组成。将样品从填充的每个瓶取出，并给小瓶盖帽。在如下所述合并的样品上执行QC检验。对每个瓶在可见光和紫外线下进行目检以证实微粒的不存在。将小瓶返回至无菌条件进行标记和在2-8℃储存。冷藏最小1天以后，将几个小瓶取出并使用用2-8℃pH标准品校准过的pH计重新检验pH以证实在使用温度(2-8℃)的可接受性。

实施例4：在GS2中的RPE细胞最终产品的质量控制和释放规范

对合并的GS2(其由从所有填充的小瓶取出的样品组成)的等分试样进行14天USP无菌度、pH、摩尔渗透压浓度和内毒素试验。还评估了在配制和穿过注射插管挤出以后每批GS2的维持RPE细胞生存力和生长的性能。示例性的质量控制试验和释放规范提供在下面表2中：

4

应该理解，在表2中列出的释放标准是示例性的，并且在表2中列出的任何标准的任意组合可以组合，并单独使用或与关于释放试验和质量控制的另外标准组合使用。

在RPE细胞生长测定的一个示例性实施方案中，在GS2储存阶段以后，将细胞以最初密度(例如，在20,000个细胞/孔的密度)接种在明胶包被的96孔板内的RPE GM或EGM2/EBM2培养基(Lonza，例如，目录号:CC-3156,CC-4176)中。使细胞在合适的条件下生长2-3天，例如，在5％CO₂中，在37℃，和在控湿培养箱中。使细胞从孔升起，例如，通过胰蛋白酶消化，然后计数。如果在培养阶段结束时，每孔的细胞计数是最初细胞密度的125％或更大(例如，对于20,000个细胞/孔的最初密度，>/＝25,000个细胞/孔)，则满足用于该试验的GS2质量释放试验标准。

实施例5：RPE最终产品配制、包装和运送

在下述的过程中，将BSS用在GS2处理的最初洗涤步骤中。本公开内容的实施方案也预见到并包括在GS2中、而不是在BSS中洗涤。将为了临床应用释放的冷冻保存的MA09-hRPE细胞的小瓶从液氮储存中恢复。取决于剂量，需要2-4个小瓶的细胞。将冷冻小瓶运送至洁净室并在37℃水浴中快速融化。将每个瓶的融化内容物(在冷冻保存时含有200万个细胞的1ml冷冻保存介质(90％FCS+10％DMSO))轻轻再悬浮于温暖的DMEM中，转移至50ml锥形管并用另外的温暖DMEM达到40ml的终体积。将每个试管的再悬浮细胞离心(在室温160×g 5分钟)，并将每份沉淀再悬浮于40ml室温BSS中。将每份细胞悬浮液再次离心，将沉淀合并和再悬浮于10ml室温BSS中。将再悬浮的合并细胞离心(在室温160×g 5分钟)第三次，并将上清液抽吸。

下面是解释上述产品制剂的步骤的流程图(GS2处理步骤用下划线表示)：

RPE产品制剂-I

除去尽可能多的上清液以后，将沉淀再悬浮于一定体积的冷BSS(当前处理)或冷GS2(GS2处理)中，对于融化的每100万个细胞，靶向50μl的终体积。从此时开始，将细胞保持在预先冷却的试管支架中以在剩余的方法步骤中将细胞保持在2-8℃。15-25％靶体积的典型回收会产生大约4,000个活RPE细胞/μl的细胞悬浮液。

取出样品，执行活细胞计数，并确定回收的细胞的活细胞密度和总数。将另外的冷BSS或冷GS2加入细胞悬浮液中以使最终的细胞浓度达到2,300个活RPE细胞/μl(比2,000个活RPE细胞/μl的靶最终制剂浓度多300个细胞)。执行确认性细胞计数并加入另外的冷BSS或冷GS2以使终浓度达到2,000个活RPE细胞/μl。将所需体积的细胞分配进最终产品闭包(closure)(0.5ml无菌微量离心管；Fisher,目录号02-707-351)。将产品标签附着于用于BSS处理的每个试管或含有用于GS2处理的产品试管的Whirl-Pak包，指定BSSRPE的4小时期满或GS2RPE的48小时期满。将样品从每个产品试管取出，并将这些样品合并用于存档和QC检验。

另外，开发了培养的细胞的配制方案。在该方案中，将冷冻保存的RPE细胞融化，并在GS2移植介质中的细胞配制之前预培养3-7天。使培养的细胞从培养皿升起，并首先在DMEM中洗涤，然后在BSS-Plus中洗涤，并最后在与GS2介质1:1混合的BSS-Plus中洗涤。最终的洗涤步骤以后，将细胞转移进冷(2-8℃)GS2介质。样品取出、试验和最终细胞密度的体积调节如上所述。

下面是解释上述产品制剂的步骤的流程图(GS2处理步骤由下划线表示)：

RPE产品制剂-II

在BSS中的RPE的包装和运送。关于临床试验移植(SMD和AMD)，每个剂量由一对试管组成：一个试管含有预先测量体积的在2,000个活RPE细胞/μl配制的RPE细胞，且另一个试管含有预先测量体积的BSS将每对试管在2-8℃放在Labtop试管冷却支架中。将冷却支架装袋，放在含有～16磅预冷却的Insul-Ice的Coleman Cooler中，并由快递员手工递送至诊所。

在OR中，在即将移植之前，使用钝填充针头将BSS加给细胞。将细胞混合并加载进1ml注射器中。将产品(对于所有剂量，150μl)穿过注射插管挤出在视网膜下间隙中。将注射器中的负载细胞密度设定在1.33倍递送密度以补偿在插管挤出过程中的25％预期损失。

下面是解释在BSS中的包装和运送步骤的流程图：

在GS2中的RPE的包装和运送。每个剂量由1个含有以2,300个活RPE细胞/μl配制的250μl RPE细胞的微量离心管组成。将含有1个剂量的最终的配制的RPE产品的单个试管放在2盎司无菌Whirl-Pak袋中，所述袋已经附着最终产品标签。将装袋的试管放在干净的、预冷却的(2-8℃)、独特编号的便携式试管冷却器中。除了带标签的产品试管以外，还将含有30μl RPE产品细胞的带标签的附属试管(没有装袋)和含有100μl 0.4％锥虫蓝的单独试管放在每个Chillette冷却器中。还将最终产品标签附着于每个Chillette冷却器。将每个含有产品的冷却器在无菌条件下放在无菌的Whirl-Pak袋中。将装袋的含有产品的冷却器、伴随的临床定货单和两个产品标记放在通向最终的包装和装运区域的洁净室通道(pass-through)中。为了避免混淆，给每个Chillette冷却器在无菌条件加载产品试管并一次一个地放入洁净室通道中。

包装人员从洁净室通道取回每个Chillette冷却器和伴随的文件和最终产品标记，并将装袋的Chillette冷却器、泡沫包装、钝填充针头、注射器、注射插管和血球计数器放入预先冷却的Nano Cool冷却单元的装运室中。将冷却单元的盖子扣紧，并给外部托运箱装入关于收据、检查、储存和运送后生存力试验的文件。将包装的产品置于隔离下，直到已经执行所有产品释放试验和已经颁发“释放用于移植的RPE细胞最终产品证书”。将具有产品和文件的NanoCool托运箱连夜发送至诊所。在接收后，可以将托运箱在室温或在2-8℃储存，直到从最终填充时算起48小时内的产品使用。将具有失效日期和时间的最终产品标记附着于外部托运箱、Chillette试管冷却器和含有最终产品试管的袋。

RPE最终产品质量释放试验。在移植之前执行的当前最终产品(在BSS中)质量释放试验包括细胞生存力检查和革兰氏染色。发送样品用于USP 14天无菌度试验，在移植后报告结果。

用于检测污染物的qPCR。由于RPE最终产品储存期限从在BSS-中的4小时延长至在GS2中的至少48小时，可以在产品释放之前执行具有较长出报告时间(turn-aroundtime)的测定。例如，现在可能在产品的释放和使用之前对RPE最终产品进行PCR测定和接收用于质量控制和释放目的的结果。可以执行的一个合适测定是pan-引物DNA qPCR测定。这样的测定可以在2小时内完成。qPCR测定是极其灵敏的，并且可以用于检测宽范围的病原性污染物，例如，环境污染物、微生物污染物和病毒污染物以及常见的皮肤共栖物(commensules)。qPCR测定可以用作除了革兰氏染色和USP无菌度试验以外用于检测微生物污染物的辅助最终产品释放测定。在产品装运之前已知qPCR结果，从而防止潜在污染的产品离开设备。应该理解，本文描述的qPCR测定是示例性的，并且可以替代性地或额外地执行其它合适测定，包括、但不限于，其它PCR测定和可以在最终RPE产品的延长储存期限内执行的其它类型的测定。

最终产品运送后检查和生存力检查。在临床场所接收后，经过训练的人员将取回外部托运箱，证实正确的批次和批信息，并检查托运箱的损伤痕迹。如果临床场所具有执行细胞生存力检查的能力，在此时从Chillette冷却器取出含有细胞的附属试管和含有锥虫蓝的试管。将试管转移至试验实验室进行运送后细胞生存力检查。如果细胞生存力低于70％，则将该产品抛弃。

关于加载注射插管的简介。在即将在OR中移植之前，将细胞使用钝填充针头混合并加载进1ml注射器。将产品(150μl)穿过注射插管挤出进视网膜下间隙中。由于在GS2中在插管挤出过程中仅存在标称的细胞损失，在注射器中的加载细胞密度(2,000个活RPE细胞/μl)是用150μL(为300K剂量注射)递送的密度。

实施例6:在GS2中的细胞稳定性

图1表明，RPE细胞可以在HypoThermosol(BioLife Solutions,Inc.,Bothell,WA,USA)中维持24小时(而不是48小时)，随后铺板和在培养物中生长的能力没有明显损失。

图2-5解释了在2-8℃在GS2中的RPE稳定性。图2表明，可以将RPE细胞在GS2中维持至少48小时，活细胞数目或随后铺板和在培养物中生长的能力没有明显损失。图3表明，可以将RPE细胞在GS2中维持4-5天，细胞生存力仅稍微损失，且活细胞密度没有显著下降。图4表明，在GS2冷藏5天以后，RPE细胞的铺板和在培养物中生长的能力开始下降。图5表明，GS2与当前的注射系统相容。

实施例7:GS2移植介质-粘弹性聚合物的影响

评估了在套管插入以后不同浓度的粘弹性聚合物对细胞生存力的影响。根据cGMP规程制备人视网膜色素上皮细胞(RPE)整批(bulk lot)NRPE-313 5C P2并冷冻保存。在实验当天，将小瓶融化并配制。将细胞融化进预温热的(37℃)DMEM(Gibco)中。然后将细胞离心(在160×g 5分钟)。将每份沉淀再悬浮于40ml室温BSS(Alcon)中并再次离心。然后将沉淀合并进单个离心管中，再悬浮于室温BSS并然后分入多个(4)试管，然后以每个试管10ml体积完成最终的离心步骤。将细胞沉淀物放入不同的移植介质制剂(命名为GS2TM)中。

如下制备移植介质GS2TM：在无菌蓄池中组合5％的右旋糖在盐水(0.9％NaOH)中的溶液，Braun NDC#00264-7610-00或Baxter NDC#0338-0089-04；盐水(0.9％NaOH)，Baxter NDC#0338-0049-11；Alcon BSS冲洗溶液，NDC#0065-0795-15；和透明质酸或透明质酸钠(HA)，诸如Abbott Healon EndoCoat,NDC#05047-4547-06，并在定轨摇床上混合组分。测量pH，并用0.1N NaOH的递增添加调至7.4±0.2的pH，然后无菌过滤。在该实验中，制备含有0.15％、0.1％、0.05％或0％的来自Healon EndoCoat(Abbott)的透明质酸(HA)的终浓度的GS2TM。

将细胞递增稀释以得到约2,000个细胞/微升的最终储存细胞密度。在不同的移植介质中重构和稀释以后，为每种条件制备三个小瓶的细胞。将小瓶的细胞在冰箱中在2-8℃储存2天。此后，使用血球计数器确定细胞数目。通过锥虫蓝排除获得细胞生存力。从为每种条件制备的三个试管的细胞计算平均值，从三份计数确定每个试管的活细胞浓度。计算在穿过MedOne#3233插管挤出之前和之后细胞数目的差异，或δ。

该实验的结果显示在图6中。显示了来自三份试管的平均活细胞密度±标准差。使用血球计数器确定人RPE细胞密度。通过锥虫蓝排除获得细胞生存力。从为每种条件制备的三个试管的细胞计算平均值，从三份计数确定每个试管的活细胞浓度。对于每种条件，在穿过MedOne#3233插管的细胞挤出以后观察到的细胞数目的变化百分比(δ)显示在每组值上面。

尽管试验的HA的所有浓度表明在套管插入以后改善的细胞生存力值，但是确定0.05％HA的添加对于移植介质制剂而言是优选的。与没用HA或用0.1％或0.15％的HA制备的GS2TM相比，用含有0.05％HA的GS2TM观察到穿过MedOne#3233插管挤出RPE细胞以后更少的细胞损失。最值得注意的是，与没有加入HA的GS2TM相比，包含0.05％HA时观察到少10％的损失。

实施例8:GS2介质-葡萄糖浓度对细胞生存力的影响

评估了在套管插入以后不同浓度的粘弹性聚合物对细胞生存力的影响。为此目的，根据cGMP规程制备人视网膜色素上皮细胞(RPE)整批(bulk lot)NRPE-313 5C P2并冷冻保存。在实验当天，将小瓶融化，将细胞在预温热的(37℃)DMEM(Gibco)中重构。然后将细胞离心(在160×g 5分钟)。将每份沉淀再悬浮于40ml室温BSS (Alcon)中并再次离心。然后将沉淀合并进单个离心管中，再悬浮于室温BSS并然后分入多个(6)试管，然后以每个试管10ml BSS完成最终的离心步骤。将细胞沉淀物放入不同的移植介质制剂(GS2TM)中。

如下制备移植介质(GS2TM)：在无菌蓄池中组合5％的右旋糖在盐水(0.9％NaOH)中的溶液；盐水(0.9％NaOH)；和Alcon BSS冲洗溶液,NDC#0065-0795-15；并在定轨摇床上混合。测量pH，并用0.1N NaOH的递增添加调至7.4±0.2的pH，然后无菌过滤。用不同浓度的葡萄糖制备用于该实验的GS2TM介质，如在下面表3中所示。所注的体积以毫升为单位：

表3：

在不同的GS2移植介质中配制后，将细胞递增稀释以得到约2,000个细胞/微升的最终储存细胞密度。然后将细胞在无菌的小瓶(Fischer)中在冰箱中在2-8℃储存3-天。随后，使用血球计数器确定活细胞数目，并将大致20,000个活细胞/孔铺板在明胶包被的(Stem Cell,Inc.)96-孔组织培养板(COSTAR)中。将细胞在5％CO₂、37℃控湿培养箱中在RPE生长培养基(EBM-2，其含有EGM2Single Quots,Stem Cell,Inc.，例如，Lonza目录号:CC-3156,CC-4176)中培养3-天。随后使用40μl/孔的1:1胰蛋白酶(Sigma)和基于HEPES的解离介质(Gibco)使细胞从平板升起。使用含有血清的介质(40μl/孔)中和胰蛋白酶作用，并将细胞用吸量管吹打(titrated)以升起，并使用血球计数器计数。图7显示了对于试验的每种条件来自6个孔的人RPE细胞/孔的平均数±SD。每种葡萄糖浓度产生了与不含葡萄糖的对照相比增强的结果。

实施例9：在GS2介质中增强的间充质干细胞的生存力

图8解释了间充质干细胞(MSC)在不同的配制介质中的细胞生存力。使人胚胎干细胞-衍生的MSC生长至70％汇合，用0.05％胰蛋白酶收获，再悬浮于aMEM+15％FCS(MSC介质)中，并在200×g离心5min。将细胞沉淀物再悬浮于小体积的MSC介质中，并使用锥虫蓝排除针对生存力计数。将500万MSC放入4个Eppendorf管中的每一个中，离心，并再悬浮于1ml每种指示的介质。将试管放入4℃冷藏室中指定的时间段。CS：犬血清；FBS：胎牛血清。图8表明，在有和没有血清的情况下，在GS2中的制剂增强MSC细胞生存力并延长MSC储存时间。

图9表明，当在GS2中储存时，较高的细胞密度(以百万个细胞/ml显示)增强MSC生存力。在GS2中储存24小时以后，发现血清(在这里是FBS)的存在对细胞生存力没有影响(箭头)。

图10表明，在4℃在GS2中储存并随后穿过26G针头/注射器挤出以后，保留MSC生存力。

实施例10:关于GS2运送介质的分析的示例性证书

作为质量控制的部分，对意图用于人和/或兽医患者的主题运送介质进行一组试验，意图使所述介质作为药物或外科手术过程的部分的效用最大化，并使不良反应或事件的潜力最小化。例如，内毒素是非常有效的、热稳定的，并穿过大多数灭菌膜滤器，并且存在于细菌所在或已经存在过的每个地方。在要将运送介质用于局部递送的情况下，诸如在视网膜下间隙中(如当用于配制注射用RPE细胞时所预期的)，最担心内毒素。因此，已经对GS2运送制剂进行一组试验，并已经证实满足下述标准:

实施例11:通过阻光(light obscuration)方法试验运送介质

也作为质量控制的部分，特别是对于为用在人患者中配制的细胞的应用，本发明的运送介质通常不含有不可接受的量的颗粒物。颗粒物由可移动的不溶性颗粒(即，其不是气泡)组成，由于它代表的小物质和它的异质组成，所述不溶性颗粒通常不可通过化学分析量化。当使用阻光方法(USP 788试验方法)试验(即，其用电子颗粒计数器计数颗粒物)时，已经证实本发明的运送介质制剂具有不超过25个≥10微米大小的颗粒/mL运送介质和不超过3个≥25微米大小的颗粒/mL运送介质。

USP 788提供了用于确定颗粒物的规程，方法1(阻光颗粒计数试验)和方法2(微观颗粒计数试验)。当针对在显微镜下才能看到的颗粒检查运送介质时，优选地应用方法1。但是，在主题制剂的某些情况下，可能必须通过阻光颗粒计数试验、随后通过微观颗粒计数试验来试验制品以达到关于与要求的一致性的结论。

并非通过这些方法中的一种或两种可以针对在显微镜下才能看到的颗粒检查所有胃肠外制品。当方法1不可用时，例如在具有降低的澄清度或增加的粘度的制品的情况下，应当根据方法2进行试验。在运送介质包括胶体或脂质体作为组分的情况下，是后者的实施例。类似地，对于当抽入传感器中时可能产生空气或气泡的运送介质的那些实施方案，也可能需要微观颗粒计数试验。尽管主题运送的当前优选实施方案不是非常粘的，如果要试验的制品的粘度足够高以致于妨碍通过任一种试验方法对它的检查，那么可以在必要时做出用适当稀释剂的定量稀释以降低粘度，以允许执行所述分析。

USP方法1.阻光颗粒计数试验。在基于阻光原理的合适设备中试验GS2运送介质的样品(含有和不含透明质酸组分)，所述设备允许自动确定颗粒的大小和根据大小的颗粒数目。使用在10μm和25μm之间的已知大小的球形颗粒的分散体校准所述设备，USP ParticleCount Reference Standard。将这些标准颗粒分散在无颗粒的水中。小心地避免在分散过程中的颗粒聚集。在限制颗粒物的条件下(即，在层流柜中)进行颗粒物试验。非常小心地洗涤和冲洗玻璃器皿和过滤设备。在即将使用前，将设备用无颗粒的水从上至下冲洗外面和里面。使用足以提供正在分析的运送介质的统计上可靠的评估的试验样本数目，针对等于或大于10微米和25微米的颗粒的数目分析样品。对于每种试验的GS2运送介质样品，样品包括≤25个≥10微米大小的颗粒/mL运送介质和≤3个≥25微米大小的颗粒/mL运送介质。

实施例12:RPE细胞体内生存力和在GS2介质中的效力的证实

其目的是评价和对比以下细胞的安全性、移植物植入和功能性：1)在BSS中配制并在4小时内移植的、源自胚胎干细胞(ES)系MA09的人视网膜色素上皮(hRPE)细胞；2)在BSS中配制的、源自ES细胞系J1的hRPE细胞；和3)在GS2运送介质中配制并(a)在22-28小时内和(b)在44-52小时内移植的、源自J1细胞系的hRPE细胞。该研究证实，与当前使用的临床配制介质(BSS-PLUS)相比，GS2介质会延长最终产品的储存期限。

接收共32只RCS(Royal College of Surgeon)青少年大鼠(16只雄性和16只雌性)用于研究。在给药开始时，大鼠是21-25天龄。

顺应阶段：最小7天。第1天对应于视网膜下注射的当天。

实验设计：将8只RCS大鼠(4/性别)随机化至四个剂量组MA09-hRPE(组1)和J1-hRPE(组2,3,4)，每个组由三个亚组组成(下面表1)。所有大鼠在麻醉下经由经巩膜施用途径接受在右眼(OD)中的hRPE细胞的视网膜下注射。给组1施用在BSS中的MA-09hRPE(在4小时内)，给组2注射在BSS中的J1hRPE细胞(在4小时内)，给组3注射在GS2中的J1hRPE细胞(在22-28小时内)，并给组4注射在GS2中的J1hRPE细胞(在44-52小时内)。通过左眼的给药定义亚组；假亚组(1/性别)仅接受向左眼的视网膜下间隙的针头穿刺；无注射(NI或未治疗)亚组(1/性别)没有接受左眼中的注射；且两个媒介物亚组(2/性别)接受GS2或BSS Plus媒介物的视网膜下注射。在注射后70-80天将大鼠安乐死。

表1实验性研究设计

NI＝无注射，假的＝用空移液器穿刺视网膜下间隙。

媒介物(无细胞)GS2＝2μL媒介物(无细胞)

hRPE＝100,000个细胞在2μL BSS或GS2媒介物中。

在下面表2中呈现了存活(in-life)测量、进行的评价的尸检和组织病理学端点的总结。

表2评价参数和间隔

在给药当天按照标签重构BSS-并冷藏(2-8℃)储存用于在配制过程中稀释RPE细胞，以及用于被外科医生用来填充注射设备和用于用作媒介物参照物。简而言之，将BSS部分II的内容物转移至BSS部分I并用于在重构的6小时内重新悬浮RPE细胞。在研究记录中记录并维持重构和注射的时间。

配制在该研究中使用的GS2介质批次并在2-8℃储存。在配制过程中在室温使用GS2来洗涤细胞，并且对于RPE细胞最终制剂在2-8℃，以及，被外科医生用来填充注射设备和用作要注射的媒介物参照物。

BBS-Plus制品：将冷冻保存的MA09-hRPE和J1-hRPE细胞在液氮(LN2)中储存以将细胞维持在≤135℃的温度的汽相中。在处理和移植当天之前，将细胞维持在LN2储存。在移植当天，将冷冻保存的hRPE融化并以大约50,000个活细胞/μL在BSS-中配制。将浓缩的hRPE细胞在Final Fill Tube(在LabTop Cooler中放在湿冰上)中递送至外科医生用于在配制的4小时内使用(图11,参见“MA-09RPE<4h”和“J1RPE<4h”)。在研究记录中记录并维持重构和注射的时间。

GS2制品：将冷冻保存的J1-hRPE储存在干燥液氮(LN2)中-在≤135℃的温度的汽相中。在处理当天之前，将细胞维持在LN2储存。在移植之前1或2天，将J1-hRPE细胞融化并以大约1,500个活细胞/μL在GS2中配制。然后将配制的RPE在2-8℃储存，并在配制后2-6小时以后评估活细胞数目。在配制后大约20小时或42小时，将RPE细胞在GS2中浓缩至大约50,000个活细胞/μL。将浓缩的hRPE细胞在Final Fill Tube(在LabTop Cooler中放在湿冰上)中递送至外科医生。在GS2中配制后约22小时或44小时，移植RPE细胞(图11，分别参见“J1RPE<22”和“J1RPE<44”)。

剂量施用：视网膜下注射

将动物用氯胺酮(75mg/kg)和右美托咪定(0.25mg/kg)的混合液麻醉，继之以经由SQ的卡洛芬(5mg/kg)用于剂量施用。在给药前，用0.9％注射用氯化钠(无菌NaCl)USP冲洗眼睛。然后将眼睛用2滴0.3％Ocuflux眼用溶液USP清洁，并用散瞳药滴剂(1％托吡卡胺)、继之以2.5％盐酸去氧肾上腺素眼科学溶液USP扩瞳。将在BSS中的试验物MA09和J1hRPE细胞在配制的0.25-4小时内注射(组1和2，表1)。在GS2中的试验物J1hRPE细胞是在配制的22或44小时内(组3和4，表1)。通过视网膜下注射将每组(接受MA09-hRPE细胞或J1-hRPE细胞)的试验物施用至每组8只动物的右眼，如在上面的实验设计(和表1)中指示的。给组1和2中的每一组的四只动物的左眼施用参照物BSS给组3和4中的每一组的四只动物的左眼施用参照物GS2。对四个组中的每一组的2只动物的左眼进行注射操作，但是不注射物质(假注射)。四个组中的每一组的剩余2只动物的左眼没有接受注射(未治疗)。

简而言之，使用外科手术显微镜执行视网膜下注射。在眼球中纬线(equator)后面使用缝线(Ethicon 4-0Perma-Hand Silk)使用围绕眼球的荷包环(purse-string loop)使眼睛稳定化。将羟丙甲纤维素(或类似的)溶液应用于眼睛并用环保持就位。使用剪刀切掉结膜的小区域，并应用30G x1/2”金属针头以在眼球的上背颞区处执行巩膜切开术。将由经校准的无菌玻璃移液器(World Precision Instruments,Item#1B150-4)组成的给药设备连接至约0.8mm孔Tygon^TM塑料管道(Saint-Gobain Performance Plastics#R-3603)，后者连接至18G钝针头(Becton-Dickenson,Inc.Reference#305196)，后者连接至25μLHamilton注射器(Model#702LT目录号804010)，后者预填充了如在研究设计中所述的适当媒介物(表1)。将少量空气引入线中以将注射液(injectate)与给药设备中的媒介物分离，此后将试验物或参照物抽入玻璃移液器中至2μL的体积。将新的无菌玻璃移液器用于每次注射/眼睛。

用不可吸收的外科手术缝线(Ethicon Prolene 10-0)缝合巩膜切开术。将围绕眼球的缝线(Ethicon 4-0Perma-Hand)除去，并将眼睑最终恢复至正常位置。在注射操作结束后，将局部抗生素(5mg/g红霉素眼软膏)应用于经治疗的眼睛。

在外科手术过程中，绘制小心的外科手术中底(fundus)图以记录泡(bleb)的大小和位置以及任意其它眼睛变化。

将动物维持在保温板上或加热毯(～37℃)下直到完全恢复，此后将它们返回至它们的居住笼。在需要时，将0.5％红霉素眼软膏的另外施用应用于眼睛的表面以防止干燥，直到动物完全清醒和可以正常眨眼。

将所有动物维持于在饮用水中施用的口服环孢菌素A(CsA)(210g/L，导致大约300g/L的靶血液浓度)。地塞米松的腹膜内注射也是在外科手术以后每天1次持续14天(1.6mg/kg/天)。

至少每天1次进行死亡率/垂死率的笼侧面观察和临床观察。不存在疾病或对治疗的反应的临床征象。在顺应期间将动物称重至少一次，和在研究期间大约每周和在即将尸检之前称重(终末重量)。对于研究动物没有观察到体重的例外变化。在给药前、在给药后大约40天和在尸检前再次进行眼检查。使用作为1滴/眼滴注的1％托吡卡胺将动物眼睛扩瞳进行检查。从不同RPE制剂组之间的眼检查没有揭示明显差异。同样地，在表2所述的时间，为所有动物测量使用不同空间频率的移动条执行的光动反应(OKR)。通过所有眼睛(实验和对照)中的OKR测量视敏度。要使用的方法，视力测定试验设备(Prusky等人,2000)，由被垂直正弦波格栅(grafting)覆盖的旋转圆筒组成，在虚拟三维(3-D)空间中呈现在排列成正方形的四台计算机监视器上。将大鼠无限制地放在平台上在正方形的中央，在此处它们用反身头部运动跟踪格栅。通过重复地将‘圆筒’中心重新定位在试验对象的头部上，将格栅的空间频率夹紧在观察位置。通过使用精神物理学楼梯进展增加格栅的空间频率将视敏度量化，直到视动反射丧失，由此得到最大阈值。以c/d(周期/度)为单位进行测量。从不同RPE制剂组之间的OKR实验没有揭示明显差异。如上还执行了波谱域光相干性体层摄影术(SD-OCT)，从不同RPE制剂组之间的眼检查没有揭示明显差异。通过IP注射麻醉剂，将大鼠麻醉。为了视网膜的更好成像，将托吡卡胺应用于双眼以扩大瞳孔。将大鼠放在成像系统中，将Genteal和Systane的滴眼剂应用于角膜以保持角膜湿润。

图11显示了一组16只大鼠在治疗后60天的视网膜电流图(ERG)的结果。如上，从不同RPE制剂组之间的ERG检查没有揭示明显差异。简而言之，将动物保持在完全黑暗中过夜(至少12小时)以达到视网膜的暗适应状态。为了记录ERG，将动物用麻醉剂的IP注射麻醉并放在立体定位头固定架中。在模糊红光照射下，将记录电极(两个共轴丝环，丝直径50um，附着于中性接触镜片)放在用利多卡因预处理的动物眼睛上。将一条后肢用电动推子剪掉毛，并将皮肤用betadyne准备，然后插入插管(在操作持续期间将插管插入后肢肌肉中)。用托吡卡胺扩大瞳孔。在开始记录之前，使用另外的1-小时暗适应阶段来恢复动物准备以后的适应。对于双眼(将以左-右或右至左的次序试验眼睛)，整个ERG记录持续约20分钟。用全视野闪光刺激眼睛。用与电极连接的放大器记录角膜电势。用计算机程序控制闪光呈现。为5-100次刺激呈现取应答平均值，取决于ERG强度，其在具有进行性视网膜变性的动物中可以是非常低的。

总之，这些研究的结果指示，GS2转移介质会提供大约同样有效剂量的活的和功能性的RPE细胞(甚至在GS2转移介质中悬浮多达44小时以后)，当与悬浮小于4小时以后的BSSPlus介质相比时，所述4小时是当前FDA和EMA批准的用于RPE细胞注射的BSS-Plus的使用的储存期限。在每种情况下，作为对照，所述动物的假的和未治疗的眼睛没有表现出相对于在BSS-Plus和GS2转移介质中RPE细胞治疗的眼睛的任何改善。

等同方案和范围、通过引用并入

本领域技术人员会认识到，或使用不超过例行实验能够确定，本文描述的实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围无意限于以上描述，而是如所附权利要求所述。

冠词诸如“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数形式，除非上下文另外清楚地指出。因而，例如，对“一种试剂”的提及包括单一试剂和多种这样的试剂。

如果组成员中的一个、超过一个或全部存在，则认为满足在一组的两个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。在两个或多个组成员之间包括“或”的组的公开内容会提供其中存在该组的刚好一个成员的实施方案，其中存在该组的超过一个成员的实施方案，和其中存在所有组成员的实施方案。为了简洁的目的，没有在本文中单独阐述那些实施方案，但是应该理解，本文提供了这些实施方案中的每一个，并且可以具体地声明或放弃。

应当理解，本发明包括所有变体、组合和排列，其中将来自一项或多项权利要求或来自说明书的一个或多个相关部分的一个或多个限制、要素、条款或描述性术语引入另一项权利要求中。例如，可以将依赖于另一项权利要求的权利要求修改成包括在依赖于相同基础权利要求的任意其它权利要求中发现的一个或多个限制。此外，当权利要求叙述一种组合物时，应当理解，包括根据本文中公开的任何制备或使用方法或根据本领域已知的方法(如果有的话)制备或使用所述组合物的方法，除非另外指出或者除非本领域普通技术人员显而易见会引起抵触或矛盾。

在将要素呈现为列表的情况下，例如，以马库什群组形式，应当理解，也公开了所述要素的每个可能亚组，并且可以从所述组除去任何要素或要素亚组。还指出，术语“包含”意图是开放的，并允许包括另外的要素或步骤。应当理解，一般而言，在实施方案、产品或方法被称作包含特定要素、特征或步骤的情况下，同样提供了由这样的要素、特征或步骤组成或基本上由这样的要素、特征或步骤组成的实施方案、产品或方法。为了简洁的目的，没有在本文中单独阐述那些实施方案，但是应该理解，本文提供了这些实施方案中的每一个，并且可以具体地声明或放弃。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指出或以其它方式从上下文和/或本领域普通技术人员的理解显而易见，被表达为范围的值可以采用在所述范围内的任何具体值，在某些实施方案中，其精确至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。为了简洁的目的，在本文中没有单独阐明在每个范围内的值，但是应该理解，本文提供了这些值中的每一个，且可以具体地声明或放弃。还应该理解，除非另外指出或以其它方式从上下文和/或本领域普通技术人员的理解显而易见，被表达为范围的值可以采用在给定范围内的任何子范围，其中将所述子范围的端点表达至与所述范围的下限单位的1/10相同的精确度。

另外，应当理解，可以从任意一项或多项权利要求明确地排除本发明的任何特定实施方案。在给出范围的情况下，可以从任意一项或多项权利要求明确地排除在所述范围内的任意值。可以从任意一项或多项权利要求排除本发明的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面。为了简洁的目的，在本文中没有明确地阐述所有这样的实施方案：其中排除一个或多个要素、特征、目的或方面。

在本文中(例如，在背景、发明内容、详细描述、实施例和/或参考文献部分中)提及的所有出版物、专利、专利申请、公开和数据库条目(例如，序列数据库条目)特此通过引用整体并入，如同每篇单独的出版物、专利、专利申请、公开和数据库条目特别地和单独地通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

Claims (42)

1.溶液，其包含

(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂；和

(b)至少2mM或至少0.05％(w/v)葡萄糖；和

(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂。

2.权利要求1的溶液，其中所述溶液包含至少5mM或至少0.1％(w/v)葡萄糖；或至少7.5mM或至少0.14％(w/v)葡萄糖；或至少10mM或至少0.2％(w/v)葡萄糖；或至少15mM或至少0.25％(w/v)葡萄糖；或至少20mM或至少0.4％(w/v)葡萄糖；或至少25mM或至少0.5％(w/v)葡萄糖。

3.权利要求1或2的溶液，其中所述溶液还包含

(a)二价阳离子的来源，任选地其中所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源，和/或

(b)乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂。

4.溶液，其包含

(a)将所述溶液维持在生理pH的缓冲剂，其中所述缓冲剂不是碳酸氢盐缓冲剂；和

(b)葡萄糖；和

(c)将所述溶液维持在生理学摩尔渗透压浓度的渗透压活性剂；和

(d)二价阳离子的来源，

任选地其中所述二价阳离子的来源包含钙源和/或镁源，和/或其中所述缓冲剂包含乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂。

5.权利要求3或4中的任一项的溶液，其中所述钙源包含药学上可接受的钙盐，和/或所述镁源包含药学上可接受的镁盐。

6.权利要求5的溶液，其中所述药学上可接受的钙和/或所述药学上可接受的镁盐选自与选自乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、盐酸、马来酸、草酸、磷酸、硬脂酸、琥珀酸和硫酸的酸形成的钙盐和/或镁盐。

7.权利要求3-6中的任一项的溶液，其中所述钙源包含氯化钙，任选地其中所述钙源包含氯化钙二水合物。

8.权利要求3-7中的任一项的溶液，其中所述镁源包含氯化镁，任选地其中所述镁源包含氯化镁六水合物。

9.权利要求3-9中的任一项的溶液，其中所述柠檬酸盐缓冲剂作为柠檬酸钠提供。

10.权利要求1-9中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖是D-葡萄糖(右旋糖)。

11.权利要求1-10中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂是盐，任选地其中所述渗透压活性剂是钠盐，进一步任选地其中所述渗透压活性剂是氯化钠。

12.权利要求1-11中的任一项的溶液，其中所述溶液包含氯化钙、氯化镁、柠檬酸钠、氯化钠和葡萄糖。

13.权利要求1-12中的任一项的溶液，其中所述溶液的pH是6.8-7.8、或7.4-7.5、或约7.5。

14.权利要求1-13中的任一项的溶液，其中所述溶液是等渗的或高渗的。

15.权利要求1-14中的任一项的溶液，其中所述溶液表现出约270-345mOsm/l或约315mOsm/l的摩尔渗透压浓度。

16.权利要求3-15中的任一项的溶液，其中所述钙源的浓度是

(a)0.25-0.75mM、或0.4-0.65mM、或0.5-0.6mM、或约0.6mM；或

(b)0.5-0.9mM、或0.6-0.8mM、或约0.7mM。

17.权利要求3-16中的任一项的溶液，其中所述镁源的浓度是0.05-5mM、或0.1-0.3mM、或约0.3mM。

18.权利要求1-40中的任一项的溶液，其中所述葡萄糖的浓度是5-50mM、或10-25mM、或10-20mM、或约16mM。

19.权利要求1-18中的任一项的溶液，其中所述渗透压活性剂的浓度是约100-200mM、或约125-175mM、或约150mM。

20.权利要求3-19中的任一项的溶液，其中所述柠檬酸盐或乙酸盐的浓度是0.1-5mM、或0.5-2mM、或约1mM。

21.权利要求1-20中的任一项的溶液，其中所述溶液还包含钾盐，任选地其中所述钾盐是氯化钾，进一步任选地其中所述KCl的浓度是0.2-5mM、或1-2.5mM、或约2mM。

22.权利要求1-21中的任一项的溶液，其中所述溶液包含

(a)约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖和约145mM NaCl，或

(b)约0.5-0.9mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖和约116-174mM NaCl，或

(c)约0.85％NaCl、约0.01％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.006％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.035％柠檬酸钠二水合物和约0.29％右旋糖，或

(d)约0.68-1.02％NaCl、约0.008-0.012％CaCl二水合物(氯化钙二水合物)、约0.0048-0.0072％MgCl六水合物(氯化镁六水合物)、约0.028-0.042％柠檬酸钠二水合物和约0.23-0.35％右旋糖。

23.权利要求1-22中的任一项的溶液，其中所述溶液还包含

(a)约2mM KCl，和/或

(b)粘弹性聚合物，任选地其中所述聚合物是透明质酸或其盐或溶剂化物，进一步任选地其中所述聚合物是透明质酸钠。

24.权利要求23的溶液，其中所述聚合物以有效地减少溶液中的细胞暴露于剪切应力的浓度存在，任选地其中所述聚合物的浓度是0.005-5％w/v或约0.05％w/v。

25.权利要求1-24中的任一项的溶液，其中所述溶液包含

(a)约0.7mM CaCl(氯化钙)、约0.3mM MgCl(氯化镁)、约2mM KCl、约1mM柠檬酸钠、约16mM右旋糖、约145mM NaCl和约0.05％透明质酸，或

(b)约0.5-0.8mM CaCl(氯化钙)、约0.2-.4mM MgCl(氯化镁)、约1.6-2.4mM KCl、约0.8-1.2mM柠檬酸钠、约13-19mM右旋糖、约116-174mM NaCl和约0.04-0.06％透明质酸。

26.权利要求1-25中的任一项的溶液，其中所述溶液不包含

(a)碳酸盐缓冲剂，和/或

(b)谷胱甘肽或谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，和/或

(c)两性离子有机缓冲剂。

27.权利要求1-26中的任一项的溶液，其中所述溶液可以

(a)在25℃储存至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月，而没有可测量的溶质沉淀和/或可测量的所述溶液支持在所述溶液中储存的细胞的存活和生存力的能力的损失，和/或

(b)在2-8℃储存至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少1周、至少2周、至少3周或至少1个月，而没有可测量的溶质沉淀和/或可测量的所述溶液支持在所述溶液中储存的细胞的存活和生存力的能力的损失。

28.权利要求1-27中的任一项的溶液，其中所述溶液是

(a)适合用于施用给受试者，适合用于施用给受试者的眼睛，和/或适合用于将细胞移植进受试者的眼睛，和/或

(b)基本上无热原的，和/或

(c)无菌的，和/或

(d)用于冲洗、细胞重构、细胞储存、细胞运送，和/或施用给受试者。

29.制品，其包含在权利要求1-28中的任一项的溶液中的细胞群体，任选地其中所述细胞群体

(a)适合用于移植进受试者，进一步任选地适合用于移植进受试者的眼睛，和/或

(b)包含RPE细胞，和/或

(c)包含感光细胞，和/或

(d)包含间充质细胞。

30.权利要求29的制品，其中将所述制品冷藏，任选地其中将所述制品在约2-8℃冷藏。

31.权利要求29或30的制品，其中在所述制品的储存过程中，所述制品支持所述细胞群体中的细胞的存活，且其中所述细胞群体中的至少70％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的，

任选地其中所述细胞群体中的至少80％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的，或

其中所述细胞群体中的至少90％的细胞在将所述制品在2-8℃储存48小时以后是活的。

32.权利要求29-31中的任一项的制品，其中在所述制品的储存过程中所述制品支持所述细胞群体的铺板效率的维持，且其中在将所述制品在2-8℃储存48小时以后所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少70％，其中所述原始铺板效率是所述细胞群体在储存阶段开始时的铺板效率，

任选地其中在将所述制品在2-8℃储存48小时以后所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少80％，或

其中所述细胞群体表现出它的原始铺板效率的至少90％。

33.权利要求29-32中的任一项的制品，其中所述制品是在

(a)储存容器内，和/或

(b)注射器内。

34.用于制备权利要求29-33中的任一项的制品的方法，其中所述方法包括使细胞群体与权利要求1-28中的任一项的溶液接触，任选地其中所述方法包括使冷冻保存的或沉淀的细胞群体与权利要求1-28中的任一项的溶液接触，从而重构所述细胞。

35.药物组合物，其包含权利要求1-28中的任一项的溶液或权利要求29-33中的任一项的制品，其中所述药物组合物适合用于施用给受试者。

36.方法，其包括将权利要求1-28中的任一项的溶液或权利要求29-33中的任一项的制品或权利要求35的药物组合物施用给有此需要的受试者，任选地其中所述方法包括将所述溶液或所述制品施用至所述受试者的眼睛，进一步任选地其中所述方法包括在将所述制品储存至少4、至少6、至少12、至少24、至少36或至少48小时以后将所述制品施用至所述受试者。

37.权利要求36的方法，其中所述受试者具有或被诊断出视网膜疾病，任选地其中所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇或Stargardt病。

38.权利要求37的方法，其中所述制品包含有效地改善所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状的大小的细胞群体，任选地其中所述方法还包括监测所述受试者中的视网膜疾病的至少一种症状。

39.方法，其包括

(a)使细胞群体与权利要求1-28中的任一项的溶液接触从而产生细胞制品，任选地进一步包括

(b)将(a)的细胞制品储存至少4、至少6、至少12、至少18、至少24、至少36、至少48、至少60或至少72小时，任选地进一步包括

(c)在(b)的储存阶段以后将(a)的细胞制品施用给受试者，任选地其中施用包括将所述细胞注射进受试者的眼睛。

40.权利要求39的方法，其中所述方法还包括

(i)在(b)的储存阶段以后确定(a)的细胞制品中的细胞生存力，和/或

(ii)在步骤(b)的储存阶段中冷藏(a)的细胞制品，任选地其中冷藏包括在2-8℃的温度储存所述细胞制品。

41.用于治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括

将有效量的权利要求29-33中的任一项的制品或权利要求35的药物组合物施用给具有视网膜疾病的受试者的眼睛，任选地其中所述视网膜疾病是视杆或视锥营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、利伯先天性黑矇或Stargardt病。

42.试剂盒，其包含

(a)权利要求1-28中的任一项的溶液；

(b)关于使细胞群体与(a)的溶液接触以产生细胞制品的说明书；和

(c)用于(b)的接触和/或用于储存(b)的细胞制品的容器，任选地其中(a)的溶液和所述容器适合于(b)的细胞制品用于移植给受试者的用途。