JP2022040140A - 臨床製剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】
本開示のいくつかの側面は、４８時間まで、またはより長い保存の間に、細胞および組織の生存能、再播種効率、および再増殖能をサポートする臨床用培地を提供する。
【解決手段】
本明細書において提供される臨床用培地は臨床の灌流にとってもまた有用である。細胞集団または組織と本明細書において提供される臨床用培地とを含む細胞または組織調製物もまた提供され、かかる調製物を生成する方法も同様である。本明細書において提供される臨床用培地ならびに細胞および組織の調製物を用いるための、例えばその必要がある対象に細胞または組織の有効量を投与するための方法もまた開示される。
【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、「CLINICAL FORMULATIONS」と題する２０１５年８月１８日出願の米国仮出願第６２／２０６，８２１号の米国特許法第１１９条（e）の下における利益を主張し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
移植のための細胞および組織の保存および輸送のために用いられる現行で利用可能な臨床用培地は、比較的短い期間（例えば、最高４～６時間）を超えると細胞生存能および機能をサポートせず、それらの短い保存時間の間でさえも、細胞および細胞機能の顕著な損失が通常観察される。加えて、重炭酸アニオンを含む現行の臨床用培地は加熱滅菌に耐えることができず、常温における保存の間でさえも高頻度に炭素塩沈殿を形成し、短い品質保持期限をもたらす。
多種多様な医療手術は、例えば術野の灌流、創傷消毒、術後癒着防止、および術野からの残骸除去のための臨床用溶液の使用に頼っている。細胞もしくは組織の埋植または移植においては、臨床用溶液は、細胞または組織を調製すること、調製後の対象への投与までの細胞または組織の保存のために、および投与の間に、例えば細胞または組織の注射の間に細胞または組織構造物を運搬するための培地として用いられる。臨床的観点では、例えば灌流、創傷消毒、注射などの間に細胞または組織と接触する溶液は、典型的には無菌であり、発熱物質を含まず、生理的ｐＨに緩衝化され、生理的オスモル濃度を示す。
傷つきやすい細胞または組織の外傷を防止するために、手術の間に使用するための現行で利用可能な手術用灌流溶液に関連する１つの問題は、重炭酸アニオンとの沈殿を形成し得る塩、例えば、薬学的賦形剤として典型的に用いられる、実質的に全てのカルシウムおよびマグネシウムのイオン性塩などと一緒になった、緩衝化剤としての重炭酸アニオンの使用である。炭酸塩の形成および爾後の沈殿は、重炭酸塩とカルシウムおよび／またはマグネシウムとを含有する溶液が加熱滅菌されるときに急速に起こることがあり、多くの場合には常温保存条件においてもまた経時的に起こる。
沈殿の問題に対する１つの可能な解決策は、２液型（two-part）キットとしての手術用灌流溶液の提供であり、このうち、一方の液は重炭酸塩緩衝剤を含有し、他方の液はカルシウムおよび／またはマグネシウム塩を含有する。液同士は、典型的には使用直前に一緒に混合されて単一の溶液を形成する。かかる２液型溶液の使用には、２つの別個の溶液を製造するという必要性、混合エラーのリスクを表す不便な混合ステップ、および混合された溶液の典型的には短い半減期を包含する、いくつかの短所が関係する。故に、１液型（one-part）灌流溶液が非常に望ましく、有利であろう。
１液型灌流溶液を作る試みもなされてきた。例えば、欧州特許出願ＥＰ１０６７９０７Ｂ１（Armitage）参照。かかる試みは、典型的には、上で論じられた炭酸塩沈殿問題を防止するために、通常はＨＥＰＥＳと呼ばれるＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）などの双性イオン有機緩衝剤の使用に頼ってきた。しかしながら、かかる１液型灌流溶液に用いられる双性イオン有機緩衝剤は、典型的には細胞または組織培養培地と適合せず、それゆえに細胞保存の間の沈殿形成の問題に対する幅広く適用可能な解決策を提供しない。
上に記されている沈殿を形成することおよび通常の細胞培養成分との不適合性の問題に加えて、一般的に用いられる手術用灌流溶液にはまた、蒸気滅菌に耐え得ない成分、例えばある種の炭水化物またはグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）の組み合わせも通常は含まれる。
以前に開発された１液型灌流溶液とは対照的に、本開示は、双性イオン有機緩衝剤の使用を必要としない１液型溶液を提供する。本発明の安定した灌流溶液は、現行の灌流溶液の沈殿および関連する短い品質保持期限の問題を解決する。本明細書において提供される溶液は、現行で利用可能な溶液のものと比較して大いに改善された品質保持期限を有する。
本明細書において提供される溶液は、灌流、（例えば、凍結保存もしくはペレット化された細胞の）細胞再構成、（例えば、運送もしくは移植のための製剤後の）細胞保存、輸送、および／または対象への細胞の投与（例えば、細胞埋植もしくは移植の観点において）にとって有用である。本明細書において提供される溶液は、異なる細胞種におよび異なる投与部位に関連して用いられ得る。眼科学の適用が好ましいが、他の適用もまた企図され、本開示によって包含される。
本開示のいくつかの側面は、細胞の再構成、保存、輸送、および／または対象への投与のための溶液を提供する。いくつかの態様において、溶液は、（ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤（buffer）；および（ｂ）少なくとも２ｍＭのグルコース；および（ｃ）溶液を生理的オスモル濃度に維持する浸透圧剤を含む。いくつかの態様において、溶液は２～１５０ｍＭのグルコース、例えば５～１５０ｍＭ、１０～１５０ｍＭ、１５～１５０ｍＭ、２～１００ｍＭ、２～５０ｍＭ、５～３０ｍＭ、１０～１００ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１０～３０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、１２～１８ｍＭ、１４～１７ｍＭ、１５～１７、または１６～１７ｍＭを含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、または少なくとも３０ｍＭのグルコースを含む。いくつかの態様において、グルコースはデキストロースからなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、または少なくとも３０ｍＭのデキストロースを含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも０．０３％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２８％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２９％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．３％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．３５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．４５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．６％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．６５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．７％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．８％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．９％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．１２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．７５％（ｗ／ｖ）、または少なくとも３％（ｗ／ｖ）グルコースを含む。いくつかの態様において、溶液はさらに二価カチオン源を含む。いくつかの態様において、二価カチオンはカルシウムおよび／またはマグネシウムカチオンを含む。いくつかの態様において、二価カチオン源はカルシウム源および／またはマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、溶液はカルシウム源を含む。いくつかの態様において、溶液はマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、緩衝剤は、酢酸塩緩衝剤（acetate buffer）および／またはクエン酸塩緩衝剤（citrate buffer）を含む。
本開示のいくつかの側面は、細胞の再構成、保存、輸送、および／または対象への投与のための溶液を提供し、溶液は、（ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤；および（ｂ）グルコース；および（ｃ）溶液を生理的オスモル濃度に維持する浸透圧剤；および（ｄ）二価カチオン源を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源はカルシウム源および／またはマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、緩衝剤は酢酸塩および／またはクエン酸塩緩衝剤を含む。
本願において提供される溶液のいくつかの態様において、グルコースはＤ－グルコース（デキストロース）である。いくつかの態様において、グルコースの濃度は５～５０ｍＭである。いくつかの態様において、グルコースの濃度は１０～２５ｍＭである。いくつかの態様において、グルコースの濃度は１０～２０ｍＭである。いくつかの態様において、グルコースの濃度は約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、または約２０ｍＭである。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、二価カチオン源は二価カチオンの薬学的に許容される塩を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源は薬学的に許容されるカルシウム塩を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源は薬学的に許容されるマグネシウム塩を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源は薬学的に許容されるカルシウムおよび／または薬学的に許容されるマグネシウム塩を含み、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、塩酸、マレイン酸、シュウ酸、リン酸、ステアリン酸、コハク酸、および硫酸を含む群から選択される酸と形成されるカルシウムおよび／またはマグネシウム塩の群から選択される。いくつかの態様において、二価カチオン源はカルシウム源を含む。いくつかの態様において、カルシウム源は塩化カルシウムを含む。いくつかの態様において、カルシウム源は塩化カルシウム二水和物を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源はマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、マグネシウム源は塩化マグネシウムを含む。いくつかの態様において、マグネシウム源は塩化マグネシウム六水和物を含む。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、カルシウム源の濃度は０．２５～０．７５ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は０．４～０．６５ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は０．５～０．６ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は約０．６ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は０．５～０．９ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は０．６～０．８ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は約０．７ｍＭである。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、マグネシウム源の濃度は０．０５～５ｍＭである。いくつかの態様において、マグネシウム源の濃度は０．１～０．３ｍＭである。いくつかの態様において、マグネシウム源の濃度は約０．３ｍＭである。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩緩衝剤はクエン酸または酢酸の塩の形態で提供される。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、クエン酸塩緩衝剤はクエン酸ナトリウムとして提供される。いくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩の濃度は０．１～５ｍＭである。いくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩の濃度は０．５～２ｍＭである。いくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩の濃度は約１ｍＭである。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液のｐＨは６．８～７．８である。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液のｐＨは７．２～７．６である。いくつかの態様において、溶液のｐＨは７．４～７．５である。いくつかの態様において、溶液のｐＨは約７．５である。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、浸透圧剤は塩である。いくつかの態様において、浸透圧剤はナトリウム塩である。いくつかの態様において、浸透圧剤は塩化ナトリウムである。いくつかの態様において、浸透圧剤の濃度は約１００～２５０ｍＭである。いくつかの態様において、浸透圧剤の濃度は約１２５～１７５ｍＭである。いくつかの態様において、浸透圧剤の濃度は約１５０ｍＭである。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は等張である。いくつかの態様において、溶液は高張である。いくつかの態様において、溶液は約２７０～３４５ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を示す。いくつかの態様において、溶液は約３００～３３０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を示す。いくつかの態様において、溶液のオスモル濃度は約３１５ｍＯｓｍ／ｌである。
いくつかの態様において、溶液はさらにカリウム塩を含む。いくつかの態様において、カリウム塩は塩化カリウムである。いくつかの態様において、ＫＣｌの濃度は０．２～５ｍＭである。いくつかの態様において、ＫＣｌの濃度は１～２．５ｍＭである。いくつかの態様において、ＫＣｌの濃度は約２ｍＭである。
いくつかの態様において、溶液はさらに粘弾性ポリマーを含む。いくつかの態様において、ポリマーは合成ポリマーである。いくつかの態様において、ポリマーは、溶液中の細胞の、剪断応力への暴露を低減するために有効な濃度で存在する。いくつかの態様において、ポリマーの濃度は０．００１～５％ｗ／ｖである。いくつかの態様において、ポリマーの濃度は約０．０５％ｗ／ｖである。いくつかの態様において、ポリマーはヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物である。いくつかの態様において、ポリマーはヒアルロン酸ナトリウムである。いくつかの態様において、ヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物はHealon Endocoat（登録商標）（Abbott）、Hyasis（登録商標）（Novozymes）、またはPro-Visc（登録商標）（Alcon）である。いくつかの態様において、ヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物の濃度は約０．００１％～０．０５％ｗ／ｖ、例えば０．０１％～０．０５％ｗ／ｖ、約０．０２％～０．０５％ｗ／ｖ、約０．０１％、約０，０２％、約０．０３％、約０，０４％、または約０，０５％ｗ／ｖである。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびグルコース、例えばＤ－グルコースを水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グルコース、例えばＤ－グルコース、および塩化カリウムを水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、および約１４５ｍＭのＮａＣｌを水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は約０．５～０．９ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約０．８～１．２ｍＭクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭデキストロース、および約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌを水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。
いくつかの態様において、溶液はさらに約２ｍＭのＫＣｌを含む。いくつかの態様において、溶液は約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約２ｍＭのＫＣｌを水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は約０．５～０．９ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約０．８～１．２ｍＭクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭデキストロース、約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌ、および約１．６～２．４ｍＭのＫＣｌを水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グルコース、例えばＤ－グルコース、および粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物を水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グルコース、例えばＤ－グルコース、塩化カリウム、および粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物を水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約１～５％ｗ／ｖの粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物を水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、約２ｍＭのＫＣｌ、および約０．０１～５％ｗ／ｖの粘弾性ポリマー、例えば約０．０１～０．０５％ｗ／ｖヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物を水溶液中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約２ｍＭのＫＣｌ、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０５％ヒアルロン酸を含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．５～０．８ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１．６～２．４ｍＭのＫＣｌ、約０．８～１．２ｍＭクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭデキストロース、約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０４～０．０６％ヒアルロン酸を含むかまたは本質的にそれらからなる。
いくつかの態様において、溶液は無菌である。いくつかの態様において、溶液は本質的に発熱物質を含まない。
いくつかの態様において、溶液は炭酸塩緩衝剤を含まない。いくつかの態様において、溶液はグルタチオンまたはグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）を含まない。いくつかの態様において、溶液は双性イオン有機緩衝剤を含まない。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間、２５℃において、溶質の測定可能な沈殿ならびに／または溶液中に保存された細胞の生残および生存能をサポートする溶液の能力の測定可能な損失なしに保存され得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間、２～８℃において、溶質の測定可能な沈殿ならびに／または溶液中に保存された細胞の生残および生存能をサポートする溶液の能力の測定可能な損失なしに保存され得る。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される溶液中に細胞の集団を含む調製物を提供する。いくつかの態様において、細胞の集団は対象への移植にとって好適である。いくつかの態様において、細胞の集団は対象の眼への移植にとって好適である。いくつかの態様において、細胞の集団はＲＰＥ細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は光受容体細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は間葉系細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は網膜神経節細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は網膜前駆細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は、造血幹もしくは前駆細胞、神経幹もしくは前駆細胞、神経細胞、アストロサイトもしくはアストロサイト前駆体、グリア細胞もしくはグリア細胞前駆体、および／または膵臓細胞を含む。いくつかの態様において、調製物は冷蔵される。いくつかの態様において、調製物は約２～８℃で冷蔵される。いくつかの態様において、調製物は、調製物の保存の間における細胞の集団中の細胞の生残をサポートする。いくつかの態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも７０％は、２～８℃における調製物の保存の２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、または１４４時間後に生存可能である。いくつかの態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも８０％は、２～８℃における調製物の保存の２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、または１４４時間後に生存可能である。いくつかの態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも９０％は、２～８℃における調製物の保存の２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、または１４４後に生存可能である。いくつかの態様において、調製物は、調製物の保存の間における細胞の集団の播種効率（plating efficiency）の維持をサポートする。いくつかの態様において、２～８℃における調製物の保存の２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、または１４４時間の後に、細胞の集団はその元の播種効率の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を示し、元の播種効率は、保存期間開始時における細胞の集団の播種効率を言う。いくつかの態様において、調製物は保存容器内に存在している。いくつかの態様において、調製物はシリンジ内に存在している。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される調製物、例えば本明細書において提供される溶液中の細胞の集団を含む調製物を調製するための方法を提供し、ここで、方法は、細胞の集団を溶液と接触させることを含む。いくつかの態様において、方法は、凍結保存またはペレット化された細胞の集団を溶液と接触させ、それゆえに細胞を再構成することを含む。
本開示のいくつかの側面は、対象への投与にとって好適な医薬組成物を提供し、ここで、医薬調製物は、本明細書において提供される溶液、または本明細書において提供される溶液中の細胞の集団を含む調製物を含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される溶液または調製物をその必要がある対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、方法は溶液または調製物を対象の眼に投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも１２、少なくとも２４、少なくとも３６、少なくとも２４、少なくとも４８、少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも９６、少なくとも１２０、または少なくとも１４４時間の調製物の保存後に、調製物を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、対象は網膜疾患を有するか、またはそれと診断される。いくつかの態様において、網膜疾患は、桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、網膜神経節細胞に関連する疾患、緑内障、またはシュタルガルト病である。いくつかの態様において、調製物は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために有効なサイズの細胞の集団を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、または間葉系幹細胞を含む。いくつかの態様において、方法は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることをさらに含む。
本開示のいくつかの側面は、（ａ）細胞の集団を本明細書において提供される溶液と接触させて、細胞調製物を生成することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ｂ）（ａ）の細胞調製物を少なくとも４、少なくとも６、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３６、少なくとも４８、少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも９６、少なくとも１２０、または少なくとも１４４時間保存することを含む。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ｃ）（ｂ）の保存期間後に（ａ）の細胞調製物を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、（ｃ）の投与は、細胞を対象の眼に注射することを含む。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ｂ）の保存期間後に（ａ）の細胞調製物の細胞生存能を決定することを含む。いくつかの態様において、方法は、ステップ（ｂ）の保存期間の間に（ａ）の細胞調製物を冷蔵することを含む。いくつかの態様において、冷蔵は、細胞調製物を２～８℃の温度で保存することを含む。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ａ）において生成された調製物を、調製物が生成された場所とは異なる場所に（ｂ）の保存期間内に輸送することを含む。いくつかの態様において、輸送は、調製物を、（ｃ）の投与が行われるクリニックまたは手術室に輸送することを含む。
本開示のいくつかの側面は、網膜疾患を処置するための方法を提供し、方法は、本明細書において提供される細胞調製物の有効量を、網膜疾患を有する対象の眼に投与することを含む。いくつかの態様において、対象は網膜疾患を有するか、またはそれと診断される。いくつかの態様において、網膜疾患は桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、病的近視、レーバー先天性黒内障、緑内障、またはシュタルガルト病である。いくつかの態様において、調製物は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために有効なサイズの細胞の集団を含む。いくつかの態様において、細胞の集団は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、網膜神経節、または間葉系幹細胞を含む。いくつかの態様において、方法は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることをさらに含む。
本開示のいくつかの側面は、キットであって、（ａ）本明細書において提供される溶液；および（ｂ）細胞集団を（ａ）の溶液と接触させて細胞調製物を生成するための説明書；および（ｃ）（ｂ）の接触のためのおよび／または（ｂ）の細胞調製物を保存するための容器を含む、前記キットを提供する。いくつかの態様において、（ａ）の溶液および（ｃ）の容器は、対象への移植のための（ｂ）の細胞調製物の使用にとって好適である。
上の概要は、本明細書において開示されるテクノロジーの態様、利点、特徴、および使用のいくつかを限定することなく説明することを意味している。本明細書において開示されるテクノロジーの他の態様、利点、特徴、および使用は、詳細な説明、図面、例、および特許請求の範囲から明らかである。
ＲＰＥ細胞は、培養におけるその後の播種および増殖能力の明らかな損失なしにHypoThermosol中に２４（４８時間ではなく）維持され得る。
GS2中におけるＲＰＥ安定性（２～８℃）。ＲＰＥ細胞は、生存細胞数または培養におけるその後の播種および増殖能力の明らかな損失なしにGS2中に少なくとも４８時間維持され得る。
GS2中におけるＲＰＥ安定性（２～８℃）。ＲＰＥ細胞は、生存細胞密度の有意な減少なしに、細胞生存能のわずかな損失のみで、GS2中に４～５日間維持され得る。
GS2中におけるＲＰＥ安定性（２～８℃）。ＲＰＥ細胞の培養における播種および増殖能力は、GS2低温保存において５日後に減少し始める。
GS2中におけるＲＰＥ安定性（２～８℃）。GS2は現行の注射システムと適合する。
トリプリケートチューブからの平均生存細胞密度±標準偏差を示している。ヒトＲＰＥ細胞密度は血球計算盤を用いて決定された。細胞生存能はトリパンブルー排出によって得られた。各条件について作られた細胞のトリプリケートチューブから平均値を計算し、各チューブの生存細胞濃度をトリプリケート計数から決定した。MedOneの＃３２３３カニューレからの細胞押出し後に観察された細胞数のパーセント変化（デルタ）が、各条件について値の各セットの上に示されている。
試験された各条件について６ウェルからのウェルあたりのヒトＲＰＥ細胞の平均数および標準偏差（±ＳＤ）が示されている。各条件について、ウェルあたり約２０，０００細胞をゼラチンコート９６ウェルプレートに播き、ＲＰＥ増殖培地（EGM2 Single Quotsを有するEBM-2、Stem Cell, Inc.）中で５％ＣＯ２、摂氏３７度の湿度コントロールされたインキュベータ内で３日間培養した。増殖３日後の細胞数を決定するために、細胞をトリプシン（Sigma）およびＨＥＰＥＳベースの剥離培地（Gibco）の１：１ミックスによって剥がした。ひとたび細胞を剥がしたら、１０％ウシ胎仔血清を含有する培地によってトリプシンを中和し、血球計算盤を用いて細胞を計数した。
ＭＳＣの保存のための異なる培地の比較。ヒト胚性幹細胞由来ＭＳＣを７０％コンフルエントまで増殖させ、０．０５％トリプシンによって収穫し、ａＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ（ＭＳＣ培地）中に再懸濁し、２００×ｇで５分間スピンダウンした。細胞ペレットを小容量のＭＳＣ培地中に再懸濁し、トリパンブルー排出を用いて生存能について計数した。次いで、５００万個のＭＳＣを４つのエッペンドルフチューブのそれぞれの中に置き、スピンダウンし、指示されている緩衝剤の各１ｍｌ中に再懸濁した。チューブは、４℃にセットされた低温室に、指示されている時間だけ置いた。ＣＳ：イヌ血清、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清。
ＭＳＣ生存能は、より高い密度でGS2中に保存されたときには向上するが、ＦＢＳの存在は２４時間のGS2中における生存能をほとんど向上させない。
ＭＳＣ生存能は、２６Ｇ針／シリンジ中に保存およびそれから排出されたときに保全される（４℃でGS2中）。
BSS-PlusもしくはGS2輸送培地単独（細胞なし）のいずれかで処理されたかまたは偽（sham）処理もしくは無処理を受けた動物の眼と比較した、BSS-PlusまたはGS2輸送培地中に懸濁されたＲＰＥ細胞のいずれかで処置された１６匹のラットの眼の群についての、処置後６０日における網膜電図（ＥＲＧ）。
詳細な説明
序論
多くの最新外科手術はより古い技術と比較して細胞および組織の損傷を最小化するが、ある種のデリケートな手術は、用いられる技術および材料によって非常に影響されやすいままである。例えば、眼科用外科手術、例えば白内障手術およびビトレクトミー手術には、（角膜内皮層などの）非常に脆い細胞および組織が関わり、従ってエラーに対する余裕はほとんどなく、かかる眼組織および患者の視覚を損なう大きな可能性を有する。加えて、細胞の移植には、多くの場合、例えば再生医療アプローチの観点では、不適切な取り扱いまたは非生理的条件に対する暴露によって損傷し得るかまたは再増殖能を失い得るデリケートなまたは脆い細胞を製剤、保存、輸送、および／または注射することが必要とされる。
本開示は、灌流、細胞の再構成、細胞保存、細胞輸送、および／または対象への細胞投与のための溶液を提供する。本明細書において提供される溶液は、灌流、細胞の再構成、製剤、保存、および／または移植のための現行で利用可能な溶液と比べていくつかの利点を有する。例えば、現行で利用可能な培地とは対照的に、本明細書において提供される溶液は、脆い細胞ならびに組織を包含する様々な種類の細胞ならびに組織の生残をサポートし、延長された保存期間の間でさえも、細胞および組織生存能、再播種効率（re-plating efficiency）、ならびに再増殖能の改善されたレベルを維持する。本明細書の他所により詳細に説明される通り、灌流または術前の細胞製剤のための現行で利用可能な培地は、（例えば、炭素塩の沈殿に基づく）短い半減期を有し、ならびに／または保存された細胞の生残、再播種効率、および再増殖能を長期間は（例えば、４～６時間よりも多くは）サポートしない。短い半減期ならびに比較的短い期間を超えての細胞生存能および機能のサポートの欠如ゆえに、現行で利用可能な培地の使用は、培地または細胞調製物が用いられる（例えば移植される）臨床現場に近接しての、例えばクリニックにおいて自前でまたは近接した実験室においてのいずれかでの、培地ならびに／またはそれぞれの培地中の細胞および組織の製剤を要する。従って、現行で利用可能な溶液は、製剤された細胞または組織の臨床使用を、細胞生存能、再播種効率、および／または再増殖能が許容される短いタイムスパン内での投与を可能にする適用に限定する。臨床現場に近接した製剤が要求されることにより、追加の出費、リスク、およびオフサイトプロセシングのさらなる限定が生じる。
対照的に、本明細書において提供される溶液は、現行で利用可能な溶液と比較して延長された品質保持期限を有し、ＲＰＥおよび光受容体細胞ならびに間葉系幹細胞などの脆い細胞を包含する様々な種類の細胞の細胞機能、生存能、再播種効率、ならびに再増殖能を、長い保存期間（例えば、２４時間まで、４８時間まで、またはより長い保存期間）の間でさえもまたサポートする。本明細書において提供される溶液はさらに生体適合性であり、それゆえに対象への投与にとって好適である。それゆえに、本明細書において提供される溶液中の製剤された細胞または組織は、培地置換の必要なしに対象に直接的に投与され得る。
本明細書において提供される溶液の向上した性質により、製剤の現場から遠く離れた臨床現場への製剤された溶液、細胞、および組織の輸送が可能となり、これによって、最終製品の集中的なプロセシングおよび製剤が可能になり、臨床現場に近接して製剤する必要性がなくなる。本明細書において提供される溶液の改善された保存および輸送能力は、さらに、最終製品の製剤の現場からより遠隔である臨床現場の使用を許し、臨床適用をスケジューリングする際の、例えば本明細書において提供される溶液中の製剤された細胞または組織の投与のための手術をスケジューリングする際のフレキシビリティーをもまた増大させる。保存のために拡大した時間枠は、さらに、臨床手術が開始する前の（例えば、手術チームが手術の準備を始める前のまたは対象が手術の準備をする前の）、製剤された製品の品質管理のための追加の機会（例えば、最終的な製剤された製品中の病原性汚染物質の存在の試験）を提供する。
臨床用溶液
本開示のいくつかの側面は、灌流のための、ならびに細胞および組織を製剤、保存、輸送、および投与するための臨床用溶液を提供する。
灌流および細胞製剤のために用いられる現行で利用可能な培地、例えば平衡塩溶液または生理食塩水とは対照的に、本記載の臨床用溶液は、傷つきやすい細胞または組織の延長された生残および機能をサポートし、調製および滅菌することが容易であり、延長された品質保持期限を有する。
リン酸緩衝生理食塩水または０．９％塩化ナトリウム溶液などの単一塩溶液は細胞の短期保存に用いられ得るが、それらの溶液はより長期の保存では細胞生存能または細胞機能を十分にはサポートせず、保存のごくわずかな期間の後でさえも、細胞生存能、再播種効率、および再増殖能について、顕著で多くの場合に許容されない減少をもたらす。
より手の込んだ平衡塩溶液が臨床灌流または細胞および組織保存などの臨床目的のために利用可能であり、それらは典型的にはオスモル濃度を維持するための薬剤、カルシウム源、マグネシウム源、および緩衝化剤（buffering agent）を含む。
塩化ナトリウムは溶液のオスモル濃度を維持するために通常用いられる。カルシウムイオンは、例えば角膜内皮において、細胞間ジャンクションを維持する役割を果たす。マグネシウムイオンはカルシウムイオンのように房水中に見いだされ、数多くの細胞プロセスに必須である。
重炭酸アニオンは緩衝化剤として典型的に用いられる。なぜなら、これらは多くの組織にとって生理的緩衝剤を代表し、他の溶質と広く適合性であるからである。しかしながら、カルシウムおよびマグネシウムのある種の形態は重炭酸塩と反応して炭酸カルシウムまたはマグネシウムを形成することがあり、これはある種の状況においては溶液から沈殿し得る。反応および沈殿は、重炭酸塩ならびにカルシウムおよび／またはマグネシウムを含有する溶液が加熱滅菌されるときに急速に起こることがあり、常温保存条件においては経時的に起こり得る。カルシウムまたはマグネシウムおよび重炭酸塩の間の反応は、薬学的賦形剤として典型的に用いられる実質的に全てのカルシウムおよびマグネシウムのイオン性塩で起こるようである。
沈殿を避けるための１つのアプローチは、重炭酸塩緩衝剤を用いる臨床用溶液を２つの別個のストック溶液として提供することであり、これらは適用の少し前に混合される。例えば、１つの広く用いられる臨床用培地はBSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液（Alcon Laboratories, Inc.）である。BSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液は２液型溶液である。液同士は手術の直前に一緒に混合されて単一の溶液を形成する。この混合ステップは、不便な場合があり、混雑した手術室において混合エラーのリスクを表す。加えて、２つの別個の溶液を製造することは１液型製剤を製造することよりも複雑でコストがかかる。故に、１液型臨床用溶液が非常に望ましく、有利であろう。
BSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液のＩ液は、注射のための水中に溶解した塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、および二塩基性リン酸ナトリウムを含有する。Ｉ液のｐＨは中性に近く、これは生理的流体に対して等張に近いオスモル濃度を有する。BSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液のＩＩ液は、注射のための水中に溶解した塩化カルシウム、塩化マグネシウム、デキストロース、およびグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）を含有する。ＩＩ液のｐＨは３および５の間に調整され、溶液は低張なオスモル濃度を有する。
再構成されたBSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液は中性のｐＨと等張であるオスモル濃度とを有する。ＩＩ液中のカルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンは、BSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液の２つの液が組み合わせられた場合には、Ｉ液中の重炭酸塩およびリン酸塩と反応して沈殿を形成するであろう。この反応は、組み合わせた溶液が蒸気滅菌される場合にはほぼ直ちに、室温ではよりゆっくり、典型的には数時間から数日の期間をかけて進む。この沈殿を防止するために、再構成されたBSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液のラベリングされた品質保持期限は６時間であり、その間に溶液は用いられなければならない。
性能において２液型BSS PLUS（登録商標）無菌眼内灌流溶液に匹敵する１液型臨床用溶液を作る試みがなされてきた。欧州特許出願ＥＰ１０６７９０７Ｂ１（Armitage）は、上で論じられた沈殿を防止するために、通常はＨＥＰＥＳと呼ばれるＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）などの双性イオン有機緩衝剤の使用を教示している。Armitageによって開示されている製剤は、オートクレーブされるかまたは生理的ｐＨ溶液に組み込まれるときに不安定であることが公知であるデキストロースおよびＧＳＳＧなどの成分を含有しない。Armitageによって開示されている製剤は、普通では組織培養培地中に存在する種類の成分、例えばアミノ酸をもまた含有しない。それゆえに、Armitageの教示は沈殿形成の問題の解決法を提供しない。
以前に開発された１液型溶液とは対照的に、本開示のいくつかの側面は、溶液を生理的ｐＨ範囲内に維持するためのＨＥＰＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＥＰＰＳ、およびＴＲＩＣＩＮＥなどの双性イオン有機緩衝剤の使用を必要としない１液型臨床用溶液を提供する。本発明の臨床用溶液は短い品質保持期限の問題を解決する。本明細書において提供される臨床用溶液は現行で利用可能な臨床用培地と比較して大いに改善された品質保持期限を有し、２４、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、または１６８時間以上の長期保存後でさえも細胞の生存能、再播種効率、および再増殖能をサポートする。
本明細書において用いられる用語「溶液」は、主溶媒としての水と溶液中に溶解した１つ以上の溶質、例えば緩衝化剤、浸透圧剤、グルコース、塩、ポリマーなどとを含む水性媒体を言う。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は臨床使用のためであり、それゆえに非毒性で、本質的に発熱物質を含まず、ならびに無菌である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は、生理的ｐＨと、生理的オスモル濃度ともまた言われる生理的浸透圧とを示す。生理的ｐＨは、細胞毒性ではなくかつ溶液が投与される細胞または組織のｐＨに似ているか、あるいは溶液中の製剤された細胞または組織がその天然環境において遭遇するｐＨを言う。大部分の細胞および組織にとって、生理的ｐＨは約６．８～７．８のｐＨ、例えば７～７．７のｐＨ、７．２～７．６のｐＨ、７．２～７．４のｐＨ、または７．４～７．５のｐＨである。従って、いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、または約７．８のｐＨを示す。生理的浸透圧は、細胞毒性ではなくかつ溶液が投与される細胞または組織の浸透圧に似ているか、または溶液中の製剤された細胞または組織がその天然環境において遭遇する浸透圧を言う。大部分の細胞および組織にとって、生理的浸透圧は約２７０～３４５ｍＯｓｍ／ｌ、例えば２８０～３３０ｍＯｓｍ／ｌ、２９０～３２５ｍＯｓｍ／ｌ、３００～３１５ｍＯｓｍ／ｌである。いくつかの態様において、生理的浸透圧は約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約３２０、または約３２５ｍＯｓｍ／ｌである。
溶液の用語「浸透圧」または「オスモル濃度」は、一方の純粋な溶媒と他方の溶液とを分離する半透膜の向こう側の溶液中への溶媒の流れを止めるために要求される圧力であり、半透膜は溶媒分子にとっては透過性であるが溶質分子にとっては非透過性である。溶液の浸透圧は溶液中の溶質粒子のモル濃度に比例し、ｍＯｓｍ／ｌまたはｍＯｓｍ／ｋｇで測定される。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は、約２９０ｍＯｓｍ／ｌおよび約３２０ｍＯｓｍ／ｌの間、または約３００ｍＯｓｍ／ｌおよび３１０ｍＯｓｍ／ｌもしくは約３０５ｍＯｓｍ／ｌの間のオスモル濃度を示す。いくつかの態様において、溶液は約３００～３３０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を見せる。いくつかの態様において、溶液のオスモル濃度は約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約３２０、または約３２５ｍＯｓｍ／ｌである。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液のオスモル濃度はその張度の観点から参照され、高張溶液は細胞が収縮することを引き起こす溶液であり、低張溶液は細胞が膨張することを引き起こす溶液であり、等張溶液は細胞体積の変化を生じない。用語「高張」、「低張」、および「等張」は、典型的には、溶液が接触をさせられる細胞、細胞集団、または組織に関して用いられる。例えば、灌流溶液が提供される態様において、等張性は、灌流の間に溶液と接触することになる細胞または組織の体積の変化を引き起こさない浸透圧を言う。同様に、溶液が細胞、細胞集団、または組織を臨床使用のために、例えば対象への移植のために、製剤するために用いられる態様において、等張性は、溶液中に製剤されたときに細胞、細胞集団の細胞、または組織の細胞の体積の変化を引き起こさない浸透圧を言う。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は等張である。いくつかの態様において、溶液は高張である。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、浸透圧剤は塩である。いくつかの態様において、塩は薬学的に許容される塩である。いくつかの態様において、浸透圧剤はナトリウム塩である。いくつかの態様において、浸透圧剤は塩化ナトリウムである。いくつかの態様において、浸透圧剤の濃度は約１００～２００ｍＭ、１２５～１７５ｍＭ、または１４０～１６０ｍＭである。いくつかの態様において、浸透圧剤の濃度は約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、または約２００ｍＭである。
本明細書において用いられる用語「生理的オスモル濃度」は、細胞毒性ではなく（例えば、所与の細胞もしくは細胞種が破裂することを引き起こさず、または別様に細胞の損傷を引き起こさず）かつ溶液が投与される組織の浸透圧に似ているか、あるいは溶液中の製剤された細胞または組織がその天然環境において遭遇する浸透圧を言う。大部分の適用の生理的オスモル濃度の範囲は約２８０ｍＯｓｍ／ｌおよび約３２５ｍＯｓｍ／ｌの間、約２９０ｍＯｓｍ／ｌおよび約３２０ｍＯｓｍ／ｌの間、または約３００ｍＯｓｍ／ｌおよび３１０ｍＯｓｍ／ｌの間、または約３０５ｍＯｓｍ／ｌである。
いくつかの態様において、本明細書において提供される細胞の再構成、保存、輸送、および／または対象への投与のための溶液は、（ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤；および（ｂ）少なくとも２ｍＭのグルコース；および（ｃ）溶液を生理的オスモル濃度に維持する浸透圧剤を含む。いくつかの態様において、溶液はさらに二価カチオン源を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源はカルシウム源および／またはマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、溶液はカルシウム源を含む。いくつかの態様において、溶液はさらにマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、緩衝剤は酢酸塩緩衝剤および／またはクエン酸塩緩衝剤を含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭのグルコースを含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭのデキストロースを含む。いくつかの態様において、溶液は３ｍＭ以下、４ｍＭ以下、５ｍＭ以下、６ｍＭ以下、７ｍＭ以下、７．５ｍＭ以下、８ｍＭ以下、９ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１７ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下のグルコースを含む。いくつかの態様において、溶液は０．５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、２ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、４ｍＭ以下、５ｍＭ以下、６ｍＭ以下、７ｍＭ以下、７．５ｍＭ以下、８ｍＭ以下、９ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下のデキストロースを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される細胞の再構成、保存、輸送、および／または対象への投与のための溶液は、（ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤；および（ｂ）グルコース；および（ｃ）溶液を生理的オスモル濃度に維持する浸透圧剤；および（ｄ）カルシウム源；および（ｅ）マグネシウム源を含む。いくつかの態様において、緩衝剤は酢酸塩および／またはクエン酸塩緩衝剤を含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭのグルコースを含む。いくつかの態様において、溶液は少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭのデキストロースを含む。いくつかの態様において、溶液は０．５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、２ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、４ｍＭ以下、５ｍＭ以下、６ｍＭ以下、７ｍＭ以下、７．５ｍＭ以下、８ｍＭ以下、９ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１７ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下のグルコースを含む。いくつかの態様において、溶液は０．５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、２ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、４ｍＭ以下、５ｍＭ以下、６ｍＭ以下、７ｍＭ以下、７．５ｍＭ以下、８ｍＭ以下、９ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１７ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下のデキストロースを含む。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、グルコースのまたはデキストロースの濃度は０．５～１５０ｍＭ、０．５～５０ｍＭ、２．５～５０ｍＭ、５～５０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、０．５～２５ｍＭ、２．５～２５ｍＭ、５～２５ｍＭ、１０～２５ｍＭ、または１０～２０ｍＭである。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、グルコースのまたはデキストロースの濃度は約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２．５ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、または約５０ｍＭである。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は二価カチオン源を含む。好適な二価カチオンは、限定なしに、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、およびＳｒ２＋を包含する。いくつかの態様において、二価カチオン源はカルシウム源を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源はマグネシウム源を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源は、２つ以上の異なる二価カチオン源、例えばカルシウム源およびマグネシウム源を含む。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は、カルシウム源、例えばカルシウムイオン源を含む。いくつかの態様において、カルシウム源は薬学的に許容されるカルシウム塩を含む。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は、マグネシウム源、例えばマグネシウムイオン源を含む。いくつかの態様においてマグネシウム源は薬学的に許容されるマグネシウム塩を含む。
本明細書において用いられる用語「薬学的に許容される塩」は、ヒト対象への投与にとって好適であると見なされる塩を言う。いくつかの態様において、薬学的に許容される塩は、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、塩酸、マレイン酸、シュウ酸、リン酸、ステアリン酸、コハク酸、および硫酸を含む群から選択される酸と形成される塩である。いくつかの態様において、薬学的に許容される二価カチオン源は、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、塩酸、マレイン酸、シュウ酸、リン酸、ステアリン酸、コハク酸、および硫酸を含む群から選択される酸と形成されるカルシウムおよび／またはマグネシウム塩の群から選択される。例えば、この群の態様の薬学的に許容されるカルシウム塩は、酢酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、塩化カルシウム、マレイン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、コハク酸カルシウム、および硫酸カルシウムを包含するであろう。溶液が２つ以上の薬学的に許容される塩（例えばカルシウム、マグネシウム、およびカリウム塩）を含む態様において、いくつかまたは全ての塩が同じ酸と形成され得るか（例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウム）、または２つ以上の塩が異なる酸と形成され得る（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、および酢酸カリウム、塩化カルシウム、クエン酸マグネシウム、およびマレイン酸カリウムなど）ということは当業者には明らかであろう。
いくつかの態様において、薬学的に許容される塩、例えば薬学的に許容されるカルシウムまたはマグネシウム塩は、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、２，２－ジクロロ酢酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－オキソグルタル酸、４－アセトアミド安息香酸、４－アミノサリチル酸、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｌ）、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファー酸（＋）、１０－カンファースルホン酸（＋）、カプリン酸（デカン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸（Ｄ）、グルコン酸（Ｄ）、グルクロン酸（Ｄ）、グルタミン酸、グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イソ酪酸、乳酸（ＤＬ）、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸（－Ｌ）、マロン酸、マンデル酸（ＤＬ）、メタンスルホン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸（－Ｌ）、サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸（＋Ｌ）、チオシアン酸、トルエンスルホン酸（ｐ）、およびウンデシレン酸からなる群から選択される酸の塩である。追加の好適な薬学的に許容される塩は当業者には明らかであり、本開示がこの点で限定されないということは理解されるであろう。
いくつかの態様において、二価カチオン源は０．１～２０ｍＭの、例えば約０．５～１０ｍＭ、０．５～５ｍＭ、１～１０ｍＭ、または２～１０ｍＭの二価カチオンの合計濃度を含む。いくつかの態様において、二価カチオン源の濃度は約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭである。いくつかの態様において、二価カチオン源はカルシウムおよび／またはマグネシウム源を含む。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、カルシウム源は塩化カルシウムを含む。いくつかの態様において、カルシウム源は塩化カルシウム二水和物を含む。いくつかの態様において、マグネシウム源は塩化マグネシウムを含む。いくつかの態様において、マグネシウム源は塩化マグネシウム六水和物を含む。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、カルシウム源の濃度は０．１～１．２ｍＭ、０．２５～０．７５ｍＭ、０．４～０．６５ｍＭ、または０．５～０．７ｍＭである。いくつかの態様において、カルシウム源の濃度は約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約１．１ｍＭ、または約１．２ｍＭである。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、マグネシウム源の濃度は０．０５～５ｍＭ、０．１～０．５ｍＭ、０．２５～２．５ｍＭ、０．１～１ｍＭ、または０．１～０．３ｍＭである。いくつかの態様において、マグネシウム源の濃度は約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭである。
本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は緩衝化剤を含む。本明細書において用語「緩衝剤」と交換可能に用いられる用語「緩衝化剤」は、加えられる酸または塩基を中和することによって溶液のｐＨを比較的安定に維持し得る薬剤を言う。典型的には、緩衝剤は、弱い共役酸－塩基対、すなわち弱酸およびその共役塩基または弱塩基およびその共役酸のいずれかを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液中に含まれる緩衝剤はクエン酸塩または酢酸塩緩衝剤であり、例えばクエン酸または酢酸の塩の形態で提供される。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、クエン酸塩緩衝剤はクエン酸ナトリウムとして提供される。いくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩の濃度は０．１～５ｍＭである。いくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩の濃度は０．５～２ｍＭである。いくつかの態様において、クエン酸塩または酢酸塩の濃度は約０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭである。
いくつかの態様において、溶液はさらにカリウム塩、好ましくは薬学的に許容されるカリウム塩を含む。いくつかの態様において、カリウム塩は塩化カリウムである。いくつかの態様において、ＫＣｌの濃度は０．２～５ｍＭまたは１～２．５ｍＭである。いくつかの態様において、ＫＣｌの濃度は約０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、または５ｍＭである。
いくつかの態様において、溶液はさらに粘弾性ポリマーを含む。理論によって拘束されようとするものではないが、粘弾性ポリマーの添加は、細胞および組織を剪断応力から保護することによって、本明細書において提供される溶液中における保存後のおよび／または例えばカニュレーションを含む投与経路による対象への投与後の、細胞および組織生存能、再播種効率、ならびに再増殖能を向上させると考えられる。粘弾性ポリマーは当業者に周知であり、例示的な好適な粘弾性ポリマーは、ヒアルロン酸（例えば、Healon Endocoat（登録商標）（Abbott）、Hyasis（登録商標）（Novozymes）、およびPro-Visc（登録商標）（Alcon））、アルギン酸塩（アルギン酸ナトリウムを包含する）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としてもまた公知のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ヒドロキシルエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ（Ｎ－ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ＰＨＥＡ）、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、ポリメタクリル酸（カルボマー）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、およびトリブロックコポリマー、例えばポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）、ポロキサマーＰ１０８（プルロニック（登録商標）Ｆ３８）、ポロキサマーＰ１８４（プルロニック（登録商標）Ｌ６４）、ポロキサマーＰ４０１、ポロキサマーＰ４０２、ポロキサマーＰ４０７（プルロニック（登録商標）Ｆ１２７）、およびポロキサマーＰ４０８（プルロニック（登録商標）Ｆ１０８）、ヒドロキシルプロピルグアーポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー）、またはそれらの塩もしくは混合物を包含するが、これに限定されず、ヒアルロン酸およびアルギン酸の混合物またはその塩を包含する（が、これに限定されない）。いくつかの態様において、ポリマーは非イオン性ポリマーである。ある種の態様において、ポリマーはポリエーテルである。ある種の態様において、ポリマーはポリアルキルエーテルである。ある種の態様において、ポリマーはポリアルキルエーテルおよび別のポリマー（例えばポリアルキルエーテル）のコポリマーである。いくつかの態様において、ポリマーはポロキサマーである（poloxymerとしてもまた公知）。Poloxymerは非イオン性トリブロックコポリマーであり、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としてもまた公知）の２つの親水性鎖によってはさまれたポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）（ポリプロピレングリコールとしてもまた公知）の中心的な疎水性鎖から構成される。当業者は、本開示に基づいて、本明細書において提供される溶液への使用のための追加の好適な粘弾性ポリマーに気付くであろう。本開示がこの点で限定されないということは理解されるであろう。当業者は、本明細書において提供される溶液および調製物への使用にとって好適な粘弾性ポリマーの量が、ポリマーの粘弾性特性に、例えばとりわけ用いられるポリマーの分子量に依存するであろうということを理解するであろう。いくつかの態様において、粘弾性ポリマーは本明細書において提供される溶液および調製物中において０．００１％ｗ／ｖ～５％ｗ／ｖの濃度で用いられる。いくつかの態様において、粘弾性ポリマーは、０．０１％～０．０５％ヒアルロン酸を含む同じ溶液または調製物の粘度に、例えば０．０１％～０．０５％のHealon Endocoat（登録商標）を含む同じ溶液または調製物が示す粘度に対応する、本明細書において提供される溶液または調製物の粘度を提供する濃度で用いられる。
ある種の態様において、粘弾性ポリマーを含有する輸送培地は１，０００、１０，０００、５０，０００、またはさらには１００，０００Ｐａｓよりも大きいゼロ剪断粘度を有し、好ましくは１，０００から２００，０００Ｐａｓの範囲の、より好ましくは１，０００から２０，０００Ｐａｓの範囲のゼロ剪断粘度を有する。ある種の態様において、粘弾性ポリマーは、得られる輸送培地のゼロ剪断粘度を、粘弾性ポリマーなしの輸送培地に対して５％、１０％、１５％、２５％、またはさらには４０％増大させる。
溶液が、例えば溶液中の細胞または組織を含む調製物の形態で対象に投与される態様において、本発明に利用されるポリマーは生体適合性および／または生分解性である。
いくつかの態様において、ポリマーはヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物である。いくつかの態様において、ポリマーはヒアルロン酸ナトリウムである。いくつかの態様において、ポリマーは、剪断応力に対する溶液中の細胞の暴露を低減するために有効な濃度で存在する。いくつかの態様において、ポリマーの濃度は０．０１～５％ｗ／ｖである。いくつかの態様において、ポリマーの濃度は約０．０１％～０．０５％ｗ／ｖである。いくつかの態様において、ポリマーはHealon Endocoat（登録商標）である。
いくつかの態様において、溶液は炭酸塩緩衝剤を含まない。いくつかの態様において、溶液はグルタチオンまたはグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）を含まない。いくつかの態様において、溶液は双性イオン有機緩衝剤を含まない。
本開示は、基準（例えば、ｐＨ、オスモル濃度、溶質（緩衝剤、グルコース、浸透圧剤、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ポリマー）、濃度など）の２つ以上またはいずれかの数を組み合わせた溶液を包含する。例えば、本開示は、加えられるポリマーありまたはなしで、緩衝剤、グルコース、および浸透圧剤を含む溶液、カリウムを含む溶液、ならびにカリウムを含まない溶液、ならびにそれぞれの溶質について提供されているあらゆる濃度での溶質のあらゆる組み合わせを含む溶液を包含する。本開示が、列記された溶質を含む溶液、および列記された溶質と溶媒、例えば水とから本質的になるかまたはそれらからなる溶液を包含するということもまた理解されるであろう。簡潔の目的のために、それらの代替はここでは書き出さない。
例えば、本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびグルコース、例えばＤ－グルコースを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グルコース、例えばＤ－グルコース、および塩化カリウムを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．０３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、および約１４５ｍＭのＮａＣｌを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液はさらに約２ｍＭのＫＣｌを含む。いくつかの態様において、溶液は、約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．０３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約２ｍＭのＫＣｌを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約２ｍＭのＫＣｌを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液はさらに粘弾性ポリマーを含む。いくつかの態様において、ポリマーはヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物である。いくつかの態様において、ポリマーはヒアルロン酸ナトリウムである。いくつかの態様において、ポリマーは、剪断応力に対する溶液中の細胞の暴露を低減するために有効な濃度で存在する。いくつかの態様において、ポリマーの濃度は０．０１～５％ｗ／ｖである。いくつかの態様において、ポリマーの濃度は約０．０１～０．０５％ｗ／ｖである。本明細書において提供される溶液のいくつかの態様において、溶液は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グルコース、例えばＤ－グルコース、および粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物を水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グルコース、例えばＤ－グルコース、塩化カリウム、および粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物を水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．０３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物の約０．００５～５％ｗ／ｖを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．０３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、約２ｍＭのＫＣｌ、および粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物の約０．００５～５％ｗ／ｖを水中に含むかまたは本質的にそれらからなる。いくつかの態様において、溶液は、約０．８５％ＮａＣｌ、約０．０１５％ＫＣｌ、約０．０１％ＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００６％ＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０３５％クエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２９％デキストロースを水中に含むかまたは本質的にそれらからなり、任意に、粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物の約０．０１～５％ｗ／ｖ、例えば、例えば０．０１～０．０５％Healon Endocoat（登録商標）を含む。いくつかの態様において、溶液は、約０．６８～１．０２％ＮａＣｌ、約０．００８～０．０１２％ＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００４８～０．００７２％ＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０２８～０．０４２％クエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２３～０．３５％デキストロースを水中に含むかまたは本質的にそれらからなり、任意に、粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物の約０．０１～５％ｗ／ｖ、例えば、例えば０．０１～０．０５％Healon Endocoat（登録商標）を含む。いくつかの態様において、溶液は、約０．６８～１．０２％ＮａＣｌ、約０．０１２～０．０１８％ＫＣｌ、約０．００８～０．０１２％ＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００４８～０．００７２％ＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０２８～０．０４２％クエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２３～０．３５％デキストロースを水中に含むかまたは本質的にそれらからなり、任意に、粘弾性ポリマー、例えばヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物の約０．０１～５％ｗ／ｖ、例えば、例えば０．０１～０．０５％Healon Endocoat（登録商標）を含む。
細胞および組織調製物
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される溶液中の細胞の集団または組織を含む調製物を提供する。いくつかの態様において、細胞の集団は対象への移植にとって好適である。いくつかの態様において、本明細書において提供される調製物は、対象への投与のために、例えば注射または灌流による投与のために製剤される。本明細書において提供される調製物は、本明細書に記載される溶液、例えばGS2中の細胞の集団または組織を、単独で、または１つ以上の追加の化合物もしくは薬剤、例えば抗酸化剤、静菌剤、もしくは薬学的活性剤との組み合わせで含み得る。例示的な医薬調製物は、本開示の例１に記載されるGS2中の細胞または組織を含む。
本明細書において提供される溶液中の例示的な細胞または組織調製物は、ヒト患者を処置することへの使用にとって好適である、例えば発熱物質を含まないかまたは本質的に発熱物質を含まない、病原体を含まない、無菌、ならびに生理的ｐＨおよびオスモル濃度であるように製剤され得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される調製物は、具体的な部位への、例えば網膜疾患または障害を処置するための眼科用調製物の場合においては網膜または脈絡膜損傷の部位への送達のための硝子体液への、注射のために製剤される。
本開示によって提供される調製物は、さらに治療薬剤、例えば免疫抑制剤、血管新生促進剤、または調製物中の細胞の生残および／もしくは定着をサポートする栄養もしくは成長因子を包含し得る。
調製物の体積および調製物中の細胞の数は具体的な適用に依存するであろう。典型的には、細胞移植適用のためには、投与される体積を可能な限り減らすことが望ましい。従って、調製物は、最小化された体積が送達され得るように製剤され得る。注射のための細胞濃度は、有効で非毒性であるいずれの量であってもよい。例えば、いくつかの態様においては、移植のための細胞の調製物が提供され、これは本明細書において提供される溶液中、例えばGS2中に少なくとも約１０４細胞／ｍｌを含む。いくつかの態様において、移植のための細胞調製物は、少なくとも約１０３、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、または少なくとも約１０１０細胞／ｍｌの用量で製剤される。
いくつかの態様において、本明細書において提供される調製物中の細胞の数および／または細胞の濃度は、生存細胞を計数し、非生存細胞を除外することによって決定され得る。例えば、非生存細胞は、（トリパンブルーなどの）生体染色色素を排出できないことによって、または（培養基質への接着能、ファゴサイトーシスなどの）機能的アッセイを用いて検出され得る。加えて、所望の細胞種の細胞の数または細胞の濃度は、その細胞種に特徴的な１つ以上の細胞マーカーを発現する細胞を計数すること、および／または所望の細胞種以外の細胞種の指標である１つ以上のマーカーを発現する細胞を除外することによって決定され得る。
いくつかの態様においては、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、または９，０００細胞を含む細胞調製物が本明細書において提供される。いくつかの態様において、細胞調製物は少なくとも約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０細胞を含み得る。いくつかの態様において、細胞調製物は少なくとも約１×１０２～１×１０３、１×１０２～１×１０４、１×１０４～１×１０５、または１×１０３～１×１０６細胞を含み得る。いくつかの態様において、細胞調製物は少なくとも約１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、または２００，０００細胞を含んでもよく、例えば、細胞調製物は、少なくとも約２０，０００～２００，０００細胞を、本明細書において提供される溶液の、例えばGS2の約５０～２００μｌの体積中に含み得る。
いくつかの態様において、細胞の集団は対象の眼への移植にとって好適である。いくつかの態様において、対象の眼への移植にとって好適な細胞の集団は、ＲＰＥ細胞、ＲＰＥ前駆細胞、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞、および他の視覚に関連する神経細胞、例えば介在ニューロン（例えば、内顆粒層（ＩＮＬ）の「リレー」ニューロン）およびアマクリン細胞、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞、神経細胞、光受容体細胞、ならびに例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの間葉系細胞を含む。
いくつかの態様において、提供される調製物は、本明細書において提供される溶液中に、例えば例１に記載されているGS2培地中に、ＲＰＥ細胞の集団を含む。好適なＲＰＥ細胞は、ヒト胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から分化させることができ、胚性幹細胞、成体由来ＲＰＥ細胞、および胎児由来ＲＰＥ細胞とは分子的に別異のものであり得る。いくつかの態様においては、成体由来ＲＰＥ細胞および胎児由来ＲＰＥ細胞が用いられる。
いくつかの態様において、ＥＳ細胞由来ＲＰＥ細胞が用いられる場合、調製物は、検出可能な量の残存ＥＳ細胞を含まず、その結果、本明細書において提供される調製物は、ＲＰＥ細胞培養物および調製物中における汚染の許容できないリスクをもたらさない。
いくつかの態様において、対象の眼への移植にとって好適な細胞の集団を含む調製物は、対象の眼への注射にとって好適である。いくつかの態様において、かかる調製物は、網膜剥離、網膜異形成、網膜色素線条症、近視性黄斑変性、もしくは網膜萎縮を包含するが、これに限定されない、または例えばコロイデレミア、糖尿病性網膜症、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、網膜色素変性症、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などの光受容体損傷および失明をもたらす数多くの視覚に変化をきたす疾病に関連する、網膜変性疾患または障害を処置するために用いることができる。
ＲＰＥ細胞は、非ＲＰＥ細胞種に脱分化しない安定な終末分化したＲＰＥ細胞であり得る。本明細書に記載されるＲＰＥ細胞は、ヒトまたは非ヒト動物への角膜、網膜下、または他の投与によって網膜と一体化する能力を特徴とする機能的なＲＰＥ細胞であり得る。
ＲＰＥ細胞はＲＰＥ細胞マーカーを発現し得る。例えば、ＲＰＥ６５、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、チロシナーゼ、ベストロフィン、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、Ｏｔｘ２、および／またはＭＩＴＦなどのマーカーの発現のレベルは、天然に存在するＲＰＥ細胞のものと同等であり得る。ＲＰＥ細胞の成熟度のレベルは、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、およびチロシナーゼの少なくとも１つの発現、またはそれらのそれぞれの発現レベルを測定することによって評価され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載される本明細書において提供される調製物中に含まれるＲＰＥ細胞は、細胞の色素沈着度に基づいて同定および特徴付けされ得る。色素の変化は、ＲＰＥ細胞が培養および維持される密度と、ＲＰＥが培養中に維持される持続期間とによってコントロールされ得る。急速に分裂している分化したＲＰＥ細胞はより軽度に色素沈着している。対照的に、よりゆっくり分裂しているかまたは分裂していないＲＰＥは、それらの特徴的な多角形または六角形形状をとり、メラニンおよびリポフスチンを蓄積することによって色素沈着レベルを増大させる。例えば、（例えば、コンフルエントであるために）静止期にあるＲＰＥ培養物は、典型的には経時的に色素沈着のそれらのレベルを増大させる。そのため、色素沈着の蓄積はＲＰＥ分化の指標としての役割を果たし、細胞密度に関連する増大した色素沈着はＲＰＥ成熟度の指標としての役割を果たす。例えば、成熟ＲＰＥ細胞は、色素沈着が減少するように、より低い密度で継代培養され得る。この観点から、成熟ＲＰＥ細胞は、より未成熟のＲＰＥ細胞を生ずるように培養され得る。かかるＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ分化のマーカーを発現するさらに分化したＲＰＥ細胞である。
例えば、いくつかの態様においては、ＲＰＥ細胞を含む調製物が提供され、その平均メラニン含量は８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、または５ｐｇ／細胞未満、例えば０．１～８ｐｇ／細胞の間、０．１～７ｐｇ／細胞の間、０．１～６ｐｇ／細胞の間、０．１～５ｐｇ／細胞の間、０．１～４ｐｇ／細胞の間、０．１～３ｐｇ／細胞の間、０．１～２ｐｇ／細胞の間、０．１～１ｐｇ／細胞の間、１～８ｐｇ／細胞の間、１～７ｐｇ／細胞の間、１～６ｐｇ／細胞の間、１～５ｐｇ／細胞の間、１～４ｐｇ／細胞の間、１～３ｐｇ／細胞の間、１～２ｐｇ／細胞の間、２～６ｐｇ／細胞の間、３～５ｐｇ／細胞の間、または４～５ｐｇ／細胞の間、例えば４．２～４．８ｐｇ／細胞など、または０．１～５ｐｇ／細胞の間である。さらなる例において、平均メラニン含量は５ｐｇ／細胞未満、例えば０．１～５ｐｇ／細胞の間、０．２～５ｐｇ／細胞の間、０．５～５ｐｇ／細胞、１～５ｐｇ／細胞、２～５ｐｇ／細胞、３～５ｐｇ／細胞、４～５ｐｇ／細胞、または４．５～５ｐｇ／細胞であり得る。
いくつかの態様においては、本明細書に記載される溶液、例えばGS2中のＲＰＥ細胞を含む調製物が提供され、ここで、ＲＰＥ細胞は、対象へのＲＰＥ細胞の移植後に、例えば対象の眼への調製物の注射後にそれらの表現型を維持する。ＲＰＥ細胞は、移植後のレシピエントの寿命までそれらの表現型を維持し得る。例えば、ＲＰＥ細胞は、移植後にそれらの表現型を少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間維持し得る。さらに、ＲＰＥ細胞は、移植後にそれらの表現型を少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間維持し得る。ＲＰＥ細胞は、移植後にそれらの表現型を少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月間維持し得る。ＲＰＥ細胞は、移植後にそれらの表現型を少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０年以上の間、維持し得る。
いくつかの態様において、本開示は、対象の眼への注射のための本明細書において提供される溶液中のＲＰＥ細胞の調製物を提供する。かかる態様において、調製物は眼内注射のための薬学的に許容される眼科用製剤である。調製物を硝子体内注射によって投与するときに、例えば、調製物は、最小化された体積が送達され得るように製剤され得る。注射のための濃度は、有効で非毒性であるいずれかの量であり得る。患者の処置のためのＲＰＥ細胞の調製物は、少なくとも約１０４細胞／ｍｌ（本明細書において提供される溶液）のの用量で製剤され得る。患者の処置のためのＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個のＲＰＥ細胞／ｍＬの用量で製剤される。
本明細書に記載されるＲＰＥ細胞の調製物は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、または９，０００個のＲＰＥ細胞を、本明細書に記載される溶液中に、例えば例１に記載されるGS2中に含み得る。ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０個のＲＰＥ細胞を含み得る。ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１×１０２～１×１０３、１×１０２～１×１０４、１×１０４～１×１０５、または１×１０３～１×１０６個のＲＰＥ細胞を含み得る。ＲＰＥ細胞の医薬調製物は、少なくとも約１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、または２００，０００個のＲＰＥ細胞を含み得る。例えば、ＲＰＥ細胞の医薬調製物は、少なくとも約５０～２００μｌ体積中に少なくとも約２０，０００～２００，０００個のＲＰＥ細胞を含み得る。さらに、ＲＰＥ細胞の医薬調製物は、１５０μｌの体積中に約５０，０００個のＲＰＥ細胞、１５０μｌの体積中に約２００，０００個のＲＰＥ細胞、または少なくとも約１５０μｌ体積中に少なくとも約１８０，０００個のＲＰＥ細胞を含み得る。
ＲＰＥ細胞は、調製物が眼表面との接触をして十分な期間維持されて、細胞が眼の患部、例として前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜、網膜、強膜、上脈絡膜（suprachoridal）腔、結膜、結膜下腔、上強膜腔、角膜内腔、角膜上腔、毛様体扁平部、手術によって誘導された無血管部、または黄斑まで浸透することを可能にするように、薬学的に許容される眼科用基剤による送達のために本明細書において提供される調製物中に製剤され得る。
いくつかの態様においては、細胞調製物が本明細書において提供され、その中のＲＰＥ細胞は細胞のシート中に含有される。例えば、ＲＰＥ細胞を含む細胞のシートは、細胞の無傷のシートが剥離し得る基質、例えば温度応答性ポリマー、例えば温度応答性ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）グラフト表面上でＲＰＥ細胞を培養することによって調製され得る。その上に細胞が接着し、培養温度において増殖し、それから温度シフトによって表面特性が変化し、細胞の培養シートの剥離を引き起こす（例えば、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）未満に冷却することによる（Silva et al., Trends Biotechnol. 2007 Dec;25(12):577-83、Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb 15;81(3):473-6、Ide, T. et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614、Sumide, T. et al. (2005), FASEB J. 20, 392-394、Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385、およびNishida, K. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196参照。これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。細胞のシートは、移植にとって好適な基質、例えばシートが宿主生物に移植されたときにインビボで溶解し得る基質、に対して接着性であってよく、例えば、移植にとって好適な基質上で細胞を培養すること、または細胞を別の基質（温度応答性ポリマーなどの）から移植にとって好適な基質上に解離させることによって調製される。可能性として移植にとって好適な例示的な基質はゼラチンを含み得る（Hsiue et al.,上記参照）。移植にとって好適であり得る代替的な基質は、フィブリンに基づくマトリックスおよび他を包含する。細胞のシートは、網膜変性の疾患の防止または処置のための医薬の製造に用いられ得る。ＲＰＥ細胞のシートは、それを本明細書に記載される溶液、例えばGS2溶液と接触させることによって、その必要がある対象の眼への導入のための細胞または組織調製物に製剤され得る。いくつかの態様において、細胞のシートは、ＲＰＥ細胞のシート移植を用いた中心窩下膜切除術によってその必要がある対象の眼に導入され得るか、または中心窩下膜切除術後の移植のための医薬の製造に用いられ得る。
本開示のいくつかの態様によって提供される調製物の体積は、投与方法、送達されるべき細胞の数、患者の年齢および体重、ならびに処置されようとする疾患の種類および重症度などの因子に依存する。例えば、注射によって投与される場合に、本開示のＲＰＥ細胞の医薬調製物の体積は約１、１．５、２、２．５、３、４、または５ｍｌであり得る。体積は約１～２ｍＬであり得る。例えば、注射によって投与される場合に、本開示のＲＰＥ細胞の医薬調製物の体積は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１００、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００μＬ（マイクロリットル）であり得る。例えば、本開示の調製物の体積は約１０～５０、２０～５０、２５～５０、または１～２００μＬであり得る。本開示の調製物の体積は約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μＬ以上であり得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される調製物は、μＬあたり、約１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、または９×１０４個のＲＰＥ細胞を含み得る。例えば、いくつかの態様において、調製物はμＬあたり２０００個のＲＰＥ細胞、例えば５０μＬあたり１００，０００個のＲＰＥ細胞、または９０μＬあたり１８０，０００個のＲＰＥ細胞を含み得る。
いくつかの態様において、調製物は冷蔵される。いくつかの態様において、調製物は約２～８℃で冷蔵される。
いくつかの態様において、調製物は、調製物の保存の間における細胞の集団中の細胞の生残をサポートする。いくつかの態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも７０％は２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である。いくつかの態様において、細胞または細胞集団の少なくとも８０％は、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である。いくつかの態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも９０％は、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である。いくつかの態様において、調製物は、調製物の保存の間における細胞の集団の播種効率の維持をサポートする。いくつかの態様において、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に、細胞の集団は、その元の播種効率の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を示し、元の播種効率は、保存期間開始時における細胞の集団の播種効率を言う。いくつかの態様において、調製物は保存容器内に存在する。いくつかの態様において、調製物はシリンジ内に存在する。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される溶液中の細胞および組織の医薬調製物を提供する。かかる調製物は対象への投与にとって好適である。いくつかの態様において、医薬調製物は、細胞、細胞集団、または組織と、本明細書において提供される溶液とから本質的になる。いくつかの態様において、医薬調製物は、１つ以上の薬学的活性成分、例えば保存料、抗酸化剤、ラジカルスカベンジャー、免疫抑制剤、血管新生促進因子、血管新生抑制因子、成長ホルモン、または細胞増殖、生残、および定着をサポートする細胞栄養もしくは基質を含む。
医薬パックおよび／またはキットもまた本開示によって包含される。提供される医薬パックおよび／またはキットは、本明細書において提供される細胞または組織調製物と容器（例えば、バイアル、アンプル、ボトル、シリンジ、および／またはクーラーパッケージ、または他の好適な容器）とを含み得る。いくつかの態様において、提供されるキットは、任意に、さらに第２の容器を包含することができ、細胞または組織調製物の希釈、洗浄、および／または再構成のために、調製物を製剤するために用いられる溶液を含む。いくつかの態様において、提供される製剤容器および溶媒容器の内容は組み合わさって、少なくとも１つのユニット剤形を形成する。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される調製物、例えば本明細書において提供される溶液中の細胞の集団を含む調製物を調製するための方法を提供し、ここで、方法は、細胞の集団を溶液と接触させることを含む。いくつかの態様において、方法は、凍結保存またはペレット化された細胞の集団を溶液と接触させて、細胞を再構成することを含む。
例えば、本開示のいくつかの側面は、（ａ）細胞の集団を本明細書において提供される溶液と接触させて、細胞調製物を生成することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ｂ）（ａ）の細胞調製物を少なくとも４、少なくとも６、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３６、少なくとも４８、少なくとも６０、少なくとも７２、または少なくとも９６時間保存することを含む。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ｃ）（ｂ）の保存期間後に対象に（ａ）の細胞調製物を投与することを含む。いくつかの態様において、（ｃ）の投与は、細胞を対象の眼に注射することを含む。いくつかの態様において、方法は、さらに（ｂ）の保存期間後に（ａ）の細胞調製物中の細胞生存能を決定することを含む。いくつかの態様において、方法は、ステップ（ｂ）の保存期間の間に（ａ）の細胞調製物を冷蔵することを含む。いくつかの態様において、冷蔵は、細胞調製物を２～８℃の温度で保存することを含む。いくつかの態様において、方法は、さらに、（ａ）において作り出された調製物を、調製物が作り出された場所とは異なる場所に（ｂ）の保存期間内に輸送することを含む。いくつかの態様において、輸送は、調製物を（ｃ）の投与が行われるクリニックまたは手術室に輸送することを含む。
例示的な使用および方法
本開示の溶液は種々の臨床適用のために用いられ得る。かかる適用は、臨床灌流、例えばペレット化または凍結保存後の細胞の再構成または製剤、ならびに例えば臨床適用のための細胞の製剤を包含し、対象への投与前の細胞保存および輸送、ならびに／あるいは対象への細胞、細胞単層、または組織の投与のための担体培地としてを包含するが、これに限定されない。
例えば、いくつかの態様において、本開示の溶液は細胞の再構成のための溶液として用いられ得る。本明細書において用いられる用語「細胞の再構成」は、細胞の集団を含む溶液を生成するために、細胞の集団を溶液、例えば本明細書において提供される溶液と接触させるプロセスを言う。いくつかの態様において、細胞の集団を再構成することは、細胞のペレット、例えば遠心ステップ後に上清を捨てることによって得られた細胞のペレットから、細胞の集団を含む溶液を生成することを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液によって細胞の集団を再構成することは、細胞が最初に懸濁されているいずれかの培地を希釈または置換して、本明細書において提供される溶液から本質的になるかまたはそれからなる培地中の細胞の集団を得ることを含む。いくつかのかかる態様において、本明細書において提供される溶液以外の培地中に懸濁された細胞の集団は、本明細書において提供される溶液によって１回以上洗浄され得る。いくつかの態様において、洗浄ステップは、細胞を本明細書において提供される溶液と接触させることと、例えば遠心によって細胞をペレット化することと、上清を捨てることと、細胞ペレットを溶液によって再構成することとを含み得る。用いられる溶液の体積および細胞ペレットの体積に依存して、最初の培地は、単一の洗浄－再構成サイクル後に、または２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回のかかるサイクル後に、溶液によって本質的に置換され得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は細胞および組織製剤のために用いられ得る。細胞および組織の観点から、本明細書において用いられる用語「製剤」は、細胞、細胞の集団、または組織を本明細書において提供される溶液のある体積と接触させて、臨床使用にとって、例えば対象への投与にとって、好適である細胞または組織調製物を得ることを言う。本明細書において提供される溶液は様々な細胞種、細胞集団、および組織と広く適合性であり、成体幹および前駆細胞、分化した細胞、ならびにかかる細胞を含む集団および組織を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液中のそのように製剤された細胞、細胞集団、または組織は、例えば再生医療アプローチにおける臨床使用のための治療用細胞、細胞集団、または組織である。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液中の製剤された細胞、細胞集団、または組織は、対象の失われたもしくは変性した細胞を置換し得るか、または対象の損傷したかもしくは機能不全である組織を修復もしくは置換し得る細胞の集団を含み得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液中に製剤される細胞、細胞集団、または組織は、多能性幹または前駆細胞、あるいは機能的な分化した細胞、あるいはかかる細胞を含む集団または組織、あるいはかかる細胞の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経もしくはニューロン幹もしくは前駆細胞、グリア幹もしくは前駆細胞、膵臓幹もしくは前駆細胞、ベータ細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、またはかかる細胞を含むかもしくはそれから本質的になる集団もしくは組織、例えばＲＰＥ細胞の単層、膵島、もしくは皮膚移植片を製剤するために用いられる。いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液中の細胞の製剤は臨床使用まで（例えば、対象への投与まで）保存され、および／あるいは臨床現場に輸送され、提供されたまままたは製剤を所望の体積もしくは細胞の所望の濃度に希釈することなどの最小限のプロセシングのみのいずれかで、対象に投与され得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される溶液は細胞または組織保存にとって有用である。本明細書において用いられる用語「保存」は、細胞および組織の観点において、本明細書において提供される溶液中の細胞（単数もしくは複数）または組織（単数もしくは複数）の製剤と、細胞（単数もしくは複数）または組織（単数もしくは複数）のさらなるプロセシングステップまたは臨床使用どちらかとの間の期間を言う。以前に利用可能な溶液とは対照的に、本明細書において提供される溶液は、ＲＰＥ細胞、光受容体、およびＭＳＣなどの傷つきやすい細胞および組織を包含する様々な種類の細胞および組織の保存を、延長された期間、例えば少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、または少なくとも７２時間、細胞生存能、再播種効率、または再増殖能の最小限の減少のみでサポートする。例えば、いくつかの態様において、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、少なくとも４８、少なくとも６０、または少なくとも７２時間の期間の、本明細書において提供される溶液中における例えばＲＰＥ細胞、光受容体細胞、またはＭＳＣの細胞、細胞集団、または組織の保存は、保存期間開始時における生存能、再播種効率、および／または再増殖能の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％という細胞生存能、再播種効率、および／または再増殖能をもたらす。いくつかの態様において、保存期間、例えば細胞または組織の製剤とそれらの臨床使用との間の期間は、４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間を超過しないであろう。典型的には、本明細書において提供される溶液中の製剤された細胞または組織は、保存のために、例えば２～８℃の間の温度にして冷蔵される。従って、いくつかの態様において、細胞および組織は、本明細書において提供される溶液中において常温未満の温度で、例えば２～８℃の間の温度で保存される。しかしながら、いくつかの態様においては、より高い温度、例えば８℃および１６℃の間の温度、１６～２２℃、または常温（典型的には約２５℃）での保存が企図される。
本明細書において提供される溶液は、細胞、細胞集団、および組織をそれらの製剤後に臨床現場に輸送するためにもまた有用である。本明細書において提供される溶液は細胞生残をサポートし、輸送の間の剪断応力を包含する代謝的および物理的ストレスを最小化する。細胞または組織輸送は、典型的には、上に記載されているように、細胞または組織の保存期間内に行われるため、保存にとって好適な条件において行われるであろう。本明細書において提供される溶液中の製剤された細胞または組織が冷蔵条件において、例えば常温未満の温度において輸送される態様においては、移動型冷蔵装置の使用が輸送にとって好ましい。かかる装置は、限定なしに、断熱の輸送または運送容器、氷パック、冷却ゲル、冷却容器、および移動型冷蔵ユニットを包含する。冷蔵輸送のためのいくつかの例示的な好適な輸送方法、容器、およびデバイスは本明細書に他所により詳細に記載される。当業者は、本開示に鑑みて、追加の好適な方法、容器、およびデバイスに気付くであろう。
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載される臨床用溶液または細胞もしくは組織調製物の有効量を対象に投与することによって、その必要がある対象を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、細胞、細胞集団、または組織を例えば本明細書に記載される細胞または組織調製物の形態で投与することによって処置され得る疾患または障害を有するか、またはそれと診断される。いくつかの態様において、対象に投与されようとする調製物は、対象の疾患または障害の少なくとも１つの症状を軽減するために有効なサイズの細胞の集団を含む。いくつかの態様において、対象は手術を受けており、本明細書に記載される溶液または調製物は手術部位を灌流するために投与される。いくつかの態様において、方法は、対象の疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることをさらに含む。
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその１つ以上の症状を回復させるか、緩和するか、その発症を遅延させるか、またはその進行を阻害することを目的とする臨床的介入を言う。いくつかの態様において、処置は１つ以上の症状が発生した後におよび／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、症状の不在下において、例えば疾患の症状の発症を防止するかもしくは遅延させるか、または発症もしくは進行を阻害するために投与され得る。例えば、処置は、（例えば、症状の既往に照らして、および／または遺伝性もしくは他の易罹患性因子に照らして）症状の発症前の易罹患性の個体に投与され得る。処置は、症状が解消した後にもまた、例えばそれらの再発を防止するかまたは遅延させるために継続され得る。
本明細書において用いられる用語「対象」は、個体の生物、例えば個体の哺乳動物を言う。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は齧歯類である。いくつかの態様において、対象は羊、山羊、牛、猫、または犬である。いくつかの態様において、対象は実験動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象はどちらかの性別、発達のあらゆるステージであり得る。
本明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の生体応答を誘発するために十分である生物活性薬剤の量を言う。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞または組織調製物の有効量は、疾患または障害に関連する症状を改善するために十分、例えば網膜疾患または障害を有する対象の視覚を改善するために十分である細胞の数または組織の量を含む、調製物の量を言い得る。当業者によって理解されるように、本明細書において提供される溶液または調製物の有効量は、種々の因子に、例として所望の生体応答、例えば処置されようとする具体的な疾患、緩和されるべき具体的な症状、標的とされている細胞または組織、ならびに対象の年齢、性、および一般的な健康状態に依存して様々であり得る。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される溶液または調製物をその必要がある対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、溶液または調製物を対象の眼に投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも１２、少なくとも２４、少なくとも３６、または少なくとも４８時間の調製物の保存後に、調製物を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、対象は網膜疾患を有するか、またはそれと診断される。いくつかの態様において、網膜疾患は桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、またはシュタルガルト病である。いくつかの態様において、調製物は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために有効なサイズの細胞の集団を含む。いくつかの態様において、細胞の集団はＲＰＥ細胞、光受容体細胞、または間葉系幹細胞を含む。いくつかの態様において、方法は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることをさらに含む。
本開示のいくつかの側面は網膜疾患を処置するための方法を提供し、方法は、網膜疾患を有する対象の眼に、本明細書において提供される細胞調製物の有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は網膜疾患を有するか、またはそれと診断される。いくつかの態様において、網膜疾患は桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、またはシュタルガルト病である。いくつかの態様において、調製物は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために有効なサイズの細胞の集団を含む。いくつかの態様において、細胞の集団はＲＰＥ細胞、光受容体細胞、または間葉系幹細胞を含む。いくつかの態様において、方法は、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることをさらに含む。
本明細書において用いられる用語「疾患の症状をモニタリングする」は、ある期間の複数の時点において疾患の症状の重症度を評価することを言う。例えば、対象の症状の重症度は、対象の処置が開始する前に、および次いで再び処置の期間後に、評価され得る。いくつかの態様において、モニタリングは、処置が類似の対象（例えば、同じ生物種、性、年齢、一般的な健康状態などの対象）の症状の測定可能な改善をもたらすために十分であることが公知であるかまたは予想される時間の後に、症状の重症度を評価することを包含し得る。いくつかの態様において、モニタリングは、規則的な間隔で症状の重症度を評価することを包含し得る。例えば、網膜障害を処置されようとする対象において、対象の視覚の最初の評価が実施され得る。当業者は、この評価が例示的であるということと、他の評価が対象の視覚の評価に加えてまたは代わりに実施され得るということとを理解するであろう。かかる評価は、網膜変性、網膜アブレーション、黄斑変性などのレベルを包含し得る。ひとたび対象が本明細書において提供される細胞調製物、例えば本明細書において提供されるGS2培地中にＲＰＥ細胞の有効数を含む調製物を投与することによって処置されたら、理想的には、投与された細胞が定着することとそれらの機能を実行することとを可能にするある期間が術後に経過した後に、例えば約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、または約１年後に、対象の視覚が再び評価され得る。術後評価の結果は記録され、術前評価と比較されて、症状が改善したかどうか、例えば対象の視覚のレベルが復活したかどうかを決定し得る。評価は１回または複数回繰り返されて、症状の軽減がなお進行中であるかどうか、またはエンドポイントに到達したかどうかを決定し得る。術後モニタリングの結果に依存して、追加の外科手術がスケジューリングされて、評価される症状を（さらに）改善し得る。最初の手術後に改善が観察されない場合には、細胞または組織調製物の投与量は、症状の軽減を促進するために増加し得る。
網膜疾患の処置の方法は、本明細書において提供されるＲＰＥ細胞調製物の有効量の単一の用量、例えば本明細書に記載されるGS2培地中にＲＰＥ細胞の有効量を含む調製物の投与を含み得る。本明細書に記載される処置の方法は、ＲＰＥ細胞がある程度の期間に渡って複数回投与され、かつ細胞の各投与量が疾患の症状を緩和するために有効であるかまたは複数の用量が有効量を累積的に送達する治療の過程をもまた含み得る。処置の例示的な過程は毎週、二週毎、一ヶ月毎、年４回、年２回、または毎年の処置を含み得る。代替的には、処置は段階的に進んでもよく、それによって多数の用量が最初に投与され（例えば、第１週には毎日の用量）、爾後により少なくより低頻度の用量が必要とされる。
本明細書に記載されるＲＰＥ細胞調製物、例えばGS2溶液中にＲＰＥ細胞を含む調製物が眼内注射によって投与される場合には、ＲＰＥ細胞調製物は、患者の一生を通して定期的に１回以上送達され得る。例えば、ＲＰＥ細胞調製物は年あたり１回、６～１２ヶ月毎に１回、３～６ヶ月毎に１回、１～３ヶ月毎に１回、または１～４週間毎に１回送達され得る。代替的には、より高頻度の投与がある種の状態または障害にとって望ましくあり得る。インプラントまたはデバイスによって投与される場合には、ＲＰＥ細胞は、処置されようとする特定の患者および障害または状態の必要に応じて１回、または患者の生涯を通して定期的に１回以上投与され得る。同様に、経時的に変化する治療計画が企図される。例えば、より高頻度の処置が始めに必要とされ得る（例えば、毎日または毎週の処置）。経時的に患者の状態が改善するのに伴って、より低頻度の処置が必要とされ得るか、またはさらなる処置が必要とされないこともある。
本明細書に記載される方法は、対象の網膜電図応答、視運動知覚閾値、または輝度閾値を測定することによって、処置または防止の効能をモニタリングするステップをさらに含み得る。方法は、眼における細胞の免疫原性または細胞の遊走をモニタリングすることによって、処置または防止の効能をモニタリングすることをもまた含み得る。
ＲＰＥ細胞またはＲＰＥ細胞と本明細書において提供される臨床用溶液、例えばGS2溶液とを含む調製物は、網膜変性を処置するための医薬の製造に用いられ得る。本開示は、失明の処置における、本明細書において開示されるＲＰＥ細胞を含む調製物の使用をもまた包摂する。例えば、ヒトＲＰＥ細胞を含む調製物は、糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢黄斑変性、例えば湿潤型加齢黄斑変性および乾燥型加齢黄斑変性を包含する）、網膜色素変性症、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などの、光受容体損傷および失明をもたらす多数の視覚に変化をきたす疾病に関連する網膜変性を処置するために用いられ得る。調製物は少なくとも約５，０００～５００，０００個のＲＰＥ細胞（例えば、１００，００個のＲＰＥ細胞）を含むことができ、これは、糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢黄斑変性を包含する）、網膜色素変性症、およびシュタルガルト病（黄色斑眼底）などの光受容体損傷および失明をもたらす多数の視覚に変化をきたす疾病に関連する網膜変性を処置するために網膜に投与され得る。
対象の処置のための調製物に用いられる細胞、例えば本明細書において提供されるＲＰＥ細胞調製物に用いられるＲＰＥ細胞は、ヒト細胞であり得る。ヒト細胞はヒト患者に、および動物モデルまたは患畜に用いられ得る。例えば、ヒト細胞は網膜変性のマウス、ラット、猫、犬、または非ヒト霊長類モデルによって試験され得る。加えて、ヒト細胞は、獣医療などにおいてその必要がある動物を処置するために治療用に用いられ得る。
いくつかの態様において、網膜疾患を処置する方法は、さらに、本明細書において提供される臨床用調製物の投与に時間的に近接して免疫抑制剤の投与を含み得る。用いられ得る免疫抑制剤は、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BASILIXIMAB（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUXIMAB（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、およびタクロリムスを包含するが、これに限定されない。免疫抑制剤は、少なくとも約１、２、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇで投薬され得る。免疫抑制剤が用いられる場合には、それらは全身または局所投与することができ、それらはＲＰＥ細胞の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与され得る。免疫抑制治療はＲＰＥ細胞の投与後に数週間、数ヶ月間、数年間、または無期限に継続し得る。例えば、患者はＲＰＥ細胞の投与後に５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンを６週間投与され得る。
いくつかの側面において、本明細書において提供される溶液は臨床灌流溶液として用いられ得る。かかる溶液は、臨床灌流にとって、例えば創傷または手術部位の灌流にとって有用である。本明細書において用語「灌流」と交換可能に用いられる用語「臨床灌流」は、一般的に、溶液、典型的には水溶液を創傷または手術部位に投与することを言う。本明細書において提供される灌流溶液は、種々の目的のために、例えば組織の水和、消毒、残骸もしくは表面病原体の除去、潤滑化、組織癒着の回避、または目視検査の補助の目的のために投与され得る。いくつかの態様において、灌流は、開放性創傷または手術部位に灌流溶液の定流を投与することを含む。いくつかの態様において、灌流溶液は間欠的に投与される。投与される灌流溶液の投与の様式ならびに体積および流量は、具体的な状況、例えば創傷のサイズ、灌流される組織、ならびに創傷または手術部位の状態（例えば、残骸の存在、表面病原体に対する暴露）に依存するであろう。当業者は、投与にとって好適な適切な方法およびデバイス、ならびに好適な体積および流量を特定することができるであろう。
いくつかの状況においては、単純な灌流溶液が灌流の目的のいくつかを達成するためには十分であり得るが、従来の灌流溶液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、消毒剤、または抗生物質は、いくつかの手術環境において傷つきやすい細胞または組織の生残をサポートすることができないかまたはそれに対して細胞毒性である場合もあり、それゆえに手術結果に負の影響を及ぼし得る。
１つの通常用いられる臨床灌流液である生理食塩水（水中の０．９％ＮａＣｌ）は、等張であり、その低い毒性、生理的特性（ｐＨおよびオスモル濃度）、調製および滅菌（蒸気滅菌を包含する）の容易さ、ならびに常温における長い品質保持期限のために、創傷灌流のために高頻度に用いられる。生理食塩水の１つの欠点は、それが傷つきやすい細胞または組織の延長された生残をサポートしないということ、および他の灌流溶液と比較して比較的高い創傷感染率が生理食塩水による灌流後に報告されているということである。
傷つきやすい手術部位または創傷、例えば、眼手術の間等に、生理食塩水または他の単純な灌流溶液の灌流によって負の影響を及ぼされ得る部位または創傷、を灌流するために、いくつもの商業的に利用可能な手術用灌流溶液が開発されてきた。例えば眼手術の間に傷つきやすい細胞または組織の外傷を防止するための、手術の間の使用のための現行で利用可能な手術用灌流溶液には、典型的には４つの主要成分がある：オスモル濃度を維持するための薬剤、カルシウム源、マグネシウム源、および緩衝化剤である。
本開示のいくつかの態様は、本明細書において提供される溶液によって、例えばGS2溶液によって、手術部位を灌流するための方法を提供する。いくつかの態様において、手術部位は対象の眼である。
手術部位の灌流のための方法およびデバイスは当業者に周知である。当業者は、用いられる送達の方法、体積、および圧力が手術部位の種類および状態に依存するということを理解するであろう。臨床灌流のための好適なデバイスは、限定なしに、バルブシリンジ、ピストンシリンジ、圧力キャニスター、ワールプール撹拌機、ワールプールホース・スプレイヤー、注ぎキャップまたはノズルを有するプラスチック容器中の灌流流体、およびパルス洗浄デバイス（例えばジェット洗浄、機械洗浄、パルス式洗浄、機械灌流、高圧灌流デバイス）を包含する。
いくつかの態様において、灌流は連続的であり、灌流液の絶え間ない流れが手術部位に投与される。他の態様においては、パルスのまたは間欠的な灌流が採用され、灌流液の間欠的なまたは断続的な送達が実施される。灌流体積は手術部位の性質および灌流の目的（創傷消毒、水和など）に依存するであろう。
キット
本開示のいくつかの側面はキットを提供し、（ａ）本明細書において提供される溶液；および（ｂ）細胞集団を（ａ）の溶液と接触させて細胞調製物を生成するための説明書；および（ｃ）（ｂ）の接触のためのおよび／または（ｂ）の細胞調製物を保存するための容器を含む。いくつかの態様において、（ａ）の溶液および（ｃ）の容器は、対象への移植のための（ｂ）の細胞調製物の使用にとって好適である。
したがって、本開示は、とりわけ下記：
項目１． 溶液であって、
（ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤；および
（ｂ）少なくとも２ｍＭまたは少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）のグルコース；および
（ｃ）溶液を生理的オスモル濃度に維持する浸透圧剤
を含む、前記溶液。
項目２． 項目１の溶液であって、溶液が少なくとも５ｍＭまたは少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む。
項目３． 項目１の溶液であって、溶液が少なくとも７．５ｍＭまたは少なくとも０．１４％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む。
項目４． 項目１の溶液であって、溶液が少なくとも１０ｍＭまたは少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む。
項目５． 項目１の溶液であって、溶液が少なくとも１５ｍＭまたは少なくとも０．２５％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む。
項目６． 項目１の溶液であって、溶液が少なくとも２０ｍＭまたは少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む。
項目７． 項目１の溶液であって、溶液が少なくとも２５ｍＭまたは少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む。
項目８． 項目１～７のいずれか１つの溶液であって、溶液がさらに二価カチオン源を含む。
項目９． 項目８の溶液であって、二価カチオン源がカルシウムおよび／またはマグネシウム源を含む。
項目１０． 項目１～９のいずれか１つの溶液であって、緩衝剤が酢酸塩緩衝剤および／またはクエン酸塩緩衝剤を含む。
項目１１． 溶液であって、
（ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤（緩衝剤は二炭酸緩衝剤ではない）；および
（ｂ）グルコース；および
（ｃ）溶液を生理的オスモル濃度に維持する浸透圧剤；および
（ｄ）二価カチオン源
を含む、前記溶液。
項目１２． 項目１１の溶液であって、（ｄ）の二価カチオン源がカルシウム源および／またはマグネシウム源を含む。
項目１３． 項目１１～１２のいずれか１つの溶液であって、緩衝剤が酢酸塩緩衝剤および／またはクエン酸塩緩衝剤を含む。
項目１４． 項目９～１０または１２～１３のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源が薬学的に許容されるカルシウム塩を含む。
項目１５． 項目９～１０または１２～１４のいずれか１つの溶液であって、マグネシウム源が薬学的に許容されるマグネシウム塩を含む。
項目１６． 項目１４～１５のいずれか１つの溶液であって、薬学的に許容されるカルシウムおよび／または薬学的に許容されるマグネシウム塩が、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、塩酸、マレイン酸、シュウ酸、リン酸、ステアリン酸、コハク酸、および硫酸を含む群から選択される酸によって形成されるカルシウムおよび／またはマグネシウム塩の群から選択される。
項目１７． 項目９～１０または１２～１６のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源が塩化カルシウムを含む。
項目１８． 項目９～１０または１２～１７のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源が塩化カルシウム二水和物を含む。
項目１９． 項目９～１０または１２～１８のいずれか１つの溶液であって、マグネシウム源が塩化マグネシウムを含む。
項目２０． 項目９～１０または１２～１８のいずれか１つの溶液であって、マグネシウム源が塩化マグネシウム六水和物を含む。
項目２１． 項目１０または１３～２０のいずれか１つの溶液であって、クエン酸緩塩衝剤がクエン酸ナトリウムとして提供される。
項目２２． 項目１～２１のいずれか１つの溶液であって、グルコースがＤ－グルコース（デキストロース）である。
項目２３． 項目１～２２のいずれか１つの溶液であって、浸透圧剤が塩である。
項目２４． 項目１～２３のいずれか１つの溶液であって、浸透圧剤がナトリウム塩である。
項目２５． 項目１～２４のいずれか１つの溶液であって、浸透圧剤が塩化ナトリウムである。
項目２６． 項目１～２５のいずれか１つの溶液であって、溶液が塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびグルコースを含む。
項目２７． 項目１～２６のいずれか１つの溶液であって、溶液のｐＨが６．８～７．８である。
項目２８． 項目１～２７のいずれか１つの溶液であって、溶液のｐＨが７．４～７．５である。
項目２９． 項目１～２８のいずれか１つの溶液であって、溶液のｐＨが約７．５である。
項目３０． 項目１～２９のいずれか１つの溶液であって、溶液が等張である。
項目３１． 項目１～２９のいずれか１つの溶液であって、溶液が高張である。
項目３２． 項目１～３１のいずれか１つの溶液であって、溶液が約２７０～３４５ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を示す。
項目３３． 項目１～３２のいずれか１つの溶液であって、溶液のオスモル濃度が約３１５ｍＯｓｍ／ｌである。
項目３４． 項目９～１０または１２～３３のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源の濃度が０．２５～０．７５ｍＭである。
項目３５． 項目９～１０または１２～３４のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源の濃度が０．４～０．６５ｍＭである。
項目３６． 項目９～１０もしくは１２～３５のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源の濃度が０．５～０．６ｍＭであるか、または項目９～１０もしくは１２～３５のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源の濃度が０．５～０．９ｍＭであるか、もしくはカルシウム源の濃度が０．６～０．８ｍＭである。
項目３７． 項目９～１０もしくは１２～３６のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源の濃度が約０．６ｍＭであるか、または項目９～１０もしくは１２～３６のいずれか１つの溶液であって、カルシウム源の濃度が約０．７ｍＭである。
項目３８． 項目９～１０または１２～３７のいずれか１つの溶液であって、マグネシウム源の濃度が０．０５～５ｍＭである。
項目３９． 項目９～１０または１２～３８のいずれか１つの溶液であって、マグネシウム源の濃度が０．１～０．３ｍＭである。
項目４０． 項目９～１０または１２～３９のいずれか１つの溶液であって、マグネシウム源の濃度が約０．３ｍＭである。
項目４１． 項目１～４０のいずれか１つの溶液であって、グルコースの濃度が５～５０ｍＭである。
項目４２． 項目１～４１のいずれか１つの溶液であって、グルコースの濃度が１０～２５ｍＭである。
項目４３． 項目１～４２のいずれか１つの溶液であって、グルコースの濃度が１０～２０ｍＭである。
項目４４． 項目１～４３のいずれか１つの溶液であって、グルコースの濃度が約１６ｍＭである。
項目４５． 項目１～４４のいずれか１つの溶液であって、浸透圧剤の濃度が約１００～２００ｍＭである。
項目４６． 項目１～４５のいずれか１つの溶液であって、浸透圧剤の濃度が約１２５～１７５ｍＭである。
項目４７． 項目１～４６のいずれか１つの溶液であって、浸透圧剤の濃度が約１５０ｍＭである。
項目４８． 項目１０または１３～４７のいずれか１つの溶液であって、クエン酸塩または酢酸塩の濃度が０．１～５ｍＭである。
項目４９． 項目１０または１３～４８のいずれか１つの溶液であって、クエン酸塩または酢酸塩の濃度が０．５～２ｍＭである。
項目５０． 項目１０または１３～３９のいずれか１つの溶液であって、クエン酸塩または酢酸塩の濃度が約１ｍＭである。
項目５１． 項目１～５１のいずれか１つの溶液であって、溶液がさらにカリウム塩を含む。
項目５２． 項目５１の溶液であって、カリウム塩が塩化カリウムである。
項目５３． 項目５１または５２の溶液であって、ＫＣｌの濃度が０．２～５ｍＭである。
項目５４． 項目５３の溶液であって、ＫＣｌの濃度が１～２．５ｍＭである。
項目５５． 項目５４の溶液であって、ＫＣｌの濃度が約２ｍＭである。
項目５６． 項目１～５５のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．０３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、および約１４５ｍＭのＮａＣｌを含むか、または項目１～５５のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、および約１４５ｍＭのＮａＣｌを含むか、または項目１～５５のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．５～０．９ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約０．８～１．２ｍＭクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭデキストロース、および約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌを含む。
項目５７． 項目１～５５のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．８５％ＮａＣｌ、約０．０１％ＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００６％ＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０３５％クエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２９％デキストロースを含むか、または項目１～５５のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．６８～１．０２％ＮａＣｌ、約０．００８～０．０１２％ＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００４８～０．００７２％ＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０２８～０．０４２％クエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２３～０．３５％デキストロースを含む。
項目５８． 項目１～５７のいずれか１つの溶液であって、溶液がさらに約２ｍＭのＫＣｌを含む。
項目５９． 項目１～５８のいずれか１つの溶液であって、溶液がさらに粘弾性ポリマーを含む。
項目６０． 項目５９の溶液であって、ポリマーがヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物である。
項目６１． 項目５９または６０の溶液であって、ポリマーがヒアルロン酸ナトリウムである。
項目６２． 項目５９～６１のいずれか１つの溶液であって、ポリマーが、剪断応力に対する溶液中の細胞の暴露を低減するために有効な濃度で存在する。
項目６３． 項目５９～６２のいずれか１つの溶液であって、ポリマーの濃度が０．００５～５％ｗ／ｖである。
項目６４． 項目６３の溶液であって、ポリマーの濃度が約０．０５％ｗ／ｖである。
項目６５． 項目１～６４のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．０３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約２ｍＭのＫＣｌ、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０５％ヒアルロン酸を含むか、または項目１～６４のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約２ｍＭのＫＣｌ、約１ｍＭクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０５％ヒアルロン酸を含むか、または項目１～６４のいずれか１つの溶液であって、溶液が約０．５～０．８ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１．６～２．４ｍＭのＫＣｌ、約０．８～１．２ｍＭクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭデキストロース、約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０４～０．０６％ヒアルロン酸を含む。
項目６６． 項目１～６５のいずれか１つの溶液であって、溶液が炭酸塩緩衝剤を含まない。
項目６７． 項目１～６６のいずれか１つの溶液であって、溶液がグルタチオンまたはグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）を含まない。
項目６８． 項目１～６７のいずれか１つの溶液であって、溶液が双性イオン有機緩衝剤を含まない。
項目６９． 項目１～６８のいずれか１つの溶液であって、溶液が、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間、２５℃において、溶質の測定可能な沈殿ならびに／または溶液中に保存された細胞の生残および生存能をサポートする溶液の能力の測定可能な損失なしに保存され得る。
項目７０． 項目１～６９のいずれか１つの溶液であって、溶液が、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間、２～８℃において、溶質の測定可能な沈殿ならびに／または溶液中に保存された細胞の生残および生存能をサポートする溶液の能力の測定可能な損失なしに保存され得る。
項目７１． 項目１～７０のいずれか１つの溶液であって、溶液が対象への投与にとって好適、対象の眼への投与にとって好適、および／または対象の眼に細胞を移植することにとって好適である。
項目７２． 項目１～７１のいずれか１つの溶液であって、溶液が本質的に発熱物質を含まない。
項目７３． 項目１～７２のいずれか１つの溶液であって、溶液が無菌である。
項目７４． 項目１～７３のいずれか１つの溶液であって、溶液が灌流、細胞の再構成、細胞保存、細胞の輸送、および／または対象への投与のためのものである。
項目７５． 調製物であって、項目１～７４のいずれか１つの溶液中の細胞の集団を含む。
項目７６． 項目７５の調製物であって、細胞の集団が対象への移植にとって好適である。
項目７７． 項目７６の調製物であって、細胞の集団が対象の眼への移植にとって好適である。
項目７８． 項目７５～７７のいずれか１つの調製物であって、細胞の集団がＲＰＥ細胞を含む。
項目７９． 項目７５～７８のいずれか１つの調製物であって、細胞の集団が光受容体細胞を含む。
項目８０． 項目７５～７９のいずれか１つの調製物であって、細胞の集団が間葉系細胞を含む。
項目８１． 項目７５～８０のいずれか１つの調製物であって、調製物が冷蔵される。
項目８２． 項目８１の調製物であって、調製物が約２～８℃で冷蔵される。
項目８３． 項目７５～８２のいずれか１つの調製物であって、調製物が、調製物の保存の間における細胞の集団中の細胞の生残をサポートし、細胞集団中の細胞の少なくとも７０％が２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である。
項目８４． 項目８３の調製物であって、細胞集団中の細胞の少なくとも８０％が２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である。
項目８５． 項目８３の調製物であって、細胞集団中の細胞の少なくとも９０％が２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である。
項目８６． 項目７５～８５のいずれか１つの調製物であって、調製物が、調製物の保存の間における細胞の集団の播種効率の維持をサポートし、細胞の集団が、２～８℃における調製物の保存の４８時間の後にその元の播種効率の少なくとも７０％を示し、元の播種効率が、保存期間開始時における細胞の集団の播種効率である。
項目８７． 項目８６の調製物であって、細胞の集団が、２～８℃における調製物の保存の４８時間後にその元の播種効率の少なくとも８０％を示す。
項目８８． 項目８６の調製物であって、細胞の集団がその元の播種効率の少なくとも９０％を示す。
項目８９． 項目７５～８８のいずれか１つの調製物であって、調製物が保存容器内に存在する。
項目９０． 項目７５～８９のいずれか１つの調製物であって、調製物がシリンジ内に存在する。
項目９１． 項目７５～９０のいずれか１つの調製物を調製するための方法であって、方法が、細胞の集団を項目１～７４のいずれか１つの溶液と接触させることを含む。
項目９２． 項目９１の方法であって、方法が、凍結保存またはペレット化された細胞の集団を項目１～７４のいずれか１つの溶液と接触させて、細胞を再構成することを含む。
項目９３． 項目１～７４のいずれか１つの溶液または項目７５～９０のいずれか１つの調製物を含む医薬組成物であって、医薬組成物が対象への投与にとって好適である。
項目９４． 方法であって、項目１～７４のいずれか１つの溶液または項目７５～９０のいずれか１つの調製物または項目８８の医薬組成物をその必要がある対象に投与することを含む。
項目９５． 項目９４の方法であって、方法が、溶液または調製物を対象の眼に投与することを含む。
項目９６． 項目９４または９５の方法であって、方法が、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも１２、少なくとも２４、少なくとも３６、または少なくとも４８時間の調製物の保存後に、調製物を対象に投与することを含む。
項目９７． 項目９６の方法であって、対象が、網膜疾患を有するか、またはそれと診断される。
項目９８． 項目９７の方法であって、網膜疾患が桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、またはシュタルガルト病である。
項目９９． 項目９７または９８の方法であって、調製物が、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために有効なサイズの細胞の集団を含む。
項目１００． 項目９７～９９のいずれか１つの方法であって、方法が、対象の網膜疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることをさらに含む。
項目１０１． 方法であって、
（ａ）細胞の集団を項目１～７４のいずれか１つの溶液と接触させて、細胞調製物を生成することを含む。
項目１０２． 項目１０１の方法であって、さらに、
（ｂ）（ａ）の細胞調製物を少なくとも４、少なくとも６、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３６、少なくとも４８、少なくとも６０、または少なくとも７２時間保存することを含む。
項目１０３． 項目１０２の方法であって、方法が、さらに、
（ｃ）（ｂ）の保存期間後に対象に（ａ）の細胞調製物を投与することを含む。
項目１０４． 項目１０３の方法であって、（ｃ）の投与が、細胞を対象の眼に注射することを含む。
項目１０５． 項目１０１～１０４のいずれか１つの方法であって、方法が、（ｂ）の保存期間後に（ａ）の細胞調製物中の細胞生存能を決定することをさらに含む。
項目１０６． 項目１０１～１０５のいずれか１つの方法であって、方法が、ステップ（ｂ）の保存期間の間に（ａ）の細胞調製物を冷蔵することを含む。
項目１０７． 項目１０６の方法であって、冷蔵が、細胞調製物を２～８℃の温度で保存することを含む。
項目１０８． 網膜疾患を処置するための方法であって、方法が、網膜疾患を有する対象の眼に項目７５～９０のいずれか１つの調製物または項目９３の医薬組成物の有効量を投与することを含む。
項目１０９． 項目１０８の方法であって、網膜疾患が桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、またはシュタルガルト病である。
項目１１０． キットであって、
（ａ）項目１～７４のいずれか１つの溶液；
（ｂ）細胞集団を（ａ）の溶液と接触させて細胞調製物を生成するための説明書；および
（ｃ）（ｂ）の接触のためのおよび／または（ｂ）の細胞調製物を保存するための容器
を含む、前記キット。
項目１１１． 項目１１０のキットであって、（ａ）の溶液および（ｃ）の容器が対象への移植のための（ｂ）の細胞調製物の使用にとって好適である。
を提供する。
例
序論
ＳＭＤおよびＡＭＤを有する対象の眼にＲＰＥ細胞を投与するための第１相臨床治験を、Alcon BSS PLUS（登録商標）をＲＰＥ細胞製剤、保存、および移植培地として用いて実施した。BSS PLUS（登録商標）は、眼内手術への使用を承認された生理的に適合性の（オスモル濃度～３１０ｍＯｓ、ｐＨ～７．４）溶液である。BSS PLUS（登録商標）中の製剤されたＲＰＥ細胞の品質保持期限は、臨床投与（注射）前に２～８℃で保存されるときには約４時間に限定される。この限定された製品品質保持期限のため、サテライトの細胞プロセシング実験室が、治験に参加する各臨床現場に近接して設置されなければならなかった。
最終製品品質保持期限を顕著に（例えば４８時間以上に）引き伸ばす培地を開発することは、数々の利点を授けるであろう。向上した品質保持期限は、最終製品製剤が単一の場所に統合されることを可能にし、そこから最終製品がＵＳ内の全ての臨床現場に運送され得るであろう。このようにして、現行ではｃＧＭＰプロセシング現場に近接した所在のものに限られているクリニック現場の数が、拡大され得る。引き伸ばされた製品品質保持期限は、複数の材料の在庫を維持すること、担当者を訓練すること、および複数のサテライトのプロセシング現場を監督することに関連するロジスティクス的複雑さをもまた消し去る。引き伸ばされた品質保持期限は、現行で厳しい４時間の枠内で行われなければならない移植をスケジューリングする際のフレキシビリティーを向上させる。
最終製品品質保持期限を引き伸ばすことは、患者が手術の準備をするかまたは手術室（ＯＲ）に入る充分前に、あらゆる遅延またはキャンセルの通知のための十二分な時間を許容するであろう。加えて、最終製品が品質出荷試験に不合格である場合には、手術を遅延させることまたはキャンセルすることなしに、同じ日に最終製品の追加の製剤を調製することが可能であり得る。品質保持期限を引き伸ばすことは、下で提案される混入微生物の存在を検出するための汎用プライマーを用いるＤＮＡのｑＰＣＲなどの、補足の最終製品出荷試験のための追加時間を与える。
BSS Plus（登録商標）中の製剤されたＲＰＥ最終製品を、MedOneのＲＥＦ３２３３のPolyTip（登録商標）カニューレ２３／３８から送達した。現行のBSS PLUS（登録商標）製剤を用いて、～２３％という生存細胞密度の平均損失が観察された。この損失は試験した全ての細胞密度で一貫しており、生存能または培養中に播種、増殖、および分化する爾後の能力の観点からは、カニューレから押出された細胞の残りの７７％に及ぼす明らかな影響を有さなかった。接着を原因とするある程度の細胞損失が予想され得るが、爾後の実験は、細胞損失とおそらくカニューレ押出しの間に作り出される剪断力に帰せられる細胞溶解とについては一貫していた。予期される損失を補うために、カニューレ装填密度をしかるべく増大させて、要求される用量が送達されることを保証する。品質保持期限を向上させることに加えて、好適な粘弾性特性を有する最終的な製剤培地はカニューレ送達の間の細胞損失を最小化する。細胞損失を最小化することは、細胞断片の送達を低減し、細胞内コンポーネントに対する潜在的免疫反応を和らげる。
例１：培地組成
GS2培地
細胞の再構成、保存、輸送、および／または対象への投与のための培地を調製した。「GS2」と名付けた培地を、次のように調製した。
水中の０．９％ＮａＣｌの４８．７５ｍｌ、
水中のAlcon平衡塩溶液（BSS（登録商標））、３００ｍＯｓｍの１３．１０ｍｌ、および
０．９％ＮａＣｌ（水中）中の５％デキストロース（５６０ｍＯｓｍ）の３．７５ｍｌ
を組み合わせて、０．２９％デキストロースの最終濃度および３１５ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する６５．６ｍＬ培地を得た。
したがって、基礎GS2培地は、
約１４５ｍＭのＮａＣｌ（約０．８５％ＮａＣｌ）、
約２ｍＭのＫＣｌ（約０．０１５％ＫＣｌ）、
約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）（約０．０１％ＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物））、
約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）（約０．００６％ＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物））、
約１ｍＭクエン酸ナトリウム（約０．０３５％クエン酸ナトリウム二水和物）、および
約１６ｍＭグルコース（約０．２９％デキストロース）、
を水中に含む。
任意に、GS2培地は、粘弾性ポリマーを、細胞への剪断応力を低減するために有効な量で、例えば約０．００５～５％ｗ／ｖの最終濃度でさらに含み得る。いくつかの態様において、粘弾性ポリマーはヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物である。
Alcon平衡塩溶液（BSS（登録商標））
Alcon平衡塩溶液（BSS（登録商標）無菌灌流溶液）は無菌の平衡塩溶液であり、
０．６４％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、
０．０７５％塩化カリウム（ＫＣｌ）、
０．０４８％塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、
０．０３％塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、
０．３９％酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、
０．１７％クエン酸ナトリウム二水和物（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７・２Ｈ２Ｏ）、
水酸化ナトリウムおよび／または塩酸（ｐＨを調整するため）、および
注射のための水
を含有する。
BSS（登録商標）のｐＨはおよそ７．５であり、オスモル濃度はおよそ３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
それゆえに、Alcon BSSは、
約１０９ｍＭのＮａＣｌ、
約１０ｍＭのＫＣｌ
約３ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）
約０．１ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）
約５ｍＭクエン酸ナトリウム
を含む
Alcon平衡塩溶液PLUS（BSS（登録商標）PLUS）
Alcon平衡塩溶液PLUS（BSS PLUS（登録商標））は眼内外科手術の間の使用のための無菌眼内灌流溶液である。これは使用前に「Ｉ液」および「ＩＩ液」と名付けた２つの液から再構成される。
Ｉ液は５００ｍＬ単一用量ボトル中の４８０ｍＬ無菌溶液であり、これにＩＩ液濃縮液を加える。BSS PLUS（登録商標）のＩ液は、
７．４４０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、
０．３９５ｍｇ／ｍｌ塩化カリウム、
０．４３３ｍｇ／ｍｌ二塩基性リン酸ナトリウム、
２．１９０ｍｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、
塩酸および／または水酸化ナトリウム（ｐＨを調整するため）、および
注射のための水
を含有する。
ＩＩ液は、Ｉ液へ加えるための２０ｍｌ単一用量バイアル中の無菌濃縮液である。
BSS PLUS（登録商標）のＩＩ液は、
３．８５ｍｇ／ｍｌ塩化カルシウム二水和物、
５ｍｇ／ｍｌ塩化マグネシウム六水和物、
２３ｍｇ／ｍｌデキストロース、
４．６ｍｇ／ｍｌグルタチオンジスルフィド（酸化グルタチオン）、および
注射のための水
を含有する。
Ｉ液ボトルへのBSS PLUS（登録商標）ＩＩ液の添加後に、再構成された製品は、
７．１４ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、
０．３８ｍｇ／ｍｌ塩化カリウム、
０．１５４ｍｇ／ｍｌ塩化カルシウム二水和物、
０．２ｍｇ／ｍｌ塩化マグネシウム六水和物、
０．４２ｍｇ／ｍｌ二塩基性リン酸ナトリウム、
２．１ｍｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、
０．９２ｍｇ／ｍｌデキストロース、
グルタチオンジスルフィド（酸化グルタチオン）０．１８４ｍｇ／ｍｌ、
塩酸および／または水酸化ナトリウム（ｐＨを調整するため）を、
注射のための水中に含有する。
再構成された製品はおよそ７．４のｐＨおよびおよそ３０５ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する。
例２：BSS-Plus（登録商標）中の製剤されたＲＰＥ最終製品の品質保持期限
BSS Plus（登録商標）中の製剤されたＲＰＥ最終製品は、低温保存（２～８℃）においてその生存能を４時間維持した。最終製品品質保持期限のより包括的な評価が完了した。この研究においては、ＲＰＥバルク製品を融解し、２，０００個の生存細胞／μｌという最終的な保存密度にまとめる（bracket）２つの生存細胞密度で製剤した。この保存密度は、調製された全ての用量で一定であった。BSS Plus（登録商標）の予め測定した体積による細胞の最終希釈を、シリンジに装填する直前にＯＲにおいて実施する。この希釈ステップは、１５０μＬ注射体積中の送達される最終的な細胞密度を決定する（これもまた全ての用量で一定）。
低温で保存された最終的なBSS-Plus（登録商標）によって製剤されたＲＰＥ細胞製品の細胞生存能、生存細胞密度、純度、および力価を、製剤の時に（０時間）、ならびに低温保存（２～８℃）の４および６時間の後に評価した。生存細胞密度および細胞生存能は低温保存の６時間では一定であることが示された。加えて、０、４、および６時間保存した製剤されたＲＰＥ細胞を播種し、爾後の純度および力価評価のために培養した。播種した各時点（０、４、および６時間）について、純度をＭＩＴＦおよびＰＡＸ６免疫染色によって評価し、力価をファゴサイトーシスされた粒子のＦＡＣＳ解析を測定することによって評価した。データは、試験された全ての製品属性が評価された６時間の期間では一定のままであったということを示している。
BSS Plus（登録商標）中に１２時間保存されたＲＰＥ細胞は、一般的に７０％未満の生存能を見せ、BSS-Plus中における２４時間後には、ＲＰＥ細胞生存能は典型的には２０％未満である。
例３：改善された細胞の再構成、保存、輸送、および／または移植培地の開発
（例えば凍結保存状態からの、細胞の再構成、細胞保存（例えば、再構成または細胞培養からの収穫と移植施設への輸送または対象への投与どちらかとの間の低温保存）、細胞輸送、および細胞移植のための改善された培地を開発した。得られた培地（GS2）の成分を下の表１に列記する。例示的な供給業者が提供されている。当業者は列記された成分の追加的供給源が存在するということを理解し、これらの試薬の好適な供給源を特定することができるであろう。
Figure 2022040140000001
GS2最終製剤はｐＨ（７．２～７．６）およびオスモル濃度（計算されたオスモル濃度３１５）の観点から生理的である。
GS2培地を製剤し、専用のＲＰＥ細胞最終製品Ｉｓｏ－７クリーンルームにおいてＩｓｏ－５のＢＳＣ内で分注した。表１の無菌成分を無菌リザーバに追加し、ロータリーシェーカー上に置いた（３０～４０ＲＰＭ）。最低３時間後に、サンプルをリザーバから取り出し、ｐＨを測定し、０．１ＮのＮａＯＨの漸増的な添加によって７．４＋／－０．２のｐＨに調整した。充填のためのGS2はｐＨプローブと接触しなかった。溶液をメンブレンフィルター滅菌し、ｐＨを再チェックした。
GS2の３ｍｌ分注物を、ＵＳＰクラスＶＩ制限値を満たすバージンポリプロピレン樹脂によって構成された、ガンマ照射したクライオバイアルに分注した。充填された各バイアルからサンプルを取り出し、バイアルにキャップをした。ＱＣ試験を、下に記載されているようにプールされたサンプルについて実施した。各バイアルを可視およびＵＶ光下における目視点検にかけて、粒子状物質の不在を確認した。バイアルをラベリングのために無菌条件に戻し、２～８℃で保存する。低温保存における最低１日の後に、いくつかのいくつかのバイアルを取り出し、２～８℃のｐＨ標準によって校正したｐＨメータを用いてｐＨを再試験して、利用温度（２～８℃）における許容性を確認した。
例４：GS2中のＲＰＥ細胞最終製品の品質管理および出荷仕様
全ての充填されたバイアルから取り出されたサンプルからなるプールされたGS2の分注物を、１４日のＵＳＰ無菌性、ｐＨ、オスモル濃度、およびエンドトキシン試験にかけた。製剤および注射カニューレからの押出し後にＲＰＥ細胞生存能および増殖を維持するGS2の各ロットの性能をもまた評価した。例示的な品質管理試験および出荷仕様が下の表２に提供されている。
Figure 2022040140000002
表２に列記された出荷基準は例示的であるということ、ならびに、表２に列記されたいずれかの基準のいずれかの組み合わせで組み合わせることができ、単独でまたは出荷試験および品質管理のための追加の基準との組み合わせのいずれかで用いられ得るということが理解されるであろう。
ＲＰＥ細胞増殖アッセイの例示的な態様において、GS2保存期間後に、細胞は、ゼラチンコート９６ウェルプレートに最初の密度で、例えばウェルあたり２０，０００細胞の密度で、RPE GMまたはEGM2／EBM2培地（Lonza、例えばＣａｔ．＃：ＣＣ－３１５６、ＣＣ－４１７６）に播種される。細胞は、好適な条件において、例えば５％ＣＯ２、３７℃で、湿度コントロールしたインキュベータ内において２～３日間増殖させる。細胞を例えばトリプシン消化によってウェルから剥がしとり、それから計数する。この試験のGS2品質出荷試験基準は、培養期間の終わりにウェルあたりの細胞計数が最初の細胞密度の１２５％以上、例えば２０，０００細胞／ウェルという最初の密度では＞／＝２５，０００細胞／ウェル）である場合には満たされる。
例５：ＲＰＥ最終製品製剤、パッケージング、および運送
下に概説されているプロセスにおいては、BSS Plus（登録商標）をGS2プロセシングのための最初の洗浄ステップに用いる。BSS Plus（登録商標）の代わりにGS2による洗浄もまた企図され、本開示の態様によって包含される。臨床使用のために出荷された凍結保存されたＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞のバイアルを液体窒素保存から回収した。用量に応じて、細胞の２～４つのバイアルが必要とされた。クライオバイアルをクリーンルームに輸送し、３７℃水浴によって急速に融解した。各バイアルの融解した内容物（凍結保存の時に２００万細胞を含有する凍結保存培地（９０％ＦＣＳ＋１０％ＤＭＳＯ）の１ｍｌ）を温かいＤＭＥＭ中に穏やかに再懸濁し、５０ｍｌコニカルチューブに移し、追加の温かいＤＭＥＭによって４０ｍｌの最終体積にした。再懸濁された細胞の各チューブを遠心し（室温における５分間の１６０×ｇ）、各ペレットを室温BSS Plus（登録商標）の４０ｍｌ中に再懸濁した。各細胞懸濁液を再び遠心し、ペレットをプールし、室温BSS Plus（登録商標）の１０ｍｌ中に再懸濁した。再懸濁されたプールされた細胞を３回目に遠心し（室温における５分間の１６０×ｇ）、上清を吸引した。
下は、上で概説された製品製剤のステップを例示するフローチャートである（GS2プロセシングステップには下線を付けている）。
Figure 2022040140000003
可能な限りの上清を除去した後に、ペレットは、融解された百万細胞毎に５０μｌの最終体積になるように低温BSS Plus（登録商標）（現行のプロセシング）または低温GS2（GS2プロセシング）の体積中に再懸濁した。このポイントから、細胞を予冷したチューブラック中に保って、細胞を残りのプロセスステップでは２～８℃に保った。１５～２５％を目標とする体積（target volume）の典型的な回収により、およそ４，０００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌの細胞懸濁液となるであろう。
サンプルを取り出し、生存細胞計数を実施し、生存細胞密度および回収された細胞の合計数を決定した。追加の低温BSS Plus（登録商標）または低温GS2を細胞懸濁液に加えて、最終細胞濃度を２，３００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌにした（２，０００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌという目標とする最終製剤濃度よりも３００細胞超えている）。確認用の細胞計数を実施し、追加の低温BSS Plus（登録商標）または低温GS2を加えて、最終濃度を２，０００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌにした。必要とされる体積の細胞を最終製品密封容器（０．５ｍｌ無菌マイクロ遠心チューブ、Fisher、Ｃａｔｎｏ．０２－７０７－３５１）に分注した。BSS Plus（登録商標）ＲＰＥの４時間の有効期限またはGS2のＲＰＥの４８時間の有効期限を表示する製品ラベルを、BSS Plus（登録商標）プロセシングのための各チューブに、またはGS2プロセシングのための製品チューブを含有するWhirl-Pakバッグに貼付した。サンプルを各製品チューブから取り出し、それらのサンプルはアーカイブおよびＱＣ試験のためにプールした。
加えて、培養細胞の製剤のためのプロトコールを開発した。このプロトコールにおいては、凍結保存されたＲＰＥ細胞を融解し、GS2移植培地中への細胞製剤前に３～７日間前培養した。培養細胞を培養皿から剥がしとり、最初にＤＭＥＭによって、次いでBSS-Plusによって、最終的にはGS2培地と１：１混合されたBSS-Plusによって洗浄した。最終洗浄ステップ後に、細胞を低温（２～８℃）GS2培地に移した。最終細胞密度のためのサンプル取り出し、試験、および体積の調整は上に記載されている通りであった。
下は、上で概説された製品製剤のステップを例示するフローチャートである（GS2プロセシングステップには下線を付けている）。
Figure 2022040140000004
BSS PLUS（登録商標）中のＲＰＥのパッケージングおよび運送．臨床治験の移植（ＳＭＤおよびＡＭＤ）のために、各用量は一対のチューブからなった：１つは２，０００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌで製剤されたＲＰＥ細胞の予め測定した体積を含有し、別のチューブはBSS Plus（登録商標）の予め測定した体積を含有した。各対のチューブを２～８℃でLabtopチューブクーラーラック中に置いた。クーラーラックをバッグに入れ、予冷したInsul-Iceの～１６ポンドを含有するColemanクーラー中に置き、配送業者によってクリニックに手渡し配達した。
ＯＲにおいて、移植の直前に、BSS Plus（登録商標）をブラントフィルニードルを用いて細胞に添加した。細胞を混合し、１ｍｌ注射シリンジに装填した。製品（全ての用量について１５０μｌ）を注射カニューレから網膜下腔内に押出した。シリンジ中の装填細胞密度はカニューレ押出しの間の２５％の予期される損失を補うために１．３３×送達密度にセットした。
下は、BSS PLUS（登録商標）のパッケージングおよび運送のステップを例示するフローチャートである。
Figure 2022040140000005
GS2中のＲＰＥのパッケージングおよび運送．各用量は、２，３００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌで製剤されたＲＰＥ細胞の２５０μｌを含有する１つのマイクロ遠心チューブからなった。最終的な製剤されたＲＰＥ製品の１用量を含有する単一チューブを２オンス無菌Whirl-Pakバッグ中に置いた。これには最終製品ラベルを貼付した。バッグに入れたチューブを、クリーンな予冷した（２～８℃）固有付番のポータブルチューブクーラー内に置いた。ラベリングされた製品チューブ（単数または複数）に加えて、ＲＰＥ製品細胞の３０μｌを含有するラベリングされたサテライトチューブ（バッグに入れていない）と、０．４％トリパンブルーの１００μｌを含有する別個のチューブとを各Chilletteクーラー内に置いた。最終製品ラベルを各Chilletteクーラーにもまた貼付した。製品を有する各クーラーは無菌条件において無菌Whirl-Pakバッグ中に置いた。製品を有するバッグに入れたクーラー、付属の臨床オーダーフォーム、および２つの製品ラベルを、最終パッケージングおよび運送エリアに通ずるクリーンルームパススルーに置いた。混同を避けるために、各Chilletteクーラーに無菌条件において製品チューブを装填し、一度に１つずつクリーンルームパススルーに置いた。
パッケージング担当者が各Chilletteクーラーならびに付属の文書および最終製品ラベルをクリーンルームパススルーから回収し、バッグに入れたChilletteクーラー、バブルラップ、ブラントフィルニードル、シリンジ、注射カニューレ、および血球計算盤を、予冷したNanoCool冷却ユニットの運送コンパートメント内に置いた。冷却ユニットの蓋を締めた。外側のシッパーに受け取り、点検、保存、および運送後生存能試験のための書類を詰める。パッケージングされた製品は、全ての製品出荷試験が実施され、「ＲＰＥ細胞最終製品の移植向け出荷時証明書」が発行されるまでクアランティンに置いた。製品および書類を有するNanoCoolシッパーを一晩でクリニックに送った。受け取り時に、シッパーは、最終充填の時間から４８時間以内の製品使用まで室温でまたは２～８℃で保存され得る。有効期限の日付および時間を有する最終製品ラベルが外側のシッパー、Chilletteチューブクーラー、および最終製品チューブを含有するバッグに貼付されている。
Figure 2022040140000006
ＲＰＥ最終製品品質出荷試験．移植前に実施される現行の最終製品（BSS PLUS（登録商標）中）品質出荷試験は、細胞生存能チェックおよびグラム染色を包含する。サンプルはＵＳＰの１４日間無菌性試験に送られ、結果は移植後に報告される。
Figure 2022040140000007
汚染物質検出のためのｑＰＣＲ．ＲＰＥ最終製品品質保持期限は、GS2中においては、BSS-Plus（登録商標）中における４時間から少なくとも４８時間に引き伸ばされているので、より長いターンアラウンド（turn-around）時間を有するアッセイが製品出荷前に実施され得る。例えば、今では、ＲＰＥ最終製品をＰＣＲアッセイにかけ、製品の出荷および使用前に品質管理および出荷目的の結果を受け取ることが可能である。実施され得る１つの好適なアッセイは、汎用プライマーのＤＮＡのｑＰＣＲアッセイである。かかるアッセイは２時間以内に完了し得る。ｑＰＣＲアッセイは極めて高感度であり、多様な病原性混入物質、例えば環境性、微生物性、およびウイルス性混入物質、ならびに通常の皮膚片利共生生物（commensules）を検出するために用いられ得る。グラム染色およびＵＳＰ無菌性試験に加えて、ｑＰＣＲアッセイは、微生物混入を検出するためにアジュバントの最終製品出荷アッセイとして用いられ得る。ｑＰＣＲ結果は製品運送前に知ることになり、それによって、可能性として汚染された製品が施設から出ることを防止するであろう。本明細書に記載されるｑＰＣＲアッセイは例示的であるということ、ならびに、ＲＰＥ最終製品の引き伸ばされた品質保持期限内に実施され得る他のＰＣＲアッセイおよび他の種類のアッセイを包含するがこれに限定されない、他の好適なアッセイが代わりにまたは加えて実施され得るということが理解されるであろう。
最終製品の運送後点検および生存能チェック．臨床現場での受け取り時に、訓練された担当者が外側のシッパーを回収し、正しいバッチおよびロット情報を確認し、シッパーの損傷の形跡についてチェックする。臨床現場が細胞生存能チェックを実施する能力を有する場合には、細胞を含有するサテライトチューブおよびトリパンブルーを含有するチューブをこの時にChilletteクーラーから取り出す。チューブは、運送後の細胞生存能チェックのために試験実験室に移す。細胞生存能が７０％未満である場合には、製品を廃棄する。
注射カニューレに装填するための説明．ＯＲにおける移植の直前に、細胞を、ブラントフィルニードルを用いて混合し、１ｍｌ注射シリンジに装填する。製品（１５０μｌ）を注射カニューレから網膜下腔内に押出す。GS2のカニューレ押出しの間にはわずかな細胞損失があるのみであるので、シリンジ中の装填細胞密度（２，０００個の生存ＲＰＥ細胞／μｌ）は、３００Ｋ用量では注射される１５０μＬによって送達される密度である。
例６：GS2中での細胞安定性
図１は、ＲＰＥ細胞が、培養によって播種および増殖する爾後の能力の明らかな損失なしにHypoThermosol（BioLife Solutions, Inc.、ボセル、ＷＡ、ＵＳＡ）中に２４時間（４８時間ではなく）維持され得るということを説明している。
図２～５は２～８℃におけるGS2中のＲＰＥ安定性を説明している。図２は、ＲＰＥ細胞が、生存細胞数または培養によって播種および増殖する爾後の能力の明らかな損失なしに、GS2中に少なくとも４８時間維持され得るということを示している。図３は、ＲＰＥ細胞が、生存細胞密度の顕著な減少なしに、細胞生存能のわずかな損失のみでGS2中に４～５日間維持され得るということを示している。図４は、培養によって播種および増殖するＲＰＥ細胞の能力が、GS2低温保存の５日の後に減少し始めるということを示している。図５は、GS2が現行の注射システムと適合性であるということを示している。
例７：GS2移植培地－粘弾性ポリマーの効果
種々の濃度の粘弾性ポリマーがカニュレーション後の細胞生存能に及ぼす効果を、評価した。ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）バルクロットＮＲＰＥ－３１３５ＣＰ２をｃＧＭＰ手順に従って製造し、凍結保存した。実験の日に、バイアルを融解し、製剤した。細胞を予め加温した（３７℃）ＤＭＥＭ（Gibco）中に融解した。次いで、細胞を遠心した（５分＠１６０×ｇ）。各ペレットを４０ｍｌの室温BSS Plus（登録商標）（Alcon）中に再懸濁し、再び遠心した。それから、ペレットを単一の遠心チューブにプールし、室温BSS Plus（登録商標）中に再懸濁し、次いで、最終スピンステップ前にチューブあたり１０ｍｌ体積で複数の（４つの）チューブに分割した。細胞ペレットをGS2 TMと名付けた異なる移植培地製剤に入れた。
移植培地GS2 TMは、生理食塩水（０．９％ＮａＯＨ）BraunのＮＤＣ＃００２６４－７６１０－００またはBaxterのＮＤＣ＃０３３８－００８９－０４中の５％デキストロース、生理食塩水（０．９％ＮａＯＨ）BaxterのＮＤＣ＃０３３８－００４９－１１、Alcon BSS灌流溶液ＮＤＣ＃００６５－０７９５－１５、およびヒアルロン酸またはヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）、例えばAbbott Healon EndoCoat、ＮＤＣ＃０５０４７－４５４７－０６を無菌リザーバ中で組み合わせることと、コンポーネントをオービタルシェーカー上で混合することとによって作った。ｐＨを測定し、無菌濾過前に０．１ＮのＮａＯＨの漸増的な添加によって７．４＋／－０．２のｐＨに調整した。この実験では、Healon EndoCoat（Abbott）からのヒアルロン酸（ＨＡ）の０．１５％、０．１％、０．０５％、または０％のいずれかの最終濃度を含有するGS2 TMを作った。
細胞を漸増的に希釈して、マイクロリットルあたり約２，０００細胞という最終的な保存細胞密度を得た。異なる移植培地中で再構成、希釈した後に、細胞のトリプリケートバイアルを各条件について作った。細胞のバイアルを２～８℃で冷蔵庫に２日間保存した。そして、細胞数を、血球計算盤を用いて決定した。細胞生存能はトリパンブルー排出によって求めた。各条件について作られた細胞のトリプリケートチューブから平均値を計算し、各チューブの生存細胞濃度をトリプリケート計数から決定した。MedOneの＃３２３３カニューレからの押出し前および後の細胞数の違い、またはデルタを計算した。
この実験の結果を図６に示す。トリプリケートチューブからの平均生存細胞密度±標準偏差を示している。ヒトＲＰＥ細胞密度は血球計算盤を用いて決定した。細胞生存能はトリパンブルー排出によって求めた。各条件について作られた細胞のトリプリケートチューブから平均値を計算し、各チューブの生存細胞濃度をトリプリケート計数から決定した。MedOneの＃３２３３カニューレからの細胞押出し後に観察された細胞数のパーセント変化（デルタ）が各条件について値の各セットの上に示されている。
試験されたＨＡの全ての濃度はカニュレーション後に改善された細胞生存能の値を示したが、０．０５％ＨＡの追加は移植培地製剤にとって好ましいことが決定された。０．０５％ＨＡを含有するGS2 TMでは、MedOneの＃３２３３カニューレからのＲＰＥ細胞の押出し後に、ＨＡなしまたはＨＡの０．１％もしくは０．１５％によって作られたGS2 TMよりも少ない細胞損失が観察された。最も著しくは、追加されるＨＡなしのGS2 TMと比較して、１０％少ない損失が０．０５％ＨＡの包含によって観察された。
例８：GS2培地－細胞生存能に及ぼすグルコース濃度の効果
種々の濃度の粘弾性ポリマーがカニュレーション後の細胞生存能に及ぼす効果を評価した。この目的のために、ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）バルクロットＮＲＰＥ－３１３５ＣＰ２をｃＧＭＰ手順に従って製造し、凍結保存した。実験の日に、バイアルを融解し、細胞を予め加温した（３７℃）ＤＭＥＭ（Gibco）中で再構成た。それから、細胞を遠心した（５分＠１６０×ｇ）。各ペレットを４０ｍｌの室温BSS Plus（登録商標）（Alcon）中に再懸濁し、再び遠心した。それから、ペレットを単一の遠心チューブ中にプールし、室温のBSS Plus（登録商標）中に再懸濁し、それから、最終スピンステップ前にチューブあたり１０ｍｌのBSS Plus（登録商標）で複数の（６つの）チューブに分割した。細胞ペレットを異なる移植培地GS2 TMに入れた。
移植培地GS2 TMは、生理食塩水（０．９％ＮａＯＨ）中の５％デキストロース、生理食塩水（０．９％ＮａＯＨ）、およびAlcon BSS灌流溶液ＮＤＣ＃００６５－０７９５－１５を無菌リザーバ中に組み合わせることと、オービタルシェーカー上で混合することとによって作った。ｐＨを測定し、無菌濾過前に０．１ＮのＮａＯＨの漸増的な添加によって７．４＋／－０．２のｐＨに調整した。この実験のGS2 TM培地は、下の表３に示されているように種々の濃度のグルコースで作った。記されている体積はミリリットルである。
Figure 2022040140000008
 表３：
一度、種々のGS2移植培地中に製剤した場合には、細胞を漸増的に希釈して、マイクロリットルあたり約２，０００細胞という最終的な保存細胞密度を得た。次いで、細胞を無菌バイアル（Fischer）中で２～８℃にて冷蔵庫に３日間保存した。爾後に、生存細胞数を血球計算盤を用いて決定し、ウェルあたり大体２０，０００個の生存細胞をゼラチンコート（Stem Cell, Inc.）９６ウェル組織培養プレート（COSTAR）に播種した。細胞は、ＲＰＥ増殖培地（EGM2 Single Quotsを有するEBM-2、Stem Cell, Inc.、例えば、LonzaのＣａｔ．＃：ＣＣ－３１５６、ＣＣ－４１７６）によって５％ＣＯ２、３７℃の湿度コントロールしたインキュベータ内で３日間培養した。細胞は、爾後に、４０μｌ／ウェルの１：１トリプシン（Sigma）およびＨＥＰＥＳに基づく剥離液（Gibco）を用いてプレートから剥がしとった。血清含有培地（４０μｌ／ウェル）を用いてトリプシン作用を中和し、ピペットで細胞にかけて剥がしとり、血球計算盤を用いて計数した。図７は、試験した各条件について６つのウェルからのウェルあたりのヒトＲＰＥ細胞の平均数±ＳＤを示している。グルコースの各濃度はグルコースを含有しないコントロールと比較して向上した結果となった。
例９：GS2培地による間葉系幹細胞の向上した生存能
図８は、異なる製剤培地中の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞生存能を説明している。ヒト胚性幹細胞由来ＭＳＣを７０％コンフルエントまで増殖させ、０．０５％トリプシンによって収穫し、ａＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ（ＭＳＣ培地）中に再懸濁し、２００×ｇで５分間スピンダウンした。細胞ペレットをＭＳＣ培地の小体積中に再懸濁し、トリパンブルー排出を用いて生存能について計数した。５００万個のＭＳＣを４つのエッペンドルフチューブのそれぞれの中に置き、スピンダウンし、指示されている培地の各１ｍｌ中に再懸濁した。チューブを低温室に４℃で指示されている期間置いた。ＣＳ：イヌ血清、ＦＢＳ：ウシ胎仔血清。図８は、GS2中の製剤が、血清ありおよびなし両方において、ＭＳＣ細胞生存能を向上させ、ＭＳＣ保存時間を引き伸ばすということを説明している。
図９は、より高い細胞密度（ｍｌあたりの百万細胞で示されている）が、GS2中に保存されたときのＭＳＣ生存能を向上させるということを説明している。血清（ここではＦＢＳ）の存在は、２４時間のGS2中における保存後に細胞生存能に及ぼす効果をほとんど有さないことが見いだされた（矢印）。
図１０は、ＭＳＣ生存能が、４℃におけるGS2中での保存および２６Ｇ針／シリンジからの爾後の排出後に保全されるということを説明している。
例１０：GS2輸送培地の例示的な分析証明書
品質管理の一部として、ヒト患者および／または患畜への使用を意図される対象の輸送培地を、製薬または手術プロセスの一部としての培地の実用性を最大化し、有害反応または事象の可能性を最小化することを意図された、一通りの試験にかける。例えば、エンドトキシンは極めて強力であり、熱安定性であり、大部分の滅菌メンブレンフィルターを通過し、細菌が存在するかまたは存在したあらゆるところに存在する。注射のためのＲＰＥ細胞を製剤するために用いられるときに意図されるように、輸送培地が網膜下腔などへの局所的な送達のために用いられるところでは、エンドトキシンは最大の懸念である。従って、GS2輸送製剤を一通りの試験にかけ、次の基準を満たすことを実証した。
Figure 2022040140000009
 例１１：光遮蔽法による輸送培地の試験
品質管理の一部としてもまた、特にヒト患者への使用のために製剤された細胞の使用のためには、本発明の輸送培地は、一般的に、粒子状物質の許容できない量を含まないであろう。特定の物質は、移動できる溶解していない粒子（すなわち、それらはガス気泡ではない）からなり、これらは、それが表す材料の小ささとその不均質な組成とのために、典型的には化学分析によって定量化され得ない。光遮蔽法（ＵＳＰ７８８試験プロセス）（すなわち、これは電子粒子カウンターの使用によって粒子状物質を計数する）を用いて試験されたときには、本発明の輸送培地製剤は、輸送培地のｍＬあたり２５個未満の粒子≧１０ミクロンサイズと輸送培地のｍＬあたり３個未満の粒子≧２５ミクロンサイズとを有するということが実証された。
ＵＳＰ７８８は、粒子状物質の決定のための手順、方法１（光遮蔽粒子計数試験）および方法２（顕微鏡粒子計数試験）を提供する。可視以下の粒子について輸送培地を検査するときには、方法１が好ましくは適用される。しかしながら、対象の製剤のいくつかの場合においては、光遮蔽粒子計数試験、次に顕微鏡粒子計数試験によって調製物を試験することが、要件への適合性についての結論に到達するために必要であり得る。
全ての非経口調製物がこれらの方法の１つまたは両方によって可視以下の粒子を検査され得るわけではない。方法１が適用可能でないときには、例えば低減した透明性または増大した粘度を有する調製物の場合においては、試験は方法２に従って実行されるべきである。輸送培地がコロイドまたはリポソームをコンポーネントとして包含する場合は、後の例である。同様に、センサーに引き込まれたときに空気またはガス気泡を生じ得る輸送培地の態様でもまた、顕微鏡粒子計数試験を必要とし得る。対象の輸送の現行の好ましい態様は過度に粘着性ではないが、試験されるべき調製物の粘度が、どちらかの試験方法によるその検査を妨げるほどに十分に高い場合には、適切な希釈剤による定量的希釈をして、必要に応じて粘度を減少させて、分析が実施されることも許容され得る。
ＵＳＰ法１．光遮蔽粒子計数試験．ヒアルロン酸コンポーネントありまたはなしのGS2輸送培地のサンプルを、光遮蔽の原理に基づく好適な器具によって試験した。これは、粒子のサイズおよびサイズに従った粒子の数の自動式決定が可能である。器具は、１０μｍおよび２５μｍの間の公知サイズの球状粒子の分散液、ＵＳＰ粒子計数参照標準を用いて校正した。これらの標準粒子は粒子を含まない水中に分散する。分散の間の粒子の凝集を避けるように注意した。粒子状物質試験は、粒子状物質を限定する条件において、すなわち層流（laminar-flow）キャビネット内において実行した。ガラス器具および濾過装置を非常に丁寧に洗浄し、濯いだ。使用の直前に、装置を上から下まで外も中も粒子を含まない水によって濯いだ。分析されようとする輸送培地の統計的に妥当な評価を提供するために適当ないくつもの試験標本を用いて、サンプルを１０ミクロンおよび２５ミクロンに等しいかまたはそれよりも大きい粒子の数について分析した。試験されたGS2輸送培地サンプルのそれぞれについて、サンプルは、輸送培地のｍＬあたりサイズが≧１０ミクロンの≦２５粒子と、輸送培地のｍＬあたりサイズが≧２５ミクロンの≦３粒子とを包含した。
例１２：GS2培地中のＲＰＥ細胞のインビボ生存能および効能の確認
これの目的は、１）BSS PLUS（登録商標）中に製剤され、４時間以内に移植された胚性幹細胞（ＥＳ）株ＭＡ０９に由来するヒト網膜色素上皮（ｈＲＰＥ）細胞、２）BSS PLUS（登録商標）中に製剤されたＥＳ細胞株Ｊ１に由来するｈＲＰＥ細胞、ならびに３）GS2輸送培地中に製剤され、（ａ）２２～２８時間以内および（ｂ）４４～５２時間以内に移植されたＪ１細胞株に由来するｈＲＰＥ細胞の、安全性、生着、ならびに機能性を評価および比較することであった。この研究は、GS2培地が、現行で用いられている臨床製剤培地（BSS-PLUS）と比較して最終製品の品質保持期限を引き伸ばすということを確認する。
合計で３２匹のＲＣＳ（王立外科医師会）若齢ラット（１６匹の雄および１６匹の雌）を研究のために受け取った。ラットは、投与開始において２１～２５日齢の間であった。
馴化期間：最低７日間。第１日は網膜下注射の日に対応する。
実験デザイン：８匹のＲＣＳラット（４／性別）を、それぞれ３つの亜群からなる４つの用量群ＭＡ０９－ｈＲＰＥ（群１）およびＪ１－ｈＲＰＥ（群２、３、４）にランダム化した（下の表１）。全てのラットは、麻酔下において経強膜（transcleral）投与経路によって右眼（ＯＤ）にｈＲＰＥ細胞の網膜下注射を受けた。群１はBSS PLUS（登録商標）中のＭＡ０９－ｈＲＰＥを投与され（４時間以内）、群２はBSS Plus（登録商標）中のＪ１－ｈＲＰＥ細胞を注射され（４時間以内）、群３はGS2中のＪ１－ｈＲＰＥ細胞を注射され（２２～２８時間以内）、群４はGS2中のＪ１－ｈＲＰＥ細胞を注射された（４４～５２時間以内）。亜群は左眼の投薬によって定義される。偽亜群（１／性別）は左眼の網膜下腔への針穿刺のみを受けた。注射なし（ＮＩまたは未処置）亜群（１／性別）は左眼の注射を受けなかった。２つのビークル（vehicle）亜群（２／性別）はGS2またはBSS Plusビークルどちらかの網膜下注射を受けた。ラットは注射後７０～８０日に安楽死させた。
Figure 2022040140000010
ＮＩ＝注射なし 偽＝空のピペットによって網膜下腔を穿刺。
BSS PLUS（登録商標）＝２μＬビークル（細胞なし） GS2＝２μＬビークル（細胞なし）
ｈＲＰＥ＝BSS PLUS（登録商標）またはGS2ビークルの２μＬ中に１００，０００細胞。
実施された評価のための生存中における測定、剖検、および組織病理エンドポイントの概要が下の表２に提示されている。
Figure 2022040140000011
BSS-PLUS（登録商標）をラベリングの通り投与の日に再構成し、製剤の間にＲＰＥ細胞を希釈するための使用のために、ならびに注射器具に充填する術者による使用のために、およびビークル参照物としての使用のために、冷やして保存した（２～８℃）。簡潔には、BSS PLUS（登録商標）ＩＩ液の内容をBSS PLUS（登録商標）Ｉ液に移し、再構成の６時間以内にＲＰＥ細胞を再懸濁するために用いた。再構成および注射の時間を記録し、研究記録に残した。
この研究において用いられるGS2培地ロットを製剤し、２～８℃で保存した。GS2は、製剤の間の細胞を洗浄するためには室温で、ＲＰＥ細胞最終製剤のため、ならびに注射器具を充填する術者による、および注射されるビークル参照物としての使用のためには２～８℃で用いる。
BBS-Plus調製物：凍結保存されたＭＡ０９－ｈＲＰＥおよびＪ１－ｈＲＰＥ細胞を液体窒素（ＬＮ２）中に保存して、細胞を気相中で温度≦１３５℃に維持した。細胞は、プロセシングおよび移植の日までＬＮ２保存で維持した。移植の日に、凍結保存されたｈＲＰＥを融解し、およそ５０，０００個の生存細胞／μＬでBSS-PLUS（登録商標）中に製剤した。濃縮されたｈＲＰＥ細胞は、製剤から４時間以内の使用のために、LabTopクーラー中の氷上に置かれた最終充填チューブによって術者に送達した（図１１、「MA-09 RPE <4h」および「J1 RPE <4h」参照）。再構成および注射の時間を記録し、研究記録に残した。
GS2調製物：凍結保存されたＪ１－ｈＲＰＥは、液体窒素（ＬＮ２）ドライ－中、気相中で温度≦１３５℃において保存した。細胞はプロセシングの日までＬＮ２保存で維持した。移植の１または２日前に、Ｊ１－ｈＲＰＥ細胞を融解し、およそ１，５００個の生存細胞／μＬでGS2中に製剤した。それから、製剤されたＲＰＥを２～８℃で保存し、製剤後の２～６時間後の生存細胞数を評価した。製剤後およそ２０時間または４２時間に、ＲＰＥ細胞はGS2中においておよそ５０，０００個の生存細胞／μＬまで濃縮された。濃縮されたｈＲＰＥ細胞は、LabTopクーラー中の氷上に置かれた最終充填チューブによって術者に送達した。GS2中のＲＰＥ細胞を製剤後約２２時間または４４時間に移植した（図１１、それぞれ「J1 RPE ＜lt;22」および「J1 RPE ＜lt;44」参照）。
用量投与：網膜下注射
動物は、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびデクスメデトミジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のカクテル、次にカルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）によって、ＳＱによって用量投与のために麻酔した。投与前に、眼を注射のための０．９％塩化ナトリウム（無菌ＮａＣｌ）ＵＳＰによって洗い流した。それから、眼を２滴の０．３％Ocuflux眼用溶液ＵＳＰによって消毒し、散瞳点眼薬（１％トロピカミド）、次に２．５％フェニレフリン塩酸塩眼科学用溶液ＵＳＰによって散大させた。BSS PLUS（登録商標）中の試験品ＭＡ０９およびＪ１－ｈＲＰＥ細胞を製剤の０．２５から４時間以内に注射した（群１および２、表１）。GS2中の試験品Ｊ１－ｈＲＰＥ細胞は製剤の２２または４４時間以内であった（群３および４、表１）。試験品は、各群（ＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞またはＪ１－ｈＲＰＥ細胞どちらかを受けた）について、上の実験デザイン（および表１）に指示されているように群あたり８匹の動物の右眼に網膜下注射によって投与した。群１および２のそれぞれの４匹の動物の左眼には参照品BSS PLUS（登録商標）を投与した。群３および４のそれぞれの４匹の動物の左眼には参照品GS2を投与した。４つの群のそれぞれの２匹の動物の左眼は注射手順にかけたが、材料は注射されないであろう（偽注射）。４つの群のそれぞれの残りの２匹の動物の左眼は注射を受けなかった（未処置）。
簡潔には、網膜下注射を、手術用顕微鏡を用いて実施した。眼球の周りの巾着縫合ループを用いて、眼球赤道の後ろで縫合糸（suture）（Ethicon 4-0 Perma-Hand Silk）を用いて眼を安定させた。ヒプロメロース（または類似の）溶液を眼に適用し、リングによって固定した。はさみを用いて結膜の小さいエリアを切り取り、３０Ｇ×１／２”金属針を適用して、眼球の背側の外上側部において強膜切開を実施した。校正した無菌ガラスピペット（World Precision Instruments、品＃１Ｂ１５０－４）からなる投与器具を、およそ０．８ｍｍボアTygon（商標）プラスチック管（Saint-Gobain Performance Plastics ＃Ｒ－３６０３）につなげ、１８Ｇブラント針（Becton-Dickenson, Inc.参照＃３０５１９６）につなげ、研究デザイン（表１）に記載されている適切なビークルを予め充填した２５μＬのHamiltonシリンジ（モデル＃７０２ＬＴカタログ＃８０４０１０につなげた。空気の小量をラインに導入して、注射液を投与器具中のビークルから分離し、その後で試験または参照品を２μＬの体積までガラスピペット中に引き込んだ。新しい無菌ガラスピペットを各注射／眼に用いた。
強膜切開を非吸収性の手術用縫合糸（Ethicon Prolene 10-0）によって縫合した。眼球の周りの縫合糸（Ethicon 4-0 Perma-Hand Silk（登録商標））を除去し、最後に目蓋を正常な位置に返した。外用抗生物質（５ｍｇ／ｇエリスロマイシン眼軟膏）を、注射手順の完了後に、処置された眼に適用した。
手術の間は、気泡（bleb）のサイズおよび場所、ならびにいずれかの他の眼の変化を記録するための丁寧な術中眼底描画。
動物を、完全に回復するまで加温プレート上または加熱ブランケット下に維持し（～３７℃）、その後で、それらをそれらのホームケージに返した。０．５％エリスロマイシン眼軟膏の追加の投与を必要に応じて眼の表面に適用して、動物が完全に覚醒し、正常に瞬きし得るまで乾燥を防止する。
全ての動物は、飲用水によって投与される経口シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）によって維持した（およそ３００ｇ／Ｌの標的血中濃度をもたらす、２１０ｇ／Ｌ）。デキサメタゾンの腹腔内注射もまた術後の１４日間の間に毎日１回であった（１．６ｍｇ／ｋｇ／日）。
少なくとも毎日１回、死亡／瀕死のケージサイド観察および臨床観察をした。体調不良の臨床徴候または処置に対する反応はなかった。動物は、馴化前に少なくとも１回、研究の間にはおよそ毎週、および剖検の直前に体重計測した（死亡時重量）。研究動物の体重の異常な変化は観察されなかった。眼の検査を、投与前、投与後およそ４０日、および再び剖検前に実施した。動物の眼を、１滴／眼として点眼された１％トロピカミドを用いて検査のために散大させた。種々のＲＰＥ製剤群間において眼検査から明らかになる明白な違いはなかった。同じく、視運動性応答（ＯＫＲ）を、様々な空間周波数の動く縞模様を用いて実施した。これは、表２に記載されている時間に全ての動物について測定する。視力を、実験およびコントロールの全ての眼についてＯＫＲによって測定した。用いられるべき方法、検眼試験器具（Prusky et al., 2000）は、垂直な正弦波グレーティングによって被われた回転する円筒からなり、四角に並べた４つのコンピュータモニター上のバーチャル三次元（３Ｄ）空間に提示される。ラットを四角の中心のプラットフォーム上に非拘束的に置き、そこでそれらは頭部反射運動によってグレーティング（grating）を追跡した。「円筒」を試験対象の頭部に対して繰り返し中心合わせすることによって、グレーティングの空間周波数を観察位置にクランプした。視力は、視運動性反射が失われるまで精神物理学の階段進行を用いてグレーティングの空間周波数を増大させることによって定量し、それによって最高の閾値を得た。測定はｃ／ｄ（サイクル／度）で取った。種々のＲＰＥ製剤群間においてＯＫＲ実験から明らかになる明らかな違いはなかった。スペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）もまた上のように実施され、種々のＲＰＥ製剤群間において眼検査から明らかになる明らかな違いはなかった。ラットを麻酔薬のＩＰ注射によって麻酔した。トロピカミドを両眼に適用して、網膜のより良好なイメージングのために瞳孔を散大させた。ラットをイメージングシステム内に置き、GentealおよびSystaneの点眼液を角膜に適用して、角膜を湿潤に保った。
図１１は、ラットの１６匹の群について、処置後６０日の網膜電図（ＥＲＧ）の結果を示している。上のように、種々のＲＰＥ製剤群間においてＥＲＧ検査から明らかになる明白な違いはなかった。簡潔には、動物を完全な暗所に一晩（少なくとも１２時間）保って、網膜の暗順応した状態を達成した。ＥＲＧを記録するために、動物を麻酔薬のＩＰ注射によって麻酔し、定位頭部ホルダーに置いた。赤色の暗い照明下において、記録電極（中性コンタクトレンズに取り付けられた２つの共軸のワイヤーループ、ワイヤー直径５０ｕｍ）をリドカインによって前処置された動物の眼に置いた。１つの後肢を電気バリカンによって剃毛し、カニューレを挿入する前にベタダイン（betadyne）によって皮膚をプレップした（カニューレは手順の持続期間の間は後肢筋に埋め込む）。瞳孔をトロピカミドによって散大させた。記録を始める前に、暗順応の追加の１時間期間を用いて、動物の準備後の順応を復活させた。全体のＥＲＧ記録は両眼で約２０分間続ける（眼は一連に左～右、または右から左で試験する）。眼を全視野光の閃光によって刺激した。角膜電位は、電極につないだアンプによって記録した。閃光提示はコンピュータプログラムによってコントロールした。応答は、ＥＲＧ強度に依存して５～１００の刺激提示について平均した。これは進行性網膜変性を有する動物では非常に低くなり得る。
概要として、これらの研究の結果は、GS2輸送培地が、４時間未満の懸濁後のBSS Plus培地と比較したときに、GS2輸送培地による懸濁の４４時間までの後でさえも、機能的な生存ＲＰＥ細胞のおよそ等しく有効な用量を提供するということを示している。後者は、ＲＰＥ細胞注射のためのBSS-Plusの使用について現行でＦＤＡおよびＥＭＡによって承認された品質保持期限である。各ケースにおいて、コントロールとして、動物の偽および未処置の眼は、BSS-PlusおよびGS2輸送培地群のＲＰＥ細胞によって処置された眼と比較して全く改善を示さなかった。
均等物および範囲、参照による組み込み
当業者は、本明細書に記載される態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例の実験法を用いて確かめることができるであろう。本開示の範囲は上の記載に限定されることを意図されず、むしろ添付の請求項に示されている通りである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、文脈が明瞭に別様に指示しない限り単数形および複数形の言及を包含する。それゆえに、例えば、「薬剤」の言及は単一の薬剤および複数のかかる薬剤を包含する。
群の２つ以上の構成要素の間に「または」を包含する請求項または記載は、群構成要素の１つ、１つよりも多く、または全てが存在する場合には、反対に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、満足していると考えられる。２つ以上の群構成要素の間に「または」を包含する群の開示は、群の厳密に１つの構成要素が存在する態様、群の１つの構成要素よりも多くが存在する態様、および群構成要素の全てが存在する態様を提供する。簡潔の目的のために、それらの態様は本明細書に個々に書き出さなかったが、それらの態様のそれぞれは本明細書によって提供され、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。
本発明が、請求項の１つ以上からのまたは明細書の１つ以上の該当箇所からの１つ以上の限定、要素、項目、または記述用語が別の請求項中に導入される全ての変形、組み合わせ、および入れ替えを包摂するということが理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属するある請求項は、同じ被引用請求項に従属するいずれかの他の請求項に見いだされる限定の１つ以上を包含するように改変され得る。さらにその上に、請求項が組成物を記載しているところでは、別様に指示されない限り、または矛盾もしくは不一致が来されるであろうということが当業者にとって明白でない限り、本明細書において開示される作るかもしくは用いる方法のいずれかに従ってまたは何らかの当分野において公知の方法に従って組成物を作るかまたは用いる方法が包含されるということが理解されるべきである。
要素がリストとして、例えばマーカッシュ群フォーマットで提示されるところでは、要素のあらゆる可能な亜群もまた開示されているということと、いずれかの要素または要素の亜群が群から除去され得るということとが理解されるべきである。用語「含む」は開放的であることを意図され、追加の要素またはステップの包含を許容するということもまた留意される。一般的に、ある態様、製品、または方法が特定の要素、特徴、またはステップを含むと言われるところでは、かかる要素、特徴、またはステップからなるかまたは本質的になる態様、製品、または方法が同じく提供されるということが理解されるべきである。簡潔の目的のために、それらの態様は本明細書に個々に書き出さなかったが、それらの態様のそれぞれは本明細書によって提供され、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上に、別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は、いくつかの態様においては、文脈が明瞭に別様に述べていない限り、書かれた範囲内のいずれかの具体的な値を範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということが理解されるべきである。簡潔の目的のために、各範囲内の値は本明細書に個々に書き出さなかったが、それらの値のそれぞれは本明細書によって提供され、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現された値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとることができ、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ正確度まで表現されるということもまた理解されるであろう。
加えて、本発明のいずれかの特定の態様が請求項のいずれか１つ以上からはっきりと排除され得るということは理解されるべきである。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値は請求項のいずれか１つ以上からはっきりと排除され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、適用、または側面はいずれか１つ以上の請求項から排除され得る。簡潔の目的のために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が排除された態様の全てが本明細書にはっきりと示されてはいない。
本明細書において、例えば背景技術、発明の概要、詳細な説明、例、および／または参照の項において挙げられている全ての刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリー（例えば配列データベースエントリー）は、各個々の刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリーが参照によって本明細書に具体的かつ個々に組み込まれた場合のように、それらの全体が参照によってここに組み込まれる。相反のケースにおいては、本願のいずれかの定義を包含して、本願がコントロールする。

Claims (42)

  1. 溶液であって、
    （ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤；および
    （ｂ）少なくとも２ｍＭまたは少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）グルコース；および
    （ｃ）溶液を生理的浸透圧に維持する、浸透圧剤、
    を含む、前記溶液。
  2. 溶液が、少なくとも５ｍＭもしくは少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）グルコース；または少なくとも７．５ｍＭもしくは少なくとも０．１４％（ｗ／ｖ）グルコース；または少なくとも１０ｍＭもしくは少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）グルコース；または少なくとも１５ｍＭもしくは少なくとも０．２５％（ｗ／ｖ）グルコース；または少なくとも２０ｍＭもしくは少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）グルコース；または少なくとも２５ｍＭもしくは少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを含む、請求項１に記載の溶液。
  3. 溶液がさらに、
    （ａ）二価カチオン源、任意にここで、前記二価カチオン源はカルシウムおよび／またはマグネシウム源を含む、および／または
    （ｂ）酢酸塩緩衝剤および／またはクエン酸塩緩衝剤、
    を含む、請求項１または２に記載の溶液。
  4. 溶液であって、
    （ａ）溶液を生理的ｐＨに維持する緩衝剤、ここで緩衝剤は二炭酸塩緩衝剤ではない；および
    （ｂ）グルコース；および
    （ｃ）溶液を生理的浸透圧に維持する、浸透圧剤；および
    （ｄ）二価カチオン源、
    を含み、任意にここで、二価カチオン源がカルシウム源および／またはマグネシウム源を含み、および／またはここで、緩衝剤が酢酸塩緩衝剤および／またはクエン酸塩緩衝剤を含む、前記溶液。
  5. カルシウム源が、薬学的に許容し得るカルシウム塩を含み、および／またはマグネシウム源が、薬学的に許容し得るマグネシウム塩を含む、請求項３または４に記載の溶液。
  6. 薬学的に許容し得るカルシウム塩および／または薬学的に許容し得るマグネシウム塩が、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、塩酸、マレイン酸、シュウ酸、リン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸を含む群から選択される酸と形成されるカルシウム塩および／またはマグネシウム塩の群から選択される、請求項５に記載の溶液。
  7. カルシウム源が塩化カルシウムを含み、任意にここで、カルシウム源が塩化カルシウム二水和物を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の溶液。
  8. マグネシウム源が塩化マグネシウムを含み、任意にここで、マグネシウム源が塩化マグネシウム六水和物を含む、請求項３～７のいずれか一項に記載の溶液。
  9. クエン酸塩緩衝剤が、クエン酸ナトリウムとして提供される、請求項３～９のいずれか一項に記載の溶液。
  10. グルコースが、Ｄ－グルコース（デキストロース）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の溶液。
  11. 浸透圧剤が塩であり、任意にここで、浸透圧剤がナトリウム塩であり、さらに任意にここで、浸透圧剤が塩化ナトリウムである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の溶液。
  12. 溶液が、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびグルコースを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の溶液。
  13. 溶液のｐＨが、６．８～７．８、または７．４～７．５、または約７．５である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の溶液。
  14. 溶液が等張または高張である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の溶液。
  15. 溶液が、約２７０～３４５ｍＯｓｍ／ｌまたは約３１５ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧を示す、請求項１～１４のいずれか一項に記載の溶液。
  16. カルシウム源の濃度が、
    （ａ）０．２５～０．７５ｍＭ、もしくは０．４～０．６５ｍＭ、もしくは０．５～０．６ｍＭ、もしくは約０．６ｍＭ；または
    （ｂ）０．５～０．９ｍＭ、もしくは０．６～０．８ｍＭ、もしくは約０．７ｍＭである、請求項３～１５のいずれか一項に記載の溶液。
  17. マグネシウム源の濃度が、０．０５～５ｍＭ、または０．１～０．３ｍＭ、または約０．３ｍＭである、請求項３～１６のいずれか一項に記載の溶液。
  18. グルコースの濃度が、５～５０ｍＭ、または１０～２５ｍＭ、または１０～２０ｍＭ、または約１６ｍＭである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の溶液。
  19. 浸透圧剤の濃度が、約１００～２００ｍＭ、または約１２５～１７５ｍＭ、または約１５０ｍＭである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の溶液。
  20. クエン酸塩または酢酸塩の濃度が、０．１～５ｍＭ、または０．５～２ｍＭ、または約１ｍＭである、請求項３～１９のいずれか一項に記載の溶液。
  21. 溶液がさらにカリウム塩を含み、任意にここで、カリウム塩が塩化カリウムであり、さらに任意にここで、ＫＣｌの濃度が０．２～５ｍＭ、または１～２．５ｍＭ、または約２ｍＭである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の溶液。
  22. 溶液が、
    （ａ）約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭのデキストロース、および約１４５ｍＭのＮａＣｌ、または
    （ｂ）約０．５～０．９ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～０．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約０．８～１．２ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭのデキストロース、および約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌ、または
    （ｃ）約０．８５％のＮａＣｌ、約０．０１％のＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００６％のＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０３５％のクエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２９％のデキストロース、または
    （ｄ）約０．６８～１．０２％のＮａＣｌ、約０．００８～０．０１２％のＣａＣｌ二水和物（塩化カルシウム二水和物）、約０．００４８～０．００７２％のＭｇＣｌ六水和物（塩化マグネシウム六水和物）、約０．０２８～０．０４２％のクエン酸ナトリウム二水和物、および約０．２３～０．３５％のデキストロース、
    を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の溶液。
  23. 溶液がさらに、
    （ａ）約２ｍＭのＫＣｌ、および／または
    （ｂ）粘弾性ポリマー、任意にここで、前記ポリマーはヒアルロン酸またはその塩もしくは溶媒和物であり、さらに任意にここで、前記ポリマーはヒアルロン酸ナトリウムである、
    を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の溶液。
  24. ポリマーが、溶液中の細胞の、剪断応力への曝露を低減するのに有効な濃度で存在し、任意にここで、ポリマーの濃度が０．００５～５％ｗ／ｖまたは約０．０５％ｗ／ｖである、請求項２３に記載の溶液。
  25. 溶液が、
    （ａ）約０．７ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．３ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約２ｍＭのＫＣｌ、約１ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１６ｍＭのデキストロース、約１４５ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０５％のヒアルロン酸、または
    （ｂ）約０．５～０．８ｍＭのＣａＣｌ（塩化カルシウム）、約０．２～０．４ｍＭのＭｇＣｌ（塩化マグネシウム）、約１．６～２．４ｍＭのＫＣｌ、約０．８～１．２ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１３～１９ｍＭのデキストロース、約１１６～１７４ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０４～０．０６％のヒアルロン酸、
    を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の溶液。
  26. 溶液が、
    （ａ）炭酸塩緩衝剤、および／または
    （ｂ）グルタチオン、またはグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、および／または
    （ｃ）双性イオン有機緩衝剤、
    を含まない、請求項１～２５のいずれか一項に記載の溶液。
  27. 溶液が、
    （ａ）少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月、２５℃で、溶質の測定可能な沈殿および／または溶液中に保存された細胞の生残および生存能をサポートする溶液の能力の測定可能な損失なしに保存され得る、
    および／または
    （ｂ）少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月、２～８℃で、溶質の測定可能な沈殿および／または溶液中に保存された細胞の生残および生存能をサポートする溶液の能力の測定可能な損失なしに保存され得る、
    請求項１～２６のいずれか一項に記載の溶液。
  28. 溶液が、
    （ａ）対象への投与に適している、対象の眼への投与に適している、および／または細胞を対象の眼に移植するのに適している、および／または
    （ｂ）実質的に発熱物質を含まない、および／または
    （ｃ）滅菌されている、および／または
    （ｄ）灌流、細胞再構成、細胞保存、細胞輸送、および／または対象への投与のためのものである、
    請求項１～２７のいずれか一項に記載の溶液。
  29. 調製物であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液中の細胞集団を含み、任意にここで、細胞集団が、
    （ａ）対象への移植に適しており、さらに任意にここで、対象の眼への移植に適しており、および／または
    （ｂ）ＲＰＥ細胞を含み、および／または
    （ｃ）光受容体細胞を含み、および／または
    （ｄ）間葉系細胞を含む、
    前記調製物。
  30. 調製物が冷蔵されており、任意にここで、調製物が約２～８℃で冷蔵されている、請求項２９に記載の調製物。
  31. 調製物が、調製物の保存中の細胞集団における細胞の生残をサポートし、ここで細胞集団中の細胞の少なくとも７０％が、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能であり、
    任意にここで、細胞集団中の細胞の少なくとも８０％が、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能であり、または
    ここで、細胞集団中の細胞の少なくとも９０％が、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に生存可能である、
    請求項２９または３０に記載の調製物。
  32. 調製物が、調製物の保存中の細胞集団の播種効率の維持をサポートし、ここで細胞集団が、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に元の播種効率の少なくとも７０％を示し、ここで元の播種効率は、保存期間開始時の細胞集団の播種効率であり、
    任意にここで、細胞集団が、２～８℃における調製物の保存の４８時間後に元の播種効率の少なくとも８０％を示し、または
    ここで、細胞集団が、元の播種効率の少なくとも９０％を示す、
    請求項２９～３１のいずれか一項に記載の調製物。
  33. 調製物が、
    （ａ）貯蔵容器、および／または
    （ｂ）シリンジ、
    の中にある、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の調製物。
  34. 請求項２９～３３のいずれか一項に記載の調製物を調製する方法であって、方法が、細胞集団を請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液と接触させることを含み、任意にここで、方法が、凍結保存またはペレット化された細胞の集団を請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液と接触させて、細胞を再構成することを含む、前記方法。
  35. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液または請求項２９～３３のいずれか一項に記載の調製物を含む医薬組成物であって、対象への投与に適している、前記医薬組成物。
  36. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液、または請求項２９～３３のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３５に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法であって、任意にここで、方法が、溶液または調製物を対象の眼に投与することを含み、さらに任意にここで、方法が、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間の調製物の保存の後に、調製物を対象に投与することを含む、前記方法。
  37. 対象が、網膜疾患を有するか、または網膜疾患と診断され、任意にここで、網膜疾患が、桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、またはシュタルガルト病である、請求項３６に記載の方法。
  38. 調製物が、対象における網膜疾患の少なくとも１つの症状を軽減するのに有効なサイズの細胞集団を含み、任意にここで、方法がさらに、対象における網膜疾患の少なくとも１つの症状をモニタリングすることを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 方法であって、
    （ａ）細胞集団を請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液と接触させて、細胞調製物を生成することを含み、任意にさらに、
    （ｂ）（ａ）の細胞調製物を、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、または少なくとも７２時間保存することを含み、任意にさらに、
    （ｃ）（ａ）の細胞調製物を、（ｂ）の保存期間の後に対象に投与することを含み、任意にここで、投与することが、細胞を対象の眼に注入することを含む、
    前記方法。
  40. 方法がさらに、
    （ｉ）（ａ）の細胞調製物における細胞生存能を、（ｂ）の保存期間の後に決定すること、および／または
    （ｉｉ）（ａ）の細胞調製物を、ステップ（ｂ）の保存期間中に冷蔵すること、任意にここで、冷蔵することが、細胞調製物を２～８℃の温度において保存することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 網膜疾患を処置するための方法であって、方法が、
    請求項２９～３３のいずれか一項に記載の調製物、または請求項３５に記載の医薬組成物の有効量を、網膜疾患を有する対象の眼に投与することを含み、任意にここで、網膜疾患が、桿体もしくは錐体ジストロフィー、網膜変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、またはシュタルガルト病である、前記方法。
  42. キットであって、
    （ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の溶液；
    （ｂ）細胞集団を（ａ）の溶液と接触させて細胞調製物を生成するための、説明書；および
    （ｃ）（ｂ）の接触のためのおよび／または（ｂ）の細胞調製物を保存するための容器、任意にここで、（ａ）の溶液および容器が、対象への移植のための（ｂ）の細胞調製物の使用に好適である、
    を含む、前記キット。
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