CN103783031B - 一种细胞保存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞保存液，它包含如下成分：NaCl？120~137mM、KCl？2.2~2.8mM、柠檬酸钠3~9mM、葡萄糖15~20mM、CaCl2？0.6~1.2mM、1.5~3.5%（w/v）白蛋白、0.3~0.8%（w/v）氨基酸和0.015~0.035%（w/v）维生素。本发明还公开了一种细胞保存液的制备方法以及细胞的保存方法。本发明细胞保存液安全，能长时间维持细胞的活率，成本低廉，具有良好的应用前景和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞保存液。
背景技术
细胞，是生命最基本的单位，在很多方面均具有应用价值。干细胞(stemcells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞(StemCell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。间充质干细胞【mesenchymalstemcells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
与普通的生物制品和药品不同，细胞制品中，维持细胞活性是一个极大的挑战。生理盐水作为常用的输注介质，在临床应用上方便安全，但是细胞在生理盐水中活性的下降速度非常快，10小时之内细胞的活性丧失就达到30％之多，因此只适合细胞短暂保存，即时输注。血浆可以较好的维持细胞活性，但是，血浆中含有大量未知成分，异体输注存在安全隐患，同体输注则成本极高。
申请号：200510112642.1，发明名称：“细胞保存液及其调制方法、细胞保存方法、细胞培养方法”的专利申请公开了不含血浆的细胞保存液，如，由葡萄糖5.5mM、钠离子143.8mM、钾离子5.4mM、碳酸氢根离子和/或碳酸根离子23.7mM、钙离子1.8mM、镁离子0.8mM、氯化物离子130.8mM、磷酸根离子1.0mM、硫酸根离子0.8mM和纯水组成的保存液1；由甘露醇5.5mM、钠离子143.8mM、钾离子5.4mM、碳酸氢根离子和/或碳酸根离子23.7mM、钙离子1.8mM、镁离子0.8mM、氯化物离子130.8mM、磷酸根离子1.0mM、硫酸根离子0.8mM和纯水组成的保存液2。用通常作为细胞保存液的磷酸缓冲液和生理盐水（含有2.5%v/v人白蛋白）与前述保存液1和保存液2保存细胞4天后，细胞存活率分别为26.9%、11.9%、73.6%和39.8%。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了另一种不含血浆的细胞保存液，以及该保存液的制备方法和细胞的保存方法。
本发明细胞保存液，它包含如下成分：NaCl120~137mM、KCl2.2~2.8mM、柠檬酸钠3~9mM、葡萄糖15~20mM、CaCl20.6~1.2mM、1.5~3.5%（w/v）白蛋白、0.3~0.8%（w/v）氨基酸和0.015~0.035%（w/v）维生素。
本发明所述维生素是指市售的注射用水溶性维生素，含有如下重量配比的组分：维生素B13.0份；维生素B23.6份；烟酰胺40份；维生素B64.0份；泛酸15份；维生素C100份；生物素60×10-3份；叶酸0.4份；维生素B125.0×10-3份；甘氨酸300份；乙二胺四乙酸二钠0.5份；对羟基苯甲酸甲酯0.5份。
优选地，它包含如下成分：NaCl125~132mM、KCl2.4~2.6mM、柠檬酸钠5~7mM、葡萄糖16.5~18.5mM、CaCl20.8~1.0mM、2.0~3.0%（w/v）白蛋白、0.4~0.6%（w/v）氨基酸和0.02~0.03%（w/v）维生素。
进一步优选地，它包含如下成分：NaCl128mM、KCl2.5mM、柠檬酸钠6mM、葡萄糖17.5mM、CaCl20.9mM、2.5%（w/v）白蛋白、0.5%（w/v）氨基酸和0.025%（w/v）维生素。
所述细胞保存液还还包含15~25mM甘露醇。优选地，所述甘露醇的浓度为18~22mM。进一步优选地，所述甘露醇的浓度为20mM。
所述保存液的pH为7.0~7.4，渗透压为280~320mOsm/L。
本发明保存液的制备方法，它包括如下步骤：
（1）取前述配比的原料；
（2）将步骤（1）的原料配制成溶液，灭菌，即可。
本发明细胞保存方法，它是采用前述细胞保存液保存。优选地，所述细胞为干细胞，细胞的浓度为1×105~1×108个/ml。进一步优选地，所述干细胞为间充质干细胞。
本发明提供了一种新的不含血浆的细胞保存液，特别是干细胞保存液，既可以很好地维持细胞活率及干细胞增殖活性，又不会导致细胞变异，其细胞保存效果与现有无血浆细胞保存液相当，而本发明优选的技术方案，保存细胞的效果显著优于现有无血浆保存液。
本发明细胞保存液安全，有效期长，制备方法简单，成本低廉，为细胞保存提供了一种新的选择，具有良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1细胞存活率统计结果；
图2细胞增殖活性统计结果；
图34℃保护液保存5天后培养细胞的流式分析。
具体实施方式
NaCl，购自成都科龙化工；
KCl，购自成都科龙化工；
柠檬酸钠，购自成都科龙化工；
葡萄糖，购自成都科龙化工；
甘露醇，购自河北华旭药业有限责任公司
CaCl2，购自成都科龙化工
白蛋白，购自成都蓉生制药
氨基酸，购自成都科龙化工
维生素（注射用水溶性维生素），购自成都天台山制药有限公司。
实施例1用本发明细胞保存液的制备
取NaCl7.020g、KCl0.164g、柠檬酸钠0.774g、葡萄糖2.700g、CaCl20.066g、白蛋白15.000g、氨基酸3.000g、维生素0.150g，溶于1000ml水；
制成NaCl120mM、KCl2.2mM、柠檬酸钠3mM、葡萄糖15mM、CaCl20.6mM、1.5%（w/v）白蛋白、0.3%（w/v）氨基酸和0.015%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例2用本发明细胞保存液的制备
取NaCl7.020g、KCl0.164g、柠檬酸钠0.774g、葡萄糖2.700g、甘露醇2.730g、CaCl20.066g、白蛋白15.000g、氨基酸3.000g、维生素0.150g，溶于1000ml水；
制成NaCl120mM、KCl2.2mM、柠檬酸钠3mM、葡萄糖15mM、甘露醇15mM、CaCl20.6mM、1.5%（w/v）白蛋白、0.3%（w/v）氨基酸和0.015%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例3用本发明细胞保存液的制备
取NaCl8.014g、KCl0.209g、柠檬酸钠2.322g、葡萄糖3.600g、CaCl20.133g、白蛋白35.000g、氨基酸8.000g、维生素0.350g，溶于1000ml水；
制成NaCl137mM、KCl2.8mM、柠檬酸钠9mM、葡萄糖20mM、CaCl21.2mM、3.5%（w/v）白蛋白、0.8%（w/v）氨基酸和0.035%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例4用本发明细胞保存液的制备
取NaCl8.014g、KCl0.209g、柠檬酸钠2.322g、葡萄糖3.600g、甘露醇4.550g、CaCl20.133g、白蛋白35.000g、氨基酸8.000g、维生素0.350g，溶于1000ml水；
制成NaCl137mM、KCl2.8mM、柠檬酸钠9mM、葡萄糖20mM、甘露醇25mM、CaCl21.2mM、3.5%（w/v）白蛋白、0.8%（w/v）氨基酸和0.035%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例5用本发明细胞保存液的制备
取NaCl7.312g、KCl0.179g、柠檬酸钠1.290g、葡萄糖2.970g、CaCl20.089g、白蛋白20.000g、氨基酸4.000g、维生素0.200g，溶于1000ml水；
制成NaCl125mM、KCl2.4mM、柠檬酸钠5mM、葡萄糖16.5mM、CaCl20.8mM、2.0%（w/v）白蛋白、0.4%（w/v）氨基酸和0.02%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例6用本发明细胞保存液的制备
取NaCl7.312g、KCl0.179g、柠檬酸钠1.290g、葡萄糖2.970g、甘露醇3.276g、CaCl20.089g、白蛋白20.000g、氨基酸4.000g、维生素0.200g，溶于1000ml水；
制成NaCl125mM、KCl2.4mM、柠檬酸钠5mM、葡萄糖16.5mM、甘露醇18mM、CaCl20.8mM、2.0%（w/v）白蛋白、0.4%（w/v）氨基酸和0.02%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例7用本发明细胞保存液的制备
取NaCl7.722g、KCl0.194g、柠檬酸钠1.806g、葡萄糖3.330g、CaCl20.111g、白蛋白30.000g、氨基酸6.000g、维生素0.300g，溶于1000ml水；
制成NaCl132mM、KCl2.6mM、柠檬酸钠7mM、葡萄糖18.5mM、CaCl21.0mM、3.0%（w/v）白蛋白、0.6%（w/v）氨基酸和0.03%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例8用本发明细胞保存液的制备
取NaCl7.722g、KCl0.194g、柠檬酸钠1.806g、葡萄糖3.330g、甘露醇4.004g、CaCl20.111g、白蛋白30.000g、氨基酸6.000g、维生素0.300g，溶于1000ml水；
制成NaCl132mM、KCl2.6mM、柠檬酸钠7mM、葡萄糖18.5mM、甘露醇22mM、CaCl21.0mM、3.0%（w/v）白蛋白、0.6%（w/v）氨基酸和0.03%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例9用本发明细胞保存液的制备
NaCl7.488g、KCl0.186g、柠檬酸钠1.548g、葡萄糖3.150g、CaCl20.100g、白蛋白25.000g、氨基酸5.000g、维生素0.250g，溶于1000ml水；
制成NaCl128mM、KCl2.5mM、柠檬酸钠6mM、葡萄糖17.5mM、CaCl20.9mM、2.5%（w/v）白蛋白、0.5%（w/v）氨基酸、0.025%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
实施例10用本发明细胞保存液的制备
NaCl7.488g、KCl0.186g、柠檬酸钠1.548g、葡萄糖3.150g、甘露醇3.640g、CaCl20.100g、白蛋白25.000g、氨基酸5.000g、维生素0.250g，溶于1000ml水；
制成NaCl128mM、KCl2.5mM、柠檬酸钠6mM、葡萄糖17.5mM、甘露醇20mM、CaCl20.9mM、2.5%（w/v）白蛋白、0.5%（w/v）氨基酸、0.025%（w/v）维生素的溶液，即为本发明细胞保存液。
经检测，该保存液的pH在7.0~7.4范围内，渗透压在280~320mOsm/L范围内。
以下用实验例说明本发明有益效果：
实验例1本发明细胞保存液的保存效果
1、实验材料
实施例10制备的保存液：本发明细胞保存液（含甘露醇）；
实施例9制备的保存液：本发明细胞保存液（不含甘露醇）；
间充质干细胞（MSC细胞）：用镊子夹出脐带，放置于90mm玻璃平皿中，剪下一段长约10cm的脐带,倒入一定量的生理盐水，漂洗脐带，将表面血污洗去。用眼科剪将脐带剪至约1.5cm的小段并剖开，漂洗清除血管内血污，将脐带转入另一干净平皿中。倒入一定量的生理盐水，再次漂洗脐带；重复漂洗2-3次，除净血污。准备4-6个直径100mm塑料培养皿并标记，每皿中放入1段1.5cm长的脐带（多余的脐带组织丢弃）并加入2ml培养基（DMEM/F12+10%FBS）。用眼科剪将脐带剪碎成肉糜状（2-3mm3的颗粒）。用剪刀将脐带碎块均匀的平铺在平皿上。将培养皿置于37℃，5%CO2培养箱中培养。（移动培养皿时，勿使组织碎块晃动）培养24小时后补加8ml培养基；培养至第7天时进行半量换液，之后每3天进行半量换液。第10天观察细胞爬出情况，直至2个以上的皿中，10个细胞以上克隆数≥4，即可去除全部组织块；待平均汇合度达30-50%左右时进行传代，经检测，得到MSC细胞。连续传代三代后，将P3代MSC细胞消化冻存至液氮中待用。
2、实验方法
取出液氮保存的P3代MSC细胞1×107个/ml，在37℃水浴下解冻细胞，并立即添加5倍体积的生理盐水，混合均匀；
室温下500g离心5min，移去上清后用5ml生理盐水重悬细胞并用血球计数板计数，将细胞按照2×106个/管分置于2个15ml离心管中，离心去除培养基后分别用1ml本发明保存液重悬细胞，置于4℃冰箱保存。
（1）保存液细胞存活状态检测方法
在24h，48h，72h，96h，120h分别取细胞用台盼蓝染色，并在显微镜下计数观察活细胞的数量。
（2）保护液细胞增殖活性检测方法
在第0h,24h,48h,72h,96h,120h分别取4℃保存的本发明保存液和对照组保存液细胞2×105接种于60mm细胞培养皿中（每个皿5ml培养基：DMEM/F12+10%FBS），37℃5%CO2培养72h后消化细胞计数。
（3）细胞表面标记的检测
取保存120h后的细胞，以PE标记的CD105，FITC标记的CD90、CD45、HLA-DR抗体标记细胞，进行流式检测。
3、实验结果
（1）细胞存活状态细胞存活状态结果如图1和表1所示：
表1细胞存活状态
| Day | 本发明细胞保存液（含甘露醇） | SD | 本发明细胞保存液（不含甘露醇） | SD |
| 1 | 97.50%* | 1.60% | 93.38% | 2.09% |
| 2 | 93.79%* | 1.49% | 87.21% | 3.44% |
| 3 | 89.83%* | 3.53% | 76.25% | 9.12% |
| 4 | 86.21%* | 3.03% | 65.67% | 7.46% |
| 5 | 82.42%* | 3.69% | 58.21% | 8.73% |
注：*表示与本发明保存液（不含甘露醇）相比，存在显著差异。国家标准规定，间充质干细胞注射液中的细胞活率不得低于85%。
由图1和表1可以看出：
1、本发明含甘露醇的细胞保存液保存细胞4天后，细胞活率高达86.21%，其有效期大于4天，保存效果显著优于现有无血浆细胞保存液；本发明含甘露醇的细胞保存液保存细胞，细胞活率下降慢，平均下降率仅为3.516%/天；
2、本发明不含甘露醇的细胞保存液保存细胞4天后，细胞活率为65.67%，保存效果与现有无血浆细胞保存液相当；本发明不含甘露醇的细胞保存液保存细胞2天后，细胞活率高达87.21%，其有效期大于2天；本发明不含甘露醇的细胞保存液保存细胞，细胞活率平均下降率为8.358%/天；
实验结果说明，本发明细胞保存液可长时间维持细胞活性，细胞活率下降慢，保存效果至少与现有无血浆细胞保存液相当，其中，优选地含有甘露醇的细胞保存液，其保存效果显著优于现有无血浆细胞保存液。
（2）增殖活性检测方法
细胞存活状态结果如图2和表2所示：
表2细胞增殖活性
| Day | 本发明保存液（含甘露醇） | SD | 本发明保存液（不含甘露醇） | SD |
| 1 | 83.49%* | 3.57% | 70.85% | 7.32% |
| 2 | 79.20%* | 2.94% | 53.72% | 6.11% |
| 3 | 73.24%* | 4.87% | 30.05% | 8.78% |
| 4 | 65.09%* | 11.78% | 21.54% | 9.86% |
| 5 | 58.32%* | 10.77% | 17.02% | 1.89% |
注：*表示与本发明保存液（不含甘露醇）相比，存在显著差异。
由图2和表2可知，用本发明细胞保存液保存细胞，细胞增殖活性下降慢，可长时间维持细胞增殖活性，其中，含有甘露醇的细胞保存液显著优于不含甘露醇的细胞保存液。
（3）细胞表面标记的检测
实验结果如图3所示，细胞表面标志CD90和CD105表达为阳性，CD45和HLA-DR表达为阴性，符合MSCs表面标志的特征，说明用本发明保存液保存细胞，细胞不会发生变异。
实验结果说明，本发明细胞保存液用于保存细胞，细胞活率高、增殖活性强，不会导致细胞变异。
综上，本发明细胞保存液不含血浆等存在安全隐患的成分，可以长时间维持细胞活率和细胞增殖活率，不会导致细胞变异，是一种新的安全有效，制备方法简单，成本低廉的细胞保存液，具有良好的工业应用前景。
Claims (10)
1.一种细胞保存液，其特征在于：它包含如下成分：NaCl120～137mM、KCl2.2～2.8mM、柠檬酸钠3～9mM、葡萄糖15～20mM、CaCl20.6～1.2mM、1.5～3.5％(w/v)白蛋白、0.3～0.8％(w/v)氨基酸和0.015～0.035％(w/v)维生素；
其还包含15～25mM甘露醇。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于：它包含如下成分：NaCl125～132mM、KCl2.4～2.6mM、柠檬酸钠5～7mM、葡萄糖16.5～18.5mM、CaCl20.8～1.0mM、2.0～3.0％(w/v)白蛋白、0.4～0.6％(w/v)氨基酸和0.02～0.03％(w/v)维生素。
3.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于：它包含如下成分：NaCl128mM、KCl2.5mM、柠檬酸钠6mM、葡萄糖17.5mM、CaCl20.9mM、2.5％(w/v)白蛋白、0.5％(w/v)氨基酸和0.025％(w/v)维生素。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于：所述甘露醇的浓度为18～22mM。
5.根据权利要求4所述的保存液，其特征在于：所述甘露醇的浓度为20mM。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的保存液，其特征在于：其pH为7.0～7.4，渗透压为280～320mOsm/L。
7.权利要求1～6任意一项所述保存液的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)取权利要求1～6任意一项所述配比的原料；
(2)将步骤(1)的原料配制成溶液，灭菌，即可。
8.一种细胞保存方法，其特征在于：它是采用权利要求1～6任意一项所述细胞保存液保存。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于：所述细胞为干细胞，细胞的浓度为1×105～1×108个/ml。
10.根据权利要求9所述的保存方法，其特征在于：所述干细胞为间充质干细胞。
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