CN106620681A

CN106620681A - 一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载dc肿瘤疫苗中的应用

Info

Publication number: CN106620681A
Application number: CN201710022928.3A
Authority: CN
Inventors: 胡攀勇; 陈曦
Original assignee: Nanjing Bai Tektronix Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bai Tektronix Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2017-05-10

Abstract

本发明公开了一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用，肿瘤细胞裂解液包括缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解细胞膜成分选自化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯。本发明化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯可温和诱导肿瘤细胞细胞膜破裂，不破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象，用其配置的肿瘤细胞裂解液能最大限度保持裂解物的抗原性，将DC与用上述裂解液裂解的肿瘤细胞裂解物共同培养得到的裂解物致敏DC疫苗具有优异的抗肿瘤效果，并与现有技术常用的冻溶裂解法进行了比较，结果本发明肿瘤细胞裂解液显著优于传统裂解液，对肿瘤的预防、治疗效果与冻溶裂解接近。

Description

一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫领域，涉及肿瘤细胞裂解液，具体涉及一种细胞裂解液、裂解试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用。

背景技术

免疫治疗是手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方式，在肿瘤的综合治疗模式中，免疫治疗在提高肿瘤治愈率、改善患者生活质量、延长生存期方面起重要作用。在肿瘤免疫中，T淋巴细胞识别的肿瘤抗原不是被肿瘤细胞提呈，而是被抗原提呈细胞提呈。树突状细胞(DC)是人体内目前已知功能最强大、唯一能激活静息状态T细胞的抗原提呈细胞，具有强大的激活辅助和细胞毒T细胞的能力。树突状细胞肿瘤疫苗是肿瘤治疗的第四模式之一，有望成为一种很有实用前景的抗肿瘤方法。肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗是由树突状细胞经肿瘤细胞裂解物或完整肿瘤细胞(两种最常用的全细胞抗原)致敏形成，致敏树突状细胞能表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及共刺激分子，使疫苗的抗肿瘤作用明显提高。

将树突状细胞与肿瘤细胞裂解物共同培养得到的致敏树突状细胞称为裂解物致敏DC疫苗；将树突状细胞与完整肿瘤细胞进行细胞融合得到的疫苗称为融合疫苗。相对而言，裂解物致敏DC疫苗技术难度相对较小，易于操作。肿瘤细胞裂解物的获得方法主要有两种：化学裂解和物理裂解。物理裂解包括反复冻溶法(又称为热休克法)和超声波处理法。化学裂解包括裂解液裂解和酶裂解。四种方法比较而言，超声波处理法最为剧烈，容易造成DNA断裂和蛋白质变性；酶裂解用在裂解物致敏DC疫苗方面最容易破坏肿瘤细胞裂解物，降低抗原性；反复冻溶法最为温和，裂解效率也高，但是冻溶裂解需要将肿瘤细胞于-80℃和37℃反复冻融4个循环以上，操作耗费时间，且不易商品化、标准化；裂解液裂解比超声波处理法温和，没有酶裂解法对肿瘤细胞裂解物破坏性强，比冻溶裂解法快捷方便，唯一的不足就是还是会一定程度上造成肿瘤细胞裂解物中抗原成分高级构象的破坏，降低抗原性。现有技术中，为了最大限度保留肿瘤细胞裂解物中蛋白的抗原性，冻溶裂解法较为常用，如赵增仁等采用液氮反复冻融法制备人胃癌OCUM-2MD3肿瘤抗原(肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率，第四军医大学学报)，古涛等采用-80℃和37℃反复冻融4个循环再离心取上清的方法制备小鼠骨髓瘤SP2/0细胞裂解物(肿瘤细胞冻融裂解物上清对凋亡细胞负载的树突状细胞生物学特性的作用研究，中国病理生理杂志)。

因此，如果能开发一种对肿瘤细胞裂解效率高且能最大限度保持裂解物抗原性的裂解液，裂解液裂解法必将取代冻溶裂解法而一枝独秀！

细胞裂解液的主要目的包括如下两个方面：(1)破坏脂质双分子层，使细胞破裂；(2)抑制蛋白酶活性，防止蛋白被蛋白酶水解。因此，现有技术中，各大实验室自行配制的细胞裂解液或市售的细胞裂解液试剂盒主要包含以下成分：多种细胞裂解成分和蛋白酶抑制成分。当然还有其他一些成分。裂解液中常添加的化学成分有：Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系)、NaCl(等渗体系)、EDTA(变性剂和稳定剂)、Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂)、SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)、PMSF(强大的蛋白酶抑制剂)、Aprotinin(蛋白酶抑制剂)、Leupeptin(蛋白酶抑制剂)、脱氧胆酸钠(强去污剂，破坏细胞膜)、Triton X-100(非离子型表面活性剂，破坏细胞膜)、CHAPS(离子型表面活性剂，破坏细胞膜)。添加蛋白溶解剂的一般主要目的是为了获得裂解液中的核酸，而不太在乎抗原等蛋白质成分。

细胞裂解液的成分及浓度对实验效果的影响不容小觑。刘友平等(不同细胞裂解液对肝细胞蛋白提取影响的研究，山西医药杂志2005年1月第34卷第1期)配制不同组成和不同浓度的细胞裂解液,分别对相同条件下培养的肝细胞进行裂解并进行蛋白定量及十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)佐证，结果发现不同组成及不同浓度的细胞裂解液对肝细胞裂解作用存在显著差异，两性去污剂CHAPS配制4％浓度时能有效溶解膜蛋白，而肝细胞膜蛋白本身就很丰富，同时，胞质中的蛋白质也可以彻底释放出来，因此提取的蛋白量较多。王丽等(不同细胞裂解液提取总蛋白在免疫印迹中的效果分析，泸州医学院学报2010年第33卷第4期)为了寻找一种适合乳腺癌细胞MCF-7蛋白提取的裂解液配方用于免疫印迹分析，测试了两种裂解液A(50mM pH 7.4 Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％SDS，1％NP-40，1mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM)和B(50mM pH 7.4 Tris-HCl，150mMNaCl，0.1％SDS，1％NP-40，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，1mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM)，结果发现2种细胞裂解液均可满足免疫印迹分析的要求，B液提取的蛋白含量虽比A液高，但A液用于免疫印迹检测β-actin和Twist的效果更佳。

由上述背景技术可得出如下结论：裂解液裂解法要想最大限度保持裂解物的抗原性，一方面要避免裂解液中的外来成分破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象；另一方面要避免细胞内裂解后释放出的内在蛋白酶对细胞膜蛋白和细胞质蛋白进行水解。

发明内容

本发明旨在克服背景技术中裂解液裂解法存在的不足，提供一种肿瘤细胞裂解液及其试剂盒，以最大限度地保持裂解物的抗原性。

本发明通过如下技术方案得以实现：

化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯在诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂方面的应用。

优选地，所述化合物蓖麻油磺酸盐为蓖麻油磺酸钠或蓖麻油磺酸钾。

优选地，所述化合物蓖麻油酸酯为蓖麻油酸乙酯。

一种肿瘤细胞裂解液，包括缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解细胞膜成分选自上述化合物。

优选地，所述缓冲体系成分为50mM pH为7.4的Tris-HCl。

优选地，等渗体系成分为150mM NaCl。

优选地，蛋白稳定剂为0.5mM EDTA。

优选地，所述蛋白酶抑制剂为5μg/ml Aprotinin或5μg/ml Leupeptin或1mMPMSF。

上述肿瘤细胞裂解液在制备肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗中的应用。

一种肿瘤细胞裂解试剂盒，包括上述缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂。

本发明优点：

本发明发现化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯可以温和诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂，不破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象，用其配置的肿瘤细胞裂解液能最大限度地保持裂解物的抗原性，将树突状细胞与用上述裂解液裂解的肿瘤细胞裂解物共同培养得到的裂解物致敏DC疫苗具有优异的抗肿瘤效果，并与现有技术常用的冻溶裂解法进行了比较。

具体实施方式

为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。

实施例1：肿瘤细胞裂解液的制备和应用

一、实验材料

C57BL/6小鼠为8周龄雌性SPF级，购自南京大学动物中心；C57BL/6小鼠来源的肺癌细胞系3LL为本公司保存；DMEM培养基、胎牛血清购于Gibco公司。

其它所用试剂均为国产或进口分析纯。

二、实验方法

1、小鼠骨髓DC的分离制备和鉴定

脱颈处死C57BL/6小鼠，取双后腿股骨、胫骨，除去上面附着的肌肉组织，除去骨两端，暴露骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔数次，充分吹打制成单细胞悬液。用200目铜网过滤后，以PBS洗2次，重新悬浮细胞，配制成浓度1×l0⁵/ml细胞悬液，放置于含15％％胎牛血清的DMEM培养液(含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mM谷氨酰氨)中培养。在培养体系中加4ng/ml rhGM-CSF和10ng/ml rhIL-4，6天后培养体系中加入50ng/ml TNF-α继续培养3天使之成熟。每3天半量换液，培养至第9天时收集疏松黏附的细胞。

DC表型鉴定：通过流式细胞仪测定上述方法获得的DC表达MHCⅡ类分子、CD86水平。首先将以上制备的DC分别与FICT-抗MHCⅡ类分子、CD86单抗在PBS中反应45分钟，反应结束后以PBS洗3次，上机分析。

2、肿瘤细胞裂解液的制备

实验组A：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，5‰蓖麻油磺酸钠，0.5mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM；

实验组B：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，5‰蓖麻油磺酸钾，0.5mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM；

实验组C：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，5‰蓖麻油酸乙酯，0.5mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM；

对比组A：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.5mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM；

对比组B：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％脱氧胆酸钠，0.5mM EDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM。

3、肿瘤细胞系的培养

C57BL/6小鼠肺癌细胞系3LL于含10％FBS的DMEM培养液中培养。

4、肿瘤细胞系的裂解

当培养的细胞融合率达90％以上时，选取处于对数生长期细胞，调整至5×10⁶/mL，随机分为6组，每组3瓶。倾去培养液，PBS冲洗2遍，沥干。其中5组分别加入肿瘤细胞裂解液实验组A、B、C和对比组A、B 200μl，缓慢吹打约5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脱色摇床上振摇20min，4℃，12000×g离心15min，收集上清液，0.2μm的微孔滤膜过滤，-80℃保存。剩余1组采用冻溶裂解法(下文称为对比组C)，方法为：将浓度为5×10⁶/mL的肿瘤细胞置于43℃30min，之后于-80℃和37℃反复冻融4个循环，12000r/min，20min，取上清，0.2μm的微孔滤膜过滤，置-80℃冻存。

5、肿瘤细胞裂解物对DC细胞的致敏方法(DC疫苗的制备)

按6:1的细胞比例将来自C57BL/6小鼠的DC与C57BL/6小鼠肺癌细胞裂解物共培养18小时，收集半贴壁的致敏DC细胞，包括6组：实验组A、B、C和对比组A、B、C。

6、DC疫苗体内诱导的免疫预防作用

用DC疫苗对健康小鼠进行免疫：将各组DC疫苗悬浮于PBS中，小鼠双侧中腹部皮内注射，每侧100微升，2×10⁶/鼠；3天后对小鼠进行第二次免疫，剂量及方法同第一次免疫。两次免疫小鼠7天后，以肿瘤细胞3LL攻击小鼠，5×10⁴/鼠/200微升，溶于PBS中，双侧中侧腹皮下接种，100微升/侧。定期观察肿瘤生长情况，测定肿瘤体积。空白对照组注射等剂量PBS，肿瘤细胞正常接种。

7、DC疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用

将对数生长期的3LL(悬浮于PBS中)以5×10⁴/鼠/200微升双侧中侧腹皮下接种攻击小鼠，随机分组。7天后，皮下注射经放射线灭活的DC疫苗，在第10天进行第二次免疫，免疫剂量和方法同上。记录肿瘤生长状况，定期测量肿瘤体积，并记录各组小鼠180天存活率(％)。空白对照组注射等剂量PBS，肿瘤细胞正常接种。每组20只。

三、实验结果

1、小鼠骨髓DC的分离鉴定结果

小鼠骨髓来源的DC倒置显微镜下观察，具有典型DC的形态，细胞体积大，外形不规则，胞浆丰富，胞膜向外伸出毛刺状或树枝状突起，有明显的贴壁集簇生长现象。DC表型鉴定证明上述方法获得的DC高表达MHCⅡ类分子和CD86。

2、DC疫苗体内诱导的免疫预防作用

肿瘤体积测定结果如下表：

从上表可以看出，传统的冻溶裂解物致敏DC疫苗对肿瘤的预防效果明显优于传统的以Triton X-100或脱氧胆酸钠为裂解剂的裂解物致敏DC疫苗。本发明提供的肿瘤细胞裂解液显著优于传统的裂解液配方，对肿瘤的预防效果与冻溶裂解接近。

3、DC疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用

各组小鼠180天存活率(％)如下表：

从上表可以看出，传统的冻溶裂解物致敏DC疫苗对肿瘤的治疗效果明显优于传统的以Triton X-100或脱氧胆酸钠为裂解剂的裂解物致敏DC疫苗。本发明提供的肿瘤细胞裂解液显著优于传统的裂解液配方，对肿瘤的治疗效果与冻溶裂解接近。

上述实施例中，蛋白酶抑制剂也可选用5μg/ml Aprotinin或5μg/ml Leupeptin。

实施例2：肿瘤细胞裂解试剂盒的制备和应用

一种肿瘤细胞裂解试剂盒，包括上述缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂。缓冲体系成分为Tris-HCl，等渗体系成分NaCl，裂解细胞膜成分为蓖麻油磺酸钠或蓖麻油磺酸钾或蓖麻油酸乙酯，蛋白稳定剂为EDTA，蛋白酶抑制剂为Aprotinin或Leupeptin或PMSF。

本发明发现化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯可以温和诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂，不破坏细胞膜蛋白和细胞质蛋白的高级构象，用其配置的肿瘤细胞裂解液能最大限度地保持裂解物的抗原性，将树突状细胞与用上述裂解液裂解的肿瘤细胞裂解物共同培养得到的裂解物致敏DC疫苗具有优异的抗肿瘤效果，并与现有技术常用的冻溶裂解法进行了比较，结果发现本发明肿瘤细胞裂解液显著优于传统裂解液，对肿瘤的预防、治疗效果与冻溶裂解接近。这表明，本发明肿瘤细胞裂解液既比冻溶裂解效率高、操作便捷，又具有相近的致敏效果。

上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims

1.化合物蓖麻油磺酸盐或蓖麻油酸酯在诱导肿瘤细胞的细胞膜破裂方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述化合物蓖麻油磺酸盐为蓖麻油磺酸钠或蓖麻油磺酸钾。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述化合物蓖麻油酸酯为蓖麻油酸乙酯。

4.一种肿瘤细胞裂解液，包括缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂，其特征在于：所述裂解细胞膜成分选自权利要求1-3任一所述化合物。

5.根据权利要求4所述的肿瘤细胞裂解液，其特征在于：所述缓冲体系成分为50mM pH为7.4的Tris-HCl。

6.根据权利要求4所述的肿瘤细胞裂解液，其特征在于：等渗体系成分为150mM NaCl。

7.根据权利要求4所述的肿瘤细胞裂解液，其特征在于：蛋白稳定剂为0.5mM EDTA。

8.根据权利要求4所述的肿瘤细胞裂解液，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂为5μg/mlAprotinin或5μg/ml Leupeptin或1mM PMSF。

9.权利要求4-8任一所述肿瘤细胞裂解液在制备肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗中的应用。

10.一种肿瘤细胞裂解试剂盒，其特征在于：包括权利要求4-8中的缓冲体系成分、等渗体系成分、裂解细胞膜成分、蛋白稳定剂和蛋白酶抑制剂。