CN117088937B - 一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途，包括组分a和组分b，组分a包括tween20以及双氧水或蒸馏水，组分b包括二硫苏糖醇、磷酸缓冲液以及NaCl溶液；其制备方法为：收集癌细胞，以2%的比例加入组分a混合静置；加入与组分a等量体积的组分b混合静置；加入乙醇溶液，离心后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。本发明采用组分a、组分b相互配合，快速充分破解细胞，组分b中含有还原剂及高浓度盐溶液，与组分a等比混合后，既中和了组分a中的过氧化物，并纠正了低渗对蛋白的损伤，提取过程对操作人要求极低，能够快速安全的获得细胞的蛋白组份，可用于癌症的临床治疗。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途。
背景技术
源自人体自己的细胞、蛋白是可以应用于人体的，比如人红细胞、白蛋白、球蛋白等，这些应用都是以药品管理的方式或方案进行推进。自体肿瘤治疗疫苗是近年发展起来的一类新型肿瘤治疗技术，并已广泛应用于临床肿瘤治疗研究。这类治疗中往往需要患者自体的肿瘤抗原组（蛋白），解决这一需求往往是在临床医院，由医生兼职完成，传统科研实验室常用的蛋白提取方案不适合临床应用（部分制剂可能回输人体），这就需要为临床提供一种适应的方案，快速安全的获得细胞的蛋白组份，并在适合的情况下应用于临床。
真核细胞蛋白提取有着成熟的方案，如RIPA法、液氮反复冻融法、液氮研磨法、超声破碎、或热裂解法等。但这些方案无疑都存在着不适合临床应用的成分：如RIPA法会引入SDS等离子型去污剂、液氮冻融和研磨法需要液氮，操作时间长，超声、热裂解对细胞和蛋白的影响较大，出现非预期蛋白、蛋白变性后复性率低等等。具体表现为：（1）细胞裂解过程中引入过多去污剂、还原剂等对人体有害的试剂：依据裂解程度的不同，RIPA法会引入较高浓度的去污剂，尤其是SDS等离子型去污剂的引入，造成制剂不能应用于人体或制备物不能应用于人体方面；（2）不符合人体细胞被破坏的生理情况：正常的人体破坏，更多的是以凋亡的形式发生，而非利用加热、超声等直接破坏细胞；（3）需要使用蛋白酶抑制剂等试剂：这类物品会阻抑生命的生理活动，从而影响诸多代谢环节，这一类物质是不能应用于人体的；（4）蛋白提取时间较长，如反复冻融的方案，通常3次冻融需要超过数小时，不利于临床快速处理；（5）非预期的变化引入：如热裂解会产品HSP、同时热变性后的蛋白有很多不可逆，从而损失较多蛋白；（6）特定条件的要求：如需要液氮罐、-80°冰箱等非临床应用条件；（7）主要应用于基础研究，不适合人体临床：科研后续研究如SDS-PAGE、MALDITOF、氨基酸测序、蛋白结晶等，与临床应用的提取差异较大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
一种细胞蛋白提取液，包括组分a和组分b，所述组分a包括体积分数为1%的tween20以及体积分数为6%的双氧水或蒸馏水，所述组分b包括0.2mol/L 二硫苏糖醇（DTT）、0.01mol/L、pH6.0 磷酸缓冲液（PB）以及300mmol/L NaCl溶液。
根据上述技术方案，优选地，还包括乙醇溶液，乙醇溶液为无水乙醇，所述乙醇溶液的体积为组分a或组分b的体积的6倍以上，所述乙醇溶液的浓度不低于75%。
本专利还公开了一种制备蛋白提取物的方法，使用上述一种细胞蛋白提取液，包括如下步骤：
S1.收集癌细胞，以2%（细胞重量/g：组分a溶液/ml）的比例加入所述组分a，混合静置；
S2.加入与组分a等量体积的所述组分b，混合静置；
S3.加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，离心后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。
根据上述技术方案，优选地，步骤S1、S2中，所述混合静置包括：涡旋20s或手动震荡30s，静置2分钟。
根据上述技术方案，优选地，步骤S3包括：加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，涡旋20s或手动震荡30s；离心12000rpm、2min后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。
本专利同时公开了一种细胞蛋白提取液的用途，基于上述一种制备蛋白提取物的方法，用于DC细胞的肿瘤抗原负载，具体包括以下步骤：
S41.采集人外周抗凝血并稀释；
S42.将稀释后的抗凝血加在淋巴细胞分离液上部，离心并取白膜层；
S43.采用无菌PBS缓冲液洗涤，离心收集细胞沉淀，沉淀用1640培养基制备悬浮细胞液，过夜培养12h以上；
S44.次日缓慢吸出培养液及未贴壁细胞，加入等量新的1640培养基，继续培养48h；
S45.采用培养基半量换液，加入所述蛋白提取物溶液，并控制蛋白浓度，使蛋白浓度达3ug蛋白提取物/ml培养基，培养48h。
根据上述技术方案，优选地，在步骤S41中，采集人外周抗凝血10ml，用无菌PBS缓冲液按照体积比1:1稀释。
根据上述技术方案，优选地，在步骤S42中，在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血加在其上部，离心1500rpm、20min，取白膜层。
本发明的有益效果是：
本发明采用组分a、组分b相互配合，快速充分破解细胞，组分b中含有还原剂及高浓度盐溶液，与组分a等比混合后，既中和了组分a中的过氧化物，并纠正了低渗对蛋白的损伤，同时将PH调整至蛋白易于沉淀出来，提取过程对操作人要求极低，操作人容易掌握，能够快速安全的获得细胞的蛋白组份，可用于癌症的临床治疗。
附图说明
图1是本发明实施例3中未负载人细胞裂解物蛋白的DC细胞示意图。
图2是本发明实施例3中负载人细胞裂解物蛋白的DC细胞示意图。
图3是本发明实施例4中对照组与DC组肿瘤结节数目对比图。
图4是本发明实施例4中对照组中小鼠肿瘤结节示意图一。
图5是本发明实施例4中对照组中小鼠肿瘤结节示意图二。
图6是本发明实施例4中DC组中小鼠肿瘤结节示意图一。
图7是本发明实施例4中DC组中小鼠肿瘤结节示意图二。
图8是本发明实施例4中DC组中小鼠肿瘤结节示意图三。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。基于发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于发明保护的范围。
实施例1：本发明包括组分a和组分b，所述组分a包括体积分数为1%的tween20以及体积分数为6%的双氧水或蒸馏水，所述组分b包括0.2mol/L 二硫苏糖醇（DTT）、0.01mol/L、pH6.0 磷酸缓冲液（PB）以及300mmol/L NaCl溶液。此外，还包括乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积为组分a或组分b的体积的6倍以上，所述乙醇溶液的浓度不低于75%。
其具体配方组分的原理为：
组分a用于细胞裂解溶液，这一细胞裂解过程，同时拥有3项破解细胞的因素存在：①在低渗环境（蒸馏水）中，细胞自身可以溶胀破解；②1%的tween20可以破解细胞膜；③双氧水可以破坏细胞，变性蛋白，可以模拟细胞破裂后，细胞内自身氧化物对蛋白的影响。这一溶液结合涡旋或较为剧烈的震荡，可以迅速破裂细胞，并变性、破碎大部分蛋白质。利用组分a破解后的溶液，不适宜蛋白长时间存留，需要尽可能快的回复生理状态，这就需要其他因素引入。
组分b作用有3方面：①分解过氧化物，中断超氧化对蛋白的超氧化影响，并利用打开二硫键等的方式，分解、变性蛋白；②迅速将溶液整体变为等渗的状态，为长久保存蛋白提供条件；③将溶液PH调至偏酸性，使得大部分蛋白接近等电点，为接下来乙醇沉淀打下基础。
乙醇沉淀利用超75%的乙醇沉淀溶液中蛋白组分，并将大部分tween20、DTT除去，这样的蛋白制剂非常安全，甚至可以直接应用于人体。
实施例2：本专利还公开了一种制备蛋白提取物的方法，使用上述一种细胞蛋白提取液，包括如下步骤：
S1.收集癌细胞，以2%的比例（细胞重量/g：组分a溶液/ml）加入所述组分a，涡旋20s或手动震荡30s，静置2分钟；
S2.加入与组分a等量体积的所述组分b，涡旋20s或手动震荡30s，静置2分钟；
S3.加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，涡旋20s或手动震荡30s；离心12000rpm、2min后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。
实施例3：本专利同时公开了一种细胞蛋白提取液的用途，基于上述一种制备蛋白提取物的方法，本例中以人卵巢癌细胞为例，将人卵巢癌细胞SKOV3培养，收集约2×106个细胞，加入组分a 1.5ml震荡混匀，随后加入组分b 1.5ml振荡混匀，再加入预冷的乙醇溶液9ml振荡混匀，12000rpm离心2分钟，沉淀用1640培养基300ul悬浮起来，获得蛋白提取物溶液，用于体内外DC细胞的肿瘤抗原负载，具体包括以下步骤：
S41.采集人外周抗凝血10ml，用无菌PBS缓冲液按照体积比1:1稀释；
S42.在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血加在其上部，离心1500rpm、20min，取白膜层，获得单个核细胞；
S43.采用无菌PBS缓冲液洗涤，离心收集细胞沉淀，沉淀用1640培养基制备悬浮细胞液，2×106个细胞/ml，培养瓶中过夜培养12h以上；
S44.次日缓慢吸出培养液及未贴壁细胞，加入等量新的1640培养基（rhIL-4、rhGM-CSF终浓度均为10ug/ml），继续培养48h，留照片存档（图1），期间可依具体情况培养基半量换液1次；
S45.采用培养基半量换液，加入所述蛋白提取物溶液，并控制蛋白浓度，使蛋白浓度达3ug蛋白提取物/ml培养基，培养48h后观察留档（图2）。
结果显示，图1中未负载人细胞裂解物蛋白的DC非成熟，显示成星形结构，伸出伪足。抗原蛋白组冲击后，细胞成熟并脱离培养容器内壁，形成球形细胞。
实施例4：为进一步说明实施例3中公开的一种细胞蛋白提取液的用途，本例中采用负载小鼠DC细胞应用进行表征，具体包括如下步骤：
（1）肿瘤抗原的提取：将ID8小鼠卵巢癌细胞系培养，收集约2×106个细胞，加入组分a裂解液1.5ml震荡混匀；随后加入组分b裂解液1.5ml振荡混匀；加入预冷的乙醇溶液9ml震荡混匀，12000rpm离心2分钟，沉淀用1640培养基300ul悬浮起来，获得蛋白提取物溶液，测定蛋白含量。
（2）小鼠DC的制备：方案类似人的DC的制备，单个核细胞选自脾脏，分离细胞时选用小鼠淋巴细胞分离液。
（3）小鼠卵巢癌模型构建：将12只8-10周雌性C57BL/6小鼠随机分为2组、每组6只；分别为对照组、肿瘤抗原冲击的DC细胞组。将ID8细胞以5×106/200μl注射于小鼠腹腔，构建卵巢癌模型。
（4）在荷瘤第2天，DC细胞组脾内注射50μl生理盐水、蛋白提取物溶液冲击的DC细胞（5×105/50μl/只），对照组注射等量生理盐水。
（5）荷瘤42天颈椎脱臼处死小鼠，观察腹水，打开腹腔观察瘤结节生长情况，计数并拍照，结果见图3-8，结果显示，DC细胞治疗的小鼠肿瘤结节显著少于对照组，表明小鼠细胞裂解蛋白冲击DC后，DC成熟，并在动物治疗实验中获得成功。
本发明采用组分a、组分b相互配合，快速充分破解细胞，组分b中含有还原剂及高浓度盐溶液，与组分a等比混合后，既中和了组分a中的过氧化物，并纠正了低渗对蛋白的损伤，同时将PH调整至蛋白易于沉淀出来，提取过程对操作人要求极低，操作人容易掌握，能够快速安全的获得细胞的蛋白组份，可用于癌症的临床治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种细胞蛋白提取液，其特征在于，包括组分a和组分b，所述组分a包括体积分数为1%的tween20以及体积分数为6%的双氧水，所述组分b包括0.2mol/L 二硫苏糖醇、0.01mol/L 磷酸缓冲液以及300mmol/L NaCl溶液。
2.根据权利要求1所述一种细胞蛋白提取液，其特征在于，还包括乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积为组分a或组分b的体积的6倍以上。
3.根据权利要求2所述一种细胞蛋白提取液，其特征在于，所述乙醇溶液为无水乙醇。
4.一种制备蛋白提取物的方法，使用权利要求2或3中所述一种细胞蛋白提取液，其特征在于，包括如下步骤：
S1.收集癌细胞，以2%的比例加入所述组分a，混合静置；
S2.加入与组分a等量体积的所述组分b，混合静置；
S3.加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，使得乙醇溶液终浓度达75%以上，离心后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。
5.根据权利要求4所述一种制备蛋白提取物的方法，其特征在于，步骤S1、S2中，所述混合静置包括：涡旋20s或手动震荡30s，静置2分钟。
6.根据权利要求4所述一种制备蛋白提取物的方法，其特征在于，步骤S3包括：加入6倍以上组分a或组分b的体积的所述乙醇溶液，涡旋20s或手动震荡30s；离心12000rpm、2min后收集沉淀，沉淀用培养基混匀悬浮，获得蛋白提取物溶液。
7.一种负载肿瘤抗原DC细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S41.采集人外周抗凝血并稀释；
S42.将稀释后的抗凝血加在淋巴细胞分离液上部，离心并取白膜层；
S43.采用无菌PBS缓冲液洗涤，离心收集细胞沉淀，沉淀用1640培养基制备悬浮细胞液，过夜培养12h以上；
S44.次日缓慢吸出培养液及未贴壁细胞，加入等量新的1640培养基，继续培养48h；
S45.采用培养基半量换液，使用权利要求4所述一种制备蛋白提取物的方法，获得蛋白提取物溶液，再加入所述蛋白提取物溶液，并控制蛋白浓度，使蛋白浓度达3ug蛋白提取物/ml培养基，培养48h。
8.根据权利要求7所述一种负载肿瘤抗原DC细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S41中，采集人外周抗凝血10ml，用无菌PBS缓冲液按照体积比1:1稀释。
9.根据权利要求8所述一种负载肿瘤抗原DC细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S42中，在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血加在其上部，离心1500rpm、20min，取白膜层。
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