CN117547499A - 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用 - Google Patents

胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117547499A
CN117547499A CN202310998920.6A CN202310998920A CN117547499A CN 117547499 A CN117547499 A CN 117547499A CN 202310998920 A CN202310998920 A CN 202310998920A CN 117547499 A CN117547499 A CN 117547499A
Authority
CN
China
Prior art keywords
embryo extract
embryo
extract
temperature
solid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310998920.6A
Other languages
English (en)
Inventor
曾凡一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Fanyi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Fanyi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Fanyi Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Fanyi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310998920.6A priority Critical patent/CN117547499A/zh
Publication of CN117547499A publication Critical patent/CN117547499A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A61K8/982—Reproductive organs; Embryos, Eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52—Stabilizers
    • A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明提供了一种胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用，涉及生物提取技术领域，本发明提供的胚胎提取物的制备方法，工艺流程步骤科学合理，兼顾的工艺的科学性和生产的可操作性，通过匀浆、冷冻、酶解、超滤等特定条件步骤的配合，能够制备得到具有抗衰功效的多种胚胎提取物；同时，在保证多种胚胎提取物抗衰功效的前提下，提高了胚胎提取物的提取率，特别是提高了胚胎提取物中有效成分的含量；并且，本发明的胚胎提取物为水提取物，提取工艺适合利于规模化，设备、原料成本低，环境友好，适合工业化生产。

Description

胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用
技术领域
本发明涉及生物提取技术领域，尤其是涉及一种胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用。
背景技术
胚胎提取物是常见的美容护肤产品的成分之一。20世纪初期，卡雷尔(AlexisCarrel，1873-1944)教授通过对鸡胚胎提取物的研究，发现了胚胎提取物的促进细胞生长作用；20世纪30年代，尼汉斯(Paul Niehans，1882-1971)博士发明了新鲜细胞疗法，以同源细胞归位或系统修复理论获得特定的治疗作用，并进行广泛的临床实践，促进皮肤抗衰老的产品形式的发展，并出现了羊胎素治疗衰老的活细胞疗法。
目前，在护肤品市场上，运用比较广泛的是胚胎细胞提取物(鸡胚、羊胚胎等)及基于羊胎素概念的水解羊胎盘提取物等具有生物活性物质的原料产品。但对于动物胚胎提取的方法还普遍存在操作繁琐、原料利用率低下等问题，不利于大规模生产。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种胚胎提取物的制备方法，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供应用上述制备方法制备得到的胚胎提取物。
本发明的目的之三在于提供上述胚胎提取物在制备抗衰产品中的应用。
本发明的目的之四在于提供包含上述胚胎提取物的化妆品。
本发明的目的之四在于提供包含上述胚胎提取物的食品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种胚胎提取物的制备方法，包括如下步骤：
(a)将经过预处理的动物胚胎匀浆后冷冻；
(b)将冷冻的匀浆液解冻后在65～80℃温度下水浴0.5～1.5h，固液分离得到液体A和固体B；
(c1)将得到的液体A冷冻，得到中间品A；
(c2)向得到的固体B中加入蒸馏水和水解蛋白酶，在65～80℃温度下水浴0.5～1.5h，固液分离得到液体B，然后将得到的液体B冷冻，得到中间品B；
(d)分别将中间品A和中间品B解冻后过滤，取滤过液分别得到胚胎提取物A和胚胎提取物B；取未滤过浓缩液分别得到胚胎提取物C和胚胎提取物D。
进一步的，步骤(a)中，所述预处理包括去除动物胚胎的胃肠道和胎粪，并清洗；
优选地，匀浆时加入动物胚胎质量2～6倍的蒸馏水；
优选地，所述冷冻的温度为-30～-20℃，优选为-30℃。
进一步的，步骤(b)中，在20～25℃温度下进行解冻；
优选地，所述水浴的温度为60～80℃，优选为70℃；
优选地，所述水浴的时间为0.8～1.2h，优选为1h；
优选地，采用80目至120目的筛网过滤进行固液分离，优选采用100目筛网过滤。
进一步的，步骤(c1)中，所述冷冻的温度为-30～-20℃，优选为-30℃。
进一步的，步骤(c2)中，所述蒸馏水的加入量为固体B质量的2～6倍；
优选地，所述水解蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的至少一种；
优选地，加入水解蛋白酶的质量是固体B质量的0.1％～0.5％；
优选地，所述水浴的温度为60～80℃，优选为70℃；
优选地，所述水浴的时间为0.8～1.2h，优选为1h；
优选地，所述冷冻的温度为-30～-20℃，优选为-30℃；
优选地，采用100目至200目筛网过滤进行固液分离，优选采用150目筛网过滤。
进一步的，步骤(d)中，在20～25℃温度下进行解冻；
优选地，所述过滤包括使用15～30k孔径超滤膜进行超滤；
优选地，将所述未滤过浓缩液分别离心取上清，得到胚胎提取物C和胚胎提取物D；
优选地，所述离心的条件包括6000～8000rpm、20～50min或2～10℃中的至少一种；
优选地，还包括将所述上清冻干的步骤，分别得到冻干粉胚胎提取物C和冻干粉胚胎提取物D。
本发明提供了采用上述的制备方法制备得到的胚胎提取物；
优选地，所述胚胎提取物包括胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D。
本发明提供了述的胚胎提取物在制备抗衰产品中的应用；
优选地，所述的胚胎提取物A和/或胚胎提取物B在制备抗衰化妆品中的应用；
优选地，所述的胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D中的至少一种在制备抗衰食品中的应用。
本发明还提供了一种化妆品，包括上述的胚胎提取物A和/或胚胎提取物B。
本发明还提供了一种食品，包括上述的胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供的胚胎提取物的制备方法，工艺流程步骤科学合理，兼顾的工艺的科学性和生产的可操作性，通过特定条件步骤的配合，能够制备得到具有抗衰功效的多种胚胎提取物；同时，在保证多种胚胎提取物抗衰功效的前提下，提高了胚胎提取物的提取率，特别是提高了胚胎提取物中有效成分的含量；并且，本发明的胚胎提取物为水提取物，提取工艺适合利于规模化，设备、原料成本低，环境友好，适合工业化生产。
通过本发明提取方法提取得到的多种胚胎提取物具有不同的成分，针对胚胎提取物不同成分的性质，可分别或联合用于化妆品、保健食品等领域，实现对胚胎原料充分利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的胚胎提取物提取方法流程图；
图2为本发明提供的胚胎提取物蛋白组质谱鉴定总览图；
图3为本发明提供的胚胎提取物蛋白质电泳图；
图4A为本发明提供的胚胎提取物A的紫外吸收峰，最大吸收峰在250nm附近；
图4B为本发明提供的胚胎提取物B的紫外吸收峰，最大吸收峰在260nm附近；
图4C为本发明提供的胚胎提取物C的紫外吸收峰，最大峰不明显；
图4D为本发明提供的胚胎提取物D的紫外吸收峰，最大吸收峰不明显；
图5A为本发明提供的胚胎提取物样品清除超氧阴离子自由基能力结果图，其中B为胚胎提取物A，C为对照，D为胚胎提取物B；
图5B为本发明提供的胚胎提取物样品清除羟自由基能力结果图，其中B为胚胎提取物A，C为对照，D为胚胎提取物B；
图5C为本发明提供的胚胎提取物样品对抑制小鼠肝匀浆脂质过氧化的能力结果图，其中B为胚胎提取物A，C为对照，D为胚胎提取物B；
图6为本发明提供的胚胎提取物对小鼠胚胎成纤维细胞增值作用的结果图(胚胎提取物A为例)；
图7为本发明提供的胚胎提取物A和B的活性氧测定结果图；
图8为本发明提供的灌胃胚胎提取物C和D之后的小鼠血常规指标结果图；
图9为本发明提供的灌胃胚胎提取物C和D之后的小鼠毛发生长结果图；
图10为本发明提供的胚胎提取物毒理检测-激素检测结果图(胚胎提取物A为例)；
图11为本发明提供的胚胎提取物毒理检测-多次皮肤应激试验结果图(胚胎提取物A为例)；
图12为本发明提供的胚胎提取物毒理检测-变态反应结果图(胚胎提取物A为例)；
图13为本发明提供的胚胎提取物的毒理-皮肤变态反应试验(以胚胎提取物A为例)。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种胚胎提取物的制备方法，包括如下步骤：
(a)将经过预处理的动物胚胎匀浆后冷冻；
(b)将冷冻的匀浆液解冻后在65～80℃温度下水浴0.5～1.5h，固液分离得到液体A和固体B；
(c1)将得到的液体A冷冻，得到中间品A；
(c2)向得到的固体B中加入蒸馏水和水解蛋白酶，在65～80℃温度下水浴0.5～1.5h，固液分离得到液体B，然后将得到的液体B冷冻，得到中间品B；
(d)分别将中间品A和中间品B解冻后过滤，取滤过液分别得到胚胎提取物A和胚胎提取物B；取未滤过浓缩液分别得到胚胎提取物C和胚胎提取物D。
在以往胚胎提取物的生产工艺中，小分子组分(小于30K或更小组分，包含非蛋白质成分)的产率很低，限制了胚胎提取物在化妆品上的运用，也对胚胎原料造成了极大的浪费。本发明提供的胚胎提取物的制备方法，工艺流程步骤科学合理，兼顾的工艺的科学性和生产的可操作性，通过特定条件步骤的配合，能够制备得到具有抗衰功效的多种胚胎提取物。同时，在保证多种胚胎提取物抗衰功效的前提下，提高了胚胎提取物的提取率，特别是提高了胚胎提取物中有效成分的含量，其中，小于30k用于化妆品的胚胎提取物产量是常规方法的4-6倍；大于30k的胚胎提取物(主要为蛋白质及水解肽)应用于食品作为保健品，可以增强机体免疫力，提高机体的抗衰老能力。并且，本发明的胚胎提取物为水提取物，提取工艺适合利于规模化，设备、原料成本低，环境友好，适合工业化生产。
步骤(a)：
其中，所述动物胚胎例如可以为，但不限于山羊胚胎、绵羊胚胎、兔胚胎、猪胚胎、牛胚胎、马胚胎等。优选地，选择崇明白山羊，该品种毛皮肉兼用，体型中等偏小，适合手术操作；该品种体格强壮，适应性强，适合各地引进饲养；该品种繁殖率高，得到的胚胎率较高；该品种山羊的胎羊肌肉丰满，内脏发育完善，适合提取胚胎提取物。挑选身体健康、膘体适中、年龄适中(2-3岁)、发情周期正常的经产母山羊作为待孕羊，其中所有山羊均已经检疫、防疫和药浴处理，并在饲料中注意青饲料、维生素和微量元素的补充。在待孕羊在黄体期7-14d时肌注氯前列烯醇，30h后开始观察发情。当观察到发情后12小时进行人工采精和输精，发情后24可复配一次。30-35天后进行B超检查，确定怀孕情况。待胎羊长到75-95天时(上下误差5天)，手术法取出胎羊，以得到的山羊胚胎作为胚胎提取物的原料。
可选地，预处理包括将得到的山羊胚胎置于无菌容器内，去除胃肠道及胎粪，保留眼球、大脑、肝、肺、心等脏器，需要注意的是，保留内脏可以获得晶体蛋白等重要的蛋白成分。并用生理盐水洗净；之后可直接进入下一步或在-30℃冷冻保存，冷冻保存可以方便的按需取出合适的数量进行下一步的加工。
可选地，将山羊胚胎置于无菌容器称重，剪成碎块，然后加入山羊胚胎质量2～6倍的蒸馏水于无菌匀浆器，置入山羊胚胎碎块进行匀浆。
可选地，将得到的匀浆液置于无菌容器冷冻保存，确保完全冻结后可进入下一步。其中冷冻温度为-30～-20℃，优选为-30℃。匀浆后冻存，有助于细胞低渗裂解和低温水分结晶裂解，尽可能释放细胞内物质，冻存后可以择期解冻再进行下一步(水浴)，有助于灵活安排生产时间及生产进度。
步骤(b)：
其中，在室温如20～25℃温度下进行解冻，待完全融化后进行水浴。
可选地，所述水浴的温度为60～80℃，例如可以为，但不限于60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，优选为70℃；所述水浴的时间为0.8～1.2h，例如可以为，但不限于0.8h、0.9h、1h、1.1h或1.2h，优选为1h。需要注意的是，水浴时需保证匀浆液达到60～80℃后至少保持0.5h。
可选地，采用80目至120目的筛网过滤进行固液分离，优选采用100目筛网过滤。
步骤(c1)：
其中，将得到的液体A转入无菌容器中冷冻，冷冻的温度为-30～-20℃，例如可以为，但不限于-30℃、-28℃、-25℃、-22℃或-20℃，优选为-30℃。确保完全冻结后可进入下一步。
步骤(c2)：
其中，蒸馏水的加入量为固体B质量的2～6倍；
可选地，所述水解蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的至少一种，以木瓜蛋白酶为优选；
可选地，加入水解蛋白酶的质量是固体B质量的0.1％～0.5％，例如可以为，但不限于0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％；
可选地，所述水浴的温度为60～80℃例如可以为，但不限于60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，优选为70℃；所述水浴的时间为0.8～1.2h，例如可以为，但不限于0.8h、0.9h、1h、1.1h或1.2h，优选为1h；需要注意的是，水浴时需保证水解液达到60～80℃后至少保持0.5h。此时水解液含有丰富的泛素，水解角蛋白等功能性蛋白及肽。本发明中通过水解蛋白酶，从如下基因：RPS27A(编码结合在核糖体蛋白S27a上的单个泛素)、UBC(编码多泛素的先导蛋白)、UBA52(ubiquitin-60S ribosomal protein，编码结合在核糖体蛋白L40上的单个泛素)、UBB(编码多泛素的先导蛋白)编码的蛋白质上水解出执行特异功能的泛素(ubiquitin)分子。以往研究证实泛素化几乎参与一切生命活动调节，特别对抗衰老具有重要的影响，添加外源性泛素的含量，可以加快细胞内冗余蛋白的分解，从而使细胞年轻化。
可选地，待水解液自然将至室温后冷冻，冷冻的温度为-30～-20℃，例如可以为，但不限于-30℃、-28℃、-25℃、-22℃或-20℃，优选为-30℃；确保完全冻结后可进入下一步。水浴后室温下自然降温，有助于水解蛋白酶的充分作用；水解液的低温冻存及解冻，有助于安排下一步生产和不溶固体的沉淀，无须离心去沉淀及其他去沉淀方式，在超滤前只需过滤即可，操作简单方便，有助于规模化生产。
可选地，采用100目至200目筛网过滤进行固液分离，滤渣为少量的骨头等水解残留物，弃去，优选采用150目筛网过滤。
需要说明的是，步骤(c1)和步骤(c2)的并无特定顺序要求，可以先进行步骤(c1)再进行步骤(c2)，或者先进行步骤(c2)再进行步骤(c1)，或者同时进行步骤(c1)和步骤(c2)。
步骤(d)：
其中，在室温20～25℃温度下进行解冻，待完全融化后进行过滤，具体可以使用无菌纱布过滤上清，沉淀离心(例如4℃，8000rpm，30分钟)，取上清并入纱布过滤的上清液。
可选地，滤过液转入无菌容器，使用切向流超滤系统，典型地可以使用15～30k孔径超滤膜进行超滤，例如可以为，但不限于15k、20k、25k或30k，优选使用30k孔径超滤膜进行超滤。
可选地，将所述未滤过浓缩液分别离心取上清，得到胚胎提取物C和胚胎提取物D；
可选地，所述离心的条件包括6000～8000rpm、20～50min或2～10℃中的至少一种；
可选地，还包括将所述上清冻干的步骤，分别得到冻干粉胚胎提取物C和冻干粉胚胎提取物D。
根据本发明的第二个方面，提供了采用上述的制备方法制备得到的胚胎提取物；
其中，所述胚胎提取物包括胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D。
胚胎提取物A：(A1001，小于30K，见下图2)为天然的胚胎提取物，当使用关键的水浴温度(70℃)及最优超滤孔径(30k)时，小蛋白及蛋白质亚基被热变性从大分子蛋白质中解离，保持复性的能力，并通过最适合的超滤孔径予以分离。通过该条件蛋白质成分占提取物固体成分的15％至25％，通过蛋白组质谱鉴定到的肽段高达5625条，分布于1499个蛋白质。有1377个蛋白质可被定量到。在该提取条件下，胚胎提取物A的蛋白质种类多，可以执行蛋白质本身天然的功能。目前应用于化妆品中的外源性抗衰老活性成分主要包括以下几个方面，影响组织细胞生长代谢的成分、皮肤保湿与修复皮肤屏障功能的成分、抗氧化损伤的成分，包含微生素E、超氧化物歧化酶等、抵抗紫外线的成分等，这些成分在胚胎提取物A里都能找到。胚胎提取物A可以作为单独成分添加到化妆品原料中，也可以与胚胎提取物B协同使用。
胚胎提取物B：(A3001，小于30K，见下图2)为蛋白酶水解水浴时的不溶固体，水解后得到的胚胎提取物。该提取物采用了水解蛋白酶，特别是最适的水解蛋白酶-木瓜蛋白酶的水解，在该酶的水解下，通过质谱鉴定到的肽段高达2164条，分布于641个蛋白质，有509个蛋白质可被定量到。特别指出的是，在木瓜蛋白酶的水解下，可分别从四个含泛素的蛋白质里水解出执行抗衰老的有效成分-泛素，并且泛素的含量(泛素在蛋白质成分里的百分比)占比为20％-25％，优于其他方法或者水解条件。虽然胚胎提取物B的蛋白质种类少于胚胎提取物A，但胚胎提取物B富集了外源性抗衰老活性成分泛素的含量，并提高了其他水解活性小分子物质的质量百分比含量。
胚胎提取物C：经质谱鉴定，胚胎提取物C所含蛋白种类1526种(图2，A1002)。胚胎提取物C是经过水浴去除热不稳定蛋白，并经超滤过滤后得到分子量较大的具有抗氧化功能的水溶性蛋白成分，例如在此条件下获得丰富的含二价铁的血红蛋白、白蛋白、超氧化物歧化酶等成分，含二价铁血红蛋白在总蛋白里的百分比含量为15％-25％，白蛋白在总蛋白里的百分比含量为7％-15％；超氧化物歧化酶在总蛋白里的百分比含量为2％-5％；这些富集的重要蛋白质在胚胎提取物的保健品产品中具有重要的作用。
胚胎提取物D：所含蛋白种类816种(图2，A3002)。
质谱数据显示，胚胎提取物C和胚胎提取物D含不同的蛋白组成和含量，胚胎提取物C的蛋白种类较多，而胚胎提取物D的有效成分含量则更丰富。胚胎提取物D相较胚胎提取物C，增加了水解酶水解的过程，在水解过程中，水解并富集了分子量较大的蛋白成分。在该方法中，通过水浴并水解，水解出与DNA结合的组蛋白，组蛋白在总蛋白中的含量高达25％-30％，而不经水解的胚胎提取物C中该蛋白含量小于1％，显然，水解蛋白酶特别是木瓜蛋白的水解以及适合的超滤条件，富集了丰富的组蛋白成分。组蛋白是碱性蛋白质，在抗衰老中具有重要的作用。胚胎提取物D与胚胎提取物C，两者功能互补，可以单独制备成不同的抗衰老保健食品，也可按不同比例配置进新的抗衰老保健食品中。
基于上述胚胎提取物的特性，本发明的第三个方面提供了上述的胚胎提取物在制备抗衰产品中的应用；
其中胚胎提取物A和胚胎提取物B主要应用于制备抗衰化妆品中，也可应用于制备抗衰老保健食品。胚胎提取物C和胚胎提取物D主要应用于制备抗衰保健食品。
本发明的第四个方面提供了一种化妆品，包括上述的胚胎提取物A和/或胚胎提取物B。
胚胎提取物A，可单独作为化妆品原料，在脸部护肤产品如日霜、夜霜、精萃露上使用，添加量(质量百分比)为5-50％不等。胚胎提取物A的投料量可取代护肤产品中原有水分相应的含量。在柔肤水、面膜、眼部护理产品、身体霜、手部护理等产品上使用视最终产品性质添加。主要功效是抗衰老(生理性衰老)。
胚胎提取物B，可单独作为化妆品原料，在脸部护肤产品如日霜、夜霜、精萃露上使用，添加量(质量百分比)为5-50％不等。胚胎提取物B的投料量可取代护肤产品中原有水分相应的含量。在柔肤水、面膜、眼部护理产品、身体霜、手部护理等产品上使用视最终产品性质添加。主要功效是抗氧化损伤(氧化损伤会造成病理性衰老)。
胚胎提取物A和胚胎提取物B也可协同使用，二者为相同的质量标准，比如相同的有效物质含量(具体为1.5％-2.3％)，在此基础上，具有不同体积比例终产品，其主要功效不一样。例如胚胎提取物B的含量大胚胎提取物A，胚胎提取物A和胚胎提取物B的体积配比(具有相同的质量标准)可以是1:1或1:2等。当胚胎提取物B的含量大胚胎提取物A时，主要功效是抗氧化损伤(氧化损伤会造成病理性衰老)，次要功效为抗生理性衰老；同理，如果胚胎提取物A含量大于胚胎提取物B含量，主要功效为抗生理性衰老，次要功效为抗氧化损伤。胚胎提取物A与胚胎提取物B按比例混合后作为化妆品原料，在脸部护肤产品如日霜、夜霜、精萃露上使用。添加量(质量百分比)为5-50％不等，胚胎提取物A与胚胎提取物B的投料量可取代护肤产品中原有水分相应的含量。在柔肤水、面膜、眼部护理产品、身体霜、手部护理等产品上使用视最终产品性质添加。
具体地，当所述化妆品为冻干粉时：
统一定量及调整胚胎提取物A和胚胎提取物B浓度，可为15～23mg/ml。单独的胚胎提取物A或胚胎提取物B，或胚胎提取物A及胚胎提取物B按不同比例混合，例如主要功效为抗氧化损伤(病理性衰老)，兼具抗生理性衰老，则保证胚胎提取物B的含量大于胚胎提取物A，例如胚胎提取物A和胚胎提取物B的体积配比(具有相同的质量标准)可以是1:1，或者1:2。添加冻干赋形剂，可以是甘露醇，可以是谷氨酸钠、赖氨酸等赋形剂；可以添加海藻糖等保湿成分，无菌过滤、分装、冻干。溶媒可以是注射用水，可以加入无菌透明质酸钠，或其他保湿成分。1ml的胚胎提取物原液冻干粉，用5～10ml溶媒溶解，脸部涂抹使用。
当所述化妆品为日霜时：
在日霜的配料里，按质量百分比添加5％-50％的胚胎提取物，可以是胚胎提取物A，或者胚胎提取物B，或者胚胎提取物A或胚胎提取物B按一定比例的混合，原理同上(对主要功效的选择)，例如胚胎提取物B的含量大于胚胎提取物A，例如胚胎提取物A和胚胎提取物B的体积配比(具有相同的质量标准)为1:1，或者1:2，优选1:2混合，胚胎提取物的投料量可取代面霜配方中原有水分相应的含量。面霜配方包含水、二氧化钛、角鲨烷、鲸蜡醇乙基己酸酯、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、烟酰胺、尿囊素、红没药醇、二裂酵母发酵产物溶胞产物、透明质酸钠等成分，并不局限于上述成分。
当所述化妆品为夜霜时：
在夜霜的配料里，按质量百分比添加5％-50％的胚胎提取物，可以是胚胎提取物A，或者胚胎提取物B，或者胚胎提取物A或胚胎提取物B按一定比例的混合，原理同上(对主要功效的选择)，例如1:1，或者1:2，优选1:2混合，胚胎提取物的投料量可取代夜霜配方中原有水分相应的含量。夜霜配方包含水、鲸蜡醇乙基己酸酯、霍霍巴籽油、鲸蜡硬脂醇、牛油果树果脂、泛醇、二裂酵母发酵产物溶胞产物等成分，并不局限于上述成分。
当所述化妆品为精粹露时：
在精萃露的配料里，按质量百分比添加5％-50％的胚胎提取物，可以是胚胎提取物A，或者胚胎提取物B，或者胚胎提取物A或胚胎提取物B按一定比例的混合，原理同上(对主要功效的选择)，例如胚胎提取物B的含量大于胚胎提取物A，例如胚胎提取物A和胚胎提取物B的体积配比(具有相同的质量标准)，为1:1，或者1:2，优选1:2混合，胚胎提取物的投料量可取代精萃露配方中原有水分相应的含量。精粹露配方包含水、霍霍巴籽油、红没药醇、二裂酵母发酵产物溶胞产物等成分，并不局限于上述成分。
当所述化妆品为面膜时：
在面膜的配料里，按质量百分比添加3％-10％的胚胎提取物，可以是胚胎提取物A，或者胚胎提取物B，或者胚胎提取物A或胚胎提取物B按一定比例的混合，原理同上(对主要功效的选择)，例如胚胎提取物B的含量大于胚胎提取物A，例如胚胎提取物A和胚胎提取物B的体积配比(具有相同的质量标准)为1:1，或者1:2，优选1:2混合，胚胎提取物的投料量可取代面膜配方中原有水分相应的含量。面膜配方包含水、透明质酸钠、聚谷氨酸钠、积雪草提取物、光果甘草根提取物、母菊花提取物等成分，并不局限于上述成分。
此外，本发明的第五个方面提供了一种抗衰老保健食品，包括上述的胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D中的至少一种。
胚胎提取物A及胚胎提取物B为原液，可与其他食品原料制成口服液。胚胎提取物C及胚胎提取物D已提取为冻干粉形式，可以单独使用，或者联合使用作为生产胚胎素胶囊的原料，直接用于抗衰老保健食品。也可以与其他原料制粒，做成不同型制的保健食品。考虑到原料成本，优选使用胚胎提取物C和/或胚胎提取物D作为保健食品的原料。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，包括如下步骤(图1)：
(1)挑选身体健康、体重20-26kg、年龄2-3岁、发情周期正常的经产母羊作为待孕羊。待山羊孕期90天左右，手术方法解剖母羊，得到无菌的山羊胚胎，置于无菌容器内，去除胃肠道及胎粪，并用生理盐水洗净，-30℃保存或进入下一步。母羊手术缝合伤口。
(2)将山羊胚胎置于无菌容器称重，剪成碎块。加入适量蒸馏水于无菌匀浆器，置入胎羊碎块进行匀浆，在匀浆液中加入适量蒸馏水稀释，蒸馏水总的质量是胎羊质量的2-6倍。
(3)匀浆液置于无菌容器放置-30℃，确保冻结后进入下一步。
(4)取出已冻结的匀浆液室温解冻，待完全融化后转入无菌耐热容器，置于70℃水浴1个小时，其中保证匀浆液在70℃保温至少维持30分钟。150目不锈钢筛网过滤，得到液体A和固体B。
(5)液体A转入无菌容器，-30℃确保冻结，进入下一步。固体B转入无菌耐热容器，加入木瓜蛋白酶。置于70℃水浴1个小时，其中保证在70℃保温至少维持30分钟。100目不锈钢筛网过滤得到液体B。液体B自然冷却(保持冷却时间至少2个小时)，-30℃确保冻结后进入下一步。此时滤渣为少量的骨头等水解残留物，弃去。
(6)分别取上步骤的液体A及液体B自然解冻，无菌纱布滤过上清。底部少量沉淀离心去除，4℃，8000rpm，30分钟，上清并入纱布过滤的滤过液，得到滤过液A和滤过液B。
(7)滤过液A和滤过液B分别转入无菌容器，使用切向流超滤系统，30k孔径，超滤。分别收集到的超滤滤过液为胚胎提取物A和胚胎提取物B。
(8)未滤过的浓缩液，分别采用冷冻离心方式，4℃，8000rpm，30分钟，收集上清，无菌过滤，冻干机冻干，分别得到胚胎提取物C和胚胎提取物D。
实施例2
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)代孕山羊的年龄为1岁，体重18-20kg。
与实施例1的结果相比可以看出，选择的待孕山羊的体重较轻、年龄较小，对孕育胚胎的个头比较小，得到的胚胎比较瘦弱，可供提取的有效成分的量较少。
实施例3
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)中的胎羊，去除了心、肝、脾、肺、肾、肠道、胃等内脏，还去除了大脑、眼球等组织，仅保留胎羊的躯干。
与实施例1的结果相比可以看出，去除大脑、眼球、心、肝、脾、肺、肾等器官，所提取的抗衰老组分比较少，比如超氧化物歧化酶含量不高等；另外，对抗衰老起保护作用的有效成分也比较少，如晶体蛋白等。
实施例4
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中置于60℃水浴1.2个小时。
与实施例1的结果相比可以看出，相对于本实施例的60℃，实施例1中的70℃对热不稳定蛋白成分、非蛋白固体成分、未溶于溶剂的成分可以起到充分沉淀作用，还能热裂解出充分的小分子蛋白质成分。
实施例5
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)和步骤(5)中置于80℃水浴0.8个小时。
与实施例1的结果相比可以看出，相对于本实施例的80℃，实施例1中的70℃更能保护热裂解成分的有效活性。
实施例6
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(5)中使用的水解蛋白酶为胃蛋白酶。
与实施例1的结果相比可以看出，木瓜蛋白酶从含泛素的蛋白质里裂解出泛素分子，胃蛋白酶倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽键，裂解出的泛素含量并不高。
实施例7
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(5)中使用的水解蛋白酶为胰蛋白酶。
与实施例1的结果相比可以看出，胰蛋白酶专一作用于有碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键，所裂解的肽段较小，肽段失去应有的功能活性，比如泛素分子被切得更碎，失去标记冗余蛋白的功能等。
实施例8
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，将步骤(5)中自然冷却替换为在4℃条件下冷却。
与实施例1的结果相比可以看出，自然冷却以酶切更充分的时间，酶切条件温和，有利于木瓜酶的充分反应以及蛋白质的充分裂解。可以提取到更多的具有抗氧化作用的小分子物质。4℃冷却，酶切反应时间缩短，酶切活性被抑制。
实施例9
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(7)中使用15k孔径超滤膜进行超滤。
与实施例1的结果相比可以看出，30K孔径的超滤膜包，其蛋白质组分的分子量范围主要在10K-15K左右，在胚胎提取物A中，15K及15K以下的蛋白质成分占总蛋白成分的百分比含量在95％以上，在胚胎提取物B中，10K及10K以下的蛋白质成分占总蛋白成分的百分比含量在95％以上其中包括泛素分子。15k孔径的超滤滤过液主要为分子量为5K及5K以下的小分子多肽，虽然也具有优秀的抗氧化功能及对皮肤的穿透性，但缺乏泛素、晶体蛋白等有效成分。
实施例10
本实施例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，使用的是绵羊的胚胎。
对比例1
本对比例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(3)中不包含冷冻步骤。
与实施例1的结果相比可以看出，经过-30℃的冷冻，可以冻裂细胞，释放细胞中的蛋白质，提取到的胚胎提取物含有丰富的细胞内蛋白质成分及其他非蛋白成分。
对比例2
本对比例提供了一种胚胎提取物的提取方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)和步骤(5)中置于55℃水浴1个小时。
步骤(4)中55℃水浴温度不够高，不能有效沉淀热不稳定蛋白和解离大分子蛋白，降低有效成分含量和产量；步骤(5)中55℃水浴温度不够高，不能充分的从蛋白质中水解出有效的肽段，降低了有效肽段的含量。
为验证本发明提取得到的胚胎提取物的效果，对实施例1提取得到的胚胎提取物进行抽样质检及功能验证：
实验例1胚胎提取物分子量大小比较
通过SDS-PAGE电泳，对胚胎提取分子量大小进行比较。
如图3所示，胚胎提取物A蛋白质成分分子量范围，主要是小于15K蛋白及多肽；而胚胎提取物B蛋白质成分分子量范围，主要是小于10K蛋白及多肽，其中包含含量比较高的泛素。
胚胎提取物C包含了分子量较大的主要成分为血红蛋白、白蛋白等；胚胎提取物D的蛋白质分子组成主要是组蛋白等。
实验例2胚胎提取物的紫外检测及浓度测定
分别称取冷冻干燥而来的胚胎提取物A、B、C、D固体，用水稀释，分别使用核酸蛋白测定仪测定紫外吸收波长及BCA法对其蛋白质成分浓度验证，如下表1及图4中的A、图4中的B、图4中的C、图4中的D。由于蛋白质分子中常酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其吸收值与蛋白质浓度成正比，故可用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。
BCA分析主要依靠蛋白质中的肽键将硫酸铜中的Cu2+还原成Cu+(反应依赖于温度)，其中减少的Cu2+的量与溶液中存在的蛋白质的量成比例，据此来检测蛋白质含量。在本实验中，样品经TCA沉淀蛋白后重新溶解测量，所测量到的主要是分子量较大的蛋白质成分。
如表1所示，以胚胎提取物的干粉稀释的浓度数值(称量干粉并溶解，包含蛋白质成分及非蛋白质成分)为标准浓度，与在280nm波长测定的浓度值相当(假定样品主要为蛋白质成分)，但与BCA法测定的蛋白浓度数值差异较大。胚胎提取物C主要成分为大分子蛋白质成分，但胚胎提取物A、胚胎提取物B及胚胎提取物D中含有较多的不被TCA沉淀的小分子蛋白质及小肽等成分，这些成分提供了胚胎提取物在化妆品及保健品应用中的抗衰老功能。从紫外吸收图谱(图4A-D)也可看出，胚胎提取物A、B、C、D的物质组成具有巨大的差异性。
表1胚胎提取物蛋白组分浓度验证
实验例3胚胎提取物的体外抗氧化活性
分别采用邻苯三酚自氧化化学法、邻二氮菲-亚铁化学法以及硫代巴比妥酸法检测胚胎提取物不同组分的清除超氧阴离子自由基、羟自由基的能力和抑制脂质过氧化能力，方法见段末参考文献[1-5]。从而分析胚胎提取物各组分的体外抗氧化活性能力的差异。结果表明胚胎提取物A及胚胎提取物B均呈现了一定的抗氧化活性。其中胚胎提取物B的体外抗氧化活性以及抑制脂质过氧化的能力比较显著，对开发优质高效美容养颜产品等方面均具有重要的意义。见图5中的A、图5中的B、图5中的C所示。
体外抗氧化实验参考文献如下：
[1]程莹,朱振中等.抗氧化活性综合评价方法研究[J].应用化工,2012,41(1):123-125.
[2]韩少华,朱靖博,王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].中国酿造,2009,207(6):155-157.
[3]Michael A,Paul D P,Emilios P,et al.Methods for testing antioxidantactivity[J].Analyst,2002,127:183-198.
[4]Marklund S,Marklund G.Involvement of the superoxide anion radicalin theautoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxidedismutase[J].Eur J Biochem,1974,47:469-474.
[5]金鸣,蔡亚欣,等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理进展,1996,23(6):553-555.
实验例4胚胎提取物对小鼠胚胎成纤维细胞增值作用
皮肤成纤维细胞可合成与分泌胶原纤维、弹性纤维，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，其数量减少是引起皱纹产生的重要原因。在成纤维细胞的培养液中，添加羊胎素成分，检测成纤维细胞增殖率，可证明功效物质对胶原蛋白合成的促进及抗氧化损伤的作用机制。
将小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)从机体中取出，经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
种细胞体积200ul，细胞数目分别为：500个/孔，1000个/孔，1500个/孔，每空4个重复。接种细胞后次日加胚胎提取物原液(以胚胎提取物A为例，胚胎提取物B也有类似的刺激细胞增值作用)，添加胚胎提取物后终浓度分别为5mg/ml，2.5mg/ml，1.25mg/ml，0.65mg/ml；培养72小时(3天)。采用CCK8检测细胞增值率，CCK8添加量20ul/孔(培养液200ul)，加药后培养3个小时，450nm测OD值。增值率P％＝OD实验组/OD阴性对照组×100％，并相对于对照组的增值率作图(增长倍数)，如下图6(对照组为1)。
从数据看出，不同浓度的胚胎提取物对细胞均具有刺激增值作用，其中在2.5mg/ml时对成纤维细胞的促生长效果最好，跟对照(不添加胚胎提取物)相比有6-12倍的增值效率。
实验例5胚胎提取物活性氧(ROS)测定实验
采用碧云天活性氧检测试剂盒，检测加胚胎提取物后，培养的小鼠胚胎成纤维细胞的活性氧变化。
小鼠胚胎成纤维细胞P5代，去除培养液，PBS洗2遍，37℃预温的0.25％胰酶消化2-5钟，显微镜观察细胞消化状态，确认消化完全后，加等量完全培养基(含血清)终止反应，转移细胞液体至15ml离心管，1200RPM，离心5分钟，去除上清，加3.6ml完全培养基溶解沉淀，平均分装18管，每管200ul。每管ep管预加入0.8ml完全培养基，培养液含添加的胚胎提取物等，共计1ml，胚胎提取物终浓度2.5mg/ml，开盖，放置37℃，5％二氧化碳，细胞培养箱培养3小时后离心去除培养液，加入无血清培养基1ml溶解沉淀，并加入1ul探针DCFH-DA(按说明书)，培养20分钟标记探针，每隔3-4分钟颠倒摇匀。探针标记结束后1200rpm离心，去上清，PBS洗3次，最后溶于200ul PBS，上流式细胞仪检测。使用488nm激发波长，525nm发射波长，检测刺激前后荧光的强弱。仪器型号：贝克曼库尔特CYTO FLEX。
活性氧测定结果如图7所示，胚胎提取物样品A1001、A3001与细胞共培养培养3小时，细胞内活性氧平均含量明显比对照组N(不加任何药物)降低，也比加H2O2组降低，说明胚胎提取物能够去除细胞中的活性氧(ROS)。
实验例6胚胎提取物的保健效果(提取物C，A1002；提取物D，A3002)
验证胚胎提取物的保健效果，主要为抗衰老的功效。机体的衰老具有12个特征，其中原发性的特征为基因组不稳定、端粒损耗、表观遗传学改变、蛋白质稳态丧失、自噬障碍；拮抗性特征为营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、综合性特征为干细胞耗竭、细胞间通讯改变、慢性炎症和微生态失调(见参考文献)等方面。胚胎提取物作为保健品对机体的抗衰老功效，主要体现在提高有机体的免疫功能，降低慢性炎症对机体带来的损伤，从而达到保健的功效。
本实验的小鼠品系为C57BL/6J，年龄12月龄，属于中年年龄，相当于人42岁左右。小鼠18只，分为3组，第一组对照组，灌胃蒸馏水；第二组胚胎提取物C组(A1002),第3组为胚胎提取物D组(A3002)，每天灌胃一次，一次0.5ml，胚胎提取物浓度为100mg/ml，连续灌胃60天，检测小鼠血常规，以及比较小鼠毛发、运动等状态。
由于小鼠为12月年龄，背部毛发有严重的脱毛情况，在饲喂时去除部分背部鼠毛，观察鼠毛的生长情况。
实验结果显示，实验组小鼠血常规指标中，红细胞、血红蛋白含量、血小板等相关指标与对照组类似，没有显著性差异；但白细胞的数据有明显的差异，如图8所示。对照组(灌蒸馏水)的白细胞数目远高于实验组。白细胞包含粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等)、淋巴细胞、单核细胞、3类，对照组中粒细胞和淋巴细胞数目均大于实验组，预示着随着小鼠年龄的增加，慢性炎症的发生也比较活跃，灌了胚胎提取物的小鼠降低了慢性炎症的发生，有效的抵抗了机体的衰老。另外，对3组小鼠的毛发、运动等观察，也证实灌了胚胎提取物的小鼠比对照组小鼠新长出的毛发更鲜亮，也更浓密，运动上也更有活力。如图9所示。
保健品抗衰老参考文献：
López-Otín C,Blasco MA,Partridge L,Serrano M,Kroemer G.Hallmarks ofaging:An expanding universe.Cell.2023Jan 19；186(2):243-278.doi:10.1016/j.cell.2022.11.001.Epub 2023Jan 3.PMID:36599349.
实验例7胚胎提取物的质量检测
根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)相关章节的检测方法，对胚胎提取物进行质量检测，检测项目包括砷、汞、铅、镉等重金属及菌落总数、霉菌和酵母菌、耐热大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等检测，检测结果符合要求。以胚胎提取物A为例，如图10所示。
实验例8胚胎提取物的毒理检测(以胚胎提取物A为例)
(1)激素检测
根据GB/T24800.2-2009液相色谱-串联质谱法，检测样品中糖皮质激素、可的松等41项激素指标，检测方法的检测下限为0.03ug/g。所有激素指标均未检出。以胚胎提取物A为例，如图11所示
(2)多次皮肤刺激性实验
取新西兰兔各4只，雌雄不限，体重2.44kg-2.91kg，在21.6℃-23.4℃环境饲养，相对湿度50.5％-62.8％，单笼饲养，实验前在实验动物房环境中至少适应3天。实验前约24小时将动物背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围3cm×3cm。涂抹面积2.5cm×2.5cm。取受试样品(以胚胎提取物A为例，0.5ml涂抹在一侧去毛皮肤上，另一侧去毛皮肤作为对照，每天涂抹1次，连续涂抹14天。从第2天开始，每次涂抹前剪毛，用温水清除残留受试样品，1小时后观察结果。刺激反应指标为红斑、水肿，并积分。试验期间，实验动物均未出现异常症状。14天内每天每只动物平均积分为0，与对照一致。在本试验条件下，受试样品对家兔多次皮肤刺激性为无刺激性。实验结果如图12所示
(3)皮肤变态反应试验-BT法
选用荷兰种豚鼠，每个样品(以胚胎提取物A为例)的实验动物分别为实验组和阳性对照组，各20只，阴性对照组10只。动物雌雄不限，雌性动物选用未孕和未曾产仔，体重：258.1g-274.6g；阳性对照品为α-己基肉桂醛。
试验前动物在实验动物房环境中至少适应3d。试验前约24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围约为6cm2。
诱导接触：将0.2mL受试样品涂在试验组动物2cm×2cm去毛皮肤上，以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6h。第7d和第14d以同样方法重复一次。阳性对照组用60％α-己基肉桂醛溶液同法操作，阴性对照组除不给予受试物外与试验组同法操作。
激发接触：末次诱导后14d，将0.2mL受试样品涂于试验组和阴性对照组豚鼠背部右侧2cm×2cm去毛区(接触前24h脱毛)，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6h。阳性对照组用30％α-己基肉桂醛溶液同法操作。激发接触结束后24h和48h观察皮肤反应，评分并判定致敏强度。
皮肤反应指标为红斑、水肿。在试验期间，实验动物均未出现异常症状，各观察时点的致敏率均为0％。在本试验条件下，受试样品对豚鼠皮肤变态反应试验结果为：未见皮肤变态反应。结果以胚胎提取物A为例，如图13所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种胚胎提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将经过预处理的动物胚胎匀浆后冷冻；
(b)将冷冻的匀浆液解冻后在65～80℃温度下水浴0.5～1.5h，固液分离得到液体A和固体B；
(c1)将得到的液体A冷冻，得到中间品A；
(c2)向得到的固体B中加入蒸馏水和水解蛋白酶，在65～80℃温度下水浴0.5～1.5h，固液分离得到液体B，然后将得到的液体B冷冻，得到中间品B；
(d)分别将中间品A和中间品B解冻后过滤，取滤过液分别得到胚胎提取物A和胚胎提取物B；取未滤过浓缩液分别得到胚胎提取物C和胚胎提取物D。
2.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述预处理包括去除动物胚胎的胃肠道和胎粪，并清洗；
优选地，匀浆时加入动物胚胎质量2～6倍的蒸馏水；
优选地，所述冷冻的温度为-30～-20℃，优选为-30℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，在20～25℃温度下进行解冻；
优选地，所述水浴的温度为60～80℃，优选为70℃；
优选地，所述水浴的时间为0.8～1.2h，优选为1h；
优选地，采用80目至120目的筛网过滤进行固液分离，优选采用100目筛网过滤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c1)中，所述冷冻的温度为-30～-20℃，优选为-30℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c2)中，所述蒸馏水的加入量为固体B质量的2～6倍；
优选地，所述水解蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的至少一种；
优选地，加入水解蛋白酶的质量是固体B质量的0.1％～0.5％；
优选地，所述水浴的温度为60～80℃，优选为70℃；
优选地，所述水浴的时间为0.8～1.2h，优选为1h；
优选地，所述冷冻的温度为-30～-20℃，优选为-30℃；
优选地，采用100目至200目筛网过滤进行固液分离，优选采用150目筛网过滤。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)中，在20～25℃温度下进行解冻；
优选地，所述过滤包括使用15～30k孔径超滤膜进行超滤；
优选地，将所述未滤过浓缩液分别离心取上清，得到胚胎提取物C和胚胎提取物D；
优选地，所述离心的条件包括6000～8000rpm、20～50min或2～10℃中的至少一种；
优选地，还包括将所述上清冻干的步骤，分别得到冻干粉胚胎提取物C和冻干粉胚胎提取物D。
7.采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的胚胎提取物；
优选地，所述胚胎提取物包括胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D。
8.权利要求7所述的胚胎提取物在制备抗衰产品中的应用；
优选地，所述的胚胎提取物A和/或胚胎提取物B在制备抗衰化妆品中的应用；
优选地，所述的胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D中的至少一种在制备抗衰食品中的应用。
9.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求7中所述的胚胎提取物A和/或胚胎提取物B。
10.一种食品，其特征在于，包括权利要求7中所述的胚胎提取物A、胚胎提取物B、胚胎提取物C和胚胎提取物D中的至少一种。
CN202310998920.6A 2023-08-08 2023-08-08 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用 Pending CN117547499A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310998920.6A CN117547499A (zh) 2023-08-08 2023-08-08 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310998920.6A CN117547499A (zh) 2023-08-08 2023-08-08 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117547499A true CN117547499A (zh) 2024-02-13

Family

ID=89811755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310998920.6A Pending CN117547499A (zh) 2023-08-08 2023-08-08 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117547499A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104195205B (zh) 从动物胎盘制备高活性胶原蛋白肽的方法与所制备的高活性胶原蛋白肽及其用途
CN110218756B (zh) 一种具有抗衰作用的富硒鲟鱼骨肽提取方法及产品
US20070010430A1 (en) Proteoglycan isolated from cartilaginous fish and process for producing the same
CN110724203B (zh) 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用
CN110638681A (zh) 一种贻贝抗过敏肽的制备方法及在化妆品中的应用
CN116514912B (zh) 抗皮肤氧化损伤的草菇多肽及其应用
EP2730585B1 (en) Protein-polypeptide complex obtained from tissues of embryos of hoofed animals , use on skin tissue, method for producing said complex and pharmaceutical composition
EP2589389B1 (en) Method for producing a biologically active complex. biologically active protein/polypeptide complex
Morse Factors involved in the atrophy of the organs of the larval frog
EP2730586B1 (en) Protein-polypeptide complex obtained from tissues of hoofed livestock embryos, process for preparing same and pharmaceutical composition
JPS62236499A (ja) 生物学的に活性なポリペプチド、それらの製造方法ならびにそれらを含有する組成物
CN117547499A (zh) 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用
CN105254749B (zh) 一种生物活性多肽yvta及其制备与应用
CN116869853A (zh) 鲟鱼籽肽粉及其制备方法、化妆品组合物
EP2730584B1 (en) Protein-polypeptide complex obtained from nervous tissue of hoofed livestock embryos, process for preparing same and pharmaceutical composition
US4908206A (en) Extracts of embryonic organs, process for their preparation and pharmaceutical preparation containing them
RU2274003C2 (ru) Способ комплексной переработки крови сельскохозяйственных животных для получения биологически активного вещества с противоанемическими свойствами на основе гемоглобина, биологически активное вещество с противоанемическими свойствами (варианты) и продукт, его содержащий (варианты).
EP3087176B1 (en) Multipotent and immunocompatible stem cell concentrate
KR100462166B1 (ko) 강정효과를 갖는 나방이 이전의 누에 수 번데기 추출물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 식품 및 약제학적 조성물
CN115154351B (zh) 含熊果苷的皮肤美白用组合物
US20040076618A1 (en) Placental preparation having antitumor activity
TWI745609B (zh) 具抗氧化活性之組合物
CN115109132B (zh) 一种具有抗氧化、抗衰老活性的多管藻藻红蛋白活性肽及其制备方法与应用
CA3105317C (en) Composition with inhibiting fat formation and antioxidative activities and use thereof
RU2678588C1 (ru) Способ нормализации эмоционально-психического состояния домашних животных

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination