CN111330000A - 一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法 - Google Patents

一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法，疫苗使用DC细胞负载legumain蛋白制备；树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的注射方式为：细胞混悬液，经X射线血液辐照仪照射，3Gy/min，照射1min；混悬液，通过尾静脉注射回输机体体内。本发明的有益之处在于：利用体外培养DC，然后通过legumain特异性抗原的刺激，同时通过X射线辐照的方式，消除机体异常的免疫应答，然后回输机体体内，进而唤醒免疫细胞的记忆，达到治疗肿瘤的目的；通过联合手术和放化疗，对于微小组织以及残余组织的清除，对于防止肿瘤复发和转移，具有较大的应用价值。

Description

一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白治疗肝癌的新方法，具体涉及一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法，属于医药技术领域。
背景技术
哺乳动物免疫系统分为两个部分，一部分是固有免疫应答系统，另一部分是适应性免疫应答系统，两者不是孤立的，而是形成一个统一的整体。
当外界的病原微生物或机体自身细胞发生凋亡时所释放的成分刺激机体，固有免疫系统首先发挥作用。当人体的固有免疫系统，不足以应付体外的刺激或者体内的变异时，就要根据外界抗原的性质，刺激量以及刺激强度，同时权衡自身的免疫状况，来决定和调控是否启动适应性免疫应答。抗原提呈细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells,DC)等，便是连接固有免疫和适应性免疫应答的桥梁。
DC是功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)，通过自身表达的某些分子，决定免疫应答的类型和强度，尤其是其成熟状态与否，直接影响机体的免疫平衡。成熟DC(Mature DC,mDC)能有效提呈抗原、激活初始T细胞、启动适应性免疫应答；未成熟DC(Immature DC,imDC)则不能启动适应性免疫应答，甚至引发机体免疫耐受。
Legumain又称天冬酰胺内肽酶(AEP)，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其基因定位于14号染色体，与动脉粥样硬化，脑退行性变，肝脏纤维化，抗原加工处理等过程密切相关，同时，在机体乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，而在正常组织中，不表达或者表达水平极低。Legumain的表达程度能够增强肿瘤细胞的运动，增殖和迁移能力，具有一定的肿瘤特异性。
肿瘤疾病的发生和发展，其根本原因是，机体的固有免疫系统，特别是适应性免疫系统，无法识别变异的细胞，导致细胞异常增殖，其增殖的数量，超过机体承受的限度，就会导致肿瘤发生。
所以，我们设想选择高敏感度的抗原，在体外触发机体的免疫系统，在实际的肿瘤治疗中，具有一定的可行性，特别是对于手术，放化疗后的患者，能够清除微小肿瘤残灶，进而最大程度防止复发和转移方面，具有一定的治疗价值。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种树突状细胞负载legumain蛋白治疗肝癌的新方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，使用DC细胞负载legumain蛋白制备。
优选的DC细胞培养步骤包括：
步骤一：小鼠眼球取血，置于EDTA抗凝管中；44
步骤二：Ficoll淋巴细胞分离液和生理盐水1：1混合，配制成单个核细胞提取液，放于离心管中；
步骤三：将EDTA抗凝的全血缓慢加入单个核细胞提取液表面，离心后分为三层；
步骤四：用移液器，轻轻吸取中间层，用RPMI-1640基础培养基洗涤两遍，调整细胞浓度为1×106/mL，置于RPMI-1640基础培养基中，温箱中孵育2～3h，用预温的RPMI1640液轻轻冲刷细胞，洗去未贴壁的细胞，吸取基础培养基；
步骤五：加入X-Vivo无血清培养基，包含IL-4，GM-CSF,青链霉素，放入温箱中继续培养，此时定为细胞培养的第0d，以后，隔日半定量换液，轻轻摇动培养板，防止细胞凝集，在细胞培养的第6d收集细胞。
优选的DC细胞培养步骤四中，温箱条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
优选的legumain蛋白提取和纯化步骤包括：
步骤一：处死小鼠，取出小鼠肝脏，切除肿瘤组织，进行免疫组织化学筛查，确认legumain高表达；
步骤二：切除1g左右的肿瘤组织，置于生理盐水中，充分剪碎肿瘤组织，加入2-3倍Tris-NH4CL裂解液，充分匀浆，过滤，获得匀浆液，在低温离心机高速离心，收集上清液，进一步滤网过滤，去掉大的杂质，收集过滤后的液体；
步骤三：加入含有Sepharose 6B的层析过滤柱预平衡，加入样品，用缓冲液、NaCl溶液进行洗涤，再用SDS，对层析柱最后洗涤，收集有蛋白流出的截段，置于聚乙二醇溶液中，进一步浓缩；
步骤四：将1μg相应的Anti-legumain抗体和10-50μl protein A/G-beads混合，加入到步骤四得到的浓缩液中，在4℃缓慢摇晃孵育过夜；
步骤五：将步骤五所获得的溶液离心，将protein A/G-beads离心至管底；去掉上清液，legumain蛋白和附着于ProteinA/G柱子上的抗体相结合；加入20uL的SDS缓冲液，冲洗，然后沸水煮10min；得到的缓冲液低温真空干燥，即为legumain蛋白样品。
优选的legumain蛋白提取和纯化步骤中步骤二的离心条件为4℃，25,000rpm，3小时。
优选的legumain蛋白提取和纯化步骤中步骤三的Sepharose 6B层析过滤柱中包含20mmol/L，pH＝7.2的Tris溶液，然后加入样品，缓冲液是20mmol/L的Tris溶液，NaCl溶液是溶度为1mmol/L,pH值为8.5。
优选的DC细胞负载legumain蛋白的步骤为：
步骤一：收集培养6天树突状细胞，镜下观察状态良好；
步骤二：按照104细胞：1ng的比例，加入legumain蛋白，然后两者共培养4h，镜下观察，加入100ml浓度为5％的糖盐水，制成细胞混悬液。
树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的注射方式为：细胞混悬液，经X射线血液辐照仪照射，3Gy/min，照射1min；混悬液，通过尾静脉注射回输机体体内。
本发明的有益之处在于：
利用体外培养DC，然后通过legumain特异性抗原的刺激，同时通过X射线辐照的方式，杀灭细胞混悬液释放的异常成分，消除机体异常的免疫应答，然后回输机体体内，进而唤醒免疫细胞的记忆，达到治疗肿瘤的目的；
通过联合手术和放化疗，对于微小组织以及残余组织的清除，对于防止肿瘤复发和转移，具有较大的应用价值。
附图说明
图1是本发明树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的制备过程总体技术路线；
图2是第6天DC细胞40X下光镜图；
图3是免疫组织化学检测小鼠肝脏组织legumain蛋白的表达情况；
图4是免疫蛋白印迹检测结果；
图5是DC和legumain共培养4h后DC细胞40X下光镜图；
图6是不同治疗策略下小鼠生存中位数比较；
图7是患瘤小鼠接受治疗后，其体内肝脏肿瘤组织大小对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
如图1所示，一种树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的制备过程，使用DC细胞负载legumain蛋白。
具体制备过程为：
1、实验动物分组和肝癌模型制备
取新鲜的人的肝癌切除标本，在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1mm3小块。
取2块瘤组织，在离体40min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。
取上述2块瘤组织，在离体40min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。
60只老鼠，分为6组，每组10只小鼠。分组情况如下：G0组，作为取材组，眼球采血，肿瘤肿块提取legumain蛋白；G1组，对照组，不做任何治疗；G2组，安慰剂组，尾静脉注射生理盐水；G3组，DC治疗组；G4组，DC-legumain联合治疗组；G5组，顺铂治疗组，作为阳性对照，以浓度1ug/g溶于生理盐水中，尾静脉推注。
2、DC细胞培养
小鼠眼球取血，置于EDTA抗凝管中；Ficoll淋巴细胞分离液(GElife)和生理盐水1：1混合，配制成单个核细胞提取液，放于一个15mL的离心管中；EDTA抗凝的全血缓慢加入单个核细胞提取液表面；1,200rpm，10min，离心，此时血液分为上中下三层；用移液器，轻轻吸取中间层；中间层细胞用RPMI-1640基础培养基(Hyclone)洗涤两遍(1,200rpm,5min)；细胞镜下计数，用RPMI 1640调整细胞浓度为1×106/mL；然后置于3-4mL RPMI-1640基础培养基中，温箱中(37℃、5％CO2、饱和湿度)孵育2～3h，使细胞充分贴壁，用预温的RPMI1640液轻轻冲刷细胞，洗去未贴壁的细胞，吸取基础培养基；然后加入完全培养基，X-Vivo无血清培养基(Lonza)包含IL-4(2ng/mL)，10ng/mL GM-CSF,青链霉素(100U/mL,Hepes(10mM))4mL，放入温箱中继续培养，此时定为细胞培养的第0d，以后，隔日半定量换液，轻轻摇动培养板，防止细胞凝集，在细胞培养的第6d收集细胞，在光镜下(40X)显示如图2所示，形态良好，细胞表面光滑。
3、legumain蛋白提取和纯化
断头术处死小鼠，取出小鼠肝脏，切除肿瘤组织，取材，按照免疫组织化学(IHC)常规步骤处理：福尔马林处理，蜡块包埋，取材，一抗孵育，HRP偶联的二抗反应，DAB显色。结果如图3所示，证实：肿瘤组织高表达legumain蛋白。
肿瘤组织剪碎，组织匀浆，层析过滤，挂柱，洗涤，低温干燥等多个步骤，免疫蛋白印迹(WB)检测，结果如图4所示，确认所提取的蛋白为Legumain蛋白(37KDa)。
切除1g左右的肿瘤组织，置于生理盐水中，用剪刀充分剪碎肿瘤组织；剪碎的组织，加入2-3倍裂解液(Tris-NH4CL液)，电动匀浆器，充分匀浆，过滤，获得匀浆液；匀浆液在低温离心机在4℃下，高速离心(25,000rpm,3h)，收集上清液，提取总蛋白；上清液，进一步滤网过滤，去掉大的杂质，收集过滤后的液体；将经过以上处理的样品上清液，加入150cm含有Sepharose 6B(GE life)的层析过滤柱(Tris溶液(20mmol/L，pH7.2))，层析柱首先预平衡，然后加入样品，缓冲液(Tris(20mmol/L)、NaCl(1mmol/L)，pH8.5)，进行洗涤；用2％SDS，对层析柱最后洗涤，收集有蛋白流出的截段；收集液放入透析袋中，置于聚乙二醇溶液中，进一步浓缩；将1μg相应的Anti-legumain抗体(Abcam)和10-50μl protein A/G-beads(Santa Cruz)混合，加入到浓缩液中，在4℃条件下，缓慢摇晃孵育过夜；反应完成后，在4℃以3000r速度离心5min，将protein A/G-beads离心至管底；去掉上清液，Legumain蛋白和附着于ProteinA/G柱子上的抗体相结合；加入加入20uL的SDS缓冲液，冲洗，然后沸水煮10min；得到的缓冲液低温真空干燥，即为legumain蛋白样品。
4、DC负载legumain
收集培养第6天树突状细胞，镜下观察状态良好；按照104：1ng的数量，加入legumain蛋白，作为靶抗原，两者共培养4h，镜下观察，其结果如图5所示，DC细胞分支明显增多，状态良好；然后加入加入100ml的糖盐水(5％)，制成细胞混悬液。
5、细胞混悬液X射线照射
细胞混悬液，经X射线血液辐照仪照射，3Gy/min，照射1min；混悬液，通过尾静脉回输机体体内，观察治疗效果。
6、观察治疗效果
对比观察治疗组小鼠和对照组小鼠的精神状态以及二便情况，观察不同组小鼠的生存时间。所有小鼠死亡后，切除肿瘤肿块，对比分析肿瘤的大小。通过多种指标，推断DC-legumain疫苗的治疗效果。
7、统计学分析
统计学处理应用SPSS Ver.11.5软件，样本比较采用独立样本的秩和检验，取P<0.05为有意义。
造模成功的小鼠，以治疗之日起，定为第一天(D1)，45天后，所有的50只患瘤小鼠全部死亡。小鼠生存中位数如图6所示，G1(对照组)和G2组(安慰剂组)的小鼠在10-15天内，小鼠全部死亡，生存中位数10-12天；G3组(DC组)的小鼠，存活时间为14-20天，生存中位数为15-17天；G4组(DC-legumain)存活时间为14-30天，生存中位数为23-25天；G5组(顺铂)存活时间12-16天，生存中位数为12-15天。结果可以看出，接受DC-legumain治疗的小鼠，存活时间最长，其次DC组，其次顺铂治疗组。并且，DC-legumain治疗组，小鼠精神状态明显好于顺铂和其他组(P<0.05)。说明DC-legumain在肿瘤的临床治疗中有一定的价值。
小鼠死亡后，切除肿瘤肿块，对比肿瘤大小，如图7所示，G3、G4以及G5，相对G1和G2而言，肿瘤都有明显缩小，但G5组，肿瘤虽然有缩小，但生存期短，这可能和顺铂的副作用有关。得到结论，DC-legumain治疗组和DC治疗组，肿瘤体积要小于其他组顺铂治疗组的肿瘤体积也相对缩小，综合肿瘤缩小程度和生存天数以及小鼠饮食和精神状态的综合判断，DC-legumain治疗组在缩小肿瘤体积，提升小鼠生存中位数，提升小鼠生存质量方面，都有重要意义。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的制备使用DC细胞负载legumain蛋白。
2.根据权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，DC细胞培养步骤包括：
步骤一：小鼠眼球取血，置于EDTA抗凝管中；
步骤二：Ficoll淋巴细胞分离液和生理盐水1：1混合，配制成单个核细胞提取液，放于离心管中；
步骤三：将EDTA抗凝的全血缓慢加入单个核细胞提取液表面，离心后分为三层；
步骤四：用移液器，轻轻吸取中间层，用RPMI-1640基础培养基洗涤两遍，调整细胞浓度为1×106/mL，置于RPMI-1640基础培养基中，温箱中孵育2～3h，用预温的RPMI1640液轻轻冲刷细胞，洗去未贴壁的细胞，吸取基础培养基；
步骤五：加入X-Vivo无血清培养基，包含IL-4，GM-CSF,青链霉素，放入温箱中继续培养，此时定为细胞培养的第0d，以后，隔日半定量换液，轻轻摇动培养板，防止细胞凝集，在细胞培养的第6d收集细胞。
3.根据权利要求2所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，DC细胞培养步骤四中，温箱条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
4.根据权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，legumain蛋白提取和纯化步骤包括：
步骤一：处死小鼠，取出小鼠肝脏，切除肿瘤组织，进行免疫组化筛查，确认legumain高表达；
步骤二：切除1g左右的肿瘤组织，置于生理盐水中，充分剪碎肿瘤组织，加入2-3倍Tris-NH4CL裂解液，充分匀浆，过滤，获得匀浆液，在低温离心机高速离心，收集上清液，进一步滤网过滤，去掉大的杂质，收集过滤后的液体；
步骤三：加入含有Sepharose 6B的层析过滤柱预平衡，加入样品，用缓冲液、NaCl溶液进行洗涤，再用SDS，对层析柱最后洗涤，收集有蛋白流出的截段，置于聚乙二醇溶液中，进一步浓缩；
步骤四：将1μg相应的Anti-legumain抗体和10-50μl protein A/G-beads混合，加入到步骤四得到的浓缩液中，在4℃缓慢摇晃孵育过夜；
步骤五：将步骤五所获得的溶液离心，将proteinA/G-beads离心至管底；去掉上清液，legumain蛋白和附着于ProteinA/G柱子上的抗体相结合；加入20uL的SDS缓冲液，冲洗，然后沸水煮10min；得到的缓冲液低温真空干燥，即为legumain蛋白样品。
5.根据权利要求4所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，legumain蛋白提取和纯化步骤中步骤二的离心条件为4℃，25,000rpm，3小时。
6.根据权利要求4所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，legumain蛋白提取和纯化步骤中步骤三的Sepharose 6B层析过滤柱中包含20mmol/L，pH＝7.2的Tris溶液，然后加入样品，缓冲液是20mmol/L的Tris溶液，NaCl溶液是溶度为1mmol/L,pH值为8.5。
7.根据权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗，其特征在于，DC细胞负载legumain蛋白的步骤为：
步骤一：收集培养6天树突状细胞，镜下观察状态良好；
步骤二：按照104细胞：1ng的比例，加入legumain蛋白，然后两者共培养4h，镜下观察，加入100ml浓度为5％的糖盐水，制成细胞混悬液。
8.一种权利要求1所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的使用方法，其特征在于，注射方式为：细胞混悬液，经X射线血液辐照仪照射，3Gy/min，照射1min；混悬液，通过尾静脉注射回输机体体内。
9.如权利要求1至7任一所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗和权利要求8所述的树突状细胞负载legumain蛋白疫苗的使用方法在肝癌治疗中的应用。
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