CN104673746B - 骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群的制备及其应用，所涉及的制备包括利用抗‑CD45抗体、抗‑Ter119抗体和抗‑Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群。所涉及的应用之一是骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群用于制备治疗肿瘤相关性贫血药物的应用。所涉及的应用之二是骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群用于制备缓解急性移植物抗宿主病药物的应用。

Description

骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备及其应用

技术领域

本发明涉及骨相关间充质干细胞，具体涉及骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群的制备及应用。

背景技术

骨龛的组成复杂多样，包含了多种细胞成分、细胞外基质成分、氧气张力生长因子、细胞因子，以及维持微环境的pH、离子强度、代谢物等物理化学因素。骨相关间充质干细胞(bone-associated MSC)是骨龛的组分细胞之一，其具有多种分化潜能，在不同的诱导条件下，骨相关间充质干细胞可以发育为骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。

发明内容

本发明提供的骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群的制备方法包括：利用抗 -CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群。

本发明同时还提供了骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群用于治疗肿瘤相关性贫血的应用。

本发明还提供了骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群制备缓解急性移植物抗宿主病的应用。

附图说明

图1为流式细胞仪鉴定骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群分选纯化的结果。

图2为分选的骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群，CD271⁺亚群和SSEA4-1⁺亚群体外培养5d后检测细胞增殖结果，显微镜放大倍率为400×。

图3为骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群支持造血重建结果；图A为技术路线示意图；图B为克隆形成分析结果；图C为骨髓移植后1-4月HSC重建形成分析，a图为HSC重建分析；b图为T细胞重建分析；c图为髓系细胞重建分析；d图为B细胞重建分析。

图4为野生型小鼠(Ctrl)、未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC) 和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠生存曲线比较结果。

图5为野生型小鼠(Ctrl)、未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC) 和亚群治疗组(B16/Sca1)的长骨比较。

图6为骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群移植治疗后，野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)，混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠外周血检测结果比较；图A为外周血中红细胞计数；图B为外周血中红细胞压积；图C为外周血中血红蛋白的浓度；图中*代表显著性差异程度，*P<0.05，**P< 0.01，***P<0.001；ns代表没有显著差异。

图7为骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群移植治疗后，野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)，混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠的骨髓中红系细胞发育检测，图A为流式检测图，图B为数据统计分析图。

图8为骨相关间充质干细胞移植治疗后，同种骨髓移植组(Ctrl)，异种骨髓移植组(BM)、混合群治疗组(MSC)和亚群治疗组(Sca1)的生存曲线比较结果。

图9为骨相关间充质干细胞移植治疗后，同种骨髓移植组(Ctrl)，异种骨髓移植组(BM)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)的临床评分比较结果。

具体实施方式

造血微环境(Niche)这一概念在1978年由Schofield首先提出。这是一种从低等动物到哺乳动物都存在的造血调控模式。多项研究证实，Niche是调控 HSC生理功能的主要功能单位，是HSC的维持和调控依赖的特定细胞微环境。Niche内的多种细胞可通过产生细胞因子，或者细胞直接接触的方式，去调控 HSC的自我更新、多向分化和不对称分裂。如Niche内Wnt信号的非经典成员 Flamingo和Frizzled分子之间的相互作用，直接参与维持HSC的稳态；抑制 Wnt信号同时活化mTOR信号，体内外均可有效维持HSC；内皮细胞来源的 Notch受体能促进LT-HSC的增殖；Niche来源的Hedgehog信号参与维持HSC，腺苷脱氨酶信号则可以对抗Hedgehog对HSC的调控作用。目前认为Niche 主要有血管龛和骨龛两种经典的结构。血窦内皮龛除了定位于骨髓以外，还存在于肝脏、脾脏等具有血窦结构的器官内；骨龛仅位于骨髓。骨龛通过其构成细胞产生的各种造血相关细胞因子或者信号分子对HSC的增生分化、发育、成熟、迁移、定居、释放、凋亡等活动产生直接影响作用，从而实现对HSC 生物学行为的调控。

作为Niche的重要组成部分，骨相关MSC不仅对HSC生理功能的调控过程起到了重要作用，而且对各系细胞，尤其是免疫细胞，如T细胞、树突细胞、 DC细胞等的分化发育都起到了调节作用。但是骨相关MSC是多种类型细胞组成的混合群细胞，其功能与MSC的来源、分离纯化技术、分选标记都有密切关系。

肿瘤相关性贫血(cancer related anemia,CRA)是恶性肿瘤常见的并发症之一，能显著影响临床治疗效果和肿瘤患者生存期。CRA发生的本质是实体肿瘤发生时，红系细胞发育分化的过程异常，导致患者外周血中单位容积内红细胞计数、血红蛋白浓度或红细胞压积异常，即临床症状为贫血。目前临床上CRA 的治疗方案主要是采用对症治疗、输血治疗、重组EPO以及铁剂补充等方法。这些治疗方法能暂时改善患者贫血的临床症状，但是并不能完全从根本上治疗 CRA。同时这些治疗方法本身还存在一定局限性与副作用。因此如果能够从根本上，即从影响红系细胞的生成发育过程的因素对CRA进行治疗，可能会大大提高CRA的治疗效果。造血微环境是调控红系生成发育的重要因素之一，而骨相关MSC作为其重要组成部分，也参与了红系生成发育得调控。因此以其作为CRA治疗的靶向目标，不仅能从根本上对CRA起到治疗作用，同时还会减低CRA的复发率，最终提高肿瘤患者的生存治疗。

造血干细胞移植是治疗血液恶性疾病的有效途径，然而并发症移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的发生成为阻碍造血干细胞移植成功的主要原因。接受异体移植物的受体发生急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的概率是50％，其中不到20％的人移植后能存活超过5年，尤其是抗固醇类aGVHD能导致90％的致死率。目前，临床上采用多种细胞治疗方法预防或治疗GVHD，其中包括不同来源的MSCs。但是目前诱导移植免疫耐受时多使用MSCs混合群，而MSCs亚群众多，功能差异较大，为了使 MSCs在临床上得到更好的应用，需要探索MSCs各细胞亚群在免疫耐受诱导中的作用以及机制。

发明人意外地发现，将从小鼠胫骨、股骨上得到的骨相关MSC利用发明人独创的分选标记对其进行分选鉴定，获得了较高纯度的Sca1⁺亚群细胞。

发明人意外的发现，上述获得的Sca1⁺亚群细胞可以在体外培养并增殖；并且参与支持造血重建。

发明人利用分选得到的Sca1⁺亚群细胞对CRA模型小鼠进行治疗，发现治疗后的模型小鼠外周血贫血症状被纠正，同时改善了骨髓中红系前体细胞发育异常的情况；且治疗效果比混合群细胞明显。

发明人利用分选得到Sca1⁺亚群细胞对aGVHD小鼠模型进行治疗，发现治疗后的模型小鼠aGVHD临床症状有所改善，生存时间延长；且治疗效果比混合群细胞明显。

实施例1.骨相关间充质干细胞制备

1、取小鼠股骨和胫骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，放于研磨杯内研磨至骨髓释放，分离收集骨髓待用。加入PBS冲洗骨头，再次研磨和冲洗，直到骨头全部变成白色；

2、用吸水纸吸干残余PBS，加入0.5％胶原酶(3mg/mL,Sigma,Ronkonkoma, NY,USA)混匀后，摇床上37℃消化1h；

3、取60μm孔径滤网，过滤消化后骨混合物，收集虑过液，1500rpm离心5min后弃上清；

4、向上述细胞沉积中加入适量红细胞裂解液，室温静止2min，加入过量的PBS后，1500rpm离心5min，弃上清，获得细胞沉积即为骨相关间充质干细胞。

实施例2.骨相关间充质干细胞亚群细胞制备

1、骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群的制备

1.1将得到骨相关MSC细胞转入5mL试管中并计数，然后按照磁珠分选试剂盒(easysep mouse selection kit,Stem Cell Ltd.Vancouver,Canada)要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠。按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选。

1.2将分选得到的细胞计数，取适量细胞转入流式管中，1500rpm离心5 min后弃上清。

1.3在20μl流式缓冲液中加入抗-CD45(30-F11,Biolegend,California, USA)，抗-Ter119(17-5921,eBioscience,San Diego,USA)，抗 -Sca1(E13-161.7,Biolegend,California,USA)流式抗体，混匀。

1.4将上述预混的流式抗体加入到所得的细胞沉积中，2-8℃染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300μl流式缓冲液，流式仪上机分选骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群，结果如图1所示。

2、骨相关间充质干细胞CD271⁺亚群细胞的制备

2.1将得到骨相关MSC细胞转入5mL试管中并计数，然后按照磁珠分选试剂盒要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠。按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选。

2.2将分选得到的细胞计数，取适量细胞转入流式管中，1500rpm离心5 min后弃上清。

2.3在20μl流式缓冲液中加入抗-CD45，抗-Ter119，抗-CD271流式抗体，混匀。

2.4将上述预混的流式抗体加入到所得的细胞沉积中，2-8℃染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300μl流式缓冲液，流式仪上机分选CD271⁺亚群细胞。

3、骨相关间充质干细胞SSEA4⁺亚群细胞的制备

3.1将得到骨相关MSC细胞转入5mL试管中并计数，然后按照磁珠分选试剂盒要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠。按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选。

3.2将分选得到的细胞计数，取适量细胞转入流式管中，1500rpm离心5 min后弃上清。

3.3在20μl流式缓冲液中加入抗-CD45，抗-Ter119，抗-SSEA4流式抗体，混匀。

3.4将上述预混的流式抗体加入到所得的细胞沉积中，2-8℃染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300μl流式缓冲液，流式仪上机分选SSEA4⁺亚群细胞。

实施例3.骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群具有支持造血重建的功能

1、筛选骨相关间充质干细胞亚群

1.1将分选后的Sca1⁺亚群细胞、CD271⁺亚群细胞和SSEA4⁺亚群细胞进行体外培养。培养条件：DMEM/F12+GlutaMAX^TM-1(1×)培养液(Gibco)，15％(v/v) 胎牛血清(Gibco)，1％(v/v)丙酮酸钠(SODIUM PYRUVATE,SIGMA)、1％(v/v) 非必需氨基酸(MEM NEAA,GIBCO)、1％(v/v)β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol,GIBCO)。

1.2培养5d后，镜下观察并分析细胞增殖情况，结果如图2所示。经检测，CD271⁺亚群细胞和SSEA4⁺亚群细胞在体外不能进行增殖，而Sca1⁺亚群可以再体外明显增殖。

2、小鼠LT-HSC细胞制备

2.1对骨髓细胞，红细胞裂解液冰上5min裂解红细胞，加入2倍体积的 PBS,1500rpm离心5min，重复一次后悬于10流式缓冲液，按每只小鼠加入 0.1μl CD16/32封闭抗体，冰上封闭5min；

2.2按适当稀释比例，混合抗-CD150、抗-CD48、抗-sca1、抗-c-kit、抗-CD135 和抗-Lin(含抗-CD3、CD4、CD8、B220、CD11b、Gr1和Ter119抗体)流式抗体到20μl流式缓冲液，加到封闭后骨髓细胞悬液，2-8℃染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300μl流式缓冲液，上机分选收集LT-HSC细胞；

3、骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群参与支持造血重建

3.1将分选后的骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群和LT-HSC细胞进行体外共培养48h。培养条件为：IMDM培养液(Gibco)，胎牛血清10％(v/v)，细胞因子10ng/ml(细胞因子：IL-1α,IL-3,IL-5,IL-6,IL-7,IL-9,IL-10,IL-11,GM-CSF, TPO,EPO,SCF,Flt3L)(Francoet al.,2010).

3.2共培养后分选部分LT-HSC细胞，进行克隆形成实验、凋亡实验和细胞周期分析(Franco et al.,2010)；

3.38-12周龄的CD45.2 C57/B6小鼠，接受剂量为1100Rads照射；

3.4收集共培养的部分LT-HSC细胞，与辅助细胞CD45.2 C57/B6小鼠骨髓混合，悬于100μlPBS，眼眶静脉注射到照射后受体小鼠体内(200个LT-HSC⁺辅助骨髓细胞为2×10⁵剂/小鼠)，饮水中持续给予抗生素，连续两周；

3.5第4、8、12、16周眼眶静脉取血，裂解红细胞后封闭，用抗-CD45.1、抗-CD45.2、抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8、抗-TCR-beta、抗-CD19、抗-B220、抗-CD11b和抗-Gr1抗体染色，分析骨髓重建分化；

3.616周后处死受体小鼠，分离骨髓和外周血，流式分析骨髓重建，必要时进行二次骨髓移植，进行L中相同分析，结果如图3所示。

实施例4.骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群治疗CRA模型小鼠

1、CRA模型小鼠的建立、鉴定及检测

1.1B16细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养基培养，37℃，5％CO₂，环境中培养，每2-4天传代；选取对数生长期B16细胞进行造模。取该期B16细胞，吸取培养液，PBS液清洗2遍。用0.25％胰酶消化贴壁细胞4min后，加入含血清培养液终止反应，吹打贴壁细胞，得细胞悬液，1500r/min离心5min 收集细胞，重悬于PBS液中。进行细胞计数，调整细胞悬液浓度调整到1x10⁷ /ml。

1.2将制备好的瘤液250μl于无菌条件下接种于C57BL/6小鼠背部皮下。瘤液接种后注意观察注射部分瘤灶的形成。瘤灶形成后每隔2天游标卡尺对瘤灶进行范围测量。测量最大直径(a)及与之垂直的横径(b)，以axb(mm²)表示，体积以(axb²/2)(单位mm³)计算。瘤液接种后14-16天，选择在注射部位形成瘤灶的C57BL/6小鼠，采外周血，用1％EDTA-Na₂抗凝，检测外周血中RBC、 Hb、Hct(％)，野生型C57BL/6小鼠作为对照参考。当荷瘤小鼠的RBC、Hb、Hct(％)值低于野生型小鼠各检测值的20％以上时，可判定荷瘤小鼠发生了贫血，即CRA发生。

1.3小鼠骨髓中红系前体细胞检测：取CRA小鼠股骨和胫骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，放于研磨杯内研磨至骨髓释放，分离收集骨髓；取 60μm孔径滤网过滤，收集虑过液；加入适量ACK裂解红细胞，1500rpm离心5min；弃上清，加入PBS混匀细胞，1500rpm离心5min后弃上清，重复一次；按适当稀释比例，混合抗-Ter119和抗-CD71流式抗体到20μl流式缓冲液，加到封闭后骨髓细胞，2-8℃染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300μl流式缓冲液，流式仪上机分析。

2.骨相关间充质干细胞及其Sca1⁺亚群移植治疗CRA小鼠的效果检测

2.1骨相关间充质干细胞移植治疗CRA小鼠模型建立：取已经制备好的骨相关间充质干细胞混合群细胞用PBS溶液制备细胞悬液，调整细胞浓度到 4x10⁶/ml；将制备好的细胞悬液100μl于无菌条件下经静脉输注给C57BL/6小鼠；按上述CRA小鼠模型制备方法，将制备好的瘤液250μl于无菌条件下接种于输注过混合群细胞的C57BL/6小鼠背部皮下；瘤灶观察与贫血鉴定方法参考CRA小鼠模型建立方法。

2.2细胞移植治疗CRA小鼠模型建立

取经分选的Sca1⁺亚群用PBS溶液制备成细胞悬液，分别调整细胞浓度到 4x10⁵/ml；将制备好的细胞悬液100μl于无菌条件下经静脉输注给C57BL/6小鼠；按上述CRA小鼠模型制备方法，将制备好的瘤液250μl于无菌条件下接种于经上述细胞移植的小鼠背部皮下；瘤灶观察与贫血鉴定方法参考CRA小鼠模型建立方法，

2.3细胞移植治疗小鼠CRA的效果检测

通过比较野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠的生存曲线、血常规指标、长骨图片以及骨髓中红系发育分化情况，评价细胞治疗作用，结果如图4，5，6，7所示。

实施例5.骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群缓解aGVHD小鼠模型临床症状

1、aGVHD模型小鼠的建立

1.1骨髓细胞制备：分别取C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠的股骨和胫骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，减去两端骨骺，用充满PBS的注射器从骨一端注射进入，将骨干中的骨髓细胞冲洗出来，反复冲洗2-3次，收集骨髓细胞。取60μm孔径滤网过滤，收集滤过液；加入适量ACK裂解红细胞，1500 rpm离心5min；弃上清，加入PBS混匀细胞，1500rpm离心5min后弃上清，重复一次；细胞计数后，按适当稀释比例用PBS重悬细胞制备单细胞悬液。

1.2脾细胞制备：取C57BL/6小鼠的脾脏，去除结缔组织，PBS冲洗后，将组织剪成小块，用玻片进行研磨，收集脾脏细胞。取60μm孔径滤网过滤，收集滤过液；加入适量ACK裂解红细胞，1500rpm离心5min；弃上清，加入 PBS混匀细胞，1500rpm离心5min后弃上清，重复一次；细胞计数后，按适当稀释比例用PBS重悬细胞制备单细胞悬液。

1.3aGVHD模型小鼠的建立：经8.0Gy辐照处理的BALB/C小鼠作为受体，对照组(Ctrl)小鼠按1×10⁷BALB/C小鼠骨髓细胞/只经静脉移植注射；实验组(BM)小鼠按1×10⁷C57BL/6小鼠骨髓细胞/只和6×10⁶C57BL/6小鼠脾脏细胞经静脉移植注射。

1.4aGVHD模型小鼠的观察：通过对小鼠的皮肤状态、活动力、行为姿势、体重以及毛发完整度等的观察，给予小鼠综合评分。

2、细胞移植缓解aGVHD模型小鼠的效果检测

将骨相关间充质干细胞混合群细胞及Sca1⁺亚群细胞用PBS溶液制备细胞悬液，按8×10⁴/只静脉分别移植给经8.0Gy辐照处理的BALB/C小鼠，建立混合群治疗组(MSC)和Sca1⁺亚群处理组(Sca1+)。同时对该小鼠按1×10⁷ C57BL/6小鼠骨髓细胞/只和6×10⁶C57BL/6小鼠脾脏细胞进行静脉移植注射。对照组(Control)和实验组(BM)小鼠按前面的方法进行处理。通过对小鼠的皮肤状态、活动力、行为姿势、体重以及毛发完整度等的观察，给予小鼠综合评分，并判定骨相关间充质干细胞及其Sca1⁺亚群细胞移植缓解aGVHD模型小鼠的效果，结果如图8，9所示。

Claims (2)

1.骨相关间充质干细胞Sca1+亚群用于制备治疗肿瘤相关性贫血药物的应用；所述骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备包括：利用抗-CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1+亚群。

2.骨相关间充质干细胞Sca1+亚群用于制备缓解急性移植物抗宿主病药物的应用；所述骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备包括：利用抗-CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1⁺亚群。