CN113564108A - 一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞及其体外扩增培养方法，所述方法包括：将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增，获得骨髓间充质干细胞。该方法可以提高细胞的存活率和细胞的纯度，增加细胞的增殖速度。

Description

一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞提取技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能分化为多种类型细胞的多能干细胞。间充质骨髓干细胞目前在许多临床试验中被用来研究其在免疫调节、造血和组织再生方面的潜力。

目前常用的分离方法有贴壁培养法、密度梯度离心法及流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法。①贴壁培养法是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长，而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行培养分离，同时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，保证骨髓间充质干细胞在短时间内与培养瓶底分开，从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化，但该法获得的细胞不均一，纯度过低。②密度梯度离心法又分为两种：Ficoll分离液法和Percoll分离液法。贴壁培养法和Ficoll分离液法所获得的干细胞生长较快但纯度过低。而Percoll分离液法所获得的干细胞纯度较好，但生长速度较慢而且可能缺失一部分干细胞。③流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法：根据细胞大小不同或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离细胞，该方法分选的细胞纯度高，但对细胞的损伤较大，分选后的细胞活力较弱，存活率低。

因此，如何有必要开发一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，以解决现有技术中细胞存活率低、细胞纯度低、增值速度慢的技术问题。

发明内容

针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种骨髓间充质干细胞及其体外扩增培养方法，可以提高细胞的存活率和细胞的纯度，增加细胞的增殖速度。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，所述方法包括：

将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；

将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，用生理盐水洗涤，加入胰酶消化液消化，后加入无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增。

进一步地，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：5。

进一步地，所述骨髓细胞为从年龄18～45岁且无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获得的完好骨髓细胞。

进一步地，所述原代培养基为在基础培养基中添加8～12％FBS和(3～5)mM L-谷氨酰胺。

进一步地，所述原代培养和所述传代培养的条件均包括：37℃，5％CO₂细胞培养箱内培养。

进一步地，所述原代培养中，在原代培养的第3天后，在相差显微镜下评估所述培养物，所述评估包括：细胞粘附的状态、细胞密度、上清液中的细胞是否存在以及基质/红细胞是否存在。

进一步地，所述原代培养中，在原代培养的第5天后进行全量换液；所述全量换液包括：吸取掉所述原代培养基中的上清液，后加入磷脂酰胆碱或生理盐水或PBS以进行冲洗，再加入新的原代培养基。

进一步地，在所述全量换液前，还包括：观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否全量换液，包括：

若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不进行全量换液，且取样进行微生物控制；

若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则进行全量换液。

进一步地，在所述传代培养前，还包括：

所述全量换液的第3-4天后，观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否更换为无血清培养基以进行传代培养，包括：

若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不更换为无血清培养基，且需取样进行微生物控制；

若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则更换为无血清培养基以进行传代培养。

进一步地，所述P0代细胞进行传代并扩增，包括：

将所述P0代细胞按10000个/cm²的细胞密度进行传代并扩增至P6代。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明实施例提供的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，包括：将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；其中，所述原代培养中，在原代培养的第5天后进行全量换液；将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增。本发明首先将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离获得的固体再进行原代培养和传代培养，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；所述红细胞溶解缓冲液不仅可以在提取骨髓的时候立马去除骨髓里的红细胞而且提高细胞的存活率，增加细胞的增殖速度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为实施例3中P0代培养2d的骨髓干细胞换液之前存在的红细胞状态图；

图2为实施例2中P0代培养2d骨髓干细胞换液之前不存在的细胞状态图

图3为实施例2中骨髓干细胞P0代培养4d的细胞状态图；

图4为实施例2中骨髓干细胞P0代培养7d的细胞状态图；

图5为实施例1中骨髓干细胞P1代培养24h的细胞状态图；

图6为实施例1中骨髓干细胞P3代培养4d的细胞状态图；

图7为本发明实施例提供的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路根据下：

根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，如图6所示，所述方法包括：

S1、将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；

该实施方式中，红细胞溶解缓冲液的配方为3.8％柠檬酸钠、1％和2％NaCl溶液，可选用德国Qiagen GmbH的QIAamp RNA Blood Mini Kit中的红细胞溶解缓冲液；

上述技术方案中，所述骨髓细胞为从年龄18～45岁且无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获得的完好骨髓细胞。

上述技术方案中，所述红细胞溶解缓冲液不仅可以在提取骨髓的时候立马去除骨髓里的红细胞而且提高细胞的存活率，增加细胞的增殖速度。

所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比若小于1：5.5，有一点细胞生长和提取率不利影响，若大于1：4.5，有细胞状态不利影响；优选地，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：5。

上述技术方案中，所述离心的转速为400～600g，所述离心的时间为5min；

S2、将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；

上述技术方案中，所述原代培养基为在基础培养基中添加8～12％FBS和(3～5)mML-谷氨酰胺。添加谷氨酰胺有利于促进干细胞再生作用，优选地，所述原代培养基为在基础培养基中添加10％FBS和4mM L-谷氨酰胺。

作为一种可选的实施方式，所述原代培养中，在原代培养的第3天后，在相差显微镜下评估所述培养物，所述评估包括：细胞粘附的状态、细胞密度、上清液中的细胞是否存在以及基质/红细胞是否存在。

作为一种可选的实施方式，所述原代培养中，在原代培养的第5天后进行全量换液；在所述全量换液前，还包括：观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否全量换液，包括：

若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不进行全量换液，且取样进行微生物控制；

若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则进行全量换液。

具体地，所述全量换液包括：吸取掉所述原代培养基中的上清液，后加入磷脂酰胆碱或生理盐水或PBS以进行冲洗，再加入新的原代培养基。

S3、将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增。

作为一种可选的实施方式，在所述传代培养前，还包括：

所述全量换液的第3-4天后，观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否更换为无血清培养基以进行传代培养，包括：

若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不更换为无血清培养基，且需取样进行微生物控制；

若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则更换为无血清培养基以进行传代培养。

上述技术方案中，所述P0代细胞进行传代并扩增，包括：

将所述P0代细胞按10000个/cm²的细胞密度进行传代并扩增至P6代。在其他实施方式中接种细胞密度范围可以为10000-15000个/cm²。

下面将结合实施例、对比实验数据对本申请的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法进行详细说明。

实施例1

本发明实施例提供一种快速及有效的骨髓间充质干细胞提取方法，包括以下步骤：

步骤1、骨髓获取：从年龄21岁，无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获取，也禁忌骨髓细胞的先天性疾的患者。

步骤2、首先培养基中温/解冻的基础培养基、L-谷氨酰胺和FBS。

步骤3、在生物安全柜下准备完整的培养基(基础添加10％FBS和4mM L-谷氨酰胺的培养基)：从500毫升的瓶底液中吸取60毫升丢弃培养基，加入10毫升L-谷氨酰胺和50毫升FBS；再悬浮用移液管

步骤4、用18g针抽离体骨髓插入注射器并转移到无菌管中，用移液管复吸并测量骨髓量转移到50ml锥形离心管中，并按1:5的比例添加红细胞溶解缓冲液(剩余试剂来自德国Qiagen GmbH的QIAamp RNA Blood Mini Kit)，将试管手动混合1分钟，并立即在480g下离心5分钟。离心后立即丢弃顶层，

步骤5、采集微生物控制样品：

(a)–1毫升，用无菌注射器在BacT/1中接种好氧培养瓶(SA)；

(b)–1毫升，用无菌注射器在BacT/1中接种厌氧培养瓶(SN)；

(c)–2ml收集在PCR管中用于支原体检测。

然后将收集的样品送至适当的专门机构进行分析的质量控制实验室。

步骤6、将细胞转到T75置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。

步骤7、原代制备后的第3天后，在相差显微镜下评估培养物，以下为参数：上清液中的细胞不存在；基质/红细胞不存在。

步骤8、全量换液：原代制备后的第5天，进行全量换液，从CO₂培养箱中取出烧瓶，观察培养基的宏观外观。外观清晰为颜色，取细胞培养基上清液倒掉,同时，向烧瓶中加入10mL磷脂酰胆碱冲再T75烧瓶中洗涤，弃上清液体。再加入新的培养基。

步骤9、传代：3-4天后，培养基的颜色为红色。更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60％时，用10mL生理盐水洗涤2次，加入5mL胰酶消化液消化1～3min后，5mL加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为P0代细胞，按10000个/cm2的细胞密度进行传代，并扩增至P6代。

步骤10、鉴定：利用流式检测方法对提取的骨髓干细胞进行表面标记物表达水平进行检测。

实施例2

本发明实施例提供一种快速及有效的骨髓间充质干细胞提取方法，包括以下步骤：

步骤1、骨髓获取：从年龄33岁，无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获取，也禁忌骨髓细胞的先天性疾的患者

步骤2、首先培养基中温/解冻的基础培养基、L-谷氨酰胺和FBS。

步骤3、在生物安全柜下准备完整的培养基：从500毫升的瓶底液中吸取60毫升丢弃培养基，加入10毫升L-谷氨酰胺；再悬浮用移液管

步骤4、用18g针抽离体骨髓插入注射器并转移到无菌管中，用移液管复吸并测量骨髓量转移到50ml锥形离心管中，并按1:4.5的比例添加红细胞溶解缓冲液(剩余试剂来自德国Qiagen GmbH的QIAamp RNA Blood Mini Kit)，将试管手动混合1分钟，并立即在480g下离心5分钟。离心后立即丢弃顶层

步骤5、采集微生物控制样品：

(a)–1毫升，用无菌注射器在BacT/1中接种好氧培养瓶(SA)；

(b)–1毫升，用无菌注射器在BacT/1中接种厌氧培养瓶(SN)；

(c)–2ml收集在PCR管中用于支原体检测。

然后将收集的样品送至适当的专门机构进行分析的质量控制实验室。

步骤6、将细胞转到T75培养瓶中，加入20ml的完全培养液，放着在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

步骤7、原代制备后的第3天后，在相差显微镜下评估培养物，以下为参数：上清液中的细胞不存在；基质/红细胞不存在。

步骤8、全量换液：原代制备后的第5天，进行全量换液，从CO₂培养箱中取出烧瓶，观察培养基的宏观外观。外观清晰为颜色，取细胞培养基上清液倒掉,同时，向烧瓶中加入10mL PBS在T75烧瓶中洗涤，弃上清液体。再加入新的培养基。

步骤9、传代：3-4天后，培养基的颜色为红色。更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60％时，用10mL生理盐水洗涤2次，加入5mL胰酶消化液消化1～3min后，5mL加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为P0代细胞，按10000个/cm2的细胞密度进行传代，并扩增至P6代。

步骤10、鉴定：利用流式检测方法对提取的骨髓干细胞进行表面标记物表达水平进行检测。

实施例3

本发明实施例提供一种快速及有效的骨髓间充质干细胞提取方法，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比1:5.5，其他步骤均同实施例1。

对比例1

一种快速及有效的骨髓间充质干细胞提取方法，包括以下步骤：

步骤1、骨髓获取：从年龄33岁，无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获取，也禁忌骨髓细胞的先天性疾的患者

步骤2、首先培养基中温/解冻的基础培养基、L-谷氨酰胺和FBS。

步骤3、在生物安全柜下准备完整的培养基：从500毫升的瓶底液中吸取60毫升丢弃培养基，加入10毫升L-谷氨酰胺；再悬浮用移液管

步骤4、用18g针抽离体骨髓插入注射器并转移到无菌管中，用移液管复吸并测量骨髓量，用完全培养基将骨髓样品稀释1:4并立即在480g下离心5分钟。离心后立即丢弃顶层

步骤5、采集微生物控制样品：

(a)–1毫升，用无菌注射器在BacT/1中接种好氧培养瓶(SA)；

(b)–1毫升，用无菌注射器在BacT/1中接种厌氧培养瓶(SN)；

(c)–2ml收集在PCR管中用于支原体检测。

然后将收集的样品送至适当的专门机构进行分析的质量控制实验室。

步骤6、将细胞转到T75培养瓶中，加入20ml的完全培养液，放着在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

步骤7、原代制备后的第3天后，在相差显微镜下评估培养物，以下为参数：上清液中的细胞不存在；基质/红细胞不存在。

步骤8、全量换液：原代制备后的第5天，进行全量换液，从CO2培养箱中取出烧瓶，观察培养基的宏观外观。外观清晰为颜色，取细胞培养基上清液倒掉,同时，向烧瓶中加入10mL PBS在T75烧瓶中洗涤，弃上清液体。再加入新的培养基。

步骤9、传代：3-4天后，培养基的颜色为红色。更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60％时，用10mL生理盐水洗涤2次，加入5mL胰酶消化液消化1～3min后，5mL加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为P0代细胞，按10000个/cm2的细胞密度进行传代，并扩增至P6代。

步骤10、鉴定：利用流式检测方法对提取的骨髓干细胞进行表面标记物表达水平进行检测。

对比例2

该对比例中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：8；其他步骤均同实施例1。

对比例3

该对比例中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：3；其他步骤均同实施例1。

实验例1

分别对实施例1-实施例3和对比例1提取的骨髓干细胞进行表面标记物表达水平进行检测，分别记录实施例1～3和对比例1中P0的培养天数，详见表1；统计P0代，P3代和P6代细胞数量和存活率。

表1-P0的培养天数

实施例

实施例1

实施例2

实施例3

对比例1

对比例2

对比例3

P0代培养天数

5d

5d

5d

5d

5d

5d

表2-细胞数量及活率

由表2数据可知：

对比例1中，采用现有技术常用方法，细胞个数和存活率均低于本发明实施例；

对比例2中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：8，小于本发明实施例1：(4.5-5.5)的范围，细胞个数和存活率均低于本发明实施例；且由于高渗红细胞溶解缓，会失去水分发生皱缩影响细胞的生长；

对比例3中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：3，大于本发明实施例1：(4.5-5.5)的范围，也存在活率和提取率缺点；由于低渗红细胞溶解缓无法完全溶解红细胞，由于存在红细胞，骨髓细胞无法完贴壁因此存在活率的缺点；

本发明实施例1-实施3中，P6代细胞个数达到2.8×10⁶～3.3×10⁶，细胞存活率达到96.73-99.35％；细胞数量活率高于对比例1-对比例3，说明本发明能提高骨髓干细胞的提取率和存活率。

实验例2

分别对实施例1-实施例3和对比例1的细胞进行表型鉴定，具体方法如下：

收集一定数量的骨髓干细胞悬液于离心管中，1200rpm离心8min，弃上清液，加入10ml PBS洗两次，离心弃上清，保留细胞，加PBS重细胞，每个T75瓶加细胞悬液1ml,细胞密度悬液密度为1×107个/ml，将细胞分装100μl/EP管，加入10μl PE标记的鼠抗人CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105和同型对照，混匀，37℃避光孵育30min。1200rpm离心8min，弃上清，PBS洗涤细胞2次，离心后用200μl PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测。表面标记物的含量如图3所示。详见表4。实施例1骨髓干细胞P3代流式检测结果见图6。

表3骨髓干细胞P3代流式检测结果

由表3的实验结果可知，脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90和CD105，不表达CD34和CD45，表明本发明实施例的脐带间充质干细胞符合间充质干细胞的表型特征；

上流式细胞仪检测CD90+、CD73+、CD105+和hMSC阴性混合物CD45+、CD34+、CD11b+、CD19+、HLA-DR+等主要表面标记物的表达水平，其中CD90+、CD73+、CD105+表达量应≥95％，CD45+、CD34+、CD11b+、CD19+、HLA-DR+表达量应≤2％。表明本发明实施例的脐带间充质干细胞符合间充质干细胞的表型特征。

值得注意的是，上述实施例中，所包括的各个单元和模块只是按照功能逻辑进行划分的，但并不局限于上述的划分，只要能够实现相应的功能即可；另外，各功能单元的具体名称也只是为了便于相互区分，并不用于限制本发明的保护范围。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在。

Claims (10)

1.一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述方法包括：

将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；

将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；

将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增，获得骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：5。

3.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述骨髓细胞为从年龄18～45岁且无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获得的完好骨髓细胞。

4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养基为在基础培养基中添加8～12％FBS和(3～5)mM L-谷氨酰胺。

5.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养和所述传代培养的条件均包括：37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。

6.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养中，在原代培养的第3天后，在相差显微镜下评估所述培养物，所述评估包括：细胞粘附的状态、细胞密度、上清液中的细胞是否存在以及基质/红细胞是否存在。

7.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养中，在原代培养的第5天后进行全量换液；所述全量换液包括：吸取掉所述原代培养基中的上清液，后加入磷脂酰胆碱或生理盐水或PBS以进行冲洗，再加入新的原代培养基。

8.根据权利要求7所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，在所述全量换液前，还包括：观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否全量换液，包括：

若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不进行全量换液，且取样进行微生物控制；

若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则进行全量换液。

9.根据权利要求7所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，在所述传代培养前，还包括：

所述全量换液的第3-4天后，观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否更换为无血清培养基以进行传代培养，包括：

若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不更换为无血清培养基，且需取样进行微生物控制；

若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则更换为无血清培养基以进行传代培养。

10.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述P0代细胞进行传代并扩增，包括：

将所述P0代细胞按10000个/cm²的细胞密度进行传代并扩增至P6代。

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