CN102614527A - 具有pH敏感特性的抗酸纳米口服DNA抗肿瘤疫苗及制备方法 - Google Patents

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一种具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及制备方法。所述的DNA口服疫苗是一种由海藻酸进行表面修饰的壳聚糖结合编码肿瘤特异性抗原Legumain蛋白DNA质粒的纳米颗粒，能够高效在小肠派氏淋巴结中被树突状细胞及巨噬细胞吞噬，并表达编码的肿瘤抗原，激活宿主对肿瘤细胞的免疫杀伤。本发明所构建的纳米颗粒毒副作用小，且具有强烈的抗原呈递作用。具体说是将DNA质粒与壳聚糖进行静电负交联，后利用海藻酸对壳聚糖纳米颗粒的表面进行修饰。借助免疫荧光染色及流式细胞检测，对小鼠乳腺癌的生长及转移情况进行评估，并对小鼠的免疫应答进行分析，确定pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA疫苗的抗原呈递能力及抗肿瘤效果。

Description

具有pH敏感特性的抗酸纳米口服DNA抗肿瘤疫苗及制备方法
技术领域
本发明涉及一种新的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗，以及用其进行治疗方法。属于基因工程制药技术领域。
背景技术
乳腺癌已经成为女性中常见的一种肿瘤。根据美国国家癌症研究所(National CancerInstitute，NCI)统计，2004-2008年间，确诊患有乳腺癌的患者平均年龄为61岁，女性中的年发病率约为0.0122％，其中亚裔/太平洋岛裔发病率约为0.0937％；2003-2007年间，乳腺癌患者平均死亡年龄为68岁，女性中的年死亡率为0.024％，其中亚裔/太平洋岛裔的年死亡率为0.0122％；其发病率和死亡率分别在女性中占第一和第二位。目前对乳腺癌的治疗主要是传统疗法，即手术切除、放疗和化疗。随着基础研究的发展和进步，更多的新型疗法正在不断涌现，例如免疫疗法和分子靶向疗法。免疫疗法包括制备肿瘤疫苗和使用免疫调节剂。分子靶向疗法主要以表皮生长因子受体和肿瘤新生血管生成为靶标。但是总体而言，无论是传统疗法还是新型免疫疗法，目前的治疗效果都不甚理想，这也是乳腺癌治愈率始终很低的主要原因，所以目前的疗法还有很大的改进空间。找到一种能够靶向多发的肿瘤病灶部位的载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对周围的正常组织造成影响将显著提高治疗效果，减低副作用。DNA疫苗能引起强而持久的细胞免疫及体液免疫。它能诱导CD8+T细胞的CTL反应及CD4+T细胞的Th1反应，并能激活B细胞产生中和抗体。DNA疫苗即可用于预防，亦可用于治疗，目前主要应用于感染性疾病、变态反应及肿瘤的防治。抗肿瘤DNA疫苗由于其具有如下优点：(1)产生免疫专一性好；(2)导入的质粒在体内可持续表达2个月；(3)构建双基因表达质粒可提高疫苗的免疫作用，使得DNA疫苗在各方面有了很大的发展。
壳聚糖是一种由甲壳素脱乙酰反应后的产品，分子量和聚合程度有关，不同分子量的壳聚糖制成的纳米颗粒进入体内会在不同的器官或组织富集，因此可以根据壳聚糖的这一特性有针对性的合成壳聚糖分子，使其特异性的将所负载的DNA或RNA运送的特定的器官或组织，如果再在壳聚糖纳米微球表明标记上组织特异性蛋白的配体或抗体，其靶向功能更佳。因此我们认为，以壳聚糖为微球骨架制成的纳米颗粒是良好的DNA疫苗载体，但由于壳聚糖分子链上游离的氨基会吸收大量的胃酸中的H+，成为一种溶胀结构，从而使携带的DNA片段遭到胃酸的降解，降低DNA疫苗的稳定性。这个问题是导致壳聚糖纳米DNA载体一直难以用于口服的重要影响因素。
目前绝大多数纳米颗粒都无法经受消化道特别是胃中的胃酸的消化作用，对其中被包裹的药物或者基因不能起到保护作用，因而无法通过口服途径进入人体发挥作用，给患者使用带来极大的不便。
发明内容
本发明的目的在于解决目前应用于试验性肿瘤免疫治疗的纳米颗粒载体毒副作用大、口服给药途径不稳定、表达效率低难以携带DNA通过胃酸环境并进入肠道高效表达肿瘤抗原的问题，提供一种新的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗。
本发明提供的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗，是通过利用海藻酸对壳聚糖纳米颗粒进行修饰，使壳聚糖纳米颗粒具有pH敏感性，然后将编码肿瘤特异性抗原Legumain蛋白的DNA质粒装载到修饰后的壳聚糖纳米颗粒而制成；该疫苗能够在口服给药后激活宿主自身的免疫应答，对肿瘤细胞进行杀伤；在疫苗通过胃液时保护DNA质粒不被降解，并在肠道中形成松散的结构，利于树突细胞及巨噬细胞吞噬，高效表达编码的基因；同时有效激发CD8+T细胞介导的免疫反应，降低调节T细胞对免疫系统的抑制作用，对肿瘤细胞进行杀伤，延缓肿瘤细胞的生长与转移。
本发明同时提供了一种具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备方法，具体步骤为：
第1、壳聚糖纳米颗粒的制备
第1.1、将分子量在28000至32000的长链壳聚糖溶解于双蒸水中，并调节pH值到5.2，在55℃下搅拌30分钟，形成A液；
第1.2、同时将25mM Na2SO4溶液与DNA质粒混合加热至55℃，匀速搅拌30分钟，形成B液；
第1.3、随后将A液与B液以体积比1∶1混合两种溶液，并马上进行混合，5分钟后将制备好的壳聚糖纳米颗粒保存在4℃；
第2、海藻酸侧链上的羧基的活化
将海藻酸粉末溶解到双蒸水中，将海藻酸溶液与加入的N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶5∶5混合，并将pH值调节到9.0，室温搅拌过夜，活化后的海藻酸置于4℃保存待用；
第3、将第2步中活化的海藻酸与第1步中的壳聚糖纳米颗粒按1∶1的体积比混合，并调节pH值到6.0，室温20rpm，搅拌4～6小时，得到的产物放置4～7℃保存；
第4、将第3步中制备的纳米颗粒进行离心，12000rpm，10分钟，所得到的纳米颗粒将沉于离心管的底部，弃上清，并将纳米颗粒重悬于PBS缓冲液中，4～7℃保存，即得到具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗。
本发明的优点和积极效果：
本发明所述的DNA口服疫苗是一种由海藻酸进行表面修饰的壳聚糖结合编码肿瘤特异性抗原Legumain蛋白DNA质粒的纳米颗粒，粒径范围在300-400nm，能够高效在小肠派氏淋巴结中被树突状细胞及巨噬细胞吞噬，并表达编码的肿瘤抗原，激活宿主对肿瘤细胞的免疫杀伤。本发明所构建的纳米颗粒毒副作用小，且具有强烈的抗原呈递作用，具体说是将DNA质粒与壳聚糖进行静电负交联后，利用海藻酸对壳聚糖纳米颗粒的表面进行修饰。借助免疫荧光染色及流式细胞检测，对小鼠乳腺癌的生长及转移情况进行评估，并对小鼠的免疫应答进行分析，确定pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA疫苗的抗原呈递能力及抗肿瘤效果。
本发明提供的经过化学修饰的壳聚糖纳米颗粒的一个重要优点就是，可以抵抗胃肠道环境(pH、核酸酶)对药物的破坏，因而可以作为DNA口服疫苗的载体，这是壳聚糖纳米颗粒在应用上的重要意义。
附图说明
图1pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗制备示意图；
图2pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的粒径分布结果图；
图3pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的投射电镜形态图；
图4pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的表面电位图；
图5经pH1.5的人工胃液消化后的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及其他DNA载体抗酸降解的琼脂凝胶分析；
图6在不同pH条件下pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的粒径分布；
图7经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗免疫后在荷瘤小鼠小肠淋巴结巨噬细胞中的绿色荧光表达情况(免疫荧光结果)；
图8经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗免疫后在荷瘤小鼠小肠淋巴结巨噬细胞及树突状细胞中的绿色荧光表达情况(流式细胞仪检测结果)；
图9经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及不同组别免疫后在荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；
图10经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及不同组别免疫后在荷瘤小鼠的肿瘤生长及肿瘤体重比；
图11经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及不同组别免疫后在荷瘤小鼠的脾细胞中的CD8+T的激活情况；
图12经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及不同组别免疫后在荷瘤小鼠的脾细胞中的调节T细胞的的抑制作用。
本发明结合附图和具体实施方式做进一步详细说明。
具体实施方式
一、具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备
具体步骤为：
第1、壳聚糖纳米颗粒的制备
第1.1、将分子量在28000至32000的长链壳聚糖溶解于双蒸水中，并调节pH值到5.2，在55℃下搅拌30分钟，形成A液；
第1.2、同时将25mM Na2SO4溶液与需要的DNA质粒混合加热至55℃，匀速搅拌30分钟，形成B液；
第1.3、随后将A液与B液以体积比1∶1混合两种溶液，并马上进行混合，5分钟后将制备好的壳聚糖纳米颗粒保存在4℃；
第2、海藻酸侧链上的羧基的活化
将海藻酸粉末溶解到双蒸水中，将海藻酸溶液与加入的N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶5∶5混合，并将pH值调节到9.0，室温搅拌过夜，活化后的海藻酸置于4℃保存待用；
第3、将第2步中活化的海藻酸与第1步中的壳聚糖纳米颗粒按1∶1的体积比混合，并调节pH值到6.0，室温20rpm，搅拌4～6小时，得到的产物放置4～7℃保存；
第4、将第3步中制备的纳米颗粒进行离心，12000rpm，10分钟，所得到的纳米颗粒将沉于离心管的底部，弃上清，并将纳米颗粒重悬于PBS缓冲液中，4～7℃保存，即得到具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗。
二、体内肿瘤免疫治疗
(1)对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
(2)通过灌胃的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为5组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为空纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗载体组；第三组为未经海藻酸修饰的纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；第四组为本发明经海藻酸修饰的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗组；第五组为阳性对照，传统沙门氏菌载体口服DNA抗肿瘤疫苗组；
(3)灌胃及给药剂量为每只BALB/c小鼠施以合150μg DNA质粒的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗或108CFU的沙门氏菌，每天一次；
(4)重复上述步骤5次。
三、体内表达编码的基因
(1)对口服免疫后的BALB/c荷瘤小鼠进行体内荧光表达检测：处死荷瘤小鼠，取其小肠派氏淋巴结，观察编码绿色荧光蛋白的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的表达情况，并与其他对照组进行比较。
(2)具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的抗肿瘤效果的评估：①流式细胞仪分析CD8+T细胞在体内的激活情况：处死荷瘤小鼠，取其脾脏，分离出脾细胞，与4T1小鼠乳腺癌细胞共培养24小鼠后，进行CD3\CD4\CD8\CD25\F4/80\CD11c等染色，后立即利用流式细胞仪进行检测，记录并采集1X106个细胞的数据；②对荷瘤小鼠的肿瘤生长进行评估：每天测量荷瘤小鼠的肿瘤大小，并在处死小鼠时，精确测量肿瘤的大小以及重量，以评估pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗对小鼠乳腺癌生长的抑制作用。
四、体外免疫荧光成像：
(1)处死小鼠，取出肿瘤或小肠派氏淋巴结组织，用OCT包埋，切成5毫米冰冻切片；
(2)用预冷丙酮-20℃固定20分钟；
(3)用10％山羊血清室温封闭1小时；
(4)倾去多余液体，滴加F4/80\CD11c等抗体(1∶100)，4℃孵育过夜；
(5)TBST缓冲液洗3次，每次5分钟；
(6)滴加荧光二抗(1∶200)，室温避光孵育0.5小时；
(7)TBST缓冲液洗3次，每次5分钟；
(8)DAPI(1∶1000)复染细胞核，室温避光孵育5分钟；
(9)TBST缓冲液洗5分钟；
(10)封片，荧光显微镜下观察。
实施例1
1.具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备：
(1)壳聚糖纳米颗粒的制备：将分子量在28000至32000的长链壳聚糖溶解于双蒸水中，并调节pH值到5.2，在55℃下搅拌30分钟。
(2)同时，将25mM Na2SO4溶液与Legumain DNA质粒混合加热至55℃，匀速搅拌30分钟。随后以体积比1∶1混合两种溶液，并马上进行混合，5分钟后将制备好的壳聚糖纳米颗粒保存在4℃；
(3)海藻酸侧链上的羧基的活化：将海藻酸粉末溶解到双蒸水中，将海藻酸溶液与加入的N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶5∶5混合，并将pH值调节到9.0，室温搅拌过夜，活化后的海藻酸置于4℃保存待用；
(4)将步骤(2)中活化的海藻酸与壳聚糖纳米颗粒按1∶1的体积比混合，并调节pH值到6.0，室温20rpm，搅拌4～6小时，得到的产物放置4～7℃保存；
(5)可将(4)中制备的纳米颗粒进行离心，12000rpm，10分钟，所得到的纳米颗粒将沉于离心管的底部，弃上清，并将纳米颗粒重悬于PBS缓冲液中，4～7℃保存；
利用DLS分析pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备在中性溶液中粒径分布的结果如图2所示，可见合成的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备粒径分布统一在371±27nm；电镜分析结果如图3所示，可见经海藻酸包被的壳聚糖纳米颗粒在表面有可见的包被层。且表面电位也可以明显看出经修饰后的壳聚糖纳米颗粒的表面电位被封闭如图4所示。
将200μl的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗在体外进行pH1.5的人工胃液进行消化后，结果如图5所示，只有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗有明显的抗酸降解能力。在不同的pH值条件下，海藻酸包被及不包被的壳聚糖纳米颗粒的粒径分布结果如图6所示。
实施例2
pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗在正常BALB/c小鼠的体内表达编码蛋白。
(1)灌胃及给药剂量为每只BALB/c小鼠施以合150μg DNA质粒的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗或108CFU的沙门氏菌，每天一次；
(2)重复上述步骤5次；
(3)对口服免疫后的BALB/c荷瘤小鼠进行体内荧光表达检测：处死荷瘤小鼠，取其小肠派氏淋巴结，观察编码绿色荧光蛋白的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的表达情况，并与其他对照组进行比较。
结果如图7所示，在小鼠派氏淋巴结中的巨噬细胞中绿色荧光蛋白被高表达。图8的流式细胞仪检测分析结果显示，在小鼠派氏淋巴结中的巨噬细胞以及树突状细胞中绿色荧光蛋白较空白对照组的表达量高。
实施例3
pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗在体内的抗肿瘤效果
(1)对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
(2)按步骤1.中的方法制备具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；
(3)通过灌胃的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为5组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为空纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗载体组；第三组为未经海藻酸修饰的纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；第四组为经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗组；第五组为阳性对照，传统沙门氏菌载体口服DNA抗肿瘤疫苗组；
结果如图9所示，较其他组别经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗组肿瘤生长被延缓，与传统沙门氏菌载体口服DNA抗肿瘤疫苗组相仿。最终的肿瘤体重比亦可说明pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗对肿瘤的生长有明显的抑制作用。如图10所示。
实施例4
经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及不同组别免疫后在荷瘤小鼠的脾细胞中的CD8+T的激活情况。
(1)对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
(2)按步骤1.中的方法制备具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；
(3)通过灌胃的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为5组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为空纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗载体组；第三组为未经海藻酸修饰的纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；第四组为经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗组；第五组为阳性对照，传统沙门氏菌载体口服DNA抗肿瘤疫苗组；
(4)流式细胞仪分析CD8+T细胞在体内的激活情况：处死荷瘤小鼠，取其脾脏，分离出脾细胞，与4T1小鼠乳腺癌细胞共培养24小鼠后，进行CD3\CD4\CD8\CD25等染色，后立即利用流式细胞仪进行检测，记录并采集1X106个细胞的数据；
结果如图11所示，经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗组可以有效地激活机体CD8+T细胞的激活。
实施例5
经pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及不同组别免疫后在荷瘤小鼠的脾细胞中的调节T细胞的的抑制作用
(1)对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
(2)按步骤1.中的方法制备具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；
(3)通过灌胃的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为5组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为空纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗载体组；第三组为未经海藻酸修饰的纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗；第四组为经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗组；第五组为阳性对照，传统沙门氏菌载体口服DNA抗肿瘤疫苗组；
(4)流式细胞仪分析调节T细胞在体内的激活情况：处死荷瘤小鼠，取其脾脏，分离出脾细胞，与4T1小鼠乳腺癌细胞共培养24小鼠后，进行CD3\CD4\CD8\CD25等染色，后立即利用流式细胞仪进行检测，记录并采集1X106个细胞的数据；
结果如图12所示，经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗，以及经海藻酸修饰的pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗空载体，都可以有效的抑制调节T细胞的比例，从而达到对免疫抑制的调节。

Claims (2)

1.具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗，其特征在于该疫苗是通过利用海藻酸对壳聚糖纳米颗粒进行修饰，使壳聚糖纳米颗粒具有pH敏感性，然后将编码肿瘤特异性抗原Legumain蛋白的DNA质粒装载到修饰后的壳聚糖纳米颗粒而制成；在疫苗通过胃液时保护DNA质粒不被降解，并在肠道中形成松散的结构，利于树突细胞及巨噬细胞吞噬，高效表达编码的基因；同时有效激发CD8+T细胞介导的免疫反应，降低调节T细胞对免疫系统的抑制作用，对肿瘤细胞进行杀伤，延缓肿瘤细胞的生长与转移。
2.如权利要求1所述的具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征是具体步骤为：
第1、壳聚糖纳米颗粒的制备
第1.1、将分子量在28000至32000的长链壳聚糖溶解于双蒸水中，并调节pH值到5.2，在55℃下搅拌30分钟，形成A液；
第1.2、同时将25mM Na2SO4溶液与DNA质粒混合加热至55℃，匀速搅拌30分钟，形成B液；
第1.3、随后将A液与B液以体积比1∶1混合两种溶液，并马上进行混合，5分钟后将制备好的壳聚糖纳米颗粒保存在4℃；
第2、海藻酸侧链上的羧基的活化
将海藻酸粉末溶解到双蒸水中，并且将海藻酸溶液与加入的N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶5∶5混合，并将pH值调节到9.0，室温搅拌过夜，活化后的海藻酸置于4℃保存待用；
第3、将第2步中活化的海藻酸与第1步中的壳聚糖纳米颗粒按1∶1的体积比混合，并调节pH值到6.0，室温20rpm，搅拌4～6小时，得到的产物放置4～7℃保存；
第4、将第3步中制备的纳米颗粒进行离心，12000rpm，10分钟，所得到的纳米颗粒将沉于离心管的底部，弃上清，并将纳米颗粒重悬于PBS缓冲液中，4～7℃保存，即得到具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗。
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