CN105907715B - 一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用 - Google Patents
一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105907715B CN105907715B CN201610276593.3A CN201610276593A CN105907715B CN 105907715 B CN105907715 B CN 105907715B CN 201610276593 A CN201610276593 A CN 201610276593A CN 105907715 B CN105907715 B CN 105907715B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- schistosoma japonicum
- exosome
- sea
- exosomes
- inflammatory bowel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 64
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 title claims abstract description 32
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 10
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 abstract description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 29
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 229920003045 dextran sodium sulfate Polymers 0.000 description 6
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 4
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 4
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 4
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 2
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 2
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 206010013183 Dislocation of vertebra Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000043977 Tetraspanins Human genes 0.000 description 1
- 108700031126 Tetraspanins Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940125698 hormone suppressant Drugs 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009854 mucosal lesion Effects 0.000 description 1
- 210000002487 multivesicular body Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明通过日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞产生外泌体，并经分离纯化获得外泌体，所述外泌体用于治疗免疫性肠病的小鼠后，其体重变化、疾病活动指数、结肠长度、组织病变、病理组织评分等各项指标显示实验小鼠疾病有明显好转；提示日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞（BMDC）产生的外泌体是具有确切的治疗炎症性肠病的作用。本发明属于生物治疗，可以在很大程度上避免现有的抗炎药物的毒副作用，具有低毒高效的特点，本发明为炎症性肠病的治疗提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，更具体地，涉及一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用。
背景技术
炎症性肠病是一组病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。炎症性肠病是北美和欧洲的常见病，近30年来我国炎症性肠病发病率亦呈逐步增高的趋势。目前对于炎症性肠病的治疗主要为药物治疗，药物治疗主要集中在应用激素和免疫抑制剂，但激素治疗和免疫抑制剂又具有一定的副作用，且会增加患者对于感染和肿瘤的易感性。因此研发一种无毒安全有效的药物治疗炎症性肠病是临床患者的迫切需要。
最近的研究提示，免疫性肠炎的发生可能与T细胞亚群的偏移存在一定关系，因此，从免疫调节方面纠正失衡的免疫应答是治疗免疫性肠病的重要方法，寄生虫感染可诱导宿主产生免疫耐受，调控宿主T细胞亚群的偏移，可能具有治疗免疫性肠病的作用，但是利用寄生虫活虫直接感染患者存在医疗伦理的限制，也存在寄生虫感染致病的风险，但从寄生虫中寻找和发现具有免疫调节作用的虫源性分子如血吸虫虫卵抗原（SEA），将其开发为药物则完全可以避免这种风险。
外泌体（exosomes）是细胞主动向胞外分泌的大小均一的囊泡样小体，富含胆固醇和鞘磷脂，是由多囊泡体与细胞膜融合后向胞外分泌的囊泡，具有脂质双分子层结构。几乎所有的外泌体都有微管蛋白、肌动蛋白结合蛋白、四跨膜蛋白。不同细胞来源的外泌体蛋白组成存在差异。最近，外泌体受到了研究者广泛关注，发现其可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，具有抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能并且参与抗原递呈、细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。因此，外泌体有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。
树突状细胞（DC）是一组分布广泛的、由骨髓来源的、具有迁移能力的免疫细胞，是目前发现的功能最强大的抗原递呈细胞（APC）。已有大量的研究表明，DC在抗肿瘤、抗感染、移植排斥和自身免疫疾病中发挥着重要作用。由于 DC 在抗原摄取、加工、递呈，尤其在激活和维持自身特异性 T 细胞免疫上的关键性作用，有理由相信，随着对 DC 基础研究的不断深入和在临床上的更广泛应用，以 DC为基础的自身免疫治疗将成为临床免疫治疗中十分重要的一种方法，可能使生物治疗真正成为继手术、化疗、放疗之后的又一治疗自身免疫性疾病的有效武器。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体。
本发明的第二个目的是提供所述外泌体在制备治疗炎症性肠炎的药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体，是通过以下方法获得：收获培养了7天的未成熟的树突状细胞，用日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞，4～48h后收集上清，经分离提纯后即得外泌体。
近几年外泌体的研究非常热门，关于外泌体治疗肿瘤癌症已有相关报道，但这些报道多还是利用母体来源的树突状细胞产生的外泌体治疗，其治疗效果差异大，而本发明直接用血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞，产生外泌体，用刺激获得的外泌体用于治疗炎症性肠病效果突出，而直接用树突状细胞本身产生的外泌体治疗炎症性肠病并没有效果。
优选地，所述日本血吸虫虫卵抗原和树突状细胞的用量比为（40～100）μg/mL：（104～107）个细胞/mL，因此，本发明还提供含有上述外泌体的制剂。
当所述制剂被用于治疗炎症性肠病的药物时，所述制剂还包括药学上可接受的辅剂。
当然制剂的剂型可以是散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、片剂或注射剂。
本发明还提供所述外泌体在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。
优选地，所述炎症性肠病包括累及回肠、直肠、结肠等的各种特发性肠道炎症性疾病，还包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞产生外泌体，并经分离纯化获得外泌体，所述外泌体用于治疗免疫性肠病的小鼠后，其体重变化、疾病活动指数、结肠长度、组织病变、病理组织评分等各项指标显示实验小鼠疾病有明显好转；提示日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞（DC）产生的外泌体是具有确切的治疗炎症性肠病的作用；本发明属于生物治疗，可以在很大程度上避免现有的抗炎药物的毒副作用，具有低毒高效的特点，本发明为炎症性肠病的治疗提供了新的方法。
附图说明
图1为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome负染透射电镜图片；其为典型的圆形泡状结构，直径范围为30～100nm，提示其为典型的exosome。
图2为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗炎症性肠病小鼠模型后体重变化情况，如图所示，炎症性肠病小鼠模型经日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗后，其体重与未治疗组相比有明显好转趋势；其中，% ofcontrol是指实验组小鼠的体重与对照组小鼠的体重的比值。
图3为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗炎症性肠病小鼠模型后疾病活动指数（DAI），如图所示，炎症性肠病小鼠模型经日本血吸虫虫卵抗原（SEA)刺激树突状细胞来源exosome治疗后，疾病活动指数（DAI）评分与未治疗组相比有明显下降趋势（评分越低，效果越好）。
图4为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗炎症性肠病小鼠模型，结肠大体形态，如图所示，炎症性肠病小鼠模型经日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗后，与未治疗组相比结肠炎症程度明显改善。
图5为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗炎症性肠病小鼠模型，结肠长度变化，如图所示，炎症性肠病小鼠模型经日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗后，与未治疗组相比结肠长度受疾病影响较轻。
图6为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗炎症性肠病小鼠模型，结肠组织切片HE染色观察，与未治疗组相比炎症范围、中性粒细胞浸润、隐窝损伤范围、隐窝脓肿、粘膜下水肿、杯状细胞消失、反应性上皮增生减轻。
图7为日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗炎症性肠病小鼠模型的组织病理学评分，与未治疗组相比组织病理学评分降低。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 日本血吸虫虫卵抗原（SEA）的制备方法
解剖日本血吸虫感染的新西兰兔，取出肝脏，去除大血管、胆管及结缔组织，剪成小碎块，置组织捣碎器内，加适量4℃预冷生理盐水，以3000转/min捣碎3次，每次l min，间隔3min。肝脏匀浆分别经50、100、120和140目/英寸分样筛过筛，收集的滤渣重复按上述步骤捣碎，过滤后与上述滤液合并。滤液置玻璃沉淀杯内沉淀l h，负压吸引器吸去上层肝渣悬液（注意避免将底部虫卵吸去，留下管底金黄色虫卵部分，反复水洗沉淀数次，每次沉淀45imn，至上清液清晰为止），先后用100和140目/英寸分样筛过滤去除滤渣，滤过液再次沉淀后将沉淀物置玻璃离心管中，以1000转/min低速离心分层，吸去上层肝糊，反复多次直至呈现金黄色纯净虫卵为止。然后用260目/英寸尼龙绢筛过滤。虫卵冻干，碾碎成粉，粉末溶于PBS中，混匀，4℃静置过夜，第二天离心取上清，BCA检测虫卵抗原SEA的浓度。
实施例2 日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激DC产生外泌体的方法
BALB/c小鼠颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5min，在无菌条件下取出股骨、胫骨，仔细剔除骨骼表面附着的肌肉和结缔组织，剪去两侧骨骺端以便暴露骨髓腔，用5mL无血清RPMI1640培养基冲洗出骨髓细胞，反复冲洗直至骨变白，收集细胞悬液置于15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，沉淀细胞用5mL无血清RPMI1640培养基重悬，1：10的体积比加入37℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，置室温2～3min，破红细胞。然后离心PBS洗涤2次，收集沉淀细胞重悬于5mL完全RPMI-1640 DC培养液（含有10mM Hepes，2mM谷胺酰氨，100U/mL青霉素和100U/mL的链霉素，10ng/mLrmGM-CSF，5ng/mLrmIL-4，10%无exosome胎牛血清）中，调整细胞浓度为2×106个/mL，分装细胞于25mL培养瓶中培养，5mL/瓶，37℃、5%CO2培养，每2天半量换液一次，第7天收获悬浮细胞并计数，即为未成熟的骨髓来源树突状细胞（BMDC）。
SEA刺激后外泌体收集时间摸索实验：分别开展了SEA刺激鼠BMDC产生外泌体的量的摸索实验，分别利用1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的SEA刺激树突状细胞产生外泌体，结果提示40～100μg/mL SEA刺激树突状细胞产生的外泌体的量较多，其中，50μg/mL SEA刺激树突状细胞产生的外泌体的量最多。
SEA与BMDC细胞的不同比例对外泌体产量的影响：分别利用50μg/mLSEA刺激不同浓度的BMDC细胞（101个/mL、102个/mL、103个/mL、104个/mL、105个/mL、106个/mL、107个/mL、108个/mL、109个/mL、1010个/mL），结果提示50μg/mL SEA刺激104～107个/mL树突状细胞产生的外泌体的量较多，其中，50μg/mL SEA刺激106个/mL树突状细胞产生的外泌体的量最多。
第7天收获悬浮细胞的未成熟的骨髓来源树突状细胞（BMDC），细胞计数，调整细胞浓度为2×106个/mL，培养于六孔板中（胎牛血清须用无exosome胎牛血清），淹没孔2mL，采用日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激，浓度为50μg/mL。刺激24小时后收集培养上清。
收集上清后，2000g离心，去除杂质；以上清：exosome提取试剂（invetrogen）的体积比为2：1混匀，4℃过夜，10000g，4℃离心1小时，小心吸去上清，并用PBS轻轻清洗沉淀表面提取试剂，PBS重悬沉淀即为exosome。分离后，采用透射电镜技术鉴定exosome形状、结构、纯度及大小；粒度仪鉴定exosome粒径分布及纯度；westernblotting鉴定exosome表面分子。
实施例3 实施例2制备的exosome治疗炎症性肠病小鼠模型
采用日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome对炎症性肠病治疗。
1、炎症性肠病（IBD）模型的建立方法
采用利用硫酸葡聚糖钠（Dextran sodium sulphate，DSS）诱导BALB/C小鼠进行炎症性肠病（IBD）模型建模：将DDS溶解于直饮水中，配成3%溶液（W/V）,喂养6周龄BALB/C小鼠，从第0天开始喂养，一直到第8天。每天记录小鼠体重变化，收集粪便，观察粪便形状并测隐血便，结合体重变化、隐血便、粪便形状计算小鼠模型疾病活动指数。
利用DSS与BALB/C小鼠构建炎症性肠病小鼠模型，用日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome经腹腔注射进行治疗，实验分组为PBS正常对照组（Water+PBS组）、PBS阴性对照组（DSS+PBS组）、树突状细胞来源exosome治疗组（DSS+N-EXO组）、虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源exosome治疗组（DSS+SEA-EXO组）。建模后，从第0天开始给小鼠exosome治疗，100μg/只/天，对照组给等体积的PBS，每天给药直至第6天。
每日观察和记录指标，每日采用盲法由双人观察小鼠体重变化、大便性状及潜血或便血，用体重变化、大便性状改变和有无便血作为疾病活动指数（diseaseactivityindex，DAI）评价小鼠的症状。潜血检查按联苯胺冰醋酸法进行。小鼠结肠大体观察和测量长度变化，HE染色镜下观察结肠粘膜损害程度和利用Wallace组织学损害评分标准进行炎症浸润程度评价，结果见表1。
组织学损害评分标准，此评分标准考虑到了炎症范围、中性粒细胞浸润、隐窝损伤范围、隐窝脓肿、粘膜下水肿、杯状细胞消失、反应性上皮增生，结果见表2。
实验结果表明，炎症性肠病小鼠模型经日本血吸虫虫卵抗原（SEA）刺激树突状细胞来源的exosome治疗后，体重变化与、疾病活动指数、结肠长度、组织病变、病理组织评分等各项指标显示小鼠炎症性肠病有明显好转。
Claims (5)
1.一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体，其特征在于，是通过以下方法获得：收获培养了7天的未成熟的树突状细胞，用日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞，4～48h后收集上清，经分离提纯后即得外泌体；所述日本血吸虫虫卵抗原和树突状细胞的用量比为(40～100)μg/mL：(104～107)个细胞/mL；所述树突状细胞为骨髓来源树突状细胞。
2.含有权利要求1所述外泌体的制剂。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅剂。
4.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型为散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、片剂或注射剂。
5.权利要求1所述外泌体在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610276593.3A CN105907715B (zh) | 2016-04-29 | 2016-04-29 | 一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610276593.3A CN105907715B (zh) | 2016-04-29 | 2016-04-29 | 一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105907715A CN105907715A (zh) | 2016-08-31 |
| CN105907715B true CN105907715B (zh) | 2020-12-29 |
Family
ID=56753082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610276593.3A Active CN105907715B (zh) | 2016-04-29 | 2016-04-29 | 一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105907715B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108715610B (zh) * | 2018-04-08 | 2021-09-24 | 湖北省预防医学科学院疾病预防控制中心血吸虫病防治研究所 | 一种血吸虫虫卵抗原的制备及纯化方法 |
| CN113832103B (zh) * | 2021-08-13 | 2023-08-22 | 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) | 弓形虫感染dc的外泌体制备及其应用 |
| CN115850426A (zh) * | 2022-07-13 | 2023-03-28 | 中国人民解放军海军军医大学 | 日本血吸虫虫卵及其分泌排泄蛋白抗肿瘤的作用及制备和用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103966165A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-06 | 中南大学湘雅医院 | 抗原特异性不成熟dc来源外泌体及其制备和应用方法 |
| CN104382827A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-03-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 人羊膜间充质干细胞外泌体的用途 |
| CN105349487A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-02-24 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种基于外泌体的促人骨髓间充质干细胞增殖的方法 |
-
2016
- 2016-04-29 CN CN201610276593.3A patent/CN105907715B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103966165A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-06 | 中南大学湘雅医院 | 抗原特异性不成熟dc来源外泌体及其制备和应用方法 |
| CN104382827A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-03-04 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 人羊膜间充质干细胞外泌体的用途 |
| CN105349487A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-02-24 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种基于外泌体的促人骨髓间充质干细胞增殖的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105907715A (zh) | 2016-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11154571B2 (en) | Exosomes sourced from granulocytic myeloid-derived suppressor cells and application thereof | |
| CN105907715B (zh) | 一种日本血吸虫虫卵抗原刺激树突状细胞来源的外泌体及其应用 | |
| CN106974938B (zh) | 一种具有抗肝癌作用的骨髓间充质干细胞来源的外泌体及其药物制剂 | |
| TW200829269A (en) | Methods for the cultivation of DC/D-CIK cells and applications | |
| CN110639007B (zh) | 一种口服型重组人乳铁蛋白丝蛋白水凝胶及其在制备增强免疫力的药物中的应用 | |
| CN110734896B (zh) | 一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN113616674A (zh) | 一种具有抗炎作用的细胞外囊泡的应用 | |
| Tan et al. | In situ formed scaffold with royal jelly-derived extracellular vesicles for wound healing | |
| CN112029705B (zh) | 促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用 | |
| CN111117964B (zh) | 一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途 | |
| CN103610699A (zh) | 一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用 | |
| CN114984049A (zh) | 人脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途 | |
| CN115227667A (zh) | 负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 | |
| BG107482A (bg) | Лекарствено средство за имунотерапия на злокачествени тумори | |
| CN110215523B (zh) | 甲基hispolon在制备抗宫颈癌的药物中的应用 | |
| CN111375053A (zh) | 一种口服型重组人乳铁蛋白丝胶纳米颗粒的制备方法及应用 | |
| JP2024504263A (ja) | 敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用 | |
| CN111317741A (zh) | 用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂及其鉴别方法与应用 | |
| CN114854667B (zh) | 一种猕猴桃来源的植物纳米囊泡及其应用 | |
| CN101686993A (zh) | 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 | |
| WO2024108605A1 (zh) | 一种芦荟来源外泌体的制备方法及其应用 | |
| CN118290563B (zh) | 一种前列腺癌抗原肽和免疫佐剂组合物及其在抗肿瘤中的应用 | |
| CN117771260A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞外泌体-淫羊藿苷载药系统、制备方法及应用 | |
| CN116473235A (zh) | 芦荟凝胶粉及其与水苏糖的组合物的应用 | |
| KR100562274B1 (ko) | 수지상 세포를 제조하는 방법 및 상기 수지상 세포를 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |