CN103966165A - 抗原特异性不成熟dc来源外泌体及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗原特异性不成熟DC来源外泌体及其制备和应用方法。将髓源性DC(BMDC)用microRNA-146a mimics干扰其成熟，然后通过检测其表面CD80，CD86和MHC II分子的表达，证实microRNA-146a mimics转染后的BMDC具有抵御抗原成熟刺激的能力；再将转染后的BMDC负载MG的致病肽段Tα146-162，即得到抗原特异性未成熟DC，这种抗原特异性未成熟DC分泌的外泌体则为本发明提供的外泌体。该外泌体用于治疗重症肌无力，并可进一步用于制备治疗该病的药物或制剂；具有制备方法简单、易于储备、稳定性强、效果显著、特异性强、副作用小等优点，具有广阔的应用前景。
Description
发明名称
本发明属于治疗重症肌无力的药物或制剂的技术领域，具体涉及一种抗原特异性不成熟DC来源外泌体和制备方法，及其在制备治疗重症肌无力药物中的应用。
背景技术
重症肌无力(Myasthenia Graves,MG)是常见的神经系统自身免疫性疾病。其发病率为(0.5-5)/10万，患病率为10/10万，且目前仍呈上升趋势。临床表现为全身骨骼肌的波动性易疲劳，症状晨轻暮重，严重时可累及呼吸肌而危及生命。该病易复发，难以根治，显著影响患者的生活质量和生存。传统的治疗方法包括胸腺切除，血浆置换，和应用非特异的免疫抑制药物，这些方法副作用多且不能有效阻止MG的复发和进展。MG的治疗目标应当是抑制抗原特异性的免疫反应，同时保留免疫系统的其它功能，因此具有免疫调节功能的生物疗法对治疗MG具有更为重要的临床意义。且目前尚无针对MG的抗原特异性生物疗法。
树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知的体内调节功能最强大的抗原提呈细胞。DC的成熟状态决定着体内免疫反应的方向。成熟DC表面高表达MHC II，以及CD80，CD86等共刺激分子，能促使T细胞活化，使其分化为效应性T细胞和记忆性T细胞，在治疗肿瘤和特殊病原体感染疾病的动物模型中显示了巨大的应用前景。而不成熟DC表面低表达MHCII，以及CD80，CD86等共刺激因子，与T细胞作用时不能给予足够的刺激从而导致T细胞凋亡，无能或者耐受，这使得人们思考能否将不成熟DC用于移植排异或者自身免疫性疾病的治疗。然而，不成熟DC具有不稳定的特点，它在体内和体外均易受到炎症因子的刺激而分化成熟，从而丧失其治疗效果。另外，不成熟DC作为细胞性的疫苗，其在体外的储存难度大。这一切限制了DC作为疫苗在自身免疫性疾病治疗中的应用。
外泌体(exosomes)是由活细胞分泌的，直径为30-100nm的囊状小体。外泌体能反应其分泌细胞的功能。不同DC分泌的外泌体具有以下共同特点，首先它是非细胞性疫苗，具有可以冷冻储藏的优点。其次，将DC来源的外泌体注入体内后其表面分子不会像DC那样经历表型变化，并且，Dex疫苗在体内发挥作用不受杀伤性T细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)细胞的影响。且在其应用于抗肿瘤的免疫治疗中，其副作用轻微且可耐受。不成熟DC来源的外泌体除了具有上述优点外，其表面低表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子能导致T细胞无能或低能反应，能诱导免疫耐受。Pêche等人先后证实了在小鼠心脏移植手术中，不成熟DC来源的外泌体能调节受者的抗移植免疫反应，并能显著延长同种异体心脏的存活时间。在自身免疫性疾病的治疗中，通过基因工程技术将表达IL-4，IL-10,FasL，吲哚胺2，3-加双氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)和CTLA-4Ig转染入髓源DC中，其来源的外泌体均能够抑制小鼠迟发型超敏反应的炎症进展，阻止类风湿性关节炎的病情进展。然而，这些实验使用的未成熟DC并不具有抗原特异性，因此它无法对自身免疫性疾病产生抗原特异性治疗，不能达到最佳的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗原特异性不成熟DC来源外泌体及其制备和应用方法。该抗原特异性不成熟DC来源外泌体能够用于治疗重症肌无力，而且具有制备方法简单、易于储备、稳定性强、效果显著、特异性强、副作用小等优点。
本发明的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，是将髓源性DC用microRNA-146amimics干扰其成熟，再负载MG的致病肽段Tα146-162得到抗原特异性不成熟DC，然后依靠抗原特异性不成熟DC分泌得到外泌体。
具体包括以下步骤：
1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；6小时后更换含GM-CSF的RPMI1640完全培养基；
2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC中，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心过滤纯化得外泌体。
上述方法更具体包括以下步骤：
1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含10ng/mlGM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；体系中microRNA-146a mimics浓度为100-150nM，DC浓度为106-108个/ml，6小时后更换含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基；
2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的浓度为106-108个/ml的转染microRNA-146amimics后的不成熟DC中，肽段Tα146-162终浓度为50-100μg/ml，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心，收集得到的液体滤膜过滤，收集滤后液体，离心得到白色沉淀；吸除上清液，加无菌PBS洗涤，离心，无菌PBS重悬外泌体，超滤离心过滤，得外泌体。
上述方法更进一步具体优选包括以下步骤：
1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；体系中microRNA-146a mimics浓度为100nM，DC浓度为106个/ml，6小时后更换含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基；
2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的浓度为106个/ml的转染microRNA-146amimics后的不成熟DC中，肽段Tα146-162终浓度为50μg/ml，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，4℃离心，300r/min，10分钟，吸取上清液至另一干净无菌的离心管中，4℃离心，2000r/min，20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的离心管中，在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22μm滤膜过滤，收集滤后液体，4℃离心100000r/min，70分钟，得到白色沉淀；吸除上清液，加无菌PBS洗涤，4℃离心，100000r/min，70分钟，无菌PBS重悬外泌体，100nm超滤离心管4℃离心，300r/min，30分钟，得外泌体。
抗原特异性不成熟DC来源外泌体，是由上述的方法制备而成的外泌体。
所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备治疗重症肌无力的药物，制备时制剂的含量为5μg/25g体重。
所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体在制备重症肌无力的药物时，具体是用于制备抑制抗原特异性脾脏细胞的增殖的制剂，或者是用于制备改变脾脏培养细胞上清液的细胞因子的极化方向的制剂。
进一步具体说所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备降低血清抗AChR IgG及其亚型IgG1,IgG2b水平的制剂，或用于制备降低血清中或脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ，IL-17水平和增高IL-4、IL-10水平的制剂。
所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体还可以用于制备促进EAMG小鼠T淋巴细胞由Th17、Th1向Th2、FoxP3+Treg转化的制剂；或者是用于制备脾淋巴细胞Th17、Th1细胞特异性转录因子T-bet、RORγt表达水平降低，而GATA-3、FoxP3表达水平增高的制剂。
本发明将髓源性DC(BMDC)用microRNA-146a mimics干扰其成熟，然后通过检测其表面CD80，CD86和MHC II分子的表达，证实microRNA-146a mimics转染后的BMDC具有抵御抗原成熟刺激的能力；再将转染后的BMDC负载MG的致病肽段Tα146-162，即得到抗原特异性未成熟DC，这种抗原特异性未成熟DC分泌的外泌体则为本发明提供的外泌体。
本发明首次将制备得到的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于治疗重症肌无力，并可进一步用于制备治疗该病的药物或制剂。本发明通过有效试验能够证明本发明的外泌体能在体外抑制抗原特异性脾脏细胞的增殖，以及改变脾脏培养细胞上清液的细胞因子的极化方向，而且在实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)小鼠体内能改善EAMG小鼠疾病严重程度的临床评分、降低血清抗AChR IgG及其亚型水平、降低血清中或者脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-17水平和增高IL-4、IL-10水平、以及改变脾脏Th淋巴细胞的极化方向，从而达到对EAMG的治疗效果。
附图说明
图1为分离纯化髓源性不成熟DC时分选后DC的纯度；
图2a为DC表面MHC II分子和共刺激分子的表达百分比；
b为DC表面MHC II分子和共刺激分子的平均荧光强度(MFI)；
图3为microRNA-146a转染量效图；
图4a为转染microRNA-146a mimics组及PBS组DC负载抗原后的表型的比较(百分比)；
b为转染microRNA-146a mimics组及PBS组DC负载抗原后的表型的比较(平均荧光强度)；
c为转染microRNA-146a mimics组及PBS组DC上清液IL-6，IL-12p70的水平；
图5为EAMG小鼠治疗后的临床评分比较；
图6为入组第20天EAMG小鼠血清抗AChR IgG及其亚型水平；
图7为入组第20天EAMG小鼠血清细胞因子水平；
图8a为治疗后EAMG小鼠脾脏细胞培养上清液细胞因子的水平(pg/ml)；
b为治疗后EAMG小鼠脾脏细胞T淋巴细胞转录因子的表达；
图9为imDex治疗组和mDex对照组对EAMG小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应影响的比较。
具体实施方式
以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
1.制备抗原特异性不成熟DC来源外泌体
1.1分离纯化髓源性不成熟DC及表型检测
选取6-8周B6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，将胫骨和腓骨的骨髓液用红细胞裂解去除红细胞后加入含有10ng/ml rmGM-CSF的RPMI1640完全培养基中培养72小时后全量换液继续培养至第五天，之后半量换液后培养至第7天。按照磁珠分选说明书，选用抗CD11c的磁珠分选提纯DC，使其纯度达95％以上(附图1)。
1.2流式细胞学检测DC负载抗原(肽段Tα146-162)后的表型变化
将1.1中培养第5天的DC分为两组，每组3个复孔，实验组加入50μg/ml的肽段Tα146-162至DC培养体系中，对照组加入等剂量的PBS至DC培养体系中。继续培养至第7天，收集细胞，磁珠分选提纯DC。100μl PBS重悬DC，每孔加入5μl PE标记的抗CD11c，5μl FITC标记的抗MHCII，10μl Alexa647标记的CD80，10μl PE/cy7标记的抗CD86,避光孕育20分钟，300μl PBS重悬DC，流式上机检测。结果发现负载抗原(肽段Tα146-162)后DC表面MHC II,CD80，CD86的百分比及平均荧光强度均有增高(附图2a,b)。
1.3microRNA-146a mimics转染DC及其抵抗抗原成熟刺激的能力
收集培养至第5天的DC备用；
microRNA-146a mimics加入载体HiperFect，按说明书(QIAGEN公司的HiPerFectTransfection Reagent产品的说明书)20℃温育20分钟，然后将microRNA和HiperFect加入培养至第5天的DC培养体系中，整个体系中microRNA-146a mimics的浓度分别为25nM，50nM，75nM，100nM，150nM，negative control的浓度为150nM，载体HiperFect浓度1.5μl/ml，DC浓度为106-108个/ml(优选106个/ml)real time PCR检测microRNA-146a mimics的最适转染浓度为100nM(附图3)。以100nM microRNA-146a mimics和negative control分别转染DC，每组设3个复孔。6小时后换液，加入抗原(肽段Tα146-162)培养至第7天，抗原终浓度为50-100μg/ml。收集转染和未转染microRNA-146a mimics的DC和上清液，流式细胞学(MHC II,CD80,CD86)和ELISA(IL-6,IL-12p70)鉴定转染microRNA-146a mimics的DC抵御抗原成熟刺激的能力。结果发现，microRNA-146a mimics转染后，DC表面MHC II，CD80，CD86分子的百分比和荧光强度均较PBS组降低。microRNA-146a mimics转染组炎性因子IL-6，IL-12p70的分泌较PBS组减少(附图4a-c)。这说明转染microRNA-146a mimics后的DC具有抵抗抗原成熟刺激的能力。
1.4抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备
将转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC加入50μg/ml肽段Tα146-162培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，4℃离心,300r/min×10分钟，吸取上清液至另一干净无菌的50ml离心管中。4℃离心，2000r/min×20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的50ml离心管中。在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22μm滤膜过滤。收集滤后液体，4℃离心100000r/min×70分钟，得到白色沉淀即为外泌体。吸去上清液，加无菌PBS洗涤，4℃离心，100000r/min×70分钟，1ml无菌PBS重悬外泌体。100nm超滤离心管4℃离心，300r/min×30分钟过滤外泌体。0.22μm超滤离心管4℃离心，300r/min×30分钟过滤外泌体。将获得的外泌体用BCA法检测其蛋白含量。
2.抗原特异性不成熟DC来源外泌体对EAMG的治疗
采用经典主动免疫方法建立EAMG模型(具体方法详见文献)，挑选EAMG临床评分为1-2分的B6发病小鼠，随机分为治疗组和对照组(体重均为25g左右)。两组根据注射剂量和种类的不同分为4个亚组，即负载Tα146-162抗原特异性不成熟DC组(按注射剂量不同分为2μg组，5μg组和10μg组)，负载Tα146-162抗原特异性成熟DC来源外泌体组。4组相同条件饲养，观察体重，临床评分，第20天留取尾静脉血检测血清抗AChR抗体总IgG,IgG1,IgG2b,IgG2c，以及血清中IL-4,IL-10，IL-17,IFN-γ细胞因子水平。同时，取脾脏检测淋巴细胞增殖反应，细胞因子IL-4,IL-10，IL-17,IFN-γ水平及蛋白辅助性T细胞转录因子GATA-3，FoxP3,RORγt,T-bet表达检测。
2.1抗原特异性不成熟DC来源外泌体对EAMG小鼠临床评分的影响
距初次免疫70天，选取EAMG临床评分为1-2分的B6发病小鼠随机分为治疗组(2μg,5μg,10μg Tα146-162-imDex)和对照组(10μg Tα146-162-mDex)。治疗组入组后予以尾静脉注射负载Tα146-162-imDex，平均临床评分(MCS)逐渐减轻，且随着治疗剂量的增加，减轻程度越大，而注射Tα146-162-mDex组MCS逐渐加重,试验终止前有3只死亡。入组后第10天到实验终止治疗组和对照组MCS差异一直有显著性意义。2μg和5μg治疗组间MCS差异有统计学意义，而5μg和10μg治疗组间差异没有统计学意义(附图5)。
2.2EAMG小鼠治疗后其体内抗AchR IgG抗体的变化
EAMG小鼠入组20天后，治疗组血清抗AChR IgG及其亚型IgG1,IgG2b较对照组降低，而IgG2c较对照组无明显变化(附图6)。
2.3不成熟DC来源外泌体对EAMG小鼠血清细胞因子的影响
EAMG小鼠入组20天后，不同剂量治疗组血清IFN-γ，IL-17均较对照组降低，而IL-4、IL-10均较对照组增高。其中，2μg治疗组和5μg治疗组的细胞因子差异均有统计学意义，而5μg治疗组和10μg治疗组之间细胞因子水平的差异无明显统计学意义(附图7)。
2.4imDex对EAMG小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响
实验终止时取小鼠脾脏淋巴细胞体外培养，培养体系中给予抗原T-AChR刺激，并检测细胞因子IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ分泌水平及脾淋巴细胞转录因子GATA-3、FoxP3、RORγt、T-bet。各个Tα146-162-imDex治疗组小鼠脾脏淋巴细胞IL-17、IFN-γ分泌水平均显著低于mDex组(P<0.01)，IL-4、IL-10分泌水平均显著高于mDex组(P<0.05)。在Tα146-162-imDex治疗组脾淋巴细胞Th17、Th1细胞特异性转录因子T-bet、RORγt表达水平显著低于mDex组，而GATA-3、FoxP3表达水平显著高于mDex组。结果说明Tα146-162-imDex可以促进EAMG小鼠T淋巴细胞由Th17、Th1向Th2、FoxP3+Treg转化(附图8a,b)。
2.5Tα146-162-imDex对EAMG小鼠脾脏T淋巴增殖的影响是呈抗原特异性的
从不同剂量Tα146-162-imDex治疗EAMG小鼠的临床症状,细胞因子分泌水平，脾脏淋巴细胞反应程度可以看出imDex对EAMG的治疗效果与剂量有关，5μg的imDex的剂量治疗效果明显好于2μg的imDex，而10μg和5μg治疗剂量之间无明显的差异。取5μg Tα146-162-imDex治疗组和mDex对照组，分别给予抗原T-AChR、Tα146-162、ConA抗原刺激，检测淋巴细胞增殖反应。Tα146-162-imDex治疗组小鼠脾脏淋巴细胞对TAChR和Tα146-162刺激的淋巴细胞增殖反应显著低于Tα146-162-mDex治疗组(P<0.05)，而两组小鼠脾淋巴细胞对ConA刺激的淋巴细胞增殖反应无明显差别，这说明本发明中Tα146-162-imDex对EAMG的治疗是呈抗原特异性的(附图9)。
Claims (10)
1.抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，将髓源性DC用microRNA-146a mimics干扰其成熟，再负载MG的致病肽段Tα146-162得到抗原特异性不成熟DC，然后依靠抗原特异性不成熟DC分泌得到外泌体。
2.根据权利要求1所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，
具体包括以下步骤：
1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；6小时后更换含GM-CSF的RPMI1640完全培养基；
2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC中，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心过滤纯化得外泌体。
3.根据权利要求2所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，
具体包括以下步骤：
1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含10ng/mlGM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；体系中microRNA-146a mimics浓度为100-150nM，DC浓度为106-108个/ml，6小时后更换含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基；
2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的浓度为106-108个/ml的转染microRNA-146amimics后的不成熟DC中，肽段Tα146-162终浓度为50-100μg/ml，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心，收集得到的液体滤膜过滤，收集滤后液体，离心得到白色沉淀；吸除上清液，加无菌PBS洗涤，离心，无菌PBS重悬外泌体，超滤离心过滤，得外泌体。
4.根据权利要求3所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，
具体包括以下步骤：
1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；体系中microRNA-146a mimics浓度为100nM，DC浓度为106个/ml，6小时后更换含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基；
2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的浓度为106个/ml的转染microRNA-146amimics后的不成熟DC中，肽段Tα146-162终浓度为50μg/ml，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，4℃离心，300r/min，10分钟，吸取上清液至另一干净无菌的离心管中，4℃离心，2000r/min，20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的离心管中，在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22μm滤膜过滤，收集滤后液体，4℃离心100000r/min，70分钟，得到白色沉淀；吸除上清液，加无菌PBS洗涤，4℃离心，100000r/min，70分钟，无菌PBS重悬外泌体，100nm超滤离心管4℃离心，300r/min，30分钟，得外泌体。
5.抗原特异性不成熟DC来源外泌体，其特征在于，是由权利要求1-4任一项所述的方法制备而成的外泌体。
6.权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备治疗重症肌无力的药物。
7.根据权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备治疗重症肌无力的药物时，制剂的含量为5μg/25g体重。
8.权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备抑制抗原特异性脾脏细胞的增殖的制剂；或用于制备改变脾脏培养细胞上清液的细胞因子的极化方向的制剂。
9.权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备降低血清抗AChR IgG及其亚型IgG1,IgG2b水平的制剂，或用于制备降低血清中或脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ，IL-17水平和增高IL-4、IL-10水平的制剂。
10.权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备促进T淋巴细胞由Th17、Th1向Th2、FoxP3+Treg转化的制剂；或用于制备脾淋巴细胞Th17、Th1细胞特异性转录因子T-bet、RORγt表达水平降低，而GATA-3、FoxP3表达水平增高的制剂。
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