CN104894067B

CN104894067B - 一种高质量外排体及其制备方法

Info

Publication number: CN104894067B
Application number: CN201410078627.9A
Authority: CN
Inventors: 王建莉; 杨菲; 蔡志坚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-03-05
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2034-03-05
Also published as: CN104894067A

Abstract

本发明公开了一种高质量外排体及其制备方法，具体地，涉及一种外排体(exosomes)，它是由细胞产生的分泌到细胞外的囊泡，且所述囊泡具有以下特征：a)直径在30‑90nm之间；b)密度在1.11‑1.19g/ml之间；c)含有以下一个或多个特征分子：TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9。本发明外排体具有均一性好、安全性高的特点，且可通过本发明方法进行大规模制备，从而适应临床需要。

Description

一种高质量外排体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，尤其涉及一种均一性好、安全性高的外排体以及大规模制备该外排体的方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病。肿瘤免疫治疗是目前对手术、化疗与放疗三大治疗方法的必要补充，也是肿瘤治疗和免疫学研究的热点。随着许多肿瘤特异性抗原及肿瘤相关抗原等的相继发现与鉴定及其人们对抗原递呈机制及T细胞活化机制研究的不断深入，应用多种形式的肿瘤疫苗诱导以机体T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫功能的应用研究得到了迅速的发展。但是，由于大多数肿瘤的免疫原性很弱，因此在特异性免疫治疗过程中，如何运用新型免疫佐剂及抗原递送系统提高肿瘤疫苗的免疫原性、增强肿瘤抗原的抗原递呈、提高免疫效应细胞的杀伤活性是研究的主要方向。

外排体(Exosomes)是细胞所释放的直径为50-100nm的微小的膜性囊泡，成熟的红细胞以外排体的形式将功能所不需要的浆膜蛋白排出细胞外，例如转铁蛋白受体（TfR）或乙酰胆碱脂酶等。通过电镜的深入研究，证实外排体不是由细胞膜直接芽生形成的，而是来源于称为多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）的由内吞过程形成的结构。这种小囊泡出现在MVBs内腔中，很可能是由MVBs内侧面的膜芽生而来。最后通过MVBs与胞浆膜的直接融合，这些小囊泡被释放到细胞外的基质中，即被称为exosome。近年来发现exosome并不仅仅由终期分化的网织红细胞唯一分泌，包括EB病毒转染的B淋巴细胞、T淋巴细胞、肿瘤细胞、抗原递呈细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血小板等均被证明能分泌exosome，其功能也与来源的细胞有关。

目前最受人们关注的是来源于树突状细胞的Exosomes（dendritic cell-derivedExosomes，DEXs)及来源于肿瘤细胞Exosomes（tumor-derived Exosomes，TEXs)。研究表明，Exosomes表达丰富的膜蛋白，包括抗原递呈相关分子如MHC-I,MHC-II,共刺激分子,热休克蛋白分子，介导细胞间粘附的分子如CD11b,ICAM,tetraspanins,lactadherin等，抗原冲击后的DC来源的Exosomes可表达相应的抗原，而肿瘤细胞来源的Exosomes可表达肿瘤相关抗原。自从Raposo等最先报道Exosomes的免疫激活功能后，exosome作为一种非细胞性的抗原递送系统，在肿瘤免疫抗原递呈及肿瘤疫苗研究领域引起了广泛的关注（Raposo G,et al,J Exp Med.1996;183:1161–72）。研究表明，无论是肿瘤抗原冲击DC来源的Exosomes还是肿瘤细胞来源的Exosomes均可在体外激活抗原特异性CTL。而且在体外将抗原肽直接荷载到纯化的Exosomes后，比抗原肽冲击DC来源的Exosomes具有更强的免疫活化潜能（Hsu DH,etal.J Immunother.2003;26:440–50）。

Zitvogel实验室报道了人和小鼠的肿瘤细胞均能够持续分泌Exosome，这些肿瘤细胞来源的TEXs，富含共刺激分子如CD80/CD86,MHCⅠ/Ⅱ以及某些黏附分子等，而且TEXs还富含肿瘤共同抗原以及热休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)等。研究结果表明，TEXs体内免疫后，能够将肿瘤抗原呈递给DC，从而产生显著的CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应，且这种免疫效应对同系的和异系的荷瘤小鼠有交叉治疗作用。由于TEXs来自于肿瘤细胞，携带有肿瘤抗原，又有几乎所有目前研制的高效肿瘤疫苗所必须的共刺激信号的特性，因此其不仅是一种安全、有效的的非细胞性肿瘤疫苗，而且也可成为一种新型的肿瘤抗原的递呈系统。这种新型高效的肿瘤递呈系统，未经基因修饰和外源基因导入，对机体潜在危害作用小，没有伦理的难题，无个体限制性,且制备简单易行，因而可成为一种极有临床应用前景的新型肿瘤抗原递呈系统，在多种恶性肿瘤的免疫治疗中具有重要的应用价值和良好的市场前景。

由于体外建株的肿瘤细胞易于大规模培养，从体外建株的肿瘤细胞中制备TEXs具有来源广泛、制备工艺简单易行等优点。但是传统制备Exosomes需要通过高速离心、超速离心来获取。这种方法由于细胞培养上清本身体积较大，同时受离心机的规格所限，产量较低、效率不高，难以满足临床所需。

因此，本领域迫切需要开发一种新型大规模制备细胞外排体（exosome）的技术。

发明内容

本发明提供了一种均一性好、安全性高的外排体，较佳地，所述外排体来源于肿瘤细胞。

本发明第一方面，提供了一种外排体(exosomes)，它是由细胞产生的分泌到细胞外的囊泡，其中所述的细胞包括：肿瘤细胞、树突状细胞(DC细胞)、T细胞，且所述囊泡具有以下特征：

a)直径在30-90nm之间；

b)密度在1.11-1.19g/ml之间；

c)含有以下一个或多个特征分子：TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9。

在另一优选例中，所述的外排体含有HSP70特征分子。

在另一优选例中，所述的外排体的密度在1.11-1.17g/ml之间，较佳地，为1.13-1.15g/ml之间。

在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括来自结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌的细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞还包括经热休克处理的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述外排体通过以下方法产生：

培养肿瘤细胞，从而制得含有外排体的培养上清液。

在另一优选例中，所述的外排体进一步通过以下方法分离：

(i)提供一非连续密度梯度的蔗糖体系，其中，所述蔗糖体系的浓度范围为26%-45%，且所述体系的密度梯度间隔为0.02g/cm³；

(ii)将所述含有外排体的培养上清液加入所述蔗糖体系并进行离心，其中，离心的转速为100,000×g，离心时间为1-3小时，从而获得分布于不同密度蔗糖的之间中间层中的外排体粗体；

(iii)抽取两种不同密度蔗糖的中间层中的所述外排体粗体，并进行洗滤，从而获得如本发明第一方面所述的外排体。

在另一优选例中，在步骤(iii)中，还包括混合或不混合不同密度层中间所抽取的外排体粗体。

在另一优选例中，所述的洗滤采用PBS通过500KD中空膜至少洗滤3次，较佳地，至少洗滤5次。

在另一优选例中，步骤(iii)还包括在洗滤后进行滤菌。

在另一优选例中，所述的滤菌包括采用0.22μm的滤器。

本发明第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述外排体的方法，包括步骤：

(a)提供一含有外排体的细胞培养上清液以及一非连续密度梯度的蔗糖-水溶液体系，其中，所述体系中蔗糖的浓度范围为26%-45%，且所述体系的密度梯度间隔为0.02g/cm³；

(b)将所述含有外排体的细胞培养上清液加入所述蔗糖体系并进行离心，其中，离心的转速为80,000-200,000×g，离心时间为1-3小时，从而获得分布于不同密度蔗糖的之间中间层中的外排体粗体；

(c)抽取(a)中不同梯度的两相邻密度蔗糖的中间层中所述的外排体粗体，并进行洗滤，从而获得如本发明第一方面所述的外排体；

其中，所述的细胞包括来自以下细胞系的细胞：肿瘤细胞、树突状细胞(DC细胞)、T细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括来自肿瘤细胞系的细胞。

在另一优选例中，所述的细胞培养上清液通过如下步骤获得：

(a1)采用培养液培养细胞；

(a2)细胞培养至汇聚度60%时，更换含10%不含外排体的小牛血清作为培养基继续培养18-30小时后收集上清液粗体；较佳地，为24小时。

(a3)将(a2)中的上清液粗体经3+0.8μm滤膜过滤，从而获得不含细胞残留物的上清液；

(a4)将(a3)中的上清液采用500KD的中空膜进行浓缩，并将浓缩产物经PBS和500KD中空膜洗滤，从而获得含有外排体的PBS溶液，即所述的细胞培养上清液。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括sw480、3LL、B16、4T1。

在另一优选例中，所述的细胞培养液包括为常规细胞培养液。

在另一优选例中，所述的不含外排体的小牛血清通过以下步骤制备：

采用500KD滤膜去除小牛血清中大于500KD的成分后，采用0.22μm滤器过滤从而获得不含外排体的小牛血清。

在另一优选例中，所述0.22μm滤器通过蠕动泵上样，其中上样速率为50rpm/min。

在另一优选例中，所述500KD滤膜的跨膜压为2-3psi；进料控制的截留速度为25ml/min。

在另一优选例中，步骤(c)中，所述的洗滤包括对所述的外排体粗体进行滤菌。

在另一优选例中，采用0.22μm的滤器进行所述的滤菌。

本发明第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括安全有效量的本发明第一方面所述的外排体，以及药学上可接受的载体。

本发明第四方面，提供了本发明第一方面所述外排体的用途，用于制备预防或治疗肿瘤、自身免疫性疾病的药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括安全有效量的本发明第一方面所述的外排体，以及药学上可接受的载体。

所述的肿瘤包括恶性实体肿瘤与恶性非实体肿瘤，较佳地为实体肿瘤，所述的自身免疫性疾病包括多发性硬化症、炎症性肠病。

在另一优选例中，所述的恶性实体肿瘤包括结肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤。

本发明第五方面，提供了一种治疗肿瘤或治疗自身免疫性疾病的方法，包括向所需要的对象施用安全有效量的本发明第一方面的外排体或本发明第三方面的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明新型大规模制备的细胞外排体的电镜观察。

图2显示了本发明新型大规模制备的细胞外排体的成分鉴定，westernblot方法检测表达外排体的特征分子及肿瘤抗原。

图3显示了本发明新型大规模制备的细胞外排体的成分鉴定，流式细胞术检测表达外排体的特征分子。

图4显示了本发明新型大规模制备的细胞外排体的安全性鉴定，检测肿瘤细胞来源的exosomes体外形成克隆的能力，证实exosomes没有克隆形成能力，没有生长和增殖能力。

图5显示了本发明新型大规模制备的细胞外排体的安全性鉴定，检测exosomes的急性毒性作用，表明最大剂量注射(3mg)，14天内动物无一死亡，解剖后主要脏器未见异常变化。

图6显示了本发明新型大规模制备的细胞外排体与传统制备方法得到的外排体比较，电镜观察。

图7显示了采用Western Blot分析本发明外排体的HSP70含量，其中在1.11-1.19g/cm³密度层之间，所含exosomes标志分子HSP70含量较高，而在1.13-1.15g/cm³的密度层之间，exosomes标志分子HSP70含量最高。

图8显示了本发明制备的外排体能够促进DC成熟，分泌更多IL-12、TNFα-11。LPS为阳性对照，EXO：外排体，HS-EXO：热休克肿瘤细胞分泌的外排体。

图9显示了流式检测DC表面分子发现，EXO可以促进DC表型成熟。

图10显示了采用3H胸腺嘧啶核苷酸掺入法进行混合淋巴细胞实验，EXO增强了DC的抗原提呈功能。因此发明外排体能够促进T细胞增殖，能够在抗肿瘤中发挥作用。

图11显示了外排体体内免疫HLA－A2转基因鼠，将免疫后小鼠脾细胞过继回输治疗sw480荷瘤裸鼠，结果显示本发明外排体可显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠及的存活期。

图12显示了B16、3LL、4T1细胞来源外排体

该技术制备的三种肿瘤细胞分泌的外排体，具有外排体的特征（电镜：双分子囊泡，30-90nM；蛋白特征：表达CD63，HSP70，Tsg101），并且能够促进DC成熟，分泌更强的细胞因子。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次制备了一种来源于肿瘤细胞，均一性高、安全性好的外排体，本发明外排体特征性表达TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9以及肿瘤抗原，其密度在1.11-1.19g/ml之间，且无肿瘤克隆形成能力，施用本发明外排体作为抗肿瘤疫苗不存在致瘤性以及不良反应。此外，本发明还提供了一种大规模制备所述外排体的方法，实验证明，采用浓度为26%-42%的非连续密度梯度蔗糖体系对细胞培养液进行处理离心，能够快速获得大量密度均一的本发明外排体，可满足广大的临床需求。在此基础上，完成了本发明。

外排体

外排体是细胞所释放的直径为50-100nm的微小的膜性囊泡，成熟的红细胞以外排体的形式将功能所不需要的浆膜蛋白排出细胞外，例如转铁蛋白受体(TfR)或乙酰胆碱脂酶等。通过电镜的深入研究，证实外排体不是由细胞膜直接芽生形成的，而是来源于称为多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)的由内吞过程形成的结构。这种小囊泡出现在MVBs内腔中，很可能是由MVBs内侧面的膜芽生而来。最后通过MVBs与胞浆膜的直接融合，这些小囊泡被释放到细胞外的基质中，即被称为外排体。近年来发现外排体并不仅仅由终期分化的网织红细胞唯一分泌，有人证实了EB病毒转染的B淋巴细胞可以分泌同样的这种小囊泡。在B淋巴细胞和抗原提呈细胞中，包括MVBs在内的这种参与内吞过程的结构正是多肽结合MHCII类分子的部位。EB病毒来源的含有多肽MHCII类分子复合物，并能够将其直接呈递给CD4⁺T淋巴细胞。Zitvogel等报道了DC同样也可以分泌外排体，并且这种DC来源的外排体含有MHCI类和MHCII类分子。当用肿瘤细胞来源的多肽冲击DC后得到的外排体，可以诱导CTL介导的抗肿瘤免疫反应，导致荷瘤小鼠的肿瘤生长明显抑制。最近，Zitvogel实验室又报道了人和小鼠的肿瘤细胞均能够持续分泌外排体，这些肿瘤细胞来源的外排体含有MHCI类分子和LAMP1并且能够将肿瘤抗原呈递给DC从而产生显著的CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应，且这种免疫效应对同系的和异系的荷瘤小鼠有交叉治疗作用，提示肿瘤来源的外排体可能与肿瘤免疫密切相关。外排体可以作为肿瘤治疗的制剂和肿瘤疫苗，介导针对同系小鼠和不同系小鼠的肿瘤免疫保护作用。

在本发明中，相较于传统制备方法所制得的外排体而言，本发明的外排体密度均一，质量稳定，且具有以下特征：

a)直径在30-90nm之间；

b)密度在1.11-1.19g/ml之间；

c)含有以下一个或多个特征分子：TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9。

在另一优选例中，所述的外排体含有HSP70特征分子。

在另一优选例中，所述的外排体的密度在1.13-1.17g/ml之间，较佳地，为1.14-1.16g/ml之间。

通常，在这一密度下的外排体具有的镜下表现来看，大小均一，形状均为圆形或卵圆形，脂质双分子层结构。此外，通过实验证明，本发明外排体可用于制备肿瘤疫苗，施用于哺乳动物后没有致瘤性，且不会产生明显的不良反应。

细胞

可用于制备本发明外排体的细胞没有特殊限制，可以是任何产生外排体并携带肿瘤抗原的细胞。典型地，可用于本发明的细胞包括肿瘤细胞、与肿瘤细胞共培养的树突状细胞(DC细胞)、T细胞。

此外，还可以通过其他方式使细胞产生外排体，例如采用热休克的方法使细胞产生外排体。(参见CN02145022.6)。

制备方法

本发明还提供了一种可以高效、大规模地制备本发明外排体的方法，包括步骤：

(a)提供一含有外排体的细胞培养上清液以及一非连续密度梯度的蔗糖-水溶液体系，其中，其中，所述体系中蔗糖的浓度范围为26%-45%，且所述体系的密度梯度间隔为0.02g/cm³；

一种优选的非连续密度梯度体系如下：

1.07g/cm³（18%蔗糖（H₂O））、1.09g/cm³（22%蔗糖（H₂O））、1.11g/cm³（26%蔗糖（H₂O））、1.13g/cm³（30%蔗糖（H₂O））、1.15g/cm³（35%蔗糖（H₂O））、1.17g/cm³（39%蔗糖（H₂O）、1.19g/cm³（42%蔗糖（H₂O）、1.21g/cm³45%蔗糖（H₂O）；较佳地，浓度为26%-39%，更佳地，为30%-35%。

其中，所述的细胞包括肿瘤细胞、树突状细胞(DC细胞)、T细胞。

如本文所用，术语“洗滤”表示在对含有外排体的制备粗产物或含有外排体的液体进行过滤时(如采用500KD的半透膜)，同时采用缓冲溶液如PBS等对粗产物或该液体进行冲洗，从而使<500KD的外排体过滤并洗入缓冲溶液中。

本发明细胞培养上清液可以通过本领域常规生产外排体的方法获得，优选地，所述的细胞培养上清液通过如下步骤获得：

(a1)采用培养液培养细胞；

为了获得肿瘤细胞来源的外排体，需要对培养所用的小牛血清进行过滤从而获得不含外排体的小牛血清，主要包括步骤：

在另一优选例中，所述500KD滤膜的跨膜压为2-3psi；进料控制(feed control)的截留速度为25ml/min。

步骤(c)中，所述的洗滤包括对所述的外排体粗体进行滤菌，优选地，采用0.22μm的滤器进行所述的滤菌。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物或免疫组合物。在所述组合物中，含有药学上可接受的载体(包括稀释剂、赋形剂等)以及有效量的本发明外排体。外排体的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的外排体。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如肿瘤抗原)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

本发明的含外排体的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经口服、皮下、皮内、腔内、瘤内或病变部位、淋巴结、静脉注射或埋植等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

本发明的外排体可用于治疗和预防肿瘤及感染性疾病发生，对已发生的肿瘤及感染性疾病具有治疗作用。代表性的例子包括(但并不限于)：各种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤等以及各类感染性疾病如细菌、病毒、真菌、寄生虫感染包括艾滋病、各型病毒性肝炎等的预防及治疗。

本发明有益效果：

1.本发明外排体其密度均一，约在1.11-1.19g/ml，且该密度下的外排体具有高质量、高安全性的特点，尤其是本发明外排体无致瘤作用以及明显的不良反应。

2.本发明方法能够大规模、快速地制备本发明外排体，其产率更高、损耗率更小，所获得的外排体密度均一，安全性好，能够充分供给临床需要。

3.本发明外排体可用于制备肿瘤疫苗，该疫苗对机体潜在危害作用小，没有伦理的难题，无个体限制性，是一种极有临床应用前景的新型生物制剂和疫苗，具有重要的应用价值和良好的市场前景，对有效控制肿瘤的发生发展、改善恶性肿瘤治疗现状具有重要意义，将有极大的社会效益和经济效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

外排体的制备

培养人结肠癌细胞sw480（表达癌胚抗原CEA），细胞培养至汇聚度60%，更换含10%exosome-free血清的培养基继续培养24小时后收集细胞培养上清。培养上清使用50rpm/min蠕动泵通过3+0.8μm滤器去除上清中的细胞、细胞碎片、细胞器、杂质。经过过滤的上清使用超滤仪进行500KD浓缩，进一步通过PBS洗滤，再经过26%-42%（w/v）非连续蔗糖密度梯度100,000g离心2h，离心中间层用PBS洗滤5次，0.22μm滤器滤菌。这样制备的外排体可作为肿瘤疫苗进行临床研究。

实施例2

本发明制备外排体的鉴定

外排体沉淀用4%多聚甲醛于4℃固定1小时，PBS洗两次，制成悬液滴片，1%锇酸固定，梯度酒精脱水，经超薄切片铅铀染色后于透射电镜下观察摄片。结果如图1所示，外排体为均一的30-90nM的小囊泡。

实施例3

本发明制备外排体特征性表达TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9及来源细胞特异表达的肿瘤抗原CEA。

采用western-blot（图2）及流式细胞术分析（图3）分析外排体蛋白组成，表达标志性蛋白溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein,LAMP)、HSP70、HSC70、转铁蛋白受体（Transferin receptor，TfR）、CD9以及sw480表达的肿瘤抗原CEA。

实施例4

本发明外排体的产率与传统产率比较

根据实施例1的方法，分别制备三批次的外排体，具体三次样品产率见表1。

表1

由表1可见，根据本发明方法，每1×10⁶细胞可得到1ug的外排体，而传统制备外排体的得率一般如下：1×10⁶细胞可得到大约0.6ug的外排体（通过0.22μM滤器后）

此外，分别对三批次的外排体进行内毒素含量测试，实验结果表明，所以批次的外排体内毒素含量均小于0.1ng/ml。

实施例5

本发明外排体的安全性检测，见图4、表2、图5

采用exosomes软琼脂克隆形成实验、体内致瘤性实验及急性毒理实验对本发明制备的外排体进行安全性检测。

方法：

5.1.体内致瘤性实验

将周龄、体重相同、健康的雄性裸鼠随机分成3组，每组10只。

实验组：每只裸鼠皮下接种10μg exosomes（动物实验治疗量）。

阳性对照组：每只裸鼠皮下接种1×10⁷的sw480细胞。

阴性对照组：每只裸鼠皮下接种1×10⁷的正常二倍体细胞（人淋巴细胞）。14天后，按照《中国生物制品规程》2000年版中“致肿瘤性检查”之“结果观察”判定结果。

5.2.软琼脂克隆形成实验：

实验材料及方法：

1）.DMEM,胎牛血清（FCS），琼脂粉，CMY-1细胞，正常人外周血淋巴细胞（采自健康志愿者）；

2）.将加热融化的1%琼脂1ml与含20%FCS的双倍DMEM培养基等体积混合，置42℃水浴环境中备用；

3）.将待检exosomes，sw480细胞、正常人淋巴细胞用含10%FCS的DMEM培养基（37oC预热）分别配成20μg/ml(exosomes)或2×10⁴/ml（细胞）的悬液2ml备用；

4）.将待测细胞样品与预热的琼脂等体积混合;

5）.用1ml移液器迅速吸取1ml软琼脂细胞混合物铺入无菌的24孔培养板，每组设3个复孔；

6）.将培养板置37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱中培养；

7）.一周后取出，用显微镜观察，记数8个细胞以上的集落。

实验结果：sw480细胞组形成克隆，人外周血淋巴细胞及exosomes组无克隆形。

5.3.热休克肿瘤细胞来源exosomes急性毒理实验

选用Balb/c小鼠，体重为20±2g,将动物分为五组：

①空白对照组（10只，雌、雄各五只）

②3mg exosome尾静脉注射组（10只，雌、雄各五只）

③3mg exosome腹腔注射组（10只，雌、雄各五只）

④PBS对照尾静脉注射组（10只，雌、雄各五只）

⑤PBS对照腹腔注射组（10只，雌、雄各五只）

选用3000μg/200μl/只（肿瘤模型治疗时exosome的量为10μg/100μlPBS/只，注射3次，所以选择了30μg治疗量的100倍，即3mg/只exosome作为急性毒理实验的实验剂量），给药后观察14天，包括：中毒体征及发生过程，死亡情况和时间分布，体重，病理检查；当天连续观察，以后隔天观察。给药后动物反应未见异常，在观察期间（14天）未见死亡，小鼠被毛浓密且有光泽，食量和粪便正常，精神状况良好，活动自如，未出现毒性反应，解剖后主要脏器未见明显异常变化。

各组实验动物解剖后主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）病理切片HE染色均未见异常（图示仅为3mg exosome尾静脉注射组的结果）。

结果表明，制备的外排体没有形成克隆的能力（图4），体内不存在致瘤性（表2），没有急性毒理反应（图5）。

表2

实施例6

本发明外排体与传统方法制备的外排体比较

6.1形态学比较

通过电镜进行形态学比较，本发明所制备的外排体较传统方法所制备的更为散在、大小更为均一（图6）。

6.2制备过程和得率比较，见表3：

表3

从表3可见，本发明外排体制备的总纯化时间缩小为传统方法的一半，而产生外排体的量为传统方法的1.5倍，且在过滤后损失率仅为传统方法的1/4-1/3。

实施例7外排体的体外药效学研究

将exosomes（EXO）与树突状细胞(DC)共培养，ELISA检测DC分泌细胞因子。

结果表明：

EXO可促进DC分泌IL-12、TNFα(图8)；

流式检测DC表面分子发现，EXO可以促进DC表型成熟(图9)；

采用3H胸腺嘧啶核苷酸掺入法进行混合淋巴细胞实验，表明EXO增强了DC的抗原提呈功能，采用热休克处理的肿瘤细胞作为肿瘤细胞来源，并用本发明方法制备的exosomes（HS-EXO）的作用更明显(图10)。

体内免疫HLA－A2转基因鼠，将免疫后小鼠脾细胞过继回输治疗sw480荷瘤裸鼠，观察裸鼠肿瘤生长情况及存活期，发现可显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠及的存活期（图11）。

实施例8利用其他细胞系制备的外排体

本实施例为另外三种肿瘤细胞利用本技术提取的外排体，三种肿瘤细胞分别为3LL(Lewis肺癌)、B16(黑色素瘤)、4T1(乳腺癌)。图12显示了利用其他肿瘤细胞制备的外排体的鉴定，电镜及western blot显示这些符合外排体的特征，并且能够促进DC成熟，分泌更多的细胞因子。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种外排体的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗结肠癌的药物组合物，其中所述外排体是由表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480产生的分泌到细胞外的囊泡，且所述囊泡具有以下特征的组合：

a)直径在30-90 nm之间；

b)密度在1.11-1.19 g/ml之间；和

c)表达以下特征分子：TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9和肿瘤抗原CEA，且所述外排体无肿瘤克隆形成能力，并且所述外排体通过以下方法产生：

培养表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480，从而制得含有外排体的培养上清液；

所述的外排体通过以下方法分离：

(i) 提供一非连续密度梯度的蔗糖体系，其中，所述蔗糖体系的浓度范围为26%-45%，且所述体系的密度梯度间隔为0.02g/cm³；

(ii) 将所述含有外排体的培养上清液加入所述蔗糖体系并进行离心，其中，离心的转速为100,000×g，离心时间为2小时，从而获得分布于不同密度蔗糖的之间中间层中的外排体粗体；

(iii) 抽取两种不同密度蔗糖的中间层中的所述外排体粗体，并进行洗滤，从而获得所述的外排体；所述肿瘤细胞为表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞；

并且所述的培养上清液的获得步骤为：

(a1) 采用培养液培养表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480；

(a2) 细胞培养至汇聚度60%时，更换含10%不含外排体的小牛血清作为培养基继续培养18-30小时后收集上清液粗体；

(a3) 将(a2)中的上清液粗体经3+0.8μm滤膜过滤，从而获得不含细胞残留物的上清液；

(a4) 将(a3)中的上清液采用500KD的中空膜进行浓缩，并将浓缩产物经PBS和500KD中空膜洗滤，从而获得含有外排体的PBS溶液，即所述的细胞培养上清液。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的外排体的密度在1.11-1.17 g/ml之间。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480经热休克处理。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在步骤(iii)中，还包括混合或不混合不同密度层中间所抽取的外排体粗体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的洗滤采用PBS通过500KD中空膜至少洗滤3次。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的洗滤采用PBS通过500KD中空膜至少洗滤5次。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(iii)还包括在洗滤后进行滤菌。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的滤菌为采用0.22μm的滤器滤菌。