JP2021513860A - ユニバーサル抗原提示細胞およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 ユニバーサル抗原提示細胞が、本明細書中に提供される。【解決手段】 ＵＡＰＣを用いて免疫細胞を拡大する方法、およびその拡大された免疫細胞を用いて癌などの疾患を処置するための方法も本明細書中に提供される。【選択図】 図１Ａ

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年２月２１日出願の米国特許仮出願第６２／６３３，５８７号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書中に援用される。

ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓにおいて測定）であり、２０１９年２月２１日に作成された「ＵＴＦＣＰ１３５５ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含められる配列表は、電子提出により本明細書とともに出願され、参照により本明細書中に援用される。

本発明は、概して医学および免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、抗原提示細胞およびその使用、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の拡大に関する。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞とは対照的に、活性化するために事前に抗原に曝露する必要がないことから、腫瘍に対する免疫監視において非常に有効である。事前の活性化は必要ないが、意図的でない細胞傷害性および自己免疫を未然に防ぐために、ＮＫ細胞のとてつもない殺傷力には、厳しいコントロールが必要である。臨床的に十分な量かつ最適に機能するＮＫ細胞を作製することが、もう１つの障害になっている。したがって、ＮＫ細胞媒介性の癌免疫療法を向上させるヘルパー細胞をデザインするために、「抵抗性」の標的細胞と「感受性」の標的細胞とを区別するＮＫ細胞の働きを司る分子機構に注目することが必要とされる。

したがって、本開示のある特定の実施形態は、細胞療法および免疫療法を目的とした臨床グレードのＮＫ細胞の製造、拡大、品質管理および機能の特徴付けに関する方法および組成物を提供する。

第１の実施形態では、（１）ＣＤ４８および／またはＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合型インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）、ならびに（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作されたユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）が提供される。いくつかの態様において、ＵＡＰＣは、ＣＤ４８を発現する。他の態様において、ＵＡＰＣは、ＣＳ１を発現する。特定の態様において、ＵＡＰＣは、ＣＤ４８およびＣＳ１を発現する。

いくつかの態様において、ＵＡＰＣは、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子を本質的に発現しない。ある特定の態様において、ＵＡＰＣは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現する。

ある特定の態様において、ＵＡＰＣはさらに、白血病細胞由来のａＡＰＣと定義される。いくつかの態様において、白血病細胞由来のＵＡＰＣはさらに、Ｋ５６２細胞と定義される。

いくつかの態様において、操作はさらに、レトロウイルス導入と定義される。いくつかの態様において、そのレトロウイルス導入はさらに、配列番号１および／または配列番号２のウイルス構築物の導入と定義される。ある特定の態様において、ＵＡＰＣは、照射される。

さらなる実施形態では、免疫細胞を拡大するための方法が提供され、その方法は、その免疫細胞を、有効量の上記実施形態のＵＡＰＣ（例えば、（１）ＣＤ４８および／またはＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合型インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）、ならびに（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作されたユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ））の存在下において培養する工程を含む。いくつかの態様において、免疫細胞とＵＡＰＣとは、３：１〜１：３、例えば、３：１、３：２、１：１、１：２または１：３の比で培養される。特定の態様において、免疫細胞とＵＡＰＣとは、１：２の比で培養される。

いくつかの態様において、拡大は、ＩＬ−２の存在下における拡大である。具体的な態様において、ＩＬ−２は、１０〜５００Ｕ／ｍＬ（例えば、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１０、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００または４００〜５００Ｕ／ｍＬ）の濃度で存在する。ある特定の態様において、ＩＬ−２は、１００〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する。特定の態様において、ＩＬ−２は、２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの態様において、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２である。具体的な態様において、ＩＬ−２は、２〜３日ごと（例えば、２日ごとまたは３日ごと）に補充される。

ある特定の態様において、ＵＡＰＣは、少なくとも２度加えられる。いくつかの態様において、免疫細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。特定の態様において、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。

特定の態様において、免疫細胞は、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、幹細胞または骨髄に由来する。具体的な態様において、幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、ＣＢから得られる。特定の態様において、ＣＢは、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされる。具体的な態様において、ＣＢは、３、４、５、６、７または８単位の個々の臍帯血単位からプールされる。

いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、ＣＢ単核細胞（ＣＢＭＣ）である。ある特定の態様において、ＮＫ細胞はさらに、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞と定義される。

ある特定の態様において、上記方法は、無血清培地中で行われる。

さらなる態様において、免疫細胞は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように操作されている。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＤ５、ＣＤ４７、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＣＤ９９、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＣＳ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＲＯＲ−１またはＢＣＭＡの抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ヒト化ＣＡＲである。いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＩＬ−１５を含む。ある特定の態様において、ＣＡＲは、自殺遺伝子を含む。いくつかの態様において、自殺遺伝子は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９である。

上記実施形態（例えば、上記免疫細胞を、有効量の上記実施形態のＵＡＰＣ（例えば、（１）ＣＤ４８および／またはＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合型インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）、ならびに（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作されたユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ））の存在下において培養すること）に従って作製され、拡大された免疫細胞の集団が、さらに本明細書中に提供される。

別の実施形態では、上記実施形態の拡大された免疫細胞の集団および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物が提供される。被験体における疾患または障害の処置において使用するための、有効量の上記実施形態の拡大された免疫細胞を含む組成物が、さらに本明細書中に提供される。

さらなる実施形態は、被験体における疾患または障害を処置する方法を提供し、その方法は、治療有効量の、上記実施形態の拡大された免疫細胞をその被験体に投与する工程を含む。

いくつかの態様において、上記疾患または障害は、癌、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、自己免疫障害、免疫不全症、Ｂ細胞悪性疾患または感染症である。特定の態様において、癌は、白血病である。いくつかの態様において、白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。特定の態様において、上記障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。いくつかの態様において、上記障害は、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息またはシェーグレン症候群である。いくつかの態様において、被験体は、ヒトである。

ある特定の態様において、免疫細胞は、同種異系である。いくつかの態様において、免疫細胞は、自家性である。いくつかの態様において、免疫細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。

さらなる態様において、上記方法は、少なくとも１つの第２の治療薬を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、その少なくとも１つの第２の治療薬は、治療有効量の抗癌剤、免疫調節剤または免疫抑制剤である。ある特定の態様において、その抗癌剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法または免疫療法である。

いくつかの態様において、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である。

さらなる態様において、免疫細胞および／または少なくとも１つの第２の治療薬は、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって投与される。いくつかの態様において、第２の治療薬は、抗体である。ある特定の態様において、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、リツキシマブである。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、当業者には、本発明の趣旨および範囲を超えない様々な変更および修正がこの詳細な説明から明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に例証として与えられることに注意するべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を成し、本開示のある特定の態様をさらに示すために含められる。本開示は、本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、さらに良く理解され得る。

ヒトナチュラルキラー細胞のレセプターと標的細胞のリガンドとの相互作用のジッパーモデル。ヒトＮＫ細胞は、キラー免疫グロブリンレセプター（ＫＩＲ）、天然細胞傷害性レセプター（ＮＣＲ）、ＮＫＧ２ファミリーのレセプター、ネクチン結合レセプター、ＳＬＡＭファミリーレセプターなどをはじめとした多くのレセプターを介して標的細胞と相互作用する。ＮＫ細胞上のレセプターは、賦活性であるか（ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＣＲＴＡＭ、ＤＮＡＭ、２Ｂ４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１００、ＣＤ１６０）または阻害性である（ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３／５Ａ／５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１／２／３、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＩＬＴ２／ＬＩＬＲＢ１、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、Ｓｉｇｌｅｃ−３／７／９）。 ヒトナチュラルキラー細胞のレセプターと標的細胞のリガンドとの相互作用のジッパーモデル。ヒトＮＫ細胞は、キラー免疫グロブリンレセプター（ＫＩＲ）、天然細胞傷害性レセプター（ＮＣＲ）、ＮＫＧ２ファミリーのレセプター、ネクチン結合レセプター、ＳＬＡＭファミリーレセプターなどをはじめとした多くのレセプターを介して標的細胞と相互作用する。ＮＫ細胞上のレセプターは、賦活性であるか（ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＣＲＴＡＭ、ＤＮＡＭ、２Ｂ４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１００、ＣＤ１６０）または阻害性である（ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３／５Ａ／５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１／２／３、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＩＬＴ２／ＬＩＬＲＢ１、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、Ｓｉｇｌｅｃ−３／７／９）。 ヒトナチュラルキラー細胞のレセプターと標的細胞のリガンドとの相互作用のジッパーモデル。ヒトＮＫ細胞は、キラー免疫グロブリンレセプター（ＫＩＲ）、天然細胞傷害性レセプター（ＮＣＲ）、ＮＫＧ２ファミリーのレセプター、ネクチン結合レセプター、ＳＬＡＭファミリーレセプターなどをはじめとした多くのレセプターを介して標的細胞と相互作用する。ＮＫ細胞上のレセプターは、賦活性であるか（ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＣＲＴＡＭ、ＤＮＡＭ、２Ｂ４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１００、ＣＤ１６０）または阻害性である（ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３／５Ａ／５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１／２／３、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＩＬＴ２／ＬＩＬＲＢ１、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、Ｓｉｇｌｅｃ−３／７／９）。

ＩＬ−２またはＡＰＣを用いたときの、新鮮ＮＫ細胞または凍結ＮＫ細胞の拡大倍率。 ＩＬ−２またはＡＰＣを用いたときの、新鮮ＮＫ細胞または凍結ＮＫ細胞の拡大倍率。 ＮＫ細胞におけるＣＤ３およびＣＤ５６の発現についての、０日目、７日目または１４日目のフローサイトメトリー。 ＡＰＣで刺激されたＮＴ−ＮＫ細胞またはＳＧ４−ＮＫ細胞の細胞数。 クローン９ＡＰＣまたはＵＡＰＣで刺激されたＮＫ細胞の増殖動態。

記載のマーカーに対する、親Ｋ５６２細胞のフローサイトメトリー。ｍｂ−ＩＬ２１、４１ＢＢＬ、ＣＤ４８およびＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１）の発現は観察されなかった。 クローン４６導入後のＡＰＣのフローサイトメトリー解析（ｍｂＩＬ−２１、４１ＢＢＬ）。 ＣＤ４８を発現させるためのｕＡＰＣ構築物導入後のＡＰＣのフローサイトメトリー解析（ｎｍＩＬ−２１、４１ＢＢＬおよびＣＤ４８）。 ＣＳ１を発現させるためのｕＡＰＣ２構築物導入後のＡＰＣのフローサイトメトリー解析（ｍｂＩＬ−２１、４１ＢＢＬおよびＣＳ１）。

ＭＭＬＶ−レトロウイルス導入構築物のマップおよびアノテーション。ｍｂ−ＩＬ２１に対するレトロウイルストランスファーベクター。 ＭＭＬＶ−レトロウイルス導入構築物のマップおよびアノテーション。４１ＢＢＬに対するレトロウイルストランスファーベクター。 ＭＭＬＶ−レトロウイルス導入構築物のマップおよびアノテーション。ＣＤ４８−Ｋａｔｕｓｈｋａに対するレトロウイルストランスファーベクター。 ＭＭＬＶ−レトロウイルス導入構築物のマップおよびアノテーション。ＣＳ１−ＥＧＦＰに対するレトロウイルストランスファーベクター。

本研究において、ＮＫ細胞は当初、自然免疫コンパートメントの他の構成要素とは異なる抗腫瘍機能および抗同種異系細胞溶解機能について特徴付けられた。ＮＫ細胞の挙動を支配する無数の免疫受容体を、図１に「シッパー」グラフとして例証する。その一連のシグナル伝達物質は、２大グループ、すなわち、賦活性と阻害性に大まかに分類され得る。構造およびシグナル伝達の様式によって、それらのカテゴリーがさらに免疫受容体の関連ファミリーに分けられる。ＮＫ細胞の膜プロテオームは、まだ完全に解明されていないが、ＮＫ細胞「ジッパー」の中の機能的冗長性が、相補的経路と拮抗性経路との複雑かつ動的な平衡を保ちつつ、細胞溶解機能を調節するために活用された。

したがって、本開示のある特定の実施形態は、細胞療法および免疫療法を目的とした臨床グレードのＮＫ細胞の製造、拡大、品質管理および機能の特徴付けに関する方法および組成物を提供する。時間の制約を満たしつつ、患者に注入するために臨床的に妥当な数のＮＫ細胞を増殖し、形成することは、最善の状況であっても困難である。ある特定の態様において、本開示の方法および組成物は、ＮＫ細胞製造の技術的プロセス、達成可能なＮＫ細胞拡大の詳細および動態、ならびに細胞形成の成功を検証するための分子の特徴付けを詳述する。

さらなる実施形態では、腫瘍に対してヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を条件付ける、形成する、および兵器化するためのユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）として具体化されるロバストなプラットフォーム技術が、本明細書中に提供される。「ＵＡＰＣ」は、本明細書中では、ＮＫ細胞などの免疫細胞の最適化された拡大のためにデザインされた抗原提示細胞のことを指す。本ＵＡＰＣを、阻害シグナルを克服するため、およびＮＫ細胞の最適かつ特異的な殺滅機能を誘導するために、ユニークな組み合わせの共刺激分子によって作製した。大規模な試験から、ＵＡＰＣが、ＮＫ細胞の機構および改善された腫瘍消失を微調整することが示された。本ＵＡＰＣは、ＮＫ細胞媒介性の癌免疫療法に使用され得る。

例示的なＡＰＣは、ＮＫ細胞感受性Ｋ５６２抗原提示細胞株（ＡＰＣ）（クローン４６と称される）における膜結合型インターロイキン２１（ｍｂＩＬ−２１）および４−１ＢＢリガンドの強制発現によって作製される。別の実施形態では、Ｋ５６２細胞においてｍｂＩＬ−２１、４−１ＢＢリガンドおよびＣＤ４８を強制発現することによって、ＵＡＰＣを作製した（ユニバーサルＡＰＣ（ＵＡＰＣ）と呼ばれる）。別の実施形態では、Ｋ５６２細胞においてｍｂＩＬ−２１、４−１ＢＢリガンドおよびＣＳ１を強制発現することによって、ＵＡＰＣを作製した（ＵＡＰＣ２と呼ばれる）。それらのＵＡＰＣは、ｍｂＩＬ−２１、４１ＢＢＬおよびＮＫ細胞特異的抗原（例えば、ＳＬＡＭファミリー抗原（表１））を発現するように作製され得る。

ＵＡＰＣプラットフォームは、Ｔ細胞（例えば、アルファ−ベータおよびガンマ−デルタＴ細胞）をはじめとした他の免疫エフェクターを拡大するためにも適用され得る。それらの免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞）は、末梢血、臍帯血、骨髄または幹細胞（誘導多能性幹細胞を含む）に由来し得る。これらの免疫細胞は、癌免疫療法などの臨床的に妥当な用途に向けて意味ある数に達するための培養に必要な、本ＵＡＰＣを用いたエキソビボでの拡大および活性化に供され得る。

したがって、本開示は、癌免疫療法のためのヒト免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）を条件付けるため、調節するため、プライミングするため、および拡大するためにデザインされ、製造された一連のヘルパー細胞株を提供する。
Ｉ．定義

本明細書中で使用されるとき、特定の構成要素に関して「本質的に含まない」は、その特定の構成要素が、ある組成物中に意図的に処方されていないことおよび／または夾雑物としてしかもしくは微量でしか存在しないことを意味するために本明細書中で使用される。ゆえに、ある組成物の任意の意図されない混入に起因するその特定の構成要素の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは、０．０１％を下回る。その特定の構成要素の量が標準的な分析方法で検出できない組成物が最も好ましい。

本明細書中で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。請求項において使用されるとき、単語「ａ」または「ａｎ」は、単語「含む」とともに使用されるとき、１つまたは１つより多いことを意味し得る。

請求項における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されない限り、または選択肢が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみのことを指す定義と「および／または」とを支持する。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも１つの第２のものまたはそれ以上のものを意味し得る。用語「約」、「実質的に」および「およそ」は、一般に、述べられる値プラスまたはマイナス５％を意味する。

「免疫障害」、「免疫関連障害」または「免疫介在性障害」とは、免疫応答が疾患の発生または進行において重要な役割を果たす障害のことを指す。免疫介在性障害としては、自己免疫障害、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、ならびに炎症性およびアレルギー性の状態が挙げられる。

「免疫応答」は、刺激に対する免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞または自然免疫細胞）の応答である。１つの実施形態において、その応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。

「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を引き起こして組織に対して損傷を生じる疾患のことを指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、または通常、粘膜表面にコロニー形成する微生物（共生生物として知られる）などの共生生物に由来し得る。

疾患もしくは状態を「処置する」またはそれらの処置とは、その疾患の徴候または症状を軽減する目的で１つ以上の薬物を患者に投与することを含み得るプロトコルの実行のことを指す。望ましい処置の効果としては、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態を軽減することまたは緩和すること、および緩解または予後の改善が挙げられる。軽減は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前、ならびにそれらが現れた後に生じ得る。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患もしくは望ましくない状態を「予防する」またはそれらの「予防」を含み得る。さらに、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者に対して限界効果だけをもたらすプロトコルを含む。

用語「治療効果」または「治療的に有効な」は、本願全体で使用されるとき、この状態の医学的処置に関して被験体の健康を増進するまたは向上させるもののことを指す。これには、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の処置は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の低下、または転移の予防を含み得る。癌の処置とは、癌を有する被験体の生存時間の延長のことも指し得る。

「被験体」および「患者」とは、ヒトまたは非ヒト（例えば、霊長類、哺乳動物および脊椎動物）のことを指す。特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。

句「薬学的または薬理学的に許容され得る」とは、必要に応じてヒトなどの動物に投与されたとき、副作用、アレルギー反応または他の有害反応を引き起こさない分子実体および組成物のことを指す。抗体またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らして、当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓが要求するような無菌性、発熱性、全般的な安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解される。

本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」には、当業者に公知であり得るように、任意のおよびあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど）、非水溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、補液および栄養補給剤、それらのそのような材料および組み合わせが含まれる。薬学的組成物中の様々な構成要素のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。

用語「ハプロタイピングまたは組織タイピング」とは、例えば、特定の被験体のリンパ球上にどのＨＬＡ遺伝子座（または複数の遺伝子座）が発現されているかを明らかにすることによる、被験体のハプロタイプまたは組織タイプを特定するために用いられる方法のことを指す。ＨＬＡ遺伝子は、６番染色体の短腕上の領域である主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に配置されており、細胞間相互作用、免疫応答、臓器移植、癌の発生、および疾患に対する感受性に関わる。移植において重要な遺伝子座は６つあり、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱと命名されている。各遺伝子座に、いくつかの異なる対立遺伝子のいずれかが存在し得る。

ハプロタイピングのために広く用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＭＨＣ抗原をコードする遺伝子の公知のセグメントと被験体のＤＮＡを比較する。それらの遺伝子のこれらの領域の多様性が、被験体の組織タイプまたはハプロタイプを決定する。血清学的方法も、細胞表面上の血清学的に定義された抗原を検出するために用いられる。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ決定基は、公知の血清学的手法によって計測され得る。簡潔には、被験体由来の（新鮮末梢血から単離された）リンパ球を、公知のすべてのＨＬＡ抗原を認識する抗血清とともにインキュベートする。それらの細胞を、様々な種類の抗血清が入った微細ウェルを備えるトレーに広げる。それらの細胞を３０分間インキュベートした後、さらに６０分間、インキュベーションを補完する。リンパ球が、抗血清中の抗体によって認識される抗原を表面上に有する場合、そのリンパ球は溶解される。色素を加えることにより、細胞膜の透過性の変化および細胞死を示すことができる。溶解によって破壊された細胞のパターンは、組織学的不適合性の程度を示す。例えば、ＨＬＡ−Ａ３について試験されているある人物由来のリンパ球が、ＨＬＡ−Ａ３に対する抗血清を含むウェルにおいて破壊された場合、その検査は、この抗原群について陽性である。

用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、免疫系の特定のエフェクター細胞によって認識可能なペプチド−ＭＨＣ複合体の形態で１つ以上の抗原を提示することができ、それによって、提示される抗原に対する有効な細胞免疫応答を誘導することができる、細胞のクラスのことを指す。用語「ＡＰＣ」は、インタクトなホールセル（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞および樹状細胞）、または抗原を提示することができる天然に存在するかもしくは合成の分子（例えば、ｙ２−ミクログロブリンと複合体化した精製ＭＨＣクラスＩ分子）を包含する。
ＩＩ．ユニバーサル抗原提示細胞

本開示のいくつかの実施形態は、ユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）の作製および使用に関する。ＵＡＰＣは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞）の拡大のために使用され得る。ＵＡＰＣは、膜結合型ＩＬ−２１（ｍｂＩＬ−２１）および４１ＢＢＬ（ＣＤ１３７リガンド）を発現するように操作され得る。

ＵＡＰＣは、ＣＤ１３７リガンドおよび／または膜結合型サイトカインを発現するように操作され得る。膜結合型サイトカインは、ｍＩＬ−２１またはｍＩＬ−１５であり得る。特定の実施形態において、ＵＡＰＣは、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現するように操作される。ＡＰＣは、白血病細胞などの癌細胞に由来し得る。ＡＰＣは、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子のいずれも発現しないことがある。ＡＰＣは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現し得る。特に、ＡＰＣは、Ｋ５６２細胞（例えば、ＣＤ１３７リガンドおよびｍＩＬ−２１を発現するように操作されたＫ５６２細胞）であり得る。ＡＰＣは、照射され得る。上記操作は、当該分野で公知の任意の方法、例えば、レトロウイルス導入による操作であり得る。

サイトカインは、免疫細胞の全クラス（ＮＫ細胞を含む）に対して非常に強力な調節を発揮し、細胞の運命、活性および細胞応答の有効性に影響する。ＮＫ細胞を活性化させるサイトカイン刺激の力は、それらの「天然の」エフェクター機能が環境的介入に高度に感受性であること、およびプライミングが、インビボにおいてＮＫ細胞の挙動を制御し得ることを裏付ける。

臨床的に妥当な量のＮＫ細胞を取得するという問題に対処するために、本方法は、本ＵＡＰＣプラットフォーム技術におけるＮＫ細胞の拡大のための駆動物質としてインターロイキン（ＩＬ−２１）を使用し得る。ヒトでは、ＩＬ−１０およびＩＬ−２１によるＮＫ細胞刺激は、ＳＴＡＴ３依存的様式でＮＫＧ２Ｄ発現を誘導する。サイトカインレセプターが、多くの免疫細胞において類似の細胞シグナル伝達構成要素を共有するが、ＮＫ細胞特異的なシグナル伝達は、増殖に対して、ＩＬ−２１レセプター−ＳＴＡＴ３の関係に依存する。

サイトカインのシグナル伝達は、リンパ球の生存および増殖の維持にとって重要である。インビボでは、ＩＬ−２投与が、ＮＫ細胞を拡大するためにＦＤＡに認められた唯一の方法である。別の強力なＮＫ細胞活性化物質であるＩＬ−１５は、見込みのあるＩＬ−２代替物として第Ｉ相臨床試験を行っている最中であるが、全身投与後に有意な毒性を有し得る。有意な毒性のほかに、これらのサイトカインは、ＮＫ細胞の残存性を制限しつつ、Ｔ細胞の増殖も誘導する。シグナル伝達に対して同じレセプターを共有するにもかかわらず、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１レセプターは、多様な細胞に対して異なるかつ特異的な影響を及ぼす。
Ａ．膜結合型ＩＬ−２１

ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞を特異的に作動させる場合、本ＵＡＰＣを作製するためにＩＬ−２１を使用してもよい。ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ２１Ｒ）は、共通サイトカインレセプターガンマ鎖（ガンマ（ｃ）との二量体化によってシグナルを伝達することができるＩＬ−２レセプターベータ鎖との密接な関係にあり、活性化ヒトＮＫ細胞（誘発される準備の整った細胞）においてアップレギュレートされる。Ｉ型サイトカインであるＩＬ−２１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の機能を調節し得るが、本研究は、ヒトＮＫ細胞だけが、ＩＬ２１レセプターシグナル伝達経路の活性化を介して有意な拡大を起こすことを見出した（すなわち、２１日間にわたって１０００倍）。逆に、ＩＬ２１は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の縮小において重要な役割を果たす。

ＩＬ２１Ｒシグナル伝達は、主に、高度に強力な細胞増殖活性化物質であるＳＴＡＴ３によって促進される。ＩＬ２１Ｒ−ＳＴＡＴ３の関係は、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロッティングによって検証される、ＧＡＳおよびシス誘導性エレメントへのＩＬ−２１誘導性ＳＴＡＴ３ ＤＮＡ結合によって駆動される。ＩＬ２１によって媒介される増殖の分子基盤は、ＩＬ−２１によって誘導されるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３３のリン酸化を媒介する、ＩＬ２１Ｒ上のチロシン５１０（Ｙ５１０）であると特異的に突き止められ得る。この機構は、Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ３ダブルノックアウトマウスではＩＬ−２１応答が弱まることによってはっきりと示される。

ＩＬ２１Ｒシグナル伝達は、ＮＫ細胞傷害性にとって重要である。ヒトＩＬ２１Ｒ欠損は、５１Ｃｒで標識されたＫ５６２標的細胞の細胞溶解の障害に関連するが、抗体依存性細胞傷害は、影響されない。一遺伝子性の非胚性致死欠損（ＩＬ２１Ｒの機能喪失変異）は、生得的なＮＫ細胞溶解反応を明確化する優れた機会を提供するので、その生得的なＮＫ細胞溶解反応のモデリング、増強および形成に有用である。

ＣＤ５６^ｄｉｍ細胞集団とＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞集団の両方が、似た数の表面ＩＬ２１Ｒを有したとしても、ＩＬ−２１シグナル伝達は、ＮＫ細胞のサブセットを選択的に形成する。ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３リン酸化のＩＬ−２１誘導は、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞に対してＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞においてより高い。対照的に、ＩＬ−２１は、Ｔ細胞拡大も駆動するＩＬ−２活性化経路であるＳＴＡＴ５活性化には影響しない。ＩＬ−２１シグナル伝達には、ＳＴＡＴ３活性化に加えて、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路が関与し、ＮＫ細胞において自然免疫応答性遺伝子（ＩＦＮ−ガンマ、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ−１２Ｒベータ２およびＩＬ−１８Ｒを含む）の発現を誘導して、腫瘍細胞を殺滅するようにＮＫ細胞をプライミングする。

ＩＬ−２１を効率的に利用するために、ｍｂＩＬ−２１の発現（図４Ａ）を用いて、ＮＫ細胞上のＩＬ２１Ｒとのトランス相互作用を集中させ、局在化させてもよい。ｍｂＩＬ２１は、膜に近接していることから、それが必要とされる場合にすぐに利用できるので、大量かつ高濃度のＩＬ−２１を外から供給しなくても、最適な細胞増殖を維持できる。照射されたＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬとの共培養により、末梢血からＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の、中央値２１．６倍の拡大が誘導された。この拡大は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１を単独でまたは組み合わせて含む共有γｃファミリー由来の単なる可溶性のサイトカインによる刺激と比べてより大きい。比較すると、本ＵＡＰＣは、ＮＫ細胞を１４〜２１日間にわたって少なくとも１０００倍（３−ｌｏｇ）拡大し得る。ＵＡＰＣ上のｍｂＩＬ２１の発現は、外来性の臨床グレードのサイトカインも不必要にし得る。
Ｂ．４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド、ＣＤ１３７リガンド、ＣＤ１３７Ｌ、ＴＮＦＳＦ９）

ＮＫ細胞の機能をサイトカインでプライミングするという考えに加えて、ＮＫ細胞における活性化分子との直接的な物理的相互作用も、細胞増殖応答を高める。ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）は、腫瘍壊死レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）遺伝子ファミリーのメンバーであり、細胞増殖、分化およびプログラム細胞死（アポトーシス）を媒介する。マウスレセプターが最初に特徴付けられた後、ヒトホモログが特徴付けられ、それは、アミノ酸レベルで６０％の同一性を共有し、細胞質／シグナル伝達ドメインが有意に保存されている。ＣＤ１３７は、主に、活性化Ｔ細胞および活性化ＮＫ細胞において発現され、胸腺細胞、骨髄性細胞および炎症部位の内皮細胞においても検出可能な様々なレベルで発現される。生理学的なＣＤ１３７シグナル伝達は、１）Ｂｃｌ−ＸＬ活性化によって生存を促進するＮＦ−κＢ、および２）細胞周期の進行を特異的に駆動するＰＩ３Ｋ／ＥＲＫ１／２経路によって媒介される。

活性化ＮＫ細胞では、ＣＤ１３７は、サイトカイン誘導性の共刺激分子であり、この共刺激分子は、細胞増殖およびＩＦＮ−γ分泌を増加させることによって、ＮＫ細胞において抗腫瘍応答を駆動する。ＣＤ１３７Ｌ−／−ノックアウトマウスを用いた研究によって、抗腫瘍免疫細胞の発達におけるＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌシグナル伝達の重要性が解明された。ＣＤ１３７−／−ノックアウトマウスは、コントロールマウスと比べて、腫瘍転移頻度が４倍高かった。

ＴＮＦスーパーファミリーの３４ｋＤａ糖タンパク質メンバーであるＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ、４−１ＢＢリガンド）は、主に、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞を含む活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で検出され、活性化Ｔ細胞上でも低レベルで一過性に発現される。ヒトＣＤ１３７Ｌは、マウス対応物に対してたった３６％相同でしかない。作動性ＣＤ１３７抗体の抗腫瘍有効性と一致して、ＣＤ１３７Ｌの結合は、ＣＴＬおよび抗腫瘍活性を誘発すると示されている。

したがって、本ＵＡＰＣは、ＣＤ１３７に対する生理学的なカウンターレセプターである４−１ＢＢリガンドを刺激のために発現するように操作され得る。
Ｃ．ＳＬＡＭ／ＣＤ４８

サイトカインによる条件づけおよび４−１ＢＢＬによる共刺激のほかに、ＮＫ細胞と標的細胞との直接的な物理的相互作用も、細胞応答、すなわち標的細胞の殺滅に影響する。免疫系において広く発現され、決定的役割を果たす、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ、以前はＣＤ２スーパーファミリーとしても知られた）ファミリーの相同性の免疫グロブリンレセプターは、細胞間の相互作用に関して特に重要である。

したがって、本開示のＵＡＰＣは、１つ以上のＳＬＡＭファミリー抗原を発現し得る。ＳＬＡＭファミリーのメンバーとしては、ＣＤ２、ＣＤ４８、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、ＣＤ３１９（ＣＳ１（ＣＤ２サブセット１）；ＣＲＡＣＣ（ＣＤ２様レセプター活性化細胞傷害性細胞））およびＣＤ３５２（ＮＴＢ−Ａ（ＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原））が挙げられる。特定の態様において、ＵＡＰＣは、ＣＤ４８および／またはＣＳ１を発現する。ＮＫ細胞は、ＳＬＡＭファミリー（ＳＬＡＭＦ）の少なくとも３つのメンバーを発現する。それらは、２Ｂ４、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞抗原（ＮＴＢ−Ａ）、ならびにＣＤ２様レセプター活性化細胞傷害性細胞（ＣＲＡＣＣ）（これらは、標的細胞上およびおそらく他のＮＫ細胞上の、それぞれのリガンドであるＣＤ４８、ＮＴＢ−ＡおよびＣＲＡＣＣを認識する）である。ＳＬＡＭＦ１、３、５、６、７、８および９は、同種親和性（自己リガンド）レセプターであるが、ＳＬＡＭＦ２およびＳＬＡＭＦ４は、互いに対してカウンターレセプター（ヘテロ親和性）である。公知の同種親和性のアフィニティ（＜１μＭ〜２００μＭの解離定数Ｋｄ）が広範囲であること（３桁）は、ＳＬＡＭ糖タンパク質に対するシグナル伝達の機構が重複しているが異なることについての機構の基礎を示唆している。

表１：ＳＬＡＭファミリーメンバーの結合親和性。

特定の実施形態において、本ＵＡＰＣは、細胞間相互作用を支えてＮＫ細胞応答を高めるためにＣＤ４８を発現するように操作される。ＣＤ４８は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球および好塩基球の表面上に見られるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質（ＧＰＩ−ＡＰ）であり、これらの細胞における接着経路および活性化経路に関与する。細胞内ドメインを欠いているにもかかわらず、ＣＤ４８の刺激は、脂質ラフトにおけるシグナル伝達因子の再配列、Ｌｃｋ−キナーゼ活性およびチロシンリン酸化を誘導する。接着共刺激分子として、ＣＤ４８は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ＮＫ細胞、マスト細胞ならびに好酸球において数多くの作用を誘導する。ヒトＮＫ細胞では、ＣＤ４８は、ＮＫ細胞の重要なアクチベーターである２Ｂ４２６に対するカウンターレセプターである。ヘテロ親和性の相互作用は、ＭＨＣ−ＩとＣＤ２４４の相互作用について競合すると考えられている。ゆえに、２Ｂ４／ＣＤ４８相互作用は、ヒトＮＫ細胞において活性化シグナルを誘導するのに対して、マウスＮＫ細胞では、阻害性シグナルを送る。

同じ集団の細胞間の２Ｂ４−ＣＤ４８相互作用、すなわち、ＮＫ細胞間の相互作用またはＴ細胞間の相互作用は、ＡＰＣ（例えば、正常にはＣＤ４８を欠くＫ５６２骨髄性細胞系列）上にＣＤ４８を発現することによって、活性化を強化するが、本ＵＡＰＣは、ＮＫ細胞に対して強力な２Ｂ４シグナル伝達経路をトランスでオンにし得る。
Ｄ．ＳＬＡＭ／ＣＳ１

いくつかの実施形態において、本ＵＡＰＣは、ＮＫ細胞の殺傷力のスイッチをオンにする共刺激分子として、ＳＬＡＭファミリーの別のメンバーであるＣＳ１を発現するように操作される。２Ｂ４と相互結合するＣＤ４８とは異なり、ＣＳ１相互作用は、同種親和性であり、シス相互作用とトランス相互作用とを対比する状況において特徴付けられ得る。正常にはＣＳ１を含まないＫ５６２細胞が、ＣＳ１を発現するように操作される。
Ｅ．核酸の送達

ｍｂＩＬ−２１、４１ＢＢＬおよび共刺激抗原は、当該分野で公知の方法のいずれかによって操作され得る。核酸は、通常、ウイルス発現ベクターなどの発現ベクターの形態で投与される。いくつかの態様において、発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ＤＮＡプラスミド発現ベクターまたはＡＡＶ発現ベクターである。いくつかの態様において、上記送達は、１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物および／またはそれらから転写された１つ以上のタンパク質の送達によるものであり、上記細胞に送達される。

ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入するための方法は公知であり、それらとしては、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムにインテグレートされる安定な形質転換方法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムにインテグレートされない一過性の形質転換方法、およびウイルス媒介性の方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、いくつかの態様において、一過性の形質転換方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは粒子銃が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より詳細には、プラスミドまたはウイルスに含められ得る。

核酸の非ウイルス性送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質強化型取り込み（ａｇｅｎｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｕｐｔａｋｅ）が挙げられる。リポフェクションは、（例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^ＴＭおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｉｇｎｅｒの脂質、ＷＯ９１１１７４２４；ＷＯ９１１１６０２４が挙げられる。送達は、細胞への送達（例えば、インビトロ投与またはエキソビボ投与）または標的組織への送達（例えば、インビボ投与）であり得る。

いくつかの実施形態において、送達は、核酸を送達するためのＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用による送達である。ウイルスベクターは、いくつかの態様において、患者に直接投与され得る（インビボ）か、またはウイルスベクターを用いてインビトロもしくはエキソビボで細胞を処置し、次いで、患者に投与され得る。いくつかの実施形態におけるウイルスに基づく系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
ＩＩＩ．免疫細胞

本開示のいくつかの実施形態は、癌免疫療法用などの免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）の単離および拡大に関する。

ある特定の実施形態において、免疫細胞は、当該分野で周知の方法によって、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、未刺激の白血球搬出産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄または臍帯血から得られる。詳細には、免疫細胞は、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、骨髄または幹細胞から単離され得る。特定の実施形態において、免疫細胞は、プールされたＣＢから単離される。ＣＢは、２、３、４、５、６、７、８、１０またはそれ以上の単位からプールされ得る。免疫細胞は、自家性または同種異系であり得る。単離された免疫細胞は、細胞療法を施される被験体とハプロタイプが一致し得る。ＮＫ細胞は、特異的な表面マーカー（例えば、ヒトではＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ８）によって検出され得る。

ある特定の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞をエキソビボで拡大するという以前に報告された方法（Ｓｐａｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）によって単離される。この方法では、ＣＢ単核細胞が、フィコール密度勾配遠心分離によって単離される。その細胞培養物は、ＣＤ３を発現する任意の細胞が枯渇していることがあり、ＣＤ５６^＋／ＣＤ３⁻細胞またはＮＫ細胞のパーセンテージを測定するために特徴付けられ得る。他の方法では、臍ＣＢを用いることにより、ＣＤ３４^＋細胞の単離によってＮＫ細胞が得られる。この方法は、ＣＤ３、ＣＤ１４および／またはＣＤ１９陽性細胞の枯渇を含み得る。

単離された免疫細胞は、本ＵＡＰＣの存在下において拡大され得る。その拡大は、約２〜３０日間（例えば、３〜２０日間、特に１２〜１６日間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９日間、詳細には約１４日間）であり得る。免疫細胞とＵＡＰＣとは、約３：１〜１：３（例えば、２：１、１：１、１：２、詳細には約１：２）の比で存在し得る。拡大培養物は、拡大を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）をさらに含み得る。ＩＬ−２は、約１０〜５００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００〜３００Ｕ／ｍＬ、特に約２００Ｕ／ｍＬ）の濃度で存在し得る。ＩＬ−２は、拡大培養物に、例えば、２〜３日ごとに補充され得る。ＵＡＰＣは、少なくとも２度（例えば、拡大の約７日後に）、培養物に加えられ得る。

免疫細胞は、拡大後、直ちに注入されてもよいし、凍結保存などによって保存されてもよい。ある特定の態様において、それらの細胞は、約１、２、３、４、５日以内に、数日間、数週間または数ヶ月間、エキソビボでバルク集団として増殖され得る。

拡大されたＮＫ細胞は、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方を活性化するＩ型サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、ならびに他のサイトカインおよびケモカインを分泌し得る。これらのサイトカインの計測を用いることにより、ＮＫ細胞の活性化状態を測定することができる。さらに、ＮＫ細胞の活性化を測定するための当該分野で公知の他の方法を、本開示のＮＫ細胞の特徴付けのために用いてもよい。
ＩＶ．キメラ抗原レセプター

ある特定の実施形態において、本免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。

ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と無関係な細胞表面腫瘍関連抗原を認識し、１つ以上のシグナル伝達分子を用いて、殺滅、増殖およびサイトカイン産生に向けて、遺伝的に改変されたＮＫ細胞を活性化する。ある特定の実施形態において、本ＮＫ細胞は、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた、非ウイルス性の遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）抗原認識ドメインを細胞表面とつなぐ種々の長さの細胞外ドメインを有するＣＡＲ、および場合によっては、（ｉｖ）ＣＡＲ^＋ＮＫ細胞を確実かつ数値的に拡大することができるＫ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を含む方法によって遺伝的に改変され得る。

本開示の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、免疫原性を低下させるようにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む抗原特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、そのＣＡＲは、１つ以上の抗原の間で共有される空間を含むエピトープを認識し得る。ある特定の実施形態において、その結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域および／またはその抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、レセプターに結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。

ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を向上させるために用いられるヒト遺伝子であり得ることが企図される。具体的な実施形態において、本方法は、完全長ＣＡＲｃＤＮＡまたはコード領域を使用する。抗原結合領域または抗原結合ドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているもの）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖のフラグメントを含み得る。そのフラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、そのフラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトコドン使用頻度について最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。

配置は、多量体、例えば、ダイアボディまたはマルチマーであり得る。マルチマーは、たいてい、軽鎖および重鎖の可変部分が相互に対形成してダイアボディになることによって形成される。その構築物のヒンジ部分には、複数の選択肢があり、それらとしては、完全に削除されること、１番目のシステインが維持されること、セリンではなくプロリンに置換されること、１番目のシステインまで切断されることが挙げられる。Ｆｃ部分は、削除され得る。安定であるかつ／または二量体化する任意のタンパク質が、この目的にかない得る。Ｆｃドメインの１つ、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかが、使用され得る。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域が、使用され得る。他の態様では、単に免疫グロブリンのヒンジ部分またはＣＤ８αの一部が、使用され得る。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲ核酸は、他の共刺激レセプター（例えば、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）をコードする配列を含む。他の共刺激レセプターとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって惹起される１次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激レセプターによって提供されるさらなるシグナルは、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの残存性の改善および養子免疫療法の治療の成功の改善を助け得る。

キメラ抗原レセプターの細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ抗原レセプターが配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関わる。そのエフェクター機能は、ＮＫ細胞などの分化細胞の特殊機能である。具体的な実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内レセプターシグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞抗原レセプター複合体の細胞内レセプターシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３のゼータ鎖、また、ＦｃγＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２を単独でまたは例えばＣＤ３ゼータと一続きで）が含まれる。具体的な実施形態において、細胞内ドメイン（細胞質ドメインと称され得る）は、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒアルファ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ４０の１つ以上の一部または全部を含む。内在性のＴ細胞レセプター複合体の任意の部分が、細胞内ドメインにおいて使用され得る。いわゆる第３世代ＣＡＲは、例えば、相加効果または相乗効果のために共に融合された、少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するので、１つまたは複数の細胞質ドメインを使用してもよい。

ＣＡＲのある特定の実施形態において、レセプターの抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称され得る）は、腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、Ｄｅｃｔｉｎ−１などのパターン認識レセプターによって認識される糖鎖抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上で発現される限り、任意の種類であってよい。腫瘍抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＶＥＧＦＲ２であり得るが、これらに限定されない。ＣＡＲは、ヒト化ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化ＣＤ１９またはＣＤ１２３）を含み得る。

ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原の量が少ないとき、残存性を改善するために、サイトカインと共発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ−１５と共発現され得る。

キメラレセプターをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ起源、ｃＤＮＡ起源から得ることができるか、または合成され得るか（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組み合わせであり得る。イントロンがｍＲＮＡを安定化することが見出されているので、ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化させるために内在性または外来性の非コード領域を使用することもさらに有益であり得る。

キメラ構築物は、裸のＤＮＡとしてまたは好適なベクターの形でＮＫ細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡを使用してエレクトロポレーションによって細胞を安定にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡとは、一般に、発現にとって適切な向きでプラスミド発現ベクターに含められる、キメラレセプターをコードするＤＮＡのことを指す。

あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を使用することにより、キメラ構築物をＮＫ細胞に導入することができる。本発明の方法に従って使用するのに適したベクターは、ＮＫ細胞において非複製である。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、細胞内で維持されるウイルスのコピー数は、その細胞の生存能を維持できるほど十分低く、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターである。

ＣＡＲは、自殺遺伝子（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９）を発現し得る。

ＣＡＲは、腫瘍抗原結合ドメインを含み得る。その腫瘍抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒアルファ、カッパー鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＶＥＧＦＲ２であり得るが、これらに限定されない。ＣＡＲは、ヒト化ｓｃＦｖ、例えば、ヒト化ＣＤ１９、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＤ５、ＣＤ４７、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＣＤ９９、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＣＳ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＲＯＲ−１またはＢＣＭＡを含み得る。
Ｖ．使用方法

本開示の実施形態は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団を移入することによって内科疾患または障害を処置または予防するために本明細書中に提供される免疫細胞、例えば、ＮＫまたはＴ細胞（例えば、本ＵＡＰＣによって拡大されたもの）を使用するための方法に関する。その方法は、被験体に治療有効量の拡大された免疫細胞を投与することによって、その被験体における障害を処置または予防する工程を含む。本開示のある特定の実施形態では、免疫応答を誘発する免疫細胞集団を移入することによって、癌または感染症が処置される。免疫細胞は、炎症促進性サイトカインの放出に起因して、補助的な免疫細胞の分化、活性化および／または悪性疾患部位への動員を促進することによって、抗炎症性の腫瘍微小環境を逆転させ得、適応免疫応答を高め得る。

本処置方法が有用な腫瘍としては、任意の悪性細胞タイプ、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍に見られるタイプが挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性疾患、白血病、リンパ腫、芽腫、ミエローマなどが挙げられる。本明細書中に提供される方法を用いて処置され得る癌のさらなる例としては、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々なタイプの頭頸部癌、ならびに黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

癌は、具体的には以下の組織型の癌であり得るが、これらに限定されない：新生物，悪性；癌腫；癌腫，未分化型；巨細胞および紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ，悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌・胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ内腺癌；腺癌，家族性大腸ポリポーシス；充実性癌；カルチノイド腫瘍，悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病，乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫，悪性；卵巣間質腫瘍，悪性；莢膜細胞腫，悪性；顆粒膜細胞腫，悪性；アンドロブラストーマ，悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍，悪性；脂質細胞腫瘍，悪性；傍神経節腫，悪性；乳房外傍神経節腫，悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑内悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑，悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫，悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍，悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫，悪性；ブレンナー腫瘍，悪性；葉状腫瘍，悪性；滑膜肉腫；中皮腫，悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫，悪性；卵巣甲状腺腫，悪性；絨毛癌；中腎腫，悪性；血管肉腫；血管内皮腫，悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫，悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫，悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍，悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫，悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；松果体腫，悪性；脊索腫；神経膠腫，悪性；上衣腫；アストロサイトーマ；原形質性アストロサイトーマ；細線維性アストロサイトーマ；星芽腫；神経膠芽腫；乏突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫，悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫，悪性；顆粒細胞腫，悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫，小リンパ球性；悪性リンパ腫，大細胞型，びまん性；悪性リンパ腫，濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切れ込み細胞ＮＨＬ；巨大病変（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリーセル白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。

特定の実施形態は、白血病を処置する方法に関する。白血病は、血液または骨髄の癌であり、血液細胞、通常は白血球細胞（白血球）の異常な増殖（分裂増殖による生成）を特徴とする。白血病は、血液新生物と呼ばれる広範囲な疾患群の一部である。白血病は、ある疾患範囲を網羅する広義語である。白血病は、臨床的および病理学的に、急性型と慢性型とに分けられる。

急性白血病は、未熟な血液細胞の急速な増殖を特徴とする。この密集によって、骨髄は健康な血液細胞を産生できなくなる。急性型の白血病は、小児および若年成人において生じ得る。急性白血病では、急速な進行および悪性細胞の蓄積、次いでそれが血流にあふれ出て、身体の他の器官に広がることから、速やかな処置が必要とされる。中枢神経系（ＣＮＳ）の関与は珍しいが、この疾患は、時として脳神経麻痺を起こし得る。慢性白血病は、比較的成熟しているがなおも異常な血液細胞の過剰な蓄積によって区別される。通常、数ヶ月から数年間かけて進行する間に、正常細胞よりもかなり速い速度で細胞が産生されて、血液中に多くの異常な白血球が生じる。慢性白血病は、たいていは高齢者に起きるが、理論的にはどの年齢群でも生じ得る。急性白血病は、直ちに処置しなければならないのに対して、慢性型は時折、治療の有効性が最大となるのを確実にするために、処置前にしばらくの間、監視される。

さらに、上記疾患は、リンパ球性もしくはリンパ芽球性（正常にはリンパ球を形成し続けるあるタイプの骨髄細胞に癌化が起こったことを示す）および骨髄性または骨髄球性（正常には赤血球、いくつかのタイプの白血球および血小板を形成し続けるあるタイプの骨髄細胞に癌化が起こったことを示す）に分類される。

急性リンパ性白血病（急性リンパ芽球性白血病、すなわちＡＬＬとしても知られる）は、低年齢小児において最も一般的なタイプの白血病である。この疾患は、成人、特に、６５歳以上でも発症する。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、ほとんどの場合、５５歳を超える成人で発症する。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、時折、それより若い成人でも生じるが、小児で発症することはほとんどない。急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、すなわちＡＭＬとしても知られる）は、通常、小児よりも成人において生じる。このタイプの白血病は、以前は急性非リンパ性白血病と呼ばれていた。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、主に成人に生じる。

リンパ腫は、リンパ球（脊椎動物の免疫系における白血球の１タイプ）から発生する癌のタイプである。リンパ腫には、多くのタイプが存在する。米国国立衛生研究所によると、リンパ腫は、米国における癌の全症例の約５パーセントを占め、特にホジキンリンパ腫は、米国における癌の全症例の１パーセント未満を占める。リンパ系は、身体の免疫系の一部であるので、ＨＩＶ感染またはある特定の薬物もしくは薬物療法などによって免疫系が弱った患者も、リンパ腫の発生率が高い。

本開示のある特定の実施形態において、免疫細胞は、それを必要とする個体（例えば、癌または感染症を有する個体）に送達される。次いで、それらの細胞は、その個体の免疫系を亢進して、それぞれの癌細胞または病原性細胞を攻撃する。いくつかの場合では、個体は、免疫細胞を１回以上提供される。個体が、免疫細胞を２回以上提供される場合、投与間の時間は、その個体において伝播のための時間が経過するのに十分な時間であるべきであり、具体的な実施形態において、投与間の時間は、ｌ、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上である。

プレ活性化され、拡大される免疫細胞の起源は、任意の種類であってよいが、具体的な実施形態において、その細胞は、例えば、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞のバンクから得られる。治療効果にとって好適な用量は、好ましくは一連の投与サイクルにおいて、１用量あたり例えば少なくとも１０^５または約１０^５〜約１０^１０細胞であり得る。例示的な投与レジメンは、０日目の少なくとも約１０^５細胞から開始し、例えば、患者内用量漸増スキーム開始の数週間以内に約１０^１０細胞という目標用量まで徐々に増加させるという用量漸増の１週間投与サイクルの４サイクルからなる。好適な投与様式としては、静脈内、皮下、腔内（例えば、レザバーアクセスデバイス）、腹腔内および腫瘤への直接注射が挙げられる。

１つの例示的な方法では、ＮＫ細胞は、１単位以上の臍帯血単位などの生物学的サンプルに由来し得る。臍帯血単位は、凍結臍帯血単位であり得る。その臍帯血単位を解凍し、フィコール勾配に供することにより、単核細胞が得られ得る。その単核細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＳなどによって、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１９陽性細胞が枯渇していることがある。次いで、ネガティブ選択されたＮＫ細胞は、ＡＰＣおよびＩＬ−２（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）の存在下において培養され得る。次いで、そのＮＫ細胞に、ＣＡＲを発現するレトロウイルス上清が形質導入され得、γ線照射されたＡＰＣおよびＩＬ−２とともに培養され得る。最後に、その細胞は、ＣＡＲの陽性発現（例えば、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４またはＣＤ４５）についてソーティングされ得る。

本方法に従って作製された免疫細胞には、実験用途および治療用途をはじめとした、多くの潜在的な用途がある。特に、そのような細胞集団は、望ましくないまたは不適当な免疫応答を抑制する際に極めて有用であることが想定される。そのような方法では、少数の免疫細胞を患者から取り出し、次いで、エキソビボで操作し、拡大した後、それを患者に再注入する。このように処置され得る疾患の例は、例えば、同種移植寛容のために、免疫活性の抑制が望ましい自己免疫疾患および自己免疫状態である。治療的な方法は、哺乳動物を準備する工程、その哺乳動物から免疫細胞を得る工程；上に記載された本方法の方法に従ってその免疫細胞をエキソビボで拡大する工程；および拡大された免疫細胞を処置される哺乳動物に投与する工程を含み得る。

本開示の薬学的組成物は、単独でまたは癌の処置に有用な他の確立された作用物質と組み合わせて使用され得る。単独で送達されるのか、他の作用物質と組み合わせて送達されるのかに関係なく、本開示の薬学的組成物は、様々な経路を介して、哺乳動物、特にヒトの身体の様々な部位に送達されることにより、特定の効果が達成され得る。当業者は、２つ以上の経路を投与に用いることができるが、特定の経路が、別の経路よりも即効性かつ効果的な反応を提供できることを認識するだろう。例えば、黒色腫の処置の場合、吸入よりも皮内送達が有利に使用され得る。局所送達または全身送達は、体腔への製剤の適用もしくは滴下注入、エアロゾルの吸入もしくはガス注入、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹膜、皮下もしくは皮内投与を含む非経口導入を含む投与によって達成され得る。

本開示のある特定の実施形態は、免疫介在性障害を処置または予防するための方法を提供する。１つの実施形態において、被験体は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および自己免疫性睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスペート−皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化群、巣状糸球体硬化症または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑、ならびにヴェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書中に開示される方法を用いて処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。

なおも別の実施形態において、被験体は、臓器移植または幹細胞移植のレシピエントであり、拒絶を予防および／または処置するために免疫細胞が用いられる。特定の実施形態において、被験体は、移植片対宿主病を有するか、または移植片対宿主病を発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するかまたは含む任意の移植で起き得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足における赤みを帯びた発疹が挙げられ、それは、広がって、より重篤になることがあり、皮膚剥脱または水疱形成を伴う。急性ＧＶＨＤは、胃および腸にも影響することがあり、その場合、筋痙攣、悪心および下痢が現れる。皮膚および眼の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいてランク付けされる：ステージ／グレード１が軽度であり；ステージ／グレード４が重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３ヶ月後またはそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口の唾液腺、ならびに胃の内壁および腸を滑らかにする腺にも影響することがある。本明細書中に開示される任意の免疫細胞の集団が利用され得る。移植される器官の例としては、実質臓器の移植（例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓）または細胞移植（例えば、膵島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄、または造血性幹細胞もしくは他の幹細胞）が挙げられる。移植は、複合移植（例えば、顔面の組織）であり得る。免疫細胞は、移植の前、移植と同時、または移植の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、移植の前（例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前または少なくとも１ヶ月前）に投与される。１つの非限定的な具体例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３〜５日前に行われる。

ある特定の実施形態において、免疫細胞は、第２の治療薬と組み合わせて投与される。例えば、第２の治療薬としては、Ｔ細胞、免疫調節剤、モノクローナル抗体または化学療法剤が挙げられ得る。非限定的な例において、免疫調節剤は、レノリドミドであり、モノクローナル抗体は、リツキシマブ、オファツマブまたはルミリキシマブであり、化学療法剤は、フルダラビンまたはシクロホスファミドである。

本開示の組成物は、単位剤形で提供され得、ここで、各投与単位、例えば、注射剤は、所定の量のその組成物を単独でまたは他の活性な作用物質との適切な組み合わせで含む。単位剤形という用語は、本明細書中で使用されるとき、ヒトおよび動物被験体に対する単位投与量として適した物理的に不連続な単位のことを指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量として計算された所定の量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性な作用物質と組み合わせて、必要に応じて薬学的に許容され得る希釈剤、キャリアまたはビヒクルと併せて、含む。本発明の新規の単位剤形についての仕様は、特定の被験体における、薬学的組成物に関連する特定の薬力学に依存する。

望ましくは、長期間の特異的な抗腫瘍応答が確立されて、腫瘍サイズが減少するか、またはそのような処置が無い場合に生じ得る腫瘍の成長もしくは再成長が無くなるように、単離され、導入された有効量のまたは十分な数の免疫細胞が、組成物中に存在し、被験体に導入される。望ましくは、被験体に再導入されるその量の免疫細胞は、他の点では同じ条件（免疫細胞が存在しない）と比べて、腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％減少させる。

したがって、投与される免疫細胞の量は、投与経路を考慮するべきであり、十分な数の免疫細胞が所望の治療反応を達成するように導入されるような量であるべきである。さらに、本明細書中に記載される組成物に含められる活性な作用物質の各々の量（例えば、接触される各細胞あたりの量またはある特定の体重あたりの量）は、用途によって異なり得る。一般に、免疫細胞の濃度は、望ましくは、処置される被験体において、少なくとも約１×１０^６〜約１×１０^９免疫細胞、さらにより望ましくは、約１×１０^７〜約５×１０^８免疫細胞を提供するのに十分であるべきであるが、それを超える量、例えば、５×１０^８細胞を超える量、またはそれを下回る量、例えば、１×１０^７細胞未満の量といった、任意の好適な量を利用できる。投与スケジュールは、確立された細胞ベースの治療に基づき得る（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７；米国特許第４，６９０，９１５号を参照のこと）か、または代わりの持続注入ストラテジーを用いることもできる。

これらの値は、本発明を実施するために本発明の方法を最適化する際に実務家が利用する免疫細胞の範囲の一般的ガイダンスを提供する。そのような範囲の本明細書中の詳述は決して、特定の用途では保証され得る、それより多いまたは少ない量の構成要素の使用を排除しない。例えば、正確な用量およびスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるか否かに応じて、または薬物動態、薬物処分および代謝の個体差に応じて、異なり得る。当業者は、特定の状況の緊急事態に応じて、任意の必要な調整を容易に行うことができる。
ＶＩ．キット

いくつかの実施形態において、例えば、ＵＡＰＣおよび／または免疫細胞を作製するための１つ以上の培地および構成要素を含み得るキットが提供される。そのような製剤は、ＡＰＣおよび／または免疫細胞と組み合わせるのに適した形態で因子のカクテルを含み得る。試薬系は、必要に応じて、水性媒質中にまたは凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、構成要素が配置され得る、好ましくは、適切に分注され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられる。キットに２以上の構成要素が存在する場合、そのキットは一般に、追加の構成要素が別々に入れられ得る第２、第３または他のさらなる容器も含み得る。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、１つのバイアルに含められてもよい。キットの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または構成要素が、乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成され得る。その溶媒は、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。また、キットは、通常、商業的販売のためにキットの構成要素を厳重に閉じ込めた状態で含めるための手段も含み得る。そのような容器としては、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が挙げられ得る。キットは、使用のための指示書（例えば、印刷された形式または電子的な形式、例えば、デジタル形式）も含み得る。

ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本発明の実施においてうまく機能すると本発明者が発見した手法であり、ゆえに、それらの手法は、実施するための好ましい形態を構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態では、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更が行われ得、なおも同様または類似の結果が得られることを認識するはずである。

実施例１−ｍｂＩＬ２１、４−１ＢＢＬおよびＳＬＡＭ（ＣＤ４８／ＣＳ１）の組み合わせ
ＣＤ４８−ＫａｔｕｓｈｋａまたはＣＳ１−ＥＧＦＰのいずれかとともに、膜結合型ＩＬ−２１および４１ＢＢＬ（ＣＤ１３７リガンド）に対するレトロウイルス構築物をＫ５６２細胞に形質導入することによって、ユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）を作製した。ＭＭＬＶ−レトロウイルス構築物のマップおよびアノテーションを図４Ａ〜４Ｄに示す。ＮＫ細胞感受性Ｋ５６２（ＨＬＡ−Ａ⁻、ＨＬＡ−Ｂ⁻）ＡＰＣ（図３Ａ）におけるｍｂＩＬ−２１および４１ＢＢＬの強制発現から、クローン４６（図３Ｂ）を作製した。Ｋ５６２細胞におけるｍｂＩＬ−１、４１ＢＢＬおよびＣＤ４８の強制発現によって、ＵＡＰＣを作製した（図３Ｃ）。Ｋ５６２細胞におけるｍｂＩＬ−２１、４１ＢＢＬおよびＣＳ１の強制発現によって、ＵＡＰＣ２を作製した（図３Ｄ）。

ＮＫ細胞の数値的拡大を、クローン４６、ＵＡＰＣまたはＵＡＰＣ２による活性化を用いて行った。ＡＰＣ共培養によるＮＫ細胞の増殖および拡大は、クローン４６が、以前に発表されたクローン９（図２Ｂ）と比べて、形質導入されていないＮＫ細胞（ＮＴ−ＮＫ）とＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞（ＳＧ４−ＮＫ）との両方を拡大する能力に優れていることを示した。

ＵＡＰＣとの共培養によるＮＫ細胞の拡大は、以前に発表されたクローン９（３３時間という倍加時間）と比べて、ＮＫ細胞の倍加時間を３１．３８時間まで短縮する能力に優れていると示され、２週間で４４％という増殖性の利点をもたらした（ＵＡＰＣの場合、１６７１倍の拡大に対して、クローン９の場合、１１６１倍の拡大）（図２Ｅ）。倍加時間と拡大倍率と開始時の細胞集団との関係は、以下の式によって簡約される：

式中、Ｎ_ｆは、最終的な細胞数であり、Ｎ_ｂは、開始時の細胞であり、ｅ＝２．７１８２８（オイラー数としても知られる数学定数）であり、Ｔは、時を単位とする培養の時間範囲であり、Ｔ_Ｄは、時を単位とする倍加時間である。倍加時間は、最終的な細胞数に指数関数的に影響するので、指定の細胞培養期間にわたって増殖性の利点をさらに大きくすることから、圧縮された時間枠において、臨床的に妥当な数の細胞の収集が可能になる。ゆえに、本方法は、ＵＡＰＣとの共培養によるＮＫ細胞の効率的な作製を可能にする。

本プラットフォーム技術は、特定の治療的な組み合わせ経路を利用して、癌免疫療法を目的とした、臨床グレードの多数の高度に機能的かつ細胞傷害性のＮＫ細胞を製造するための実用的な方法を提供する。拡大された細胞は、１００％ＮＫ細胞であり、Ｔ細胞は検出不可能であることから、多くの免疫細胞調製物において共通する意図されない移植片対宿主の副作用が回避される。

本明細書中に開示されるおよび特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく、実施および実行され得る。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法および方法の工程または工程の順序に変更が適用され得ることが当業者には明らかであろう。より詳細には、化学的かつ生理的に関係するある特定の作用物質が、本明細書中に記載される作用物質の代わりに用いられ得るが、同じまたは類似の結果が達成され得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換および修正のすべてが、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念を超えないとみなされる。

以下の文献は、本明細書に記載されているものを補足する例示的な手順、又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods 1988;110:29-36.
Fast et al., Transfusion 2004;44:282-5.
He Y, et al. Journal of immunology research. 2014;2014:7.
International Publication No. PCT/US95/01570
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Olsson et al. J. Clin. Invest. 1990;86:981-985.
Taitano et al., The Journal of Immunology, 196, 2016.
U.S. Patent No. 5,939,281
U.S. Patent No. 6,218,132
U.S. Patent No. 6,264,951
U.S. Patent No. 7,488,490
U.S. Patent Publication No. 2007/0078113

Claims (61)

1. （１）ＣＤ４８および／またはＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合型インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）、ならびに（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作されたユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）。
2. 前記ＵＡＰＣが、ＣＤ４８を発現する、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
3. 前記ＵＡＰＣが、ＣＳ１を発現する、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
4. 前記ＵＡＰＣが、ＣＤ４８およびＣＳ１を発現する、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
5. 前記ＵＡＰＣが、内在性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子を本質的に発現しない、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
6. 前記ＵＡＰＣが、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現する、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
7. 前記ＵＡＰＣが、白血病細胞由来のＵＡＰＣである、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
8. 前記白血病細胞由来のＵＡＰＣが、さらにＫ５６２細胞と定義される、請求項７に記載のＵＡＰＣ。
9. 前記ＵＡＰＣが、レトロウイルス導入によって操作されたものである、請求項１に記載のＵＡＰＣ。
10. 前記レトロウイルス導入がさらに、配列番号１および／または配列番号２のウイルス構築物を用いた導入と定義される、請求項９に記載のＵＡＰＣ。
11. 前記ＵＡＰＣが、照射される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＵＡＰＣ。
12. 免疫細胞を拡大するための方法であって、該免疫細胞を有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＵＡＰＣの存在下において培養する工程を含む、方法。
13. 前記免疫細胞とＵＡＰＣとが、３：１〜１：３の比で培養される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記免疫細胞とＵＡＰＣとが、１：２の比で培養される、請求項１２に記載の方法。
15. 前記拡大が、ＩＬ−２の存在下におけるものである、請求項１２に記載の方法。
16. 前記ＩＬ−２が、１０〜５００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＩＬ−２が、１００〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
18. 前記ＩＬ−２が、２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
19. 前記ＩＬ−２が、組換えヒトＩＬ−２である、請求項１５に記載の方法。
20. 前記ＩＬ−２が、２〜３日ごとに補充される、請求項１５に記載の方法。
21. 前記ＵＡＰＣが、少なくとも２度加えられる、請求項１２に記載の方法。
22. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項１２に記載の方法。
23. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１２に記載の方法。
24. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１２に記載の方法。
25. 前記免疫細胞が、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、幹細胞または骨髄に由来する、請求項１２に記載の方法。
26. 前記幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項１２に記載の方法。
27. 前記免疫細胞が、ＣＢから得られる、請求項１２に記載の方法。
28. 前記ＣＢが、２単位以上の個々の臍帯血単位からプールされる、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＣＢが、３、４、５、６、７または８単位の個々の臍帯血単位からプールされる、請求項２７に記載の方法。
30. 前記ＮＫ細胞が、ＣＢ単核細胞（ＣＢＭＣ）である、請求項２３に記載の方法。
31. ＮＫ細胞がさらに、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞と定義される、請求項２３に記載の方法。
32. 前記方法が、無血清培地中で行われる、請求項１２に記載の方法。
33. 前記免疫細胞が、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように操作されている、請求項１２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記ＣＡＲが、ヒト化抗原結合ドメインを含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＤ５、ＣＤ４７、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＣＤ９９、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＣＳ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＲＯＲ−１またはＢＣＭＡの抗原結合ドメインを含む、請求項３３に記載の方法。
36. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９またはＣＤ１２３の抗原結合ドメインを含む、請求項３３に記載の方法。
37. 前記ＣＡＲが、ＩＬ−１５を含む、請求項３３に記載の方法。
38. 前記ＣＡＲが、自殺遺伝子を含む、請求項３３に記載の方法。
39. 前記自殺遺伝子が、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９である、請求項３８に記載の方法。
40. 請求項１２〜３９のいずれか１項に記載の方法に従って作製され、拡大された免疫細胞の集団。
41. 請求項４０に記載の拡大された免疫細胞の集団および薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
42. 被験体における疾患または障害の処置において使用するための、有効量の請求項４０に記載の拡大された免疫細胞を含む、組成物。
43. 被験体における疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項４０に記載の拡大された免疫細胞を該被験体に投与する工程を含む、方法。
44. 前記疾患または障害が、癌、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、自己免疫障害、免疫不全症、Ｂ細胞悪性疾患または感染症である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記癌が、白血病である、請求項４４に記載の方法。
46. 前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記免疫細胞が、同種異系である、請求項４３に記載の方法。
48. 前記免疫細胞が、自家性である、請求項４３に記載の方法。
49. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項４３に記載の方法。
50. 前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項４３に記載の方法。
51. 前記障害が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項４３に記載の方法。
52. 前記障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息またはシェーグレン症候群である、請求項４３に記載の方法。
53. 前記被験体が、ヒトである、請求項４３に記載の方法。
54. 少なくとも１つの第２の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
55. 前記少なくとも１つの第２の治療薬が、治療有効量の抗癌剤、免疫調節剤または免疫抑制剤である、請求項５４に記載の方法。
56. 前記抗癌剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法または免疫療法である、請求項５５に記載の方法。
57. 前記免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体、化学療法剤照射、ケモカイン、インターロイキン、またはケモカインもしくはインターロイキンの阻害剤である、請求項５５に記載の方法。
58. 免疫細胞および／または前記少なくとも１つの第２の治療薬が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、領域性に、または直接注射もしくは灌流によって投与される、請求項５４に記載の方法。
59. 前記第２の治療薬が、抗体である、請求項５４に記載の方法。
60. 前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体または三重特異性抗体である、請求項５９に記載の方法。
61. 前記抗体が、リツキシマブである、請求項６０に記載の方法。
    

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