JP2017532353A - ナチュラルキラー細胞のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の刺激及び生成又は増殖を行うための新規な組成物並びに方法が開示される。ＮＫ細胞の数は、１種又は２種以上の刺激性ペプチドで修飾されたエクソソームとの接触後に増加し得る。刺激性ペプチドを含むエクソソームを生成するための方法及び組成物もまた記載される。また、開示されたＮＫ−刺激エクソソーム又は開示された方法で刺激したＮＫ細胞を使用する癌の治療方法が記載される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１０月２７日出願の米国仮出願第６２／０６９，０５７号の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本出願は概して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物及び方法に関連する。更に詳細には、本出願は、内因性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激及び増殖に関連し、この内因性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、癌細胞、ウイルス感染細胞、及び特定の免疫細胞を攻撃及び死滅させることができる。

遺伝子型でＨＬＡが一致した同胞からの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、血液悪性腫瘍及び骨髄不全症候群の患者の長期生存を改善した。毎年１０，０００人を超えるアメリカ人が、非血縁ドナー又は臍帯血ユニットからの骨髄移植が治癒の唯一の希望である、生命を脅かす疾患にかかる。しかし、同種幹細胞移植から利することができる７０％を超える患者に、一致同胞ドナーがいない。これらの状況が治療を遅らせ、部分的に不一致のドナーの最適に満たない使用に頼らざるを得なくさせており、これが結果的に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植不全、及び再発の発生率の増加につながり、その全てが患者の生存率を劇的に低下させる。

更なる制限は、移植プロセスの期間と、高価な金銭的負担、精神的負担、及び身体的負担と、によってもたらされる。したがって、非血縁ドナーからのＨＳＣＴの適用は、適切な社会経済的支援を持つ、プロセスに耐え得る、より若く健康な患者に制限される。

更なる課題は、残存癌細胞の根絶ができないことによる再発率の高さによってもたらされる。ＨＳＣＴは治癒的であると考えられているが、癌再発率は驚異的である。したがって、より効果的で、好ましくは一致ドナーの必要がない、新規の、より標的化された免疫療法が必要である。ＨＳＣＴ後の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）再発の治療のためのドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）は、１９９０年代に導入された。このアプローチは、元のドナーから再発疾患を持つＡＭＬ患者へのリンパ球の投与で構成されていた。しかし、臨床的利益は限られており、腫瘍負荷のより少ない少数の患者でしか観察されず、Ｔ細胞媒介性ＧＶＨＤは、多くの場合、結果を更に悪化させた。

ＮＫ細胞の数を増加させることを目的とした、新しい改善された方法論が大いに必要とされている。

開示した方法及び組成物の更なる利点が、以下の説明に部分的に記載されており、その一部は、説明から理解されるか、又は開示した方法及び組成物の実施によって習得され得る。開示した方法及び組成物の利点は、添付の「特許請求の範囲」で特に指摘された要素及び組み合わせを用いて実現及び達成されるであろう。上述の一般的な説明及び後述の「発明を実施するための形態」の両方は具体例であって、例示だけを目的としており、特許請求されている本発明の範囲の限定を意図するものではない。

本明細書には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を高めるための改善された技術の方法が開示される。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ＮＫ細胞の数の増加をもたらす。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、改善された活性を有するＮＫ細胞をもたらす。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、改善された活性を持つＮＫ細胞の数の増加をもたらす。

本明細書には、少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームに接触させることを含む、ＮＫ細胞の数を増加させるための方法が開示される。エクソソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されるエクソソーム分泌細胞の細胞外産物であり得る。場合によっては、エクソソームは、フィーダー細胞から分泌される。いくつかの態様において、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、及び／又は他のホーミング受容体、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、及び／又は他のアダプタータンパク質を含んでいてもよい。場合によっては、エクソソーム膜は、ＩＬ−１５を含まない。いくつかの態様において、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬと、ＩＬ−２１と、を含む。刺激性ペプチドはまた、１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合されてもよい。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧのセグメントを含んでいてもよい。あるいは、膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含んでいてもよい。１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、エクソソームは、ＮＫ細胞との共培養中において、フィーダー細胞によって生成される。現在の共培養方法に伴う１つの欠点は、汚染の可能性である。しかし、開示された方法ではフィーダー細胞とＮＫ細胞との間に直接的な細胞間接触の必要がないため、細胞は、エクソソームの通過を可能にするような大きさの膜によって分離することができる。したがって、本明細書では、エクソソームの通過を可能にするような大きさの膜によって分離されたフィーダー細胞とＮＫ細胞とを含むバイオリアクタも開示される。かかるバイオリアクタは、高分子多孔質膜によって分離された複数の区画、又はエクソソームの通過は可能だが細胞は通過させない高分子多孔質膜を持つ中空糸型で設計されてもよい。かかるバイオリアクタの設計は、細胞活性化、細胞増殖、又は細胞処理のためのより大きな装置又はシステムの一部として組み込まれ得る。

本明細書で使用されるエクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作される細胞株によって生成されてもよい。場合によっては、細胞株は、Ｋ５６２細胞などの白血病細胞株である。場合によっては、細胞株は、４−１ＢＢＬ及びＩＬ−２１などの１種又は２種以上の刺激性ペプチドを発現するように操作されている。したがって、いくつかの実施形態において、細胞株は、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬを含む。いくつかの実施形態において、エクソソームは、ＰＢＭＣから生成される。場合によっては、細胞株は、ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞などのエプスタイン−バールウイルス感染細胞株、又はサイトメガロウイルス感染細胞株、又は同時感染した細胞株である。

ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏでＮＫ刺激エクソソームと接触しているか、又はＮＫ−刺激エクソソームに曝露されていてもよい。例えば、ＮＫ細胞は、同種移植手順、半合致移植手順、又はｉｎ ｖｉｖｏ免疫療法手順で、ＮＫ−刺激エクソソームと接触させてもよい。いくつかの態様において、同種移植、半合致移植、又はｉｎ ｖｉｖｏ免疫療法におけるＮＫ−刺激エクソソームの使用は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさない。

いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、未選択の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団に存在する。いくつかの実施形態において、被験体から単離した全血又はＰＢＭＣは、開示されたエクソソームとｅｘ ｖｉｖｏで接触して、ＰＢＭＣ内でＮＫ細胞を増殖する。いくつかの実施形態において、エクソソームは、誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、ＰＢＭＣ、臍帯血、単離したＮＫ細胞前駆体、又はこれらの任意の組み合わせ由来のＮＫ細胞と接触する。一度接触すると、全血、ＰＢＭＣ、増殖したＮＫ細胞、単離したＮＫ細胞、又は他のリンパ系細胞型を枯渇させたＮＫ細胞産物を被験体に輸血して戻すことができる。活性化若しくは増殖のための、ＮＫ細胞のエクソソーム又はＮＫ細胞含有細胞集団によるいずれかの刺激は、標準組織培養プレート若しくはフラスコ、クローズドバッグシステム（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉによるＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム）、中空糸装置（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴによるＱｕａｎｔｕｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｇ−Ｒｅｘフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）、又は他の装置で実施され得る。

本明細書には、ＮＫ−仲介溶解に影響されやすい細胞を処理するための方法が開示されており、この方法は、接触させたＮＫ細胞を含む有効量の組成物を細胞に投与することを含む。接触させたＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む方法によって生成されてもよく、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。いくつかの態様において、ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞は、ウイルスに感染している場合がある。ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞は、これらに限定されないが、ＡＭＬ、乳癌、膀胱癌、結腸及び直腸癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌が挙げられる、癌と関連のあるような悪性細胞を含んでいる場合がある。

幹細胞移植後の再発のリスクを低減するための方法と、接触させたＮＫ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含む補助療法のための方法と、が開示されており、接触させたＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む方法によって生成され、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。

ＮＫ細胞−刺激エクソソームの生成方法が開示されており、この方法は、エクソソームの膜内に１種又は２種以上の刺激性ペプチドを包埋することを含む。刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、及び／又は他のホーミング受容体、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、及び／又は他のアダプタータンパク質ｒを含んでいてもよい。刺激性ペプチドは、任意選択的に、膜挿入ペプチドに結合されてもよい。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧを含んでいてもよい。あるいは、膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを更に含んでいてもよい。１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質を含んでいてもよい。いくつかの態様において、ＮＫ細胞−刺激エクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作された細胞株由来であってもよく、この細胞株には、細胞株Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ又は細胞株Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬが挙げられるが、これらに限定されない。

１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ−刺激エクソソームを含む有効量の組成物を投与することを含む、癌を治療するための方法が開示される。ＮＫ刺激エクソソームの使用は、ＮＫ刺激エクソソームを被験体に投与することを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ＮＫ刺激エクソソームの使用は、ＮＫ刺激エクソソームをｅｘ ｖｉｖｏでＮＫ細胞に接触させて、接触させたＮＫ細胞の集団を得ることと、接触させたＮＫ細胞の集団を被験体に投与することと、を含んでいてもよい。

１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む組成物が開示される。刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、及び／又は他のホーミング受容体、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、及び／又は他のアダプタータンパク質を含んでいてもよい。刺激性ペプチドは、任意選択的に、１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合されてもよい。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧのセグメントを含んでいてもよい。あるいは、膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを更に含んでいてもよい。膜挿入ペプチドに結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換え又はトランスジェニックＤＮＡでコードした融合タンパク質を含んでいてもよい。ＮＫ刺激エクソソームは、エクソソームの発現を改善又は生成するために操作された細胞株由来であってもよく、この細胞株には、細胞株Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、組成物は、医薬担体を更に含んでいてもよい。ＮＫ細胞を増強するための有効量の組成物を被験体に投与することを含む癌の治療方法が開示されており、組成物は、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームで修飾されたＮＫ細胞を含む。ＮＫ細胞を増強するための有効量の組成物を被験体に投与することを含む癌の治療方法が開示されており、組成物は、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームで修飾されたＮＫ細胞を含み、刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７及び／又は他のホーミング受容体、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、及び／又は他のアダプタータンパク質を含む。ＮＫ細胞を増強するための有効量の組成物を被験体に投与することを含む癌の治療方法が開示されており、組成物は、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームで修飾されたＮＫ細胞を含み、組成物は、膜挿入ペプチドを更に含む。エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームを含む有効量の組成物を細胞集団に投与することを含むＮＫ細胞の増殖方法が開示される。エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームを含む有効量の組成物を細胞集団に投与することを含むＮＫ細胞の増殖方法が開示されており、刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７及び／又は他のホーミング受容体、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、及び／又は他のアダプタータンパク質を含む。ＮＫ細胞を増強するための有効量の組成物を被験体に投与することを含むＮＫ細胞の増殖方法が開示されており、組成物は、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームで修飾されたＮＫ細胞を含み、組成物は、膜挿入ペプチドを更に含む。ＮＫ細胞を増強するための有効量の組成物を被験体に投与することを含むＮＫ細胞の増殖方法が開示されており、組成物は、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームで修飾されたＮＫ細胞を含み、かつ組成物は、膜挿入ペプチドを更に含み、膜自己挿入（membrane self-inserting）ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含む。ＮＫ細胞を増強するための有効量の組成物を被験体に投与することを含む免疫系の調節方法が開示されており、組成物は、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームで修飾されたＮＫ細胞を含み、組成物は、膜挿入ペプチドを更に含む。

したがって、開示されたエクソソームを薬学的に許容されるビヒクル内に含む医薬組成物も開示される。例えば、エクソソームは、好適な担体化学成分（carrier chemical component）を持つ注射剤として調製され得る。

開示されたＮＫ−刺激エクソソーム及び／又は接触させたＮＫ細胞は、単独で、又は治療用抗体、癌ワクチン、免疫チェックポイント阻害剤、及び養子免疫療法（ＡＣＴ）を含むがこれらに限られない癌免疫療法と組み合わせて、被験体に投与され得る。

本明細書には、ＮＫ細胞を、少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む、ＮＫ細胞の刺激方法が開示されており、ＮＫ−刺激エクソソームには、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡなどのＮＫ−刺激機能性核酸が充填される。例えば、場合によっては、ＮＫ−刺激機能性核酸は、Ａ２ＡＲ、Ｐ２ＹＲ、又はこれらの組み合わせの阻害剤（例えば、アンタゴニスト、発現阻害剤、又はサイレンサ）である。
本明細書に組み込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示された方法及び組成物のいくつかの実施形態を例証し、以下の説明と共に、開示された方法及び組成物の原理を説明するよう機能する。

刺激性リガンド（ＩＬ−２１及び４１ＢＢＬ）を含むＫ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ細胞の培養から単離したエクソソームが、癌治療の同種設定、半合致設定、自家設定、及び直接的なｉｎ ｖｉｖｏ設定においてＮＫ細胞を刺激するためにどのように使用され得るかを描写した図である。 Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームの特徴付けを示す図である。エクソソームは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたビデオ顕微鏡法のナノ粒子トラッキング解析によって特徴付けした。単一フレームの光散乱画像（図２Ａ）及び粒度分布のビニングされたヒストグラム（図２Ｂ）が示されている。ＩＬ−２１の存在は、抗−ＩＬ２１抗体を用いてウエスタンブロット解析によって免疫化学的に確認した（図２Ｃ）。抗ＩＬ−２１抗体結合金ナノ粒子（ＧＮＰ）を使用する解析（図２Ｄ）は、アイソタイプ対照抗体と結合したＧＮＰの増加がないのと比較して、抗ＩＬ−２１抗体結合ＧＮＰで動的光散乱強度の経時的な増加が観察される、エクソソームサンプルを持つＩＬ−２１の存在を示す。 Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームの特徴付けを示す図である。エクソソームは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたビデオ顕微鏡法のナノ粒子トラッキング解析によって特徴付けした。単一フレームの光散乱画像（図２Ａ）及び粒度分布のビニングされたヒストグラム（図２Ｂ）が示されている。ＩＬ−２１の存在は、抗−ＩＬ２１抗体を用いてウエスタンブロット解析によって免疫化学的に確認した（図２Ｃ）。抗ＩＬ−２１抗体結合金ナノ粒子（ＧＮＰ）を使用する解析（図２Ｄ）は、アイソタイプ対照抗体と結合したＧＮＰの増加がないのと比較して、抗ＩＬ−２１抗体結合ＧＮＰで動的光散乱強度の経時的な増加が観察される、エクソソームサンプルを持つＩＬ−２１の存在を示す。 Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームの特徴付けを示す図である。エクソソームは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたビデオ顕微鏡法のナノ粒子トラッキング解析によって特徴付けした。単一フレームの光散乱画像（図２Ａ）及び粒度分布のビニングされたヒストグラム（図２Ｂ）が示されている。ＩＬ−２１の存在は、抗−ＩＬ２１抗体を用いてウエスタンブロット解析によって免疫化学的に確認した（図２Ｃ）。抗ＩＬ−２１抗体結合金ナノ粒子（ＧＮＰ）を使用する解析（図２Ｄ）は、アイソタイプ対照抗体と結合したＧＮＰの増加がないのと比較して、抗ＩＬ−２１抗体結合ＧＮＰで動的光散乱強度の経時的な増加が観察される、エクソソームサンプルを持つＩＬ−２１の存在を示す。 Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームの特徴付けを示す図である。エクソソームは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたビデオ顕微鏡法のナノ粒子トラッキング解析によって特徴付けした。単一フレームの光散乱画像（図２Ａ）及び粒度分布のビニングされたヒストグラム（図２Ｂ）が示されている。ＩＬ−２１の存在は、抗−ＩＬ２１抗体を用いてウエスタンブロット解析によって免疫化学的に確認した（図２Ｃ）。抗ＩＬ−２１抗体結合金ナノ粒子（ＧＮＰ）を使用する解析（図２Ｄ）は、アイソタイプ対照抗体と結合したＧＮＰの増加がないのと比較して、抗ＩＬ−２１抗体結合ＧＮＰで動的光散乱強度の経時的な増加が観察される、エクソソームサンプルを持つＩＬ−２１の存在を示す。 Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームが、未選択のＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞の特異的な増殖を刺激することを示す図である。未選択のＰＢＭＣを、３５ｎｇ／ｍＬの総タンパク質でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームと培養した。初期の遅延後、ＮＫ細胞は、２０日間にわたり平均２７０倍に指数関数的に増殖し（図３Ａ）、総リンパ球の相対存在量が７４％に増加した（図３Ｂ）。全ての培養は二通りに増殖し、マーカーは、標準偏差を表す誤差バーを持つ平均を表す。 Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームが、未選択のＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞の特異的な増殖を刺激することを示す図である。未選択のＰＢＭＣを、３５ｎｇ／ｍＬの総タンパク質でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームと培養した。初期の遅延後、ＮＫ細胞は、２０日間にわたり平均２７０倍に指数関数的に増殖し（図３Ａ）、総リンパ球の相対存在量が７４％に増加した（図３Ｂ）。全ての培養は二通りに増殖し、マーカーは、標準偏差を表す誤差バーを持つ平均を表す。 エクソソームで刺激され増殖したＮＫ細胞が、Ｋ５６２細胞に対して細胞毒性であることを示す図である。未選択のＰＢＭＣを、３５ｎｇ／ｍＬの総タンパク質でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームと培養し、Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性を分析するために使用した。エクソソームで増殖したＮＫ細胞（Ｅｘ２１−ＮＫ細胞●）の細胞毒性は、フィーダー細胞で増殖したＮＫ細胞（ＦＣ２１−ＮＫ細胞▲）又はＩＬ−２１結合原形質膜粒子で増殖したＮＫ細胞（ＰＭ２１−ＮＫ細胞■）と比較して、わずかに低い。 ＰＢＭＣＳを持つフィーダー細胞として培養内でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌによって生成されたエクソソームが、ＮＫ細胞によって摂取されることを示す図である。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）で外部標識し、ＰＢＭＣと共インキュベーションした後、１０倍の対物レンズで１８時間にわたり画像化した。数分〜約１時間後の間（図５Ａ）、ＡＦ６４７標識の癒着を観察する。数時間後（図５Ｂ）、細胞内エンドソーム及び多小胞体の形成が観察される。その後、無細胞エクソソームが観察される（図５Ｃ及び図５Ｄ）。ライブ画像化した共培養からのサンプルを得て抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６で染色し、蛍光共焦点顕微鏡法によって画像化した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞は、ＡＦ６４７標識を摂取又はその後結合したが、Ｔ細胞は、優先的に摂取又は結合を行わない。示されているよりも広い領域が統計的妥当性について検査され、Ｚ軸に沿った１０個のスライスが画像化され、細胞内及び細胞外事象を識別した。矢印は、培養内の細胞内及び細胞外粒子又はエクソソームを示す。 ＰＢＭＣＳを持つフィーダー細胞として培養内でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌによって生成されたエクソソームが、ＮＫ細胞によって摂取されることを示す図である。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）で外部標識し、ＰＢＭＣと共インキュベーションした後、１０倍の対物レンズで１８時間にわたり画像化した。数分〜約１時間後の間（図５Ａ）、ＡＦ６４７標識の癒着を観察する。数時間後（図５Ｂ）、細胞内エンドソーム及び多小胞体の形成が観察される。その後、無細胞エクソソームが観察される（図５Ｃ及び図５Ｄ）。ライブ画像化した共培養からのサンプルを得て抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６で染色し、蛍光共焦点顕微鏡法によって画像化した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞は、ＡＦ６４７標識を摂取又はその後結合したが、Ｔ細胞は、優先的に摂取又は結合を行わない。示されているよりも広い領域が統計的妥当性について検査され、Ｚ軸に沿った１０個のスライスが画像化され、細胞内及び細胞外事象を識別した。矢印は、培養内の細胞内及び細胞外粒子又はエクソソームを示す。 ＰＢＭＣＳを持つフィーダー細胞として培養内でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌによって生成されたエクソソームが、ＮＫ細胞によって摂取されることを示す図である。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）で外部標識し、ＰＢＭＣと共インキュベーションした後、１０倍の対物レンズで１８時間にわたり画像化した。数分〜約１時間後の間（図５Ａ）、ＡＦ６４７標識の癒着を観察する。数時間後（図５Ｂ）、細胞内エンドソーム及び多小胞体の形成が観察される。その後、無細胞エクソソームが観察される（図５Ｃ及び図５Ｄ）。ライブ画像化した共培養からのサンプルを得て抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６で染色し、蛍光共焦点顕微鏡法によって画像化した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞は、ＡＦ６４７標識を摂取又はその後結合したが、Ｔ細胞は、優先的に摂取又は結合を行わない。示されているよりも広い領域が統計的妥当性について検査され、Ｚ軸に沿った１０個のスライスが画像化され、細胞内及び細胞外事象を識別した。矢印は、培養内の細胞内及び細胞外粒子又はエクソソームを示す。 ＰＢＭＣＳを持つフィーダー細胞として培養内でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌによって生成されたエクソソームが、ＮＫ細胞によって摂取されることを示す図である。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）で外部標識し、ＰＢＭＣと共インキュベーションした後、１０倍の対物レンズで１８時間にわたり画像化した。数分〜約１時間後の間（図５Ａ）、ＡＦ６４７標識の癒着を観察する。数時間後（図５Ｂ）、細胞内エンドソーム及び多小胞体の形成が観察される。その後、無細胞エクソソームが観察される（図５Ｃ及び図５Ｄ）。ライブ画像化した共培養からのサンプルを得て抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６で染色し、蛍光共焦点顕微鏡法によって画像化した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞は、ＡＦ６４７標識を摂取又はその後結合したが、Ｔ細胞は、優先的に摂取又は結合を行わない。示されているよりも広い領域が統計的妥当性について検査され、Ｚ軸に沿った１０個のスライスが画像化され、細胞内及び細胞外事象を識別した。矢印は、培養内の細胞内及び細胞外粒子又はエクソソームを示す。 ＰＢＭＣＳを持つフィーダー細胞として培養内でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌによって生成されたエクソソームが、ＮＫ細胞によって摂取されることを示す図である。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）で外部標識し、ＰＢＭＣと共インキュベーションした後、１０倍の対物レンズで１８時間にわたり画像化した。数分〜約１時間後の間（図５Ａ）、ＡＦ６４７標識の癒着を観察する。数時間後（図５Ｂ）、細胞内エンドソーム及び多小胞体の形成が観察される。その後、無細胞エクソソームが観察される（図５Ｃ及び図５Ｄ）。ライブ画像化した共培養からのサンプルを得て抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６で染色し、蛍光共焦点顕微鏡法によって画像化した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞は、ＡＦ６４７標識を摂取又はその後結合したが、Ｔ細胞は、優先的に摂取又は結合を行わない。示されているよりも広い領域が統計的妥当性について検査され、Ｚ軸に沿った１０個のスライスが画像化され、細胞内及び細胞外事象を識別した。矢印は、培養内の細胞内及び細胞外粒子又はエクソソームを示す。

開示した方法及び組成物は、特定の実施形態の以下の「発明を実施するための形態」及びそこに含まれる「実施例」、並びに図及びその前後の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４８６７８号を含む本明細書で引用した全ての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。

開示した方法及び組成物は、特に指定されない限り、特定の合成方法、特定の分析技術、又は特定の試薬に限定されないため、変化する可能性があること理解するべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するための目的のものにすぎず、限定することを意図しないことも理解するべきである。

ドナーリンパ球輸注によって媒介される移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果の大部分は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に起因する場合がある。ドナーの血液から単離されたＮＫ細胞の輸注は、ＧＶＨＤを引き起こすことなく有益なＧＶＴ効果をもたらし得る。前臨床及び臨床データは、ＧＶＨＤなしで完全寛解に向かうＮＫ細胞輸注の有効性を示した。したがって、ＮＫ細胞輸注は、自家移植と組み合わせて、又は独立型治療として、一致ドナーを有していないか、再発を経験したか、又は移植に適していない患者に対して、革新的かつ潜在的に非常に効果的な代替案を提供する。

ＮＫ細胞の輸注は、血液癌（急性骨髄性白血病又は多発性骨髄腫など）及びいくつかの固形腫瘍（例えば、脳腫瘍、ユーイング肉腫、及び横紋筋肉腫）を含む、ＮＫ細胞溶解に影響されやすい癌の患者に対する治療選択肢である（Ｈａｒａｄａ，Ｓａｉｊｏ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｃａｐａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｏｉｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｃｈｏ，Ｓｈｏｏｋ ｅｔ ａｌ．２０１０）。機能的ＮＫ細胞の数の増加はまた、とりわけ、リンパ腫、大腸癌、肺癌、及び乳癌を含むいくつかの癌の治療に使用される治療用抗体の有効性を有意に高めることができる（Ｈａｔｊｉｈａｒｉｓｓｉ，Ｘｕ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｔｒｉｕｌｚｉ，Ｖｅｒｔｕａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｈｏｕｏｔ，Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｔａｉ，Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）。しかし、何万ドルもかかる典型的な抗体含有レジメンを伴うこれらのタイプの個別治療は、非常に高価である。更に、既存の方法の期待される有効性は、免疫無防備状態の癌患者における免疫細胞の関与の欠如のためにしばしば達成されない（Ｄｅｗａｎ，Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍａｍｅｓｓｉｅｒ，Ｓｙｌｖａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

癌治療方法として有効であるためには、有効な治療量に達する程度のＮＫ細胞の増殖を達成することが望ましい。いくつかの研究は、刺激細胞の表面上に発現した受容体（４−１ＢＢＬ）を活性化するためにサイトカイン（ＩＬ−１５又はＩＬ−２１など）及びのリガンドが刺激された場合、ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において、指数関数的かつ優先的に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の混合物中で増殖することを示した（Ｉｍａｉ，Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｃｈｏ ａｎｄ Ｃａｍｐａｎａ ２００９；Ｌｅｅ，Ｖｅｒｎｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

サイトカインＩＬ−１５及びＩＬ−２１については、膜結合型インターロイキンの交差提示は、正常な樹状細胞におけるように、可溶型のこれらのサイトカインよりも更に強力にＮＫ細胞の増殖を誘導する。更に、かかる刺激条件下では、低濃度の可溶性ＩＬ−１２のみが、ＮＫ細胞の生存に必要とされるため、Ｔ細胞の観察可能な増殖なしに、ＰＢＭＣ混合物内でＮＫ細胞の選択的増殖が可能になる。可溶型のＩＬ−１５及びＩＬ−２１サイトカイン又は高用量のＩＬ−２は、ＮＫ細胞よりもＴ細胞の増殖を更に強力に刺激する。Ｃａｍｐａｎａ及び共同研究者によって以前に発表された研究は、膜結合型ＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬを有するＫ５６２細胞株によるＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での刺激は、いずれかの分子を単独で発現するＫ５６２細胞では観察されないＮＫ細胞の強力な増殖につながることを示した（Ｉｍａｉ，Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｋａｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．２００９）。しかし、ＮＫ細胞の増殖はいくつかの分裂に限定され、細胞は老化を達成し、増殖を停止し、テロメア短縮の観察と一致した。追跡研究において、膜結合型ＩＬ−１５の代わりに膜結合型ＩＬ−２１による刺激は、無数の世代にわたってＮＫ細胞の連続的な増殖を刺激し、培養が新鮮な刺激細胞で定期的に補充される限り、ＮＫ細胞の連続的な増殖が可能であることが見出された（Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｄｅｎｍａｎ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１２）。これらの方法が、効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞の増殖を可能にする一方、生きたフィーダー細胞に対する必要性は、この方法論を、大規模なＧＭＰ施設及び能力を有さない臨床設定に移すことを困難にする。また、患者に輸注されるＮＫ細胞は、フィーダーによる連続的な刺激の欠如により、分裂を停止する可能性が高い。更に、患者に再輸注した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＮＫ細胞が意図したとおりに機能する能力に関する情報が未だ不足している（Ｍｉｌｌｅｒ ２００９）。現在、ＩＬ−２の投与が、唯一ＦＤＡに承認された、ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の増殖方法である。ＩＬ−１５は現在、第Ｉ相臨床試験においてＩＬ−２投与の代替アプローチとして試験されているが、前臨床の結果に基づいて、体系的に投与された場合は、依然として有意な毒性を有することが予想される。したがって、両方の方法が患者に対して有意な毒性を運搬し、更に制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞の増殖を誘導して、ＮＫ細胞の短い持続性（平均２１日未満）につながる。

成功したパイロット試験では、ドナーの血液から単離された精製されたＮＫ細胞の輸注は安全であり、ＧＶＨＤなしでＡＭＬの完全寛解に至ることができることが示された。治療量に達するため、ＮＫ細胞は、高容量のＩＬ−２を毎日投与することによって、リンパ球枯渇患者においてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させた。しかし、リンパ球枯渇に必要な集中的な前処置レジメン及び本研究で使用した高容量のＩＬ−２は、有意な毒性及び長期入院をもたらし、更に多くの場合、ＮＫ細胞に対する低いｉｎ ｖｉｖｏでの増殖をもたらした。更に、ＩＬ−２の全身投与は、ＮＫ細胞の数及び機能を抑制する制御性Ｔ細胞の増殖につながるため、患者におけるＮＫ細胞の持続性及び効率を制限する。したがって、ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの増殖のための代替アプローチが必要である。

ＮＫ細胞免疫療法の有効性は、患者に投与された又はｉｎ ｖｉｖｏでの増殖による輸注後に到達したＮＫ細胞の用量に依存する。現在利用可能な技術は、患者における治療効果を達成するために必要なＮＫ細胞の増殖レベルを達成できないことによって制限される。より単純な臨床的増殖プロトコルの欠如は、ＮＫ細胞由来の免疫療法の進展及び広範な普及にとって大きな障壁である。現在のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖プロトコルは、高用量のサイトカインと、白血病由来のフィーダー／刺激細胞株で発現した活性化リガンドとの組み合わせを使用しており、ほとんどのセンターにおいて臨床設定への移行に著しい不利益をもたらし、直接的なｉｎ ｖｉｖｏでの増殖には適さない。本明細書に記載されるエクソソームを含む粒子技術の使用は、刺激細胞に対する必要性を排除するため、方法論を単純化し、直接的及び選択的なｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を可能にする。

いくつかのグループが、ＮＫ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖する方法を追求してきた。しかし、現在開発されているｅｘ ｖｉｖｏでの方法の大部分は、高濃度の様々なサイトカイン、主にＩＬ−２の存在下で、腫瘍細胞株及びＮＫ細胞の共培養系に依存している（Ｃｈｏ ａｎｄ Ｃａｍｐａｎａ ２００９；Ｓｕｃｋ ａｎｄ Ｋｏｈ ２０１０を参照）。ＮＫ細胞の増殖を引き起こすために使用した細胞には、照射した自家又は同種ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ（４−１ＢＢＬでトランスフェクトしたＫ５６２及び膜結合型ＩＬ−１５）、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ、並びにＥＢＶ−ＬＣＬが挙げられる（Ｈａｒａｄａ，Ｓａｉｊｏ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｉｍａｉ，Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｂｅｒｇ，Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｋａｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｓｉｅｇｌｅｒ，Ｍｅｙｅｒ−Ｍｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＮＫ細胞の増殖は、これらの細胞株（７〜２１日以内に３０〜１０，０００倍）のいくつかで有意であり得るが、フィーダー細胞の使用は、数百万ドルかかる現在のＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃＧＭＰ）施設の要件のため、ほとんどのセンターで、臨床設定への移行に対する著しい欠点をもたらしている（Ｃｈｏ ａｎｄ Ｃａｍｐａｎａ ２００９；Ｓｕｃｋ ａｎｄ Ｋｏｈ ２０１０を参照）。更に、フィーダー細胞の連続培養は高価であり、専任の人材のサポートが必要である。アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）は以前、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＡＣＴ）の形式で、細胞療法のための細胞の製造におけるサポートを提供していた。しかし、ＮＫ細胞は、冷凍保存中にその活性を失うように思われる（ＰＡＣＴワークショップのプレゼンテーション）。したがって、生産現場から移植センターへの増殖したＮＫ細胞の貯蔵及び輸送は、療法の適用を成功させる上で別の障害である。更なる懸念は、これらの形質転換細胞及び培養成分（例えば、ウシ胎児血清）から放出された、生きたフィーダー細胞及び／又は遺伝物質をレシピエント患者へ輸注する可能性である。

Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈは、抗体で被覆されたビーズを使用して活性化ＮＫ細胞受容体を架橋するｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖キットを導入した。しかし、この方法は、高濃度のＩＬ−２の使用を必要とする。実験室用途に有用である一方、高濃度のサイトカインを使用して培養したＮＫ細胞は、サイトカイン離脱のために輸注後急速なアポトーシスを受けるため、この方法は、臨床設定に移行することができない（Ｍｉｌｌｅｒ ２００９）。

ＰＢＭＣ内でのＮＫ細胞の増殖は、最初の５日間、高濃度のＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体による刺激が報告されている（Ｃａｒｌｅｎｓ，Ｇｉｌｌｊａｍ ｅｔ ａｌ．２００１；Ａｌｉｃｉ，Ｓｕｔｌｕ ｅｔ ａｌ．２００８）。全体的なＮＫ細胞の増殖は１０００倍に近かったが、ＮＫ細胞の大部分は、実際はＮＫ様Ｔ細胞であった（Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｓ ２０１０）。したがって、これらの方法の全てが臨床適用への移行に対して著しい困難をもたらし、直接的なｉｎ ｖｉｖｏでの増殖に使用可能な方法はない。

ＮＫ細胞の数を増加させるための方法
少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む、ＮＫ細胞の数を増加させるための方法が開示されており、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。

刺激性ペプチド
本明細書に開示される方法での使用に適した刺激性ペプチドには、ＮＫ細胞活性化剤（即ち、刺激性リガンド）、サイトカイン、又は接着分子が挙げられてもよいが、これらに限定されない。ＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドの例には、４１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７及び／又は他のホーミング受容体が挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、及びＩＬ−１８が挙げられるが、これらに限定されない。接着分子の例には、ＬＦＡ−１、ＭＩＣＡ、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、エクソソームは、刺激性ペプチドを運搬するために使用されるビヒクルである。刺激性ペプチドは、エクソソーム膜に存在し得る。刺激性ペプチドは膜結合である一方、他の治療薬又は診断薬は、原形質膜小胞の内部に輸送され得る。

刺激性ペプチドに結合した膜挿入ペプチド
少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む、ＮＫ細胞の数を増加させるための方法が開示されており、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物であり、１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、任意選択的に、１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合されてもよい。

膜挿入ペプチドは、膜への挿入を促進する分子であってもよい。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧのセグメントを含んでいてもよい。また、代替の膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含んでいてもよい。膜自己挿入ペプチドは、細胞膜内に挿入することで知られる任意のペプチドであってもよい。膜自己挿入ペプチドコンジュゲートの使用に応じて、特定の膜自己挿入ペプチドは、他よりも良好な選択であり得る。当業者は、どの膜自己挿入ペプチドが異なる状況下で理想的であるかを理解するであろう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用について、ｐＨＬＩＰ膜自己挿入ペプチドが適切であり得る。ｐＨＬＩＰ膜自己挿入ペプチドは、低ｐＨの条件下でのみ膜内に挿入される。したがって、ｐＨＬＩＰコンジュゲートは、正常な生理的条件下では細胞膜内に挿入されない。しかし、腫瘍環境への輸注の場合、腫瘍環境は正常な生理的条件よりも更に酸性であるため、ｐＨＬＩＰコンジュゲートを腫瘍細胞の細胞膜内に挿入することができる。腫瘍環境へのこの挿入は、腫瘍領域でのＮＫ細胞の活性化を可能にする。したがって、ｐＨＬＩＰを使用して、ランダムな細胞膜内への不必要な挿入を防止する。

膜挿入ペプチドは、様々な方法で１種又は２種以上の刺激性ペプチドに結合されてもよく、ペプチドを結合するための技術は、当該分野において既知である。刺激性ペプチドに結合した膜挿入ペプチドはまた、膜挿入ペプチドコンジュゲートと称され得る。いくつかの態様において、膜挿入ペプチドに結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質を含んでいてもよく、かかる融合タンパク質は、細菌細胞で生成され得る。特定の実施形態において、融合タンパク質は、リポソーム又は細胞膜に繋留するために、疎水性ペプチド、ＧＰＩ、又はヒトＦｃなどの親油性分子にコンジュゲート又は結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドで構成され得る（Ｈｕｎｔ，Ｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｋｕｅｎｇ，Ｌｅｂ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｐａｕｌｉｃｋ，Ｆｏｒｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｐａｕｌｉｃｋ，Ｗｉｓｅ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ，Ｓｅｇａｌａ ｅｔ ａｌ．２００７）。これらの融合タンパク質のｃＤＮＡベクターは、細菌（大腸菌）細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞での発現を可能にする発現プラスミドに連結され得る。特定の実施形態において、ｃＤＮＡベクターは、ＦＬＡＧタグ付き又はＨＩＳタグ付きであり得る。細菌細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるような、標準的な塩化カルシウムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトされ得る。細菌細胞はまた、ＬＢ培地で培養されてもよく、細胞は、フレンチプレスを使用して収集及び溶解することができる。対象となるタンパク質は、親和クロマトグラフィーによって可溶化液から精製され得る。パルミチン酸コンジュゲートタンパク質Ａ及び精製Ｆｃ融合タンパク質は、文献に記載されているように、これらを４℃で１：２（ｗ／ｗ）で混合することによってコンジュゲートされ得る（Ｋｉｍ ＆ Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９３ Ｊａｎ．１４；１５８（１）：５７〜６５及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７ Ｍａｒ．１；１７８（５）；３３０１〜３３０６を参照のこと）。コンジュゲートはその後、腫瘍内に直接輸注されてもよく、又はリポソームに組み込まれてもよい。

結合の種類及び結合方法は、当業者に周知である。本明細書で使用するとき、用語「結合」は、ペプチド又はタンパク質などの別の分子実体にコンジュゲート、接続、又はそうでない場合は連結している膜自己挿入ペプチドを指す。例えば、刺激性ペプチドに結合した膜挿入ペプチドは、融合タンパク質であり得、膜挿入ペプチドは、ジスルフィド結合を介して別のタンパク質に結合される。結合又はコンジュゲートは、膜自己挿入ペプチドとＮＫ細胞エフェクター剤との間に化学結合があることを意味し得る。

いくつかの態様において、１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、ｉｎ ｓｉｔｕでの自己組織化のために膜自己挿入ペプチド又はＧＰＩアンカーに結合され得る。例えば、４１−ＢＢＬ及びＩＬ−２１は、酸性条件下で細胞膜に自身を挿入するｐＨＬＩＰペプチドに結合されてもよいため、刺激性リガンドの腫瘍近傍の細胞への繋留を可能にする。刺激性ペプチド４１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、及び／又は他のホーミング受容体は、細菌細胞で生成するか、又は市販の供給源から購入してもよく、これらのタンパク質のｃＤＮＡベクターは、任意選択的に、細菌（大腸菌）細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞での発現を可能にするｐＴｒｉＥＸ発現プラスミドに連結され得る。ｃＤＮＡベクターは、ＦＬＡＧタグ又はＨＩＳタグの発現をコードしてもよい。細菌細胞は、標準的な塩化カルシウムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトすることができ、かつＬＢ培地で培養され得る。細胞は、フレンチプレスを使用して収集及び溶解することができ、対象となるタンパク質は、次いで、親和クロマトグラフィーによって可溶化液から精製され得る。

いくつかの実施形態において、ｐＨＬＩＰは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学を使用して固相ペプチド合成によって調製してもよく、生成物は、逆相クロマトグラフィーによってＣ１８カラムで精製され得る。ｐＨＬＩＰはその後、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミドなどの架橋剤と共にインキュベーションすることによって、刺激性ヒトタンパク質リガンドにコンジュゲートされ得る。数回の洗浄後、コンジュゲートしたｐＨＬＩＰタンパク質は、培地（例えば、生理食塩水）に再懸濁させ、腫瘍内に又は静脈内に輸注され得る。先行文献（Ｉｍａｉ，Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｌｉｕ，Ｂｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｋａｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｄｅｎｍａｎ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１２）及び実験結果で示された証拠に基づき、そのような修飾された腫瘍細胞の表面上における、ＮＫ細胞と、ＩＬ−２１及び４１−ＢＢＬなどの刺激性リガンドとの相互作用は、ｉｎ ｓｉｔｕでのＮＫ細胞の増殖を刺激して、腫瘍に対するこれらの細胞傷害反応を引き起こし得る。このタイプの刺激性アプローチは、酸性ｐＨ下でｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍細胞に挿入するＮＫ刺激性リガンドを、低用量のＩＬ−２単独で又はＮＫ細胞と共に患者の腹腔内空間に輸注することができる場合、卵巣癌などの固形腫瘍の治療に使用され得る（Ｇｅｌｌｅｒ，Ｃｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ＮＫ細胞などの高レベルのＦＣγＩＩＩ Ｒ（ＣＤ１６）を発現する細胞毒性リンパ球が、治療用抗体による癌治療の有効性にとって重要であるという強力な証拠がある（Ｋｕｔｅ，Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｒｅｉｍ，Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍａｍｅｓｓｉｅｒ，Ｓｙｌｖａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）。したがって、このアプローチは、治療用抗体と組み合わせて使用することもできる。

機能性核酸
本明細書には、ＮＫ細胞機能（例えば、ＮＫ細胞活性化）を修飾するための方法が開示されており、この方法は、ＮＫ細胞機能を調節する機能性核酸を送達することを含む。方法は、ＮＫ細胞を少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることによって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない機能性核酸をＮＫ細胞に送達することを含んでもよく、ＮＫ−刺激エクソソームには、機能性核酸が充填される。例えば、場合によっては、機能性核酸は、Ａ２ＡＲ、Ｐ２ＹＲ、又はこれらの組み合わせの発現レベルを調節することを意図している。

機能性核酸は、標的分子を結合すること又は特定の反応を触媒することなどの特定の機能を有する、核酸分子である。機能性核酸分子は、以下のカテゴリに分類することができるが、これらに限定するものではない。例えば、機能性核酸には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、及び外部ガイド配列が挙げられる。機能性核酸分子は、標的分子が持つ特定の活性の影響因子、阻害因子、修飾因子、及び刺激因子として作用することができ、あるいは機能性核酸分子は、任意の他の分子から独立してｄｅ ｎｏｖｏ活性を持つことができる。

機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は炭水化物鎖などの任意の高分子と相互作用することができる。したがって、機能性核酸は、ｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡと相互作用することができるか、又はポリペプチドと相互作用することができる。多くの場合、機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて、他の核酸と相互作用するように設計されている。他の状況では、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づいていないが、むしろ特異的認識が起こることを可能にする三次構造の形成に基づいている。

アンチセンス分子は、標準又は非標準塩基対合のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解による標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製のなどの、標的分子上で通常起こる処理機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計され得る。標的分子の最も到達可能な領域を見つけることによってアンチセンス効率を最適化するための多数の方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳ及びＤＥＰＣを使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選抜実験及びＤＮＡ修飾研究である。アンチセンス分子が、１０^−６、１０^−８、１０^−１０、１０^−１２以下の解離定数（Ｋ_ｄ）で標的分子を結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計及び使用に役立つ方法及び技術の代表的なサンプルは、米国特許第５，１３５，９１７号、同第５，２９４，５３３号、同第５，６２７，１５８号、同第５，６４１，７５４号、同第５，６９１，３１７号、同第５，７８０，６０７号、同第５，７８６，１３８号、同第５，８４９，９０３号、同第５，８５６，１０３号、同第５，９１９，７７２号、同第５，９５５，５９０号、同第５，９９０，０８８号、同第５，９９４，３２０号、同第５，９９８，６０２号、同第６，００５，０９５号、同第６，００７，９９５号、同第６，０１３，５２２号、同第６，０１７，８９８号、同第６，０１８，０４２号、同第６，０２５，１９８号、同第６，０３３，９１０号、同第６，０４０，２９６号、同第６，０４６，００４号、同第６，０４６，３１９号、及び同第６，０５７，４３７号に見出すことができる。

アプタマーは、好ましくは特定の方法で標的分子と相互作用する分子である。典型的にはアプタマーは、ステムループ又はＧカルテットなどの、規定された二次及び三次構造に折り畳まれる長さが１５〜５０塩基の範囲の小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小さな分子、並びに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大きな分子を結合し得る。アプタマーは、１０^−１２Ｍ未満の標的分子からのＫ_ｄと非常に強く結合することができる。アプタマーは、１０^−６、１０^−８、１０^−１０、又は１０^−１２未満のＫ_ｄで標的分子を結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子を結合することができる。例えば、分子上の単一位置でのみ異なる、標的分子と別の分子との間の結合親和性の差が１０，０００倍を超えるアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーが、バックグラウンド結合分子を持つＫ_ｄより、少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、又は１００，０００倍低い標的分子を持つＫ_ｄを有することが好ましい。例えばポリペプチドの比較を行う場合、バックグラウンド分子が異なるポリペプチドであることが好ましい。どのようにアプタマーを作製及び使用して、様々な異なる標的分子を結合するかの代表的な例は、米国特許第５，４７６，７６６号、同第５，５０３，９７８号、同第５，６３１，１４６号、同第５，７３１，４２４号、同第５，７８０，２２８号、同第５，７９２，６１３号、同第５，７９５，７２１号、同第５，８４６，７１３号、同第５，８５８，６６０号、同第５，８６１，２５４号、同第５，８６４，０２６号、同第５，８６９，６４１号、同第５，９５８，６９１号、同第６，００１，９８８号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０１３，４４３号、同第６，０２０，１３０号、同第６，０２８，１８６号、同第６，０３０，７７６号、及び同第６，０５１，６９８号に見出すことができる。

リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかの化学反応を触媒することが可能な核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒核酸である。リボザイムが、分子間反応を触媒することが好ましい。天然の系において見られるリボザイムに基づくヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼタイプの反応を触媒する、ハンマーヘッド型リボザイム（米国特許第５，３３４，７１１号、同第５，４３６，３３０号、同第５，６１６，４６６号、同第５，６３３，１３３号、同第５，６４６，０２０号、同第５，６５２，０９４号、同第５，７１２，３８４号、同第５，７７０，７１５号、同第５，８５６，４６３号、同第５，８６１，２８８号、同第５，８９１，６８３号、同第５，８９１，６８４号、同第５，９８５，６２１号、同第５，９８９，９０８号、同第５，９９８，１９３号、同第５，９９８，２０３号、Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｓｐｒｏａｔによる国際特許出願国際公開第９８５８０５８号、Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｓｐｒｏａｔによる同第９８５８０５７号、及びＬｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｓｐｒｏａｔによる同第９７１８３１２号）、ヘアピン型リボザイム（例えば、米国特許第５，６３１，１１５号、同第５，６４６，０３１号、同第５，６８３，９０２号、同第５，７１２，３８４号、同第５，８５６，１８８号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６９，３３９号、及び同第６，０２２，９６２号）、並びにテトラヒメナリボザイム（例えば、米国特許第５，５９５，８７３号、及び同第５，６５２，１０７号）などの、異なるタイプのリボザイムが数多くある。また、天然の系においては見出されないが、ｄｅ ｎｏｖｏでの特異的反応を触媒するように操作されるリボザイムが数多くある（例えば、米国特許第５，５８０，９６７号、同第５，６８８，６７０号、同第５，８０７，７１８号、及び同第５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を開裂し、更に好ましくはＲＮＡ基質を開裂する。リボザイムは典型的には、標的基質の認識及び結合、及びその後の開裂を通して、核酸基質を開裂する。この認識は主に、標準又は非標準塩基対の相互反応に基づいていることが多い。この特性は、標的基質の認識が標的基質配列に基づいているため、リボザイムを核酸の標的特異的開裂のための特に良好な候補にする。どのようにリボザイムを作製及び使用して、様々な異なる反応を触媒するかの代表的な例は、米国特許第５，６４６，０４２号、同第５，６９３，５３５号、同第５，７３１，２９５号、同第５，８１１，３００号、同第５，８３７，８５５号、同第５，８６９，２５３号、同第５，８７７，０２１号、同第５，８７７，０２２号、同第５，９７２，６９９号、同第５，９７２，７０４号、同第５，９８９，９０６号、及び同第６，０１７，７５６号に見出すことができる。

三重鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、三重鎖と称される構造が形成され、この構造では、ワトソンクリック及びフーグスティーン型塩基対合の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの三本の鎖が存在する。三重鎖分子は、高親和性及び高い特異性で標的領域を結合することができるため、好ましい。三重鎖形成分子が、１０^−６、１０^−８、１０^−１０、又は１０^−１２未満のＫ_ｄで標的分子を結合することが好ましい。どのように三重鎖形成分子を作製及び使用して、様々な異なる標的分子を結合するかの代表的な例は、米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６５０，３１６号、同第５，６８３，８７４号、同第５，６９３，７７３号、同第５，８３４，１８５号、同第５，８６９，２４６号、同第５，８７４，５６６、及び同第５，９６２，４２６号に見出すことができる。

外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子を結合する分子であり、この複合体は、標的分子を開裂するＲＮａｓｅ Ｐによって認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計され得る。ＲＮＡｓｅ Ｐは、細胞内での転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の処理に役立つ。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体が天然ｔＲＮＡ基質を模倣するように導くＥＧＳの使用により、細菌ＲＮＡｓｅ Ｐを、実質的に任意のＲＮＡ配列を開裂するように動員することができる。（Ｙａｌｅによる国際公開第９２／０３５６６号、及びＦｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：４０７〜４０９（１９９０））。

同様に、真核生物のＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐ誘導性ＲＮＡ開裂は、真核生物細胞内で所望の標的を開裂するために利用することができる。（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６〜８０１０（１９９２）；Ｙａｌｅによる国際公開第９３／２２４３４号；Ｙａｌｅによる同第９５／２４４８９号；Ｙｕａｎ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５９〜１６８（１９９５）、及びＣａｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７〜２６３１（１９９５））。どのようにＥＧＳ分子を作製及び使用して、様々な異なる標的分子の開裂を容易にするかの代表的な例は、米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，６２４，８２４号、同第５，６８３，８７３号、同第５，７２８，５２１号、同第５，８６９，２４８号、及び同第５，８７７，１６２号に見出すことができる。

遺伝子発現はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、非常に特異的な様式で効果的にサイレンシングされ得る。このサイレンシングは、元は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加で観察された（Ｆｉｒｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６〜１１；Ｎａｐｏｌｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９〜８９；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４〜５１）。ｄｓＲＮＡが細胞に入ると、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素、Ｄｉｃｅｒによって、３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを含む長さが、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２１〜２３ヌクレオチドに開裂される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８〜２００；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３〜６；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３〜６）。ＡＰＴ依存性工程において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に導く、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般的に知られているマルチサブユニットタンパク質複合体に組み入れられるようになる（Ｎｙｋａｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ，１０７：３０９〜２１）。ある時点で、ｓｉＲＮＡ二本鎖は巻き戻され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したままであり、エンドヌクレアーゼとエクソヌクレアーゼとの組み合わせによって相補的ｍＲＮＡ配列の分解を指示すると見られる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５６３〜７４）。しかし、ｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの効果若しくはこれらの使用は、いかなるタイプの機構にも限定されない。

短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それによって遺伝子発現を低減又は更には阻害し得る、二本鎖ＲＮＡである。一例において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡとの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡなどの相同ＲＮＡ分子の特異的分解を引き起こす。例えば、国際公開第０２／４４３２１号は、３’オーバーハング末端と塩基対合されると、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡの作製方法については、参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって生成したｓｉＲＮＡを模倣する合成の、短鎖二重鎖ＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞において達成され得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４ ４９８）（Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４７９：７９〜８２）。ｓｉＲＮＡは、化学的に又はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され得、あるいは、細胞内でｓｉＲＮＡへと処理される短鎖二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡは、一般的に、アルゴリズム及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者には、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、及びＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が挙げられる。ｓｉＲＮＡはまた、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔなどのキットを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され得る。

ベクターからのｓｉＲＮＡの生成は、短ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写を介して、より一般的に行われる。ｓｈＲＮＡを含むベクターの生成用キットが利用可能であり、例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミド及びレンチウイルスベクターである。本明細書には、本明細書に開示される炎症性メディエータの配列に基づいて、上述したように設計された任意のｓｈＲＮＡが開示される。

ＮＫ細胞
少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む、ＮＫ細胞の数を増加させるための方法が開示されており、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物であり、ＮＫ細胞は、未選択の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団内に存在する。

ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって規定される末梢血リンパ球のサブセットである（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ ２００７；Ｗｏａｎ ａｎｄ Ｒｅｄｄｙ ２００７）。ＮＫ細胞は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子が欠如している標的細胞を感知して死滅させる。受容体を活性化するＮＫ細胞には、とりわけ、自然細胞障害性受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６）と、レクチン様受容体ＮＫＧ２Ｄ及びＤＮＡＭ−１と、が挙げられる。これらのリガンドは、ストレス細胞、形質転換細胞、又は感染細胞で発現するが、正常細胞では発現せず、正常細胞に、ＮＫ細胞殺傷性に対する耐性を示させる（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｇａｓｓｅｒ，Ｏｒｓｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｌａｎｉｅｒ ２００５）。ＮＫ細胞の活性化は、キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、及び白血球Ｉｇ様受容体−１（ＬＩＲ−１）などの抑制性受容体を介して負に調節される。１つの抑制性受容体の関与は、標的溶解を防止するのに十分であり得る（Ｂｒｙｃｅｓｏｎ，Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９）。したがって、ＮＫ細胞は多くのストレス誘発性リガンドを発現するが、ＭＨＣクラスＩリガンドはほとんど発現しない細胞を効率的に標的化する。

ＮＫ細胞は、様々な異なる方法で、腫瘍細胞、ストレス細胞、及びウイルス感染細胞を効率的に破壊する。まず標的細胞を直接結合させ、これらの膜を透過させ、その後いくつかのアポトーシスタンパク質を開裂及び活性化するタンパク質を輸注することにより、標的細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）を開始する。また、ＮＫ細胞の表面は、腫瘍壊死要因（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）のための受容体などの受容体を、アポトーシスプログラムされた細胞死のための内部シグナルを活性化する標的細胞上で結合及び活性化し得るタンパク質リガンドを含む。刺激されると、ＮＫ細胞は、ウイルス及び腫瘍を阻害するだけでなく、他の免疫細胞へのシグナル侵襲も阻害する、ＩＮＦγ及びＴＮＦαなどのサイトカインも分泌する。ＮＫ細胞のこの広範かつ多様な抗癌活性は、医療分野にＮＫ細胞への大きな関心を持たせている。

ＮＫ細胞は、免疫系において顕著な役割を果たすため、ＮＫ細胞の数を増加させる能力は、少ない数のＮＫ細胞では不可能であったか、又は効果が低かった治療機会を提供する。

エクソソーム
本明細書に開示されるように、ＮＫ細胞の数を増加させるための方法は、少なくとも１つのＮＫ細胞を、少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む。本明細書で利用されるエクソソームは、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含み、このエクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。特定の実施形態において、エクソソームは、エクソソームの改善された形成又は解放のために操作される細胞株によって生成され、かかる細胞株には、細胞株Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ又は細胞株Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬが挙げられるが、これらに限定されない。エクソソームは、多くの異なるタイプの細胞によって分泌される天然ビヒクルであって、様々な体液中に見出される（Ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｎｄ ＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ＴＥＸｓ（ｔｕｍｏｕｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ）Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ ＴＬ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２０１３ Ｆｅｂ １；４１（１）：２４５〜５１）。エクソソームの分泌は、高度に調節されたプロセスによって行われ、生成される粒子は、３０〜１００ｎｍの大きさである。エクソソームは、脂質及びタンパク質からなり、特定のエクソソームに見られるタンパク質の同一性は、これらを生成した細胞に依存する。特定のエクソソームで見出されるタンパク質の同一性及び組成物は、どのようにエクソソームが他の細胞にシグナルを与え、影響を及ぼし、相互作用するのかを決定する。エクソソームは、免疫細胞及び腫瘍細胞を調節することが特徴付けられており、免疫細胞及び腫瘍細胞の生物活性を操作するために使用され得る。

より小さいサイズのエクソソームは、他のより大きいサイズの原形質膜粒子と比較して、エクソソームの生理学的障壁及び生体内分布によるエクソソームの拡散を増加させる可能性が高い。更に、より小さいサイズのエクソソームにより、エクソソームの静脈内注射が可能であり、環循系を介したＮＫ細胞の増殖及び生体内分布を改善し得る。

場合によっては、エクソソームは、直径３０〜１００ｎｍである。

エクソソームの使用
少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む、ＮＫ細胞の数を増加させるための方法が開示されており、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物であり、ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏでＮＫ−刺激エクソソームと接触する。ＮＫ細胞は、同種移植手順、半合致移植手順、又はｉｎ ｖｉｖｏ免疫療法手順で、ＮＫ−刺激エクソソームに接触され得る。いくつかの態様において、同種移植、半合致移植、又はｉｎ ｖｉｖｏ免疫療法におけるＮＫ−刺激エクソソームの使用は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさない。

治療方法
ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞を治療するための方法が開示されており、この方法は、接触させたＮＫ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含み、接触させたＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む方法によって生成され、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。いくつかの態様において、ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞は、ウイルスに感染している場合がある。ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞は、ＡＭＬ、乳癌、膀胱癌、結腸及び直腸癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌を含んでいる場合がある。

幹細胞移植後の再発のリスクを低減するための方法と、接触させたＮＫ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含む補助療法を提供するための方法と、が開示されており、接触させたＮＫ細胞は、少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含む方法によって生成され、エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。

ＮＫ細胞の数を増加させるために使用される増殖したＮＫ細胞、組成物、及び／又は方法は、ＮＫ細胞仲介溶解に影響されやすい癌の患者、及び造血幹細胞移植を受けた患者のための治療方法として使用され得る。ＮＫ細胞増殖組成物及び方法は、残存腫瘍細胞の増加したクリアランス及び／又は再発防止のための幹細胞移植後に、細胞毒性ＮＫ細胞の量を増加させるために使用され得る。ＮＫ細胞増殖組成物及び方法はまた、ウイルス感染患者の治療にも使用され得る。

ＮＫ細胞増殖組成物及び方法は、ＮＫ細胞輸注後の治療方法として使用することができ、ＮＫ細胞療法の有効性（即ち、寛解を達成した患者及び／又は寛解を維持している患者の数）を増加させるための細胞毒性ＮＫ細胞の数及びｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を増加させる。

ＮＫ細胞増殖組成物を含む又はこれを含まないＮＫ細胞は、リンパ腫、大腸癌、肺癌、結腸癌、頭頚部癌、及び乳癌を含むがこれらに限定されない様々な癌の治療のために治療用抗体と組み合わせて使用され、抗体医薬療法に反応し、寛解を達成及び／又は寛解を維持する患者の数を増加させるであろう。

ＮＫ細胞の増殖方法は、癌治療、ウイルス感染治療、ＮＫ細胞研究、多発性硬化症治療、免疫監視、及び移植片対宿主病治療にとって有益である。任意のＮＫ細胞関連障害は、ＮＫ細胞の増殖によって治療又は影響を受け得る。例えば、活性化したＴ細胞を増加させることで知られる多発性硬化症などの疾患は、開示される組成物で治療することができるが、これは、これらの組成物が、活性化したＴ細胞を標的化及び死滅させるＮＫ細胞の増殖を引き起こすためである。したがって、開示された組成物は、活性化したＴ細胞を減少させるために使用され得る。

エクソソームの生成方法
ＮＫ細胞−刺激エクソソームの生成方法が開示されており、この方法は、エクソソームの膜内に１種又は２種以上の刺激性ペプチドを包埋することを含む。刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、及び／又は他のホーミング受容体、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、及び／又は他のアダプタータンパク質を含んでいてもよい。刺激性ペプチドは、任意選択的に、１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合され得る。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧを含んでいてもよい。また、代替の膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含んでいてもよい。１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質を含んでいてもよい。いくつかの態様において、ＮＫ細胞−刺激エクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作された細胞株由来であり得、例えば、ＮＫ細胞−刺激エクソソームは、細胞株Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ由来であり得る。

エクソソームは、多くの異なるタイプの細胞によって分泌された天然ビヒクルであって、様々な体液中に見出される（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ ２０１３）。エクソソームは、脂質及びタンパク質からなり、特定のエクソソームに見られるタンパク質の同一性は、これらを生成した細胞に依存する。したがって、刺激性ペプチド及び／又は膜挿入ペプチドに結合した刺激性ペプチドを発現する細胞株は、エクソソームの膜に包埋された１種又は２種以上の刺激性ペプチドを有するエクソソームを生成し得る。

エクソソームは、当該分野で既知の任意の技術を使用して調製され得る。例えば、細胞によって分泌されたエクソソームは、濾過によって細胞培養培地から単離され得る（図１）。エクソソームを調製するための一般的なプロトコルが使用され得る。

癌の治療方法及びエクソソーム組成物
１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ−刺激エクソソームを含む有効量の組成物を投与することを含む、癌を治療するための方法が開示される。ＮＫ刺激エクソソームの使用は、ＮＫ刺激エクソソームを被験体に投与することを含んでいてもよい（図１）。いくつかの態様において、ＮＫ刺激エクソソームの使用は、接触させたＮＫ細胞の集団を得るために、ＮＫ刺激エクソソームを、ｅｘ ｖｉｖｏでＮＫ細胞に接触させることと、接触させたＮＫ細胞の集団を被験体に投与することと、を含み得る（図１）。

１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む組成物が開示される。１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、及び／又は他のホーミング受容体を含み得る。刺激性ペプチドは、任意選択的に、１種又は２種以上の膜挿入ペプチドに結合され得る。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧのセグメントを含み得る。あるいは、膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含んでいてもよい。膜挿入ペプチドに結合した１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質を含み得る。ＮＫ刺激エクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作された細胞株由来であり得る。ＮＫ刺激エクソソームは、細胞株Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ由来であり得る。いくつかの態様において、組成物は、医薬担体を更に含んでいてもよい。

１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む組成物で癌を治療することは、これらの組成物の存在下でのＮＫ細胞の数の増殖又は増加によって起こり得る。ＮＫ細胞の増殖は、より多くのＮＫ細胞が腫瘍細胞を標的化及び死滅させることを可能にするため、腫瘍細胞を減少させ、最終的に癌の治療又は再発防止につながる。

１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む本明細書に開示される組成物は、予防効果を提供し得る。ＮＫ細胞は、免疫監視を提供することで知られる。したがって、ＮＫ細胞の増殖をもたらす組成物を投与することは、より多くのＮＫ細胞が免疫監視を提供し、癌発生前に前癌性細胞を標的化及び死滅させることを可能にする。

いくつかの態様において、ＮＫ刺激エクソソームの使用は、ＮＫ刺激エクソソームの直接注射によってＮＫ刺激エクソソームを被験体に投与して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の増殖を引き起こすことを含み得る。

いくつかの態様において、ＮＫ刺激エクソソームの使用は、開示された組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで細胞集団に投与することと、その後それらの処理した細胞を被験体に投与することと、を含み得る。例えば、ＮＫ刺激エクソソームを含む組成物は、ドナーからアフェレーシスによって単離されたＰＢＭＣからのＮＫ細胞に投与することができ、接触させたＮＫ細胞は、同種移植手順又は半合致移植手順で患者に輸注され得る（図１）。組成物はまた、患者からアフェレーシスによって単離されたＰＢＭＣからのＮＫ細胞に投与することができ、接触させたＮＫ細胞は、患者に輸注され得る（図１）。

投与
開示された組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。いくつかの態様において、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの投与の組み合わせを含む。組成物は、薬学的に許容される担体でｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。当業者に周知であるように、用語「薬学的に許容される」には、生物学的に又はその他の点で望ましくない物質を含み、即ち、物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は物質が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、エクソソーム又は膜自己挿入ペプチドコンジュゲートと共に被験体に投与され得る。担体は、当業者に周知であるように、活性成分の分解を最小限にするため、及び被験体における任意の有害な副作用を最小限にするため、当然選択される。

本明細書に開示される組成物は、例えば、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、腫瘍内投与によって、経皮的に、体外に、局所的に投与されてもよく、これには、局所鼻腔内投与又は吸入による投与が含まれる。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方又は両方を通る鼻及び鼻孔への組成物の送達を含み、噴霧機構若しくは液滴機構による送達、又は原形質膜小胞のエアロゾル化による送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通して行われ得る。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接行われ得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の人種、年齢、体重及び全身状態、治療される疾患の重症度、使用される特定の組成物、組成物の投与様式などに依存して、被験体によって異なるであろう。適量は、本明細書の教示に鑑みて、通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。

医薬担体
本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用され得る。

好適な担体及びこれらの製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５に記載される。典型的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して、製剤等張性を与える。薬学的に許容される担体の例には、これらに限定されないが、生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは、約７〜約７．５である。更に、担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような徐放性製剤を含み、マトリックスは、フィルム、リポソーム又は微粒子などの成形品の形態である。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度によって、特定の担体が更に好ましいことは、当業者には明白であろう。

医薬担体は、当業者に既知である。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、及び生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的な担体である。組成物は、筋肉内又は皮下に投与され得る。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与されるであろう。

医薬組成物には、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などが含まれ得る。医薬組成物にはまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１種又は２種以上の有効成分が含まれ得る。

医薬組成物は、局所治療又は全身治療が望まれているかどうか、及び治療する領域に応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所的に（眼科的、経腟的、経直腸的、鼻腔内を含む）、経口的に、吸入により、又は非経口的に、例えば静脈内点滴、皮下、腹腔内、若しくは筋肉内注射によって行われ得る。開示された抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、又は経皮的に投与され得る。

非経口的投与の製剤は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。非水溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液又は懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ringer's dextrose）、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル（lactated Ringer's）、又は不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などを含む。防腐剤及び他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスとして存在し得る。

局所投与のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、スプレー、液体、及び粉末が挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末、又は油性基剤、増粘剤などが、必要又は望ましい場合がある。

経口投与のための組成物には、粉末又は顆粒、水若しくは非水性媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、小袋、又はタブレットが挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。

いくつかの組成物は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸類と、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸などの有機酸類と、の反応によって、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基と、モノ、ジ、トリアルキル並びにアリールアミン及び置換エタノールアミンなどの有機塩基類と、の反応によって形成される、薬学的に許容される酸又は塩基付加塩として、潜在的に投与され得る。

併用療法
癌、ウイルス感染、多発性硬化症、及び移植片対宿主病の治療方法が開示されており、これらの方法は、開示された組成物のうち１つと、治療される疾病又は障害の既知の治療と、を組み合わせて被験体に投与することを含む。例えば、癌の治療方法が開示されており、この方法は、１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む有効量の組成物と、これらに限定されないが、化学療法、免疫療法、放射線療法、又は疼痛療法などの既知の癌治療と、を組み合わせて投与することを含む。

免疫療法には、２つの異なる種類があり、受動免疫療法は、免疫系の成分を使用して、必ずしも患者内の免疫応答を開始させることなく、癌細胞に対する標的細胞傷害活性を指向する一方、能動免疫療法は、内在性免疫応答を積極的に引き起こす。受動的な計画には、特異的抗原に応答するＢ細胞によって生成されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用が含まれる。１９７０年代のハイブリドーマ技術の開発及び腫瘍特異抗原の同定は、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的化することができるｍＡｂの医薬開発を可能にした。これまでのところ、ｍＡｂは、免疫療法の最大の成功事例であり、２０１２年に最もよく売れた抗癌剤の上位３位はｍＡｂであった。リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）はそのうちの１つであり、これは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性腫瘍の表面上で高度に発現されるＣＤ２０タンパク質に結合する。リツキシマブは、化学療法と組み合わせた、ＮＨＬ及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療のための使用がＦＤＡによって承認されている。他の重要なｍＡｂは、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、これは、ＨＥＲ２の発現を標的化することによって、ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）−陽性乳癌の治療を変革した。

最適な「キラー」ＣＤ８Ｔ細胞応答を生成するためには、Ｔ細胞受容体活性化に加えて同時刺激も必要であり、これらは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む、腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーの連結を介して提供され得る。ＯＸ４０は、活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０ｍＡｂによる治療が、Ｔ細胞の分化及び細胞溶解機能を増強して、様々な腫瘍に対して抗腫瘍免疫を高めるため、特に興味深い。

いくつかの実施形態において、開示されたワクチンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの、養子免疫療法（ＡＣＴ）と組み合わせて使用される。

用語「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」は、血流を離れて腫瘍内に流入した白血球を指す。Ｔ細胞などの、腫瘍浸潤リンパ球を含むリンパ球の増殖は、当該技術分野において周知であるように、多数の方法のいずれかによって達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、フィーダーリンパ球及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、又はこれらの組み合わせの存在下で、非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して急速に増殖され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、マウスモノクロナール抗ＣＤ３抗体である、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３を含み得る（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ（Ｒ）（Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．）又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）。あるいは、Ｔ細胞は、約２００〜４００Ｉｌｌ／ｍＬ、例えば３００ｌＵ／ｍＬのＩＬ−２又はＩＬ−１５（ＩＬ−２が好ましい）などのＴ細胞増殖因子の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１種又は２種以上の抗原（エピトープなどの、その抗原性部分、又は癌細胞を含み、これらは例えば、およそ０．３μＭのＭＡＲＴ−１：２６〜３５（２７Ｌ）又はｇｐ１００：２０９〜２１７（２１０Ｍ）で、ヒト白血球型抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドなどのベクターから任意選択的に発現させることができる）で刺激することによって急速に増殖され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発したＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌と同じ抗原で再刺激することによって急速に発現する。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、照射された自己リンパ球で、又は照射されたＨＬＡ−Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ−２で、再刺激され得る。増殖したＴＩＬの特異的腫瘍反応性は、当該分野において周知の任意の方法で試験することができ、例えば、腫瘍細胞との共培養後にサイトカイン放出（例えば、インターフェロンガンマ）を測定することによって試験され得る。一実施形態において、自己ＡＣＴ法は、細胞の急速な増殖前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の培養ＴＩＬを濃縮することを含む。ＩＬ−２でのＴＩＬの培養後、Ｔ細胞を、例えば、（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ＜ｐｌｕｓ＞ＣＤ８マイクロビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いる）ＣＤ８マイクロビーズ分離を用いて、ＣＤ４＋細胞について枯渇させ、ＣＤ８＋細胞について濃縮する。いくつかの実施形態において、自己Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進するＴ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞と同時に、又は自己Ｔ細胞に続いて、哺乳動物に投与される。Ｔ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進する任意の好適な増殖因子であり得る。好適なＴ細胞増殖因子の例には、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−２１が挙げられ、これらは単独で使用するか、又はＩＬ−２及びＩＬ−７、ＩＬ−２及びＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５、若しくはＩＬ−１２及びＩＬ２などの様々な組み合わせで使用することができる。

多くの抗癌剤もまた、本発明の方法及び組成物との組み合わせのために利用可能である。以下は、放射線治療と併用され得る抗癌（抗悪性腫瘍）剤の非包括的なリストである。アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼルシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロミチン塩酸塩、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール（Erbulozole）、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エチオダイズド油Ｉ １３１、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン（Flurocitabine）、ホスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、金（Ａｕ）１９８、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、リュープロリド酢酸塩、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン硫酸塩、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、塩化ストロンチウムＳｒ ８９、スロフェヌル、タリソマイシン、タキサン、タキソイド、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン塩酸塩、トレミフェンクエン酸塩、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩。

いくつかの態様において、癌治療薬及びＮＫ刺激エクソソームは、同じ組成物中で調製され得る。いくつかの態様において、癌治療薬及びＮＫ−刺激エクソソームは、異なる組成物中で調製され得る。

１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームと、癌治療薬と、を含む組成物は、同時に又は異なる時間に投与され得る。いくつかの態様において、１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームは、治療される疾患又は障害の既知の治療薬の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、若しくは３１日前又は後に投与される。いくつかの態様において、１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームは、治療される疾患又は障害の既知の治療薬の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２カ月前又は後に投与される。

装置
１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む装置が開示される。例えば、アフェレーシス中に使用される容器は、１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含み得る。したがって、アフェレーシスの間、容器を通過する細胞は、ＮＫ刺激エクソソームとインキュベーションするか、又はこれと接触させた状態で配置することができ、ＮＫ細胞の刺激及び最終的にはＮＫ細胞の増殖を可能にする。

キット
上述した物質及び他の物質は、開示された方法の実施、又はその実施を助けるために有用なキットとして、任意の適切な組み合わせで共に梱包することができる。与えられたキットの中のキットの成分が、開示された方法で共に使用するように設計及び適合される場合、有用である。

開示されたキットはまた、刺激性ペプチドを含み得る。キットは、ＮＫ刺激エクソソームを調製するための成分を更に含み得る。

定義
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含することに留意が必要である。したがって、例えば、「エクソソーム（an exosome）」への言及は、複数のかかるエクソソームを含み、「刺激性ペプチド（the stimulatory peptide）」への言及は、１種又は２種以上の刺激性ペプチド及び当業者に周知のその等価物への言及である。

「エクソソーム」は、生きた細胞によって生成又は分泌された膜小胞を指す。この用語は、遊離脂質成分由来の合成リポソーム又は破壊した細胞脂質膜を処理することによって形成した原形質膜小胞を含まない。この用語はまた、微小胞、エピディディモソーム（epididimosome）、アルゴソーム、エクソソーム様小胞、プロミニノソーム、デックス、テックス、アーキオソーム（archeosome）、及びオンコソームを含むが、それは、これらが細胞によって生成又は分泌される場合に限る。いくつかの実施形態において、小胞は、多胞体が原形質膜と融合すると、細胞から放出される。場合によっては、小胞は、原形質膜から直接放出される。

「ＮＫ−刺激エクソソーム」又は「ＮＫ細胞−刺激エクソソーム」又は「ＮＫ刺激エクソソーム」は、ＮＫ細胞の生成若しくはＮＫ細胞の数の増加を刺激することが可能なエクソソーム、及び／又は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性によって溶解される標的細胞へのホーミング／標的化を強化することを含むが、これに限定されない、ＮＫ細胞活性を強化することが可能なエクソソームを指す。「ＮＫ−刺激エクソソーム」又は「ＮＫ細胞−刺激エクソソーム」又は「ＮＫ刺激エクソソーム」は、１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含み得る。

「原形質膜小胞」は、細胞からの原形質膜の調製物又は人工的に作製した原形質膜若しくはリポソームを指す。

「膜挿入ペプチド」は、細胞膜に挿入又は繋留することが可能なペプチドである。

「刺激性ペプチド」は、ＮＫ細胞の表面に存在する活性化受容体に結合する刺激性リガンドを指す。刺激性ペプチドはまた、ＮＫ細胞の増殖、刺激、活性化、又はＮＫ細胞への接着を引き起こす薬剤を指す。刺激性ペプチドは、サイトカイン、接着分子、又はＮＫ細胞活性化剤であり得る。「調節」又は「調節すること」は、本明細書で使用するとき、増加又は減少を指す。調節することは、正常な機能と比較して任意の差につながる。例えば、免疫系を調節することは、免疫細胞を増加又は減少させることを指す。

「任意選択的」又は「任意選択的に」は、引き続いて記載された事象、状況、又は物質が、存在してもしなくてもよいことと、説明が、事象、状況、又は物質が発生若しくは存在する場合の例、及びそれらが発生若しくは存在しない場合の例を含むことと、を意味する。

「接触させること」は、本明細書で使用するとき、実体が互いに影響を与え得るように、１つ又は２つ以上の実体を近接させることを意味する。「接触させること」は、物理的接触を含んでもよいし、含まなくてもよい。「接触させる」、「接触させた」、「接触させること」、及びこれらの変形は、直接的又は間接的な相互作用を介して曝露され、影響を与えることを更に含み、その効果は、細胞間又は分子相互作用を含むがこれらに限定されない相互作用によって媒介されてもされなくてもよく、これと協調してもしなくてもよく、あるいは、これの結果であってもなくてもよい。

本明細書で使用するとき、用語「被験体」は、開示された組成物を、例えば、実験、診断、及び／又は治療目的で投与することができる任意の生物を指す。典型的な被験体には、動物（例えば、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物、鳥類、猫、犬、羊、山羊、牛、馬、及び豚などの家庭内動物又は家畜、ネズミ、ラット、及びモルモットなどの実験動物、ウサギ、魚、爬虫類、動物園及び野生の動物）が挙げられる。典型的に、「被験体」は、ヒト及び霊長類などの哺乳動物を含む動物などである。被験体はまた、細胞又は細胞株を指し得る。

本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表されてもよい。また、そのような範囲が表されている場合、文脈上特に指示がない限り、１つの特定の値から及び／又は他の特定の値までの範囲が特に考慮され、開示されると考えられる。同様に、値が近似値として表される場合、先行する「約」の使用によって、特定の値は、文脈上別段の指示がない限り、開示されるべきと考えられる別の具体的に考慮される実施形態を形成することが理解されよう。文脈上別段の指示がない限り、範囲のそれぞれの端点が、他の端点に関して及び他の端点とは独立して両方とも有意であると更に理解されるであろう。最後に、明示的に開示された範囲内に含まれる個々の値及び部分的範囲の値の全ても具体的に企図され、文脈上別段の指示がない限り、開示されると考えるべきであることを理解されたい。特定の場合において、これらの実施形態のいくつか又は全てが明示的に開示されているかどうかにかかわらず、上記は適用される。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示された方法及び組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似している又は同等の任意の方法及び物質が、本発明の方法及び組成物の実施又は試験において使用され得るが、特に有用な方法、装置、及び物質は、記載されるとおりである。本明細書に引用した論文及びそれらが引用されている資料は、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行発明の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものとして解釈されるべきではない。いかなる参考文献も先行技術を構成するとは認められない。参考文献の議論では、著者の主張が述べられており、出願人は、引用した文献の正確性及び適切性に異議申し立てする権利を留保している。本明細書において多数の論文が参照されているが、そのような参考文献は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における一般的な知識の一部をなすことを認めるものではないことは明らかである。

本明細書の説明及び「特許請求の範囲」の全体を通して、単語「含む（comprise）」及び本単語の変化形（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）は、「含むが、これらに限定されない」を意味しており、例えば、他の添加剤、構成成分、整数又は工程を除外することを意図するものではない。特に、１つ若しくは２つ以上の工程又は操作を含むと述べられた方法では、各工程が、（工程が、「からなる」などの制限用語を含まない限り）列挙されたものを含むことが具体的に企図されており、これは、各工程が、例えば、工程に列挙されていない他の添加剤、成分、整数、又は工程を除外することを意図するものではない。

開示された方法及び組成物のために使用され得る、これらと併用して使用され得る、これらを調製するために使用され得る、又はこれらの生成物である、物質、組成物、及び化合物が開示される。これら及び他の物質が本明細書で開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることを理解されたい。例えば、膜自己挿入ペプチドコンジュゲートが開示及び議論されており、膜自己挿入ペプチドコンジュゲートを含む多数の分子に対してなされる多数の修飾が議論されている場合、膜自己挿入ペプチドコンジュゲートと可能な修飾との組み合わせ及び置換はいずれも全て、特にそれとは反対の指示がない限り、具体的に企図される。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラスが開示されており、同様に分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラス及び分子Ａ〜Ｄの組み合わせの例が開示されている場合、更にそれぞれが個々に列挙されていない場合、それぞれが個々に及び集合的に考慮される。したがって、本例は、Ａ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜Ｅ、及びＣ〜Ｆの組み合わせのそれぞれが具体的に企図されており、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びにＡ〜Ｄの例示的な組み合わせの開示から開示されると考えられるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも、具体的に考慮及び開示される。したがって、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、及びＣ〜Ｅの下位群が具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びにＡ〜Ｄの例示的な組み合わせの開示から開示されると考えられるべきである。この概念は、本出願の全ての態様に適用され、開示された組成物の作製及び使用方法における工程を含むが、これに限定されない。したがって、実行され得る様々な追加工程がある場合、これらの追加工程のそれぞれは、開示された方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせと共に実行することができ、それぞれのかかる組み合わせは具体的に企図されており、開示されると考えられる。

実施例１：粗製エクソソームの調製によるＮＫ細胞の増殖
結果
本明細書において実証するように、ＮＫ細胞の増殖は、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ刺激細胞の培養由来のエクソソームを使用することによって発生し得る。これらの細胞は、ＮＫ細胞を非常に強く増殖し、培養開始前に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）混合物からＮＫ細胞を単離する必要がないと報告されているため、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬの培養を、エクソソームの単離のために選択した。更に、刺激性リガンド４１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ２１の存在は、抗体染色によって容易に追跡して、フィーダー細胞上でのこれらの分子の発現及び単離したエクソソームでのこれらの分子の存在を確認することができる。

本実験は、刺激細胞の培養由来のエクソソームが、刺激細胞と同様の方法でＮＫ細胞の増殖を支持したかどうかを試験するために行った。ＰＢＭＣを５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の培養に曝露し、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ小胞の培養培地から単離した粗製エクソソームの濃度を２４日間にわたって減少させたとき、ＰＢＭＣ混合物中のＮＫ細胞内容物が増加した（図４）。エクソソームの濃度は、エクソソームに包埋されたタンパク質の濃度によって示される。粗製エクソソームの調製物は、エクソソームのより高い濃度で培養の増殖を阻害する、培養由来の特定の物質を含む可能性が高い。しかし、粗製エクソソームの調製は、希釈したときに、より効果的であった。使用したエクソソームの希釈濃度（５０μｇ／ｍＬ）では、ＮＫ細胞のおよそ２４０倍の増殖が観察され、ＮＫ細胞の割合は、７０％以上増加した。したがって、この実験は、ＮＫ細胞が、フィーダー細胞を含まない刺激性リガンドを包埋したエクソソームを使用して、ＰＢＭＣ混合物内で選択的に増殖され得ることを示す。

材料及び方法
細胞株Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ及びＫ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ（Ｋ５６２−ｃｌｏｎｅ９．ｍｂＩＬ２１）はそれぞれ、Ｄｒ．Ｄａｒｉｏ Ｃａｍｐａｎａ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）及びＤｒ．Ｄｅａｎ Ｌｅｅ（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ）から取得した。使用したＫ５６２細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。粗製エクソソームを刺激するＮＫ細胞の調製は、次のように行った。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で培養し、培養を１Ｌまでスケールアップした。スケールアップ後、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ培養を、２マイクロモルのモネシンで処理した。培地を１０Ｎ（１，０００×ｇ）での遠心分離によって細胞培養から取り出し、細胞をペレット化した。取り出した培地は、０．４５μｍのフィルタを使用して濾過し、その後１００ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用して濃縮した。ＢＣＡアッセイを使用して、エクソソーム及び培地に包埋されたタンパク質の、結合した見掛けのタンパク質濃度を決定した。

Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配によって血液から単離したＰＢＭＣは、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で補充したＳＣＧＭ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏ培地で増殖し、エクソソームの濃度を低下させた。細胞は、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気において３７℃に維持した。５日目から、培地の半分を新鮮な培地と置換することによって、培養培地を１日おきに交換し、培養培地の置換によって除去したエクソソームを置換した。細胞は１日おきに数え、培養内容物を確認した。

実施例２：エクソソームの特徴付け
ＮＫ細胞刺激エクソソームを、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離した。細胞を、およそ１×１０^６細胞／ｍＬの密度まで培養し、洗浄し、無血清ＲＰＭＩで再懸濁し、２μＭのモネンシンで処理した。細胞を、１０分間１０Ｎ（１０００×ｇ）で遠心分離することによって除去し、その後０．２２μｍのＰＥＳ膜を通して濾過した。濾過した培地はその後、１００，０００ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用して限外濾過することによって濃縮した。

図２Ａ〜図２Ｄは、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームの特徴付けを示す。エクソソームは、ＰＢＳ中で再懸濁し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたビデオ顕微鏡法のナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）によって特徴付けした。ＮＴＡは、光散乱強度及び拡散速度論の分析に基づいて粒度を決定する。単一フレームの光散乱画像（図２Ａ）及び粒度分布のビニングされたヒストグラム（図２Ｂ）が示されている。ＩＬ−２１の存在は、抗−ＩＬ２１抗体を用いてウエスタンブロット解析によって免疫化学的に確認した（図２Ｃ）。抗ＩＬ−２１抗体結合金ナノ粒子（ＧＮＰ）を使用する解析（図２Ｄ）は、アイソタイプ対照抗体と結合したＧＮＰの増加がないのと比較して、抗ＩＬ−２１抗体結合ＧＮＰで動的光散乱強度の経時的な増加が観察される、エクソソームサンプルを持つＩＬ−２１の存在を示す。

図３Ａ及び３Ｂは、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームが、未選択のＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞の特異的な増殖を刺激することを示す。初期濃度が１００，０００ＮＫ細胞／ｍＬの未選択のＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳで補充したＳＣＧＭ培地において、総タンパク質が３５ｎｇ／ｍＬのＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培地から単離したエクソソームと共に培養した。初期の遅延後、ＮＫ細胞は、２０日間にわたり平均２７０倍に指数関数的に増殖し（図３Ａ）、総リンパ球の相対存在量が７４％に増加した（図３Ｂ）。培養は、エクソソームを含む新鮮な培地で、１日おきに再懸濁した。遺伝子導入により発現されるｍｂＩＬ−２１及び４−１ＢＢＬを有さない通常の非形質転換Ｋ５６２の培養から単離したエクソソームは、ＮＫ細胞の増殖を誘導しなかった。全ての培養は二通りに増殖し、マーカーは、標準偏差を表す誤差バーを持つ平均を表す。

エクソソームで増殖したＮＫ細胞を、Ｋ５６２ ＣＭＬ腫瘍細胞に対する細胞毒性について分析した。Ｋ５６２細胞は、ＴＦＬ４色素で前標識した。標的腫瘍細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で２時間にわたり、示されたＥ：Ｔ比で、ＮＫ細胞と０．５×１０^６Ｋ５６２細胞／ｍＬで共培養した。その後細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣを含むＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ標識緩衝剤中で遠心分離及び再懸濁し、４℃で１５分間インキュベーションした。標識細胞は、２５０μＬに希釈し、Ａｃｃｕｒｉ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のフローサイトメトリーによって分析した。図４は、エクソソームで刺激され増殖したＮＫ細胞が、Ｋ５６２細胞に対して細胞毒性であることを示す。未選択のＰＢＭＣを、３５ｎｇ／ｍＬの総タンパク質でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌ細胞の培養から単離したエクソソームで培養し、Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性を分析するために使用した。比較のため、ＮＫ細胞はまた、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌフィーダー細胞及びＰＭ２１−粒子（２００μｇ／ｍＬ）で増殖した。エクソソームで増殖したＮＫ細胞（Ｅｘ２１−ＮＫ細胞●）の細胞毒性は、フィーダー細胞で増殖したＮＫ細胞（ＦＣ２１−ＮＫ細胞▲）又はＩＬ−２１結合原形質膜粒子で増殖したＮＫ細胞（ＰＭ２１−ＮＫ細胞■）と比較して、わずかに低い。

ＰＢＭＣとＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌフィーダー細胞との共培養中でのエクソソームの存在は、ビデオ顕微鏡法によって確認した。図５Ａ〜図５Ｅは、ＰＢＭＣを持つフィーダー細胞（１００，０００ＮＫ細胞／ｍＬ）として、かつ１０倍過剰のフィーダー細胞として培養内でＫ５６２−ｍｂ２１−４１ｂｂｌによって生成され、その後生きた細胞の画像形成段階を備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙシステムの１０倍の対物レンズにより、１８時間にわたって画像化された、エクソソームを示す。数分〜約１時間後の間（図５Ａ）、ＡＦ６４７標識の癒着を観察する。数時間後（図５Ｂ）、細胞内エンドソーム及び多小胞体の形成が観察される。その後、無細胞エクソソームが観察される（図５Ｃ及び図５Ｄ）。ライブ画像化した共培養からのサンプルを得て抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６で染色し、蛍光共焦点顕微鏡法によって画像化した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞は、ＡＦ６４７標識を摂取又はその後結合したが、Ｔ細胞は、優先的に摂取又は結合を行わない。示されているよりも広い領域が統計的妥当性について検査され、Ｚ軸に沿った１０個のスライスが画像化され、細胞内及び細胞外事象を識別した。

開示された方法及び組成物は、変化し得るため、記載された特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことが理解されよう。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するための目的のものにすぎず、添付の「特許請求の範囲」によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解するべきである。

当業者は、本明細書に記載された方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを用いて、認識するか又は確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。

Claims (35)

1. ＮＫ細胞の数を増加させるための方法であって、
   少なくとも１つのＮＫ細胞を、エクソソーム膜に存在する１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含む少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含み、該エクソソームは、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である、方法。
2. 前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、膜挿入ペプチドに結合される、請求項１に記載の方法。
4. 前記膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つ、膜挿入が可能な融合ペプチドを含み、前記融合ペプチドは、ＩＧ４、ＣＤ４、又はこれらの組み合わせのセグメントを含む、請求項３に記載の方法。
5. 膜挿入ペプチドに結合した前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質である、請求項３に記載の方法。
6. 前記膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記ＮＫ細胞は、未選択の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団に存在する、請求項１に記載の方法。
8. 前記エクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作される細胞株によって生成される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏで前記ＮＫ−刺激エクソソームと接触している、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＮＫ細胞は、硬膜外腔内で、腹腔内、皮下、又は静脈内においてｉｎ ｖｉｖｏで増殖する、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＮＫ細胞は、同種移植手順、半合致移植手順、又はｉｎ ｖｉｖｏ免疫療法手順で前記ＮＫ−刺激エクソソームと接触する、請求項９に記載の方法。
12. 同種移植、半合致移植、又はｉｎ ｖｉｖｏ免疫療法におけるＮＫ−刺激エクソソームの使用は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさない、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１の方法に従って接触させたＮＫ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含む、ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞を処理するための方法。
14. 前記ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞は、ウイルス感染している、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＮＫ仲介溶解に影響されやすい細胞には、ＡＭＬ、乳癌、膀胱癌、結腸及び直腸癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌を含む、請求項１３に記載の方法。
16. 請求項１の方法に従って接触させたＮＫ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含む、幹細胞移植後の再発のリスクを低減するための方法。
17. エクソソームの膜内に１種又は２種以上の刺激性ペプチドを包埋することを含む、ＮＫ細胞−刺激エクソソームの生成方法。
18. 前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、膜挿入ペプチドに結合される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つＣＤ４又はＩｇＧを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 膜挿入ペプチドに結合した前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
22. 前記膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含む、請求項１９に記載の方法。
23. 前記ＮＫ細胞−刺激エクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作される細胞株由来である、請求項１７に記載の方法。
24. １種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ−刺激エクソソームを含む有効量の組成物を投与することを含む、癌を治療するための方法。
25. （ａ）１種又は２種以上の刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを、ｅｘ ｖｉｖｏでＮＫ細胞に接触させて、接触させたＮＫ細胞の集団を得ることと、（ｂ）該接触させたＮＫ細胞の集団を被験体に投与することと、を含む、癌を治療するための方法。
26. ４−１ＢＢＬ及びＩＬ−２１刺激性ペプチドを含むＮＫ刺激エクソソームを含む、組成物。
27. ４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される１種又は２種以上の刺激性ペプチドを更に含む、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、膜挿入ペプチドに結合される、請求項２６に記載の組成物。
29. 前記膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対する親和性を持つ、ＣＤ４、ＩｇＧ、又はこれらの組み合わせのセグメントを含む、請求項２８に記載の組成物。
30. 膜挿入ペプチドに結合した前記１種又は２種以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡでコードした融合タンパク質である、請求項２８に記載の組成物。
31. 前記膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通型Ｔ細胞受容体、又はｐＨＬＩＰを含む、請求項２８に記載の組成物。
32. 前記ＮＫ刺激エクソソームは、エクソソームの発現を改善するために操作される細胞株由来である、請求項２６に記載の組成物。
33. 医薬担体を更に含む、請求項２６に記載の組成物。
34. ＮＫ細胞機能を修飾するための方法であって、少なくとも１つのＮＫ細胞を、少なくとも１つのＮＫ−刺激エクソソームと接触させることを含み、該ＮＫ−刺激エクソソームには、ＮＫ細胞機能を修飾する機能性核酸が充填されている、方法。
35. 前記機能性核酸は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の方法。