KR20210138592A - 면역 세포 효력을 검정하기 위한 자극제의 용도 - Google Patents
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Abstract
면역 세포의 효력을 결정하는 방법이 기재된다. 상기 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, 파이토헤마글루티닌(PHA))와 접촉시키는 단계 및 상기 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 면역 세포 효력을 검정하기 위한 키트가 또한 기재된다. 효력 검정은 새로운 생물 작용제, 예컨대, 면역요법 세포에 대한 FDA 요건을 충족시키는 데 중요하다. 면역요법 치료로서 강력한 면역 세포를 사용하는 방법이 기재된다.
Description
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 제62/805,349호(출원일: 2019년 2월 14일)의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 발명은 면역요법, 보다 특별하게는 면역 세포의 효과기 기능을 시험하는 것에 관한 것이다.
면역요법은 면역 체계의 활성화 또는 억제에 의해서 질환을 치료하는 것이다. 면역 체계로부터 유래된 세포는 면역 기능성 및 특징을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 최근, 면역요법은 특히 다양한 형태의 암을 치료할 가능성으로 인해서 연구원, 의사 및 제약 회사에 상당한 관심이 되어 왔다. 면역조절 치료요법은 보통 미생물 질환을 치료하는 경우 내성을 생성시킬 가능성이 적은 것을 비롯하여 기존의 약물보다 더 적은 부작용을 갖는다.
종래의 암 치료는 화학요법, 수술 및/또는 방사선을 사용하여 암 세포를 사멸시키거나 제거하는 것에 초점을 맞춘다. 그러나, 치료용 면역 세포 분야는 암을 치료하거나, 예방하거나, 암의 발병을 지연시키기 위해서 종래의 치료와 함께 또는 일부 경우에는 종래의 치료 대신에 사용될 수 있다. 면역 효과기 세포, 예컨대, 림프구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 세포독성 T 림프구(CTL) 등은 자연적으로 함께 작용하여 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 비정상적인 항원을 표적으로 함으로써 신체를 암에 대해서 방어한다. 최근의 암 치료법 개발은 환자의 면역 체계가 종양을 공격하여 파괴하도록 유도(directing)하는 것에 초점을 맞추고 있다. 다양한 전략이 사용 중이거나 연구 및 시험 중이다.
입양 세포 전달(adoptive cell transfer: ACT)은 환자에게 세포를 전달하는 것이며, 폐, 흑색종 및 다른 암에 대해서 가능한 것으로 밝혀져 있다. 이러한 세포는 환자(자가)로부터 유래되거나 또 다른 개체(동종이계)로부터 유래된다. 동종이계 요법은 세포를 제공받은 환자로부터의 공여자 분리물로부터 단리 및 확장된 세포를 포함한다. 대안적으로, 입양 세포 전달은 추후 수혈을 위해서 시험관내에서 자가의 추출된 세포를 배양하고, 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 면역 향상 요법은 대상체 자신의 말초 혈액-유래 자연 살해 세포, 세포독성 T 림프구, 상피 세포 및 다른 관련 면역 세포를 추출하고, 시험관내에서 이러한 세포를 확장시키고, 이어서 이러한 세포를 대상체의 신체에 재주입하는 것을 포함한다.
일부 요법에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 동일한 환자에게 복귀되기 전에 유전자 변형되고, 시험관내에서 확장된다. 키메라 항원 수용체 T 세포 요법(CAR-T)은 대상체로부터 T 세포를 수거하고, 이어서 T 세포에 세포 수용체(TCR) 유전자의 카피를 함유하는 레트로바이러스를 감염시키는 것을 포함한다. TCR 유전자는 종양 항원(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 CAR)을 인식하도록 전문화된다. 바이러스는 수용체를 T 세포의 게놈에 통합한다. 세포는 비특이적으로 확장되고/되거나 자극된다. 그 다음 세포는 재주입되고, 종양 세포에 대한 면역 반응을 생성시킨다.
첫 번째 CAR-T 요법의 승인 및 다중 임상 시험에 참여한 다수의 상업적인 회사로 인해서, 이 분야는 상업적으로 활기를 띄고 있으며, 면역요법에 대한 유망한 미래인 것으로 밝혀졌다. 하루 걸러 새로운 임상 시험이 발달하는 분야에서, 이들 치료용 면역 세포에 대한 신뢰할 수 있고, 재현 가능한 효력(potency) 시험에 대한 필요성이 줄곧 증가하고 있었다. 면역 세포의 효과기 기능을 시험하기 위한 산업 "금본위제(gold standard)"는 크롬 방출 검정인데, 이것은 1960년대에 개발되었고, 방사성 물질의 사용으로 인한 우려 및 표적 종양 세포로 인한 변동성에도 불구하고 여전히 사용 중이다. 사용할 수 있는 대안은 칼세인(Calcein)-기반 검정이며, 이것은 상이한 종양 표적의 사용에 의해서 유발되고, 종양 표적의 아폽토시스체(apoptotic body) 내의 칼세인의 포획으로 인해서 여전히 많은 변동성을 갖는다.
이러한 면역 세포의 효과기 기능을 시각적으로 보기 위해서 상이한 방식을 개발하려는 다른 노력이 있었지만, 이러한 방법은 여전히 표적 종양 세포를 사용한다. 면역 세포의 효과기 기능을 확인하는 다른 대용 방법은 이들 세포에 의해 생산되는 사이토카인을 확인하는 것인데, 이를 위한 모든 종래의 방법은 표적 종양 세포를 사용하여 면역 세포로부터 사이토카인 생산을 유도하는 것이다. 표적 종양 세포의 사용은 종양 세포 유형 간의 가변성으로 인해 이러한 시험 모두에 생물학적 가변성을 추가한다. 또한 이러한 검정은 이러한 검정에 배취 효과(batch effect)를 도입하는 지루한 설정이 필요하다. 배취 효과는 표적 세포 조건, 플레이트 로딩의 개인 간 가변성, 플레이트 조건, 다양한 시약의 가변성, 판독 가변성 등에 의해 발생한다. 이러한 가변성 모두를 제거할 수 있고, 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 생성하는 면역 세포 효력 검정에 대한 명확한 필요성이 있다.
면역 세포 치료 제품의 품질을 평가하기 위해서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 효력 검정이 필요하다. 승인 과정은 엄격하게 규제되며, 약물 개발자는 승인을 받기 위해서 약물 제품에 관한 상당한 양의 정보를 규제 당국에 제출해야 할 필요가 있을 것이다. 이것은 약물 제품의 효력 및 이러한 효력을 결정하기 위한 검정에 관한 정보를 포함할 수 있다. FDA(21 CFR 610.10)에서 요구하는 바에 따라서, 세포 요법의 효력은 이러한 면역 세포에 의한 관련 사이토카인 생산을 측정하는 효력을 나타내기 위해서 이러한 치료용 면역 세포의 효과기 기능을 나타내는 적절한 시험으로 제시되어야 한다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세사항은 첨부 도면 및 하기 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명, 도면 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
일 양상에서, 본 명세서에는 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 이 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin: PHA), 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)/이오노마이신, 콘카나발린 A(Con A), 지질다당류(LPS) 및/또는 포크위크 미토겐(pokeweek mitogen: PWM))와 접촉시키는 단계 및 면역 세포에 의해서 생산된 1종 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 방법은 생산된 사이토카인의 양을 면역요법에서 면역 세포의 사용에 필요한 사이토카인 효력 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다.
또한 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 면역 세포의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 여기서 사이토카인의 양은 면역검정(예를 들어, ELISA, 세포내 사이토카인 염색, ELISpot, 유세포 분석법, Luminex xMAP®, 정량적 PCR(qRT-PCR을 포함하지만 이것으로 제한되지 않음) 및/또는 비드 어레이)을 사용하여 검출된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 면역 세포의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 여기서 면역 세포는 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150분, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62일, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 접촉된다.
또한 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 면역 세포의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 여기서 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)는 5㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖의 농도를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1.0㎍/㎖ 내지 1000㎍/㎖의 농도로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM) 및 면역 세포에 적합한 완충제를 포함하는 용기(예를 들어, 마이크로원심분리기 튜브 등)를 포함하는, 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하기 위한 키트가 개시된다. 일부 양상에서, 키트는 면역 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하기 위해서 키트를 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.
또한 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 면역 세포의 효력을 검정하기 위한 키트가 개시되며, 여기서 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)는 5㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖의 농도를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1.0㎍/㎖ 내지 1000㎍/㎖의 농도로 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 a) 다수의 면역 세포에 대해서 임의의 상기 양상의 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하여 각각의 면역 세포의 효력을 결정하는 방법을 수행하는 단계; b) 검출된 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양에 기초하여 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택하는 단계; c) 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 면역치료제로서 투여하는 단계를 포함하는 면역요법이 개시된다. 일 양상에서, 방법은 면역 세포의 효력을 검정하기 전에 동종이계 또는 자가 공여자로부터 다수의 면역 세포를 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 명세서에는 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는 임의의 상기 양상의 면역요법 방법이 개시된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 다수의 면역 세포 또는 강력한 면역 세포를 명시된 항원에 반응하도록 유도하는 단계를 더 포함하는 임의의 상기 양상의 면역요법 방법이 개시된다. 일 양상에서, 방법은 관심대상 면역 세포가 반응하는 명시된 항원을 포함하도록 엑소좀이 유래된 세포주의 변형 또는 엑소좀 자체의 변형을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 이종 샘플에서 CD19 CAR T 세포의 효력을 구체적으로 결정하기 위한 CD19의 첨가).
또한 본 명세서에는 키메라 항원 수용체를 제시하도록 다수의 면역 세포 또는 강력한 면역 세포를 유전자 변경시키는 단계를 더 포함하는 임의의 상기 양상의 면역요법 방법이 개시된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법이 개시되며, 이 방법은 a) 동종이계 또는 자가 공여자로부터 얻은 1종 이상의 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)를 얻는 단계; b) 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계; c) 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양을 검출하는 단계; d) 검출된 사이토카인의 양에 기초하여 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택하는 단계; 및 e) 대상체에게 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 자가 또는 동종이계 공여자로부터 면역 세포를 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 명세서에는 치료적 유효량의 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는 임의의 상기 양상의 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법이 개시된다.
또한 본 명세서에는 세포 유형과 연관된 사이토카인 시그니처에 기초하여 적어도 1종의 면역 세포 또는 세포의 집단의 아이덴티티(예를 들어, 분화 Th1, Th2, Th3, Th9, Th17, 효과기 기억 T(Tem) 세포, 중앙 기억 T(Tcm) 세포, γδT 세포 또는 조절성 T(Treg) 세포, 휴지 NK 세포, 확장된 NK 세포)를 결정하는 방법이 개시된다.
도 1은 K-562 종양 세포에 의해서 유도된 NK 세포 사이토카인 방출 대 PHA에 의해서 유도된 NK 세포 사이토카인 방출(pg/백만 개 세포/hr 단위) 간의 상관관계를 나타낸 플롯.
도 2는 인큐베이션 시간에 기초한 결과의 분석을 도시한 그래프.
도 3은 세포 수에 기초한 결과의 분석을 도시한 그래프.
도 4는 mb-IL-21 및 TGF-β와 함께 확장된 NK 세포의 PHA 검정의 결과를 도시한 그래프.
도 5는 (PHA에 의해서 유도된) 새로 단리된 NK 세포 사이토카인 방출 대 PHA에 의해서 유도된 확장된 NK 세포 사이토카인 방출(pg/백만 개 세포/hr) 간의 상관관계를 나타낸 플롯.
도 6은 확장된(N=18) NK 세포 및 새로 입수된(N=10) NK 세포에서 PHA에 의한 1시간 자극 후 NK 세포의 사이토카인 발현을 도시한 플롯.
도 7은 PHA 자극 후 새로 입수된 NK 세포와 확장된 NK 세포 사이에서 발현된 사이토카인의 농도의 비교를 도시한 도면.
도 8은 IFN-γ 및 IL-2 발현에 기초하여 확장된 NK 세포의 분화에 있어서의 특이성 및 감도를 도시한 플롯.
도 9는 새로 입수된 NK 세포 및 확장된 NK 세포가 IL-2 상향조절 및 펜트라신-3 또는 키티나제 3-유사 1 하향조절에 기초하여 분화될 수 있다는 것을 도시한 도면.
도 10은 새로 입수된 NK 세포 및 확장된 NK 세포가 IFN-γ 상향조절 및 펜트라신-3 또는 키티나제 3-유사 1 하향조절에 기초하여 분화될 수 있다는 것을 도시한 도면.
도 2는 인큐베이션 시간에 기초한 결과의 분석을 도시한 그래프.
도 3은 세포 수에 기초한 결과의 분석을 도시한 그래프.
도 4는 mb-IL-21 및 TGF-β와 함께 확장된 NK 세포의 PHA 검정의 결과를 도시한 그래프.
도 5는 (PHA에 의해서 유도된) 새로 단리된 NK 세포 사이토카인 방출 대 PHA에 의해서 유도된 확장된 NK 세포 사이토카인 방출(pg/백만 개 세포/hr) 간의 상관관계를 나타낸 플롯.
도 6은 확장된(N=18) NK 세포 및 새로 입수된(N=10) NK 세포에서 PHA에 의한 1시간 자극 후 NK 세포의 사이토카인 발현을 도시한 플롯.
도 7은 PHA 자극 후 새로 입수된 NK 세포와 확장된 NK 세포 사이에서 발현된 사이토카인의 농도의 비교를 도시한 도면.
도 8은 IFN-γ 및 IL-2 발현에 기초하여 확장된 NK 세포의 분화에 있어서의 특이성 및 감도를 도시한 플롯.
도 9는 새로 입수된 NK 세포 및 확장된 NK 세포가 IL-2 상향조절 및 펜트라신-3 또는 키티나제 3-유사 1 하향조절에 기초하여 분화될 수 있다는 것을 도시한 도면.
도 10은 새로 입수된 NK 세포 및 확장된 NK 세포가 IFN-γ 상향조절 및 펜트라신-3 또는 키티나제 3-유사 1 하향조절에 기초하여 분화될 수 있다는 것을 도시한 도면.
본 발명은 면역 세포를 유효량의 자극제과 접촉시키는 단계 및 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함하는, 면역 세포의 효력을 결정하는 방법을 제공한다. 본 개시내용이 암 면역요법의 맥락에서 제공되어 있지만, 본 명세서에 개시된 개념 및 혁신은 다른 질환 및 장애를 위한 면역요법에 적용될 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 장애, 바이러스 질환 및/또는 박테리아 감염에 대한 면역요법에 사용되는 면역 세포는 또한 본 명세서에 개시된 검정을 사용하여 효력에 대해서 시험될 수 있다.
정의
이해의 명료화 및 참조 용이성을 위해서 간략한 설명 섹션 및 본 출원의 나머지에 걸쳐 사용된 용어 목록이 본 명세서에 편집되었다. 용어 중 일부는 당업계 전체에 널리 공지되어 있고, 명확성을 위해서 본 명세서에 정의되어 있는 반면, 용어 중 일부는 본 출원에 고유하기 때문에, 본 출원의 적절한 이해를 위해서 정의되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 표현은 그 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다. 복수 형태가 본 명세서에서 사용되는 경우, 그것은 일반적으로 단수형을 포함한다.
범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 실시형태는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사치로 표현되는 경우, 선행사 "약"을 사용하여 특정 값이 또 다른 실시형태를 형성함을 이해할 것이다. 범위 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과는 독립적으로 모두 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 종점에 의한 수치 범위의 인용은 그 범위 내에 포함된 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함). 본 명세서에 다수의 값이 개시되어 있고, 각각의 값은 또한 그 값 자체에 추가하여 그 특정 값이 "약"으로서 본 명세서에 개시되어 있음을 이해해야 한다. 예를 들어 값 "10"이 개시되면, "약 10"도 개시된다. 값이 개시된 경우, 그 값 "이하", "그 값 이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 당업자에 의해서 적절하게 이해되는 바와 같이 개시되는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면 "10 이하"뿐만 아니라 "10 이상"이 또한 개시된다. 또한 본 출원 전반에 걸쳐 데이터가 다수의 상이한 형식으로 제공되며, 이 데이터는 종점 및 시작점, 그 데이터 지점의 임의의 조합물에 대한 범위를 나타낸다. 예를 들어, 특정 데이터 지점 "10" 및 특정 데이터 지점 15가 개시되면, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하 및 10 및 15뿐만 아니라 10과 15 사이가 개시되는 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어 10과 15가 개시되면 11, 12, 13, 14가 또한 개시된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용되는 경우 "본질적으로 이루어진"은 그 조합에 임의의 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미해야 한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물 및 인산염 완충 염수, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 배제하지 않을 것이다. "로 이루어진"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 원소를 초과하는 것을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
"증가시키다"는 더 많은 양의 증상, 질환, 조성, 병태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 증가는 통계적으로 유의한 양의 병태, 증상, 활성, 조성에서의 임의의 개별, 중위 또는 평균 증가일 수 있다. 따라서 증가는 그 증가가 통계적으로 유의한 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 증가일 수 있다.
"감소시키다"는 더 작은 양의 증상, 질환, 조성, 병태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 물질이 있는 유전자 산물의 유전적 결과물이 물질이 없는 유전자 산물의 결과물에 비해서 적은 경우 물질은 또한 유전자의 유전적 결과물을 감소시키는 것으로 이해된다. 또한 예를 들어, 감소는 이전에 관찰된 것보다 증상이 덜하도록 하는 장애의 증상의 변화일 수 있다. 감소는 통계적으로 유의한 양의 병태, 증상, 활성, 조성에서의 임의의 개별, 중위 또는 평균 감소일 수 있다. 따라서 감소는 그 감소가 통계적으로 유의한 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 감소일 수 있다.
"저해하다", "저해하는" 및 "저해"는 활성, 반응, 병태, 질환 또는 다른 생물학적 파라미터를 감소시키는 것을 의미한다. 이것은 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 절제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이것은 또한 예를 들어, 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환의 10% 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 사이의 임의의 양의 감소일 수 있다.
"감소시키다" 또는 "감소시키는" 또는 "감소"와 같은 단어의 다른 형태는 사건 또는 특징(예를 들어, 종양 성장)을 낮추는 것을 의미한다. 이것은 전형적으로 일부 표준 또는 예측 값과 관련이 있으며, 다시 말해서 그것은 상대적이지만, 참조될 표준 또는 상대 값이 항상 필요한 것은 아니라는 점을 이해해야 한다. 예를 들어, "종양 성장을 감소시키다"는 표준 또는 대조군에 비해 종양 성장 속도를 감소시키는 것을 의미한다.
"예방하다" 또는 "예방하는" 또는 "예방"과 같은 단어의 다른 형태는 특정 사건 또는 특징을 중지시키거나, 특정 사건 또는 특징의 발달 또는 진행을 안정화시키거나 또는 지연시키거나, 또는 특정 사건 또는 특징이 발생할 가능성을 최소화하는 것을 의미한다. 예방하다는, 그것이 전형적으로 예를 들어, 감소시키는 것보다 더 절대적이므로, 대조군과 비교할 필요가 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 무언가가 감소될 수 있지만, 예방되지 않을 수 있고, 그러나 감소되는 무언가는 또한 예방될 수 있다. 마찬가지로, 무언가는 예방될 수 있지만, 감소되지 않을 수 있고, 그러나 예방되는 무언가는 또한 감소될 수 있다. 감소하다 또는 예방하다가 사용되는 경우, 달리 구체적으로 제시되지 않는 한, 다른 단어의 사용이 또한 명시적으로 개시되는 것으로 이해된다.
용어 "치료적으로 유효한"은 대체 요법(alternative therapy)과 전형적으로 연관된 것과 같은 부작용과 같은 유해 부작용을 회피하면서 질환 중증도를 감소시키는 목표를 달성할 활성제(예컨대, 면역치료 세포)의 수 또는 양을 한정하도록 의도된다. 치료적 유효량은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 치료적으로 유효한 치료는 질환 결과 자체를 개선하지 않더라도 대상체의 삶의 질을 개선하는 치료를 포함한다.
"유효량"은 일반적으로, 예를 들어 본 출원에 기재된 특별한 원하는 효과를 달성하는 것을 포함하여, 사이토카인 형성을 자극하는 데 효과적인 원하는 국소 또는 전신 효과를 제공하는 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 유익하거나 원하는 임상 결과를 달성하기에 충분한 양이다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어, 포유동물일 수 있다. 일 양성에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 개 또는 고양이일 수 있다. 대상체는 기니피그, 래트, 햄스터, 토끼, 마우스 또는 두더지일 수도 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의과 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어, 의사의 치료 하에 있는 대상체를 지칭한다.
용어 "치료적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 안전하고, 무독성인 조성물을 제조하는 데 유용한 담체 또는 부형제를 의미하고, 수의과 및/또는 인간 사용에 허용 가능한 담체를 포함한다. 정맥내 전달 방법은 생리학적으로 균형을 이루는 치료적으로 허용 가능한 담체를 사용할 것이다(예를 들어, 정맥내 사용에 안전한 삼투압 및 pH 수준에서). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적으로 허용 가능한 담체"는 표준 담체, 예컨대, 염수, 링거, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 수 중 덱스트로스 및 에멀션, 예컨대, 오일/물 또는 물/오일 에멀션 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 안정화제 또는 치료 제형에 사용하기 위해 당업계에 널리 공지된 다른 물질을 포함한다. 치료적으로 허용 가능한 담체는 또한 면역 세포의 생존력 및/또는 효력을 보존하는 것과 같은 보존제(냉동보존제 포함)를 포함할 수 있다. 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 같은 "치료적으로 허용 가능한 담체"는 1종 및 1종 초과의 담체를 둘 다를 포함한다.
용어 "치료"는 질환, 병리학적 병태 또는 장애를 치유, 개선, 안정화 또는 예방할 의도를 가진 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉, 구체적으로 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선에 대한 치료를 포함하며, 원인 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 제거에 대한 치료를 또한 포함한다. 또한 이 용어는 완화적 치료, 즉, 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 치유가 아니라 증상의 완화를 위해 설계된 치료; 예방적 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 발생을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 저해하는 치료; 및 지지적 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선에 대한 또 다른 특정 요법을 보완하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.
대상체에 대한 "투여"는 대상체에게 작용제를 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구, 국소, 정맥내, 피하, 피부경유(transcutaneous), 경피, 근육내, 관절내, 비경구, 세동맥내, 피부내, 뇌실내, 두개내, 복강내, 병변내, 비강내, 직장, 질내, 흡입에 의해, 이식된 저장소를 통해, 비경구(예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 복강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술) 등을 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동반 투여", "조합 투여", "동시 투여" 또는 "동시에 투여되는"은 화합물이 동일한 시점에 투여되거나 본질적으로 서로 직후에 투여됨을 의미한다. 후자의 경우, 두 화합물은 관찰된 결과가 동일한 시점에 화합물을 투여할 때 달성된 결과와 구별할 수 없을 정도로 충분히 가까운 시간에 투여된다. "전신 투여"는 예를 들어, 순환계 또는 림프계를 통해서, 대상체 신체의 광범위한 영역(예를 들어, 신체의 50% 초과)에 작용제를 도입하거나 전달하는 경로를 통해 대상체에게 작용제를 도입하거나 전달하는 것을 의미한다. 대조적으로, "국소 투여"는 투여 지점에 바로 인접한 영역 또는 영역에 작용제를 도입하거나 전달하는 경로를 통해 대상체에게 작용제를 도입하거나 또는 전달하는 것을 지칭하며, 치료적으로 유의한 양의 작용제를 전신으로 도입하지 않는다. 예를 들어, 국지적으로 투여된 작용제는 투여 지점의 국지적 부근에서 쉽게 검출될 수 있지만, 대상체 신체의 원위 부분에서는 검출될 수 없거나 무시할 수 있는 양으로 검출될 수 있다. 투여는 자가 투여 및 또 다른 사람에 의한 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이들의 문법적 변형은 1종 이상의 질환 또는 병태, 질환의 강도 또는 빈도, 질환 또는 병태의 증상 또는 질환 또는 병태의 근본 원인을 부분적으로 또는 완전히 예방, 지연, 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 교정, 개선, 향상, 안정화, 진정 및/또는 감소시킬 의도 또는 목적으로 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 예방적으로, 예방학적으로, 완화적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다. 예방적 치료는 발병 전(예를 들어, 암의 명백한 징후 전), 조기 발병 동안(예를 들어, 암의 초기 징후 및 증상 시) 또는 확립된 암 발병 후에 대상체에게 투여된다. 예방적 투여는 질환 또는 감염의 증상이 나타나기 전 수 일(들)에서 수 년 동안 발생할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법 및 키트는 자극제를 이용한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 자극제는 항원 및/또는 면역원으로서 작용하여 면역 세포가 사이토카인을 분비하도록 자극할 수 있는 임의의 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 렉틴 및/또는 미토겐일 수 있다. 자극제는 파이토헤마글루티닌(PHA), 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)/이오노마이신, 콘카나발린 A(Con A), 지질다당류(LPS) 및/또는 포크위크 미토겐(PWM), 땅콩 응집소(peanut agglutinin: PNA), 맥아 응집소 및 리신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 출원 전반에 걸쳐 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 개시내용은 이에 관련된 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참조에 의해 포함된다. 개시된 참고문헌은 또한 참고문헌에 의존하는 문장에서 논의된 참고문헌에 포함된 자료에 대해 개별적으로 그리고 구체적으로 참조에 의해 포함된다.
면역 효력 검정
일 양상에서, 본 발명은 면역 세포의 효력을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계 및 상기 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포는 자극제를 세포 배지 중에 현탁시키고, 면역 세포를 세포 배지에 노출시킴으로써 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 생산된 사이토카인의 양을 면역요법에서 면역 세포의 사용에 필요한 사이토카인 효력 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 효력 검정은 산물(즉, 면역 세포)을 특징규명하고, 로트 대 로트 일관성을 모니터링하고, 산물의 안정성을 보장하는 역할을 하기 때문에, 작용 기전 및 기능에 영향을 미칠 수 있는 차이를 검출하기에 충분히 민감해야 하고, 이에 의해서 잠재적인 임상적 중요성을 갖는다. 검정은 또한 세포-매개 면역요법을 위한 예측 바이오마커 또는 약력학적 검정으로 사용될 수 있다. 효력 검정이 산물의 추정 생리학적/약리학적 활성과 가능한 가장 가까운 관계를 보유하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 기재된 효력 검정은 제품 사양 내에서 효력 값을 측정하는 능력; 잠재적인 임상적 중요성의 차이를 검출하기 위한 높은 감도; 제품의 작용 기전 및 추정 생리학적/약리학적 활성과의 밀접한 관계를 제공한다. 바람직하게는, 효력 검정은 또한 다음 2차 기준을 충족한다: 충분히 낮은 분석 내 및 분석 간 변동(제품 사양을 지원하는 데 필요한 정밀도를 얻기 위함); 충분한 견고성; 및 고속대량처리(high-throughput) 분석에 대한 가능성. 일부 실시형태에서, 검정은 T 세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포 기능(NK 세포 면역 결핍에 대한 진단, 면역억제제 또는 면역-활성화제 효과)을 정량하기 위한 임상 검정으로서 사용된다.
상기에 언급된 바와 같이, 개시된 방법은 면역 세포의 효력을 결정하기 위해 제공된다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역 세포는 사이토카인을 생산하는 면역 체계의 임의의 세포(즉, 사이토카인-생산 면역 세포)이다. 사이토카인-생산 면역 세포의 예는 림프구, 호중구, 대식세포 및 자연 살해 세포를 포함한다. 림프구는 B-세포 및 T-세포(CD4 및 CD8 T 세포 포함) 둘 다를 포함한다. 일 양상에서, 면역 세포는 종양 침윤 림프구(TIL), T 세포, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 및/또는 CAR NK를 포함할 수 있다. 면역 세포는 세포 배양물로부터 얻어질 수 있거나, 대상체(예를 들어, 동종이계 공여자 또는 자가 공여자 등)로부터 얻어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 T-세포이다. T-세포는 세포-매개 면역에서 중심적인 역할을 하며, 다른 림프구, 예컨대, 세포 표면 상의 T-세포 수용체의 존재에 의해서, B 세포 및 자연 살해 세포와 구별될 수 있다. T-세포의 예는 T 헬퍼 세포(TH 세포), 세포독성 T 세포(TC 세포), 기억 T 세포, 조절 또는 "억제자" T 세포 및 자연 살해 T 세포(NK 세포와 구별되고, MHC 분자가 제시하는 펩타이드보다는 당지질 항원을 인식하는 NKT 세포)를 포함한다. 상이한 유형의 T-세포는 사이토카인 생산의 패턴이 서로와 상이하다. T 세포는 CD4 또는 CD8 T 세포일 수 있다. 추가로, T 세포는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) T 세포 또는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 자연 살해 세포는 면역 체계의 세포독성 림프구의 유형이다. NK 세포는 신속한 반응을 제공하여 바이러스 감염된 세포에 대한 신속한 반응을 제공하고, 형질전환된 세포에 반응한다. 전형적으로, 면역 세포는 감염된 세포의 표면 상의 주 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 분자가 제시하는 병원체의 펩타이드를 감지하여, 사이토카인 방출을 촉발하여, 용해 또는 아폽토시스를 유발한다. 그러나, NK 세포는 병원체로부터의 펩타이드가 MHC 분자에 존재하는지의 여부에 관계없이 스트레스를 받은 세포를 인식하는 능력이 있기 때문에 고유하다. 이들은 표적을 사멸시키기 위해서 사전 활성화가 필요하지 않다는 초기 개념 때문에 "자연 살해자"라고 명명되었다. NK 세포는 큰 과립 림프구(large granular lymphocyte: LGL)이며, 골수에서 분화 및 성숙되고, 그 다음 이곳으로부터 순환계로 들어간다고 공지되어 있다. 일부 양상에서, NK 세포는 CAR NK 세포일 수 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 이 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계 및 면역 세포에 의해서 생산된 1종 이상의 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 방법은 생산된 사이토카인의 양을 면역요법에서 면역 세포의 사용에 필요한 사이토카인 효력 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다.
검정은 면역 세포를 자극제로 자극한 후 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 세포 신호전달, 특히 면역 세포에 의해서 생산될 수 있는 면역조절에 중요한 작은 단백질(약 5 내지 20kDa)을 지칭한다. 사이토카인의 예는 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함한다. 검출된 사이토카인은 평가될 면역 세포에 의해서 생산된다고 공지된 사이토카인을 포함할 수 있거나, 검출은 면역 세포에 의해서 생산된다고 공지되지 않은 사이토카인을 비롯한 더 광범위하게 다양한 사이토카인을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출될 사이토카인은 T-세포 또는 자연 살해 세포에 의해서 생산된다고 공지된 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 T-세포에 의해서 생산된다고 공지된 것을 포함한다. T-세포는 Th1 및 Th2 세포를 포함하고; Th1 세포는 인터페론(IFN)-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF)-α(TNF-α) 및 IL-2를 우세하게 생산하고; Th2 세포는 인터류킨(IL)-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 및 IL-22를 생산한다. 자극된 자연 살해 세포에 의해서 생산되는 사이토카인의 예는 IL-lα, IL-1β, IL- 2, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α, 과립구-대식세포 집락-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF), 백혈병 저해성 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 및 케모카인 대식세포 염증성 단백질(macrophage inflammatory protein)(MIP)-1α(MIP-1α), MIP-1β 및 RANTES를 포함한다. 면역 세포의 효력을 결정하는 데 유용한 다른 사이토카인은 B 세포 활성화 인자/종양 괴사 인자(TNF) 리간드 슈퍼패밀리 구성원 13B(BAFF/TNFSF13B), 분화 클러스터(CD) 163(CD163), CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP-1), 오스테오칼신, 오스테오폰틴(Osteopontin: OPN), 펜트라신-3, 종양 괴사 인자(TNF)- 수용체 1(TNF-R1), TNF-R2, 흉선 기질상 림포포에틴(thymic stromal lymphopoetin: TSLP) 또는 아폽토시스의 TNF-관련 약한 유도인자 (TWEAK)/TNF 슈퍼패밀리 구성원 12(TWEAK/TNFSF12)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 이 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, 파이토헤마글루티닌(PHA), 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)/이오노마이신, 콘카나발린 A(Con A), 지질다당류(LPS) 및/또는 포크위크 미토겐(PWM))와 접촉시키는 단계 및 면역 세포에 의해서 생산된 1종 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, LIF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에는 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 이 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계 및 면역 세포에 의해서 생산된 1종 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 방법은 생산된 사이토카인의 양을 면역요법에서 면역 세포의 사용에 필요한 사이토카인 효력 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 사이토카인의 수준이 결정된다. 추가 실시형태에서, 사이토카인은 인터류킨-2, 인터류킨-6 및 인터페론-γ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
검정은 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 광범위한 방법은 사이토카인을 검출하기 위해서 당업자에게 공지되어 있고, 이것은 검출될 사이토카인에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법 또는 방법들은 복수의 상이한 사이토카인의 존재를 검출 및/또는 정량하기 위해서 사용될 수 있다. 사이토카인은 예를 들어, 특정 시약 키트 또는 면역검정의 사용에 의해서 검출될 수 있다. 사이토카인은 상업적 공급원으로부터 입수 가능한 키트, 예컨대, Miltenyi Biotec™, Luminex 및 Thermo Fisher scientific™을 사용하여 검출될 수 있다. 사이토카인의 검출에 적합한 키트의 예는 신속한 사이토카인 인스펙터(inspector)(CD4/CD8) 키트 또는 MACSPlex 사이토카인 T/NK 키트이며, 이것은 T-세포 또는 NK 세포에 의해서 형성된 사이토카인을 검출할 수 있고, 이들 둘 다는 Miltenyi Biotec™에서 판매된다.
일부 실시형태에서, 사이토카인의 양은 면역검정을 사용하여 검출된다. 면역검정은 다수의 상이한 포맷 및 변형으로 수행된다. 면역검정은 검정의 상이한 지점에서 첨가되고, 세척되거나 분리될 시약을 사용하여 다수의 단계로 수행될 수 있다. 면역검정은 다수의 단계를 포함하는 불균질 면역검정 및 시약과 샘플을 단순히 혼합하고, 물리적 측정을 수행하는 것을 포함하는 균질 면역검정을 포함한다. 면역검정은 보통 해당 분석물을 함유하는 것으로 공지된 용액인 교정기(calibrator)를 사용하며, 그 분석물의 농도는 일반적으로 알려져 있다. 교정기에 의해 생성된 검정 반응에 대한 실제 샘플에 대한 검정의 반응을 비교하면 샘플 중의 분석물의 존재 또는 농도 측면에서 신호 강도를 해석하는 것이 가능하다. 면역검정의 유형은 경쟁적, 균질 면역검정, 경쟁적 불균질 면역검정, 1-부위 비경쟁 면역검정 및 2-부위 비경쟁적 면역검정을 포함한다. 면역검정은 또한 효소-결합 면역흡착 검정(Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 측류 면역검정, 효소-결합 면역흡착 스팟(enzyme-linked immunosorbent spot: ELIspot) 검정, 유세포 분석법, 세포내 사이토카인 염색, 항체 어레이 검정 및 비드-기반 검정, 자기 면역검정, 방사선면역검정 및 정량적 PCR(qRT-PCR을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함한다. 일 양상에서, 검정은 Luminex xMAP®을 포함한다.
면역 세포의 효력을 결정하는 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
면역 세포가 사이토카인을 생성하도록 유도되는 일정 시간 동안 자극제에 노출되어야 한다는 것이 이해되고, 본 명세서에서 고려된다. 일 양상에서, 본 명세서에는 면역 세포의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 여기서 면역 세포는 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150분, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62일, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 접촉된다.
또한 본 명세서에는 임의의 상기 양상의 면역 세포의 효력을 검정하는 방법이 개시되며, 여기서 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)는 5㎍/㎖ 내지 1000㎍/㎖의 농도로 제공된다. 일 양상에서, 자극제의 농도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎍/㎖이다. 일 양상에서, 자극제의 농도는 약 1㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖, 1㎍/㎖ 내지 50㎍/㎖, 1㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖ 또는 5㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖이다.
일 양상에서, 면역 세포의 효력을 결정하기 위해서 생산되는 동일한 사이토카인을 또한 사용하여 사이토카인을 생산하는 세포를 식별할 수 있다는 것이 이해되고, 본 명세서에서 고려된다. 면역 세포는 당업계에 널리 공지된 구별되는 프로파일을 갖는다. 또한 본 명세서에는 세포 유형과 연관된 사이토카인 시그니처에 기초하여 적어도 1종의 면역 세포 또는 세포(예를 들어, 분화 Th1, Th2, Th3, Th9, Th17, 효과기 기억 T(Tem) 세포, 중앙 기억 T(Tcm) 세포, γδT 세포 또는 조절성 T(Treg) 세포, 휴지 NK 세포, 확장된 NK 세포)의 집단의 아이덴티티를 결정하는 방법이 개시된다. 따라서, 본 명세서에는 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)를 식별하는 방법이 개시되며, 이 방법은 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계 및 면역 세포에 의해서 생산된 1종 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양을 검출하는 단계를 포함하며; 여기서 면역 세포의 아이덴티티는 발현된 사이토카인의 프로파일에 기초하여 나타난다.
면역 세포 효력을 평가하기 위한 키트
본 발명의 또 다른 양상은 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM) 및 면역 세포에 적합한 완충제를 포함하는 용기를 포함하는, 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트 내의 자극제는 5㎍/㎖ 내지 1000㎍/㎖의 농도로 제공된다. 일 양상에서, 자극제의 농도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎍/㎖이다. 일 양상에서, 자극제의 농도는 약 1㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖, 1㎍/㎖ 내지 50㎍/㎖, 1㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖ 또는 5㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖이다. 일부 실시형태에서, 용기는 마이크로원심분리기 튜브(예를 들어, 에펜도르프 마이크로원심분리기 튜브)이다. 키트는 또한 대상체로부터 샘플을 얻기 위한 도구, 예컨대, 1종 이상의 면역 세포를 포함하는 샘플을 얻기 위한 주사기를 포함할 수 있다 적합한 완충제는 RPMI이다.
키트는 또한 샌드위치 면역검정 포맷의 포획 항체 및/또는 검출 항체로 기능하는 항체가 결합되는 고체상과 같은 면역검정을 수행하는 데 필요한 성분을 포함할 수 있다. 고체상은 자성 입자, 비드, 시험관, 미량정량판, 큐벳, 막, 스캐폴딩 분자, 수정, 필름, 여과지, 디스크 또는 칩과 같은 물질일 수 있다. 키트는 또한 검출 항체로서 기능하는 항체와 같은 항체일 수 있거나 이에 접합된 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지는 예를 들어, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 나노입자 화학발광단, 형광단, 형광 소광제, 화학발광 소광제 또는 바이오틴일 수 있는 직접 표지일 수 있다. 시험 키트는 표지를 검출하는 데 필요한 임의의 추가 시약을 선택적으로 포함할 수 있다.
키트는 면역 세포의 효력을 평가하기 위해서 면역 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하기 위해서 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 세포의 효력을 결정하기 위해서 사이토카인의 양을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 키트에 포함된 설명서는 포장재에 부착하거나 패키지 삽입물로 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 서면 또는 인쇄물이지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 설명서를 저장하고, 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
면역요법 방법
면역 세포의 효력을 결정하는 방법은 면역 세포를 면역 치료제로 사용하기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 다수의 면역 세포의 효력을 결정하는 방법은 상기에 기재된 바와 같이 수행될 수 있으며, 그 후에 (검출된 사이토카인의 양에 기초하여) 적어도 하나의 강력한 면역 세포가 선택될 수 있고, 강력한 면역 세포의 치료적 유효량이 면역치료제로서 대상체에게 전달될 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 a) 다수의 면역 세포에 대해서 본 명세서에 개시된 바와 같은 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)의 효력을 검정하여 각각의 면역 세포의 효력을 결정하는 방법을 수행하는 단계; b) 검출된 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양에 기초하여 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택하는 단계; c) 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 면역치료제로서 투여하는 단계를 포함하는 면역요법이 개시된다. 일 양상에서, 방법은 면역 세포의 효력을 검정하기 전에 동종이계 또는 자가 공여자로부터 다수의 면역 세포를 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역요법 면역 세포이다. 면역요법 면역 세포는 질환, 예컨대, 암의 치료에 유용한 것이다(문헌[Becker et al., Cancer Immunol. Immunother 65, 477-484 (2016)]). 암 치료를 위한 확장된 NK 세포의 사용이 설명되어 있다(문헌[Rezvani et al., Front Immunol., 6, 578 (2015)]). 면역요법 동안 많은 수의 면역 세포를 투여할 수 있는 것이 도움이 되기 때문에, 일부 실시형태에서 면역 세포는 확장된 면역 세포이다. 확장된 면역 세포는 많은 수의 면역 세포를 성장시키기 위해서 생체 외에서 성장한 것이다. 일부 실시형태에서, 확장된 면역 세포는 면역 반응을 유발하지 않으면서 대상체에게 용이하게 투여될 수 있는 자가 세포이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 확장된 면역 세포는 동종이계 면역 세포이며, 여기서 이의 고유 동종반응성이 이점이 될 수 있다. 추가 실시형태에서, 확장된 면역 세포는 면역 세포가 병변이 있는 조직을 표적으로 하는 것을 돕기 위해서 키메라 항원 수용체를 포함하도록 유전자 조작된다. 확장된 면역 세포의 제조는 면역 세포의 활성화 및 확장을 포함한다(문헌[Koepsell et al., Transfusion, 53(2):404-10 (2013)]). 다수의 사이토카인(IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, I형 IFN 및 TGF-β)이 생체외 면역 세포를 활성화 및 확장시키는 데 유용한 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 평가될 NK 세포는 IL-21 확장된 NK 세포이다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는 면역요법 방법이 개시된다.
확장은 NK 세포의 집단이 증가되도록 하는 NK 세포의 생체외 증식을 지칭한다. NK 세포는 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포로부터 확장될 수 있다. 그러나, NK 세포는 또한 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포와 같은 다른 유형의 세포에서도 확장될 수 있다. 초기 혈액 또는 줄기 세포는 태반, 제대혈, 태반 혈액, 말초 혈액, 비장 또는 간과 같은 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 확장은 세포 배양 배지에서 일어난다. 적합한 세포 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 확장된 세포는 세포 배양에서 유지될 수 있는 복수의 세포인 세포주로서 제공될 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는 면역요법 방법이 개시된다. 일부 양상에서, 면역 세포는 면역 세포의 효력을 결정하는 방법을 수행하기 전에 공지된 방법을 사용하여 대상체로부터 추출되었다. 대안적으로, 면역 세포는 세포 배양물의 확장으로부터 공급될 수 있다.
일부 양상에서, 면역 세포는 특정 항원에 반응하도록 유도된다(예를 들어, CD19). 면역 세포는 이의 효력을 결정하는 방법 이전에 또는 이의 효력을 결정하는 방법 후에 반응하도록 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 특정 항원에 반응하도록 유전자 변경된다. 항원은 예를 들어, 종양-특이적 항원일 수 있다. 일부 양상에서, 면역요법 방법은 (면역 세포의 효력을 결정하기 전 또는 후에) 키메라 항원 수용체를 제시하도록 면역 세포를 유전자 변경하는 것을 포함한다. 일 양상에서, 방법은 관심대상 면역 세포가 반응하는 명시된 항원을 포함하도록 엑소좀이 유래된 세포주의 변형 또는 엑소좀 자체의 변형을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 이종 샘플에서 CD19 CAR T 세포의 효력을 구체적으로 결정하기 위한 CD19의 첨가).
면역 세포의 효력을 결정하는 방법 전체에 걸쳐 언급된 바와 같이, 면역 세포는 입양 세포 전달 치료의 일부로 사용될 수 있다. 강력한 면역 세포는 치료적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있다. 정맥내 전달은 일반적으로 면역치료 세포를 전달하는 데 사용되지만 다른 방법도 고려될 수 있다(예를 들어, 면역요법이 필요한 신체의 국소 부위에 직접 이식).
치료적 유효량은 면역 세포에 의해 생산된 사이토카인의 양을 면역요법에서 면역 세포의 사용에 필요한 사이토카인 효력 수준과 비교함으로써 결정될 수 있다. 치료적 유효량은 투여될 면역 세포, 치료될 대상체 및 치료될 질환, 장애 및/또는 병태에 의존하는 것으로 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 당업자는 치료될 대상체에 대해 치료적으로 효과적일 사용하기 위한 면역 세포의 적절한 투여량을 알고 있을 것이다.
강력한 면역 세포의 치료적 유효량은 복수의 강력한 면역 세포를 포함한다. 예를 들어, 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택한 후, 선택된 세포는 시험관내에서 확장되어 복수의 강력한 면역 세포를 생산할 수 있다.
강력한 면역 세포를 제공받는 대상체는 면역요법으로부터 이익을 얻을 임의의 대상체(예를 들어, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 장애, 바이러스 질환 및/또는 박테리아 감염을 갖는 대상체)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암 환자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암 발병 위험이 높은 개체, 암으로 진단된 개체, 암 치료 중인 개체 또는 수술 후 암으로부터 회복 중인 개체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 강력한 면역 세포는 암 또는 전이의 발병을 예방, 저해 또는 지연시키기 위한 예방제로서 대상체에게 전달될 수 있다.
질환의 치료 방법
본 명세서에서 식별된 강력한 면역 세포는 임의의 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다고 이해되고, 본 명세서에서 고려되며, 여기서 입양 면역요법은 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 장애, 바이러스 질환, 염증성 질환 또는 장애를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법이 개시되며, 이 방법은 a) 동종이계 또는 자가 공여자로부터 얻은 1종 이상의 면역 세포(예를 들어, T-세포, 대식세포, NK 세포, NK T 세포, CAR T 세포 및/또는 CAR NK 세포)를 얻는 단계; b) 면역 세포를 유효량의 자극제(예를 들어, PHA, PMA/이오노마이신, Con A, LPS 및/또는 PWM)와 접촉시키는 단계; c) 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, 오스테오칼신, OPN, 펜트라신-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 TWEAK/TNFSF12)의 양을 검출하는 단계; d) 검출된 사이토카인의 양에 기초하여 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택하는 단계; 및 e) 대상체에게 치료적 유효량의 강력한 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 자가 또는 동종이계 공여자로부터 면역 세포를 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
면역요법 동안 많은 수의 면역 세포를 투여할 수 있는 것이 도움이 되고, 일부 실시형태에서 면역 세포는 확장된 면역 세포라는 것이 이해되고, 본 명세서에서 고려된다. 확장된 면역 세포는 많은 수의 면역 세포를 성장시키기 위해서 생체 외에서 성장한 것이다. 또한 본 명세서에는 치료적 유효량의 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 장애, 바이러스 질환, 박테리아 감염, 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법이 개시된다.
개시된 치료 방법은 암 및 전이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 제어되지 않는 세포 증식이 발생하는 임의의 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있음이 이해되고 본 명세서에서 고려된다. 개시된 강력한 면역 세포를 사용하는 방법이 치료를 위해서 사용될 수 있는 암의 대표적이지만 비제한적인 목록은 하기이다: 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계암, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종, 폐암, 예컨대, 소세포 폐암 및 비소세포폐암, 신경모세포종/교모세포종, 난소암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평세포암종, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암 및 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암, 식도암, 두경부암, 대장암, 조혈암; 고환암; 결장암, 직장암, 전립선암 또는 췌장암.
개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 이완불능증, 급성 파종성 뇌척수염, 급성 운동 축삭 신경병증, 애디슨병, 돌로사 지방증(Adiposis dolorosa), 성인 스틸병(Adult Still's disease), 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 알츠하이머병, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항GBM/항TBM 신염, 항인지질 증후군, 재생 불량성 빈혈, 자가면역 혈관부종, 자가면역 자율신경이상증, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 장병증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(Autoimmune inner ear disease: AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 췌장염, 자가면역 다내분비 증후군, 자가면역 망막병증, 자가면역 두드러기, 축삭 및 신경 신경병증(Axonal & neuronal neuropathy: AMAN), 발로병(
disease), 베체트병(Behcet's disease), 양성 점막 천포창, 비커스태프 뇌염(Bickerstaff's encephalitis), 수포성 천포창, 캐슬만병(Castleman disease: CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy: CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(Chronic recurrent multifocal osteomyelitis: CRMO), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss Syndrome: CSS), 호산구성 육아종증(Eosinophilic Granulomatosis: EGPA), 반구천포창, 코간 증후군, 한랭응집소병, 선천성 심장차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(Devic's disease)(시신경척수염), 제1형 당뇨병, 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 유착부염, 호산구성 식도염(Eosinophilic esophagitis: EoE), 호산구성 근막염, 결절 홍반, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 펠티 증후군, 섬유근육통, 섬유화 폐포염, 거대세포 동맥염(측두동맥염), 거대세포 심근염, 사구체신염, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 다발혈관염을 동반한 육아종증, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토 뇌병증, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노호 쉰라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura: HSP), 임신 포진 또는 천포창양 임신(pemphigoid gestationis: PG), 화농성 한선염(Hidradenitis Suppurativa: HS)(전위 여드름(Acne Inversa)), 저감마글로불린혈증, IgA 신병증, IgG4 관련 경화성 질환, 면역성 혈소판 감소성 자반병(Immune thrombocytopenic purpura: ITP), 봉입체 근염(Inclusion body myositis: IBM), 간질성 방광염(Interstitial cystitis: IC), 염증성 장 질환(Inflamatory Bowel Disease: IBD), 소아관절염, 소아당뇨병(제1형 당뇨병), 소아근염(Juvenile myositis: JM), 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 백혈구모세포혈관염, 편평태선, 경화태선, 결막염, 선형 IgA병(Linear IgA disease: LAD), 루푸스 신염, 루푸스 혈관염, 만성 라임병, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(Microscopic polyangiitis: MPA), 혼합 결합 조직 질환(Mixed connective tissue disease: MCTD), 무렌 궤양, 무하-하버만병, 다초점 운동 신경병증(Multifocal Motor Neuropathy: MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 시신경 척수염, 호중구 감소증, 안구 반점 천포창, 시신경염, 오르드 갑상선염, 회문형 류머티스(Palindromic rheumatism: PR), PANDAS, 종양성 소뇌 변성(Paraneoplastic cerebellar degeneration: PCD), 발작성 야간 혈색뇨(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH), 패리 롬버그 증후군, 평면부염(Pars planitis)(말초 포도막염), 파소나지-터너 증후군(Parsonnage-Turner syndrome), 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염(Perivenous encephalomyelitis), 악성 빈혈(Pernicious anemia: PA), POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 다선 증후군 유형 I, II, III, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성근염, 심근경색후 증후군, 심낭절제후 증후군, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선성 관절염, 순수 적혈구 무형성증(Pure red cell aplasia: PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 반응성 관절염, 반사 교감신경 이영양증, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군(Restless legs syndrome: RLS), 후복막 섬유증, 류마티스열, 류마티스 관절염, 류마티스 혈관염, 유육종증, 슈미트 증후군(Schmidt syndrome), 슈니츨러 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군(
syndrome), 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군(Stiff person syndrome: SPS), 아급성 세균성 심내막염(Subacute bacterial endocarditis: SBE), 수삭 증후군(Susac's syndrome), 시드넘 무도병(Sydenham chorea), 교감성 안염(Sympathetic ophthalmia: SO), 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경피증, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판 감소성 자반병(Thrombocytopenic purpura: TTP), 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome: THS), 횡단 척수염, 제1형 당뇨병, 궤양성 대장염(Ulcerative colitis: UC), 미분화 결합 조직 질환(Undifferentiated connective tissue disease: UCTD), 두드러기, 두드러기 혈관염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 보그트 고야나기 하라다병 및 베게너 육아종증(또는 다발혈관염을 동반한 육아종증(Granulomatosis with Polyangiitis: GPA)).
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 설명하도록 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 양호하게 기능하기 위해 본 발명자가 발견한 기술을 나타내고 따라서 본 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 개시되는 특정 실시형태에서 다수의 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예
본 명세서에 개시된 검정은 현재 표준 방법에 대해 존재하는 문제를 해결하고, FDA 요건을 충족시키는 치료용 면역 세포의 효능을 시험하는 것을 의도한다. 이를 달성하기 위해서, 파이토헤마글루티닌(PHA)을 면역 세포에서 사이토카인 생산을 유도하는 대리체로 사용한다. PHA는 이식 환자에서 면역 반응을 시험하기 위한 임상 설정에서 사용된다. PHA를 사용하여 치료용 면역 세포에서 사이토카인 생산을 유도하는 것은 면역 세포 효력 검정으로부터 생물학적 및 배취 변동성 모두를 제거할 것이다. 이러한 검정은 다수의 임상 주입 부위에서 치료용 면역 세포의 효력을 시험하기 위해 완전히 운영되는 연구 실험실을 가질 필요를 없애고, 이러한 시험에 더 신속한 호전 시간을 제공할 것이다. 이것은 FDA에 의한 효력 시험 요건 세트의 일부로서 치료용 면역 세포의 효과기 기능을 시험하는 방법을 제공할 것이다.
자극제로서 PHA를 사용한 치료용 면역 세포의 효력의 시험
치료용 면역 세포의 효과기 기능을 시험하기 위한 종양 세포의 사용은 표준 실시였다. 이들 표적 세포는 검정의 결과에 생물학적 변동성을 부가한다. 또한, 이러한 검정 설정은 표적 조건, 플레이트 설정, 기술의 개인간 차이로 인해서 변동성을 합산하는 것이 더 지루하고, 복잡하다. NK 세포의 치료 반응은 널리 사용되는 종양 세포(K562) 매개된 사이토카인 검정에 대한 PHA 사이토카인 검정의 비교를 통해서 이루어진다. 사이토카인의 수준은 NK 세포로부터의 반응의 효력을 나타낸다.
도 1은 PHA-유도된 사이토카인 검정과 표준 K562-유도된 사이토카인 검정의 상관관계를 나타낸다. 도 1에 제시된 이상치는 종양 세포에 의해서 도입된 변동성의 결과이다. GM-CSF의 더 높은 분비가 종양 세포 매개 검정에서 검출되었다(GC-CSF는 일반적으로 종양 세포에 의해 분비됨). 이것은 종양 세포 도입된 변동성 결여에 의한 PHA 검정의 명백한 이점을 나타내었다.
도 2는 4시간 인큐베이션 대 24시간 인큐베이션(1백만 개 NK 세포 사용)을 사용하여 달성된 사이토카인 수준의 히스토그램을 도시한다. 도 3은 1백만 개 미만의 세포 및 1백만 개 초과의 세포를 사용하여 달성된 사이토카인 수준의 히스토그램을 도시한다. 검정을 표준화하기 위해서 이러한 조건을 시험하였다. 도 4는 mb-IL-21 및 TGF-β로 확장된 NK 세포의 PHA 검정의 결과를 나타낸다. 도 5는 PHA에 의해 유도된 경우 공여자 면역 세포와 확장된 치료 NK 세포 산물 사이의 사이토카인 프로파일의 차이를 나타낸다.
검정을 위한 최적의 세포 수(106)를 확립한 후, 신선한 말초 혈액 NK 세포(N=10) 및 확장된 NK 세포(N=18)의 다중 공여자를 PHA로 자극하여 사이토카인을 생산하고, 1시간 후 상청액 중의 사이토카인을 평가하였다. 대부분의 사이토카인의 발현은 두 가지 유형의 NK 세포 간에 유사하지만, NK 세포 기능과 관련된 몇몇 사이토카인 및 케모카인은 자극에 대한 반응으로 매우 차등적으로 발현되었다(도 6). 다음으로, PHA로 1시간 자극한 후 신선한 NK 세포 및 확장된 NK 세포에서 6개의 사이토카인의 발현을 측정하였다. 펜트라신-3(평균 1,062 대 7), IL-8(평균 821 대 11) 및 키티나제 3-유사 1(평균 620 대 7)은 확장된 NK 세포에 비해서 신선한 NK 세포에서 고도로 과발현되었으며, IFN-γ(평균 15 대 105), IL-2(평균 3 대 141) 및 CD30(평균 9 대 156)은 신선한 NK 세포에 비해서 확장된 NK 세포에서 고도로 과발현되었다(도 7). 과발현만을 기준으로 하여 IFN-γ 및 IL-2 둘 다의 10pg/㎖ 발현의 컷오프는 신선한 말초 혈액 NK 세포로부터 확장된 NK 세포를 분화시키는 데 있어서 94% 특이성(17 중의 16) 및 89% 감도(18 중의 16)를 갖는다(도 8). 하향조절된 사이토카인(펜트라신-3 또는 키티나제 3-유사 1)과 함께 IL-2(상향조절됨)를 사용하면 신선한 말초 혈액 NK 세포로부터 확장된 NK 세포를 분화시키는 데 있어서 100% 민감하고, 특이적이었으며, 신선한 세포의 경우 발현비(하향조절됨:IL-2)는 1 초과였고, 확장된 세포의 경우에는 1 미만이었다(도 9). 하향조절된 사이토카인(펜트라신-3 또는 키티나제 3-유사 1)과 함께 IFNg(상향조절됨)를 사용하면 신선한 말초 혈액 NK 세포로부터 확장된 NK 세포를 분화시키는 데 있어서 95% 효과적이었다. 다중 상향조절 및 하향조절 사이토카인의 조합물은 정의된 유형의 감도 및 특이성을 증가시키는 데 사용될 수 있다(도 10).
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 간행물 및 그들이 인용된 자료는 참조에 의해서 구체적으로 원용된다. 그러나, 본 명세서에 참조에 의해 포함된다고 하는 임의의 특허, 간행물 또는 다른 개시 자료는 전체로 또는 부분적으로 포함된 자료가 본 개시내용에 언급된 기존 정의, 진술 또는 다른 개시 내용과 충돌하지 않는 정도까지만 본 명세서에 포함됨을 인식해야 한다. 이와 같이, 그리고 필요한 정도까지, 본 명세서에 명시적으로 언급된 바와 같은 본 개시내용은 참조에 의해서 본 명세서에 포함된 임의의 상충되는 자료를 대체한다. 본 명세서에 참조에 의해 포함된다고 하지만, 본 명세서에 언급된 기존 정의, 진술 또는 다른 개시 내용과 충돌하는 임의의 자료 또는 이의 일부는 포함된 자료와 기존의 개시 자료 간에 충돌이 발생하지 않는 정도까지만 포함될 것이다.
당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적인 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명이 특정 실시형태 및 구현예를 참조하여 기재되어 있지만, 본 발명의 범주 또는 본 발명의 개념을 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 추가 변형이 이루어질 수 있고 등가물이 그 요소를 대체할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명의 교시에 특정 상황 또는 장치를 적용하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 구현예로 제한되지 않고, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 모든 구현예를 포함할 것이도록 의도된다.
Claims (24)
- 면역 세포의 효력(potency)의 검정 방법으로서, 면역 세포를 유효량의 자극제와 접촉시키는 단계 및 상기 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계를 포함하는, 검정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생산된 사이토카인의 양을 면역요법에서 상기 면역 세포의 사용에 필요한 사이토카인 효력 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 검정 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 사이토카인의 양이 결정되는, 검정 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T-세포, 대식세포, 자연 살해(Natural Killer: NK) 세포, NK T 세포, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) T 세포 또는 CAR NK 세포인, 검정 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 면역 세포는 NK 세포인, 검정 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 NK 세포는 IL-21 확장된 NK 세포인, 검정 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극제는 파이토헤마글루티닌(hytohemagglutinin: PHA), 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)/이오노마이신, 콘카나발린 A(Con A), 지질다당류(LPS) 및/또는 포크위크 미토겐(pokeweek mitogen: PWM)을 포함하는, 검정 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인의 양은 면역검정을 사용하여 검출되는, 검정 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터류킨(interleukin: IL)-2(IL-2), IL-6, 인터페론(interferon: IFN)-γ(IFN-γ), B 세포 활성화 인자/종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 리간드 슈퍼패밀리 구성원 13B(BAFF/TNFSF13B), TNF-α, 분화 클러스터(cluster of differentiation: CD) 163(CD163), CD30/TNFRSF8, 키티나제 3-유사 1, gp130, IFN-a2, IL-6Ra, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(matrix metalloproteinase-1: MMP-1), 오스테오칼신, 오스테오폰틴(Osteopontin: OPN), 펜트라신(Pentraxin)-3, 종양 괴사 인자(TNF)-수용체 1(TNF-R1), TNF-R2, 흉선 기질상 림포포에틴(thymic stromal lymphopoetin: TSLP), 과립구-대식세포 집락-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF), 백혈병 저해성 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 및 케모카인 대식세포 염증성 단백질(macrophage inflammatory protein: MIP)-1α(MIP-1α), MIP-1β, RANTES 및/또는 아폽토시스의 TNF-관련 약한 유도인자(TNF-related weak inducer of apoptosis: TWEAK)/TNF 슈퍼패밀리 구성원 12(TWEAK/TNFSF12)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 검정 방법.
[청구항 9]
제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 유효량의 상기 자극제와 적어도 4시간 동안 접촉되는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 자극제는 5㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖의 농도로 제공되는, 검정 방법.
- 면역 세포의 효력을 검정하기 위한 키트로서, 유효량의 자극제 및 면역 세포에 적합한 완충제를 포함하는 용기를 포함하는, 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 자극제는 5㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖의 농도로 제공되는, 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 용기는 에펜도르프 마이크로원심분리기 튜브인, 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 키트는 면역 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하기 위해서 상기 키트를 사용하기 위한 설명서를 더 포함하는, 키트.
- 면역요법 방법으로서,
a. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법을 다수의 면역 세포에 대해서 수행하여 각각의 면역 세포의 효력을 결정하는 단계;
b. 검출된 사이토카인의 양에 기초하여 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택하는 단계; 및
c. 치료적 유효량의 상기 강력한 면역 세포를 상기 강력한 면역 세포의 투여를 필요로 하는 대상체에게 면역치료제로서 투여하는 단계
를 포함하는, 면역요법 방법. - 제15항에 있어서, 상기 면역 세포의 효력을 검정하기 전에 동종이계 또는 자가 공여자로부터 상기 다수의 면역 세포를 추출하는 단계를 더 포함하는, 면역요법 방법.
- 제15항에 있어서, 치료적 유효량의 상기 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 상기 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는, 면역요법 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 다수의 면역 세포 또는 상기 강력한 면역 세포를 명시된 항원에 반응하도록 유도(directing)하는 단계를 더 포함하는, 면역요법 방법.
- 제18항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 제시하도록 상기 다수의 면역 세포 또는 상기 강력한 면역 세포를 유전자 변경시키는 단계를 더 포함하는, 면역요법 방법.
- 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법으로서,
a. 1종 이상의 면역 세포를 얻는 단계;
b. 면역 세포를 유효량의 자극제와 접촉시키는 단계;
c. 상기 면역 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 검출하는 단계;
d. 검출된 사이토카인의 양에 기초하여 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 선택하는 단계; 및
e. 상기 대상체에게 치료적 유효량의 상기 강력한 면역 세포를 투여하는 단계
를 포함하는, 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법. - 제20항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포는 동종이계 또는 자가 공여자로부터 얻어지는, 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법.
- 제20항에 있어서, 동종이계 또는 자가 공여자로부터 상기 다수의 면역 세포를 추출하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T-세포, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 CAR NK 세포인, 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 상기 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 전달하기 전에 상기 적어도 1종의 강력한 면역 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 암 및/또는 전이를 치료, 저해, 감소, 예방 및/또는 개선하는 방법.
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