CN115478051B - 一种无血清高效培养人nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无血清高效培养人NK细胞的方法,所述方法无外源血清无自体血清使用,只使用细胞因子和化合物,能够高效激活扩增NK细胞,适合规模化细胞制剂的生产和临床应用,此外,所述方法培养过程中不依赖于饲养细胞,提高了使用安全性,避免了回输后由于体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响,临床应用前景广阔。

Description

一种无血清高效培养人NK细胞的方法
技术领域
本发明属于免疫细胞培养技术领域,具体而言,涉及一种无血清高效培养人NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线,不仅可以在天然免疫系统中发挥其主要的抗肿瘤效应,而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答,是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来,NK细胞因其细胞杀伤活性高、起效快、不受MHC限制等优点,相对于αβT细胞、γδT细胞和CIK等其它用于免疫治疗的细胞,NK细胞受到了更广泛的关注和临床应用。NK细胞对于机体防御和抗肿瘤至关重要,但肿瘤病人体内的NK细胞通常是功能受损的,因此,通过外源输入功能正常或经过基因改造的功能加强的NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤,即NK细胞过继治疗,是目前癌症治疗的前沿和热点。此外,NK细胞治疗对病毒或细菌感染、免疫调节等相关疾病以及抗衰老也有一定的疗效。
但是NK细胞数量较少,在外周血中仅占淋巴细胞的10%-15%,在脐带血中NK的含量更低,只有5%左右,正常人体外周血和脐带血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。然而,目前用来培养NK细胞的培养基,多为需在体外扩增阶段,不断添加市售胎牛血清、人AB血清、或患者的自体血清(外周血经淋巴细胞分离液分离出的血浆)的细胞培养基,尚无法实现“完全”无血清培养。其中,使用含胎牛血清的培养基在培养细胞时存在诸多安全问题,胎牛血清的成分复杂,诸多生物因子无法明确检测,培养基的可重复性低,影响实验的准确性,此外,在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中明确规定,严禁细胞制品中残留动物血清蛋白,增加临床风险;使用含人AB血清的培养基存在伦理及血源安全性问题,在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中同样明确规定,禁止添加同种但异体血清,如人AB血清;使用含患者自体血清的培养基存在如下问题:自体血清收集量有限,部分患者接受过化学药物治疗,自体血清受到影响,从而无法使细胞大量增殖。
因此,如何克服现有技术存在的上述不足,开发出一种新的能够高效激活扩增NK细胞、无外源血清无自体血清使用、安全有效的人NK细胞的培养方法是目前本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足,本发明的目的在于提供一种无血清高效培养人NK细胞的方法,所述方法无外源血清无自体血清使用,只使用细胞因子和化合物,能够高效激活扩增NK细胞,采用本发明提供的上述方法培养扩增得到的NK细胞数量多,扩增倍数高达800-1100倍,适用于临床大规模培养,此外,所述方法培养过程中不依赖于饲养细胞,提高了使用安全性,不但可用于自体NK细胞回输,也可以用于同种异体NK细胞的回输。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现:
本发明的第一方面提供了一种高效培养人NK细胞的无血清培养基。
进一步,所述无血清培养基包括激活培养基和扩增培养基;
所述激活培养基为含有FB23、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、PMA、PHA的H3无血清培养基;
所述扩增培养基为含有IL-2的H3无血清培养基。
进一步,所述激活培养基中各组分的浓度分别为FB23(0.5-5)ng/mL,IL-2(10-30)ng/mL,IL-7(0.5-5)ng/mL,IL-12(0.5-5)ng/mL,IL-15(20-80)ng/mL,IL-18(0.5-5)ng/mL,IL-21(0.5-5)ng/mL,IFN-γ(0.5-5)ng/mL,PMA(0.1-3)μg/mL,PHA(5-20)ng/mL。
进一步,所述扩增培养基中IL-2的浓度为(30-90)ng/mL。
进一步,所述激活培养基中各组分的浓度分别为FB23 2ng/mL,IL-2 20ng/mL,IL-7 2ng/mL,IL-12 2ng/mL,IL-15 50ng/mL,IL-18 2ng/mL,IL-21 2ng/mL,IFN-γ2ng/mL,PMA 1μg/mL,PHA 15ng/mL。
进一步,所述扩增培养基中IL-2的浓度为60ng/mL。
进一步,所述无血清培养基还包括包被培养基。
进一步,所述包被培养基包含CD3单抗、CD16单抗、CD137单抗、CD52单抗、PD-1单抗、Her-2单抗。
进一步,所述包被培养基中各组分的浓度分别为CD3单抗(0.5-1)mg/mL,CD16单抗(0.1-0.5)mg/mL,CD137单抗(0.01-0.1)mg/mL,CD52单抗(0.01-0.1)mg/mL,PD-1单抗(0.01-0.1)mg/mL,Her-2单抗(0.01-0.1)mg/mL;
进一步,所述包被培养基中各组分的浓度分别为CD3单抗0.75mg/mL,CD16单抗0.2mg/mL,CD137单抗0.05mg/mL,CD52单抗0.02mg/mL,PD-1单抗0.05mg/mL,Her-2单抗0.05mg/mL。
进一步,所述单抗配制于PBS溶液中。
在本发明的具体实施方案中,所述包被培养基用于包被培养PBMC细胞的培养皿,在实验前一天准备培养皿使用上述包被培养基在4℃条件下孵育12h,在实验开始时,弃去所述包被培养基,将PBMC细胞重悬于激活培养基,放入已经包被的培养皿中进行培养。
在本发明的具体实施方案中,本发明首次创新性地将FB23用于人NK细胞的无血清培养中,所述化合物FB23是一种有效的、选择性的FTO demethylase的抑制剂,其IC50值为60nM。FB23直接与FTO结合并选择性抑制FTO的mRNA N6-methyladenosine(m6A)demethylase(脱甲基酶)的活性。其分子量为377.22,化学式为C18H14Cl2N2O3,CAS号为2243736-35-6。
在本发明的具体实施方案中,所述PMA是指佛波醇酯类多克隆刺激剂,是DAG(二酯酰甘油)的analog,脂溶性,自由通过细胞膜,直接作用于细胞活化信息传导通路上的PKC。所述PHA是指植物血凝素类多克隆刺激剂,作用于TCR-CD3复合体引起T细胞活化。
本发明的第二方面提供了一种无血清高效培养人NK细胞的培养方法。
进一步,所述培养方法包括如下步骤:
(1)Day-1,准备抗体孵育培养皿或者培养瓶使用包被配方在4℃条件下孵育12h,得到经包被的培养皿或者培养瓶;
(2)Day 0,将外周血进行分离,得到PBMC细胞;
(3)Day 1-Day 5,采用本发明第一方面中所述的激活培养基对步骤(2)中得到PBMC细胞在步骤(1)中得到的经包被的培养皿或者培养瓶中进行培养,培养条件为37℃、5% CO2
(4)Day 6-Day 13,采用本发明第一方面中所述的扩增培养基对步骤(3)中所述的PBMC细胞进行培养,培养条件为37℃、5% CO2
(5)Day 14-Day 16,收获NK细胞。
进一步,步骤(1)中所述的包被配方为:CD3单抗、CD16单抗、CD137单抗、CD52单抗、PD-1单抗、Her-2单抗;
优选地,包被配方中各组分的浓度分别为:CD3单抗(0.1-1)mg/mL,CD16单抗(0.01-0.5)mg/mL,CD137单抗(0.01-0.1)mg/mL,CD52单抗(0.01-0.3)mg/mL,PD-1单抗(0.01-0.1)mg/mL,Her-2单抗(0.01-0.1)mg/mL;
更优选地,包被配方中各组分的浓度分别为:CD3单抗0.75mg/mL,CD16单抗0.2mg/mL,CD137单抗0.05mg/mL,CD52单抗0.02mg/mL,PD-1单抗0.05mg/mL,Her-2单抗0.05mg/mL;
优选地,步骤(2)中所述PBMC细胞的浓度为1.5×106细胞/mL,培养72h后,加入同等体积的激活培养基,第120h,检测PBMC细胞数量,加入所述激活培养基调整PBMC细胞密度为1×106细胞/mL;
优选地,步骤(3)中在第168h调整所述PBMC细胞的浓度为1×106细胞/mL,之后每48h监测PBMC细胞数,如果PBMC细胞数大于2.5×106细胞/mL,则加入所述扩增培养基调整PBMC细胞密度至1×106细胞/mL。
在本发明的具体实施方案中,本发明利用本发明第二方面提供的无血清高效培养人NK细胞的培养方法培养扩增得到的NK细胞CD3-CD56+CD16+大于80%,且NK细胞的扩增倍数高达800-1100倍,能够从外周血中高效获得满足临床使用的NK细胞,可满足用于同种异体回输的标准,不但可用于自体NK回输,也可以用于同种异体NK的回输。
本发明的第三方面提供了一种NK细胞群体或其衍生物。
进一步,所述NK细胞群体或其衍生物为采用本发明第二方面述的培养方法培养得到的;
优选地,所述NK细胞群体或其衍生物CD3-CD56+CD16+大于80%。
进一步,所述NK细胞群体或其衍生物可根据实际需要联合其他治疗剂使用。
进一步,所述治疗剂包括但不限于具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。
进一步,所述治疗剂是具有抗肿瘤活性的药物,例如可间接抑制肿瘤细胞生长、或通过激活机体免疫反应从而抑制或杀灭细胞,从而达到治疗肿瘤的化学物质、多肽、酶、细胞因子或其他具有生物活性的单一物质或混合物质,例如白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子、纳米颗粒。
进一步,所述治疗剂是细胞毒剂。在本发明中,所述细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。
进一步,所述治疗剂具体包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂;
优选地,所述烷化剂包括双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷雌氮芥、环磷酰胺、六甲密胺、三胺硫磷、卡氮芥、链唑霉素、福替目丁、环己亚硝脲、白消安、苏消安、英丙舒凡、氮烯咪胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂;
优选地,所述抗代谢物包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、克拉屈滨、脱氧柯福霉素、喷司他丁;
优选地,所述抗肿瘤抗生素包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧正定霉素、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、更生霉素、光辉霉素、光神霉素、丝裂霉素C、博来霉素、甲基苄肼;
优选地,所述有丝分裂抑制剂包括紫杉醇、紫杉萜、长春碱、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨;
优选地,所述染色质功能抑制剂包括托泊替康、依立替康、依托扑沙、磷酸依托扑沙、鬼臼噻吩甙;
优选地,所述抗血管生成剂包括丙亚胺、马马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺;
优选地,所述抗雌激素包括阿纳托唑、来曲唑、它莫西芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、奥多昔芬、依西美坦;
优选地,所述抗雄激素包括氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、安体舒通、醋酸环丙氯地孕酮、非那司提、西咪替丁;
优选地,所述免疫调节剂包括干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂。
本发明的第四方面提供了一种用于治疗和/或预防自身免疫性疾病和/或血液系统疾病和/或实体瘤的药物组合物。
进一步,所述药物组合物包含本发明第三方面所述的NK细胞群体或其衍生物。
进一步,所述自身免疫性疾病包括难治性类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、幼年特发性关节炎、系统性硬化症、韦格纳肉芽肿、抗磷脂抗体综合症、严重性重症肌无力、克罗恩病、Ⅰ型糖尿病、重症联合免疫缺陷症。
进一步,所述血液系统疾病包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症。
进一步,所述实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、鼻咽癌、腹膜后卵黄囊瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、肾母细胞瘤、肝癌、恶性神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤。
进一步,所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步,所述药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中有详细的记载,这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味,在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式,或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。优选地,所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂,这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。优选地,所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型,包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。优选地,所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方,熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
进一步,所述药物组合物中的活性成分(本发明第三方面所述的NK细胞群体或其衍生物)的实际剂量应根据多种相关因素来确定,包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重,因此,上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。
此外,本发明还提供了一种含有本发明第三方面所述的NK细胞群体或其衍生物、或本发明第四方面所述的药物组合物的生物制剂。
进一步,所述生物制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中,所述生物制剂为液态制剂。优选地,所述生物制剂为注射剂。优选地,所述生物制剂中所述NK细胞的浓度为1×102-1×1010个细胞/mL,更优地1×103-1×108个细胞/mL。
在一个实施方式中,所述生物制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等;碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白质;多肽或氨基酸诸如甘氨酸;抗氧化剂;螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽;佐剂(例如,氢氧化铝);和防腐剂。本发明的生物制剂优选配制用于静脉内施用。
在本发明的具体实施方案中,本发明所述的NK细胞群体或其衍生物、药物组合物或生物制剂可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定,如患者的病症、和患者疾病的类型和严重程度,适当的剂量可由临床试验确定。
待施用的有效量的本发明所述的NK细胞群体或其衍生物、药物组合物或生物制剂的精确量可由医师确定,其考虑患者(受试者)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出:包括本文描述的NK细胞的药物组合物或生物制剂可以以102至1010个细胞/kg体重的剂量,优选为102至109个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等,NewEng.J.of Med.319:1676,1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
施用可以以任何方便的方式进行,包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的NK细胞群体或其衍生物、药物组合物或生物制剂可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中,本发明提供的NK细胞群体或其衍生物、药物组合物或生物制剂可以通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中,本发明提供的NK细胞群体或其衍生物、药物组合物或生物制剂优选为通过i.v.注射施用。NK细胞群体或其衍生物、药物组合物或生物制剂可被直接注入病患部位,淋巴结或感染位置。
本发明的第五方面提供了如下任一方面的应用:
(1)本发明第一方面所述的无血清培养基在激活扩增获得NK细胞中的应用;
(2)本发明第三方面所述的NK细胞群体或其衍生物在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病和/或血液系统疾病和/或实体瘤的药物中的应用。
进一步,所述自身免疫性疾病包括难治性类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、幼年特发性关节炎、系统性硬化症、韦格纳肉芽肿、抗磷脂抗体综合症、严重性重症肌无力、克罗恩病、Ⅰ型糖尿病、重症联合免疫缺陷症。
进一步,所述血液系统疾病包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症。
进一步,所述实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、鼻咽癌、腹膜后卵黄囊瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、肾母细胞瘤、肝癌、恶性神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤。
本文中所述的“治疗和/或预防”,是指预防、逆转、缓和、抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的一种或多种症状的进展,治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状,即便基础病理生理学不受影响,例如,本文中所使用“治疗和/或预防血液系统疾病”包括以下一种或多种:(1)预防血液系统疾病的发生;(2)抑制血液系统疾病的发展;(3)治愈血液系统疾病;(4)缓解血液系统疾病患者的相关症状;(5)减轻血液系统疾病的严重程度;(6)防止血液系统疾病的复发。
本文中所述的“有效量”,是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如,药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量,治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素,包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。
本文中所述的“药学上可接受载体和/或辅料”或“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”,是指这样的载体、辅料、稀释剂和/或赋形剂,其并不引起对生物体的显著刺激,并且并不废除所给予化合物的生物活性和性质。
相对于现有技术,本发明具有的优点和有益效果:
目前已有的NK细胞培养方法中涉及到的培养基多为需在体外扩增阶段,不断添加市售胎牛血清、人AB血清、或患者的自体血清的细胞培养基,尚无法实现“完全”无血清培养,存在诸多不确定性和安全性问题,不适用于临床NK细胞治疗,相对于上述现有技术而言,本发明提供了一种无血清高效培养人NK细胞的方法,所述方法无外源血清无自体血清使用,只使用细胞因子和化合物,能够高效激活扩增NK细胞获得满足临床使用的NK细胞,培养扩增得到的NK细胞数量多,扩增倍数高达800-1100倍,不但可用于自体NK细胞回输,也可以用于同种异体NK细胞的回输,适合规模化细胞制剂的生产和临床应用。此外,所述方法培养过程中不依赖于饲养细胞,提高了使用安全性,避免了回输后由于体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响,临床应用前景广阔。
附图说明
图1为采用本发明所述的无血清培养基特异性扩增NK细胞的结果图;
图2为采用本发明所述的无血清培养基扩增PBMC倍数、细胞活率与有血清培养基和其他现有的无血清培养基对比结果图;
图3为采用本发明所述的无血清培养基和其他现有无血清培养基扩增NK细胞的对比结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、生物材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例无血清高效培养人NK细胞的方法
1、实验材料
本发明实施例中涉及到的实验材料见表1。
表1实验材料
Figure BDA0003886000670000101
Figure BDA0003886000670000111
2、包被配方、激活配方和扩增配方的组成
本发明所述的无血清高效培养人NK细胞的方法中包括包被配方、激活配方和扩增配方。具体组成如下:
(1)包被配方:CD3单抗0.75mg/mL,CD16单抗0.2mg/mL,CD137单抗0.05mg/mL,CD52单抗0.02mg/mL,PD-1单抗0.05mg/mL,Her-2单抗0.05mg/mL,上述单抗配制于PBS溶液中。
在实验前一天准备抗体孵育培养板或者培养瓶(根据体积决定)使用包被配方在4℃条件下孵育12h。
(2)激活配方:基础H3培养基,IL-2(长效型)20ng/mL,IL-7 2ng/mL,IL-12 2ng/mL,IL-15 50ng/mL,IL-18 2ng/mL,IL-21 2ng/mL,IFN-γ2ng/mL,PMA 1μg/mL,PHA 15ng/mL,FB23 2ng/mL。
从第一天至第五天120h内,PBMC培养于激活配方的培养基中。
(3)扩增配方:基础H3培养基,IL-2(长效型)60ng/mL。
从第120h起,补充培养基使用扩增配方。
3、无血清高效培养人NK细胞的方法
(1)从人全血中获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC):取全血20-40mL,缓慢地将全血加到15mL淋巴细胞分离液体(Ficoll分离液)中,形成两个界面。
(2)在1200g的条件下离心10min。
(3)轻柔去除上层血清。
(4)轻柔取白膜层,尽量不接触Ficoll分离液层,并收集于离心管中。
(5)向离心管中加入40mL DPBS溶液以重悬细胞。
(6)在400g的条件下离心10min。
(7)去上清。
(8)向离心管中加入40mL DPBS溶液以重悬细胞。
(9)在400g的条件下离心10min。
(10)去上清。
(11)向离心管中加入10mL H3基础培养基以重悬细胞。
(12)细胞计数,向经包被配方包被过的培养皿中加入H3基础培养基,将PBMC浓度调整到1.5×106细胞/mL。所述包被配方中包含如下组分:CD3单抗0.75mg/mL,CD16单抗0.2mg/mL,CD137单抗0.05mg/mL,CD52单抗0.02mg/mL,PD-1单抗0.05mg/mL,Her-2单抗0.05mg/mL。
(13)将本实施例中上述的激活配方按比例做预混后,加入到含有PBMC的H3培养基中。所述激活配方中包含如下组分:基础H3培养基,IL-2(长效型)20ng/mL,IL-7 2ng/mL,IL-12 2ng/mL,IL-15 50ng/mL,IL-18 2ng/mL,IL-21 2ng/mL,IFN-γ2ng/mL,PMA 1μg/mL,PHA 15ng/mL,FB23 2ng/mL。
(14)转移至37℃、5% CO2的CO2细胞培养箱中,培养72h。
(15)加入同等体积的激活培养基。
(16)第120h,检测细胞数量后加入相应的激活培养基调整细胞密度到1×106/mL。
(17)第168h,检测细胞数后加入相应的扩增培养基调整细胞密度到1×106/mL。所述扩增培养基中包含如下组分:基础H3培养基,IL-2(长效型)60ng/mL。
(18)以后每48h监测细胞数,如果细胞数大于2.5×106,则加入扩增培养基,调整细胞密度至1×106/mL。
(19)第14-16天收获细胞,CD3-CD56+CD16+大于80%,NK细胞扩增倍数高达800-1100倍。
4、流式细胞术检测PBMC细胞
在细胞培养开始之前,第0天,对PBMC进行流式检测,如图1所示,其中,上左一图划定活细胞;上中图确定靠右侧群是T细胞,靠上群是B细胞,双阴性是NK细胞;上右一图是NK细胞分的亚群,CD16+和CD56+。下左一、中图和右一三幅图是经过QM无血清培养基培养14天,再次检测相同项目,得到的NK细胞比率高达89.62%,CD16 CD56双阳性细胞为97.2%。
5、不同培养基用于扩增NK细胞的对比实验
(1)实验分组:分为专利-无血清组、专利-+自体血清组、QM无血清组共三组。其中,专利-无血清组是指采用申请号为201710858942.7的专利中公开的方法(不加入自体血清)培养扩增NK细胞,专利-+自体血清组是指采用申请号为201710858942.7的专利中公开的方法(加入自体血清)培养扩增NK细胞,QM无血清组是指采用本实施例中所述的方法培养扩增NK细胞。
(2)实验方法:在上述三种培养条件下,本实施例在第0天,第5天,第7天,第9天,第11天,第13天,第15天,用细胞计数仪计算细胞总数,并统计细胞活率。如图2所示,其中,上图为NK细胞数量的统计结果图,下图为NK细胞活率变化结果图。
针对专利-+自体血清组和QM无血清组,培养的第3天,第5天,第7天,第9天,第11天,第13天利用流式细胞术检测CD56的阳性率,观察NK细胞在PBMC中的变化,如图3所示,其中,上图为通过NK细胞的百分率和总细胞数计算出的NK细胞数量的统计结果图,下图为NK细胞的比率在培养基中培养后的变化图。
6、实验结果
结果见图1-图3,图1的结果显示采用本发明所述的QM无血清培养基培养14天后,NK细胞的比率高达89.62%,CD16 CD56双阳性细胞比例为97.2%;图2的结果显示本发明所述的QM无血清培养基可扩增高达190倍,而已有专利中公开的无血清培养基没有有效扩增,本发明所述的QM无血清培养基的扩增效果显著优于传统无血清培养基;图3的结果显示在扩增的PBMC中,本发明所述的QM无血清培养基能够有效提高NK比率,和有血清培养基的效果相当,上述对比数据证明了本发明所述的QM无血清培养基可以解决在无血清条件下,从PBMC中培养扩增NK细胞难的问题,培养效果和有血清培养基效果相当,无论是在NK细胞数量上,还是在NK细胞比率上都显著更优,本发明为本领域提供了一种新的能够高效激活扩增NK细胞、无外源血清无自体血清使用、安全有效的人NK细胞的培养方法。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种高效培养人NK细胞的无血清培养基,其特征在于,所述无血清培养基包括激活培养基和扩增培养基;
所述激活培养基为含有FB23、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、PMA、PHA的H3无血清培养基;
所述扩增培养基为含有IL-2的H3无血清培养基;
所述激活培养基中各组分的浓度分别为FB23 2 ng/mL,IL-2 20 ng/mL,IL-7 2 ng/mL,IL-12 2 ng/mL,IL-15 50 ng/mL,IL-18 2 ng/mL,IL-21 2 ng/mL,IFN-γ 2 ng/mL,PMA 1 μg/mL,PHA 15 ng/mL;
所述扩增培养基中IL-2的浓度为60 ng/mL。
2.一种无血清高效培养人NK细胞的培养方法,其特征在于,所述培养方法包括如下步骤:
(1) Day -1,使用包被配方包被抗体孵育培养皿或者培养瓶,4℃条件下包被12 h,得到经包被的培养皿或者培养瓶;
(2) Day 0,将外周血进行分离,得到PBMC细胞;
(3) Day 1- Day 5,采用权利要求1中所述的激活培养基对步骤(2)中得到PBMC细胞在步骤(1)中得到的经包被的培养皿或者培养瓶中进行培养,培养条件为37℃、5% CO2,得到激活后的PBMC细胞;
(4) Day 6- Day 13,采用权利要求1中所述的扩增培养基对步骤(3)中得到的激活后的PBMC细胞进行培养,培养条件为37℃、5% CO2
(5) Day 14- Day 16,收获NK细胞;
步骤(1)中所述的包被配方为:CD3单抗、CD16单抗、CD137单抗、CD52单抗、PD-1单抗和Her-2单抗;
步骤(1)中所述的包被配方中各组分的浓度分别为:CD3单抗 0.75 mg/mL,CD16单抗0.2 mg/mL,CD137单抗 0.05 mg/mL,CD52单抗 0.02 mg/mL,PD-1单抗 0.05 mg/mL,Her-2单抗 0.05 mg/mL。
3.根据权利要求2所述的培养方法,其特征在于,步骤(2)中所述PBMC细胞的浓度为1.5×106细胞/mL,培养72 h后,加入同等体积的激活培养基,第120 h,检测PBMC细胞数量,加入所述激活培养基调整PBMC细胞密度为1×106细胞/mL。
4.根据权利要求2所述的培养方法,其特征在于,步骤(3)中在Day 5时,调整所述PBMC细胞的浓度为1×106细胞/mL,之后每48 h监测PBMC细胞数,如果PBMC细胞数大于2.5×106细胞/mL,则加入所述扩增培养基调整PBMC细胞密度至1×106细胞/mL。
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