CN114716566A - 一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用 - Google Patents

一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用，所述融合蛋白含有细胞因子IL‑2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列，细胞因子IL‑2的氨基酸序列在酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列的N端。该融合蛋白能够作为肿瘤靶向免疫调节剂，能够通过pHLIP定位到肿瘤细胞膜表面，使得IL‑2富集在肿瘤组织，刺激肿瘤周围的CD8+T细胞及NK细胞，促进其增殖并增强其抗肿瘤活性，以增强其对肿瘤细胞的杀伤力实现免疫治疗。相比于传统的如手术治疗、放疗、化疗等治疗手段，免疫治疗毒副作用弱，可用于转移性癌症治疗，同时具有免疫记忆能力，阻止肿瘤的复发和转移。

Description

一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤技术领域，具体地，涉及一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗作为一种新兴的肿瘤治疗手段，通过调节自身的免疫系统使之能够更好地杀伤肿瘤组织，与传统的治疗手段相比，免疫治疗毒副作用弱、可用于转移性癌症治疗的治疗，同时具有免疫记忆能力，阻止肿瘤的复发和转移。
白介素2(Interleukin 2,IL-2)又被称为T细胞生长因子(T-Cell GrowthFactors,TCGF)，能够促进效应T细胞和NK细胞增殖并增强此类细胞的肿瘤细胞杀伤能力，是一种能够起到调节机体免疫功能的细胞因子，具有抑制肿瘤生长、转移等作用。但其体内半衰期很短，仅有5～7分钟；并且有效治疗剂量下的IL-2会对机体产生一定的毒副作用；其在体内还会激活Treg细胞导致机体的免疫抑制。这一系列问题严重地阻碍了IL-2作为一种免疫调节剂在肿瘤免疫治疗中的临床应用。因此，如何使IL-2靶向富集到肿瘤组织，使其能够更好的刺激CD8+T细胞和NK细胞，同时降低其对正常组织器官产生的毒副作用，进而更好地发挥免疫治疗作用至关重要。
酸性环境作为一种肿瘤普遍具有的特点，或许能够替代那些特定的生物标志物，成为一种更为通用，能够尽可能避免肿瘤异质性的新的靶点。
pHLIP(pH Low Insertion Peptide，酸响应穿膜肽)是一段长度为38个氨基酸的多肽序列，具有pH响应的特点且在体内表现出良好的稳定性。在体内正常pH条件下(pH＝7.4)，pHLIP呈现溶解于水的状态；当有膜出现时，pHLIP倾向吸附于膜表面；而在酸性pH条件下其会形成一种α螺旋结构实现穿膜。pHLIP的酸性穿膜特性对其体内半衰期的延长也有着一定作用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用，用具有肿瘤酸环境靶向的pHLIP将IL-2特异的定位到肿瘤组织，则能够使IL-2富集在肿瘤组织，刺激免疫细胞，增强对肿瘤细胞的杀伤力，其将能够促进免疫细胞增殖并增强其肿瘤细胞杀伤能力的细胞因子IL-2特异性富集到肿瘤细胞组织，从而实现免疫治疗。
本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种融合蛋白的编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌。
本发明的第五个目的是提供一种融合蛋白的制备方法。
本发明的第六个目的是提供另一种融合蛋白的制备方法。
本发明的第七个目的是提供任一所述的融合蛋白、和/或任一所述的制备方法制备得到的融合蛋白在制备肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种肿瘤靶向免疫调节剂，由具有调节机体免疫功能的细胞因子和肿瘤靶向功能的多肽两部分构成，所述的细胞因子被连接到靶向肽的N端，从而实现在肿瘤细胞膜外的富集。
所述的具有调节机体免疫功能的细胞因子为IL-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT RMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELK GSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT。
所述靶向肽为酸响应穿膜肽pHLIP，其靶向肿瘤酸性微环境，能尽可能地减小肿瘤异质性对其靶向特性的影响。其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列如下：
AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT。
因此本发明要求保护一种融合蛋白，含有细胞因子IL-2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列，细胞因子IL-2的氨基酸序列在酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列的N端。
优选地，所述细胞因子IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为一个具体的实施例本发明通过从头合成和化学偶联两种方法合成了pHLIP-IL2融合蛋白：本发明利用从头合成法即将IL-2氨基酸序列的C端与pHLIP氨基酸序列的N端通过2个氨基酸作为连接肽相连；化学偶联法即以Sulfo-SMCC作为交联剂使IL-2和pHLIP实现共价偶联。
在合成后，通过流式细胞术和激光共聚焦实验验证了融合蛋白酸性pH响应特性。又通过构建动物肿瘤模型进行了pHLIP-IL2体内靶向验证实验和体内疗效验证实验。
优选地，细胞因子IL-2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列通过连接肽连接。
作为一个具体的实施例，所述连接肽的序列为GS。
在此具体的实施例，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在此连接肽的序列和融合蛋白的氨基酸序列的给出均不作为对于在此连接肽的序列和融合蛋白的氨基酸序列的限定，利用各种不影响细胞因子IL-2的和酸响应穿膜肽pHLIP活性的连接肽得到的融合蛋白都属于本发明的保护范围。
优选地，细胞因子IL-2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列共价偶联。
更优选地，pHLIP的氨基酸序列N端加入一个半胱氨酸，以Sulfo-SMCC作为交联剂进行共价偶联。
本发明还要求保护一种融合蛋白的编码基因，所编码基因编码所述的融合蛋白。
一种重组载体，所述重组载体重组有所述的编码基因和/或表达所述的融合蛋白。
一种重组工程菌，携带有所述重组载体和/或表达所述的融合蛋白。
一种融合蛋白的制备方法，利用所述的工程菌表达所述的融合蛋白。
一种融合蛋白的制备方法，pHLIP的氨基酸序列N端加入一个半胱氨酸，以Sulfo-SMCC作为交联剂，将其与细胞因子IL-2的氨基酸序列进行共价偶联。
该融合蛋白能够作为肿瘤靶向免疫调节剂，能够通过pHLIP定位到肿瘤细胞膜表面，使得IL-2富集在肿瘤组织，刺激肿瘤周围的CD8+T细胞及NK细胞，促进其增殖并增强其抗肿瘤活性，以增强其对肿瘤细胞的杀伤力实现免疫治疗。
因此本发明要求保护任一所述的融合蛋白、和/或任一所述的制备方法制备得到的融合蛋白在制备肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为肾癌。
优选地，所述应用为缩小肿瘤体积。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的肿瘤靶向免疫调节剂是通过免疫治疗对肿瘤细胞起到杀伤作用，相比于传统的如手术治疗、放疗、化疗等治疗手段，免疫治疗毒副作用弱、可用于转移性癌症治疗，同时具有免疫记忆能力，阻止肿瘤的复发和转移；
(2)本发明利用了一种酸响应穿膜肽作为靶向肽，由于酸性微环境是大多数肿瘤所具有的特点，因而能够尽可能减小肿瘤异质性对其靶向特性的影响；
(3)本发明利用pHLIP使IL-2特异性地在肿瘤处富集，提高治疗效果的同时能够减少对正常脏器的损伤；
(4)本发明利用pHLIP酸性穿膜特性可以使得IL-2在体内的稳定性增加。
附图说明
图1为pHLIP-IL2从头合成法少量诱导表达后SDS-PAGE结果。
图2为pHLIP-IL2从头合成法大量诱导表达后SDS-PAGE结果。
图3为pHLIP-IL2从头合成法纯化后蛋白稀释5倍和10倍后SDS-PAGE结果。
图4为pHLIP-IL2化学偶联法SDS-PAGE结果。
图5为流式细胞术结果。
图6为流式细胞术MFI分析。
图7为激光共聚焦实验结果。
图8给药12小时后小鼠肿瘤及主要脏器荧光强度分布。
图9为肿瘤组织平均荧光辐射效率值分析图。
图10为不同组小鼠肿瘤抑制率分析。
图11为不同组小鼠体重变化曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 pHLIP-IL2 de novo合成(从头合成)及纯化
一、pHLIP-IL2 de novo合成及表达载体的构建
将IL-2氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)的C端与pHLIP氨基酸序列(如SEQ IDNO:2所示)的N端通过一段2个氨基酸肽(GS)相连。按照设计的氨基酸序列(如SEQ ID NO:3所示)合成对应cDNA，通过PCR克隆到pET30a质粒的EcoRI位点和XhoI位点之间，构建并验证成功得到表达载体载体。
二、重组菌株的构建
将构建好的表达载体转化到表达菌株中。取出在-80℃条件下保存的BL21感受态细细菌置于冰上缓慢解冻，加入之前合成好的表达载体，于冰上放置30分钟。随后在42℃条件下热激感受态细胞90秒，冰浴2分钟周加入800μl的不具有抗性的LB培养基，并于37℃条件下培养45分钟。以5000rpm的转速对培养的细胞离心，去除大部分上清，剩余体积约为100至150μl，重悬细胞后选择有相应抗性的LB平板涂板，晾干后置于37℃培养箱过夜。
三、小量诱导表达
1、实验方法
对转化后的菌株进行小量诱导表达以验证蛋白表达情况。从完成转化的LB平板中挑选单克隆细胞转移到1.5ml LB培养基中，在37℃条件下以200rpm转速培养，当培养至OD值在0.6至0.8时加入0.5mM的IPTG诱导，按照同样的培养条件培养2小时。随后取1ml诱导表达的菌液，在12000rpm转速下离心1分钟，弃掉上清，加入50ml 10mM的Tris-HCl(pH＝8)，充分吹打均匀后加入两倍体积的loading buffer，于100℃条件下煮5分钟，用15％的SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测，验证蛋白表达情况。
2、实验结果
结果如图1所示，实验结果表明pHLIP-IL2融合蛋白成功表达。
四、大量诱导表达
1、实验方法
随后对表达菌株进行大量诱导表达，并检测蛋白表达形式。取400μl菌液至20ml具有相应抗性的LB培养基中，在37℃条件下200rpm转速培养，随后转移至1000ml LB培养基中以相同条件培养，培养至OD值在0.6至0.8时加入0.5mM的IPTG诱导，在16℃条件下过夜培养。随后以8000rpm的转速离心6分钟，弃掉上清液，用20ml 10mM的Tris-HCl(pH＝8.0)溶液将沉淀吹打均匀，随后以500W功率，间隔5秒，工作5秒的参数超声破菌180次。取100μl超声后的悬液，以12000rpm转速离心10分钟，取50μl上清液留作后续电泳检测，加入50μl 10mM的Tris-HCl(pH＝8.0)溶液吹散沉淀，与之前的上清液以及破菌后未处理的原液共同上15％的SDS-PAGE检测蛋白表达形式。
2、实验结果
结果如图2所示，目的蛋白大量表达且分子量与预期一致。
五、纯化蛋白
在确定蛋白质表达形式为包涵体后，采用包涵体纯化方式来纯化蛋白。将超声后得到的溶液以12000rpm转速离心10分钟，弃上清，用20ml 10mM的Tris-HCl(pH＝8.0)重悬沉淀静置10分钟。重复上一步操作2次以洗净沉淀。随后加入1ml 10mM的Tris-HCl(pH＝8.0)溶液重悬沉淀，再加入10ml含有8M尿素的10mM的Tris-HCl(pH＝8.0)溶液溶解蛋白质，12000rpm转速离心10分钟后收集上清液，并取50μl电泳。
六、蛋白进行复性
1、实验方法
采用浓度梯度透析的方法对纯化后的蛋白进行复性。配制500ml透析Buffer(含1％甘氨酸、0.1％SDS、5％甘油、10mM Tris-HCl)，用配好的透析Buffer去分别配制尿素浓度为6M、4M、2M的浓度梯度Buffer。取1ml纯化后的蛋白于透析袋中，加入50ml含6M尿素的透析Buffer在4℃条件下透析3h，随后将Buffer更换为含4M尿素的Buffer在4℃条件下透析3h，最后更换为含2M尿素的Buffer在4℃条件下透析过夜，以完成蛋白复性。随后用含4％甘氨酸、10mM Tris-HCl的Buffer透析3小时以完成对蛋白Buffer的更换。
之后用15％的SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide GelElectrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测蛋白的纯化情况。
2、实验结果
结果如图3所示，实验结果得到纯度超过95％的pHLIP-IL2融合蛋白。
实施例2 pHLIP-IL2化学偶联合成
一、实验方法
采用Sulfo-SMCC作为连接剂。Sulfo-SMCC同时具有Sulfo-NHS酯基团和马来酰亚胺基团的交联剂，在pH 7～9的条件下NHS基团能和蛋白的伯胺基团反应形成酰胺键，而在pH 6.5～7.5的条件下马来酰亚胺基团能和蛋白的巯基反应形成硫醚键。
为了实现共价偶联的目的，对pHLIP多肽序列进行了设计，在pHLIP原序列(如SEQID NO:2所示)的N端加入一个半胱氨酸用于后续与马来酰亚胺基团反应。采用固相多肽合成的方法合成重新设计合成多肽，并通过HPLC验证纯度，MS验证分子量。
用1ml无菌水溶解1mg IL-2冻干粉(如SEQ ID NO:1所示)，随后取100μl于EP管中加入100μl PBS Buffer混匀，再加入300μl浓度为1mg/ml的Sulfo-SMCC溶液，于摇床上缓慢摇晃反应3小时。随后用NAP-5脱盐柱除去过量的Sulfo-SMCC。再加入200μl浓度为1mg/ml的pHLIP溶液，于4℃摇床上缓慢摇晃反应过夜。采用BCA定量方法测定融合蛋白产物浓度，发现蛋白浓度过低不利于后续SDS-PAGE检测，于是采用超滤的方法，用3kD超滤管以12000rpm超滤30分钟浓缩蛋白，再次使用BCA定量的方法检测蛋白浓度。随后取20μl进行15％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色检测。
二、实验结果
结果如图4所示，实验结果表明，成功采用化学偶联合成的方法，获得pHLIP-IL2融合蛋白。
实施例3流式细胞术检测pHLIP-IL2酸性pH响应特性
一、实验方法
1、对pHLIP-IL2融合蛋白进行荧光标记。
用1ml枪头蘸取20倍摩尔量过量的荧光染料Cy5.5-NHS溶解于100μl DMSO中，加入900μl PBS Buffer稀释吹打均匀后取500μl加入1ml 0.5mg/ml的实施例1制备得到的pHLIP-IL2融合蛋白溶液中，在4℃条件下反应4小时。随后用3kD超滤管以12000rpm转速超滤30分钟以除去蛋白中过量的Cy5.5-NHS，得到了Cy5.5标记的pHLIP-IL2融合蛋白。
2、pHLIP-IL2融合蛋白与细胞反应
复苏一管B16细胞，使用含10％FBSDMEM培养基培养，经传代扩增后提前一天铺六孔板，每孔铺105个细胞。培养一天后除去原有培养基，使用PBS Buffer清洗两遍，随后分别加入正常pH值培养基和使用盐酸调节pH为6.5的培养基，每孔加入20μl用Cy5.5标记的pHLIP-IL2融合蛋白(0.1mg/ml)，在冰上孵育10分钟后分别用对应pH的PBS Buffer洗涤两遍，随后每孔加入300μl胰酶消化1分钟。加入对应pH值的培养基终止消化后，以1000rpm转速离心5分钟，去除上清后用500μl对应的PBS Buffer重悬细胞，随后上流式细胞仪检测。每个样品检测104个细胞。
二、实验结果
结果如图5到6所示，实验结果表明，pHLIP-IL2融合蛋白能够在微酸条件下与肿瘤细胞高效结合，而在中心PH值条件下几乎不结合。
实施例4激光共聚焦检测pHLIP-IL2酸性pH响应特性
一、实验方法
复苏一管HUVEC细胞，使用含10％FBSDMEM培养基培养，经传代扩增后铺共聚焦皿，铺皿时对细胞计数，每皿铺5000个细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。取出培养皿，除去培养基后用PBS Buffer清洗两遍，随后分别加入pH 7.4和pH 6.5的培养基，每皿加入10μl实施例3制备的Cy5.5荧光标记的pHLIP-IL2融合蛋白(0.1mg/ml)，于冰上孵育10分钟。用对应pH的PBS Buffer清洗两遍后每皿加入500μl 1:2000稀释的Hoechst 33342荧光染料染细胞核10分钟。清洗两遍后加入PBS Buffer上共聚焦检测。
二、实验结果
结果如图7所示，pHLIP-IL2融合蛋白能够在微酸环境下靶向结合肿瘤细胞，与之前的流式细胞术结果相一致。
实施例5 pHLIP-IL2的肿瘤靶向免疫调节作用
一、动物皮下肿瘤模型构建
复苏一管Renca鼠源肾癌细胞，使用含10％FBS的DMEM培养基培养，经传代扩增后用胰酶消化，随后用预冷的PBS Buffer洗涤并重悬，经计数调整细胞浓度为2.0×107/ml，加入等体积的基质胶吹匀，接种到6～8周的Balb/c白鼠的右侧背部皮下，每只接种106个细胞，构建皮下肿瘤模型。
二、pHLIP-IL2体内靶向验证实验
1、实验方法
取肿瘤体积在200～300mm3左右(肿瘤体积计算公式：体积＝长×宽2×0.5)的小鼠分为对照组、IL-2组、K-pHLIP-IL2组和pHLIP-IL2组四组，以尾静脉注射的方式进行给药。其中，pHLIP-IL2组小鼠每只给8μg实施例3制备的Cy5.5荧光标记的pHLIP-IL2融合蛋白；K-pHLIP-IL2组小鼠每只给8μg对应Cy5.5标记的K-pHLIP-IL2，K-pHLIP-IL2为pHLIP突变的融合蛋白，不具有酸响应行为(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)；IL-2组每只给4μgCy5.5标记的IL-2；对照组注射相同体积的生理盐水。
分别在不同时间点对小鼠进行活体荧光成像，分析其体内的Cy5.5荧光信号分布，并在12小时后将小鼠处死解剖，将肿瘤及主要脏器进行荧光成像进行分析。
2、实验结果
实验结果表明，相比于对照组，pHLIP-IL2融合蛋白治高效靶向肿瘤组织(图8和图9)。
三、pHLIP-IL2体内抗肿瘤治疗
待小鼠肿瘤体积达到100mm3左右后，将小鼠分为对照组、IL-2/pHLIP组、K-pHLIP-IL2组和pHLIP-IL2组，每组数量为5只，每两天通过尾静脉注射治疗一次。
pHLIP-IL2组小鼠每只给8μg实施例3制备的Cy5.5荧光标记的pHLIP-IL2融合蛋白；K-pHLIP-IL2组小鼠每只给8μg对应Cy5.5标记的K-pHLIP-IL2，K-pHLIP-IL2为pHLIP突变的融合蛋白，不具有酸响应行为(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)；IL-2/pHLIP组给药量为每只4μg IL-2和4μg pHLIP，对照组注射相同体积的生理盐水。每两天测量肿瘤体积及体重，评价pHLIP-IL2的肿瘤治疗效果。
2、实验结果
实验结果表明，pHLIP-IL2能够显著抑制肿瘤组织的生长，具有很好的抗肿瘤效果(图10)。除此之外，pHLIP-IL2治疗不会引起小鼠的体重发生明显的变化，具有较好的生物安全性(图11)
进一步的实验发现实施例2化学合成的融合蛋白pHLIP-IL2以及利用其它的连接肽按照实施例1从头合成的融合蛋白都是是具有一致的生理功能，均可用于后续肿瘤的治疗以及抗肿瘤机制探究，其各方面的生理活性(包括对于肿瘤组织的抑制)与实施例1制备得到的融合蛋白类似。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院
<120> 一种融合蛋白及其在制备肿瘤药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 3
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gln Asn Pro
145 150 155 160
Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu
165 170 175
Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp Glu Gly Thr
180 185 190
<210> 4
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gln Asn Pro
145 150 155 160
Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Lys Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu
165 170 175
Leu Leu Lys Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp Glu Gly Thr
180 185 190

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，含有细胞因子IL-2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列，细胞因子IL-2的氨基酸序列在酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列的N端。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，细胞因子IL-2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列通过连接肽连接。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，细胞因子IL-2的氨基酸序列和酸响应穿膜肽pHLIP的氨基酸序列共价偶联。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，pHLIP的氨基酸序列N端加入一个半胱氨酸，以Sulfo-SMCC作为交联剂进行共价偶联。
5.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，所编码基因编码权利要求1或2所述的融合蛋白。
6.一种重组载体，其特在在于，所述重组载体重组有权利要5所述的编码基因和/或表达权利要求1到4任一所述的融合蛋白。
7.一种重组工程菌，其特在在于，携带有权利要求6所述重组载体和/或表达权利要求1到4任一所述的融合蛋白。
8.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，利用权利要求7所述的工程菌表达权利要求1到4任一所述的融合蛋白。
9.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，pHLIP的氨基酸序列N端加入一个半胱氨酸，以Sulfo-SMCC作为交联剂，将其与细胞因子IL-2的氨基酸序列进行共价偶联。
10.权利要求1到4任一所述的融合蛋白、和/或权利要求8或9任一所述的制备方法制备得到的融合蛋白在制备肿瘤药物中的应用。
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