CN108147990B - 一种膜锚定元件及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种膜锚定元件，至少由三部分组成：用于与目的分子连接的化学基团；与上述化学基团连接的亲水性化合物；用于与细胞膜结合的疏水性化合物，该疏水性化合物连接在上述亲水性化合物上。本发明还提供了包括该膜锚定元件的目的分子、细胞及其制备方法。本发明通过上述膜锚定元件提供了一种新的细胞工程技术，为免疫治疗等提供了新方向及操作方式。

Description

一种膜锚定元件及其应用
技术领域
本发明涉及一种能与细胞膜结合的膜锚定元件，以及连接有该膜锚定元件的目的分子、细胞及其应用。
背景技术
癌症是一种严重威胁人类身心健康的重大疾病。尽管随着人类基因组计划的顺利实施和癌变分子机理的深入揭示，癌症治疗方法得以不断地改进和更新，但是癌症发病率和死亡率依然居高不下。为提高癌症治疗效率，延长癌症患者生存期，改善癌症患者生活质量，发展更有效的癌症治疗方法势在必行。
近年来，癌症免疫治疗发展迅猛，取得了骄人的成绩，在2013年被《科学》杂志列为年度十大科学突破之首。细胞免疫治疗是癌症免疫疗法的重要支柱，以CAR-T(嵌合性抗原受体-T细胞)技术为引领的细胞免疫治疗临床试验正在世界各国广泛开展。然而这一技术目前亦面临重大挑战，如细胞因子风暴、脱靶效应等。
NK细胞又叫自然杀伤细胞，是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，属于一类独立的淋巴细胞，主要分布于外周血，肝脏和脾脏。该细胞是抗肿瘤的第一道防线，无需抗原预先致敏即可直接识别和杀伤肿瘤细胞，能发挥非特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有快速杀伤和溶解的作用。
NK细胞(自然杀伤细胞)免疫治疗是另一种极具前途的癌症免疫治疗新方法，甚至有人认为CAR-NK(嵌合性抗原受体-NK细胞)可能比CAR-T效果更好，因为CAR-NK不产生细胞因子风暴，即使CAR脱靶发生，NK细胞依然能够发挥抗肿瘤效应，且不会对正常组织和细胞产生杀伤效应。然而CAR-NK虽然具有重大优势，但由于NK细胞转染技术的限制，CAR-NK应用目前仅限于NK细胞系。
NK细胞系其本身是一种癌症细胞，因此，在给予病人之前，细胞必须进行致死性辐照，这样的NK细胞在体内的杀伤效应极低，难以达到满意的治疗效果。此外，尽管体外扩增的NK细胞过继治疗在针对某些血液肿瘤的临床试验中取得了较好成绩，但由于癌症免疫抑制环境的影响，NK细胞在输入患者体内后会被迅速训化，使其失去对癌细胞的识别与杀伤，致使NK细胞免疫治疗效应，特别是对实体肿瘤的治疗，难以达到预期目标。还由于NK细胞体内存活时间较短，往往需要大剂量反复给予，增加了技术难度和治疗花费；而且目前的高效率NK细胞体外扩增技术主要依赖于K562人工抗原提呈细胞或mIL-21修饰的K562细胞，K562细胞本身是一种白血病细胞，需要进行致死性照射方能应用，不利于大规模推广与应用。
因此，本领域技术人员致力于开发一种全新的细胞工程技术，以增强细胞，尤其是免疫细胞对于癌细胞的识别与杀伤，提高在体内的存活时间，并降低被癌症免疫抑制环境驯化等缺陷。
发明内容
有鉴于现有技术中的免疫细胞对于癌细胞的识别与杀伤不高，或在体内的存活时间段，并容易被癌症免疫抑制环境驯化等缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞工程技术，挣钱免疫细胞对于癌细胞的识别与杀伤，或提高在体内的存活时间，并降低被癌症免疫抑制环境驯化等。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种膜锚定元件，其至少由三部分组成：
第一部分：用于与目的分子连接的化学基团；
第二部分：亲水性化合物，所述化学基团连接在所述亲水性化合物上；
第三部分：用于与细胞膜结合的疏水性化合物，所述疏水性化合物连接在所述亲水性化合物上。
进一步地，第一部分中的化学基团能与氨基或巯基发生反应。
进一步地，与氨基发生反应的化学基团包括异硫氰酸类、异氰酸酯、酰基叠氮、N-羟基琥珀酰亚胺酯和磺酰氯化物中的一种或多种；与巯基发生反应的化学基团包括马来酰亚胺、氮杂环丙烷、丙烯酰基衍生物、三卤乙酰衍生物和卤代烷衍生物中的一种或多种。
进一步地，亲水性化合物包括PEG、亲水氨基酸、带电氨基酸中的一种或者多种。
进一步地，疏水性化合物为饱和脂肪酸链。
优选地，饱和脂肪酸链的碳链长度在12～22之间。
本发明的第二方面提供了一种制备膜锚定元件的方法，所述膜锚定元件至少由三部分组成：
第一部分：用于与目的分子连接的化学基团；
第二部分：亲水性化合物，所述化学基团连接在所述亲水性化合物上；
第三部分：用于与细胞膜结合的疏水性化合物，所述疏水性化合物连接在所述亲水性化合物上；
所述方法为使用多肽固相合成方法。
优选地，上述多肽固相合成方法为Fmoc法。
进一步地，该方法先合成所述第二部分，然后偶联所述第一部分，最后偶联所述第三部分。
本繁忙的第三部分提供了一种膜锚定目的分子，包括上述膜锚定元件。
进一步地，该膜锚定目的分子能用于特异性靶点识别或在选定的位置聚集。
进一步地，该膜锚定目的分子还包括目的分子，该目的分子为调节因子、抗体、能与其它蛋白相互作用的蛋白。
进一步地，上述调节因子为激活或抑制细胞的反应或应答的蛋白或抗体，或能与激活或抑制细胞的反应或应答的蛋白相互作用的蛋白。
进一步地，目的分子为细胞激活因子、免疫激活因子、抗体片段和拮抗配体中的一种或多种。
进一步地，目的分子具有氨基或巯基。
进一步地，上述氨基或巯基来自目的分子的蛋白序列中半胱氨酸残基、赖氨酸残基或蛋白序列N端的α氨基。
优选地，目的分子的蛋白序列N端或C端具有半胱氨酸残基或赖氨酸残基或在蛋白表面具有赖氨酸残基。
进一步地，细胞包括NK细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤细胞或外周血单核细胞。
进一步地，细胞为NK细胞，目的分子为NK细胞激活因子、受体、单抗或抗体scFv。
进一步地，NK细胞激活因子为IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-2中的一种或多种，受体为CD137L。
进一步地，膜锚定元件的化学基团与氨基或巯基发生反应；亲水性化合物包括PEG、亲水氨基酸、带电氨基酸中的一种或者多种；疏水性化合物为饱和脂肪酸链。
优选地，饱和脂肪酸链的碳链长度在12～22之间。
本发明的第四方面提供了一种膜锚定目的分子的制备方法，膜锚定目的分子包括如上所述的膜锚定元件，该制备方法包括：目的分子的表达；膜锚定元件的制备；所述目的分子与所述膜锚定元件的化学偶联。
进一步地，上述目的分子的表达包括：构建目的分子的原核表达载体、诱导表达及纯化。
进一步地，上述构建包括在所述目的分子的蛋白序列N端或C端引入半胱氨酸残基或赖氨酸残基。
进一步地，上述表达为包涵体表达，将表达获得的所述目的分子的包涵体进行复性。
进一步地，上述化学偶联为通过所述目的分子蛋白序列的N端或C端的半胱氨酸或赖氨酸残基、蛋白表面的赖氨酸残基或蛋白序列N端的α氨基与所述膜锚定元件进行化学偶联。
进一步地，化学偶联为通过所述目的分子的蛋白序列N端或C端的半胱氨酸残基或赖氨酸残基与所述膜锚定元件进行化学偶联。
本发明的第五方面提供了一种细胞，包括如上所述的膜锚定元件或如上所述的膜锚定目的分子。
进一步地，该细胞包括NK细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤细胞及外周血单核细胞。
进一步地，该细胞为NK细胞，与膜锚定元件化学偶联的目的分子为NK细胞激活因子、受体、单抗或抗体scFv。
进一步地，该细胞为外周血单核细胞，与膜锚定元件化学偶联的目的分子为NK细胞激活因子、受体、单抗或抗体scFv。
本发明的第六方面提供了上述细胞在制备癌症的NK细胞免疫治疗的制剂中的应用。
本发明的第七方面还提供了上述膜锚定元件在制备抗癌制剂或免疫治疗制剂中的应用。
本发明提供了一种全新的细胞工程技术，通过膜锚定元件将目的分子表达或展示在细胞表面，从而使目的分子发挥各种生物学功能，如调节细胞的免疫应答反应、激活免疫细胞、抑制肿瘤细胞、标记靶细胞等。通过膜锚定元件能使目的分子特异性的展示在细胞表面。其中，膜锚定元件的第一部分用于与目的分子连接，第二部分亲水性化合物保证了膜锚定元件的水溶性和与蛋白分子的空间位阻，第三部分疏水性化合物用于和细胞膜进行锚定。
该细胞工程技术为免疫治疗提供了新方向。比如对于NK细胞，通过膜锚定元件，将NK细胞激活、扩增和重靶向等所需要的细胞因子、CAR的单链可变片段(scFv)、靶向分子等锚定到NK细胞表面，从而实现NK细胞的自我激活、自称扩增和靶向再分布，并通过其携带的细胞因子激活癌症患者T细胞，改善癌症患者免疫抑制环境，实现高效精准的癌症免疫治疗。对于NK细胞，解决NK细胞转染困难，体外扩增依赖修饰的K562细胞，体内存活时间短且易被癌症免疫抑制环境驯化等缺陷。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的膜锚定元件的一个示意图。
图2是本发明的一个实施例的膜锚定元件与目的分子化学偶联的示意图。
图3是本发明的一个实施例的膜锚定目的分子结合到细胞膜表面的示意图。
图4是本发明的一个实施例中IL-21的SPBB纯化图。
图5是本发明的一个实施例中IL-21通过SPBB纯化后的SDS-PAGE检测结果图。其中，蛋白Marker条带从下往上为10、15、20、25、37、50、75、100、150和250KDa。
图6是本发明的一个实施例中IL-21的30S纯化图。
图7是本发明的一个实施例中IL-21通过30S纯化后的SDS-PAGE检测结果图。其中，蛋白Marker条带从下往上为10、15、20、25、37、50、75、100、150和250KDa。
图8是本发明的一个实施例中IL-21与膜锚定元件化学偶联前后的SDS-PAGE检测结果图。其中，蛋白Marker条带从下往上为10、15、20、25、37、50、75、100、150和250KDa。
图9是本发明的一个实施例中MA-IL21对NK细胞锚定效率的流式细胞仪检测图。
图10是本发明的一个实施例的MA-IL21-NK的脱颗粒效应流式细胞仪检测图。
图11是本发明的一个实施例的MA-IL21-NK的对肺癌H1299细胞的杀伤效应流式细胞仪检测图。
图12是本发明的一个实施例的MA-IL21-NK的肺癌A549细胞的杀伤效应流式细胞仪检测图。
图13是膜结合细胞因子激活NK细胞过程的示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
膜锚定元件
膜锚定元件由三部分构成：
第一部分：用于与目的分子连接的化学基团。该化学基团可以与氨基或巯基发生反应。与氨基发生反应的化学基团包括异硫氰酸类(Isothiocyanates)、异氰酸酯(Isocyanates)、酰基叠氮(Acyl Azides)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide(NHS)easter)和磺酰氯化物(Sulfonyl Chlorides)；与巯基发生反应的化学基团包括马来酰亚胺(Maleimides)、氮杂环丙烷(Aziridines)、丙烯酰基衍生物(AcryloylDerivatives)、三卤乙酰衍生物(Haloacetyl)和卤代烷衍生物(Alkyl HalideDerivatives)。
其中，氨基或者巯基来源于目的分子蛋白序列中的半胱氨酸残基、赖氨酸残基或蛋白序列N端的α氨基。进一步地，氨基或巯基来源于目的分子蛋白序列的N端或C端的半胱氨酸或赖氨酸残基、蛋白表面的赖氨酸残基或蛋白序列N端的α氨基。这些氨基或者巯基可以是目的分子天然蛋白序列就带有的，或者通过构建修饰获得的。
第二部分：亲水性化合物，上述化学基团连接在该亲水性化合物上。该亲水性化合物包括PEG、亲水氨基酸、带电氨基酸。由于大部分能与细胞膜结合的因子都是非常疏水的，因此，第二部分的存在保证了膜锚定元件的水溶性和与蛋白分子之间的空间位阻。
第三部分：与细胞膜结合的疏水性化合物，疏水性化合物连接在亲水性化合物上。该疏水性化合物如饱和脂肪酸链，优选地，其碳链长度范围从12～22碳均可。本领域技术人员可知，除了饱和脂肪酸链外，其他能与细胞结合的化合物也能作为膜锚定元件的第三部分。
膜锚定元件的一个示意性例子如图1所示，其中，“接头”为第二部分。
膜锚定元件的一个具体例子如下方化学结构式I所示，其中第一部分为：马来酰亚胺；第二部分为：赖氨酸-PEG2-gama-谷氨酸；第三部分为：C17脂肪酸链。化学式为：C14H69N5O12，分子量为823.49。
Figure BDA0001169534390000061
膜锚定元件的制备
膜锚定元件主要通过多肽固相合成获得，具体地，1)使用Fmoc法，形成第二部分；2)使用Fmoc法，将第三部分偶联到第二部分上，形成第二部分-第三部分；3)使用Fmoc法，将第一部分偶联到上述第二部分-第三部分上，形成膜锚定元件。
更具体地，对于一个实施例的膜锚定元件的多肽固相合成方法如下：
将Fmoc修饰的含氨基酸1的树脂转入多肽合成反应器中溶胀，之后脱去Fmoc保护基。加入Fmoc修饰的PEG，溶解和鼓氮气反应进行偶联。再加入Fmoc修饰的氨基酸2，溶解和鼓氮气反应进行偶联。然后偶联第三部分脂肪酸链，最后偶联第一部分。获得了含膜锚定元件的树脂。
利用树脂裂解液除去树脂，获得膜锚定元件粗品。
利用Pre-HPLC分离纯化膜锚定元件。
膜锚定元件的应用
膜锚定元件可以有效、甚至高效地携带目的蛋白分子，锚定在细胞膜表面。这种新的细胞工程方法，可以应用于基础生物学研究，比如蛋白功能研究、特定蛋白的相互作用蛋白研究等提供了良好的基础，还可以应用于免疫治疗中，如癌症免疫治疗和免疫相关疾病如感染性疾病的治疗。
膜锚定目的分子
膜锚定目的分子包括膜锚定元件和目的分子。膜锚定元件如上所述。
目的分子可以是任何需要表达或展示在细胞表面的蛋白，如细胞的调节因子、抗体、能与其它蛋白相互作用的蛋白。因此，目的分子能够发挥各种生物学功能，如调节细胞的免疫应答反应、激活免疫细胞、抑制肿瘤细胞、标记靶细胞等。举例来说，目的分子可以是NK细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤细胞或外周血单核细胞的细胞激活因子、免疫激活因子、抗体片段和拮抗配体等。
目的分子具有与膜锚定元件反应的氨基或巯基。该氨基或巯基不是在目的分子蛋白生物活性位点。氨基或者巯基来源于目的分子蛋白序列中的半胱氨酸残基、赖氨酸残基或蛋白序列N端的α氨基。进一步地，目的分子的蛋白序列的N端或C端具有半胱氨酸残基或赖氨酸残基、在蛋白表面具有赖氨酸残基或在蛋白序列的N端具有α氨基，用以与膜锚定元件化学偶联。目的分子的蛋白序列的N端或C端半胱氨酸残基或赖氨酸残基可以是目的分子本身就具有的，也可以是通过中间质粒构建过程中通过构建和修饰获得的。
氨基和巯基的区别在于化学反应的选择性，巯基比氨基强，根据需要进行选择。
举例来说，膜锚定目的分子可以含有NK细胞激活因子、受体、单抗或抗体scFv，以作用于NK细胞。进一步地，上述NK细胞激活因子为IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或IL-2，上述受体可以是CD137L。
此外，膜锚定目的分子还能用于特异性靶点识别或在选定的位置聚集。比如，通过装载的目的分子，和该目的分子识别的特异性靶点进行结合。还可以通过装载的目的分子，聚集到选定的位置，比如细胞膜上，从而执行生物学功能。
膜锚定目的分子的制备
膜锚定目的分子的制备包括：
1)目的分子的制备；
2)膜锚定元件的制备；
3)目的分子与膜锚定元件的化学偶联。
目的分子通过原核表达制备获得。将目的分子构建到原核表达载体上。若目的分子不含有可用于和膜锚定元件进行反应的氨基或巯基，则在构建时，在目的分子上修饰氨基或巯基。优选地，可以在目的分子的非蛋白活性部位修饰半胱氨酸残基或赖氨酸残基。更进一步地，可以在目的分子的蛋白序列N端或C端引入半胱氨酸残基或赖氨酸残基。将构建的原核表达质粒转化宿主细胞，进行诱导表达，对获得的包涵体进行变性、复性及纯化，获得目的分子。其中，原核表达载体可以是PET系列载体，也可以是其他适用于原核表达的载体。
本领域技术人员可知，目的分子还可以通过可溶性表达、整合表达、真核表达等方式获得。
膜锚定元件的制备如上所述，此处不再赘述。
分别获得目的分子和膜锚定元件后，通过目的分子上的氨基或巯基与膜锚定元件的第一部分中的化学基团反应进行化学偶联。具体地，可以通过目的分子的N端或C端的半胱氨酸残基或赖氨酸残基，与膜锚定元件第一部分中的化学基团进行化学偶联；或通过目的分子表面的赖氨酸残基或N端的α氨基与膜锚定元件第一部分中的化学基团进行化学偶联。所述化学偶联的举例示意图如图2所示。
具有膜锚定目的分子的细胞
将上述膜锚定目的分子与细胞孵育，使得膜锚定元件中的第三部分即疏水性化合物与细胞结合，从而将目的分子表达或展示在细胞膜表面，获得具有膜锚定目的分子的细胞，该过程的示意图如图3所示。
这些细胞可以是K细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤细胞及外周血单核细胞等，形成具有膜锚定目的分子细胞后，可以用于疾病的免疫治疗。
举例来说，将带有NK细胞激活因子的膜锚定目的分子锚定到NK细胞表面，可以用于癌症的NK细胞免疫治疗。将带有NK细胞激活因子的膜锚定目的分子锚定到外周血单核细胞(PBMC)表面，可以用于NK细胞的体外扩增以大规模生产和制备NK细胞。上述具有膜锚定目的分子的细胞，可以用于进行癌症的NK细胞免疫治疗。
膜锚定目的分子激活及扩增NK细胞的示意图如图13所示，其中目的分子为细胞因子。膜锚定目的分子结合到NK细胞的细胞膜上，目的分子(细胞因子)与NK细胞表面受体结合并发生作用，实现NK细胞的激活及扩增。
以下以IL-21为例进行具有膜锚定目的分子的NK细胞的制备与功能评价，实际上根据需要亦可用其它分子如IL-12、IL-15、IL-18等NK细胞激活因子或其它免疫激活因子、抗体片段、拮抗配体等锚定NK细胞进行癌症免疫治疗。
实施例1制备膜锚定元件
多肽固相合成：
1.以0.4mmol/g的Fmoc-Lys(Dde)-wang树脂(购自Kerabaybio)为起始树脂。
称取5g树脂(2mmol)，转入多肽合成反应器，用50ml的DMF溶胀2小时。
2.用50ml 20％哌啶的DMF溶液处理树脂30分钟，脱去Fmoc保护基，用甲醇和DMF交替洗涤3次，并真空抽干。
3.称取2.31g Fmoc-PEG2-OH(3倍体积)、HBTU:2.24g(2.95倍体积)、NMM:1.34ml(6倍体积)，依次加入上述物料，加少量DMF溶解，鼓氮气反应1小时，取样做茚三酮检测(Kaiser test)，如检测结果为阴性，则偶联完成，如果检测结果为阳性，则需要重复投料。偶联完成后，用DMF洗涤树脂4次，重复第2步操作。
4.完成脱Fmoc后，称取Fmoc-gama-Glu-OtBU 2.55g(3eq)、HBTU:2.24g(2.95eq)、NMM:1.34ml(6eq)，依次加入上述物料，加少量DMF溶解，鼓氮气反应1小时，取样做茚三酮检测(Kaiser test)，如检测结果为阴性，则偶联完成，如果检测结果为阳性，则需要重复投料。
5.再次重复第2步操作，按照上述同样的方法偶联十七烷酸，茚三酮检测(Kaisertest)偶联完成后，用2.5％的水合肼的DMF溶液处理树脂30分钟(脱去Dde保护基)，用甲醇和DMF交替洗涤3次，并真空抽干。
6.按照第3步方法偶联3-马来酰亚胺基丙酸(3-Maleimidopropionic acid)，完成偶联后用甲醇洗涤4次，获得含膜锚定元件的树脂。
7.若不直接进行后续实验，则可以真空干燥备用。
树脂裂解：
树脂裂解液配置：体积配比为TFA：Tis：H2O＝95：2.5：2.5，配置100ml。
将配置好的裂解液加入到上述含膜锚定元件的树脂中，磁力搅拌2.5小时，用3#砂芯(购自Kerabaybio公司)完成固液分离，弃去树脂，保留滤液，并将滤液缓慢加班到10倍体积的冰乙醚中，待沉淀完全后，用离心机离心分离，弃去上清液，保留沉淀物，真空干燥得粗品2.2g。
分离纯化冻干：
将上述粗品用水和乙腈溶解，经0.45μm水系滤膜(购自Minipore公司货号：MTGR15000)过滤后，上Pre-HPLC进行分离制备，收集纯度高于95％的目标峰(HPLC表征)，装入冻干瓶中，在液氮中预冻，转移至真空干燥机上，真空冻干48小时，得目标产物130mg，纯度＞95％。
实施例2制备IL-21膜锚定目的分子
IL-21为细胞膜结合因子，可以诱导NK细胞的增殖与分化，增强NK细胞的细胞毒功能，促进其分泌颗粒酶和穿孔素，以及IFN-γ等。
1)IL-21原核表达载体构建：
IL-21的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，在C端引入了一个半胱氨酸残基，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。设计引物，将IL-21的核苷酸序列构建到原核表达载体上PET21a，获得原核表达质粒。
2)诱导表达IL-21
将上述原核表达质粒转化原核宿主细胞，如大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导表达。该基因在大肠杆菌中表达成为包涵体。
3)包涵体处理
菌体破碎：收集诱导表达的菌体，用含有50mM Tris和500mM NaCl的裂解缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司，型号SCIENTZ-IID)对菌体进行超声破碎，超声功率为30％，探头在液面以下10mm，超声工作周期为2s(超声)/6s(停顿)，超声时间为15分钟，重复三次。破碎后的菌液11000rpm离心30min，弃上清，获得沉淀。
包涵体变性：用裂解缓冲液小心冲洗掉沉淀表面的膜蛋白。使用含有50mM Tris，500mM NaCl，1％Triton的缓冲液重悬沉淀，静置30min，11000rpm离心30min，弃上清，用裂解缓冲液小心冲洗掉沉淀表面的膜蛋白。之后，再使用裂解缓冲液重悬沉淀，静置30min，11000rpm离心30min，弃上清。使用含有50mM Tris，8M尿素，20mM DTT的缓冲液，以包涵体：缓冲液为1：20(即1g包涵体加入20ml缓冲液)的比例溶解包涵体，4℃过夜。包涵体沉淀若不立即进行溶解，可以置于-20℃保存。
4)IL-21蛋白复性
采用的复性试剂为pH8.0的含有50mM Tris，0.5M NaCl，10％甘油，2.5mM GSH，2mMEDTA的缓冲液。以溶解的包涵体溶液：复性试剂的体积比为1:100快速稀释变性蛋白，4℃过夜，离心或过滤去除沉淀，获得复性的IL-21蛋白溶液。
5)IL-21的纯化
复性的IL-21蛋白溶液通过SPBB和30S两种蛋白质纯化例子交换基质填料进行纯化。使用的缓冲液A1为20mM NaAc，pH 5.5；缓冲液B1为20mM NaAc，1M NaCl，pH5.5。
SPBB纯化：将复性的IL-21蛋白溶液进行透析脱盐，后直接上样，柱体积为5ml，起始浓度：0％缓冲液B1。洗脱方式为：
浓度(缓冲液B1％) 0％～100％线性
体积 10CV
洗脱后获得SPBB纯化的级分。蛋白纯化洗脱图如图4所示，收集的洗脱蛋白的SDS-PAGE电泳图如图5所示。
30S纯化：将SPBB纯化获得的纯化级分调pH至5.5，稀释5倍后上样，柱体积为5ml，起始浓度：0％缓冲液B1。洗脱方式为：
浓度(缓冲液B1％) 35％ 0％～85％线性 100％
体积 30CV 8CV 2CV
30S纯化的蛋白洗脱图如图6所示，收集的洗脱蛋白的SDS-PAGE电泳图如图7所示。
透析：采用含50mM Tris 150mM NaCl的缓冲液在截留分子量3000kDa的透析袋中进行透析透析。
超滤浓缩：用超滤浓缩管(Minipore，型号Amicon-Ultra-15)浓缩至蛋白浓度≥1mg/ml。
6)膜锚定元件与IL-21目的分子的化学偶联制备IL-21膜锚定目的分子(MA-IL21)
将制备的膜锚定元件溶于DMSO或DMF中，终浓度为1mM。随后制备修饰反应体系：即将纯化后的IL-21蛋白透析到PBS(PH7.4，1mM TCEP，5mM EDTA，0.5％TWEEN20)中，蛋白浓度保持在1mg/ml，在该体系中按摩尔比1：1加入上述膜锚定元件溶液，在37℃反应一小时，即可获得IL-21膜锚定目的分子MA-IL21。将该反应溶液再次透析至PBS(PH7.4，1mM TCEP，5mMEDTA，0.5％TWEEN20)中，冻干，于-80℃保存。化学偶联膜锚定元件前后的IL-21的SDS-PAGE电泳图如图8所示。
实施例3制备具有IL-21膜锚定目的分子的细胞
将制备的IL-21膜锚定目的分子MA-IL21与NK细胞或PBMC在无血清RPMI 1640培养基中共孵育30分钟，使膜锚定分子锚定到细胞表面，制备获得以制备IL-21膜锚定NK细胞(MA-IL21-NK)或IL-21膜锚定PBMC细胞(MA-IL21-PBMC)。通过流式细胞分析检测目的分子的锚定效率。
举例来说，不同浓度MA-IL21和未修饰IL-21分别在无血清RPMI 1640培养基中与NK细胞共培育30分钟，离心洗涤细胞，用抗IL-21抗体染色，流式细胞分析评价NK细胞表面的IL-21水平，结果如图9所示，表明结合了膜锚定元件后，IL-21在NK细胞表面的水平明显提高，尤其是在4.0μg/mL浓度下，MA-IL21在NK细胞表面的水平最高。
实施例4具有IL-21膜锚定目的分子的NK细胞(MA-IL21-NK)功能评价
对MA-IL21-NK进行功能评价，以保证所构建膜锚定分子具有正常的功能。
1)NK细胞脱颗粒试验：
不同浓度MA-IL21与NK细胞在无血清RPMI1640培养基中共培育30分钟，制备MA-IL21-NK；MA-IL21-NK在RPMI1640完全培养基中培养24小时，然后将其与肺癌细胞H1299按1:1混合共培养4小时，流式细胞分析评价NK细胞表面CD107α的表达。检测结果如图10所示，表明MA-IL21-NK能显著增强NK细胞的脱颗粒功能，且脱颗粒的能力高于相同浓度不具有膜锚定功能IL-21处理后的NK细胞。
2)NK细胞杀伤试验：
不同浓度MA-IL21与NK细胞在无血清RPMI 1640培养基中共培育30分钟，制备MA-IL21-NK；MA-IL21-NK在RPMI 1640完全培养基中培养24或48小时，然后将其与肺癌H1299或A549细胞按1:1混合共培养4小时，进行钙黄绿素(calcein)释放试验评价NK细胞对肿瘤的杀伤效应。与肺癌H1299细胞培养后的结果如图11所示，与肺癌A549细胞培养后的结果如图12所示，表明MA-IL21-NK能显著增强NK细胞对癌细胞的识别与杀伤。
序列表
<110> 上海中医药大学；北京志道生物科技有限公司
<120> 一种膜锚定元件及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Cys
130 135
<210> 2
<211> 417
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
atgcaggacc gccacatgat ccgcatgcgc cagctcatcg acatcgtcga ccagctcaag 60
aactacgtca acgacctcgt ccccgagttc ctccccgccc ccgaggacgt cgagaccaac 120
tgcgagtggt ccgccttctc ctgcttccag aaggcccagc tcaagtccgc caacaccggc 180
aacaacgagc gcatcatcaa cgtctccatc aagaagctca agcgcaagcc cccctccacc 240
aacgccggcc gccgccagaa gcaccgcctc acctgcccct cctgcgactc ctacgagaag 300
aagcccccca aggagttcct cgagcgcttc aagtccctcc tccagaagat gatccaccag 360
cacctctcct cccgcaccca cggctccgag gactccggcg gctccggcgg ctcctgc 417

Claims (4)

1.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括膜锚定目的分子，所述膜锚定目的分子包括膜锚定元件，所述膜锚定元件至少由三部分组成：
第一部分：用于与目的分子连接的化学基团；
第二部分：亲水性化合物，所述化学基团连接在所述亲水性化合物上；
第三部分：用于与细胞膜结合的疏水性化合物，所述疏水性化合物连接在所述亲水性化合物上；
其中，所述第一部分中的化学基团能与巯基发生反应；与巯基发生反应的所述化学基团为马来酰亚胺；
所述亲水性化合物为赖氨酸-PEG2-gama-谷氨酸；
所述疏水性化合物为C17脂肪酸链；
所述膜锚定目的分子还包括目的分子，所述目的分子为NK细胞激活因子IL-21；
其中，所述细胞为NK细胞。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述膜锚定目的分子能用于特异性靶点识别或在选定的位置聚集。
3.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述巯基来自目的分子的蛋白序列中的半胱氨酸残基。
4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述目的分子的蛋白序列N端或C端具有半胱氨酸残基。
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