CN117587110A

CN117587110A - 富集方法、表征分析物的方法及其装置

Info

Publication number: CN117587110A
Application number: CN202210982932.5A
Authority: CN
Inventors: 刘少伟; 苗卉; 张子朋; 朱丽梅
Original assignee: Qitan Technology Ltd Beijing
Current assignee: Qitan Technology Ltd Beijing
Priority date: 2022-08-16
Filing date: 2022-08-16
Publication date: 2024-02-23
Also published as: WO2024037325A1

Abstract

本发明涉及富集方法、表征分析物的方法及其装置，更具体地涉及将锚定分子富集在两亲膜上的方法、将分析物富集在两亲膜上的方法、将分析物富集在检测器的区域中的方法、表征分析物的方法、表征分析物的试剂盒、纳米孔表征分析物用的分子膜、纳米孔表征分析物的装置及应用。本发明可以实现低浓度分析物的高效富集，提高检测灵敏度。

Description

富集方法、表征分析物的方法及其装置

技术领城

本申请属于生物分析检测的技术领域，具体涉及富集方法、表征分析物的方法及其装置，更具体地涉及将锚定分子富集在两亲膜上的方法、将分析物富集在两亲膜上的方法、将分析物富集在检测器的区域中的方法、表征分析物的方法、表征分析物的试剂盒、纳米孔表征分析物用的分子膜、纳米孔表征分析物的装置及应用。

背景技术

现有纳米孔测序中，在充满电解液的腔内，带有检测器如纳米级小孔的分子膜将腔体分成2个小室，当电压作用于电解液时，分析物可穿过小孔，形成稳定的可检测的离子电流，可根据电流信息检测不同类型的生物分子。

在纳米孔测序过程中，有效地捕获待测物对于提高检测灵敏度非常重要。现有的分子膜中设置有锚定分子，以通过锚定分子结合生物分子，使得生物分子聚合在分子膜表面。现有锚定分子通常为带有系链的胆固醇，胆固醇均匀分布在分子膜上，而检测器如纳米孔仅设置在分子膜的两亲膜处，如磷脂膜或聚合物膜上，导致部分远离纳米孔的生物分子不易被检测到，特别是当生物分子浓度较低时，有效电流数据输出时长较短，影响检测效果。

发明内容

本发明人出乎意料地发现当使用占位分子结合在油脂膜的非两亲膜区域上之后，再添加锚定分子，可以实现锚定分子在两亲膜上的富集，进而实现分析物在两亲膜中的检测器的区域的富集，提高检测灵敏度。

因此，本发明的第一方面涉及一种将锚定分子富集在两亲膜上的方法，所述方法包括：

(a)提供分子膜，所述分子膜包括两亲膜和油脂膜，所述两亲膜设置在所述油脂膜中，使得形成的分子膜为包含两亲膜和围绕两亲膜周围的油脂膜的结构；和

(b)提供占位分子和锚定分子，使所述分子膜依次与所述占位分子和所述锚定分子接触，其中与所述占位分子接触使得所述占位分子结合在所述油脂膜上，与所述锚定分子接触使得所述锚定分子结合在所述两亲膜上。

优选地，所述占位分子在所述分子膜的顺侧或反侧与所述分子膜接触，更优选地，所述占位分子在所述分子膜的顺侧与所述分子膜接触。

优选地，所述占位分子包含第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子，所述第一占位分子用于与所述油脂膜连接，所述一个或多个第二占位分子中的至少一个用于与所述第一占位分子连接。

优选地，所述第一占位分子包含疏水分子，优选疏水多肽或疏水高分子聚合物，更优选地，所述疏水高分子聚合物选自聚噻吩、聚苯乙炔和聚菲乙炔；

所述第二占位分子包含亲水大分子，优选DNA、PEG、聚丙烯酰胺，聚丙烯酸或纤维素。

优选地，所述锚定分子包含膜结合部分和分析物结合部分，所述膜结合部分用于结合在所述两亲膜上，所述分析物结合部分用于结合分析物。

优选地，所述膜结合部分选自脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸；所述分析物结合部分为核酸序列。

优选地，该方法还包括提供生物芯片，所述生物芯片用于附着所述油脂膜并支撑所述分子膜。

优选地，该方法还包括将一个或多个检测器插入到所述两亲膜中。

优选地，所述检测器包含纳米孔，包括固态孔和/或生物孔，所述生物孔包括跨膜蛋白孔。

优选地，所述两亲膜是脂双层膜，所述油脂膜是硅油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇氨、磷脂酰甘油中的任一种或多种形成的混合物膜。

本发明的第二方面涉及一种将分析物富集在两亲膜上的方法，包括：使锚定分子，优选锚定分子的膜结合部分结合在两亲膜上；

以及使分析物与所述锚定分子接触，使所述分析物结合在所述锚定分子上，优选结合在所述锚定分子的分析物结合部分上。

本发明的第三方面涉及一种将分析物富集在检测器的区域中的方法，包括：使分析物富集在两亲膜上，所述两亲膜中插入有检测器；以及使所述分析物在所述锚定分子的牵引下靠近所述检测器的区域。

本发明的第四方面涉及一种表征分析物的方法，包括将分析物富集在检测器的区域中，并且在分析物相对于检测器移动时进行一次或多次测量，其中所述一次或多次测量指示一种分析物的一个或多个特征，从而在分析物相对于所述检测器移动时对其进行表征。

优选地，该方法用于表征多种分析物。

优选地，所述分析物或每种分析物选自多核苷酸、多肽、多糖和脂质中的一种或多种，优选为多核苷酸，所述多核苷酸包括DNA和/或RNA。

本发明的第五方面涉及一种用于表征分析物的试剂盒，包含：

(a)分子膜，所述分子膜包括两亲膜和油脂膜，所述两亲膜设置在所述油脂膜中并插入有一个或多个检测器，使得形成的分子膜为包含插入有检测器的两亲膜和围绕两亲膜周围的油脂膜的结构；

(b)占位分子，所述占位分子用于结合在所述油脂膜上；以及

(c)锚定分子，所述锚定分子用于在所述油脂膜被所述占位分子结合后将分析物结合在所述两亲膜上，并使所述分析物靠近所述检测器的区域。

优选地，所述占位分子用于结合在所述油脂膜的顺侧。

优选地，所述试剂盒还包括生物芯片，所述生物芯片用于附着所述油脂膜并支撑所述分子膜。

本发明的第六方面涉及一种纳米孔表征分析物用的分子膜，其中所述分子膜包括两亲膜和油脂膜，所述两亲膜设置在所述油脂膜中并插入有一个或多个检测器，所述油脂膜上结合有占位分子，所述两亲膜上结合有锚定分子。

优选地，所述占位分子结合在所述油脂膜的顺侧。

优选地，所述占位分子包含第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子，所述第一占位分子与所述油脂膜连接，所述一个或多个第二占位分子中的至少一个与所述第一占位分子连接。

所述第二占位分子包含亲水大分子，优选DNA、PEG、聚丙烯酰胺，聚丙烯酸或纤维素，更优选为DNA。

本发明的第七方面涉及一种纳米孔表征分析物的装置，所述装置包括：

生物芯片；和

如第六方面提供的分子膜。

本发明的第八方面涉及如第一至第四方面提供的方法、如第五方面提供的试剂盒、如第六方面提供的分子膜或如第七方面提供的装置在制备表征分析物的产品或表征分析物中的应用。

本发明的技术方案取得了以下技术效果：

本发明实现了通过使用占位分子结合在油脂膜的非两亲膜区域上之后，再添加锚定分子，提高锚定分子在两亲膜上的富集，进而提高分析物在两亲膜的检测器区域的有效富集，尤其是在分析物的浓度较低时，例如在分析物浓度低至20pM时，可以高效地富集低浓度分析物。本发明可以降低或避免锚定分子在芯片支撑结构表面的附着，从而提高富集效果。

本发明可以提高对靶多核苷酸等待测分析物的检测灵敏度。

附图说明

图1示出了本发明的一个实施方案中表征分析物的装置的部分结构示意图。其中，10、油脂膜；20、两亲膜；30、跨膜孔；40、芯片基质。

图2示出了A)单独的锚定分子、B)单独的占位分子和C)先添加占位分子再添加锚定分子在分子膜中的荧光分布情况。在A)中，单独的锚定分子的荧光在芯片的油脂膜和两亲膜上均匀分布；在B)中，单独的占位分子的荧光主要分布在芯片表面的油脂膜区域，而很少分布在两亲膜区域；在C)中，锚定分子的荧光在两亲膜区域上较其他区域更强。

图3示出了图2的A)和C)的情况下锚定分子的荧光强度比(两亲膜区/非两亲膜区)。其中先加入占位分子再加入锚定分子的情况下荧光强度比(两亲膜区/非两亲膜区)明显提高，约为仅添加锚定分子的1.5倍。

图4示出了接头结合酶的结构，其中酶结合在接头的Y1-S单链的虚线区域上，接头与待测多核苷酸序列连接。

图5示出了对照组(即仅加入锚定分子)中对ssDNA进行纳米孔测序的信号图。

图6示出了实验组(即先加入占位分子，再加入锚定分子)中对ssDNA进行纳米孔测序的信号图。

序列表说明

SEQ ID NO.：1示出了实施例1的占位分子的DNA的序列

5’-GGTCGGTGCTGGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

SEQ ID NO.：2示出了实施例1的占位分子的疏水多肽的序列

GGGKKLALA LALALALALALKKA

SEQ ID NO.：3示出了实施例1的锚定分子的核酸序列

5’-TTTTTT TTTTT TTTTT TTTTT CTCCGCTCGCCAGTT-3’

SEQ ID NO.：4示出了实施例3的占位分子的疏水多肽的序列

GGGKWWLALALALALALALWWA

SEQ ID NO.：5示出了实施例4的接头的Y1-S核酸序列

5’-nnnnn nnnnn nnnnn nnnnn ATCCT TTTTA GAATT TTAGA GAT TTTTT TTTTTAGAGA TTCAG AGATT CAGAG ATTCA GAG-3’，其中n表示iSpC3

SEQ ID NO.：6示出了实施例4的接头的Y2-S核酸序列

5’-ATCTC TAAAA TTCTA AAAAG GAT-3’

SEQ ID NO.：7示出了实施例4的接头的Y-Bottom-S核酸序列

5’-CTCTG AATCT CTGAA TCTCT GAATC TCT AACTG GCGAG CGGAG A-3’

具体实施方式

应理解，所公开的产物和方法的不同应用可根据本领域内的具体需要进行调整。还应理解，本文所用的术语只是为了描述本发明的具体实施方案的目的，而非意图进行限制。

本文中——无论在上文还是下文——引用的所有出版物、专利和专利申请以引用的方式全文纳入本文。

定义

为了更清楚地解释本发明的实施方式，本文中使用了一些科学术语和专有名词。除非在本文中进行了明确定义，所有这些术语和名词应当被理解为具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更清楚起见，对于本文中使用的某些术语进行了以下定义。

分子膜

如图1所示，基于跨膜孔测序技术进行生物分子表征时，需要在基因芯片的基质40上制备分子膜，分子膜包括混合分布的油脂膜10和两亲膜20，两亲膜20设置在油脂膜10中，使得形成的分子膜为包含两亲膜20和围绕两亲膜20周围的油脂膜10的结构。两亲膜20为两亲分子形成的膜结构，两亲膜20上设置有检测器，如跨膜孔30。两亲分子可以是合成的或天然存在的。例如，天然存在的磷脂，磷脂中磷酸部分亲水，脂肪酸部分疏水，从而同时表现出亲水性和疏水性。还比如人工合成的嵌段共聚物，其中，两个或更多个的单体亚单元聚合在一起产生单一聚合物链。可以对嵌段共聚物进行改造，使得其中一个单体亚单元在水性介质中时是疏水的，而另一个亚单元是亲水的。在这种情况下，嵌段共聚物可以具有两亲性质并且可以形成模拟生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段、三嵌段、四嵌段或五嵌段等共聚物。本申请中不限定两亲膜20具体可以采用何种形式的膜结构，通常为脂双层。脂双层是细胞膜的模型，并为一系列的实验性研究充当极好的平台。例如，脂双层可用于使用单通道记录的膜蛋白的体外研究。或者，脂双层可用作生物传感器来检测一系列物质的存在。所述脂双层可为任何脂双层。合适的脂双层包括但不限于平面的脂双层、支撑的双层或脂质体。与两亲膜20相比，油脂膜10由多层分子构成，其厚度较厚，使得油脂膜10可以稳定的附着在基质40上，两亲膜20可以通过油脂膜10与基质40固定，方便后续生物分子表征的进行。油脂膜10具体可以是硅油、磷脂酰胆碱(Phosphatidyl choline，PC)、磷脂酰乙醇氨(phosphatidyl ethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(Phosphatidyl glycerol，PG)等中的任一种或多种的混合物。跨膜孔30为沿两亲膜20厚度方向设置的通孔，以连通两亲膜20两侧。在电势的驱动下，水合离子可以从两亲膜20的一侧流到另一侧。跨膜孔30具体可以是蛋白质孔、多核苷酸孔或固态孔等，本申请不限定跨膜孔30的具体形成形式。在电势差的作用下，分析物可以依次从跨膜孔30通过，分析物从跨膜孔30通过时，会引起电信号变化，可以进一步根据电信号得到通过分析物的表征信息。例如根据电信号变化信息得到分析物的尺寸信息、序列信息、同一性信息、修饰信息等。

在一个优选的实施方式中，本发明的分子膜为纳米孔表征分析物用的分子膜，其中分子膜包括两亲膜和油脂膜，两亲膜设置在油脂膜中并插入有一个或多个检测器，油脂膜上结合有占位分子，两亲膜上结合有锚定分子。

在本文中，“顺侧”指分析物的进入侧，分析物或修饰的分析物通过该侧进入纳米孔的开口；“反侧”指分析物的流出侧，分析物或修饰的分析物通过该侧流出纳米孔的开口。例如，顺侧位于芯片的顶部，反侧位于芯片的底部。在一些情况下，分子从膜或孔的顺侧向反侧穿过孔。

占位分子优选结合在油脂膜的顺侧。

占位分子

本发明的占位分子为在基于跨膜孔测序技术进行生物分子表征时，在生物分子与跨膜孔周围的两亲膜结合之前，先结合在非两亲膜区域(即油脂膜上未设置两亲膜的区域)上的物质。该物质占位在油脂膜上的非两亲膜区域，以使其他物质无法结合在该区域，因而称为占位分子。

在本发明的一个实施方案中，占位分子包含第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子或由第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子组成。第一占位分子用于与油脂膜，优选油脂膜上的非两亲膜区域连接，一个或多个第二占位分子中的至少一个用于与第一占位分子连接。第一占位分子包含或是疏水分子，优选疏水多肽或疏水高分子聚合物，更优选地，疏水高分子聚合物选自聚噻吩、聚苯乙炔和聚菲乙炔；第二占位分子包含或是亲水大分子，优选DNA、PEG、聚丙烯酰胺，聚丙烯酸或纤维素。在一个实施方案中，占位分子为疏水多肽。在另一个实施方案中，占位分子为疏水多肽连接DNA的结构。

在一个实施方案中，占位分子中的第一占位分子通过点击化学反应与第二占位分子连接。点击化学反应(click chemistry)为通过小单元的拼接，来快速地完成不同分子的化学合成。在优选的实施方案中，第一占位分子上连接有第一连接基团，第二占位分子上连接有第二连接基团，通过第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应，实现第一占位分子和第二占位分子的快速连接。第一连接基团和第二连接基团可以是通过碳碳多键加成反应连接、通过亲核开环化反应连接、通过环加成反应等点击化学反应。例如：第一连接基团和第二连接基团中一个可以是环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)或二苯并环辛炔(DICO)中的任意一种；另一个可以是叠氮基(N3)、四嗪基(TZ)等。本领域技术人员可以理解的是，本实施方案不限定第一连接基团和第二连接基团具体为哪种可发生点击化学反应的基团。

锚定分子

本发明的锚定分子为在基于跨膜孔测序技术进行生物分子表征时，在占位分子占据在非两亲膜区域上之后，结合到两亲膜上的物质。该锚定分子锚定在两亲膜上，在分析物与锚定分子结合之后，使分析物在锚定分子的牵引下靠近两亲膜中的检测器的区域。

在本发明的一个实施方案中，锚定分子包含膜结合部分和分析物结合部分或由膜结合部分和分析物结合部分组成。膜结合部分用于结合在两亲膜上，分析物结合部分用于结合分析物。锚定分子是连接分析物与两亲膜的分子。膜结合部分选自脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸；分析物结合部分优选为核酸序列。该核酸序列可与分析物，如多核苷酸通过碱基互补配对方式连接。

在一个实施方案中，锚定分子为胆固醇连接核酸的结构。

在一个实施方案中，锚定分子中的膜结合部分通过点击化学反应与分析物结合部分连接。点击化学反应如上所述。在优选的实施方案中，膜结合部分上连接有第一连接基团，分析物结合部分上连接有第二连接基团，通过第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应，实现膜结合部分和分析物结合部分的快速连接。

分析物

分析物可以是任何物质。适合的分析物包括但不限于，金属离子、无机盐、聚合物例如聚合的酸或碱、染料、漂白剂、药物、诊断剂、休闲类药物、爆炸物和环境污染物。

分析物可以是由细胞分泌的分析物。或者，分析物可以是存在于细胞内的分析物，这样使得在实施本发明之前必须从细胞提取分析物。

分析物选自多核苷酸、多肽、多糖和脂质中的一种或多种。分析物优选地为多核苷酸例如核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以是单链或双链。多核苷酸可以是环状的。多核苷酸可以是适体，与微RNA杂交的探针或微RNA本身。多核苷酸可为任意长度。例如，多核苷酸可为至少10个，至少50个，至少100个，至少150个，至少200个，至少250个，至少300个，至少400个或至少500个核苷酸对的长度。多核苷酸可为1000或更多个核苷酸对，5000或更多个核苷酸对的长度或100000或更多个核苷酸对的长度。

分析物可存在于任何适合的样品中。本发明通常在已知含有或怀疑含有分析物的样品上实施。本发明可以在含有一种或多种种类未知的分析物的样品上实施。或者，本发明可以在样品上实施以确认已知或预期存在于所述样品中的一种或多种分析物的种类。

检测器

检测器可以是响应分析物的存在、不存在或特征而提供可读信号的任何结构。检测器可以是响应分析物的存在、不存在或特征而提供可读信号的任何结构。适合的检测器在本领域中已知，包含纳米孔，包括固态孔和/或生物孔。它们包括但不限于跨膜孔、隧道电极、经典电极、纳米管、FET(场效晶体管)和光检测器例如原子力显微镜(AFM)和扫描隧道显微镜(STM)。

在优选实施方案中，检测器用电的方式检测分析物。可以使用标准的单通道记录设备进行电测量，如Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72和国际申请WO-2000/28312所述。或者，可以使用多通道系统进行电测量，例如如国际申请WO-2009/077734和国际申请WO-2011/067559所述。

在其他优选实施方案中，检测器不用荧光方式检测分析物。

跨膜孔是容许外加电位驱动水合离子从膜的一侧流动到膜另一侧的结构。

跨膜孔优选地为跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是容许水合离子(例如分析物)从膜的一侧流动到膜另一侧的多肽或多肽集合。在本发明中，跨膜蛋白孔能够形成容许外加电位驱动水合离子从膜的一侧流动到另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选地容许分析物(例如核苷酸)从膜(例如脂双层)的一侧流动到另一侧。跨膜蛋白孔优选地使得多核苷酸或核酸(例如DNA或RNA)能够移动穿过所述孔。

跨膜蛋白孔可以是单体或寡聚体。所述孔优选地由若干个重复亚基例如6、7或8个亚基组成。所述孔更优选地为七聚体或八聚体孔。

跨膜蛋白孔通常包含离子可以流过的桶或通道。所述孔的亚基通常围绕一个中心轴并为跨膜β桶或通道或者跨膜α-螺旋束或通道提供链。

富集

本发明的方法可将锚定分子富集在两亲膜上，进而通过将锚定分子连接分析物而将分析物富集在两亲膜上。两亲膜中插入有检测器，因此本发明的方法还可将分析物富集在检测器的区域中。本发明的方法通过首先使用占位分子结合并占据在油脂膜上，然后使后加入的锚定分子结合在占位分子未占据的两亲膜上，从而实现富集。

在一个实施方案中，本发明提供一种将锚定分子富集在两亲膜上的方法，包括：提供分子膜，分子膜包括两亲膜和油脂膜，两亲膜设置在油脂膜中；和提供占位分子和锚定分子，使分子膜依次与占位分子和锚定分子接触，其中与占位分子接触使得占位分子结合在油脂膜上，与锚定分子接触使得锚定分子结合在两亲膜上，从而使锚定分子直接富集在两亲膜上。

在一个实施方式中，本发明提供一种将分析物富集在两亲膜上的方法，包括：使得锚定分子结合在两亲膜上；以及使分析物与锚定分子接触，使得分析物结合在锚定分子上，从而使分析物通过锚定分子富集在两亲膜上。

在一个实施方式中，本发明提供一种将分析物富集在检测器的区域中的方法，包括：使分析物富集在两亲膜上，所述两亲膜中插入有检测器；以及使分析物在锚定分子的牵引下靠近插入两亲膜中的检测器的区域。

在本发明的方法中，提供如图1所示的分子膜，该分子膜包含插入两亲膜中的检测器(例如跨膜孔)、围绕跨膜孔的两亲膜(例如脂双层)以及围绕两亲膜的油脂膜(例如硅油和磷脂酰胆碱混合形成的膜)。该分子膜附着在芯片基质上，两亲膜通过油脂膜与基质固定。本发明的占位分子、锚定分子以及分析物可从两亲膜的顺侧或反侧加入。在优选的实施方式中，本发明的占位分子、锚定分子以及分析物可从两亲膜的顺侧加入。

在一些实施方案中，将占位分子(比如疏水多肽连接的DNA)从两亲膜的顺侧加入，占位分子与分子膜接触之后，疏水多肽会结合在分子膜的非两亲膜区域，相反很少结合或不结合在两亲膜上。疏水多肽与DNA等大分子相连，从而占据油脂膜表面的空间，使油脂膜表面不易附着其他分子。此时，再加将锚定分子(比如胆固醇连接的DNA)从两亲膜的顺侧加入，胆固醇更容易附着在两亲膜表面而不是油脂膜的表面，从而表现为在两亲膜上的富集。

当存在分析物(例如多核苷酸)时，通过本领域已知的任何合适方法将多核苷酸与接头连接形成构建体。接头可单独合成，然后化学连接或酶连接到多核苷酸上。或者，接头在处理多核苷酸的过程中产生。接头在多核苷酸的一个末端或其附近连接至多核苷酸上。可使用任何已知的方法将包含多核苷酸的构建体偶联到膜上。构建体优选地是通过已经连接在两亲膜上的锚定分子偶联到两亲膜上。优选地，接头与锚定分子上分别具有可碱基互补配对的核苷酸序列，从而实现接头与锚定分子的连接，进而将分析物与两亲膜连接。

检测器(例如跨膜孔)插入到两亲膜中，富集在两亲膜上的分析物在锚定分子的牵引下靠近跨膜孔的区域，从而实现分析物在检测器区域的富集。

分析物相对于检测器移动

本发明的一些实施方案包括表征分析物。分析物可以在其相对于检测器移动时被表征。分析物相对于检测器的移动可以由任何合适的装置驱动。在一些实施方案中，分析物的移动由物理或化学力(电位)驱动，在一些实施方案中，物理力由电(例如电压)电位或温度梯度等提供。

在一些实施方案中，当在检测器(例如跨膜孔)上施加电势时，分析物相对于检测器移动，分析物例如多核苷酸带负电荷，因此在纳米孔上施加电压将导致分析物在施加的电压电位的影响下相对于纳米孔移动。例如，如果将正电压施加到纳米孔的反侧，那么这将诱导带负电荷的分析物从纳米孔的顺侧移动到纳米孔的反侧。

在本发明的方法中，使多核苷酸移动通过跨膜孔是指使多核苷酸从孔的一侧移动到另一侧。多核苷酸通过孔的移动可受电势或酶促作用或电位和酶促作用驱动或控制。移动可以是单向的，或可允许向后和向前移动。

优选地使用多核苷酸结合蛋白来控制多核苷酸移动通过孔。多核苷酸结合蛋白可以是能够与多核苷酸结合并且控制其通过孔的移动的任何蛋白质。在本领域中确定蛋白质是否与多核苷酸结合是很简单的。蛋白质通常与多核苷酸相互作用并且修饰其至少一种性质。蛋白质可以通过裂解多核苷酸以形成单独的核苷酸或如二核苷酸或三核苷酸的更短的核苷酸链来修饰多核苷酸。所述部分可通过将多核苷酸定位或移动到特异性位置(即控制其移动)来修饰多核苷酸。

表征分析物的方法

本发明的表征方法可使用本发明的分子膜进行，通过本发明的富集方法将分析物富集到跨膜孔附近。

所述表征方法可以包括测量分析物(例如多核苷酸)的一个、两个、三个、四个或五个或更多个特征。所述特征优选选自(i)多核苷酸的长度，(ii)多核苷酸的同一性，(iii)多核苷酸的序列，(iv)多核苷酸的二级结构，以及(v)多核苷酸是否被修饰。

本发明的方法包含移动多核苷酸通过跨膜孔，使得多核苷酸的一部分核苷酸与孔相互作用。

这些方法是可能的，因为跨膜孔可用于区分具有相似结构的核苷酸，这是基于它们对通过所述孔的电流具有不同的效应。可根据各个核苷酸与孔相互作用时它们的电流振幅，在单分子水平上鉴定各个核苷酸。如果电流以对某种核苷酸特异性的方式流经所述孔(即如果检测到与该核苷酸相关的特征性电流流过所述孔)，那么该核苷酸就在所述孔中存在。连续鉴定多核苷酸中的核苷酸，使得能够估计或确定多核苷酸的序列。

试剂盒

本发明还提供了表征分析物的试剂盒，包含：

(a)分子膜，分子膜包括两亲膜和油脂膜，两亲膜设置在油脂膜中并插入有一个或多个检测器；

(b)占位分子，占位分子用于结合在油脂膜上；以及

(c)锚定分子，锚定分子用于在油脂膜被占位分子结合后将分析物结合在两亲膜上，并使所分析物靠近检测器的区域。

在一个实施方案中，试剂盒中的分子膜、占位分子和锚定分子如前所述。

在一个优选的实施方案中，试剂盒还包含生物芯片，所述生物芯片用于附着油脂膜并支撑分子膜。

在一个优选的实施方案中，试剂盒还包含本领域已知的用于表征分析物的物质，例如用于与多核苷酸结合形成构建体的接头、控制多核苷酸移动的多核苷酸结合蛋白等。

本发明还提供纳米孔表征分析物的装置，所述装置包括生物芯片；和本发明的分子膜。

实施例

以下各实施例中未具体注明的实验操作细节可以参考本文所引用的参考文献，所采用的实验试剂和仪器设备均为常规商业可得的试剂或仪器，所采用的序列由本领域常规方法合成或为商业可得的。

实施例1：占位分子和锚定分子的制备

设计并合成占位分子，该占位分子包含疏水多肽和DNA，该占位分子的序列如下：

Cy3-GGTCGGTGCTGGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-DBCO-N3-GGGKKLALALALALALALALKKA

将合成的疏水多肽和DNA通过点击化学连接基团“DBCO”和“N3”连接，并在DNA的5’端连接有荧光基团Cy3。

设计并合成锚定分子，其核苷酸序列如下：

5’-chol-TTTTTT TTTTT TTTTT TTTTT CTCCGCTCGCCAGTT-Cy5-5’

核苷酸序列的5’端连接胆固醇用于结合膜，3’端连接荧光基团Cy5，核苷酸序列可与分析物以碱基互补配对方式结合。

实施例2：占位分子和锚定分子在芯片表面的分布

在齐碳科技有限公司的基因测序仪QNome-9604的生物芯片的储液腔中加入缓冲溶液(500mM KCl，20mM HEPES，pH 8.0)，再加入40μl硅油和磷脂酰胆碱(PC，10mg/mL)的混合油，最后再加入前述缓冲溶液，制备得到分子膜，其结构如图1所示。

将实施例1制备的占位分子和锚定分子采用以下三种不同的方式添加到芯片的顺侧溶液中，与上述分子膜进行孵育。三种方式分别为：A)将单独的锚定分子加入芯片中，终浓度20nM，室温孵育15分钟；B)将单独的占位分子加入芯片中，终浓度200nM，室温孵育16小时；以及C)向芯片中先添加占位分子，终浓度200nM，室温孵育16小时，再添加锚定分子，终浓度20nM，室温孵育15分钟。用共聚焦显微镜对芯片进行层扫拍照并三维重构，观察到锚定分子和占位分子在三种方式中在分子膜中的荧光分布情况如图2所示。

A)单独锚定分子在芯片表面上的分布

单独的锚定分子的荧光在芯片的油脂膜和两亲膜上均匀分布。

B)单独占位分子在芯片表面上的分布

单独的占位分子的荧光主要分布在芯片表面的油脂膜区域，而很少分布在两亲膜区域。

C)加入占位分子后，锚定分子在芯片表面上的分布

在B)的基础上，加入锚定分子，可以看到锚定分子的荧光在两亲膜区域上较其他区域更强。

对图2的荧光结果进行定量分析，计算锚定分子在两亲膜区荧光强度/非两亲膜区域荧光强度，结果如图3所示。可以看出先加入占位分子再加入锚定分子的情况，较仅添加锚定分子的情况，两亲膜区荧光强度/非两亲膜区荧光强度的比率明显提高，约为1.5倍。

实施例3：另一占位分子与锚定分子的制备及分布

按照实施例1的方法合成占位分子，不同之处在于：将占位分子中的疏水多肽序列替换为：GGGKWWLALALALALALALWWA。合成的占位分子的序列如下：

Cy3-GGTCGGTGCTGGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-DBCO-N3-GGGKWWLALALALALALALWWA。

按照实施例2的方法观察该占位分子和锚定分子在分子膜上的分布。结果显示，与实施例2中的结果无显著差异，先加入占位分子再加入锚定分子的情况，较仅添加锚定分子的情况，两亲膜上荧光强度/非两亲区域荧光强度的比率明显提高。

实施例4：对分析物进行纳米孔测序

(1)设置对照组和实验组，对照组和实验组中，均采用相同的生物芯片，并按实施例2的方法制备得到分子膜。

(2)在对照组中，只加入锚定分子；在实验组中，先加入实施例1制备的占位分子，再加入实施例1制备的锚定分子。

(3)在对照组和实验组中均加入相同浓度(20pM)的待测样品，使用齐碳科技有限公司的基因测序仪QNome-9604对样品中的DNA(1kb定长文库，即待测多核苷酸序列)进行纳米孔测序，获得过孔信号图。

纳米孔测序方法具体如下：

接头结构的序列如下：

①Y1-S：5’-nnnnn nnnnn nnnnn nnnnn ATCCT TTTTA GAATT TTAGA GAT TTTTTTTTTT AGAGA TTCAG AGATT CAGAG ATTCA GAG-3’；

其中，Y1-S链包含前导序列，即iSpC3，表示为n。

②Y2-S：5’-ATCTC TAAAA TTCTA AAAAG GAT-3’

③Y-Bottom-S：5’-P-CTCTG AATCT CTGAA TCTCT GAATC TCT AACTG GCGAG CGGAGA-3’

使用以上序列，合成如图4所示的接头。合成方法如下所示：将引物①、②、③按照1:2.5:2.5比例退火，引物退火终浓度为4μM，退火程序98℃10min；6s/-0.1℃，300×Cys；65℃，5min；6s/-0.1℃，400×Cys；12℃，Hold。

退火后的引物按照如下表1中的体系进行孵育。

表1：退火后的引物的孵育体系

退火后的引物(4μM)	12.5μL
		解旋酶ED1(28.5μM)	26.3μL
NaAC(3M pH7.0)	5.83μL
		TMAD(1M)	1.5μL
NF-水	53.87μL
		总计	100μL

将按照上表的孵育体系混合的样品加入1.5mL低吸附离心管中(锡纸包裹避光)，轻柔混匀(不可以使用涡旋震荡仪)，放入30℃金属浴30min。最后，孵育后的产物进行磁珠纯化，获得结合解旋酶的接头复合物。

使用合成的接头进行测序：

按照下表2配制连接反应体系，瞬时离心，室温静置10min。

表2：连接反应的体系：

待测多核苷酸序列	60μL
		接头复合物	5μL
4×连接缓冲液	25μL
		DNA连接酶	10μL
NF-水	直至100μL

将产物进行磁珠纯化，获得待测序的连接产物。

使用QNome9604测序平台，分别按实施例2中A)和C)的方式(即对照组和实验组)添加占位分子和锚定分子到测序buffer(600mM KCl、10mM HEPES pH8.0、3mM MgCl₂、3mMATP)中；然后取上述制备好的连接产物加入到测序buffer中，轻轻颠倒混匀，瞬时离心，将该混合液加入到测序芯片中静置15min之后在35℃的条件下进行测试。

对照组和实验组测序过程中电流随时间变化结果参阅图5和图6。开孔电流约为300-400pA，核酸过孔电流约为100-200pA。电流由开孔下降到过孔再恢复到开孔为一次核酸过孔。相比于对照组，实验组样品中DNA的单位时间过孔频率提高了3.27倍，说明实验组中测序灵敏度也得到了明显的提高。

Claims

1.一种将锚定分子富集在两亲膜上的方法，包括：

(a)提供分子膜，所述分子膜包括两亲膜和油脂膜，所述两亲膜设置在所述油脂膜中；和

2.根据权利要求1所述的方法，所述占位分子在所述分子膜的顺侧或反侧与所述分子膜接触，优选地，所述占位分子在所述分子膜的顺侧与所述分子膜接触。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述占位分子包含第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子，所述第一占位分子用于与所述油脂膜连接，所述一个或多个第二占位分子中的至少一个用于与所述第一占位分子连接。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一占位分子包含疏水分子，优选地，所述疏水分子选自疏水多肽或疏水高分子聚合物；更优选地，所述疏水分子选自疏水多肽；更优选地，所述疏水高分子聚合物选自聚噻吩、聚苯乙炔或聚菲乙炔；

所述第二占位分子包含亲水大分子，优选地，所述亲水大分子选自DNA、PEG、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸或纤维素，更优选地，所述亲水大分子选自DNA。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述锚定分子包含膜结合部分和分析物结合部分，所述膜结合部分用于结合在所述两亲膜上，所述分析物结合部分用于结合分析物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述膜结合部分选自脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸。

7.根据权利要求1或2所述的方法，还包括提供生物芯片，所述生物芯片上附着所述油脂膜并用于支撑所述分子膜。

8.根据权利要求1或2所述的方法，还包括将检测器插入到所述两亲膜中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述检测器包含纳米孔，所述纳米孔包括固态孔和/或生物孔，所述生物孔包括跨膜蛋白孔。

10.根据权利要求1或2所述的方法，所述两亲膜包括脂双层膜，所述油脂膜是包括硅油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇氨、磷脂酰甘油中的任一种或多种形成的混合物膜。

11.一种将分析物富集在两亲膜上的方法，包括：执行权利要求1至10中任一项所述的方法，使得所述锚定分子，优选所述锚定分子的膜结合部分结合在所述两亲膜上；

以及使分析物与所述锚定分子接触，使得所述分析物结合在所述锚定分子上，优选结合在所述锚定分子的分析物结合部分上。

12.一种将分析物富集在检测器的区域中的方法，包括：执行权利要求11所述的方法，使得所述分析物富集在所述两亲膜上，所述两亲膜中插入有检测器；以及使所述分析物在所述锚定分子的牵引下靠近所述检测器的区域。

13.一种表征分析物的方法，包括使用权利要求12所述的方法将分析物富集在检测器的区域中，并且在分析物相对于检测器移动时进行一次或多次测量，其中所述一次或多次测量指示一种分析物的一个或多个特征，从而在分析物相对于所述检测器移动时对其进行表征。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法用于表征多种分析物。

15.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述分析物或每种分析物选自多核苷酸、多肽、多糖和脂质中的一种或多种，优选为多核苷酸，所述多核苷酸包括DNA和/或RNA。

16.一种用于表征分析物的试剂盒，包含：

(a)分子膜，所述分子膜包括两亲膜和油脂膜，所述两亲膜设置在所述油脂膜中并插入有检测器；

(b)占位分子，所述占位分子用于结合在所述油脂膜上；以及

17.根据权利要求16所述的试剂盒，所述占位分子用于结合在所述油脂膜的顺侧。

18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述占位分子包含第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子，所述第一占位分子用于与所述油脂膜连接，所述一个或多个第二占位分子中的至少一个用于与所述第一占位分子连接。

19.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括生物芯片，所述生物芯片用于附着所述油脂膜并支撑所述分子膜。

20.一种纳米孔表征分析物用的分子膜，其中所述分子膜包括两亲膜和油脂膜，所述两亲膜设置在所述油脂膜中并插入有检测器，所述油脂膜上结合有占位分子，所述两亲膜上结合有锚定分子。

21.根据权利要求20所述的分子膜，所述占位分子结合在所述油脂膜的顺侧。

22.根据权利要求20或21所述的分子膜，其中所述占位分子包含第一占位分子和可选的一个或多个第二占位分子，所述第一占位分子与所述油脂膜连接，所述一个或多个第二占位分子中的至少一个与所述第一占位分子连接。

23.一种纳米孔表征分析物的装置，所述装置包括：

生物芯片；和

如权利要求20-22中任一项所述的分子膜。

24.根据权利要求1-15中任一项所述的方法、或权利要求16-19中所述的试剂盒、权利要求20-22中任一项所述的分子膜或权利要求23所述的装置在制备表征分析物的产品或表征分析物中的应用。