RU2619050C1

RU2619050C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-15b_T1_RL, обеспечивающая синтез рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, и рекомбинантный слитый белок, обладающий цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам и таргетными свойствами к опухолевой ткани

Info

Publication number: RU2619050C1
Application number: RU2016109518A
Authority: RU
Inventors: Анна Андреевна Немудрая; Елена Владимировна Кулигина; Ольга Александровна Коваль; Владимир Александрович Рихтер; Григорий Александрович Степанов
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2017-05-11

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2. Конструируют плазмидную ДНК pET-15b_T1_RL, обеспечивающую синтез рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2. Рекомбинантный слитый белок, выделенный из клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой pET-15b_T1_RL, имеет молекулярную массу 15,7 кДа, состоит из остатка метионина, опухоль-специфического пептида GLHTSATNLYLH, глицинового спейсера GGGS и рекомбинантного аналога лактаптина RL2. Изобретение обеспечивает получение белка, обладающего цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам в культуре и таргетными свойствами к опухолевой ткани. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

Description

Группа изобретений относится к биотехнологии, генетической и белковой инженерии, конкретно - к получению рекомбинантного слитого белка направленного противоопухолевого действия, состоящего из адресного пептида и противоопухолевого пептида RL2.

На сегодняшний день онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности, как в России, так и за рубежом [1].

К настоящему времени известно, что одной из причин развития злокачественных опухолей в организме является нарушение регуляции апоптоза (программируемой гибели клеток). Разработка новых индукторов и модуляторов апоптоза раковых клеток - один из наиболее продуктивных подходов для создания современных онкотерапевтических средств [2]. В то же время одним из путей повышения эффективности терапии раковых заболеваний является адресная доставка лекарственного средства в опухоль, позволяющая снизить цитотоксическое действие лекарства на нормальные клетки и увеличить, за счет увеличения локальной концентрации препарата в опухоли, эффективность действия на раковые клетки. Получение генно-инженерных рекомбинантных белков (фьюжен-белков), которые объединяют адресный пептид, обеспечивающий доставку лекарственного средства непосредственно в опухоль, и противоопухолевое лекарственное средство, является перспективным направлением совершенствования терапевтический средств лечения злокачественных новообразований.

Ранее из молока человека был выделен и охарактеризован протеолитический фрагмент к-казеина - белок лактаптин (~8.6 к Да), способный индуцировать апоптотическую гибель раковых клеток в культуре [3, 4]. Был получен ряд рекомбинантных аналогов природного пептида [5, 6] и показано, что аналог лактаптина RL2 индуцирует апоптоз раковых клеток человека в культуре и тормозит рост и метастазирование опухолей животных и человека в системе in vivo. Гепатоаденокарцинома-1 мыши оказалась одной из наиболее чувствительных опухолей к действию RL2 in vitro и in vivo [7, 8]. В настоящее время проведены доклинические испытания лекарственного средства «Лактаптин», созданного на основе RL2, показана безопасность и противоопухолевая эффективность препарата. Однако «Лактаптин», как и другие белковые терапевтические препараты, имеет ряд существенных недостатков. Он равномерно распределяется по органам и тканям организма, что уменьшает его концентрацию в опухоли и, соответственно, снижает эффективность противоопухолевого действия [9].

Традиционно в качестве молекулярных адресных агентов используют антитела или их фрагменты, однако и те и другие имеют два существенных недостатка, которые значительно ограничивают их применение, а именно низкие коэффициенты проникновения в опухоль из-за большого размера и неспецифический захват их мононуклеарной фагоцитарной системой [10]. Кроме того, современные способы производства моноклональных антител очень сложны и затратны, что обусловливает исключительно высокую стоимость конечного продукта на их основе.

Известно использование опухоль-специфических пептидов в качестве доставляющих агентов, т.к. такие пептиды хорошо проникают в опухоль, обладают низкой иммуногенностью, высокой афинностью к мишени и относительной стабильностью. Кроме того, методами генной инженерии можно легко получить конъюгаты таких пептидов с белковыми препаратами [10].

Ранее с помощью фаговой пептидной библиотеки в системе in vivo на мышиной модели перевиваемой опухоли ГА-1, линия мышей A/Sn, отобран опухоль-специфический пептид GLHTSATNLYLH, экспонированный в составе поверхностного белка pIII нитчатого бактериофага М13. Изучена возможность связывания фагового клона, экспонирующего отобранный пептид, с другими опухолями в системе in vivo. Показано достоверное связывание отобранного фагового клона с аденокарциномой легких (мыши линии A/Sn), Меланомой В16 (мыши линии С57 Black), опухолью Кребса (мыши линии С57 Black) и аденокарциномой легких Льюиса (мыши линии СВА) [11, 12].

Наиболее ближайшим к заявляемой группе изобретений - прототипом, является рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида RL2, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, имеющий молекулярную массу 14,2 к Да, состоящий из остатка метионина, фрагмента каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток и С-концевого гистидинового тракта, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: I [5].

Известная плазмида pFK2 имеет молекулярную массу 2,1 MDa, размер 3164 п.о., содержит следующие элементы: плазмидный вектор pGSDI, гидролизованный по SalI и BglII сайтам и содержащий сайт инициации репликации плазмиды pBR322, промотор фага Т7 и уникальные сайты рестрикции EcoRI (1595), BglII (1613), SalI (1985), PstI (1995), HindIII (2000), ClaI (2053); BglII-SalI, фрагмент размером 372 п.о., включающий стартовый кодон, сегмент, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток, олигопептид с последовательностью GGSHHHHHH и стоп-кодон; генетические маркеры: AMPr - ген ампициллин резистентности (ген бетта-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli.

Недостатком известной плазмиды pFK2 является то, что она не обеспечивает продукцию в клетках Escherichia coli рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2.

Недостатком известного белка (RL2) является то, что он не обладает таргетными свойствами (тропностью) к опухолевой ткани, равномерно распределяясь по органам и тканям, что снижает эффективность его противоопухолевого действия.

Техническим результатом группы изобретений является создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей синтез рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, и получение рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, обладающего цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам в культуре и таргетными свойствами к опухолевой ткани.

Указанный технический результат достигается путем конструирования плазмиды pET-15b_T1_RL путем встройки в плазмидный вектор рЕТ-15b фрагмента ДНК, кодирующего остаток метионина, опухоль-специфический пептид, глициновый спейсер (GGGS) и рекомбинантный аналог лактаптина RL2 в единой рамке трансляции, трансформацией полученной плазмидой клеток Escherichia coli, выращивания биомассы индуцированных клеток с последующим выделением и очисткой рекомбинантного слитого белка с помощью многостадийной хроматографии.

Сущность заявляемой группы изобретений заключается в следующем:

Генно-инженерными методами получают плазмиду pET-15b_T1_RL, несущую ген, кодирующий рекомбинантный слитый белок, состоящий из опухоль-специфического пептида, отобранного из фаговой пептидной библиотеки, и рекомбинантного аналога лактаптина RL2. Вектор рЕТ-15b устроен таким образом, что клонированный ген слитого белка находится под контролем промотора бактериофага Т7.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pET-15b_T1_RL являются:

а) плазмидный вектор рЕТ-15b (5708 п.н.) (Novagen, США), обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего слитый белок, и его экспрессию под контролем позднего промотора Т7 ДНК-полимеразы;

б) фрагмент ДНК 1, кодирующий остаток метионина, опухоль-специфический пептид, глициновый спейсер и N-конец последовательности RL2, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров c1_RL2_F 5`CATCATCCATGGGTTTGCATACTTCGGCT и c1_R CTGGTTGTTTCTGGTTCGAACCTCACCAGCAA и химически синтезированного олигонуклеотида ClonN1_target 5`GGTTTGC ATACTTCGGCTACTAATCTGTATTTGC ATGGTGGAGGTTC G в качестве матрицы. Праймер c1_RL2_F обеспечивает наличие в амплификационном фрагменте сайта рестрикции NcoI.

в) фрагмент ДНК 2, кодирующий фрагмент рекомбинантного аналога лактаптина RL2, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров: RL2_F 5' AACCAGAAACAACCAGCATGCCATGAGAATGAT и c1_RL2_R 5' CATCATGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGATCCGCCGATGG и плазмиду pGSD/RL2 в качестве матрицы [5]. Праймер c1_RL2_R обеспечивает наличие в амплификационном фрагменте сайта рестрикции BamHI;

г) фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, состоящий из остатка метионина, опухоль-специфического пептида, глицинового спейсера и RL2, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров c1_RL2_F и c1_RL2_R и фрагментов ДНК 1 и 2 в качестве матрицы.

Полученная плазмида pET-15b_T1_RL (фиг. 2) характеризуется следующими признаками:

- имеет размер 6054 п.о.;

- кодирует рекомбинантный слитый белок, содержащий остаток метионина, опухоль-специфическй пептид (GLHTSATNLYLH), глициновый спейсер (GGGS) и RL2;

- состоит из следующих элементов:

а) фрагмента ДНК размером 411 п.о., кодирующего рекомбинантный слитый белок,

б) сайта инициации репликации плазмиды pBR322;

б) промотора бактериофага Т7;

в) генетических маркеров: AMPr - ген ампициллин резистентности (bla), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli;

г) гена lacI, кодирующего белок-репрессор;

д) lac оператора, перекрывающегося с Т7 промотором;

д) уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющими следующие координаты: BglII (841), NcoI (736), BamHI (320), HindIII (30), EcoRI (6053).

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК, обеспечивающая продукцию в клетках Escherichia coli рекомбинантного слитого белка, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2 и обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам и таргетными свойствами к опухолевой ткани.

Клетки E.coli BL21(DE3), геном которых содержит фрагмент ДНК бактериофага λ DE3, в котором закодирован ген lacI и ген РНК полимеразы Т7 под контролем промотора lacUV5, трансформируют сконструированной плазмидой pET-15b_T1_RL и выращивают в LB-среде с добавлением ампициллина (150 мкг/мл) и глюкозы (1%) в течение 14-16 ч при 37°С, 170 об/мин. Выросшую культуру засевают в LB среду с ампициллином (100 мкг/мл) с плотностью засева 1% от объема среды и наращивают при 37°С, 170 об/мин. По достижению оптической плотности культуры OD₆₀₀=0,7-0,8 о.е. добавляют индуктор изопропилтиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,5 мМ и продолжают процесс ферментации в тех же условиях в течение 4 ч. После чего биомассу собирают центрифугированием при 10000 g, 10 мин, 4°С. Биомассу индуцированных клеток E.coli BL21(DE3)/pET-15b_T1_RL используют для выделения рекомбинантного слитого белка с помощью многостадийной хроматографии.

В результате получают слитый белок, имеющий молекулярную массу 15,7 кДа, состоящий из остатка метионина, опухоль-специфического пептида, глицинового спейсера и рекомбинантного аналога лактаптина RL2. Слитый белок обладает цитотоксической активностью в отношении клеток гепатоаденокарциномы мыши (ГА-1), клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 и MCF-7 и таргетными свойствами к опухолевой ткани ГА-1 в мышиной модели. Слитый белок имеет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (фиг. 1).

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды рЕТ-15b_T1_RL и кодируемая ею аминокислотная последовательность слитого белка T1_RL.

Фиг. 2. Карта генетической конструкции pET-15b_T1_RL. Fragment - последовательность ДНК, кодирующая слитый белок; Ар - ген устойчивости к ампициллину; lacI - ген белка-репрессора; ori репликации ColE1 (pBR322).

Фиг. 3. Анализ белков лизатов клеток Е. coli BL21(DE3)/pET-15b_T1_RL на содержание целевого белка (13% ПААГ в присутствии 2-меркаптоэтанола). Дорожки: 1 - набор маркерных белков, 2 - белки лизата клеток Е.coli до проведения индукции, 3, 4, 5, 6 - белки лизата клеток E.coli через 1, 2, 3, 4 ч с момента проведения индукции, соответственно.

Фиг. 4. Электрофоретический анализ белков целевых фракций, полученных на разных стадиях хроматографической очистки рекомбинантного слитого белка T1_RL. Дорожки: 1 - набор маркерных белков, 2 - белки лизата биомассы клеток-продуцентов перед проведением хроматографии, 3 - белки фракции 1, полученной аффинной хроматографией на IMAC Sepharose 6 Fast Flow, 4 - белки клеток E.coli, не взаимодействующие с аффинным сорбентом и элюирующиеся лизис буфером, 5 - белки фракции 2, полученной ионообменной хроматографией на DEAE Sephadex А-25, 6 - белки фракции 3, полученной катионообменной хроматографией (1) на SP Sepharose Fast Flow, 7 - белки фракции 4, полученной катионообменной хроматографией (2) на SP Sepharose Fast Flow, 8 - белки фракции 5, полученной анионообменной хроматографией на сорбенте Q Sepharose Fast Flow, 9 - белки диализованной фракции 5.

Фиг. 5. Изменение жизнеспособности клеток гепатоаденокарциномы мыши ГА-1 и клеток аденокарциномы молочной железы человека MDA-МВ-231 и MCF-7 при инкубации с T1_RL и RL2. Жизнеспособность клеток определяли относительно жизнеспособности контрольных клеток (инкубации без белков) ± стандартное отклонение (M±s) по результатам трех независимых экспериментов.

Фиг. 6 Интенсивность флуоресцентного сигнала извлеченной опухолевой ткани ГА-1 после 10 мин циркуляции T1_RL-Cy5. Интенсивность сигнала нормирована на значение интенсивности сигнала, полученного после 10 мин циркуляции RL2.

Для лучшего понимания сущности предлагаемой группы изобретений ниже следуют конкретные примеры их осуществления.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рЕТ-15b_T1_RL.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный аналог лактаптина (RL2), амплифицируют с плазмиды pGSD/RL2, используя праймеры RL2_F 5`AACCAGAAACAACCAGCATGCCATGAGAATGAT и c1_RL2_R 5`CATCATGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGATCCGCCGATGGT. Реакцию проводят в амплификаторе Eppendorf Mastercycler. В состав реакционной смеси объемом 50 мкл входит: 1×SEBuffer Pfu ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия), смесь дезоксинуклеозид трифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dGTP) (dNTP-смесь) (2,5 мМ), плазмида pGSD/RL2 (10 нг), праймер RL2_F (0,3 нМ), праймер c1_RL2_R (0,3 нМ), Pfu-полимераза (2,5 ед.) (СибЭнзим, Россия). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 мин при 96°С; 35 циклов - 30 секунд при 96°С, 30 секунд при 66°С, 40 секунд при 72°С; заключительная стадия - 10 мин при 72°С.

Амплифицируют последовательность Т1, кодирующую остаток метионина, опухоль-специфический пептид, глициновый спейсер и N-конец последовательности RL2, используя химически синтезированный олигонуклеотид ClonN1_target 5`GGTTTGCATACTTCGGCTACTAATCTGTATTTGCATGGTGGAGGTTC G в качестве матрицы. Последовательность Т1 амплифицируют, используя праймеры c1_RL2_F 5`CATCATCCATGGGTTTGCATACTTCGGCT и c1_R 5`CTGGTTGTTTCTGGTTCGAACCTCACCAGCAA. В состав реакционной смеси объемом 50 мкл входит: 1×SEBuffer Pfu ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия), dNTP-смесь (2,5 мМ), ДНК-матрица ClonN1_target (10 нг), праймер c1_RL2_F (0,3 нМ), праймер c1_R (0,3 нМ), Pfu-полимераза (2,5 ед.) (СибЭнзим, Россия). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 мин при 96°С; 35 циклов - 30 секунд при 96°С, 30 секунд при 65°С, 10 секунд при 72°С; заключительная стадия - 10 мин при 72°С.

Единую (слитую) нуклеотидную последовательность T1_RL2, кодирующую адресный пептид и RL2 в единой рамке трансляции, получают также с помощью ПЦР. Для получения последовательности T1RL2 на основе ПЦР-фрагментов Т1 и RL2 используют праймеры c1_RL2_F и c1_RL2_R, обеспечивающие в амплификационном фрагменте наличие сайтов рестрикции NcoI и BamHI. В состав реакционной смеси объемом 50 мкл входит: 1×SEBuffer Pfu ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия), dNTP-смесь (2,5 мМ), ДНК-матрица Т1 (20 нг), ДНК-матрица RL2 (80 нг), c1_RL2_F/c2_RL2_F (0,3 нМ), c1_RL2_R (0,3 нМ), Pfu-полимераза (2,5 ед.) (СибЭнзим, Россия). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 мин при 96°С; 35 циклов - 30 секунд при 96°С, 30 секунд при 65°С, 60 секунд при 72°С; заключительная стадия - 10 мин при 72°С.

Все продукты ПЦР-реакции очищают от белков фенол-хлороформной экстракцией и осаждают в течение нескольких часов при температуре минус 20°С добавлением 3М NaAc рН 5,2 (1/10 от объема растворенной фракции нуклеиновых кислот), 96% этиловым спиртом (2,5 объема растворенной фракции нуклеиновых кислот). Полученный после центрифугирования (10000 g, 10 мин) осадок промывают 70% этиловым спиртом и высушивают в вакуумном испарителе.

Векторную ДНК pET-15b (1 мкг) и клонируемый ДНК-фрагмент T1_RL2 (1 мкг), кодирующий слитый белок, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI (по 2 ед. каждого фермента) (СибЭнзим, Россия) в объеме реакционной смеси 50 мкл. Реакцию проводят в условиях, рекомендованных производителем.

После обработки рестриктазами BamHI и NcoI векторную ДНК рЕТ-15b и клонируемый ПЦР-фрагмент очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле и экстрагируют из геля набором QIAquick Gel Extarction Kit («Qiagen», США) согласно протоколу производителя.

Реакцию лигирования Т4 ДНК-лигазой (СибЭнзим, Россия) линеализированного вектора рЕТ-15b и клонируемого фрагмента, обработанных ранее эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI, проводят в объеме 5 мкл при комнатной температуре в течение 30 мин. В реакции используют 50 нг линейной формы плазмиды рЕТ-15b и клонируемый фрагмент в трехкратном молярной избытке по отношению к вектору.

Пример 2. Получение штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного слитого белка.

Бактериальные клетки Е.coli BL21(DE3), несущие ген РНК-полимеразы фага Т7 под индуцибельным lacUV5 промотором, трансформируют сконструированной плазмидой pET-15b_T1_RL. Отдельную колонию трансформированных клеток выращивают в LB-среде с добавлением ампициллина (150 мкг/мл) и глюкозы (1%) в шейкер-инкубаторе при 170 об/мин и температуре 37°С в течение 14-16 ч. Выросшую культуру засевают в LB-среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) с плотностью засева 1% от объема среды. По достижению оптической плотности культуры OD₆₀₀=0,7-0,8 о.е. добавляют индуктор изопропилтиогалактозид (ИПТГ) (Медиген, Россия) до концентрации 0,5 мМ и продолжают процесс ферментации в тех же условиях (170 об/мин, 37°С) в течение 4 ч. Биомассу индуцированных клеток собирают центрифугированием в течение 5 мин, при 10000 g. Содержание целевого белка анализируют с помощью электрофореза по Лэммли [13] в 13% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 2-меркаптоэтанола. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 3, демонстрируют, что до момента проведения индукции в белках лизата клеток E.coli видимых следов целевого белка не наблюдается, в то время как уже спустя час с момента проведения индукции ИПТГ происходит наработка целевого рекомбинантного белка с электрофоретической подвижность в диапозоне 10-15 кДа.

Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного слитого белка из клеток-продуцентов E.coli.

Биомассу индуцированных клеток E.coli разрушают экструзионным гомогенизатором. К разрушенной биомассе добавляют раствор 1, содержащий мочевину 4 М, имидазол 10 мМ, NaCl 0,3 M, Трис 20 мМ, фенилметилсульфонилфлюорид (PMSF) 1 мкМ, меркаптоэтанол 10 мМ, и центрифугируют в течение 25 минут при температуре 10°С и частоте вращения 7300 об/мин. Полученный супернатант, содержащий раствор белков, разделяют хроматографически.

На колонку, содержащую аффинный сорбент IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция), модифицированный ионами никеля, и уравновешенную раствором 1, наносят супернатант. После нанесения раствора с белком сорбент промывают 4 CV (colum volume - объем колонки) раствора 2, содержащего имидазол 10 мМ, NaCl 0,3 M, Трис 20 мМ, PMSF 1 мкМ, меркаптоэтанол 10 мМ, далее - 3 CV раствора 3, содержащего имидазол 200 мМ, NaCl 0,3 M, Трис 20 мМ, PMSF 1 мкМ, меркаптоэтанол 10 мМ. Элюцию белка проводят 4,5 CV раствора 4, содержащего ЭДТА-Na₂ 200 мМ, гуанидин гидрохлорид 6М. Целевую фракцию 1 направляют на вторую стадию очистки ионообменной хроматографией на DEAE Sephadex А-25.

Колонку с сорбентом DEAE Sephadex А-25 (GE Healthcare, Швеция) урановешивают раствором 5, содержащим NaCl 50 мМ. На колонку наносят фракцию 1, после чего сорбент промывают 0,8 CV раствора 5 и осуществляют сбор целевой фракции. Полученную фракцию 2 диализуют против воды (18 ч при 4°С) и затем направляли на следующую стадию очистки катионообменной хроматографией на SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция).

Колонку, содержащую SP Sepharose Fast Flow, уравновешивают 2 CV раствора 5. На колонку наносят диализованную фракцию 2, предварительно восстановленную дитиотреитолом. После нанесения сорбент промывают 2 CV раствора 5, 4 CV раствора 6, содержащего NaCl 1 M, Трис 0,02 Μ, ρΗ 8.8 и 3 CV раствора 7, содержащего NaCl 0,45 M, натрия ацетат трехводный 0,02 М, рН 4.5. Элюцию белка проводят 9 CV раствора 8, содержащего мочевина 3 M, NaCl 0,45 M, натрия ацетат трехводный 0,025 М; дитиотреитол 30 мМ. Проводят повторную катионообменную хроматографию на SP Sepharose Fast Flow полученной фракции 3 целевого белка с целью ее концентрирования.

Колонку, содержащую SP Sepharose Fast Flow, уравновешивали 2 CV раствора 5. На колонку наносят фракцию 3 и промывают 2 CV раствора 5. Элюцию белка проводят 3 CV раствора 9, содержащего мочевина 6 M, NaCl 0,7 M. Полученную сконцентрированного фракцию 4 диализуют против воды (18 ч при 4°С) и затем проводят финальную стадию очистки рекомбинантного слитого белка анионообменной хроматографией на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция).

Колонку с сорбентом Q Sepharose Fast Flow уравновешивают 1,5 CV раствора 5. На колонку наносят диализованную фракцию 4. Элюцию белка проводят 3 CV раствора 5, получая целевую фракцию 5. Фракцию 5 диализуют против воды (18 ч при 4°С).

Фракции анализируют электрофорезом в ПААГ с SDS по Лэммли [13], образцы для нанесения на гель готовят в присутствии 2-меркаптоэтанола. Пример такой очистки приведен на фиг. 4.

Определение концентрации слитого белка проводят по методу Брэдфорд [14]. Для построения калибровочной кривой используют бычий сывороточный альбумин (Serva, США).

Пример 4. Оценка цитотоксической активности рекомбинантного слитого белка по отношению к раковым клеткам.

Для анализа цитотоксического действия рекомбинантного слитого белка T1_RL используют клетки гепатоаденокарциномы-1 (ГА-1) мыши, полученные из ФГБУН Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск), клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MDA-MB-231, полученные из коллекции клеточных культур ЗАО «Исследовательский Институт Химического Разнообразия» (г. Химки, Московская область) и клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7, полученные из Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

Клетки ГА-1 культивируют в среде DMEM (Sigma) в присутствии 10% сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 2 мМ L-глутамина (Gibco, Life Technologies, UK), 250 мг/мл амфотерицина В и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, Life Technologies, UK). Клетки MDA-MB-231 культивируют в среде L15 (Gibco, Life Technologies, UK) в присутствии 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 250 мг/мл амфотерицина В и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки MCF-7 культивируют в среде IMDM (Gibco, Life Technologies, UK) в присутствии 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 250 мг/мл амфотерицина В и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Подсчет количества клеток проводят в камере Горяева.

В качестве способа, позволяющего быстро и точно оценить цитотоксический эффект рекомбинантного слитого белка, используют МТТ-тест. Клетки высаживают на 96-луночные планшеты для культур клеток в концентрации 4-5*10³ клеток/лунку в 100 мкл питательной среды RPMI-1640 (Gibco, Life Technologies, UK), содержащей 10% по объему FBS с добавлением раствора антибиотиков-антимикотиков состава: 100 ед/мл пенициллина G, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина, и инкубируют в течение 24 ч при температуре (37,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% CO₂.

Готовят ряд последовательных разбавлений исследуемого белка в питательной среде RPMI-1640, не содержащей FBS. Вносят по 100 мкл полученных разведений белка в лунки пластикового планшета с клетками. Через 48 ч инкубации при температуре (37,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СО₂ удаляют среду из лунок и вносят в каждую лунку по 200 мкл питательной среды RPMI-1640 и 10 мкл раствора МТТ (Sigma, США) с концентрацией 5 мг/мл после чего продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 4 ч. Затем удаляют среду с МТТ из лунок, и растворяют оставшиеся кристаллы МТТ-формазана добавлением 150 мкл ДМСО. Оптическую плотность растворенного в ДМСО МТТ-формазана измеряют на многоканальном планшетном сканере при λ=570 нм.

Результаты эксперимента представлены на фиг. 5. Результаты эксперимента показывают, что инкубация ГА-1 в присутствии созданного слитого белка приводит к снижению их жизнеспособности, T1_RL, как и RL2, дозозависимо снижает жизнеспособность клеток MDA-MB-231 и MCF-7. При этом цитотоксическая активность слитого белка практически не отличается от цитотоксической активности RL2. Таким образом, присоединение опухоль-специфического пептида к N-концу RL2 не привело к потери или изменению его цитотоксических свойств.

Пример 5. Оценка таргентных свойств (тропности) рекомбинантного слитого белка.

Оценку тропности слитого белка к опухоли проводят, определяя уровень флуоресценции опухолевой ткани после внутривенного введения животным-опухоленосителям конъюгата слитого белка с флуоресцентным красителем Сульфо-Су5 малиемидом.

Для получения сульфо-Су5 меченых аналогов T1RL и RL2 (контроль), 0,2 мМ каждого из белков инкубируют с 1,25 мМ флуоресцентного красителя Сульфо-Су5 малеимида (Ех/Em=646/662, Lumiprobe) в буфере Трис-HCl рН 5,5 при 25°С в течение 4 ч. Очистку конъюгатов RL2-Cy5 и T1_RL-Cy5 проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хромотографии (RP-HPLC) на колонке C18 на станции Milichrom А-02 (EcoNova, Россия) в системе ацетонитрил-вода.

Опухолевый штамм ГА-1 поддерживают в асцитной форме еженедельной внутрибрюшинной трансплантацией на мышах линии A/Sn. Для прививки опухолей асцитные клетки ресуспендируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 10⁶ клеток/мл и вводят мышам подкожно по 150 мкл клеточной суспензии. Животных используют в экспериментах при достижении размера опухолевого узла 0,8-0,9 см в диаметре.

Мышам с подкожно трансплантированной опухолью ГА-1 в хвостовую вену вводят по 80 мкг конъюгатов RL2-Cy5 и T1_RL-Cy5 в 200 мкл PBS. Через 10 минут циркуляции извлеченную опухоль анализируют на станции KODAK In Vivo FX Professional Imaging System, используя фильтры 650 нм экстинкции и 700 нм эмиссии.

Результаты представлены на фиг. 6. Согласно представленным данным через 10 минут циркуляции интенсивность флуоресцентного сигнала опухолевой ткани для белка T1_RL в 5,08±1,15 раз превышает интенсивность сигнала для RL2.

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК pET-15b_T1_RL, обеспечивающую продукцию в клетках Escherichia coli рекомбинантного слитого белка T1_RL, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, и обладающего бифункциональной активностью: цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам и таргетными свойствами к опухолевой ткани.

Источники информации

1. Злокачественные новообразования в России в 2014 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2016. 250 с.

2. Millimouno F.M., Dong J., Yang L., Li J., Li X. Targeting apoptosis pathways in cancer and perspectives with natural compounds from mother nature.//Cancer Prev Res (Phila). - 2014. - Vol. 7. - N. 11. - P. 1081-1107.

3. Некипелая B.B., Семенов Д.В., Потапенко M.O., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. Лактаптин - белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы MCF-7. // Докл. АН. - 2008. - Т. 419. - С. 268-271.

4. Власов В.В., Рихтер В.А., Семенов Д.В., Некипелая В.В., Кулигина Е.В., Потапенко М.О. Пептид, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека. // Патент RU 2317304 C1, оп. 20.02.2008.

5. Тикунова Н.В. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, способ получения рекомбинантного пептида и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам. // Патент RU 2401307 С1, оп. 10.10.2010.

6. Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their effect on cultured human cells. // The Protein Journal. - 2010. - Vol. 29. - N. 3. - P. 174-180.

7. Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Richter V.A. A novel pro-apoptic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice models. // Biochimie. - 2012. - Vol. 94. - N. 12. - P. 2467-2474.

8. Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S., Semenov D.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V., Zavjalov E.L. and Richter V.A. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, N4. - E. 93921.

9. Бондаренко Д.А., Рихтер B.A., Кулигина E.B., Коваль О.А., Фомин А.С. и др. Исследование токсичности и фармакокинетики препарата «Лактаптин» // Биофармацевтический журнал. - 2015. - №7. - С. 40-47.

10. Немудрая А.А., Рихтер В.А., Кулигина Е.В. Фаговые пептидные библиотеки как источник адресующих лигандов // Acta Naturae. - 2016. - №1.

11. Kuligina E.V., Vaskova A.A., Kaledin V., Ilyichev Α., Borgoyakova M., Koval O.A., Richter V.A. Targeted delivery of antitumor peptide lactaptin to tumors // FEBS J. - 2013. - V. 280. - P. 316.

12. Vaskova A.A., Kuligina E.V., Savelyeva A.V., Fomin A.S., Koval O.A., Semenov D.V., Richter V.A. Development of targeted delivery ways for antitumor peptide lactaptin // FEBS J. - 2014. - V. 281. - P. 407.

13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

14. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.

Claims

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-15b_T1_RL, обеспечивающая синтез рекомбинантного слитого белка в клетках Escherichia coli, состоящего из опухоль-специфического пептида и противоопухолевого пептида RL2, характеризующаяся в соответствии с физической картой, представленной на фиг. 2, следующими признаками:

- имеет размер 6054 п.о.;

- кодирует обладающий цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам и таргетными свойствами к опухолевой ткани рекомбинантный слитый белок, содержащий остаток метионина, опухоль-специфический пептид (GLHTSATNLYLH), глициновый спейсер GGGS и RL2;

- состоит из следующих элементов:

1) фрагмента ДНК размером 411 п.о., кодирующего рекомбинантный слитый белок с SEQ ID NO: 1;

2) сайта инициации репликации плазмиды pBR322;

3) промотора бактериофага Т7;

4) генетических маркеров: AMPr - ген ампициллин резистентности (b1a), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli;

5) гена lacI, кодирующего белок-репрессор;

6) lac оператора, перекрывающегося с Т7 промотором;

7) уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющими следующие координаты: Bg1II (841), NcoI (736), BamHI (320), HindIII (30), EcoRI (6053).

2. Рекомбинантный слитый белок, обладающий цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам и таргетными свойствами к опухолевой ткани, имеющий молекулярную массу 15,7 кДа, состоящий из остатка метионина, опухоль-специфического пептида, глицинового спейсера и рекомбинантного аналога лактаптина RL2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.