CN110903402B - 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用 - Google Patents

一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用，属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种同时靶向BCMA和NKG2D的双特异性融合蛋白及其构建方法与应用。本发明利用基因工程技术将抗人BCMA的单链抗体2A9与具有招募和激活NK细胞活性的MICA分子胞外区的α1‑2结构域部分通过柔性肽连接起来，获得融合蛋白序列，将其连接到一真核表达载体上后通过瞬时转染的方法使该融合蛋白得以在HEK 293表达体系中表达。此双特异性融合蛋白利用2A9和MICA分别对于BCMA和NKG2D的靶向作用可以将NK细胞带到BCMA+的多发性骨髓瘤(MM)细胞附近，重塑NK细胞杀伤MM细胞的功能，本发明具有良好的双向靶向能力。

Description

一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
技术领域
本项发明属于生物工程领域，具体涉及一种新型可以同时与人B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)和人自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)表面一强活化型受体NKG2D(Natural killer group 2,member D)同时结合的抗人BCMA单链抗体2A9融合人源MICA分子胞外α1-2结构域部分的双特异性融合蛋白2A9-MICAα1-2，其可利用2A9对BCMA的靶向作用以及MICAα1-2与NKG2D的结合作用将NK细胞招募到BCMA+的多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)细胞附近，利用MICA与NKG2D结合后可以激活NK细胞活性的能力，使其破坏并杀伤MM细胞。
背景技术
肿瘤尤其血液瘤方面的治疗一直是全世界所面临的6重要难题，传统的手术和化疗手段尽管在前期可能有效，但一般损伤大、副反应强且预后不佳，尤其当患者出现高转移、高侵袭或耐药复发时，其作用着实有限。而肿瘤免疫疗法将成为一大利刃，利用对肿瘤的靶向性及免疫细胞的监视杀伤能力，杀伤肿瘤，同时逐渐恢复机体自身的免疫体系。此法一方面要减少肿瘤靶向结合的非特异性，减少对正常细胞的伤害，另一方面就是要解除肿瘤细胞与免疫细胞之间的负调控，使药物的杀伤能力更加显著。目前最热的免疫疗法多以T细胞为核心，其细胞毒性特异性来源于靶细胞的MHC-Ⅰ类抗原的递呈，但狡猾的肿瘤细胞却可以通过改变其表面MHC-Ⅰ分子的表达和递呈来逃脱免疫监视。因此，从逃脱免疫监视的角度而言，T细胞可能无法展现其真正威力，而无须肿瘤相关抗原即可识别靶细胞的NK细胞就成为另一选择。
一.多发性骨髓瘤及肿瘤相关抗原BCMA
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是美国和欧洲第二常见的血液系统恶性肿瘤，是一种无法治愈的浆细胞瘤。据统计每100000人中约有6.2个人发病，好发年龄为65-74岁，2019年，美国癌症协会(ACS)给出的预估人数为：新诊断病例32110例，死亡人数为12960人。该病特征在于骨髓中单克隆浆细胞不受控制的增殖并干扰血细胞的正常产生，导致单克隆免疫球蛋白(即M蛋白)和免疫抑制的过量产生，最终产生骨溶解及终末器官(如肾脏)的损伤。目前FDA批准的治疗新型MM的药物主要有蛋白酶抑制剂类、免疫调节剂类、组蛋白脱乙酰酶抑制剂类、单克隆抗体类、化疗药物和激素类这六大类。其中不少药物价格昂贵或国内难以获得，我国国内上市的治疗MM的主流药物只有三种：bortezomib，lenalidomide，Ixazomib。除此以外，国内治疗MM的技术手段相较于国际上仍比较有限，干细胞移植加化疗及联合用药方法不仅要考察患者体质，也容易出现副反应及复发的现象，使得肿瘤具有更高的侵袭性，难以持续有效治疗；而单克隆抗体类药物如daratumumab等单药效果有限且国内无法买到，这就给治疗造成了更大的压力。
在MM领域，当下备受瞩目的新靶点就是BCMA(CD269)，它是一种表面细胞受体，偏好性地表达在成熟B淋巴细胞，识别B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)，进而影响B细胞存活成熟分化；此外，BCMA也是一种高度浆细胞特异性抗原，主要表达在MM细胞系，恶性浆细胞及类浆细胞的DC，但在幼稚和大多数记忆B细胞，生发中心和正常组织细胞中不表达。这种高度特异性表达，使得BCMA越来越成为骨髓瘤治疗中的热门靶点。
二.NK细胞表面受体NKG2D及其配体MICA通路与肿瘤免疫逃逸
NK细胞是一种具有细胞毒性的淋巴细胞，属于天然免疫系统，它可以在没有抗体或MHC的情况下，识别感染的靶细胞或癌细胞并产生快速的免疫反应，因此相比于需要MHC-Ⅰ类抗原递呈的T细胞而言，在癌细胞低表达MHC-Ⅰ类分子想要逃脱免疫监视作用时，NK则更容易被活化并清除靶细胞。
NK细胞表面也存在着活化型和抑制型受体。C型凝集素受体NKG2D是同型二聚体Ⅱ型跨膜蛋白，由KLRK1基因编码，是第一个被发现的NK细胞表面的免疫监视受体，更是一种强大的活化型受体，该受体亦被发现存在于CD8+杀伤性T细胞，NKT细胞，γδT细胞，CD4+杀伤性T细胞。在功能上，两个NKG2D蛋白招募四个造血细胞信号转导衔接蛋白分子DAP 10形成一个六聚体受体复合物，此复合物可通过PI3K和Grb2-Val信号通路提高Ca2+内流，肌动蛋白细胞骨架重组和微管激化，进一步使得NK细胞脱颗粒而活化发挥诱导靶细胞凋亡的作用。
人NKG2D受体保守型相当高，其配体主要有MHC-Ⅰ类分子同源物MICA、MICB及GPI锚定UL16结合蛋白(ULBPs,ULBP-1～6)，其中MICA的研究最多。MICA是一种跨膜锚定糖蛋白，同时也是一种压力蛋白，即当细胞遭受损伤或癌变为肿瘤细胞时，细胞表面将高表达MICA分子，该分子胞外区有α1、α2、α3三个结构域，其中远膜端的α1-α2结构域可结合NKG2D受体，而近膜端的α3结构域是蛋白酶解脱落位点。如在二硫键异构酶ERP5及几种属于ADAM(一种解整合素和金属蛋白酶)和MMP(基质金属蛋白酶)家族的蛋白酶的协同作用下，通过α3结构域即会使MICA分子脱落，使得固化的MICA分子水平降低而游离的sMICA分子水平提高，这样就使得免疫细胞难以发现MICA上调了的恶性肿瘤细胞，造成药效降低，而且有研究证明血清中高浓度的脱落MICA与许多人类癌症的进一步发展密切相关。
三.双特异性基因工程抗体
基因工程抗体又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。其优点就在于可以根据实验及理论需求在基因水平上对目的蛋白进行合理的改造和修饰。主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体等。
本专利所描述的2A9-MICAα1-2双特异性融合蛋白就是在单链抗体的基础上融合一分子使其成为具有双靶向作用的融合蛋白。一方面可以激活NKG2D通路，另一方面靶向BCMA抗原，将NKG2D+的免疫细胞尤其NK细胞招募至肿瘤细胞附近，活化免疫细胞使其分泌杀伤性细胞因子如IFN-γ，TNF-α等，同时释放颗粒酶穿孔素等来杀伤肿瘤细胞。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种具有肿瘤免疫疗效的靶向BCMA的双特异性融合蛋白2A9-MICAα1-2，该蛋白的2A9单链抗体部分成功靶向并可结合BCMA抗原，MICAα1-2部分则可与NKG2D受体结合，以提供一种多发性骨髓瘤治疗方案。
本发明还要解决的技术问题是提供上述双特异性融合蛋白的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述双特异性融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。
技术方案：一种双特异性融合蛋白，该蛋白包括：靶向人BCMA抗原的单链抗体和与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域。
进一步地，所述的靶向人BCMA抗原的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
进一步地，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述的重链可变区和轻链可变区之间由柔性肽衔接。
进一步地，重链可变区、柔性肽、轻链可变区从N端到C端依次连接。
进一步地，所述与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述靶向人BCMA抗原的单链抗体和与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域之间由柔性肽衔接。
进一步地，所述靶向人BCMA抗原的单链抗体和与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域之间的柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，所述靶向人BCMA抗原的单链抗体和与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域之间的柔性肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述双特异性融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步地，所述双特异性融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
一种双特异性融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将信号肽、靶向人BCMA抗原的单链抗体、柔性肽、与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域的核苷酸序列依次连接，得到重组核苷酸片段；
(2)将步骤(1)得到的重组核苷酸片段克隆至质粒上，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转染至宿主细胞；
(4)在宿主细胞中表达纯化，得到融合蛋白；
步骤(1)中，所述的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述的靶向人BCMA抗原的单链抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的柔性肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
步骤(2)中，所述的质粒为pcDNA3.1质粒。
步骤(3)中，所述的宿主细胞为HEK 293细胞。
步骤(4)中，所述的纯化方法是Ni柱亲和层析(如一步纯化纯度达不到，需再加一步分子筛纯化所需目的蛋白)。
上述双特异性融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。
其中，所述的肿瘤包括：多发性骨髓瘤及与BCMA+关联的肿瘤。
本专利所述的2A9-MICAα1-2双特异性融合蛋白主要由两部分组成：①、一种靶向人BCMA抗原的单链抗体2A9，其重链可变区(VH)氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；其轻链可变区(VL)氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；VH与VL之间由一柔性肽(G4S)衔接，连接方式为：(N端)VH-G4S-VL(C端)，整个单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，核苷酸序列为SEQ ID NO.6。②、一种与NKG2D受体相互作用的配体MICA分子胞外区α1-2结构域，其氨基酸序列为SEQ ID NO.7，核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
该融合蛋白是由2A9与MICAα1-2两部分之间通过G4S这一柔性肽Linker连接而成，再在C端添加一6*His纯化标签用于该融合蛋白的获得(6*His纯化标签为非必须结构，为了纯化方便，本发明在该融合蛋白的C端加入了6*His标签，6*His纯化标签也可以加在N端。)，具体的连接顺序为：信号肽-2A9 ScFv-G4S Linker-MICAα1-2-6*His Tag。融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13，核苷酸序列为SEQ ID NO.14。
该融合蛋白的制备还涉及一种真核宿主细胞(HEK 293细胞系)和一种真核表达载体(pcDNA3.1 vector)，该载体含有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，该载体同该宿主细胞用于表达专利所述的融合蛋白。
本专利采用分子生物学方法构建了所述双特异性融合蛋白。依托本实验室所保噬菌体库中筛得的抗人BCMA单链抗体2A9的氨基酸序列，通过公司优化为HEK 293表达系统所偏爱的核苷酸序列；从Uniprot及NCBI中查询并确定MICA分子胞外区α1-2结构域氨基酸序列；采用Overlap PCR技术将这两大部分拼接起来，辅以其他如纯化标签等部分，经确认其序列正确无误后，酶连到pcDNA3.1真核表达载体上，将带有此重组表达载体的菌种保藏于本实验室，提取含有融合蛋白序列的质粒，利用瞬转试剂通过瞬时转染的手段将其导入到HEK 293真核表达体系中，在信号肽的帮助下，使该融合蛋白得以分泌表达。收集细胞培养液，经4℃低温离心后，将上清过Ni柱进行分离纯化，通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白表达与否，分子量及装配是否正确。大量获得该融合蛋白后，运用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)鉴定其与BCMA+的MM细胞系(NCI-H929和RPMI-8226)的结合情况；运用SPR(Surface Plasmon Response)技术分析MICAα1-2部分与NKG2D的亲和力。这两部分的鉴定是作为双特异性融合蛋白的2A9-MICAα1-2得以发挥其靶向及诱导NK细胞杀伤靶细胞功能的基础。
有益效果：
本发明构建了一种新型的NKG2DLs(NKG2D Ligands)融合蛋白，使得NK细胞成为杀伤肿瘤细胞的核心作用力，在2A9可强特异性靶向BCMA的基础上，将NK细胞招募至肿瘤细胞附近使其发挥杀伤功能。本发明形成一套了表达融合蛋白的工艺流程；本发明可以用于治疗MM，为当下难以解决MM治疗瓶颈的市场提供一种参考方案。
附图说明
图1是pcDNA3.1 vector-2A9-MICAα1-2重组表达载体构建示意图。所插入的2A9-MICAα1-2目的片段长度为1335bp,插入到pcDNA3.1载体多克隆位点的ECORⅠ与NotⅠ酶切位点之间。SP为信号肽序列，VH、VL分别代表重、轻链可变区，Linker为Gly4Ser。
图2是所构建的含有融合蛋白序列的重组表达载体的琼脂糖凝胶电泳图。Lane 1即为pcDNA3.1 vector-2A9-MICAα1-2重组表达载体(Lane1：pcDNA3.1vector-2A9-MICAα1-2重组质粒)。
图3是2A9-MICAα1-2融合蛋白SDS-PAGE电泳图及Western Blot鉴定图。图3A为SDS-PAGE电泳结果，M表示蛋白Marker(10-245kDa),融合蛋白理论分子量50kDa左右，与电泳显示结果一致。图3B为非还原WB结果，所用一抗为mouse anti-MICA antibody。
图4是2A9-MICAα1-2与BCMA+人源MM细胞系NCI-H929、RPMI-8226的流式结合情况。图4A为2A9-MICAα1-2与BCMA高表达的NCI-H929细胞结合情况，结合率为97.3％；图4B为2A9-MICAα1-2与BCMA中低表达的RPMI-8826细胞结合情况，结合率为64.8％；图4C为2A9-MICAα1-2与人淋巴瘤细胞(BCMA-)Raji细胞的结合情况，结合率为7.06％。
图5是利用表面等离子共振(surface plasmon response,SPR)技术分析2A9-MICAα1-2融合蛋白对NKG2D的亲和力。利用Biacore X100，所测得的NKG2D与2A9-MICAα1-2的结合速率常数Ka(1/Ms)为1.58*105，解离速率常数Kd为0.005733，平衡常数KD为3.63*10-8。
具体实施方式
实施例1:pcDNA3.1 vector-2A9-MICAα1-2重组表达载体的构建。
首先将实验室通过噬菌体展示技术筛得的靶向人BCMA的单链抗体2A9的氨基酸序列送公司进行密码子的优化，使得其在HEK 293表达系统中得以高产量表达；其次利用Uniprot及NCBI等网站查询比对人MICA分子胞外区α1-2结构域部分序列，并将其送往公司合成基因序列。当得到两大部分的序列后，通过Overlap PCR的技术将两部分通过Gly4Ser衔接并辅以信号肽和His*6标签构建完整的2A9-MICAα1-2目的基因序列，将此目的序列进行TA克隆，转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂板，挑取阳性单克隆进行测序比对，选取测序结果正确的保菌进行活化，提取T vector-2A9-MICAα1-2质粒；同时提取pcDNA3.1载体质粒；分别对T vector-2A9-MICAα1-2和pcDNA3.1载体进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，回收目的片段和双酶切载体后，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂板，挑取阳性单克隆进行测序比对，选取测序结果正确的保菌进行扩增并保存。
实施例2:2A9-MICAα1-2融合蛋白的瞬时转染，分离纯化及鉴定。
选取含有序列完全正确的pcDNA3.1 vector-2A9-MICAα1-2重组表达载体的菌液，划平板活化后，挑取单克隆放大培养，提取质粒，测浓度。将所得的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，显示其大小正确。用PEI转染试剂将质粒瞬时转染到HEK 293细胞中，在分泌型信号肽的帮助下，促使其分泌表达到细胞培养上清中，收集细胞培养基上清，于4℃离心，将上清经0.22μm水系滤膜抽滤后，过亲和层析Ni柱，纯化该融合蛋白。用10％SDS-PAGE非还原电泳鉴定其分子量，与理论分子量相差不大，约50kDa左右；进行WB鉴定其融合蛋白的装配情况，经电泳、转膜、封闭后，于4℃孵育mouse anti-MICA antibody(稀释比1:2000)过夜，之后洗膜，37℃孵育二抗HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)(稀释比1:20000)1.5h，再洗膜曝光。结果证实该融合蛋白是含有MICAα1-2部分的，装配正确。
实施例3:2A9-MICAα1-2融合蛋白与BCMA+人源多发性骨髓瘤细胞系的流式结合情况。
选取BCMA高表达的人源MM细胞系NCI-H929及BCMA中低表达的RPMI-8226作为研究对象，选取BCMA阴性的Raji细胞作对照。该实验中首先分别准备1*106细胞/Ep管(空白管与实验管)，首先孵育目的融合蛋白(4℃，1h)后用2％FPBS(即含2％胎牛血清的PBS)清洗细胞两遍；再孵育mouse anti-His antibody(每100万个细胞孵育0.2μg的抗体，4℃，1h)后用2％FPBS清洗细胞两遍；再孵育Coralite 488-conjugates Affinipure Goat Anti-MouseIgG(H+L)(稀释比为1:250，4℃，1h)后用2％FPBS清洗细胞两遍；最后实验管中的细胞用250μLPBS重悬，空白管的细胞用500μL PBS重悬(空白管细胞用于调电压)，最后用美天旎流式细胞仪上机检测融合蛋白与细胞的结合情况。
实施例4:SPR技术检测2A9-MICAα1-2融合蛋白与人NKG2D的亲和力。
利用Biacore X100机器检测2A9-MICAα1-2与人NKG2D的亲和力。实验选择CM5芯片，其表面基质是共价偶联到金表面的羧甲基化葡聚糖。首先摸索偶联NKG2D所需的醋酸钠溶液的pH值，pH值4.5为宜。再用EDC/NHS活化CM5芯片表面，使其表面羧基发生酯化，待合适pH值醋酸钠溶液中的NKG2D进入后，芯片表面与NKG2D蛋白的氨基发生反应，最后用乙醇胺封闭芯片表面上多余的活性羧基。用HEPES溶液冲洗管路及芯片待其RU值稳定后开始摸索融合蛋白浓度与洗脱液Gly-HCl的pH值(pH 2.0)。根据摸索实验的结果，调整正式实验时的蛋白浓度(从1000nM到15.625nM)，在25℃，10μL/min的工作环境下，检测融合蛋白与人NKG2D之间的结合/解离能力。用2-1通道数据进行拟合并根据结合速率常数Ka值、解离速率常数Kd值、平衡常数KD值来评估二者间的亲和力。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Thr
<210> 2
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcagagg tgcagctgca gcagagcgga gcagagctgg tgaagcctgg agcctccgtg 60
aagctgtctt gtaccgccag cggcttcaac atcaaggata catacatgca ctgggtgaag 120
cagaggccag agcagggact ggagtggatc ggcagaatcg acccagccaa cggcaatacc 180
aagtacgatc ccaagtttca gggcaaggcc accatcacag ccgacaccag ctccaataca 240
gcctatctgc agctgtctag cctgacctcc gaggatacag ccgtgtacta ttgcgcaaga 300
tgggtgtact ggggacaggg aaccacactg accgtgtcca ca 342
<210> 3
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacgtggtca tgacccagag cccctcctct atgtatgcct ccctgggcga gcgcgtgacc 60
atcacctgta aggcctccca ggatatcaac tcttacctga gctggttcca gcagaagccc 120
ggcaagtctc ctaagaccct gatctatagg gcaaataggc tggtggacgg agtgccatct 180
cggttttctg gcagcggctc cggccaggat tacagcctga caatcagctc cctggagtat 240
gaggacatgg gcatctacta ttgcctgcag tacgatgagt tcccttatac ctttggcggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser
115 120 125
Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
145 150 155 160
Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly
165 170 175
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu
180 185 190
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu
195 200 205
Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
210 215 220
Ile Lys Arg
225
<210> 6
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcagagg tgcagctgca gcagagcgga gcagagctgg tgaagcctgg agcctccgtg 60
aagctgtctt gtaccgccag cggcttcaac atcaaggata catacatgca ctgggtgaag 120
cagaggccag agcagggact ggagtggatc ggcagaatcg acccagccaa cggcaatacc 180
aagtacgatc ccaagtttca gggcaaggcc accatcacag ccgacaccag ctccaataca 240
gcctatctgc agctgtctag cctgacctcc gaggatacag ccgtgtacta ttgcgcaaga 300
tgggtgtact ggggacaggg aaccacactg accgtgtcca caggaggagg aggatctgac 360
gtggtcatga cccagagccc ctcctctatg tatgcctccc tgggcgagcg cgtgaccatc 420
acctgtaagg cctcccagga tatcaactct tacctgagct ggttccagca gaagcccggc 480
aagtctccta agaccctgat ctatagggca aataggctgg tggacggagt gccatctcgg 540
ttttctggca gcggctccgg ccaggattac agcctgacaa tcagctccct ggagtatgag 600
gacatgggca tctactattg cctgcagtac gatgagttcc cttatacctt tggcggcggc 660
acaaagctgg agatcaagcg g 681
<210> 7
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly
1 5 10 15
Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro
20 25 30
Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln
35 40 45
Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg
50 55 60
Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile
65 70 75 80
Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys
85 90 95
Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr
100 105 110
Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr
115 120 125
Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn
130 135 140
Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met
145 150 155 160
His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ser Gly Val
165 170 175
Val Leu Arg Arg
180
<210> 8
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagccccaca gcctgcggta caacctgacc gtcctgtcct gggacggaag cgtccagagc 60
ggctttctgg ctgaggtgca cctggacggc cagcctttcc tgcggtacga ccggcagaaa 120
tgtcgggcta aaccccaggg ccagtgggct gaggatgtcc tgggcaacaa gacatgggac 180
cgggagacca gggacctcac aggcaacggc aaggacctcc ggatgacact ggcccacatc 240
aaggaccaga aggaaggcct gcacagcctg caggagatcc gggtgtgcga aatccacgag 300
gacaactcca cccggtcctc ccagcacttc tactacgacg gcgaactctt cctgtcccag 360
aatctggaga ccgaagagtg gacagtgcct cagagcagca gggcccaaac cctcgccatg 420
aacgtgcgga acttcctgaa ggaggacgcc atgaagacca agacccacta ccatgccatg 480
catgccgact gtctgcagga actgaggagg tacctggagt ccggcgtggt cctcaggagg 540
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcggcggcg gcagc 15
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggacatga gagtgccagc acagctgctg ggactgctgc tgctgtggct gaggggagca 60
agatgc 66
<210> 13
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
20 25 30
Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala
35 40 45
Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
50 55 60
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly
65 70 75 80
Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Val Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp
165 170 175
Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala
180 185 190
Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met
210 215 220
Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro
245 250 255
His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val
260 265 270
Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu
275 280 285
Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala
290 295 300
Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu
305 310 315 320
Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp
325 330 335
Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile
340 345 350
His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly
355 360 365
Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr Val Pro
370 375 380
Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu
385 390 395 400
Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala
405 410 415
Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ser Gly Val Val Leu
420 425 430
Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
435 440 445
<210> 14
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggacatga gagtgccagc acagctgctg ggactgctgc tgctgtggct gaggggagca 60
agatgcatgg cagaggtgca gctgcagcag agcggagcag agctggtgaa gcctggagcc 120
tccgtgaagc tgtcttgtac cgccagcggc ttcaacatca aggatacata catgcactgg 180
gtgaagcaga ggccagagca gggactggag tggatcggca gaatcgaccc agccaacggc 240
aataccaagt acgatcccaa gtttcagggc aaggccacca tcacagccga caccagctcc 300
aatacagcct atctgcagct gtctagcctg acctccgagg atacagccgt gtactattgc 360
gcaagatggg tgtactgggg acagggaacc acactgaccg tgtccacagg aggaggagga 420
tctgacgtgg tcatgaccca gagcccctcc tctatgtatg cctccctggg cgagcgcgtg 480
accatcacct gtaaggcctc ccaggatatc aactcttacc tgagctggtt ccagcagaag 540
cccggcaagt ctcctaagac cctgatctat agggcaaata ggctggtgga cggagtgcca 600
tctcggtttt ctggcagcgg ctccggccag gattacagcc tgacaatcag ctccctggag 660
tatgaggaca tgggcatcta ctattgcctg cagtacgatg agttccctta tacctttggc 720
ggcggcacaa agctggagat caagcggggc ggcggcggca gcgagcccca cagcctgcgg 780
tacaacctga ccgtcctgtc ctgggacgga agcgtccaga gcggctttct ggctgaggtg 840
cacctggacg gccagccttt cctgcggtac gaccggcaga aatgtcgggc taaaccccag 900
ggccagtggg ctgaggatgt cctgggcaac aagacatggg accgggagac cagggacctc 960
acaggcaacg gcaaggacct ccggatgaca ctggcccaca tcaaggacca gaaggaaggc 1020
ctgcacagcc tgcaggagat ccgggtgtgc gaaatccacg aggacaactc cacccggtcc 1080
tcccagcact tctactacga cggcgaactc ttcctgtccc agaatctgga gaccgaagag 1140
tggacagtgc ctcagagcag cagggcccaa accctcgcca tgaacgtgcg gaacttcctg 1200
aaggaggacg ccatgaagac caagacccac taccatgcca tgcatgccga ctgtctgcag 1260
gaactgagga ggtacctgga gtccggcgtg gtcctcagga ggggaggagg cggcagccac 1320
caccaccacc accac 1335

Claims (4)

1.一种双特异性融合蛋白，其特征在于，该蛋白包括：靶向人BCMA 抗原的单链抗体和与NKG2D受体相互作用的配体MICA 分子胞外区 α1-2 结构域；
所述的靶向人 BCMA 抗原的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的重链可变区和轻链可变区之间由柔性肽衔接；重链可变区、柔性肽、轻链可变区从N端到C端依次连接；
所述与NKG2D受体相互作用的配体MICA 分子胞外区 α1-2 结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述靶向人 BCMA 抗原的单链抗体和与NKG2D受体相互作用的配体MICA 分子胞外区α1-2 结构域之间由柔性肽衔接；
所述的柔性肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核苷酸序列SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述双特异性融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.13所示。
3.根据权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述双特异性融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4.权利要求1~3任一所述双特异性融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤为：多发性骨髓瘤。
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