CN108779178A - 抗mica抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够结合人MICA多肽的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白在治疗以表达MICA的细胞为特征的障碍，特别是癌症中具有增加的活性。

Description

抗MICA抗体
相关申请的引用
本申请要求2016年3月15日提交的美国临时申请号62/308,443的权益，该临时申请通过引用以其全文(包括任何附图和序列表)结合在此。
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“MICA2 PCT_ST25txt”的文件，创建于2017年3月13日，大小是44KB。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明提供了能够结合MICA多肽的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白在治疗以表达MICA的细胞为特征的障碍(特别是癌症)中具有增加的活性。
背景技术
免疫受体NKG2D通常在人T细胞(例如，CD8+ T细胞、γδT细胞)和NK细胞上表达。在预激活的CD8+细胞上，NKG2D经由DAP10缔合作用而起CD28和TCR信号转导的协同共刺激剂的作用，而在NK细胞中它起直接激活剂的作用。配体接合后，NKG2D因此经由配对的DAP10衔接蛋白直接传递激活或共刺激信号，从而促进癌症和传染病免疫。
已经鉴定并表征了人NKG2D(hNKG2D)的各种配体，包括主要组织相容性复合物I类相关链A和链B多肽(MICA和MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)家族、和视黄酸早期转录物-1(RAET1)家族。MICA通常与由微生物感染诱导的上皮肿瘤相关，并且在某些自身免疫性疾病病变中异常表达。MICA的结构类似于MHC I类的蛋白质折叠，具有α1α2平台结构域和膜近端Ig样α3结构域(Li等人2001Nat.Immunol.[自然免疫学]2:443)。MICA及其近亲MICB(其也充当NKG2D的配体)都是多态性的，并且已经显示多态性影响对NKG2D的亲和力(Steinle等人2001Immunogenetics[免疫遗传学]53:279)。
在缺乏MHC I类链(MIC)基因(结构上与ULBP相关的蛋白质家族)的小鼠中，视黄酸早期(RAE-1)分子作为NKG2D的配体起作用。已经显示RAE-1表达由致癌物诱导并且刺激T细胞的抗肿瘤活性。然而，鼠NKG2D识别人MICA多肽(Wiemann(2005)J.Immunol.[免疫学杂志]175:820-829)。
通过MICA以可溶形式从肿瘤细胞的细胞表面(例如，*019等位基因)和外泌体表面(*08等位基因)释放这一事实，MICA在癌症生物学中的作用变得复杂(Ashiru等人(2010)Cancer Res.[癌症研究]70(2):481-489)。可溶性MICA(sMICA)可以例如在患有胃肠道恶性肿瘤的患者的血清中以高水平检测到(Salih等人，2002J.Immunol.[免疫学杂志]169:4098)。已报道，MMP ADAM10和ADAM17连同二硫键异构酶Erp5在MICA的切割和脱落中起作用(Waldhauer(2008)Cancer Research[癌症研究]68(15)6368-76；Kaiser等人(2007)Nature[自然]；以及Salih(2002)J.Immunol[免疫学杂志]169:4098-4102)。已报道膜结合的MICA下调NKG2D在NK和/或T细胞上的表达(Von Lilienfeld-Toal等人(2010)CancerImmunol.Immunother[癌症免疫学免疫疗法])。值得注意的是，Wiemann(2005)(同上)检查了MICA Tg小鼠，并得出结论，非转基因脾细胞上的表面NKG2D的下调在与来自MICA转基因小鼠的脾细胞在体外共培养之后最明显，并且仅在用来自H2Kb-MICA小鼠的血清处理后略有下调，然而，分别与对照细胞和来自nontgLM的血清一起孵育没有效果，并且总体数据表明H2-K-MICA NK细胞上的表面NKG2D降低导致NKG2D功能障碍，并且NKG2D下调主要是由于持续暴露于细胞结合的体内MICA引起的。
还有报道称，NK细胞上的NKG2D被sMICA下调(Groh等人(2002)Nature[自然]；Arreygue-Garcia(2008)BMC；Jinushi等人(2005)J.Hepatol.[肝病学杂志])，这导致反应性较低的NK细胞。这种基本原理可能已经出现，因为在其他蛋白质家族中已经观察到类似的系统，例如已证明Ig样和TNF超家族以可溶形式释放，并且分子的释放通过减少配体密度影响细胞-细胞相互作用并且调节携带各自受体的NK细胞(Salih 2002)。因此，产生抗MICA抗体的尝试集中于开发抑制MICA脱落的抗体。
还已经报道，NKG2D配体MICA和MICB在健康细胞上的表达可以打破免疫激活和耐受性之间的平衡，并引发自身免疫。遗传连锁研究已经表明，一些MICA等位基因与1型糖尿病呈正相关，并且通过用NKG2D阻断性mAb(其减弱自身反应性CD8+ T细胞的扩增和功能)治疗可以完全阻止在其胰岛细胞上表达Rae1的前驱糖尿病NOD小鼠的的疾病发展。MICA和MICB分子在RA滑膜细胞中也显著上调并且以NKG2D依赖性方式激活T细胞。此外，已经报道，类风湿性关节炎患者在血清和发炎的关节中具有高水平的IL-15和TNF-α，它们诱导T细胞的CD4+CD28-亚群上的NKG2D的表达。在乳糜泻中，已经报道了肠中上皮内NKG2D+CD8+ T淋巴细胞的大量浸润，并且MIC蛋白变得在患有活动性疾病的患者的上皮细胞表面上强烈表达。在炎性肠病中，在肠上皮细胞上发现MIC表达水平增加，并且发现表达NKG2D的肠上皮CD4+ T细胞的数量与肠炎相关。
迄今为止基于NKG2D系统治疗炎症的方法集中于阻断NKG2D本身而不是其配体(Ogasawara等人(2004)Immunity[免疫学]20(6):757-767；Andersson等人(2011)Arthritis.Rheum.[关节炎与风湿病]63(9):2617-2629；Steigerwald等人(2009)MAbs[单克隆抗体]1(2):115-127)。一种可能性是，这种对NKG2D而非其配体的关注是由于感知难以靶向NKG2D配体系统，该NKG2D配体系统包括多种配体并且在一些情况下包括大量等位基因。
对于MICA和MICB，有超过97个MICA等位基因和至少31个MICB等位基因被识别。在α1α2结构域(参与NKG2D界面的结构域)中的MIC多肽中仅有43％的氨基酸同一性，并且80％的氨基酸取代是非保守的(Steinle等人(2001)Immunogenetics[免疫遗传学]53:279-287；Steinle等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]95:12510-12515)，这表明将不太可能获得对群体中的大多数个体有效的抗体。另外，MICA中第129位处的甲硫氨酸/缬氨酸双态性决定了NKG2D结合的差异，并且尽管残基129的侧链被部分掩蔽并且在第一个α2螺旋段中与谷氨酰胺136、丙氨酸139和甲硫氨酸140形成疏水相互作用，与缬氨酸129形式的MICA相比，这可能与该结构域中的构象差异有关(Steinle等人(2001)Immunogenetics[免疫遗传学]53:279-287)。
总之，对用治疗剂靶向MICA的新方法存在需求。
发明内容
在一方面，本发明尤其产生于跨人MICA等位基因(连同非人灵长类动物MICA)具有高亲和力的抗体的发现。
在一个实施例中，提供了抗MICA抗原结合结构域，或包含该抗原结合结构域的蛋白质(例如，单克隆抗体、多特异性结合蛋白、双特异性抗体等)，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％、90％、95％或98％相同的氨基酸序列，和
(b)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少80％、90％、95％或98％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，VL在Abnum位置71处(FR3中)包含酪氨酸(Y)氨基酸残基。在一个实施例中，VL在Abnum位置83处包含苯丙氨酸(F)。
在一个实施例中，重链可变区(VH)在Abnum位置72c(在FR2中)和74(在FR3中)处包含氨基酸残基，它们能够通过在位置72c处的残基与位置Abnum 74处的残基之间的H-键彼此相互作用。在一个实施例中，VH在Abnum位置72c处包含赖氨酸(K)氨基酸残基，并且在位置74处包含谷氨酰胺残基。在一个实施例中，VH在Abnum位置30处包含苏氨酸(T)。在一个实施例中，VH在Abnum位置48处包含异亮氨酸(I)。在一个实施例中，VH在Abnum位置67处包含缬氨酸(V)。在一个实施例中，VH在Abnum位置71处包含精氨酸(R)。
在一个实施例中，VH人受体框架的VH区段来自IGHV4-b(例如，IGHV4-b*02)，并且J区段来自IGHJ6(例如，IGHJ6*01)。在一个实施例中，VH的CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO:30、31和32的氨基酸序列。在一个实施例中，VL结构域人受体框架来自IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01)，并且J区段来自IGKJ2(例如，IGKJ2*01)。在一个实施例中，VL的CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列。在一个实施例中，人重链和/或轻链受体框架包含一个或多个回复突变，在这些回复突变中氨基酸被存在于非人哺乳动物(例如，鼠、大鼠)中具体位置处的氨基酸取代。在一个实施例中，人重链受体框架1(FR1)在Abnum位置30处包含苏氨酸(T)，并且与天然存在的人VH区段相比不包含其他突变。在一个实施例中，与天然存在的人VH区段相比，人重链受体框架2(FR2)不含突变。在一个实施例中，人重链受体框架3(FR3)在Abnum位置71处包含精氨酸(R)，并且与天然存在的人VH区段相比不包含其他突变。在一个实施例中，与天然存在的人VH区段相比，人重链受体框架4(FR4)不含突变。在一个实施例中，人轻链受体框架3(FR3)在Abnum位置71处包含酪氨酸，并且与天然存在的人VH区段相比不包含其他突变。在一个实施例中，与天然存在的人VH区段相比，人轻链受体框架1、2和4(FR1、FR2和FR4)不含突变。
在本文任何方面的一个实施例中，VH包含重链CDR1、CDR2和CDR3，它们分别具有SEQ ID NO:30、31和32中所示的氨基酸序列。在一个实施例中，VL包含轻链CDR1、CDR2和CDR3，它们分别具有SEQ ID NO:33、34和35中所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供了抗MICA抗原结合结构域,或包含该抗原结合结构域的蛋白质(例如，单克隆抗体、多特异性结合蛋白、双特异性抗体等)，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，任选地进一步在框架区中包含一个、两个或三个氨基酸残基取代，和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，任选地进一步在框架区中包含一个、两个或三个氨基酸残基取代。
在一个实施例中，提供了抗MICA抗原结合结构域,或包含该抗原结合结构域的蛋白质(例如，单克隆抗体、多特异性结合蛋白、双特异性抗体等)，该抗原结合结构域包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，任选地进一步在框架区中包含一个、两个或三个氨基酸残基取代，和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，任选地进一步在框架区中包含一个、两个或三个氨基酸残基取代。
在任何实施例的一方面中，轻链可变区在位置71(Abnum编号)处包含酪氨酸(Y)残基。
在任何实施例的另一方面中，重链可变区在位置72c(Abnum编号)处包含赖氨酸(K)残基。
在一个实施例中，提供了抗MICA抗原结合结构域,或包含该抗原结合结构域的蛋白质(例如，单克隆抗体、多特异性结合蛋白、双特异性抗体等)，该抗原结合结构域选自由以下组成的组：
(a)一种抗体结合结构域，其包含:包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)一种抗体结合结构域，其包含:包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区；以及
(c)一种抗体结合结构域，其包含:包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施例中，提供了结合人MICA的单克隆抗体，该单克隆抗体选自由以下组成的组：
(a)一种抗体，其包含:包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区；以及
(c)一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区。
在一方面，提供了抗MICA抗体,这些抗体具有人框架，这些人框架具有修饰的盐桥；蛋白质中的盐桥是带相反电荷的残基之间的H键，这些残基彼此足够接近以经历静电吸引。在一方面，提供了抗MICA抗体，这些抗体具有人框架，这些人框架具有轻链FR3中的氨基酸取代。在一方面，抗体在重链FR3区域中在位置72c和74(Abnum编号)处的残基之间包含H-键。
这些抗体显著地与来自两个主要MICA组的每一个中的主要MICA等位基因结合，所述两个主要MICA组被确定为代表MICA的主要家族：强烈结合NKG2D的组1等位基因(包括MICA*001、*002、*007、*012、*017和*018)和弱结合NKG2D的组2等位基因(MICA*004、*006、*008、*009和*019)。通过与亚组MICA*001、*004、*007和*008或者*001、*004、*007、*008和*019上存在的表位结合，这些抗体覆盖几乎存在于所有个体中的两组的等位基因。任选地，如通过流式细胞术所确定的，这些抗体对结合使在其表面*001处表达的细胞、对结合使在其表面*004处表达的细胞、对结合使在其表面*007处表达的细胞、以及对结合使在其表面*008处表达的细胞具有不超过1μg/ml、任选地不超过0.5μg/ml、不超过0.3μg/ml、或不超过0.2μg/ml的EC50。任选地，如通过流式细胞术所确定的，这些抗体对结合使在其表面*004处表达的细胞、对结合使在其表面*007处表达的细胞、以及对结合使在其表面*008处表达的细胞具有不超过0.1μg/ml、任选地不超过0.07μg/ml的EC50。这些抗体任选地进一步结合表达人MICB多肽的细胞。
在一个实施例中，能够结合MICA等位基因的抗体对结合人MICA*001具有与对人MICA*004、*007和/或*008的结合亲和力相差小于1-log的EC50，如通过流式细胞术对结合在其表面处表达用各自的MICA等位基因之一转染各自的MICA多肽细胞但不表达其他MICA等位基因的细胞所确定的。在一个实施例中，该抗体对结合人MICA*004、*007和/或*008多肽具有彼此相差不超过0.5log、0.3log或0.2log的EC50，如通过流式细胞术对结合在其表面处表达人MICA*004、*007和/或*008的细胞所确定的。
任选地，根据本文实例中的方法或根据PCT公开号WO 2013/117647的实例3确定EC50，例如用RSV.5neo载体转染的包含目的MICA核酸的C1R细胞(ATCC参考CRL-1993TM)(GenBank(NCBI)，在登录号M83237下)，通过流式细胞术进行数据获取，并且使用4参数模型进行EC50计算。
高亲和力结合尤其有利于抗体有效介导CDC和/或ADCC。
本披露的抗体能够阻断在细胞(例如，肿瘤细胞)表面上的MICA与NKG2D(例如，在NK细胞和T细胞上)的相互作用。因此，除了在包含与Fcγ受体结合的Fc结构域时诱导ADCC和/或CDC活性之外，这些抗体对于它们能够阻断膜MICA诱导的对NKG2D的下调的能力是有用的，例如，用于治疗癌症和/或传染病。此外，除了介导ADCC和/或CDC活性的能力之外或作为其替代，这些抗体对于它们降低M2巨噬细胞介导的对T细胞和/或NK细胞活性的抑制的能力是有用的。在其他实施例中，基本上不诱导ADCC和/或CDC活性的抗体(例如，不包含与FcγIIIa受体结合的Fc结构域)对于它们能够阻断膜MICA诱导的对NKG2D的下调和/或降低M2巨噬细胞介导的对T细胞和/或NK细胞活性的抑制的能力，可以是有用的，用于治疗炎性障碍和/或自身免疫障碍。在更进一步的实施例中，这些抗体可以与毒性剂(例如，细胞毒性部分)缀合并用于引起表达MICA的细胞(例如肿瘤细胞)的消耗或死亡。
在一方面，提供了使用本发明的抗MICA抗体的治疗方法。这些抗体可以用作预防性或治疗性治疗；在本文的任何实施例中，治疗有效量的抗体可以与预防有效量的抗体互换。在一方面，提供了一种治疗患有癌症、自身免疫障碍或炎性障碍的个体的方法，该方法包括向所述个体给予药学有效量的根据本披露的特异性结合MICA多肽的抗原结合化合物。
在一方面，提供了一种消除个体中表达MICA的细胞(例如癌细胞)的方法，该方法包括向患者给予药学有效量的根据本披露的特异性结合MICA多肽的抗原结合化合物。在一方面，提供了一种在患有癌症的个体中克服或降低髓源性抑制细胞(MDSC)介导的对NK细胞和/或T细胞活性的抑制的方法，该方法包括向所述个体给予药学有效量的根据本披露的特异性结合MICA多肽的抗原结合化合物。在一方面，提供了一种在患有癌症的个体中消除或抑制髓源性抑制细胞(MDSC)和/或M2巨噬细胞(例如，肿瘤组织驻留的MDSC或M2细胞)的免疫抑制活性的方法，该方法包括向所述个体给予药学有效量的根据本披露的特异性结合MICA多肽的抗原结合化合物。
在另一方面，提供了一种方法(例如，进行诊断测定、响应者测定等的方法)，该方法包括评估患者是否具有表达MICA多肽(例如，由本披露的抗体结合的MICA多肽(一个或多个MICA等位基因))的疾病相关细胞(例如肿瘤细胞)。所述方法可以包括，例如从包含疾病相关细胞的患者获得生物样品，使所述疾病相关细胞与这种抗体接触并且评估该抗体是否与疾病相关细胞结合。MICA由疾病相关细胞表达的发现表明患者患有以表达MICA的细胞为特征的病症和/或适合用本披露的抗MICA抗体治疗。可以用适合于以表达MICA的细胞为特征的具体疾病的疗法进一步治疗患者。任选地，用抗MICA抗体治疗患者。在一个实施例中，该方法用于选择患有癌症的受试者，并且疾病相关细胞是癌细胞。
将这些方面更详细地描述于在此提供的说明书中，并且另外的方面、特征和优点将从该说明书中显而易见。
附图说明
图1显示，与阴性对照(人IgG1同种型对照抗体)及其亲本(未修饰的)嵌合抗体相比，抗MICA mAb1诱导表达人KHYG-1CD16的NK细胞对C1R-MICA*001和*008细胞的特异性裂解，因此显示这些抗体诱导针对表达MICA*001和*008的靶细胞的ADCC。
图2显示抗MICA mAb1引起针对721.221-MICA*001肿瘤细胞的NK细胞激活的强烈增加，在存在或不存在M1或M2巨噬细胞的情况下。相反，在同种型对照中，不仅NK激活通常远低于此，而且肿瘤细胞和NK细胞与M2巨噬细胞一起孵育导致NK激活的强烈降低。
图3显示，当接受同种型对照或1μg抗MICA抗体mAb1的小鼠在注射后100天不存活时，在接受至少10μg抗MICA抗体的小鼠中观察到显著改善的存活。在100μg剂量下，抗MICA抗体mAb1在100天的所有小鼠中实现存活。
图4在左侧图中显示接受同种型对照的小鼠，并且在右侧图中显示接受抗MICA抗体mAb1的小鼠。显示了个体的肿瘤体积。CR＝完全响应。用抗MICA抗体mAb1治疗引起肿瘤体积减小。
图5显示与用同种型对照处理的小鼠相比，用抗MICA抗体mAb1处理的小鼠表现出降低的肿瘤细胞计数。
具体实施方式
本发明的抗体能够直接和特异性地靶向表达MICA的细胞以及表达MICB的细胞，尤其是肿瘤细胞和参与炎性过程或自身免疫过程的细胞。
MICA(PERB11.1)是指MHC I类多肽相关序列A(参见例如，UniProtKB/Swiss-ProtQ29983)、其基因和cDNA及其基因产物、或其天然存在的变体。在Frigoul A.和Lefranc,M-P.Recent Res.Devel.Human Genet.[人类遗传学最新研究与发展],3(2005):95-145ISBN:81-7736-244-5中描述了MICA基因和蛋白质的命名连同不同等位基因的序列的参考登录号，将其披露内容通过引用结合在此。MICA基因和蛋白质序列，包括蛋白质和DNA水平下的多态性，也从由英国癌症研究中心(Cancer Research UK)和欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)所维护的http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/align.html可获得。
MICA的氨基酸序列首先描述于Bahram等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]91:6259-6263和Bahram等人(1996)Immunogenetics[免疫遗传学]44:80-81中，将其披露内容通过引用结合在此。MICA基因是多态的，在其胞外α1、α2和α3结构域中显示出许多变体氨基酸的异常分布。为了进一步定义MICA的多态性，Petersdorf等人(1999)检查了275名具有常见和罕见HLA基因型的个体中的其等位基因。人MICA的胞外α1、α2和α3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1-5中。完整的MICA序列进一步包含23个氨基酸的前导序列、连同跨膜结构域和细胞质结构域。所选人MICA等位基因的胞外α1、α2和α3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1-5中。MICA*001的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1(对应于Genbank登录号AAB41060)中。人MICA等位基因MICA*004的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2(对应于Genbank登录号AAB41063)中。人MICA等位基因MICA*007的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3(对应于Genbank登录号AAB41066)中。人MICA等位基因MICA*008的氨基酸序列示于SEQ IDNO:4(对应于Genbank登录号AAB41067)中。人MICA等位基因MICA*019的氨基酸序列示于SEQID NO:5(对应于Genbank登录号AAD27008)中。人MICB的氨基酸序列示于Genbank登录号CAI18747(SEQ ID NO:36)中。
MICA基因编码属于MhcSF和IgSF的蛋白质。这种蛋白质是跨膜MHC-I-α样(I-α样)链，其包含三个胞外结构域，两个远端G样结构域，G-α1样(也称为“D1”或“α1”)和G-α2样(也称为“D2”或“α2”)，以及细胞膜近端的C样结构域(也称为“D3”或“α3”)，以及三个区域即连接区域、跨膜区域和细胞质区域(根据IMGT的IMGT科学图表(国际免疫遗传信息)，http://imgt.org以及LeFranc等人.In Silico Biology[计算机模拟生物学],2005；5:45-60进行标记)。包括前导序列、ECD、TM和CY结构域的MICA成熟蛋白由360至366个氨基酸组成，该差异源于跨膜区中的微卫星多态性。α1、α2和α3可以根据任何适合的编号系统(例如，IMGT编号系统)来定义。在一个实施例中，α1结构域包含SEQ ID NO:1的MICA多肽的残基位置1-88；α2结构域包含SEQ ID NO:1的MICA多肽的残基位置89-181；并且α3结构域包含SEQID NO:1的MICA多肽的残基位置182至274。α1和α2结构域各自包含A、B、C和D链，AB、BC和CD转角，以及螺旋。α3结构域包含A、B、C、D、E、F和G链，BC环，CD链，DE转角和FG环。MICA蛋白质是高度糖基化的，具有八个潜在的糖基化位点，两个在α1中，一个在α2中以及五个在α3结构域中，包括O-聚糖(与丝氨酸或苏氨酸连接的N-乙酰氨基乳糖)和/或N-聚糖。虽然MICA在某些细胞中组成型表达，但低水平的MICA表达通常不会引起宿主免疫细胞附着。然而，MICA在快速增殖的细胞(如肿瘤细胞)上被上调。MICA是所有NKG2D配体中表达最高的，并且已经在大范围的肿瘤类型中发现(例如，一般的癌，即膀胱癌、黑素瘤、肺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌；一般的血液恶性肿瘤，即急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴性白血病)。最近，Tsuboi等人(2011)(EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]:1-13)报道O-聚糖分支酶即核心2β-1,6-N-乙酰葡糖胺转移酶(C2GnT)在表达MICA的肿瘤细胞中有活性，并且来自肿瘤细胞的MICA包含核心2O-聚糖(包含与N-乙酰半乳糖胺连接的N-乙酰葡糖胺分支的O-聚糖)。
Bauer等人Science[科学]285:727-729,1999提供了MICA作为NKG2D的胁迫诱导型配体的作用。如本文所用的，“MICA”是指任何MICA多肽，包括MICA基因的任何变体、衍生物或同种型或它们所参考的编码的一种或多种蛋白质。MICA基因是多态的，在其胞外α1、α2和α3结构域中显示出许多变体氨基酸的异常分布。已经报道了MICA多肽(例如，MICA)的各种等位基因变体，其中的每一个都被各自的术语涵盖，包括例如人MICA多肽MICA*001、MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*006、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*010、MICA*011、MICA*012、MICA*013、MICA*014、MICA*015、MICA*016、MICA*017、MICA*018、MICA*019、MICA*020、MICA*022、MICA*023、MICA*024、MICA*025、MICA*026、MICA*027、MICA*028、MICA*029、MICA*030、MICA*031、MICA*032、MICA*033、MICA*034、MICA*035、MICA*036、MICA*037、MICA*038、MICA*039、MICA*040、MICA*041、MICA*042、MICA*043、MICA*044、MICA*045、MICA*046、MICA*047、MICA*048、MICA*049、MICA*050、MICA*051、MICA*052、MICA*053、MICA*054、MICA*055、MICA*056以及另外的MICA等位基因MICA*057-MICA*087。
如本文所用的，“hNKG2D”，并且除非另有说明或与上下文相矛盾，否则术语“NKG2D”、“NKG2-D”、“CD314”、“D12S2489E”、“KLRK1”(“杀伤细胞凝集素样受体亚家族K成员1”或“KLRK1”)，是指人类杀伤细胞激活受体基因、其cDNA(例如，GenBank登录号NM_007360)、及其基因产物(GenBank登录号NP_031386)、或其天然存在的变体。在NK和T细胞中，hNKG2D可以与蛋白质如DAP10(GenBank登录号AAG29425、AAD50293)形成异二聚体或更高级的复合物。本文归因于hNKG2D的任何活性，例如细胞激活、抗体识别等，也可以归因于异二聚体形式的hNKG2D，如hNKG2D-DAP10，或具有这两种(和/或其他)组分的更高级复合物。
已经确定了与NKG2D复合的MICA的3D结构(参见例如，Li等人，Nat.Immunol.[自然免疫学]2001；2:443-451；代码1hyr，以及IMGT/3D结构-DB(Kaas等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]2004；32:D208-D210))。当MICA与NKG2D同源二聚体复合时，MICA α2的残基63至73(IGMT编号)被排序，增加了几乎两个转角的螺旋。NKG2D的两个单体同样有助于与MICA的相互作用，并且每个NKG2D单体中的七个位置与MICAα1或α2螺旋结构域之一相互作用。
本发明提供了使用本文所披露的抗MICA抗体的方法；例如，提供了一种用于抑制细胞增殖或活性，用于递送分子(例如毒性分子、可检测的标记物等)至细胞，用于靶向、鉴定或纯化细胞，用于耗竭、杀伤或消除细胞，用于降低细胞增殖的方法，该方法包括将一种细胞(如表达MICA多肽的肿瘤细胞)暴露于结合MICA多肽的本披露的抗原结合化合物。应当理解的是，出于在此的目的，“细胞增殖”可以指细胞生长或增殖的任何方面，例如，细胞生长、细胞分裂、或细胞周期的任何方面。该细胞可以是在细胞培养物中(在体外)或在哺乳动物中(在体内)，例如在罹患表达MICA的病理学的哺乳动物中。还提供了一种用于诱导细胞死亡或抑制表达MICA多肽的细胞增殖或活性的方法，该方法包括将细胞暴露于结合与毒性剂连接的MICA多肽的抗原结合化合物，该抗原结合化合物以有效量诱导细胞死亡和/或抑制细胞增殖。因此，还提供了一种用于治疗患有增殖性疾病、以及以表达MICA多肽的细胞的病原性扩增为特征的任何病症的哺乳动物的方法，该方法包括向哺乳动物给予药学有效量的本文所披露的抗体，例如用于治疗癌症。
定义
如说明书中所使用的，“一个”或“一个”可以意指一个或多个。如在权利要求中使用的，当与词“包括(comprising)”结合使用时，这些词“一种/一个(a或an)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。如本文所用的,“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
当使用“包括”时，这可以任选地被“基本上由……组成”或通过“由……组成”代替。
当在这整个说明书中关于抗MICA结合剂(例如抗体)提及“癌症的治疗”或类似物时，意味着：(a)治疗癌症的方法，所述方法包括向对此类治疗有需要的个体、哺乳动物、特别是人，以允许治疗癌症的剂量(治疗有效量)，任选地以如本文指定的剂量(量)给予(对于至少一种治疗)抗MICA结合剂(例如在药学上可接受的载体材料中)的步骤；(b)使用抗MICA结合剂用于治疗癌症，或使用抗MICA结合剂用于所述治疗(尤其在人中)；(c)使用抗MICA结合剂用于制造用于治疗癌症的药物制剂，使用抗MICA结合剂用于制造用于治疗癌症的药物制剂(包括混合抗MICA结合剂与药学上可接受的载体)或包含有效剂量的适用于治疗癌症的抗MICA结合剂的药物制剂的方法；或(d)a)、b)、以及c)的任何组合，这是根据本主题，本主题允许在提交本申请的国家取得专利权。
如本文所用的，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。根据重链中恒定区的类型，抗体被分配到五个主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。一种示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括一种四聚物。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50kDa-70kDa)。每个链的N端定义了具有约100至110个或更多个氨基酸的一个可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区被对应地称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”以及“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG是在此使用的示例性抗体类别，因为它们是生理状况下最常见的抗体且在实验室条件下最容易制备。任选地，该抗体是单克隆抗体。抗体的具体实例是人源化的、嵌合的、人的或其他适合人的抗体。“抗体”还包括任何本文所述抗体的任何片段或衍生物。
术语“特异地结合到”意指优选地在竞争性结合测定中抗体可以结合到结合配偶体(例如MICA和MICB)上，正如使用重组体形式的蛋白、其中的表位、或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白所评估。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其他方法在下面进一步说明，并且在本领域是公知的。
当一种抗体被称为与一种具体的单克隆抗体竞争时，它意指在使用重组体MICA分子或表面表达的MICA分子结合测定中，该抗体与该单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定中降低参考抗体与MICA多肽或表达MICA的细胞的结合，那么该抗体被称为对应地与参考抗体“竞争”。
如本文所用的，术语“亲和力”意指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力通过解离常数Kd(定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag])给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka是由1/Kd定义的。确定mAb亲和力的方法可参见Harlow等人，Antibodies:A LaboratoryManual[抗体：实验室手册]，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港，纽约，1988)，Coligan等人编辑，Current Protocols in Immunology[当前免疫学方案]，格林尼出版协会(Greene Publishing Assoc.)和威力出版公司(WileyInterscience)，纽约，(1992，1993)，和Muller,Meth.Enzymol.[酶学方法]92:589-601(1983)，这些参考文献通过引用以其全文结合在此。本领域中熟知的用于确定mAb亲和力的一种标准的方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTM SPR分析装置分析)。
在本文的上下文中，“决定簇”指明多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指一种抗原决定簇，并且是在抗原上与抗体结合的面积或区域。一个蛋白质表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基连同通过特异性抗原结合的抗体或肽被有效地阻断的氨基酸残基，即，抗体“足迹”内的氨基酸残基。它是可以与例如一种抗体或一种受体组合的复杂抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可以是直链的或构象性的/结构性的。术语“直链的表位”被定义为由多个氨基酸残基组成的一个表位，这些氨基酸残基在氨基酸的线性序列上(一级结构)是连续的。术语“构象或结构表位”被定义为一种由并非都是连续的氨基酸残基构成的表位，并且因此代表通过分子的折叠(二级、三级和/或四级结构)彼此进入接近状态的氨基酸的线性序列的分开的部分。构象表位依赖于三维结构。因此，术语“构象的”经常与“结构的”互换使用。
关于表达MICA的细胞，术语“消耗(deplete或depleting)”意指导致杀伤、消除、裂解或诱导此类杀伤、消除或裂解的过程、方法、或化合物，以便负面影响存在于样品或受试者中的这样的表达MICA的细胞的数量。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是在本领域中已被充分理解的术语，并且是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞溶解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、以及嗜酸性粒细胞。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是本领域熟知的术语，并且是指分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体激活途径是通过补体系统的第一组分(C1q)结合到与同源抗原复合的分子(例如，抗体)而起始的。
术语“药剂”在本文中用于表示化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或由生物学材料制成的提取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。
出于本文的目的，“人源化”或“人”抗体是指一种抗体，其中一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)相融合。这类抗体被设计成保持衍生出这些结合区的非人类抗体的结合特异性，但是却要避免对抗非人类抗体的免疫反应。此类抗体可获自转基因小鼠或其他动物，所述动物已经被“工程化”以产生响应于抗原激发的特异性人类抗体(参见，例如，Green等人(1994)Nature Genet[自然遗传学]7:13；Lonberg等人(1994)Nature[自然]368:856；Taylor等人(1994)Int Immun[国际免疫学]6:579，将其全部传授内容通过引用结合在此)。完全的人抗体还可通过基因或染色体转染法连同噬菌体展示技术来构建，这些技术在本领域中已知(参见，例如McCafferty等人(1990)Nature[自然]348:552-553)。人类抗体也可以通过体外激活的B细胞产生(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，通过引用以其全文结合在此)。
如本文所用的，术语“抗原结合结构域”是指包含能够免疫特异性地结合到表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施例中，所述结构域可以包含高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施例中，该结合结构域可以包含抗体链的至少一个互补决定区(CDR)。在另一个实施例中，该结合结构域可以包含来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。该高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；披露内容(参见Kabat等人(1991)Sequences of Protein ofImmunological Interest[免疫学上感兴趣的蛋白的序列]，第5版，美国公共卫生署(United States Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institute ofHealth)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol[分子生物学杂志]1987；196:901-917)，或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。使用Kabat编号系统，肽的实际直链氨基酸序列可以包含对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。另一种适合的编号系统是Abnum系统。除非另有说明，否则针对免疫球蛋白的Abnum氨基酸编号命名法通常用于指VH和VL结构域中的位置(参见Abhinandan和Martin,(2008)Molecular Immunology[分子免疫学]45:3832-3839，其披露内容通过引用而并入)。使用Abnum系统的序列编号也可以在http://www.bioinfo.org.uk/abs/abnum下自动生成。然而，应当理解，本领域技术人员可以使用替代编号系统并且鉴定与Abnum编号相对应的位置。短语如本文的“Abm位置”、“Abm编号”和“根据Abm”是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。
如本文所用的，“框架”或“FR”残基意指排除定义为CDR的那些区域的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”、以及“Fc区域”是指抗体重链的C-末端片段，例如从约氨基酸(aa)230至约aa 450(Kabat编号)的人类γ重链或其在其他类型的抗体重链(例如针对人类抗体的α、δ、ε以及μ)中的对应物序列、或其天然存在的同种异型。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指实质上或基本上不含在天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。制剂中存在的主要种类的蛋白实质上是纯化的。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生氨基酸的一种人工化学模拟物，并且应用到天然发生的氨基酸聚合物以及非天然发生的氨基酸聚合物上。
术语“重组”当用于指例如一种细胞、核酸、蛋白或载体时表明该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入异源核酸或蛋白或者改变天然的核酸或蛋白进行修饰，或者表明该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或表达天然基因然而却异常表达、低表达或根本不表达。
在此上下文中，“结合”多肽的或表位的术语抗体指定一种结合所述具有特异性和/或亲和性决定簇的抗体。
术语“同一性”或“相同的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间的序列关联程度，如通过两个或更多个氨基酸残基链之间匹配的数目来确定的。“同一性”使用由具体数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的空位比对(如果有的话)测量两个或更多个序列中较短序列之间的相同匹配的百分比。相关多肽的同一性可以通过已知方法容易地计算出。这样的方法包括但不限于在以下文献中描述的那些：ComputationalMolecular Biology[计算分子生物学],Lesk,A.M.,编辑，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，纽约，1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目],Smith,D.W.,编辑，学术出版社(Academic Press)，纽约，1993；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析],第1部分，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑，胡玛纳出版社(Humana Press)，新泽西州，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学的序列分析],von Heinje,G.，学术出版社(Academic Press)，1987；Sequence Analysis Primer[序列分析引物],Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑，斯托克顿出版社(M.Stockton Press)，纽约，1991；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.[工业和应用数学学会应用数学杂志]48,1073(1988)。
用于确定同一性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。确定同一性的方法描述于公开地可获得的计算机程序中。用于确定在两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.[核酸研究]12,387(1984)；遗传学电脑集团(Genetics Computer Group)，威斯康辛大学(University ofWisconsin)，威斯康辛州麦迪逊市(Madison,Wis.))、BLASTP、BLASTN、以及FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215,403-410(1990))。BLASTX程序公开地可获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)以及其他来源(BLAST Manual[BLAST手册]，Altschul等人.NCB/NLM/NIH贝塞斯达，马里兰州20894；Altschul等人，同上)。公知的Smith Waterman算法也可以用来确定同一性。
抗体的产生
本发明部分基于可以掺入抗体CDR的经修饰的人受体框架序列的发现，使得所得的抗MICA可变区对主要的人MICA等位基因具有高的物理化学稳定性和高结合亲和力。此外，提供了具有高含量人氨基酸序列的抗体，从而当向人类个体给予时提供降低的免疫原性风险。有利地，这些抗体具有引起人抗小鼠抗体(HAMA)的低潜力。
抗MICA抗体VH和VL序列在下表1中提供，各个VH结构域和VL结构域之间不同的氨基酸标有下划线：
表1
使用针对免疫球蛋白的Abnum氨基酸编号命名法(参见Abhinandan和Martin,(2008)Molecular Immunology[分子免疫学]45:3832-3839，其披露内容通过引用而并入)描述本文的VH和VL结构域中的位置。使用Abnum系统的序列编号也可以在http://www.bioinfo.org.uk/abs/abnum下自动生成。然而，应当理解，本领域技术人员可以使用替代编号系统并且鉴定与Abnum编号相对应的位置。
在一个实施例中，该抗体包含来自人类亚组IGHV4-b(例如，IGHV4-b*02)的重链框架，并且J区段来自IGHJ6(例如，IGHJ6*01)。在一个实施例中，该人源化抗体包含来自人类亚组IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01)的轻链框架，并且J区段来自IGKJ2(例如，IGKJ2*01)。
该抗体可以进一步包含人框架序列中的一个或多个突变，以例如增强抗体的亲和力、稳定性、或其他特性。
抗MICA抗体的VH和VL氨基酸序列的实例分别在SEQ ID NO:6-21中显示。在一方面，提供了一种结合人MICA多肽的分离的抗体，其中该抗体包含：HCDR1区域，其包含如SEQID NO:30所示的氨基酸序列SDYAWN或其至少3或4个氨基酸的序列；HCDR2区域，其包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列FVSYSGTTKYNPSLKS或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列；HCDR3区域，其包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列GYGFDY或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列；LCDR1区域，其包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列SATSSISSIYFH或其至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列；LCDR2区域，其包含如SEQID NO:34所示的氨基酸序列RTSNLA或其至少3、4或5个连续氨基酸的序列；LCDR3区域，其包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列QQGTTIPFT或其至少5、6、7或8个连续氨基酸的序列。
在一方面，提供了结合人MICA多肽的抗原结合结构域或抗体，该抗原结合结构域或抗体包含：
(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及
(g)人类重链和轻链框架序列，
其中该抗原结合结构域或抗体包含VH和VL，所述VH包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％、90％、95％或98％相同的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少80％、90％、95％或98％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，轻链可变区(VL)包含能够与VL的CDR1内的氨基酸形成非共价键的在Abnum位置71(在FR3中)处的氨基酸残基。在一个实施例中，VL在Abnum位置71处(FR3中)包含酪氨酸(Y)氨基酸残基。在一个实施例中，VL在Abnum位置83处包含苯丙氨酸(F)。
在一个实施例中，重链可变区(VH)在Abnum位置72c(在FR2中)和74(在FR3中)处包含氨基酸残基，它们能够彼此相互作用以形成盐桥，例如在Abnum位置72c处的残基和在位置74处的残基之间的H键的。在一个实施例中，VH在Abnum位置72c处包含赖氨酸(K)氨基酸残基，并且在位置74处包含谷氨酰胺残基。在一个实施例中，VH在Abnum位置30处包含苏氨酸(T)。在一个实施例中，VH在Abnum位置48处包含异亮氨酸(I)。在一个实施例中，VH在Abnum位置67处包含缬氨酸(V)。在一个实施例中，VH在Abnum位置71处包含精氨酸(R)。
在一个实施例中，VH包含来自人类亚组IGHV4-b(例如，IGHV4-b*02)的重链框架，并且J区段来自IGHJ6(例如，IGHJ6*01)。在一个实施例中，VL包含来自人类亚组IGKV3-11(例如，IGKV3-11*01)的轻链框架，并且J区段来自IGKJ2(例如，IGKJ2*01)。
任选地，人VH和/或VL框架(例如，或其重链或轻链FR1、FR2、FR3和/或FR4)可以包含或不包含一个或多个突变(例如回复突变)以在非人类哺乳动物(例如小鼠或大鼠)中的具体位置处引入残基。该抗体可以进一步包含或不包含人框架序列中的一个或多个另外的突变(例如回复突变)，以例如增强抗体的亲和力、稳定性、或其他特性。
在另一方面，提供了抗MICA抗体，其包含与SEQ ID NO:6或8的VH结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或更多同一性)的VH结构域。在另一方面，提供了抗MICA抗体，其包含与SEQ ID NO:7或9的VH结构域具有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％或更多同一性)的VL结构域。
可以制备编码抗体的DNA并将其置于适当的表达载体中以转染到适当的宿主中。然后将该宿主用于重组产生抗体或其变体，例如单克隆抗体的人源化版本、抗体的活性片段、嵌合抗体(包括抗体的抗原识别部分)、或包括可检出部分的版本。
使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码鼠类抗体的重链和轻链的基因上的寡核苷酸探针)，可以很容易对编码本披露的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。在一方面，提供了编码本文任何实施例的抗MICA抗体的重链或轻链的核酸。一旦被分离，DNA可以被置于表达载体中，然后将这些载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。如在本说明书的其他地方所说明，可以出于多个目的中任何一项(例如，用于人源化抗体、产生片段或衍生物、或用于修饰抗体的序列)而例如在抗原结合位点中对这类DNA序列进行修饰，从而优化该抗体的结合特异性。在一个实施例中，提供了编码抗体的轻链和/或重链的分离的核酸序列，连同包含(例如在其基因组中)这样的核酸的重组宿主细胞。在细菌中重组表达编码抗体的DNA在本领域中是熟知的(参见，例如，Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.[免疫学新见],5,256页(1993)；以及Pluckthun,Immunol.[免疫学]130,151页(1992))。
典型地，本文提供的抗MICA抗体对MICA多肽具有约104至约1011M-1(例如约108至约1010M-1)范围内的亲和力。例如，在一个具体方面，本披露提供了关于MICA具有小于1x 10-9M的平均解离常数(KD)的抗MICA抗体，如通过例如表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTM SPR分析装置进行分析)所确定的。在一个更具体的示例性方面，本披露提供对于MICA(例如，MICA*001、*004、*007和*008等位基因)具有约1x 10-8M至约1x 10-10M、或约1x10-9M至约1x 10-11M的KD的抗MICA抗体。
可以例如通过不大于约(例如亲和力优于)100、60、10、5或1纳摩尔(优选亚纳摩尔)或任选地不大于约500、200、100或10皮摩尔的平均KD对抗体进行表征。可以例如通过将重组产生的人MICA蛋白固定在芯片表面上，接着使用溶液中待测试的抗体来确定KD。在一个实施例中，该方法进一步包括步骤(d)，从(b)中选择能够与本披露的抗体竞争结合MICA的抗体。
在测试抗体在其VH和/或VL中具有修饰的情况下，可以采用简单的竞争测定，其中将对照(例如，具有SEQ ID NO:6和7的VH和VL的抗体，或具有SEQ ID NO:8和9的VH和VL的抗体)和测试抗体进行混合(或预吸附)，并且应用于包含MICA多肽的样品上。基于蛋白质印迹法的实验方案和BiacoreTM分析的使用适合用于这类竞争研究。
在某些实施例中，在应用到MICA抗原样品之前，技术人员将对照抗体与不同量的测试抗体预混合(例如，约1:10或约1:100)持续一段时间。在其他实施例中，在暴露于MICA抗原样品期间可以将对照与不同量的测试抗体简单地混合。只要技术人员可以将结合抗体与游离抗体区分(例如通过使用分离或洗涤技术来消除非结合抗体)，并且将对照抗体与测试抗体区分(例如通过使用种属特异性或同种型特异性第二抗体，或通过用可检测性标签特异性标记对照抗体)，即技术人员可以确定测试抗体是否减少对照抗体与抗原的结合，表明该测试抗体与对照抗体识别基本上相同的表位。在完全不相关的抗体不存在时，(标记的)对照抗体的结合可以用作对照高值。对照低值可以通过将标记的对照抗体与完全同一类型的未标记抗体一起孵育而获得，其中将出现竞争并且减少标记抗体的结合。在一个测试测定中，在测试抗体存在的情况下，标记抗体反应性的显著降低可以指示基本识别相同表位的测试抗体，即，与标记的对照抗体发生“交叉反应”或竞争的抗体。在对照抗体:测试抗体在约1:10和约1:100之间的任何比率下，使对照抗体与MICA抗原的结合降低了至少约50％、例如至少约60％、或更优选至少约80％或90％(例如，约65％-100％)的任何测试抗体被认为是结合至与对照抗体基本上相同的表位或决定簇上的抗体。在一个实施例中，这种测试抗体将使对照抗体与MICA抗原的结合降低至少约90％(例如，约95％)。
竞争还可以通过例如流式细胞术测试来评估。在此类测试中，带有给定MICA多肽的细胞可以例如首先与对照抗体一起孵育，并且然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体一起孵育。如果当与饱和量的对照抗体预孵育时获得的结合是不用对照抗体预孵育的抗体所获得的结合(如用荧光测量)的约80％，任选地约50％、约40％或更少(例如，约30％、20％或10％)，就说该抗体与对照抗体竞争。可替代地，如果在与饱和量的测试抗体一起预孵育的细胞上用标记的对照抗体(通过荧光染料或生物素)获得的结合是在没有与测试抗体一起预孵育时获得的结合的约80％，任选地约50％、约40％、或更少(例如约30％、20％或10％)，就说该抗体与对照抗体竞争。
还可以采用简单的竞争测定，其中测试抗体被预吸收并且在饱和浓度下应用到固定有MICA抗原的表面上。在这种简单的竞争测定中，该表面优选地是一种BiacoreTM芯片(或适合表面等离子共振分析的其他介质)。然后使对照抗体(例如，具有SEQ ID NO:6和7的VH和VL的抗体，或具有SEQ ID NO:8和9的VH和VL的抗体)与该表面在MICA饱和浓度下进行接触，并且测量MICA和对照抗体的表面结合。将对照抗体的结合与在测试抗体不存在下对照抗体与包含MICA的表面的结合进行比较。在测试测定中，在测试抗体的存在下包含MICA的表面被对照抗体结合的显著降低表明该测试抗体识别与对照抗体基本相同的表位，这样使得该测试抗体与对照抗体进行“交叉反应”。将对照抗体与MICA抗原的结合降低至少约30％或更多(优选约40％)的任何测试抗体可以被认为是与对照抗体结合至基本相同表位或决定簇上的抗体。优选地，这样的测试抗体将对照抗体与MICA抗原的结合降低至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、或更多)。应当理解的是对照和测试抗体的顺序可以逆转：即，在一个竞争测定中可以首先将对照抗体结合到表面上并且之后将测试抗体与该表面接触。优选地，首先将对MICA抗原具有更高亲和力的抗体结合到该表面上，正如将预期的对第二抗体(假设这些抗体是交叉反应的)观察到的结合降低将具有更大幅度。此类测定的进一步实例提供于例如Saunal(1995)J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183:33-41，将其披露内容通过引用结合在此。
确定抗体是否结合在表位区之内可以用本领域的普通技术人员已知的方式进行。作为此类作图/表征方法的一个实例，抗MICA抗体的表位区可以使用在MICA蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰通过表位“足迹法(foot-printing)”来确定。这种足迹法技术的一个具体实例是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合、以及反向交换，其中保护参与蛋白结合的主链酰胺基团免受反向交换并且因此将保持被氘化。可以在这一点上通过胃蛋白酶水解作用、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷雾离子化质谱法来鉴别相关区域。参见，例如Ehring H,AnalyticalBiochemistry[分析生物化学],第267卷(2)第252-259页(1999)；Engen,J.R.和Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.[分析化学]73,256A-265A。适当的表位鉴别技术的另一个实例是核磁共振表位作图(NMR)，其中典型地将游离抗原和与抗原结合肽(如抗体)复合的抗原的二维NMR谱图中的信号的位置进行比较。典型地用15N对该抗原进行选择性核素标记，这样使得在NMR谱图中可以看到仅相应于抗原的信号以及没有来自该抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱图相比较，在复合物谱图中由涉及与抗原结合肽相互作用的氨基酸所产生的抗原信号典型地将移动位置，并且用这种方法可以鉴别涉及该结合的氨基酸。参见，例如，ErnstSchering Res Found Workshop.[恩斯特先灵研究基金会研讨会]2004；(44):149-67；Huang等人，Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志],第281卷(1)第61-67页(1998)；以及Saito和Patterson,Methods.[方法]1996年6月；9(3):516-24。
表位作图/表征还可以使用质谱法进行。参见，例如，Downard,J Mass Spectrom.[质谱杂志]2000年4月；35(4):493-503以及Kiselar和Downard,Anal Chem.[分析化学]1999年5月1日；71(9):1792-1801。在表位作图以及鉴定的情况下，蛋白酶消化技术也可能是有用的。可以通过蛋白酶消化(例如通过以相当于MICA约1:50的比率使用胰蛋白酶或在pH 7-8下进行o/n消化)，随后针对蛋白身份进行质谱(MS)分析来确定抗原决定簇相关区域/序列。被抗MICA结合剂保护而免受胰蛋白酶切割的肽可以随后通过将经历胰蛋白酶消化的样品与用抗体孵育过的、并且之后经历通过例如胰蛋白酶消化的样品进行比较(由此展现结合剂的足迹)来鉴定。在类似的表位表征方法中还可以或可替代地可以使用其他酶像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。而且，酶消化可以提供一种快速方法来分析潜在的抗原决定簇序列是否在MICA多肽的区域内，该区域不是表面暴露的，并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能是不相关的。
定点诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白片段中每个残基都用一个丙氨酸残基替换，并且测量结合亲和性的结果。如果该突变导致结合亲和力的显著降低，则它最可能参与结合。可以使用对结构性表位具有特异性的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白的抗体)来验证该丙氨酸代替不影响蛋白的整体折叠。参见，例如，Clackson和Wells,Science[科学]1995；267:383-386；以及Wells,Proc Natl Acad SciUSA[美国国家科学院院刊]1996；93:1-6。
电子显微镜也可以用于表位“足迹法”。例如，Wang等人，Nature[自然]1992；355:275-278，使用冷冻电子显微镜术、三维图像重构、以及X射线晶体学的联合应用以确定Fab片段在天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的物理足迹。
其他形式的用于表位评估的“无标签”测定包括表面等离子体共振(SPR，BiacoreTM)和反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，等人，Journal Of MolecularRecognition[分子识别杂志]1990；3:208-14；Nice等人，J.Chroma-togr.[色谱法杂志]1993；646:159-168；Leipert等人，Angew.Chem.Int.Ed.[德国应用化学国际版]1998；37:3308-3311；等人，Biosensors and Bioelectronics[生物传感器与生物电子]2002；17:937-944。
还应当指出，结合与一种抗体相同或基本上相同的表位的抗体可以在此处描述的示例性竞争测定的一个或多个中鉴定。在一个实施例中，阻断性α1α2结构域抗体结合如下表位，该表位包含一个、两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105组成的组的残基，一个或两个选自由N121和E123组成的组的残基，和/或一个或两个选自由T124和E126组成的组的残基。在一个实施例中，阻断性α1α2结构域抗体结合人MICA多肽上的表位，该表位包含选自由以下残基组成的组中的1、2、3、4、5、6个或更多个残基(参考SEQ ID NO:1)：E100、D101、N102、S103、T104、R105、N121、E123、T124和E126。
在一个实施例中，抗MICA抗体与具有E100A、D101S、N102A取代的突变型人MICA多肽的结合降低(与SEQ ID NO:1的野生型人MICA多肽相比)。在一个实施例中，抗MICA抗体与具有S103A、T104S、R105A取代的突变型人MICA多肽的结合降低(与SEQ ID NO:1的野生型人MICA多肽相比)。在一个实施例中，抗MICA抗体与具有N121A、E123S取代的突变型人MICA多肽的结合降低(与SEQ ID NO:1的野生型人MICA多肽相比)。在一个实施例中，抗MICA抗体与具有T124A和E126A取代的突变型人MICA多肽的结合降低(与SEQ ID NO:1的野生型人MICA多肽相比)。
在一个实施例中，抗MICA抗体至少部分地与MICA多肽在MICA的α2结构域内结合。任选地，该抗体结合NKG2D结合表面附近的MICA侧面的α2结构域，这与该抗体阻断细胞表面MICA与NKG2D的相互作用的发现相一致。
鉴于抗MICA抗体诱导ADCC和CDC的能力，这些抗体可以有利地采用修饰制成，所述修饰增加了它们结合Fc受体的能力，这可以影响效应子功能例如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱颗粒、以及吞噬，连同免疫调节信号(如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌)。典型的修饰包括修饰的人类IgG1恒定区，所述修饰的人类IgG1恒定区包含至少一个氨基酸修饰(例如取代、缺失、插入)、和/或改变类型的糖基化，例如低岩藻糖基化。此类修饰可以影响与以下Fc受体的相互作用：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD 16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)以及FcγRIII(CD 16)是激活型(即，免疫系统增强型)受体，而FcγRIIB(CD32B)是抑制型(即，免疫系统阻滞型)受体。修饰可以例如增加Fc结构域与效应(例如NK)细胞上的FcγRIIIa的结合。
抗MICA抗体可以包括人类IgG1或IgG3同种型的Fc结构域(或其部分)，可任选为经修饰的。人类IgG1Fc区域的位置230至447序列(GenBank登录#：J00228)的氨基酸序列显示如下：PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:37)。
残基230-341(Kabat EU)是Fc CH2区域。残基342-447(Kabat EU)是Fc CH3区域。抗MICA抗体可以包含变体Fc区域，所述变体Fc区域在一个或多个部分中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代、缺失、插入)，所述修饰增加了变体Fc区域对FcγR(包括激活型和抑制性FcγR)的亲和力和亲合力。在一些实施例中，所述一个或多个氨基酸修饰增加了变体Fc区域对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力。在另一个实施例中，变体Fc区域与可比的亲本抗体(即，一种这样的抗体，具有与本文中的抗体相同的氨基酸序列，除了Fc区域中的一个或多个氨基酸修饰)的Fc区域相比，进一步以更低的亲和力特异性地结合FcγRIIB。例如，在Kabat氨基酸位置310和435处的组氨酸残基中的一个或两个可被例如赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代(参见，例如PCT公开号WO 2007/080277)；此类取代的恒定区提供了与抑制性FcγRIIB的降低的结合，而并未降低与激活型FcγRIIIA的结合。在一些实施例中，相对于亲本抗体，此类修饰增加了变体Fc区域对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力，并且还增强了变体Fc区域对FcγyRIIB的亲和力。在其他实施例中，相对于该亲本抗体的Fc区域，所述一个或多个氨基酸修饰增加了变体Fc区域对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力，但未改变该变体Fc区域对FcγRIIB的亲和力。在另一个实施例中，相对于亲本抗体，所述一种或多种氨基酸修饰增强了变体Fc区域对FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力但降低了对FcγRIIB的亲和力。当亲本分子(没有修饰的Fc区域)的结合活性不能在细胞中检测到时，增加的亲和力和/或亲合力导致与表达低水平FcγR的细胞中FcγR或FcγR相关活性的可检测的结合。
在一个实施例中，所述对Fc区域的氨基酸的一个或多个修饰降低了抗体对一种或多种FcγR受体的亲和力和亲合力。在一个具体实施例中，抗体包含变体Fc区域，其中所述变体Fc区域相对于野生型Fc区域包含至少一个氨基酸修饰，该变体Fc区域仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIIA或FcγRIIA。
IgG1中影响(增强)FcγRIIIa或FcRn结合的特定突变也在下面列出。
这些抗体对于FcγR的亲和力和结合特性可以使用本领域中已知的用于确定抗体-抗原或Fc-FcγR相互作用(即，分别为抗原与抗体的特异性结合或Fc区域与FcγR的特异性结合)的体外测定(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，所述体外测定包括但不限于ELISA测定、表面等离子体共振测定、免疫沉淀测定。
在一些实施例中，包含变体Fc区域的抗体在Fc区域的CH3结构域中包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)。在其他实施例中，这些抗体包含变体Fc区域，所述变体Fc区域在Fc区域的CH2结构域中包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)。在一些实施例中，这些抗体包含至少两个氨基酸修饰(例如，具有2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰),其中至少一个这样的修饰是在CH3区域中并且至少一个这样的修饰是在CH2区域中。任选地，抗体可以包含铰链区中的氨基酸修饰。在一个实施例中，提供了Fc区域的CH1结构域中的氨基酸修饰，任选地在来自Kabat位置216-230(Kabat EU编号)的氨基酸跨度内。
可以制得Fc修饰的任何组合，例如在以下文献中披露的不同修饰的任何组合：美国专利号US,7,632,497；7,521,542；7,425,619；7,416,727；7,371,826；7,355,008；7,335,742；7,332,581；7,183,387；7,122,637；6,821,505和6,737,056；PCT公开号WO 2011/109400；WO 2008/105886；WO 2008/002933；WO 2007/021841；WO 2007/106707；WO 06/088494；WO 05/115452；WO 05/110474；WO 04/1032269；WO 00/42072；WO 06/088494；WO07/024249；WO 05/047327；WO 04/099249和WO 04/063351；以及Presta,L.G.等人(2002)Biochem.Soc.Trans.[物化学学会汇报]30(4):487-490；Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]26；277(30):26733-26740以及Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276(9):6591-6604。
本披露提供了包含变体Fc区域的抗MICA抗体a，其中相对于野生型Fc区域，该变体Fc区域包括至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)，使得该分子相对于包含野生型Fc区域的分子而言具有增强的效应子功能，任选地其中该变体Fc区域在以下位置的任何一个或多个处包含取代：221、243、247、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、308、309、310、311、312、316、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、370、373、376、378、392、396、399、402、404、416、419、421、430、434、435、437、438和/或439。
本披露提供了包含变体Fc区域的抗MICA抗体a，其中相对于野生型Fc区域，该变体Fc区域包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸取代)，使得该分子相对于包含野生型Fc区域的分子而言具有增强的效应子功能，任选地其中该变体Fc区域在以下Kabat位置的任何一个或多个处包含取代：329、298、330、332、333和/或334(例如S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A取代)。在一个实施例中，具有变体或野生型Fc区域的抗体可以具有改变的糖基化模式，所述模式增加抗体的Fc受体结合能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体完成此类糖类修饰。在本领域中已经说明了具有改变的糖基化机构的细胞，并且这些细胞可以用作宿主细胞，在这些宿主细胞中表达重组抗体从而由此产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-1以及欧洲专利号EP 1,176,195；PCT公开WO 06/133148、WO 03/035835、WO 99/54342，将其各自内容通过引用以其全文结合在此。
通常，具有改变的糖基化的此类抗体是“糖基化优化的”，使得抗体具有特定的N-多糖结构，其产生某些期望的性质，包括但不限于与以下抗体相比增强的ADCC和效应细胞受体结合活性，这些抗体是未修饰的抗体或具有天然存在的恒定区并由鼠骨髓瘤NSO和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Chu和Robinson,Current Opinion Biotechnol.[生物技术新见]2001,12:180-7)产生的抗体、如本文实例部分中或通常用于产生重组治疗性抗体的其他哺乳动物宿主细胞系产生的HEK293T表达的抗体。
在哺乳动物宿主细胞中产生的单克隆抗体包括在每个重链的Asn297处的N-连接的糖基化位点。抗体上的聚糖典型地是复杂的双触角(biatennary)结构，具有非常低的或没有平分型N-乙酰葡糖胺(平分型GlcNAc)和高水平的核心岩藻糖基化作用。聚糖末端包含非常低的或不含末端唾液酸和可变量的半乳糖。关于糖基化对抗体功能的作用的综述，参见，例如Wright&Morrison,Trend Biotechnol.[生物技术趋势]15:26-31(1997)。大量的工作显示，抗体聚糖结构的糖组成的改变可以改变Fc效应子功能。对抗体活性有贡献的重要的碳水化合物结构被认为是经由α-1,6连键附接至Fc区域N-连接的寡糖的最里面的N-乙酰葡糖胺(GlacNAc)残基上的岩藻糖残基(Shields等人，2002)。
FcγR结合需要共价地在人类IgGl、IgG2或IgG3类型的Fc区域中的保守Asn297处附接的寡糖的存在。非岩藻糖基化寡糖结构最近已经与大幅增加的体外ADCC活性相关联。“Asn 297”是指在Fc区域中位于大约位置297处的氨基酸天冬酰胺；基于抗体的小幅序列变化，Asn297还可以位于上游或下游若干氨基酸(通常不多于+3个氨基酸)处。
历史上，在CHO细胞中产生的抗体包含约2％至6％的非岩藻糖基化的种类。已经报道YB2/0(大鼠骨髓瘤)和Lecl3细胞系(CHO系的凝集素突变体，该突变体具有缺陷型GDP-甘露糖4,6-脱水酶，其导致作为α6-岩藻糖基转移酶底物的GDP-岩藻糖或GDP糖中间体的缺乏)可产生具有78％至98％非岩藻糖基化种类的抗体。在其他实例中，RNA干扰(RNAi)或敲除技术可以用来改造细胞，以便降低FUT8mRNA转录物水平或完全敲除基因表达完全，并且此类抗体已被报道为包含高达70％非岩藻糖基化的聚糖。
本披露提供了在Asn297处被糖链糖基化的与MICA结合的抗体，所述抗体显示出经由其Fc部分对FcγRIII的增加的结合亲和力。在一个实施例中，抗体将包含恒定区，该恒定区在Fc区域中包含改善抗体与FcγRIIIa和/或ADCC的结合的至少一个氨基酸改变。
在一方面，这些抗体在它们的恒定区中是低岩藻糖基化的。此类抗体可以包括一个氨基酸改变或可以不包括一个氨基酸改变，但是可以在用以产生这种低岩藻糖基化的条件下产生或处理。在一方面，抗体组合物包含本文描述的嵌合的、人类或人源化抗体，其中在该组合物中至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％或基本上全部的抗体种类具有包含缺乏岩藻糖的核心碳水化合物结构(例如复杂的、杂合的和高甘露糖的结构)的恒定区。在一个实施例中，提供了一种抗体组合物，该抗体组合物不含有包含核心碳水化合物结构(具有岩藻糖)的抗体。该核心碳水化合物将优选地是一种在Asn297处的糖链。
在一个实施例中，披露了一种抗体组合物，例如一种包含结合至MICA的抗体的组合物，是Asn297处的糖链被糖基化的，其中这些抗体是部分岩藻糖基化的。部分岩藻糖基化的抗体的特征在于，在Asn297处的糖链之内缺乏岩藻糖的抗MICA抗体在该组合物中的比例是在20％与90％之间，例如在20％与80％之间，例如在20％与50％、55％、60％、70％或75％之间，在35％与50％、55％、60％、70％或75％之间，或在45％和50％、55％、60％、70％或75％之间。可任选地，该抗体是人类IgGl或IgG3类型。
糖链显示可以进一步显示任何特征(例如复杂的、杂合的和高甘露糖的结构的存在和比例)，包括附接至来自人类细胞的抗体的Asn297上的N-连接的聚糖的特征，或在啮齿动物细胞、鼠类细胞(例如CHO细胞)或禽类细胞中重组表达的抗体的特征。
在一个实施例中，该抗体被表达于一种缺乏岩藻糖基转移酶的细胞中，使得该细胞系产生在其核心碳水化合物中缺乏岩藻糖的蛋白质。例如，细胞系Ms704、Ms705以及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1,6)岩藻糖转移酶)，使得在Ms704、Ms705、以及Ms709细胞系中表达的抗体中缺乏在它们的核心碳水化合物上的岩藻糖。这些细胞系是通过使用两个置换型载体由CHO/DG44细胞中的FUT8基因的靶向破坏而产生(参见Yamane等人的美国专利公开号20040110704；和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng[生物技术与生物工程]87:614-22，将其披露内容通过引用结合在此)。其他实例已经包括使用反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰或包含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰，以功能性地破坏FUT8基因。在一个实施例中，该抗体表达于一种具有功能破坏的FUT8基因(该FUT8基因编码一种岩藻糖基转移酶)的细胞系中，从而通过降低或清除α1,6键相关的酶使得在这种细胞系中表达的抗体展现出低岩藻糖基化。
在一个实施例中，该抗体在被工程化为表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(l,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTHI))的细胞系中表达，使得在工程化的细胞系中表达的抗体展现出增加的平分型GlcNac结构，这导致了抗体的ADCC活性的提高(Umana等人的PCT公开WO 99/54342；和Umana等人(1999)Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180，将其披露内容通过引用结合在此)。
在另一个实施例中，该抗体被表达并且该一个或多个岩藻糖基残基是使用岩藻糖苷酶进行裂解的。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶将岩藻糖残基从抗体中去除(Tarentino等人(1975)Biochem.[生物化学]14:5516-5523)。在其他实例中，产生抗体的细胞系可以用糖基化抑制剂来处理；Zhou等人Biotech.and Bioengin.[生物技术与生物工程]99:652-665(2008)描述了用α-甘露糖苷酶I抑制剂几夫碱(kifunensine)对CHO细胞进行处理导致产生了具有非岩藻糖基化的寡甘露糖型N-葡聚糖的抗体。
在一个实施例中，该抗体被表达于这样一种细胞系中，该细胞系天然具有低的用于将岩藻糖基添加至与抗体Fc区域结合的N-乙酰葡糖胺的酶活性，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。细胞系的其他实例包括一种CHO细胞系变种Led 3细胞，其具有降低的将岩藻糖附接至Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力，这也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(WO 03/035835(Presta等人)；以及Shields,RX.等人(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740，将其披露内容通过引用结合在此)。在另一个实施例中，该抗体在禽类细胞中表达，任选地在天然地产生具有低岩藻糖含量的抗体的细胞(维瓦里斯(Vivalis)，法国)中表达，例如WO 2008/142124。低岩藻糖基化的聚糖还可以是在植物来源的细胞系中产生，例如WO 07/084926A2(比洛克西(Biolex)公司)、WO 08/006554(创绿生物技术股份有限公司(GreenovationBiotech GMBH))，将其披露内容通过引用结合在此。
在一个实施例中，该抗体包含：包含氨基酸取代的Fc结构域，该氨基酸取代赋予蛋白酶切割降低的敏感性。基质金属蛋白酶(MMP)代表与肿瘤发生相关的最突出的蛋白酶家族。虽然癌细胞可以表达MMP，但是细胞外MMP的大多数由浸润肿瘤的不同类型的基质细胞提供，并且各自产生一组特定的蛋白酶和蛋白酶抑制剂，这些蛋白酶和蛋白酶抑制剂被释放到细胞外空间并且特异性地改变肿瘤周围的环境。存在于肿瘤微环境中的MMP可以切割铰链区内的抗体，并且因此可导致设计为在肿瘤部位内起作用的治疗性抗体的失活。在一个实施例中，包含氨基酸取代的Fc结构域对由任何一种、两种、三种或更多种(或全部)蛋白酶进行的切割具有降低的敏感性，这些蛋白酶选自由以下组成的组：GluV8、IdeS、白明胶酶A(MMP2)、白明胶酶B(MMP-9)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、基质溶素(MMP-3)、和巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)。在一个实施例中，对切割的降低敏感性的抗体包括在残基E233-L234和/或L235处包含氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施例中，该抗体包含在Kabat残基E233、L234、L235和G236处包含氨基酸取代的Fc结构域。在一个实施例中，该抗体包含在233-238的一个或多个残基处包含氨基酸取代的Fc结构域，例如这样使得E233-L234-L235-G236序列被P233-V234-A235代替(G236被缺失)。参见例如W0 99/58572和WO 2012087746，将其披露内容通过引用结合在此。
一旦获得抗原结合化合物，就可以评估其阻断NKG2D和MICA(例如，膜结合的MICA)之间相互作用的能力，以抑制膜结合的MICA诱导的对NK或CD8T细胞上NKG2D的下调，引起表达MICA的细胞(例如肿瘤细胞)的死亡，诱导ADCC或CDC朝向，和/或抑制表达MICA的靶细胞的增殖，和/或引起表达MICA的靶细胞的消除。
评估抗原结合化合物降低结合或阻断MICA和NKG2D之间相互作用的能力可以在该方法的任何适合阶段进行，例如，如在PCT公开号WO 2013/117647中的实例中。例如，可以使在其表面上表达MICA的肿瘤细胞与在其表面上表达NKG2D的细胞(例如，效应细胞)进行接触，添加或不添加候选抗MICA抗体。可以评估表达MICA和表达NKG2D的细胞之间的结合，并且选择不降低结合的抗体。另一种可能性涉及使分离的MICA多肽与分离的NKG2D多肽或在其表面表达NKG2D多肽的细胞进行接触，并且评估MICA与NKG2D多肽或表达NKG2D的细胞之间的结合。另一种可能性涉及使分离的NKG2D多肽与在其表面表达MICA多肽的细胞进行接触，并且评估与MICA多肽或表达MICA的细胞之间的结合。
例如，为了确定一种药剂是否阻断MICA与NKG2D的相互作用，进行以下测试：在存在或不存在浓度增加的测试抗MICA mAb的情况下，将用MICA转染的细胞系C1R或RMA与可溶性NKG2D-Fc融合蛋白一起孵育。洗涤细胞，并且然后与识别NKG2D-Fc融合蛋白的Fc部分的第二抗体一起孵育，再次洗涤，并且通过标准方法在流式细胞仪(FACScalibur，BD公司(Beckton Dickinson))上进行分析。在不存在抗MICA mAb的情况下，NKG2D-Fc蛋白与C1R或RMA细胞良好结合。在存在阻断MICA与NKG2D结合的抗MICA mAb的情况下，NKG2D-Fc与细胞的结合减少。
在一个实施例中，还可以通过评估抗MICA抗体对表达NKG2D的细胞(例如，NK或T细胞)的功能的影响来对该抗原结合化合物减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的能力进行评估。任选地，使用表达NKG2D但不表达CD16的NK或T细胞，以避免CD16介导的ADCC作用的任何贡献。如果抗MICA抗体减少或阻断MICA-NKG2D相互作用，则预期其会抑制NKG2D介导的NK或T细胞的激活。因此，不减少MICA与NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的抗体不会大幅度降低或阻断NKG2D介导的NK或T细胞的激活。这可以通过典型的细胞毒性测定(其实例在本文中描述)来评估。可以使用许多基于细胞的测定中的任何一种来评估NKG2D活性，包括基于基因表达的活性、基于细胞毒性的测定、和增殖测定。在一方面，体外测定将使用来自人类患者的NK细胞或T细胞，或者例如用编码NKG2D的转基因转染的T细胞系，只要该受体的表达以可检测方法改变这些细胞的活性，例如使它们用NKG2D配体可激活。反映NKG2D活性的任何适合的生理变化可以用于评估测试化合物或抗体的效用。例如，技术人员可以测量多种作用，如基因表达的改变、细胞因子产生、细胞生长、细胞增殖、pH、细胞内第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP)、或活性(如细胞毒性活性或激活其他T细胞的能力)。在一个实施例中，通过检测NKG2D应答基因(例如CD25、IFN-γ、或TNF-α)的表达来评估受体的活性(参见，例如，Groh等人(2003)PNAS[美国国家科学院院刊]100:9452-9457；André等人(2004)Eur.J.Immunol[欧洲免疫学杂志]34:1-11)。在一个实施例中，通过在表达MICA的细胞和抗MICA抗体的存在下孵育NKG2D+ T细胞或NK细胞，并且评估化合物或测试抗体抑制由T细胞或NK细胞释放TNF-α或IFN-γ的能力来评估NKG2D活性。
示例性细胞毒性测定也描述于本文的实例中，其中评估了NKG2D介导的对靶细胞的杀伤。这里，通过测量51Cr的靶细胞释放来确定抗MICA抗体减少或抑制原代NK细胞介导的对MICA*001或MICA*008转染的C1R的杀伤的能力。通过本领域熟知的标准方法进行体外细胞毒性测定，如例如在Coligan等人编辑，Current Protocols in Immunology[当代免疫学指南]，格林尼出版协会(Greene Publishing Assoc.)和威力出版公司(WileyInterscience)，纽约，(1992，1993)的实例中所描述的。在添加NK细胞之前将表达MICA的靶细胞用51Cr进行标记，然后估计杀伤与51Cr从细胞到培养基的释放成比例，这是杀伤的结果。
评估该抗原结合化合物诱导ADCC、CDC或以其他方式(例如，通过递送毒性剂)导致表达MICA的靶细胞的清除或活性抑制的能力可以在任何适合阶段进行。这种评估在预定用于治疗用途的抗体(或其他化合物)的修饰、生产和/或开发中所涉及的一个或多个不同步骤中可以是有用的。例如，可以评估活性，其中对抗原结合化合物进行修饰，其中表达该抗原结合化合物的细胞(例如，表达重组抗原结合化合物的宿主细胞)已经获得并且被针对其产生功能性抗体(或其他化合物)的能力进行评估，和/或其中一个量的抗原结合化合物已经产生并且被针对其活性进行评估(例如，测试多个批次的或大量的产物)。通常，将已知该抗原结合化合物会特异性地结合MICA多肽。该步骤可以涉及对多个(例如，使用高通量筛选方法非常大量的，或更少量的)抗原结合化合物进行测试。
测试CDC和ADCC可以进行，可以通过各种测定来确定，所述测定包括本文实验实例中描述的那些。测试ADCC典型地涉及评估细胞介导的细胞毒性，其中结合抗MICA抗体的表达MICA的靶细胞(例如癌细胞或其他表达MICA的细胞)由一种效应细胞(例如具有Fc受体的白细胞)识别，不涉及补体。一种不表达MICA抗原的细胞可以任选地用作对照。NK细胞细胞毒性的激活是通过测量细胞因子产生(例如IFN-γ产生)或细胞毒性标记物(例如CD107动员)的增加来评估的。任选地，与对照抗体(例如，不结合MICA的抗体，具有鼠类恒定区的MICA抗体)相比，在(表达MICA的)靶细胞的存在下，该抗体将诱导细胞因子产生、细胞毒性标记表达、或靶细胞裂解增加至少20％、50％、80％、100％、200％或500％。在另一个实例中，例如在铬释放测定中检测靶细胞的裂解，任选地该抗体将诱导至少10％、20％、30％、40％或50％的靶细胞裂解。
抗体的片段和衍生物(它们被如在本申请中使用的术语“抗体”或“多种抗体”涵盖，除非另外陈述或与上下文明显矛盾)可以通过本领域中已知的技术来产生。“片段”包括完整抗体的一部分，通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，该抗体片段是具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)。
在一方面，提供了多特异性(例如，双特异性)抗体或抗原结合蛋白，其包含本文任何实施例中的抗体的高变区(例如VH和VL)以及结合(除了MICA以外的)目的抗原的高变区(例如VH和VL)。在一方面，该目的抗原是在免疫效应细胞(例如，NK细胞或T细胞)表面表达的受体(例如，激活受体)。在一方面，提供了包含高变区的蛋白质或多肽。
还涵盖了由细胞表达的本披露的抗体或抗体片段，以及使用它们治疗癌症的方法。例如，可以构建表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。CAR通常被工程化以包含与T细胞抗原受体复合物ζ链的细胞内信号转导结构域融合的细胞外单链抗体(scFv)，并且当在效应细胞如T细胞或NK细胞中表达时具有基于单克隆抗体特异性的重新定向抗原识别的能力。在一方面，提供了基因工程免疫细胞，其在细胞表面膜上表达并承载MICA特异性嵌合免疫受体，该MICA特异性嵌合免疫受体包含细胞内信号转导结构域、跨膜结构域(TM)和MICA特异性细胞外结构域(例如，衍生自或包含抗体或抗体片段的结构域，或特异性结合MICA的单克隆抗体的可变重链和轻链区域)。在一个实施例中，VH和VL是本披露中的VH和VL。还提供了MICA特异性嵌合免疫受体、编码这些受体的DNA构建体、以及包含适当表达方向的这些构建体的质粒表达载体。
抗MICA抗体可以掺入浓度从1mg/ml至500mg/ml的药物配制品中，其中所述配制品具有从2.0至10.0的pH。该配制品可以进一步包含缓冲体系、一种或多种防腐剂、一种或多种张度剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，该药物配制品是水性溶液，即包含水的配制品。此类配制品典型地是溶液或悬浮液。在另外的实施例中，该药物配制品是水性溶液。术语“水性配制品”被定义为包含至少50％w/w水的配制品。同样地，术语“水性溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。在另一个实施例中，该药物配制品是冷冻干燥的配制品，医生或患者在使用前添加溶剂和/或稀释剂。在另一个实施例中，该药物配制品是立即可用而不需任何预先溶解的干燥配制品(例如冷冻干燥的或喷雾干燥的)。在另一方面中，该药物配制品包含此类抗体的水性溶液、和缓冲液，其中该抗体以从1mg/ml或以上的浓度存在，并且其中所述配制品具有从约2.0至约10.0的pH。在另一个实施例中，该配制品的pH是在选自以下列表的范围内，该列表由以下组成：从约2.0至约10.0、约3.0至约9.0、约4.0至约8.5、约5.0至约8.0、以及约5.5至约7.5。在另一个实施例中，所述缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、以及三(羟甲基)-氨基甲烷、二甘氨酸、曲辛、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲液中的每一种构成可替代的实施例。在进一步实施例中，该配制品进一步包括药学上可接受的防腐剂。在进一步实施例中，该配制品进一步包括等渗剂。在进一步实施例中，该配制品还包含螯合剂。在进一步实施例中，该配制品进一步包括稳定剂。在进一步实施例中，该配制品进一步包括表面活性剂。为了方便，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]，第19版，1995。在肽药物配制品中存在其他成分是可能的。这些另外的成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、膨胀剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、油性运载体、蛋白质(例如人血清蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些另外的成分不应不利地影响药物配制品的总体稳定性。
可以在以下若干个位点向需要此类治疗的患者给予包含抗体的药物组合物：例如在局部位点(例如皮肤)和粘膜位点、在避开吸收作用的位点(例如在动脉、血管、心脏给予)以及在涉及吸收的位点(例如在皮肤、皮下、肌肉或腹部给予)。可以通过以下给予途径向需要此类治疗的患者给予药物组合物：例如皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、舌、舌下、颊、口腔内、口服、胃和肠内、鼻、肺(例如通过细支气管和绒毛膜或其组合)、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼睛(例如通过结膜)、输尿管和胃肠外。
恶性肿瘤的诊断和治疗
在一方面，提供了药物组合物，其包含根据本披露的特异性结合细胞表面上的MICA多肽的抗原结合剂(例如，抗体)。在一个实施例中，任选地经由诱导CDC和/或ADCC，该抗体抑制细胞的生长或活性(例如免疫抑制活性)和/或导致MICA阳性细胞的消除。该组合物进一步包含药学上可接受的载体。
在一方面，提供了在对其有需要的人类个体中抑制MICA阳性细胞的生长或活性和/或消耗MICA阳性细胞的方法，该方法包括向所述个体给予根据本披露的组合物的步骤。此类治疗方法可用于许多障碍，包括但不限于癌症的治疗。
在一方面，提供了在对其有需要的人类个体中消除或抑制MICA阳性免疫细胞(任选地MDSC或M2巨噬细胞，任选地肿瘤浸润性免疫抑制性免疫细胞)的免疫抑制活性的方法，该方法包括向所述个体给予根据本披露的组合物的步骤。
在一方面，提供了在对其有需要的人类个体中消除和/或降低MICA阳性癌细胞的免疫抑制活性的方法，该方法包括向所述个体给予根据本披露的组合物的步骤。
在一个实施例中，相同的给予方案用于治疗其细胞表达MICA*001的个体、其细胞表达MICA*004的个体、其细胞表达MICA*007的个体以及其细胞表达MICA*008的个体。在一个实施例中，给予方案包括相同的给予方式、相同的剂量和相同的给予频率，而不考虑在个体(或个体的肿瘤)中表达的MICA的具体等位基因。
在一方面，所述治疗方法包括向个体给予治疗有效量的组合物，该组合物包含结合MICA的抗原结合化合物。治疗有效量可以是例如足以引起体内MICA细胞消耗或消耗增加、或针对表达MICA的肿瘤细胞的NKG2D+效应细胞(例如，NK细胞)的激活频率、反应频率、细胞毒性频率和/或IFNγ产生频率的增加的量。治疗有效量可以是例如足以克服或减少M2巨噬细胞介导的对NK细胞和/或T细胞活性的抑制的量。在另一个实例中，治疗有效量可以是例如足以克服或减少髓源性抑制细胞(MDSC)介导的对NK细胞和/或T细胞活性的抑制的量，或例如在肿瘤组织中足以消除髓源性抑制细胞(MDSC)和/或M2巨噬细胞的量。
有利地利用这些方法用于治疗癌症和其他增殖性疾病，包括但不限于癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌)、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌以及皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛状细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病以及早幼粒细胞白血病；间充质起源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸胎癌。可以被治疗的其他示例性障碍包括淋巴系造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞障碍，例如T-幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑样细胞类型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，任选地T细胞类型；塞扎里综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/后胸腺T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；间变性(Ki 1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T-成淋巴细胞淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
在一些实施例中，在给予抗MICA抗体或组合物之前，将评估患者细胞(例如，肿瘤细胞)上MICA的存在，例如，以确定在患者中MICA阳性细胞的相对水平和活性连同确认抗体对患者细胞的结合功效。然后可以用抗MICA抗体或组合物治疗其肿瘤细胞表达MICA的患者。这可以通过从障碍部位获得sPBL或肿瘤细胞的样品，并且例如使用免疫测定进行测试以确定MICA和任选地在细胞上的另外其他标记物的相对突出性来实现。其他方法也可用于检测MICA和其他基因的表达，例如基于RNA的方法，例如RT-PCR或RNA印迹法。任选地，可溶性MICA被用作在其表面表达MICA的肿瘤细胞的存在的标记物。在一个实施例中，从个体获得血清样品并且评估可溶性MICA的存在，其中对来自个体的血清中的可溶性MICA的检测表明该个体具有包含在其表面表达MICA(膜结合的MICA)的肿瘤细胞的肿瘤。
在一个实施例中，在试图抑制患者MICA阳性细胞的活性或生长或者消耗患者MICA阳性细胞的情况下，评估抗MICA抗体抑制患者MICA阳性细胞增殖或消耗患者MICA阳性细胞的能力。如果MICA阳性细胞被抗MICA抗体或组合物消耗，则确定患者对用抗MICA抗体或组合物的疗法有反应，并且任选地用抗MICA抗体或组合物治疗该患者。
该治疗可以涉及多轮抗MICA抗体或化合物的给予。例如，在第一轮给予后，通常将重新测量个体中表达MICA的细胞的水平和/或活性(例如，通过检测个体血清中可溶性MICA的存在和/或水平)，并且如果仍然是升高的，则可以进行另一轮给予。以此方式，可进行多轮MICA检测以及抗体或化合物给予，例如直到该障碍得到控制。
在一些实施例中，该方法可以包括向所述患者给予适当的另外的(第二)治疗剂的另外步骤，该另外的治疗剂选自免疫调节剂、激素剂、化学治疗剂、或与存在于表达MICA的细胞上的多肽结合的第二抗体(例如，耗竭性抗体)。可以将这类另外的试剂以单剂量形式与所述抗体一起、或以分开的剂量形式给予给所述患者。抗体的剂量(或抗体和另外治疗剂的总剂量)足以在患者体内可检出地诱导、促进、和/或增强治疗性应答。当分开给予时，令人希望的是在对患者产生可检测的组合治疗益处的条件下(例如，就定时、给予次数等而言)，给予该抗体、片段、或衍生物以及另外的治疗剂。
例如，对于肿瘤(例如实体瘤)治疗，本披露的抗MICA抗体组合物的给予可以与经典的方法(例如手术、放射疗法、化学疗法等)组合使用。因此，本披露提供了组合疗法，其中本发明的抗体在手术或放射治疗的同时、之前或之后使用；或者与常规的化学治疗剂、放射治疗剂或抗血管生成剂、或者定向的免疫毒素或凝血配体一起、在其之前、或之后给予给患者。
示例性抗癌抗血管生成剂通过受体酪氨酸激酶抑制信号转导，所述受体酪氨酸激酶包括但不限于FGFR(成纤维细胞生长因子受体，FGF-1,2)、PDGFR(血小板衍生生长因子受体)、血管生成素受体(Ang-1,2)、HGFR(肝细胞生长因子受体)、肝配蛋白受体(Eph)、VEGFR1、VEGFR-2,3、PDGFR-α、PDGFR-β、CSF-1R、MET、Flt-3、c-Kit、bcr/abl、p38α以及FGFR-1。另外的抗血管生成剂可以包括对VEGF表达和产生的各种调节剂中的一种或多种进行抑制的药剂，例如EGFR、flt-1、KDR、HER-2、COX-2或HIF-1α。另一优选类的药剂包括IMiD(免疫调节药物)，其是衍生自沙利度胺的类似物，具有广泛的作用，包括免疫和非免疫相关的作用。IMiD类的代表包括CC-5013(来那度胺，RevlimidTM)、CC-4047(ActimidTM)、和ENMD-0995。另一类抗血管生成剂包括西仑吉肽(EMD 121974，整合蛋白抑制剂)、金属蛋白酶(MPP)如marinastat(BB-251)。另一类抗血管生成剂包括法尼基化抑制剂，如洛那法尼(SarasarTM)、替吡法尼(ZarnestraTM)。其他抗血管生成剂也可以是适合的，如贝伐珠单抗(Bevacuzimab)(mAb，抑制VEGF-A，基因技术公司(Genentech))；IMC-1121B(mAb，抑制VEGFR-2，英克隆系统公司(ImClone Systems))；CDP-791(聚乙二醇化DiFab，VEGFR-2，细胞技术公司(Celltech))；2C3(mAb，VEGF-A，佩莱格林制药公司(PeregrinePharmaceuticals))；VEGF-trap(可溶性杂合受体VEGF-A，PlGF(胎盘生长因子)，安万特/再生元公司(Aventis/Regeneron))。另一类优选的药剂包括酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类，包括例如PTK-787(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，瓦他拉尼(Vatalanib)，诺华公司(Novartis))；AEE788(TKI，VEGFR-2和EGFR，诺华公司)；ZD6474(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，EGFR，凡德他尼(Zactima)，阿斯利康公司(AstraZeneca))；AZD2171(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，阿斯利康公司)；SU11248(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，PDGFR，舒尼替尼(Sunitinib)，辉瑞公司(Pfizer))；AG13925(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，辉瑞公司)；AG013736(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，辉瑞公司)；CEP-7055(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，瑟法隆公司(Cephalon))；CP-547,632(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，辉瑞公司)；GW786024(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))；GW786034(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))；索拉非尼(TKI，Bay 43-9006，VEGFR-1，VEGFR-2，PDGFR拜耳/奥尼克斯公司(Bayer/Onyx))；SU4312(TKI，VEGFR，PDGFR，辉瑞公司)，AMG706(TKI，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，安进公司(Amgen))，XL647(TKI，EGFR，HER2，VEGFR，ErbB4，伊克力西斯公司(Exelixis))，XL999(TKI，FGFR，VEGFR，PDGFR，Flt-3，伊克力西斯公司)，PKC412(TKI，KIT，PDGFR，PKC，FLT3，VEGFR-2，诺华公司)，AEE788(TKI，EGFR，HER2，VEGFR，诺华公司)，OSI-930(TKI，c-kit，VEGFR，OSI制药公司(OSI Pharmaceuticals))，OSI-817(TKI，c-kit，VEGFR，OSI制药公司)，DMPQ(TKI，ERGF，PDGFR，erbB2，p56，pkA，pkC)，MLN518(TKI，FLT3，PDGFR，c-KIT，CT53518，千禧制药公司(Millennium Pharmaceuticals))，来他替尼(lestaurinib)(TKI，FLT3，CEP-701，瑟法隆公司)，ZD1839(TKI，EGFR，吉非替尼，易瑞沙，阿斯利康公司)，OSI-774(TKI，EGFR，埃罗替尼(Erlotininb)，特罗凯(Tarceva)，OSI制药公司)，拉帕替尼(TKI，ErbB-2，EGFR，GD-2016，Tykerb，葛兰素史克公司)。抑制一种或多种受体酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂的实例选自由VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-α、β、Flt-3、c-Kit、p38α、MET、c-RAF、b-RAF、bcr/abl和FGFR-1组成的组。
在一个实施例中，第二药剂是效应细胞(例如，NK细胞)激活受体的天然配体或结合并激活除NKG2D之外的NK细胞激活受体的抗体。在一个实施例中，所述药剂是增加靶细胞(例如，感染的细胞、肿瘤细胞、促炎细胞)的表面上除NKG2D之外的NK细胞激活受体的天然配体的存在的药剂。NK细胞激活受体包括例如天然细胞毒性受体(如NKp30、NKp46、NKp44)或激活KIR受体(KIR2DS受体、KIR2DS2、KIR2DS4)。如本文所用的，术语“激活NK受体”是指NK细胞表面上的任何分子，当被刺激时，这些分子导致本领域已知的与NK活性相关的任何特性或活性可测量增加，如细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)产生，细胞内游离钙水平增加，在如例如在本说明书其他地方所述的重导向杀伤测定中靶向细胞的能力，或刺激NK细胞增殖的能力。术语“激活NK受体”包括但不限于KIR蛋白(例如KIR2DS蛋白)、NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D、IL-2R、IL-12R、IL-15R、IL-18R和IL-21R的激活形式。
在一个实施例中，抗癌剂是化学治疗剂或辐射，其上调肿瘤细胞表面上NKG2D配体的表达。这包括熟知的化学疗法，所述化学疗法包括电离和UV辐射、DNA复制抑制剂、DNA聚合酶抑制剂、染色质修饰处理、连同细胞凋亡诱导剂(如HDAC抑制剂曲古抑菌素A和丙戊酸)。优选的疗法是那些激活DNA损伤应答途径的疗法，例如那些激活ATM(共济失调性毛细血管扩张突变的)或ATR(ATM相关的和Rad3相关的)蛋白激酶或CHK1、或仍更进一步的CHK2或p53的疗法。后者的实例包括电离辐射、DNA复制抑制剂、DNA聚合酶抑制剂和染色质修饰剂或包括HDAC抑制剂的处理。在Gasser等人(2005)Nature[自然]436(7054):1186-90中进一步描述了上调NKG2D配体的组合物。NKG2D是一种激活受体，其与MHC I类相关的MICA和MICB糖蛋白以及其他配体相互作用。MICA和MICB(Bauer等人(1999)Science[科学]285:727-729，将其披露内容通过引用结合在此)在抗原呈递中没有作用，通常仅在肠上皮中发现，并且可以通过病毒和细菌感染、恶性转化和增殖在许可型细胞中应激诱导。NKG2D是一种C型凝集素样激活受体，其通过与CD28类似的相关DAP10衔接蛋白发出信号。它在大多数天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、γδT细胞、CD8T细胞、以及T细胞上表达，但通常不在CD4T细胞上表达。其他NKG2D配体包括ULBP蛋白(例如ULBP-1、-2、-3、-4、-5和-6)，其最初被鉴定为人巨细胞病毒糖蛋白UL16的配体(Cosman等人，(2001)Immunity[免疫力]14:123-133，以及Raulet等人，(2013)Ann Review Immunology[免疫学年度评论]31:413-41，将其披露内容通过引用结合在此)。
另外的抗癌剂包括烷基化剂、细胞毒性抗生素，如拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、植物衍生物、RNA/DNA抗代谢物、和抗有丝分裂剂。优选的实例可以包括例如顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴胼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、紫杉酚、吉西他滨、诺维本、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨喋呤、或前述物质的任何类似物或衍生物。
在治疗方法中，本披露的抗MICA抗体和该第二治疗剂可以分开、一起或顺序地给予，或以混合剂给予。在一些实施例中，在给予第二治疗剂之前给予该抗MICA抗体。例如，该抗MICA抗体可以是在给予该第二治疗剂之前大约0至30天给予。在一些实施例中，在给予该第二治疗剂之前从约30分钟至约2周、从约30分钟至约1周、从约1小时至约2小时、从约2小时至约4小时、从约4小时至约6小时、从约6小时至约8小时、从约8小时至1天、或从约1至5天给予抗MICA抗体。在一些实施例中，抗MICA抗体与给予所述治疗剂同时给予。在一些实施例中，在给予该第二治疗剂之后给予抗MICA抗体。例如，可以在给予该第二治疗剂之后大约0至30天给予抗MICA抗体。在一些实施例中，在给予该第二治疗剂之后从约30分钟至约2周、从约30分钟至约1周、从约1小时至约2小时、从约2小时至约4小时、从约4小时至约6小时、从约6小时至约8小时、从约8小时至1天、或从约1至5天给予抗MICA抗体。
本披露的抗MICA抗体可以包括在试剂盒中。这些试剂盒可以任选地进一步包含任何数量的抗体和/或其他化合物，例如1、2、3、4、或任何其他数量的抗MICA抗体和/或其他化合物。应当理解的是，这些试剂盒的内容物的描述不以任何形式进行限制。例如，所述试剂盒可以包含其他类型的治疗剂或诊断剂。这些试剂盒还可以包括使用这些抗体和/或试剂的说明书，例如本文所述方法的详细说明。
实例
实例1：生产经修饰的抗MICA抗体
将具有以下所示的VH和Vk可变区的抗体作为具有如本文所述的人框架和鼠KabatCDR的人IgG1抗体而产生。简言之，将每种抗体的VH和Vk序列分别克隆到包含huIgG1衍生的恒定结构域和huCk恒定结构域的载体中。将两种获得的载体共转染到CHO细胞系中。将建立的细胞池用于在CHO培养基中产生抗体。然后使用蛋白质A纯化该抗体。
叠加基于不同人VH基因区段的3D模型，并逐一仔细检查所有氨基酸差异。
为了研究可能影响轻链的CDR1的定位的盐桥的引入是否反过来影响与MICA的结合，在三肽DFT→DYT内将轻链中的残基F71(Abm编号)用酪氨酸(Y)取代(F71Y取代)。在CDR_L1环正下方的残基71处用Y取代F可能与CDR残基形成H-键。
另外，在另一个变体轻链中，进行双取代(S70D/F71Y取代)以用S70代替D70(Abnum编号)，但没有取代T72；因此，在Abnum残基70-72处所得的三肽从SYT变为DFT。最后，在引入了单个F71Y取代的轻链的变体中进行残基83(Abm编号)处的取代。V83基团暴露在VL/CK界面，而F83基团掩蔽在VL结构域疏水腔内部。
在重链中，构建了四个变体链，其均在Abnum残基30(S30T取代，框架1)和Abnum残基71(V71R取代，框架3)处具有取代，其中将鼠抗体中存在的残基取代为人序列中的残基。残基30是可能面对抗原的CDR侧翼残基。残基71占据CDR_H2环顶部正下方的关键位置，并且与CDR_H2残基形成h键。
在这些变体链中的三个(链2、3和4)中，在框架2中的Abnum残基48处引入另外的取代。异亮氨酸被甲硫氨酸取代(I48M取代)。M48是位于CDR_H2正下方的韦尼耶(Vernier)区残基。虽然它不与鼠抗体中的相邻残基形成任何h键，但韦尼耶区残基可能对CDR定位至关重要。
另外，在两个变体重链(链3和4)中，在Abnum残基72c处进行另外的框架3取代(K72cE取代)。K72c在鼠框架中与Q74形成H键。E72c和K72c采用发散构象，主要是因为K72c和Q74之间形成了h键。因此在残基72-74处去除可能的盐桥。
最后，在一个变体重链(链4)中，在Abnum残基67处进行另一个框架3取代(V67I取代)。I67是位于CDR_H2下方的韦尼耶区残基。
在轻链中，Abnum残基70、71和83分别对应于序列表中的位置71、72和84处的残基(例如，SEQ ID NO 7或9)。在重链中，Abnum残基30、48、67、71、72c和74分别对应于序列表中位置30、49、68、72、76和78处的残基(例如，SEQ ID NO:6或8)。
各重链和轻链可变区的氨基酸序列示于下表2中。
表2
实例2：与MICA等位基因结合
测试实例1的表2中的抗体与用RSV.5neo载体(GenBank(NCBI)，登录号M83237)转染的表达MICA的C1R转染子细胞(称为C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007和C1R-MICA*008)(ATCC参考CRL-1993TM)的结合，如Salih等人(2003)Blood[血液]102(4):1389-91396中所述。通过流式细胞术对结合进行分析。
流式细胞术.收获细胞并在PBS 1X/BSA 0.2％/EDTA 2mM缓冲液中在4℃下使用剂量范围的抗MICA mAb染色30分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，将细胞在4℃用小鼠抗人IgG1-PE单克隆抗体(1/11)染色30min。两次洗涤后，染色物被采集在BD FACS Canto II上，并且使用FlowJo软件分析。
结果.表3中的每种抗体显示出跨所有MICA等位基因的高亲和力结合。然而，出人意料地，mAb1和mAb2对MICA等位基因*01、*04和*07的结合亲和力显示出特别强的改善。与具有鼠亲本VH和VL并且与mAb1-12和其他人框架抗体共享相同的人恒定区的亲本抗体相比，对MICA*01的亲和力提高了2倍以上(对mAb1为2.4倍以及对mAb2为约3倍)。与亲本嵌合抗体相比，mAb3也显示出改善的结合亲和力，尽管程度小于mAb1和mAb2。结果示于下表3中。
mAb1、mAb2和mAb3均共享重链，其中赖氨酸(K)存在于位置72c处(Abnum)。在该位置的赖氨酸可以在残基72c和74之间引入盐桥。在VH中的残基72c处具有谷氨酸(E)的各种其他mAb中使用的其他重链中未引入盐桥。mAb1、mAb2和mAb3的重链在位置48处进一步具有异亮氨酸。mAb1和mAb2利用轻链，其中酪氨酸(Y)代替CDRL1环正下方的残基71(Abm编号)处的苯丙氨酸，从而与CDR残基形成可能的盐桥(H键)，从而可能改变CDR的定位。mAb3与mAb1和mAb2的不同之处在于苯丙氨酸(F)存在于mAb1和mAb2中VL中的位置83处，而mAb3在轻链中的位置83处(Abnum编号)具有缬氨酸(V)。
表3：
所示抗MICA抗体在C1R转染子细胞上的EC50，以μg/ml计
实例3-抗体能够经由ADCC杀伤表达MICA的靶标
测试mAb介导针对用MICA*008(C1R-MICA*008)或MICA*001(C1R-MICA*001)转染的C1R肿瘤细胞的ADCC的能力。
简言之，在来自(葛莱娜公司(Greiner))的96孔板V中，在经典的4小时51Cr释放测定中，评估用人CD16(F同种型)转染的人NK细胞系KHYG-1的溶细胞活性。简言之，用51Cr(100μCi(3.7Mbq)/1x 106个细胞)标记C1R-MICA*008细胞，然后在指定浓度的抗体存在下，与效应物/靶标比率等于10的hCD16F(结合人IgG1)转染的KHYG进行混合。在37℃下进行短暂离心和4小时的孵育后，取出50μl的上清液，并且用TopCount NXTβ检测器(珀金埃尔默生命科学公司(PerkinElmer Life Sciences)，波士顿，马萨诸塞州)测量51Cr释放。所有实验组一式三份地进行分析，并且如下测定特异性裂解的百分比：100x(平均cpm实验释放-平均cpm自发释放)/(平均cpm总释放-平均cpm自发释放)。通过用2％Triton X100(西格玛公司)裂解靶细胞获得的总释放百分比。
对于mAb1的结果显示于图1中。与阴性对照(人IgG1同种型对照抗体)相比，mAb1和嵌合亲本抗体各自诱导人KHYG-1hCD16F NK细胞系对C1R-MICA*008和*001细胞的特异性裂解，因此显示这些抗体诱导针对表达MICA*008和*001的靶细胞的ADCC。靶细胞裂解的程度与抗体结合细胞有关(图1)；相比嵌合亲本抗体，mAb1诱导*001细胞的稍微更特异性裂解。
实例4-抗MICA抗体克服M2巨噬细胞介导的NK细胞活性抑制
将NK细胞与自体体外单核细胞衍生的M1或M2巨噬细胞一起孵育24小时。然后，将包含非贴壁NK细胞的培养上清液与用MICA*001(LCL-721.221-MICA*001细胞)转染的LCL-721.221细胞(EBV转染的B细胞系)一起再孵育24小时。通过流式细胞术测量NK上的激活标记物CD137。以10μg/mL使用抗MICA抗体mAb1或同种型对照(IC)。
结果显示于图2中。平均值+/-SD，n＝4-7个单独的健康供体。抗MICA mAb1引起针对721.221-MICA*001肿瘤细胞(包括在存在或不存在M1或M2巨噬细胞情况下的肿瘤细胞)的NK细胞激活的强烈增加。在mAb1存在下，肿瘤细胞和NK细胞与M2巨噬细胞的孵育不会导致NK细胞激活的显著降低。相反，在同种型对照中，不仅NK激活通常远低于此，而且肿瘤细胞和NK细胞与M2巨噬细胞一起孵育导致NK激活的强烈降低。
实例5-抗MICA抗体在鼠Raji肿瘤模型中的体内功效
第1部分：静脉给予，单次给予
将NOD-SCID小鼠用MICA*001转染的Raji人伯基特淋巴瘤细胞(Raji-MICA*001细胞)进行静脉内(i.v.)移植，并且同一天单次注射1μg、10μg、50μg或100μg的抗MICA mAb1或指定剂量的同种型对照(IC)(μg/小鼠，静脉注射)进行处理。
结果显示于图3中。当接受同种型对照或1μg抗MICA抗体mAb1的小鼠几乎在注射后100天不存活时，在接受至少10μg抗MICA抗体的小鼠中观察到显著改善的存活。在100μg剂量下，抗MICA抗体mAb1在100天的所有小鼠中实现存活。对数秩(Mantel-Cox)测试，10μg p＝0.0303，50μg p＝0.0081，100μg p＝0.0024。
第2部分：皮下重复给予
用Raji-MICA*001细胞对NOD-SCID小鼠(n＝12只/组)进行皮下移植。在第10天将小鼠随机化(肿瘤体积约120mm3)，并且然后用抗MICA抗体或同种型对照(IC)(250μg/小鼠，静脉注射，每周两次，持续3周)进行处理。
结果显示于图4中。左侧图显示接受同种型对照的小鼠，并且右侧图显示接受抗MICA抗体mAb1的小鼠。显示了个体的肿瘤体积。CR＝完全响应。用抗MICA抗体mAb1治疗引起肿瘤体积减小。此外，用mAb1治疗的小鼠中有17％经历完全应答，与之相比，接受同种型对照的小鼠中的8％经历完全应答。
实例6-抗MICA抗体在鼠A549肿瘤模型中的体内功效
将NOD-SCID小鼠(n＝7只/组)腹膜内(i.p.)注射A549细胞(人肺癌；ATCCRef.CCL-185)并且单次注射抗MICA抗体mAb11或同种型对照(IC)(10μg/小鼠，静脉注射)进行处理。处理后24小时评估腹膜腔灌洗液(PCL)中的A549细胞数。
结果显示于图5中。与用同种型对照处理的小鼠相比，用抗MICA抗体mAb1处理的小鼠表现出降低的肿瘤细胞计数。表示了个体小鼠和中位数。曼-惠特尼比较，p＝0.0023。
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序列表
<110> 依奈特制药公司（Innate Pharma）
<120> 抗MICA抗体
<130> MICA2
<150> US62/308,443
<151> 2016-03-15
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly
1 5 10 15
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合智人-小家鼠
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr Ile Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合智人-小家鼠
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Val Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合智人-小家鼠
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr Ile Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合智人-小家鼠
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Val Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合智人-小家鼠
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr Ile Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Phe Val Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ile Tyr Phe His
1 5 10
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
Arg Thr Ser Asn Leu Ala
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 35
Gln Gln Gly Thr Thr Ile Pro Phe Thr
1 5
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<211> 383
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Met Gly Leu Gly Arg Val Leu Leu Phe Leu Ala Val Ala Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Met Val Leu Ser Gln Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu
35 40 45
Gly His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Arg
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Ala Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Thr Glu Thr Glu Asp Leu Thr Glu Asn Gly Gln Asp Leu
85 90 95
Arg Arg Thr Leu Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Ser Ser Thr Arg
115 120 125
Gly Ser Arg His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Gln Glu Ser Thr Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Thr Asn Phe Trp Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr Arg Ala Met Gln Ala Asp Cys Leu Gln Lys Leu Gln
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Ala Ile Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Cys Ser Glu Val Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg Asn Ile Thr Leu Thr Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asn Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Arg Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Gly Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Ala Leu Val Leu Gln
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Ser Gln Arg Thr Asp Phe Pro Tyr Val Ser Ala Ala Met Pro Cys Phe
305 310 315 320
Val Ile Ile Ile Ile Leu Cys Val Pro Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser
325 330 335
Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His
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Pro Val Gly Thr Gly Asp His Arg Asp Ala Ala Gln Leu Gly Phe Gln
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Pro Leu Met Ser Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
370 375 380
<210> 37
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
115 120 125
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215

Claims (33)

1.一种结合人MICA多肽的单克隆抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含：
(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
或
(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
2.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
3.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
4.一种结合人MICA多肽的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含：包含与SEQID NO:6的氨基酸序列至少90％、95％或98％相同的氨基酸序列的重链可变区(VH)，以及包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少90％、95％或98％相同的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其中VH在位置72c处包含赖氨酸(K)残基并且在位置74处包含谷氨酰胺(Q)残基，并且VL在位置71处包含酪氨酸(Y)，其中根据Abnum编号进行残基的编号。
5.如权利要求4所述的组合物，其中VL在Abnum位置83处包含苯丙氨酸(F)。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其中VH包含在Abnum位置30处的苏氨酸(T)、在位置67处的缬氨酸(V)和在位置71处的精氨酸(R)。
7.如权利要求4-6所述的组合物，其中VH在Abnum位置48处包含异亮氨酸(I)。
8.如权利要求4-6所述的组合物，其中VH在Abnum位置48处包含甲硫氨酸(M)。
9.如权利要求4-8中任一项所述的组合物，其中VH人受体框架来自IGHV4-b，并且J-区段来自IGHJ6。
10.如权利要求4-9中任一项所述的组合物，其中VL结构域人受体框架来自IGKV3-11，并且J-区段来自IGKJ2。
11.如权利要求4-10中任一项所述的组合物，其中该抗体包含：CDR-H1，其包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；CDR-H3，其包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列；CDR-L1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列；以及CDR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
12.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗体与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合，与包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合，与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合，以及与包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合。
13.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术所确定的，对结合使在其表面表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，对结合使在其表面表达包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，对结合使在其表面表达包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，以及对结合使在其表面表达包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，该抗体被表征为不超过1μg/ml或任选地不超过0.2μg/ml的EC50。
14.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗体进一步结合包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的细胞表面MICB多肽。
15.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗体阻断膜结合的人MICA与NKG2D的相互作用。
16.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中VH与人重链恒定区融合，并且VL与人轻链恒定区融合。
17.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗体包含结合人FcγIIIA受体的人重链恒定区。
18.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中如通过表面等离子体共振所确定的，对于与MICA多肽进行二价结合，所述抗体具有小于10-9M的Kd。
19.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗体是抗体片段，所述抗体片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包含来自不同抗体的片段的多特异性抗体。
20.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗体与毒性剂缀合或共价结合。
21.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗体与可检测部分缀合或共价结合。
22.一种药物组合物，该药物组合物包含根据以上权利要求中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
23.一种试剂盒，该试剂盒包含如以上权利要求中任一项所述的抗体，该试剂盒任选地进一步包含经标记的第二抗体，该第二抗体特异性地识别如以上权利要求中任一项所述的抗体。
24.一种产生如权利要求1至19所述的抗体的重组体宿主细胞。
25.如权利要求1-21所述的抗体或如权利要求22所述的组合物，用于治疗或预防在对其有需要的个体中的疾病。
26.一种用于鉴定表达MICA的细胞的体外方法，该方法包括从个体获得生物样品，使所述样品与如权利要求1-21所述的抗体进行接触，并且评估该抗体是否与样品中的MICA和/或MICB多肽结合。
27.一种用于鉴定表达MICA的疾病相关细胞的体外方法，该方法包括从包含疾病相关细胞的个体获得生物样品，使所述疾病相关细胞与如权利要求1-21所述的抗体进行接触，并且评估该抗体是否结合疾病相关细胞，其中该抗体结合疾病相关细胞这一发现表明该个体患有疾病、该个体携带疾病相关细胞和/或所述疾病相关细胞表达MICA。
28.一种用于选择患有响应于用如权利要求1-21所述的抗体治疗的疾病的个体的体外方法，该方法包括确定所述个体中的肿瘤细胞和/或免疫抑制性巨噬细胞或骨髓细胞是否表达MICA多肽，任选地所述细胞是否表达升高水平的MICA多肽，其中MICA多肽的表达或升高水平的MICA多肽指示应答个体。
29.如权利要求1-21所述的抗体或如权利要求22所述的组合物，用于治疗或预防个体中的癌症，该个体被发现具有MICA多肽或根据方法权利要求26-28中任一项所述的表达MICA的细胞。
30.如权利要求25-29所述的组合物或方法，其中所述疾病是一种癌症。
31.如权利要求25-30所述的组合物或方法，其中所述个体具有携带MICA等位基因的细胞，所述MICA等位基因选自由MICA*001、MICA*004、MICA*007和MICA*008组成的组。
32.如权利要求25-32所述的组合物或方法，其中相同的给予方案用于治疗其细胞表达MICA*001的患者、其细胞表达MICA*004的患者、其细胞表达MICA*007的患者以及其细胞表达MICA*008的患者。
33.如权利要求25-30所述的组合物或方法，其中所述方法在治疗之前不含确定个体中表达的具体MICA等位基因的身份的步骤。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903402A (zh) * 2019-11-27 2020-03-24 中国药科大学 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
CN112574311A (zh) * 2020-12-14 2021-03-30 广州康盛生物科技股份有限公司 双mic结合活性的抗体及其应用
CN114369161A (zh) * 2021-12-28 2022-04-19 合肥天港免疫药物有限公司 Mica抗体及其应用
CN114657123A (zh) * 2022-03-09 2022-06-24 重庆医科大学附属儿童医院 白血病特异性树突状细胞来源的过表达rae-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6405242B2 (ja) 2012-02-07 2018-10-17 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． Ｍｉｃａ結合剤
CA2990520C (en) 2015-07-24 2023-06-27 Innate Pharma Methods for detecting tissue infiltrating nk cells
EP3532091A2 (en) * 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
WO2018141959A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
CL2017003503A1 (es) * 2017-12-29 2018-06-01 Univ Chile Anticuerpo humano y fragmentos de este, para ser utilizados en el tratamiento del cáncer gástrico (cg) y eventualmente otro tipo de tumores que expresen la proteína mica (del inglés “mhc class i chain-related gene a).
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
MX2021001254A (es) * 2018-07-31 2021-05-12 Cullinan Mica Corp Anticuerpos anti-mica/b que bloquean la liberación de mica/b y métodos de uso.
WO2020035345A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Innate Pharma Treatment of colorectal cancer by a combination of an anti-mica antibody and an anti-nkg2a antibody
AU2019408408A1 (en) 2018-12-21 2021-06-03 Valerio Therapeutics New conjugated nucleic acid molecules and their uses
TW202214857A (zh) 2020-06-19 2022-04-16 法商昂席歐公司 新型結合核酸分子及其用途
IL313439A (en) 2021-12-16 2024-08-01 Valerio Therapeutics New conjugated nucleic acid molecules and their uses

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013117647A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Innate Pharma Mica binding agents
CN103958543A (zh) * 2011-09-30 2014-07-30 达纳-法伯癌症研究所股份有限公司 治疗肽
US20140322244A1 (en) * 2011-05-31 2014-10-30 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Mic-binding antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR20060067983A (ko) 1999-01-15 2006-06-20 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
US20050260213A1 (en) 2004-04-16 2005-11-24 Scott Koenig Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of use thereof
WO2004103269A2 (en) 2002-10-18 2004-12-02 Macrogenics, Inc. Methods and compositions for vaccination comprising nucleic acid and/or polypeptide sequences of the genus borrelia
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
WO2005110474A2 (en) 2004-05-10 2005-11-24 Macrogenics, Inc. HUMANIZED FcϜRIIB SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2007024249A2 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
WO2006133148A2 (en) 2005-06-03 2006-12-14 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with modified fucosylation level
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
FR2894982A1 (fr) 2005-12-16 2007-06-22 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation d'anticorps selectifs des recepteurs fc activateurs
US8716557B2 (en) 2006-01-17 2014-05-06 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for inhibition of fucosyltransferase and xylosyltransferase expression in plants
CA2644903A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
EP2021029B1 (en) 2006-05-26 2014-06-11 MacroGenics, Inc. Humanized fc gamma riib-specific antibodies and methods of use thereof
WO2008002933A2 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Macrogenics, Inc. Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
GEP201706660B (en) 2010-03-04 2017-04-25 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
HUE033205T2 (en) 2010-12-23 2017-11-28 Janssen Biotech Inc Active, protease-resistant antibody-FC mutant

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140322244A1 (en) * 2011-05-31 2014-10-30 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Mic-binding antibodies and methods of use thereof
CN103958543A (zh) * 2011-09-30 2014-07-30 达纳-法伯癌症研究所股份有限公司 治疗肽
WO2013117647A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Innate Pharma Mica binding agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T. NOELLE LOMBANA ET AL: "Optimizing antibody expression by using the naturally occurring framework diversity in a live bacterial antibody display system", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903402A (zh) * 2019-11-27 2020-03-24 中国药科大学 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
CN110903402B (zh) * 2019-11-27 2023-02-28 中国药科大学 一种双特异性融合蛋白及其构建方法与应用
CN112574311A (zh) * 2020-12-14 2021-03-30 广州康盛生物科技股份有限公司 双mic结合活性的抗体及其应用
CN112574311B (zh) * 2020-12-14 2022-03-25 广州康盛生物科技股份有限公司 双mic结合活性的抗体及其应用
CN114369161A (zh) * 2021-12-28 2022-04-19 合肥天港免疫药物有限公司 Mica抗体及其应用
CN114657123A (zh) * 2022-03-09 2022-06-24 重庆医科大学附属儿童医院 白血病特异性树突状细胞来源的过表达rae-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法

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