KR102584011B1 - 암 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가용성 인간 CD39의 효소 활성을 억제하는 항원-결합 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 생성하는 세포; 이러한 화합물, 및 항체, 이의 단편, 변이체 및 유도체를 제조하는 방법; 이를 포함하는 약학 조성물; 질환, 예를 들어 암을 진단, 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2017년 3월 16일 출원된 미국 가출원 번호 US 62/471,994 및 2017년 11월 15일 출원된 미국 가출원 번호 US 62/586,220의 우선권을 주장하고, 이들 둘 모두는 임의의 도면을 포함하여 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
서열목록 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 53 KB의 크기로 2018년 3월 15일 생성된 파일 명칭 "CD39-6_ST25"로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형식 정보는 이의 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 가용성 인간 CD39의 효소 활성을 억제하는 항원-결합 화합물 (예를 들어, 항체)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 생성하는 세포; 이러한 화합물, 및 항체, 이의 단편, 변이체, 및 유도체를 제조하는 방법; 이를 포함하는 약학 조성물; 질환, 예를 들어 암을 진단, 치료 또는 예방하기 위해 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
8종의 상이한 ENTPD 유전자가 NTPDase 단백질 패밀리의 구성원을 코딩한다. 개별 NTPDase 서브타입은 세포내 위치 및 기능적 특성이 상이하다. 원형질막-결합된 뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포히드롤라제는 뉴클레오티드의 c 및 b 포스페이트를 가수분해하여 세포 표면에서 뉴클레오티드 수준을 제어한다.
CD39/ENTPD1 또는 혈관 CD39라고도 알려진 NTPDase 1 (엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포히드롤라제1)은 다른 효소, CD73 (엑토-5'-뉴클레오티다제)와 함께 기능하여, 세포외 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 및 아데노신 디포스페이트 (ADP)를 가수분해시켜 아데노신을 생성시키고, 이것은 아데노신 수용체에 결합하여 T-세포 및 자연 살해 (NK)-세포 반응을 억제시켜서, 면역계가 억제된다. CD73/CD39 경로를 통한 아데노신의 생성은 조절성 T 세포 (Treg) 면역억제 기능의 주요 기전으로서 인식된다. CD39+ Treg의 수는 일부 인간 암에서 증가되고, 종양 성장 및 전이를 촉진하는데 있어서 CD39+ Treg의 중요성이 몇몇 생체내 모델을 사용하여 입증되었다. 그러나, CD39는 또한 종양 세포에 의해 발현되고 CD39+ 종양 세포는 아데노신 경로를 통해 면역억제를 매개할 수 있다. 암 세포에서 CD39는 ATPase 활성을 보이고, CD73과 함께 아데노신을 생성시킨다. CD73+CD39+ 암 세포는 CD4 및 CD8 T 세포의 증식 및 세포독성 이펙터 CD8 T 세포 (CTL)의 생성을 CD39- 및 아데노신-의존적 방식으로 억제하였다. CD39는 몇몇 고형 종양 (직결장암, 두경부암, 췌장암)을 비롯하여 만성 림프구성 백혈병에서 증가되는 것으로 보고되었다. CD39-발현 세포에서 CD39에 결합하여 억제하는 항체가 WO2009/095478에 개시되어 있다. 항체 "A1" (eBiosciences, Inc.)은 염색 용도로 사용되고 세포에서 CD39 활성을 중화시키는 능력은 보이지 않는다. 문헌 [Hayes et al. (2015) Am. J. Transl. Res. 7(6):1181-1188]은 FcγR에 결합하고 이펙터 기능을 갖지만 역시 차단시키는 것으로 명시된 항-CD39를 사용한다. CD39를 실제로 차단하지 않거나 또는 순수한 차단제가 아닌 항체의 사용과 조합된, 백혈구 및 종양 세포를 포함한 상이한 세포 유형 상에서 CD39 발현은 항체의 기초 활성의 평가에 대해 복잡한 상황을 생성시킨다. 지금까지, 유일하게 보고된 CD39 활성 부위의 억제제는 ARL67156으로 예시되는 소형 분자 비가수분해성 ATP 유사체가 남아있는데, 활성 부위의 직접 억제가 필요하다는 것을 시사한다. 그러나, ARL67156은 CD39에 특이적이지 않고 다른 NTPDases 예컨대 NTPDase1, NTPDase3, NPP1 또는 마우스 NTPDase8을 역시 억제하며, 뿐만 아니라 약한 경쟁적 억제제로서만 억제한다 (Levesque et al. (2007) Br. J. Pharmacol. 152:141-150).
CD39는 N-말단부 및 C-말단부 근처에 2개의 경막 도메인, 짧은 세포질 N-말단 및 C-말단 절편, 및 활성 부위를 함유하는 거대 세포외 도메인을 갖는다. 그러나, CD39는 전형적으로 분자의 2개 말단에서 2개 경막 도메인에 의해 막에 앵커링되지만, 최근에 또한 CD39의 가용성 촉매적 활성 형태가 인간 및 마우스의 순환계에 존재할 수 있다는 것이 보고되었다 (Yegutkin et al., (2012) FASEB J. 26(9): 3875-3883). 기술된 다양한 항-CD39 항체에도 불구하고, 어떠한 항체도 가용성 세포외 CD39 단백질의 ATPase 활성을 억제할 수 있다는 것이 보고된 적이 없다.
본 발명자는 가용성 (세포외 도메인) 인간 CD39 단백질의 효소 (ATPase 활성) 활성을 억제하는 항체를 수득하였다. 이 항체는 추가적으로 종양 세포를 포함한, 세포의 표면에서 발현되는 인간 CD39 단백질 상에 존재하는 에피토프에 결합하고 세포 막 결합된 CD39 효소 (세포의 표면에서 발현되는 CD39)의 효소 (ATPase 활성) 활성을 강력하게 억제한다. 이 항체는 막-결합 및 가용성 CD39 단백질 (용액 중 세포외 도메인 단백질) 둘 모두를 중화시켜서 개체의 CD39 활성의 더 큰 중화를 획득하고, 그리하여 예를 들어 암 및/또는 감염성 질환의 치료를 위해 면역억제성을 감소시키는데 유리하게 사용될 수 있다. 다른 항-CD39 항체는 이전에 막 결합된 CD39 효소의 효소 (ATPase 활성) 활성을 억제하는 것이 기술되었지만, 이들 항체는 세포 막에 결합되지 않은 가용성 CD39 단백질은 억제하지 않는다.
따라서, 일 실시형태에서, 가용성 CD39 단백질 (sCD39)의 ATPase 활성에 결합하여 억제 또는 중화시키는, 임의로 이러한 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인 또는 단백질을 제공한다. 일 실시형태에서 sCD39 단백질은 막 결합된 CD39에 존재하는 2개 경막 도메인 (즉, N-말단부 및 C-말단부 근처 경막 도메인)이 결여되어 있다. 일 실시형태에서, sCD39는 예를 들어, 인간 개체에, 순환계에 존재하는 비-막 결합된 sCD39 단백질이다. 일 실시형태에서, sCD39는 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열 (임의로 C-말단 태그 또는 다른 비-CD39-유래 아미노산 서열을 더 포함)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 단백질, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 본 명세서 (예를 들어, 실시예, 방법 참조)에 개시된 바와 같이 세포의 부재 하에서 수행되는 방법 또는 어세이에 따라서, 용액 중 sCD39와 인큐베이션 시에 sCD39의 ATPase 활성을 억제한다. 일 실시형태에서, 단백질, 항체 또는 항체 단편은 가용성 (세포외 도메인 단백질) 및 막-결합 형태 둘 모두의 인간 CD39 단백질에 특이적으로 결합한다.
이론에 국한하고 싶지 않지만, 그러나, 일부 항체는 가용성 CD39 단백질 (sCD39)의 활성에 유사하게 영향을 미치지 않으면서, 막-결합 CD39 (memCD39)의 도메인 움직임을 억제함으로써 막-결합 CD39를 중화시킬 수 있다. memCD39는 동종-다량체로서 존재하는 한편 sCD39는 단량체이고, 더욱이 memCD39의 경막 도메인은 활성 부위와의 기능적 관련성의 기저를 이루는 동적 움직임을 겪는다는 것이 보고되었다. 결과적으로, sCD39와 달리, memCD39는 항체-매개 중화를 가능하게 만드는 세팅으로 존재할 수 있다. 한가지 가능성은 2개 memCD39 분자 (예를 들어, memCD39 동종-다량체 내)와 동시에 결합하는 2가 항체의 사용이 기능적 중화에 필요하다는 것이다.
sCD39 (및 memCD39)의 활성을 중화시키는 본 발명의 항체는 그들이 sCD39 이외에도 memCD39를 표적화하는지 여부와 무관하게, 2가 결합제로서 사용이외에도, 또한 1가 결합제로서 유효할 수 있다. 결론적으로, 일 실시형태에서, 인간 CD39 단백질 (sCD39 및/또는 memCD39)에 1가로 결합하고 이의 효소 (ATPase) 활성을 중화시키는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 단일 CD39 단백질에 결합하고/하거나 CD39 단백질에 결합할 수 있는 단일 항원 결합 도메인을 보유하는 것으로 명시될 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 CD39 단백질 (sCD39 및/또는 memCD39)에 1가로 결합하여 이의 효소 (ATPase) 활성을 중화시키는, 항체 단편, 임의로 F(ab) 단편, 단일 사슬 항체, scFv, 다중특이적 항체를 제공한다. 일 실시형태에서, 인간 CD39 단백질에 1가로 결합하는 CD39-중화 항원 결합 단백질은 다중-특이적 항원 결합 단백질, 예를 들어, 다중-특이적 항체, 이중-특이적 항체, 삼중-특이적 항체 등이다. 일 실시형태에서, 인간 CD39 단백질에 1가로 결합하는 CD39-중화 항원 결합 단백질은 CD39 (sCD39 및/또는 memCD39)에 결합하는 제1 (또는 단일) 항원 결합 도메인 및 CD39 이외의 다른 단백질에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
유리하게, 일 실시형태에서 항체는 인간 Fcγ 수용체, 예를 들어, 하나 이상 (또는 전체)의 인간 CD16, CD32a, CD32b 및 CD64에 대한 결합이 감소되거나 또는 실질적으로 결여되도록 변형된 인간 Fc 도메인을 포함한다. 일 양상에서, 항체는 그들의 CD39 억제 활성에 대해서 CD39-발현 세포의 ADCC-, CDC- 또는 독소-매개 고갈에 의존하지 않는다. 이들 항체는 면역조절 활성을 허용하는 "순수" CD39 차단제로서 사용될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 결합 분자는 이의 Fc 도메인을 통해서 이펙터 기능을 유지하고/하거나 매개하도록 생성될 수 있다. 일 실시형태에서 항체는 인간 Fcγ 수용체, 예를 들어 하나 이상 (또는 전체)의 인간 CD16, CD32a, CD32b 및 CD64에 결합하는 인간 Fc 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, Fc 도메인은 임의로 하나 이상의 인간 Fcγ 수용체(들)에 대한 결합은 보유하지만 하나 이상의 다른 인간 Fcγ 수용체(들)에 대한 결합은 감소되어서, Fcγ 수용체 결합을 감소시키도록 변형될 수 있다.
일 양상에서, 항체는 혈관 CD39에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 항체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하지만 분비된 CD39 이소폼 폴리펩티드, 예를 들어, CD39-L2 및/또는 CD39-L4 폴리펩티드에는 결합하지 않는다. 임의로, 항-CD39 항체는 혈관 CD39에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 항체는 SEQ ID NO: 1의 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하지만 막 결합된 CD39 이소폼, 예를 들어 CD39-L1 및/또는 CD39-L3 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
본 개시 내용의 항체는 세포의 표면에서 발현되는 막-결합 CD39 단백질의 효소 활성을 억제할 수 있다.
일 양상에서, 항체는 그들의 CD39 억제 활성에 대한 CD39 하향-조절에 의존하지 않는다.
본 개시 내용의 항체는 가용성 CD39를 억제하는 것 이외에도, CD39 내재화의 유도의 존재 또는 부재로, 그리고 CD16 (FcγIII 수용체)의 결합의 존재 또는 부재 및/또는 CD39-발현 세포에 대한 ADCC 및/또는 CDC의 실질적 유도 존재 또는 부재로, 세포의 표면에서 발현되는 막-결합 CD39 단백질의 효소 활성을 억제할 수 있다. 임의로, 항체는 Fc 도메인을 보유하고 인간 FcRn에 대한 결합을 보유한다.
충분한 항체가 CD39-발현 세포에 결합하여 ADCC를 유도시키는 한, ADCC 및/또는 CDC를 유도하여 기능하는 항체는 CD39의 ATPase 활성의 완전한 중화/억제가 없더라도 효율적일 수 있지만, 비고갈 항체의 중화는 ATPase의 효소 활성의 더 강력한 억제를 요구할 수 있다. 일 실시형태에서, 비고갈 항체는 임의로 또한 인간에게 항체의 투여와 상용성인 농도에서, (예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법으로 평가하여) 가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 감소를 제공할 것이다. 일 실시형태에서, 비고갈 항체는 임의로 또한 인간에게 항체의 투여와 상용성인 농도에서, 본 명세서에 개시된 방법으로 측정하여, 예를 들어 CD39+ 세포 예컨대 B 세포, Ramos 세포에 의한 AMP 발생의 감소를 통해 평가시에, CD39-발현 세포의 ATPase 활성의 적어도 70%, 80%, 90% 감소를 제공하게 될 것이다.
항체가 결합되는 CD39 상의 에피토프는 광범위한 세포, 예를 들어 암 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포, 형질감염된 세포에 의해 발현되는 CD39 폴리펩티드 상에 존재하고, 유세포측정법으로 결정시 높은 친화성으로 결합한다.
항체는 임의로, 그들 표면에 CD39 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 결합에 대해, 유세포측정법으로 결정하여, 2 μg/ml 이하, 1 μg/ml 이하, 0.5 μg/ml 이하, 0.1 μg/ml 이하 또는 0.05 μg/ml 이하의 EC50 을 특징으로 한다. 일 실시형태에서 세포는 그들 표면에서 CD39를 발현하도록 만든 세포이다. 일 실시형태에서 세포는 그들 표면에서 CD39를 내생적으로 발현하는 세포, 예를 들어 조절 T (TReg) 세포, B 세포, 암 세포, 림프종 세포 (예를 들어, Ramos 세포), 백혈병 세포, 방광암 세포, 신경교종 세포, 교아세포종 세포, 난소암 세포, 골수종 세포, 전립선암 세포, 갑상선암 세포, 식도암 세포 또는 유방암 세포이다.
일 양상에서, (a) 세포의 표면에서 발현되는 막-결합 CD39 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함)의 효소 활성을 억제할 수 있고, (b) 가용성 CD39 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함)의 효소 활성을 억제할 수 있는 항-CD39 항체를 제공한다. 일 실시형태에서, 항체는 (예를 들어, 그들 Fc 도메인을 통해서) 인간 Fcγ 수용체 (예를 들어, CD16, CD32a, CD32b, CD64) 및/또는 C1q에 실질적으로 결합하지 않고/않거나, CD39-발현 세포에 대해서 ADCC 및/또는 CDC를 실질적으로 유도하지 않는다. 임의로, 항체는 Fc 도메인을 보유하고 인간 FcRn에 대한 결합을 보유한다.
일 실시형태에서, 항체는 항-CD39 항체의 다음의 연속 투여까지, 바람직한 시간 기간, 예를 들어, 1주, 2주, 1개월 동안 sCD39 및/또는 memCD39의 효소 활성을 중화시키는데 유효한 양으로 투여된다.
일 실시형태에서, 항체는 sCD39 단백질의 ATPase 활성의 억제를 위해 적어도 EC50, EC70 또는 EC100 와 동일한 항체의 혈중 농도를 제공하는 용량 및/또는 빈도로 투여되고, 임의로 농도는 적어도 1주, 2주, 1개월 동안, 또는 항-CD39 항체의 다음 연속 투여까지 유지된다.
일 양상에서, 항체는 R138, M139 및 E142 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개 잔기)를 포함하는 CD39 상의 에피토프에 결합한다.
일 양상에서, 항-CD39 항체는 야생형 CD39 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1의 CD39 폴리펩티드)와 비교하여, R138, M139 및 E142 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 중 1, 2 또는 3개에 돌연변이를 갖는 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합 (예를 들어, 결합의 실질적으로 완전한 소실)을 나타내고; 임의로, 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이: R138A, M139A 및 E142K를 갖는다. 선택적인 일 양상에서, 항체는 돌연변이체 19 이외에 표 1의 임의의 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대한 결합 소실을 갖지 않는다. 다른 선택적 양상에서, 항-CD39 항체는 야생형 CD39 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1의 CD39 폴리펩티드)와 비교하여, Q96, N99, E143 및 R147 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기 중 1, 2, 3 또는 4개에 돌연변이를 갖는 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합 (임의로 감소되지만 결합의 실질적으로 완전한 소실은 아니거나; 또는 임의로 결합의 실질적으로 완전한 소실)을 나타내고; 임의로, 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이 Q96A, N99A, E143A 및 R147E를 갖는다.
일 양상에서, 항체는 Q96, N99, E143 및 R147 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 잔기)를 포함하는 CD39 상의 에피토프에 결합한다. 일 양상에서, 항체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 CD39 폴리펩티드 및 항체 간 결합에 비해서, 각 경우에 Q96, N99, E143 및 R147 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개 잔기에 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합 (예를 들어, 결합의 실질적으로 완전한 소실)을 갖는다.
일 양상에서, 항체는 (a) R138, M139 및 E142 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개의 잔기), 및 (b) Q96, N99, E143 및 R147로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 잔기)를 포함하는 CD39 상의 에피토프에 결합한다.
일 양상에서, 항-CD39 항체는 야생형 CD39 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1의 CD39 폴리펩티드)와 비교하여 각 경우에, (a) Q96, N99, E143 및 R147 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 잔기에 돌연변이를 갖는 CD39 폴리펩티드, 및 (b) R138, M139 및 E142 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 잔기에 돌연변이를 갖는 CD30 폴리펩티드 둘 모두에 대해 감소된 결합 (예를 들어, 실질적으로 완전한 소실)을 나타낸다. 임의로, (a)의 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이: Q96A, N99A, E143A 및 R147E를 갖는다. 임의로, (b)의 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이 R138A, M139A 및 E142K를 갖는다. 임의로 항체는 돌연변이체 5 및 19 이외에 표 1의 임의의 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대한 결합의 소실을 갖지 않는다.
일 양상에서, 항체는 K87, E100 및 D107 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 잔기)를 포함하는 CD39 상의 에피토프에 결합한다.
일 양상에서, 항-CD39 항체는 야생형 CD39 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1의 CD39 폴리펩티드)와 비교하여, K87, E100 및 D107 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 잔기에 돌연변이를 갖는 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합 (예를 들어, 결합의 실질적으로 완전한 소실)을 나타내고; 임의로, 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이: K87A, E100A 및 D107A를 갖는다. 임의로 항체는 돌연변이체 15 이외의 표 1의 임의의 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대한 결합의 소실을 갖지 않는다.
일 양상에서, 항체는 N371, L372, E375, K376 및 V377 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 잔기)를 포함하는 CD39 상의 에피토프에 결합한다.
일 양상에서, 항-CD39 항체는 야생형 CD39 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 1의 CD39 폴리펩티드)와 비교하여, N371, L372, E375, K376 및 V377 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기에 돌연변이를 갖는 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합 (예를 들어, 실질적으로 완전한 소실)을 나타내고, 임의로, 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이: N371K, L372K, E375A, K376G 및 V377S, 및 잔기 376 및 377 사이에 발린의 삽입을 갖는다. 임의로 항체는 돌연변이체 11 이외의 표 1의 임의의 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대한 결합의 소실을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, CD39 중화 항체는 정제된 형태로, 세포-무함유 어세이에서 sCD39 단백질의 ATPase 활성의 감소를 야기할 수 있고, 임의로 적어도 70%, 80% 또는 90% 만큼 sCD39에 의한 AMP 발생의 감소를 야기할 수 있고; 임의로 예를 들어 본 명세서에 개시된 어세이에서 평가하여, (음성 대조군과 비교해) 존재하는 ATP의 증가를 야기할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, sCD39 억제는 항-CD39 항체와의 인큐베이션 이후에 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 유닛을 정량하여 평가할 수 있다. 일 실시형태에서, CD39-중화 항체는 1 μg/ml 이하, 임의로 0.5 μg/ml 이하, 임의로 0.1 μg/ml 이하의 sCD39 단백질의 ATPase 활성의 억제에 대한 EC50 를 특징으로 할 수 있다.
임의로, sCD39 단백질의 ATPase 활성의 억제는 시험 항체의 용량 범위를 실시예, 방법에 기술된 가용성 재조합 인간 CD39 단백질과 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키는 세포-무함유 어세이 형식으로, Cell Titer Glo™ (Promega)를 사용하여 결정되며, 여기서는 20 μM ATP가 Cell Titer Glo™ (CTG) 시약의 첨가 전 37℃에서 추가 30분 동안 플레이트에 첨가되며, 발광 빛은 암실에서 5분 동안 인큐베이션 이후 Enspire™ 광도계를 사용하여 정량된다 (예를 들어, 실시예, 방법 참조).
임의로, CD39 중화 항체는 또한 CD39의 세포의 ATPase 활성의 감소를 야기시킬 수 있고, 임의로 적어도 70%, 80% 또는 90% 만큼 CD39-발현 세포에 의한 AMP 발생의 감소를 야기시킬 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, CD39-중화 항체는 1 μg/ml 이하, 임의로 0.5 μg/ml 이하, 임의로 0.1 μg/ml 이하의 세포에 의해 발현되는 CD39의 ATPase 활성의 억제에 대한 EC50 (예를 들어, CD39-발현 세포에 의한 AMP 발생의 억제에 대한 EC50)을 특징으로 할 수 있다.
임의로, 세포에 의해 발현되는 CD39의 ATPase 활성의 억제는 ATP의 가수분해에 의해 발생되는 AMP를 정량함으로써 Ramos 세포에서 ATPase 활성의 중화를 평가하여 결정된다 (예를 들어, 실시예, 방법 참조).
일 양상에서, CD39-발현 세포에 의한 ATPase 활성의 중화는 CD39-발현 세포 (예를 들어, ATCC, 참조번호 CRL-1596로부터 입수가능한, 본 명세서에서 사용되는 Ramos 림프종 세포)를 항체와 접촉시키고, 예를 들어 질량 분광법을 통해 AMP의 생성을 평가하여 결정되고, 여기서 발생된 AMP의 감소는 ATPase 활성의 중화를 의미한다. 임의로 항체는 이러한 어세이에서 적어도 70%, 80% 또는 90% 만큼 발생된 AMP의 감소를 야기한다. 임의로 항체는 적어도 70%, 80% 또는 90%의 B 세포에 의한 세포외 ATPase 활성의 감소를 야기한다.
일 양상에서, sCD39 및 세포 표면에 발현되는 CD39 (memCD39) 둘 모두에 존재하는 항원 결정부에 결합하는 중화성 항-CD39 항체를 제공한다.
일 양상에서 항체 I-394가 결합되는 CD39 상의 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하는 (예를 들어, CD39 폴리펩티드 상의 에피토프와의 결합에 대해 임의의 I-394의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 중화성 항-CD39 항체를 제공한다.
본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 단일클론 항체 I-394와 경쟁하는 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 I-394의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 항원-결합 화합물을 제공한다. 일 실시형태에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 개별적으로 SEQ ID NO: 6 및 7의 VH 및 VL 영역을 갖는 항체와 경쟁하는 항원-결합 화합물을 제공한다.
일 실시형태에서, 항-CD39 항체는 I-394가 결합하는 CD39 상의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다.
본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 단일클론 항체 I-395와 경쟁하는 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 I-395의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 항원-결합 화합물 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 제공한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 단일클론 항체 I-396와 경쟁하는 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 I-396의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 항원-결합 화합물을 제공한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 단일클론 항체 I-397과 경쟁하는 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 I-397의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 항원-결합 화합물을 제공한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 단일클론 항체 I-398과 경쟁하는 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 I-398의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 항원-결합 화합물을 제공한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 단일클론 항체 I-399와 경쟁하는 (예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 CD39 폴리펩티드와의 결합에 대해 I-399의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 항원-결합 화합물을 제공한다.
일 실시형태에서, 결합 분자 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)는 항체 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399에 대한 중쇄 CDR1, 2 및 3 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 및 각각 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399 항체에 대한 경쇄 CDR1, 2 및 3 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는 CDR (또는 중쇄 및/또는 경쇄 CDR의 세트)이 상기 CDR (또는 중쇄 및/또는 경쇄 CDR의 상기 세트)과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태의 일 양상에서, 항체는 항체 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399의 중쇄 가변 영역 (VH)의 3개 CDR을 포함하는 중쇄 및 각각 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)의 3개 CDR을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있고, 임의로 여기서 CDR은 카밧 (Kabat), 코티아 (Chothia) 또는 IMGT 번호매김 체계에 따라 결정된다.
일 양상에서, Fc 도메인 및 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩티드 간 결합을 감소시키기 위해 (동일한 이소타입의 야생형 Fc 도메인과 비교하여) 변형된 Fc 도메인을 포함하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는 (i) SEQ ID NO: 6의 중쇄 가변 영역의 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 7의 경쇄 가변 영역의 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 양상에서, Fc 도메인은 Fc 도메인 및 인간 C1q 폴리펩티드 간 결합을 감소시키기 위해서 (동일한 이소타입의 야생형 Fc 도메인과 비교하여) 변형된다. 일 실시형태에서, 항체는 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330 및 331 (카밧 EU 번호매김)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에서 중쇄 불변 영역 내에 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 234, 235, 237, 322, 330 및 331로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에서 중쇄 불변 영역 내에 아미노산 치환을 갖는다.
일 실시형태에서, 항체는 종양 미세환경 및/또는 순환계에서 sCD39의 활성을 중화시키기에 충분한 양 및 빈도로 암을 갖는 개체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 항체는 종양 미세환경에서 아데노신의 발생 및/또는 농도를 감소시키는데 충분한 양 및 빈도로 투여된다. 일 실시형태에서, 항체는 종양 미세환경에서 AMP 및/또는 아데노신의 발생 및/또는 농도를 감소시키는데 충분한 양 및 빈도로 투여된다. 일 실시형태에서, 항체는 종양 세포에 의해 발현되는 CD39의 활성을 중화시키는데 충분한 양 및 빈도로 투여된다. 일 실시형태에서, 항체는 백혈구 또는 림프구, 예를 들어, CD4 T 세포, CD8 T 세포, TReg 세포 및/또는 B 세포에 의해 발현되는 CD39의 활성을 중화시키기에 충분한 양 및 빈도로 투여된다.
이러한 항체는 CD39-매개 ATP 가수분해를 억제하는데 유용할 것이고, 예를 들어 그리하여 종양 미세환경 및/또는 순환계에서 아데노신의 농도의 감소를 초래하게 될 것이다. 그러므로, 이들 항체는 예를 들어, 암의 치료에 있어서, T 세포, B 세포 및 아데노신 수용체 (A2A 수용체)를 발현하는 다른 세포 상에서 CD39 및/또는 아데노신의 면역억제 효과를 반전시키는데 유용할 것이다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체는 T 세포에서 증식, 사이토카인 생성, 세포독성 및/또는 NFκB 활성의 아데노신-매개 억제를 중화시킨다.
항체는 종양 미세환경 및/또는 순환계에서 아데노신의 생성, 양 및/또는 농도를 억제하는데 유용할 것이다.
다른 양상에서, 개체를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 개체 (예를 들어, 질환, 종양 등을 갖는 개체)에게, 본 명세서에 기술된 임의의 항-CD39 항원 결합 화합물의 치료적 활성량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 개체를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 개체 (예를 들어, 질환, 종양 등을 갖는 개체)에게, CD39 폴리펩티드를 억제하는 본 개시 내용의 항원 결합 화합물의 치료적 활성량을 투여하는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항원 결합 화합물 (예를 들어, 항체)은 제2 치료제, 임의로 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 치료제 (예를 들어, 항체), 임의로 항-PD-1 항체, 임의로 항-PD-L1 항체와 조합하여 개체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항원 결합 화합물 (예를 들어, 항체)은 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 작용제에 의한 치료를 위해, 암을 갖고 불충분한 반응, 또는 반응에 대한 예후를 갖는 개체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 항체는 세포 어세이에서 CD39 폴리펩티드를 억제한다. 일 실시형태에서, 화합물은 비고갈 항체 (그것이 결합된 세포를 고갈시키지 않는 항체, 예를 들어, Fc 침묵 항체)이다. 임의로, 화합물은 2가 방식으로 CD39 폴리펩티드에 결합한다. 임의로, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 임의로, 항체는 인간 Fcγ 수용체 (예를 들어, CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64)와의 결합이 제거되도록 변형된 IgG (예를 들어, IgG1) 이소타입의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
다른 양상에서, 통상의 약학 제제 중에 증가된 안정성 및/또는 가용성을 갖는 항체는 유리하게 다른 항체와 약학 제제 중에서 조합될 수 있다. 일 실시형태에서, (i) CD39 폴리펩티드를 억제하고 증가된 안정성을 나타내는 항체, 예를 들어, CDR에 다수의 방향족 잔기 및 카밧 위치 234, 235, 237, 322, 330 및 331에서 임의의 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 CD39 폴리펩티드를 억제하는 항체, 및 (ii) 인간 IgG 이소타입의 제2 항체로서, 임의로 제2 항체는 항암 활성을 갖는 것인 제2 항체를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 제2 항체는 결합되는 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있고, 임의로 제2 항체는 종양 세포 상에 존재하는 항원 (종양 항원)에 결합한다. 일 실시형태에서, 제2 항체는 이의 초가변 영역이 결합하는 단백질의 활성을 중화시킬 수 있다. 일 실시형태에서, (i) CD39 폴리펩티드를 억제하고 증가된 안정성을 나타내는 항체, 예를 들어, CDR에 다수의 방향족 잔기 및 카밧 위치 234, 235, 237, 322, 330 및 331에서 임의의 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 CD39 폴리펩티드를 억제하는 항체, 및 (ii) 인간 IgG 이소타입의 제2 항체로서, 제2 항체는 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키고, 임의로 항-PD-1 항체, 임의로 항-PD-L1 항체인 제2 항체를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체 및 제2 항체 둘 모두는 카밧 위치 234, 235, 237, 322, 330 및 331에서 임의의 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다.
일 양상에서 CD39-발현 세포 (예를 들어, 개체의 백혈구 및/또는 종양 세포)에 의한 ATP 가수분해를 감소시키기 위한 방법, 또는 세포 CD39의 효소 활성을 중화시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 CD39-발현 세포를 CD39를 억제하는 본 개시 내용의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, CD39-발현 세포를 본 개시 내용의 항원 결합 화합물과 접촉시키는 단계는 CD39를 억제하는 항체의 치료 활성량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서 개체는 암을 갖는다.
일 양상에서 종양 환경 (예를 들어, 개체)에 존재하는 아데노신을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 CD39 폴리펩티드를 억제하는 본 개시 내용의 항체의 치료 활성량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서 개체는 암을 갖는다.
일 실시형태에서, CD39 폴리펩티드를 억제하는 항체의 활성량은 개체에서 AMP로 ATP의 CD39-매개 이화작용의 억제를 위해, 적어도 EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 의 혈액 농도를 (예를 들어, 항원 결합 화합물의 후속 투여까지) 획득하고/하거나 유지시키는데 유효한 양이다. 일 실시형태에서, CD39 폴리펩티드를 억제하는 항원 결합 화합물의 활성량은 개체의 혈관외 조직에서 AMP로 ATP의 CD39-매개 이화작용의 억제를 위해, EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 를 획득하는데 유효한 양이다. 일 실시형태에서, CD39 폴리펩티드를 억제하는 항원 결합 화합물의 활성량은 개체에서 AMP로 ATP의 CD39-매개 이화작용의 억제를 위해, EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 을 획득하는데 유효한 양이다. 일 실시형태에서, CD39 폴리펩티드를 억제하는 항원 결합 화합물의 활성량은 1 내지 20 mg/체중kg이다. 일 실시형태에서, 활성량은 개체에게 2주마다, 1개월 마다 또는 2개월 마다 투여된다.
임의로 개체는 암을 갖는데 감수성이거나 또는 암을 갖는 인간이다. 임의로 개체는 CD39를 발현하는 악성 세포 및/또는 가용성 CD39 단백질의 존재 (분비 또는 발산)를 특징으로 하는 암을 갖는 것에 감수성이거나 또는 암을 갖는 인간이다. 임의로 개체는 암을 갖는 것에 감수성이거나 또는 암을 갖고, 검출가능한 수준의 순환성 가용성 세포외 CD39 단백질 또는 CD39를 발현하는 종양-침윤성 백혈구를 갖는 인간이다.
항체는 임의로 10-9 M 미만, 바람직하게 10-10 M 미만, 또는 바람직하게 10-11 M 미만의 (더 양호한) 인간 CD39 폴리펩티드에 대한 결합 친화성 (KD), 및/또는 1 μg/ml 보다 낮은 EC50 (보다 양호한 결합)으로 인간 CD39에 결합하는 것을 특징으로 하고, 바람직하게 항체는 세포 표면에서 인간 CD39를 발현하는 세포 (예를 들어, 종양 세포)와의 결합에 대해, 0.5 μg/ml 이하, 임의로 0.2 μg/ml 이하, 임의로 0.1 μg/ml 이하의 EC50 을 갖는다.
항체는 임의로 키메라, 인간 또는 인간화 항체이다.
항체는 임의로 1 μg/ml 미만, 임의로 0.5 μg/ml 미만의 (더 양호한) CD39-발현 세포 (예를 들어, Ramos 종양 세포)에서 CD39의 효소 활성의 중화에 대한 EC50 을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 항체는 CD39의 효소 활성을 중화시키는 능력 및 결합 특이성을 보유하는 단일클론 항체 또는 이의 단편이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 예를 들어, 항체는 Fc 도메인 및 Fcγ 수용체 (예를 들어, CD16) 간 결합을 감소시키기 위해 변형된 인간 IgG1 이소타입의 Fc 도메인을 포함하는 항체일 수 있다. 일 실시형태에서, 항원-결합 화합물은 Fc 도메인이 결여되거나 또는 항체 매개 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 CDC를 유도시키지 않는 Fc 도메인을 포함하고, 임의로 항원-결합 화합물은 FcγRIIIA (CD16) 폴리펩티드에 결합하지 않는 Fc 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입의) Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하고, 여기서 치환은 Fcγ 수용체 (예를 들어, CD16)에 결합하고/하거나 보체에 결합하는 Fc 도메인 (또는 이를 함유하는 항체)의 능력을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 항원-결합 화합물은 독성 모이어티에 연결되지 않는다.
또한 임의의 전술한 특성을 갖는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 세포, 및 항-CD39 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 이러한 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 항-CD39의 제조 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 이러한 단백질, 핵산, 벡터, 및/또는 세포 및 전형적으로 제제화, 전달, 안정성 또는 조성물의 다른 특징을 촉진하는 불활성 성분 (예를 들어, 다양한 담체) 또는 활성 성분일 수 있는 하나 이상의 추가 성분을 포함하는, 조성물, 예컨대 약학적으로 허용가능한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 예컨대 CD39-매개 생물학적 활성의 조절에서, 예를 들어 이와 관련된 질환, 특히 암의 치료에서, 이러한 항체, 핵산, 벡터, 세포, 유기체, 및/또는 조성물을 사용하고 제조하는 다양한 새롭고 유용한 방법에 관한 것이다.
본 개시 내용은 또한 림프구 (예를 들어, T 세포)의 활성을, 이를 필요로 하는 대상체에서, 강화시키는 방법, 또는 림프구 (예를 들어, T 세포)의 활성을 복원시키는 방법, 또는 림프구 (예를 들어, T 세포)의 아데노신-매개 억제를 경감시키는 방법을 제공하고, 이러한 방법은 임의의 전술한 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있는 환자이다. 예를 들어, 환자는 고형 종양, 예를 들어, 직결장암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암 또는 악성 골수종을 앓고 있을 수 있다. 대안적으로, 환자는 조혈성암, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 또는 비호지킨 림프종을 앓고 있을 수 있다.
본 개시 내용은 또한 개체에서 질환의 치료를 위한 방법을 제공하고, 이 치료는 개체에게, 항-CD39 항체가 적어도 1회, 임의로 적어도 2회 투여되는 적어도 1회의 투여 주기 동안, CD39의 효소 활성을 중화시키는 항-CD39 항체를, CD39의 효소 활성의 중화를 위해, 적어도 EC50 (예를 들어, 0.01 내지 0.5 μg/ml의 EC50), 임의로 EC70 또는 임의로 EC100 (예를 들어, 0.05 내지 1 μg/ml, 0.1 내지 1 μg/ml의 EC100)에 상응하는 혈액 (혈청) 또는 혈관외 조직 (예를 들어, 종양 환경) 중 농도를 항-CD39 항체의 2회 연속 투여 사이에 획득 및/또는 유지하는데 유효한 양으로, 투여하는 단계를 포함한다. 항체는 예를 들어 적어도 약 0.1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1 μg/ml 또는 2 μg/ml)의 순환계 또는 혈관외 조직 (예를 들어, 종양 환경) 중 농도를 획득 및/또는 유지하기 위한 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 0.05 내지 1 μg/ml, 또는 0.1 내지 1 μg/ml의 혈관외 조직 중 농도를 획득하기 위해서, 항-CD39 항체는 0.5 내지 10 μg/ml, 또는 1 내지 10 μg/ml의 항-CD39 항체의 순환계 중 농도를 획득하는데 유효한 양으로 투여된다. 임의로, 항-CD39 항체는 투여 주기 전반 및/또는 항-CD39 항체의 2회 연속 투여 사이에, 적어도 1주, 2주, 3주, 4주 동안, 적어도 상기 언급된 농도로 항-CD39 항체의 농도를 유지시키는데 유효한 양으로 적어도 2회 투여된다.
본 개시 내용은 또한 개체에서 질환의 치료를 위한 방법을 제공하고, 이 치료는 개체에게 CD39의 효소 활성을 중화시키는 항-CD39 항체를, 항-CD39 항체가 적어도 1회, 임의로 적어도 2회 투여되는 적어도 1회의 투여 주기 동안, 항-CD39 항체의 2회 연속 투여 사이에 적어도 1 μg/ml, 임의로 적어도 10 μg/ml, 임의로 1 내지 100 μg/ml의 항-CD39 항체의 혈액 또는 조직 농도를 획득 및/또는 유지하는데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 임의로, 항-CD39 항체는 투여 주기 전반 및/또는 항-CD39 항체의 2회 연속 투여 사이에, 적어도 1주, 2주, 3주, 4주 동안, 적어도 1 μg/ml, 임의로 적어도 10 μg/ml, 임의로 1 내지 100 μg/ml의 항-CD39 항체의 연속 혈액 또는 조직 농도를 유지시키는데 유효한 양으로 적어도 2회 투여된다.
이들 양상은 본 명세서에서 더욱 완전하게 설명되며, 추가의 양상, 특성 및 장점은 본 명세서에 제공된 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1은 양성 대조군 I-394 항체와 비교된 항체 I-397, I-398 및 I-399를 보여주는 대표적인 스크리닝 결과를 도시한다.
도 2A는 항체 BY40, I-394, I-395 및 I-396이 세포-막 결합된 CD39를 억제하고, I-394 및 I-395 둘 모두는 BY40과 비교하여 모든 농도에서 더 큰 역가를 보일뿐만 아니라 세포 CD39의 더 큰 최대 억제성을 보인다는 것을 도시한다. 도 2B는 항체 I-395 및 I-396 둘 모두는 음성 대조군 (BY40) 및 양성 대조군 (I-394) 항체와 비교하여 가용성 CD39를 억제한다는 것을 도시한다.
도 3A는 CD39 단백질의 표면 상에서 돌연변이체 5 (M5), 15 (M15) 및 19 (M19)의 돌연변이된 잔기의 위치를 도시한다. 도 3B는 상이한 항체에 대한 돌연변이체 5, 15 및 19의 결합 결과를 도시한다.
도 4는 유세포측정법으로 평가된, 인간 CD39를 발현하는 세포에 대한 항체 I-394의 결합을 도시한다. I-394는 인간 CD39 를 발현하는 세포(CHO-huCD39), 사이노몰거스 CD39 를 발현하는 세포(CHO-cyCD39) 및 Ramos 림프종 세포에 결합하지만, 쥐과 CD39 를 발현하는 세포(CHO-moCD39)에는 결합하지 않는다.
도 5는 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 유닛을 정량하여 평가시에, 항체 I-394가 종양 (Ramos) 세포, 인간 CD39 를 발현하는 세포(CHO-huCD39), 및 사이노몰거스 CD39 를 발현하는 세포(CHO-cyCD39)에서 CD39 효소 활성을 차단하는데 매우 강력하다는 것을 도시한다.
도 6은 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 유닛을 정량하여 평가시에 항체 I-394가 가용성 재조합 인간 CD39 단백질의 효소 활성을 차단하는데 매우 강력하다는 것을 도시한다.
도 7은 ELISA 어세이로 평가시에 항체 I-394가 인간 CD39에는 결합하지만 임의의 인간 이소폼 CD39-L1, CD39-L2, CD39-L3 또는 CD39-L4에는 결합하지 않는다는 것을 도시한다.
도 8은 CD4 T 세포 활성화에 대한 ATP-매개된 DC 활성화의 효과를 평가하기 위한 실험 절차를 도시한 것으로서, ATP-활성화된 DC를 세척하였고 그 다음으로 5일 동안 혼합 림프구 반응 (MLR)을 위해 동종이계 CD4 T 세포 (1 MoDC / 4 T 세포의 비율)와 인큐베이션시켰다. T 세포 활성화 및 증식은 유세포측정에 의해 CD25 발현 및 Cell Trace Violet 희석을 통해 분석하였다.
도 9는 moDC 상에서 HLA-DR 발현을 도시하고 도 10은 moDC 상에서 CD83 발현을 도시한다. 이들 도면은 항-CD39 차단 항체 I-394 및 CD39의 화학적 억제제가 각각 0.125 mM, 0.25 mM 또는 0.5 mM에서 moDC 활성화를 야기시킨다는 것을 도시한다. 그러나, 항-CD39 항체 BY40 또는 항-CD73 항체는 수지상 세포 (DC)의 ATP-유도된 활성화를 촉진할 수 없어서, 항체가 ATP 이화작용을 충분히 피하도록 효소 활성을 차단할 수 없다는 것을 시사한다. 범례는 위에서 아래로 그래프의 좌측에서 우측의 막대에 상응한다.
도 11은 CD25 발현은 MLR 어세이에서 ATP의 존재 하에서 활성화된 MoDC가 T 세포 활성화 및 증식을 유도할 수 있었고, 항-CD39 차단 항체 I-394에 의한 ATP-매개된 MoDC 활성화의 증강은 그 결과로 더 높은 T 세포 증식 및 활성화를 야기시켰다는 것을 확인한 것을 도시한다. 위에서 아래로 범례는 좌측에서 우측으로 그래프의 막대에 상응한다.
정의
"포함하는"이 사용되는 경우에, 이것은 임의로 "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"으로 교체될 수 있다.
"혈관" CD39, NTPdase1, ENTPD1, ATPDase 및 혈관 ATP 디포스포히드롤라제라고도 알려진 인간 CD39는 ATPase 활성을 나타낸다. CD39는 세포외 ATP 및 ADP를 AMP로 가수분해시키고, 이것은 다른 효소, 5-프라임 뉴클레오티다제에 의해 아데노신으로 더 전환된다. "혈관" 인간 CD39 성숙한 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 수탁 번호 P49961 하에 Genbank에서 확인되며, 그 전체 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입되고, 다음과 같다:
NTPDase2 또는 ENTPD2로도 알려진 인간 CD39-L1은 수탁 번호 NP_001237 하에 Genbank에서 확인되며, 그 전체 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입되고, 다음과 같다:
NTPDase6 또는 ENTPD6; ENTPD6 이소폼 1이라고도 알려진 인간 CD39-L2는 수탁 번호 NP_001238 하에 Genbank에서 확인되며, 그 전체 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입되고, 다음과 같다:
NTPDase3 또는 ENTPD3; ENTPD3 이소폼으로도 알려진 인간 CD39-L3은 수탁 번호 NP_001239 하에 Genbank에서 확인되며, 그 전체 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입되고, 다음과 같다:
NTPDase5 또는 ENTPD5로도 알려진 인간 CD39-L4는 수탁 번호 NP_001240 (전구체) 하에 Genbank에서 확인되며, 그 전체 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입되고, 다음과 같다:
본 명세서의 문맥에서, CD39 폴리펩티드를 언급할 때 "중화하다" 또는 "중화하는" (예를 들어, "CD39를 중화하다", "CD39의 활성을 중화하다" 또는 "CD39의 효소 활성을 중화하다")는 CD39의 ATP 가수분해 (ATPase) 활성이 억제되는 과정을 의미한다. 이것은 특히, AMP 및/또는 ADP의 CD39-매개 발생의 억제, 즉, ATP의 AMP 및/또는 ADP로의 CD39-매개 이화작용의 억제를 포함한다. 막-결합 CD39의 경우, 이것은 예를 들어 직접적으로 또는 간접적으로 ATP의 AMP 및/또는 ADP로의 전환을 억제하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 세포 어세이에서 측정될 수 있다. 가용성 CD39의 경우에, 이것은 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 가용성 CD39과 시험 화합물을 인큐베이션시키고 직접적으로 또는 간접적으로 ATP의 AMP 및/또는 ADP로의 전환을 측정하여 측정할 수 있다. 예를 들어, ATP의 소멸 및/또는 AMP의 발생은 본 명세서에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어, ATP의 소멸 및/또는 AMP의 발생은 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 유닛을 정량하여 평가할 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 조제물은 예를 들어 본 명세서에 기술된 어세이 (예를 들어, ATP의 소멸 및/또는 AMP의 발생)를 언급하면 ATP의 AMP로의 전환에서 적어도 60%의 감소, ATP의 AMP로의 전환에서 적어도 70%의 감소, 또는 ATP의 AMP로의 전환에서 적어도 80% 또는 90%의 감소를 야기시킨다.
항-CD39 결합제 (예를 들어, 항체)과 관련하여 "암의 치료" 등이 언급될 때 마다, 이것은 (a) 암의 치료 방법으로서, 상기 방법은 (바람직하게 약학적으로 허용가능한 담체 재료 중) 항-CD39 결합제를 이러한 치료를 필요로 하는 개체, 포유동물, 특히 인간에게, 암의 치료를 가능하게 하는 용량 (치료적 유효량)으로, 바람직하게 본 명세서에 명시된 바와 같은 용량 (양)으로, (적어도 하나의 치료를 위해) 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법; (b) 암의 치료를 위한 항-CD39 결합제의 용도, 또는 상기 치료에서 (특히 인간에서) 사용을 위한 항-CD39 결합제; (c) 암의 치료를 위한 약학 조제물의 제조를 위한 항-CD39 결합제의 용도, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체와 항-CD39 결합제의 혼합물을 포함하는, 암의 치료를 위한 약학 조제물, 또는 암의 치료에 적절한 항-CD39 결합체의 유효 용량을 포함하는 약학 조제물의 제조를 위한 항-CD39 결합체를 사용하는 방법; 또는 (d) 본 특허 출원이 출원되는 국가에서 특허받을 수 있는 대상에 따라서, a), b), 및 c)의 임의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "항원 결합 도메인"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 3차원 구조를 포함하는 도메인을 의미한다. 따라서, 일 실시형태에서, 상기 도메인은 초가변 영역, 임의로 항체 사슬의 VH 및/또는 VL 도메인, 임의로 적어도 VH 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 결합 도메인은 항체 사슬의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 결합 도메인은 비-면역글로불린 스캐폴드 유래 폴리펩티드 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 다클론 및 단일클론 항체를 의미한다. 중쇄의 불변 도메인의 유형에 따라서, 항체는 5종의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 하나로 지정된다. 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등으로 더욱 분류된다. 예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 유닛은 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 (약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄 (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 한정한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 해당되는 중쇄 불변 도메인은 각각 "알파", "델타", "엡실론", "감마" 및 "뮤"라고 한다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차 입체형태는 충분히 공지되어 있다. IgG는 그들이 생리학적 상황에서 가장 일반적인 항체이기 때문에 그리고 그들이 실험실 상황에서 가장 쉽게 만들어지기 때문에 본 명세서에서 적용되는 예시적인 클래스의 항체이다. 임의로 항체는 단일클론 항체이다. 항체의 특정한 예는 인간화, 키메라, 인간, 또는 아니면-인간-적합화 항체이다. "항체"는 또한 본 명세서에 기술된 임의의 항체의 임의 단편 또는 유도체를 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하다"는 항체가 단백질의 재조합 형태, 그 안의 에피토프, 또는 단리된 표적 세포의 표면 상에 존재하는 천연 단백질을 사용하여 평가 시에, 바람직하게 결합 파트너, 예를 들어 CD39와의 경쟁적 결합 어세이에서 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 경쟁적 결합 어세이 및 특이적 결합을 결정하기 위한 다른 방법이 하기에 더욱 설명되고 당분야에 충분히 공지되어 있다.
항체가 특정한 단일클론 항체 (예를 들어, 항체 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399와 "경쟁한다"고 할때)"와 경쟁한다"라고 할 때, 이것은 항체가 재조합 CD39 분자 또는 표면 발현되는 CD39 분자를 사용하는 결합 어세이에서 단일클론 항체와 경쟁한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 시험 항체는 결합 어세이에서 CD39 폴리펩티드 또는 CD39-발현 세포와 기준 항체의 결합을 감소시킨다면, 그 항체는 기준 항체와 개별적으로 "경쟁한다"고 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "친화성"은 항체의 에피토프에 결합하는 강도를 의미한다. 항체의 친화성은 [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]로서 정의된 해리 상수 Kd로 제공되고, 여기서 [Ab-Ag] 는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab] 는 미결합된 항체의 몰 농도이고 [Ag] 는 미결합된 항원의 몰 농도이다. 친화성 상수 Ka 는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화성을 결정하기 위한 방법은 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)], [Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 및 [Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 확인할 수 있고, 이들은 전체로 참조하여 본 명세서에 편입된다. mAb의 친화성을 결정하기 위해 당분야에 충분히 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 스크리닝 (예컨대 BIAcore™ SPR 분석 장치를 사용한 분석에 의함)의 사용이다.
본 명세서에 문맥 내에서, "결정부"는 폴리펩티드 상의 상호작용 또는 결합의 부위를 표시한다.
용어 "에피토프"는 항원성 결합부를 의미하고, 항체가 결합하는 항원 상의 면적 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접적으로 관여되는 아미노산 잔기를 비롯하여 특이적 항원 결합 항체 또는 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기, 즉 항체의 "풋프린트" 내 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어 항체 또는 수용체와 조합될 수 있는 복합체 항원 분자 상의 가장 단순한 형태 또는 가장 작은 구조적 영역이다. 에피토프는 선형일 수 있거나 또는 입체형태/구조일 수 있다. 용어 "선형 에피토프"는 아미노산의 선형 서열 (1차 구조) 상에서 인접하는 아미노산 잔기로 구성된 에피토프로서 정의된다. 용어 "입체형태적 또는 구조적 에피토프"는 모두 인접하는 것은 아니고 따라서 분자의 폴딩에 의해서 서로 인접하게 되는 아미노산의 선형 서열의 분리된 부분을 나타내는 아미노산 잔기로 구성된 에피토프로서 정의된다 (2차, 3차 및/또는 4차 구조). 입체형태 에피토프는 3차 구조에 의존적이다. 그러므로 용어 '입체형태적'은 종종 '구조적'과 상호교환적으로 사용된다.
"세포내 내재화"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "내재화"는 세포의 세포외 표면으로부터 세포의 세포내 표면으로 분자의 전좌 과정과 연관된 분자적, 생화학적 및 세포적 사건을 의미한다. 분자의 세포내 내재화를 담당하는 과정은 충분히 공지되어 있고, 특히 세포외 분자 (예컨대 호르몬, 항체 및 소형 유기 분자)의 내재화; 막-회합 분자 (예컨대 세포-표면 수용체); 및 세포외 분자에 결합된 막-회합 분자의 복합체 (예를 들어, 경막 수용체에 결합된 리간드 또는 막-회합 분자에 결합된 항체)를 포함할 수 있다. 따라서, "유도되고/되거나 증가된 내재화"는 세포내 내재화가 개시되고/되거나 세포내 내재화의 속도 및/또는 정도가 증가되는 사건을 포함한다.
용어 "작용제"는 본 명세서에서 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 재료로부터 만들어진 추출물을 의미하고자 사용된다. 용어 "치료제"는 생물학적 활성을 갖는 작용제를 의미한다.
본 명세서의 목적을 위해서, "인간화" 또는 "인간" 항체는 하나 이상의 인간 면역글로불린의 불변 및 가변 프레임워크 영역이 동물 면역글로불린의 결합 영역, 예를 들어 CDR과 융합된 항체를 의미한다. 이러한 항체는 결합 영역이 유래되는 비인간 항체의 결합 특이성을 유지하지만, 비인간 항체에 대한 면역 반응은 피하도록 디자인된다. 이러한 항체는 항원성 공격에 대응하여 특이적 인간 항체를 생성하도록 "조작된" 유전자이식 마우스 또는 다른 동물로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Green et al. (1994) Nature Genet 7:13]; [Lonberg et al. (1994) Nature 368:856]; [Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579]을 참조하고, 이들의 전체 교시 내용은 참조로 본 명세서에 편입됨). 완전한 인간 항체는 또한 유전자 또는 염색체 형질감염 방법을 비롯하여, 파지 디스플레이 기술에 의해 구축될 수 있고, 이들 기술 모두는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553] 참조). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조하고, 이들은 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입됨).
"키메라 항체"는 (a) 불변 영역, 또는 이의 일부분이 변경, 치환 또는 교환되어 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이하거나 또는 변경된 클래스, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체, 예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 새로운 특성을 부여하는 전체적으로 상이한 분자에 연결되거나; 또는 (b) 가변 영역, 또는 이의 일부분이 상이하거나 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 치환 또는 교환된 항원 분자이다.
본 명세서에서 사용시 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 일반적으로 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al. 1991) 및/또는 "초가변 루프" 유래 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917]), 또는 항원 결합을 담당하는 필수 아미노산을 결정하기 위한 유사한 시스템을 포함한다. 전형적으로, 이 영역 내 아미노산 잔기의 번호매김은 문헌 [Kabat et al., 상동]에 기술된 방법으로 수행된다. 본 명세서에서 "카밧 위치", "카밧으로 번호매겨진 가변 도메인 잔기" 및 카밧에 따른"과 같은 어구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이러한 번호매김 체계를 의미한다. 카밧 번호매김 체계를 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그로의 삽입에 상응하는 소수 또는 추가 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입 (카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 번호매김은 "표준" 카밧 번호매김 서열과 항체의 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 소정 항체에 대해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기란 CDR로서 정의된 이들 영역을 제외한 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 각각의 항체 가변 도메인 프레임워크는 CDR에 의해 분리된 인접한 영역으로 더욱 세분될 수 있다 (FR1, FR2, FR3 및 FR4).
용어 "Fc 도메인", "Fc 부분" 및 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 C-말단 단편, 예를 들어, 인간 γ (감마) 중쇄의 대략 아미노산 (aa) 230 내지 대략 aa 450 또는 다른 유형의 항체 중쇄 (예를 들어, 인간 항체의 경우 α, δ, ε 및 μ) 또는 이의 천연 발생 알로타입의 이의 대응 서열을 의미한다. 달리 명시하지 않으면, 면역글로불린에 대해 공통으로 허용되는 카밧 아미노산이 본 개시 내용 전반에서 사용된다 (Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).
용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 이의 천연 상태에서 존재하는 바와 같이 정상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액상 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 조제물에 존재하는 주요 종인 단백질이 실질적으로 정제된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체를 비롯하여, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해서 사용시 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래된다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연 (비재조합) 형태 내에 존재하지 않는 유전자를 발현하거나 또는 발현 하에서 달리 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
본 명세서의 문맥 내에서, 폴리펩티드 또는 에피토프에 "결합하는" 용어 항체는 특이성 및/또는 친화성을 갖는 상기 결정부에 결합하는 항체를 의미한다.
2개 이상의 폴리펩티드의 서열 간 관련성에 대해 사용될 때 용어 "동일성" 또는 "동일한"은 둘 이상의 아미노산 잔기 간 일치수에 의해 결정되는, 폴리펩티드간 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 특정한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 처리되는 (존재한다면) 갭 정렬에 의한 보다 작은 둘 이상의 서열 간 동일한 일치부의 백분율을 측정한다. 관련 폴리펩티드의 동일성은 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있다. 이러한 방법은 제한없이, 다음의 문헌들에 기술된 것들을 포함한다: [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991]; 및 [Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)].
동일성을 결정하기 위한 방법은 시험되는 서열 간 최대 일치성을 제공하도록 디자인된다. 동일성을 결정하는 방법은 공공으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램에 기술되어 있다. 2개 서열 간 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))을 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) 및 다른 공급처 (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)로부터 공공으로 입수가능하다. 충분히 공지된 스미스 워터만 (Smith Waterman) 알고리즘이 또한 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다.
항체의 제조
암 및/또는 다른 질환 (예를 들어, 감염성 질환)의 치료에 사용될 수 있는 항-CD39 항원 결합 도메인, 또는 이러한 도메인을 포함하는 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)은 가용성 인간 CD39 폴리펩티드, 예를 들어, 막 결합된 CD39에 존재하는 N-말단부 및 C-말단부 근처의 2개 경막 도메인이 결여된 인간 CD39 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인 단백질에 결합한다. 일 실시형태에서 작용제는 CD39의 ATPase 활성을 억제한다. 일 실시형태에서 항체는 아데노신의 CD39-매개 발생을 억제한다. 일 실시형태에서 항체는 ATP의 AMP로의 CD39-매개 이화작용을 억제한다. 일 실시형태에서 항체는 림프구 (예를 들어, T 세포) 활성의 아데노신-매개 억제를 억제한다. 일 양상에서, 항체는 전체 길이 항체, 항체 단편, 및 합성 또는 반합성 항체-유래 분자로부터 선택된다.
가용성 (및 임의로 막-결합) CD39 단백질의 효소적 (ATPase 활성) 활성을 강력하게 억제하는 항체는 일 실시형태에서, 고정될 수 있거나 또는 이의 입체형태의 하나로 가용성 (및 임의로 막-결합) CD39 단백질의 도메인 움직임을 제한할 수 있어서, 그에 따라 이의 기질이 가수분해되는 것을 방지한다. 이 항체는 가용성 (및 임의로 막-결합) CD39의 C-말단 및 N-말단 도메인 둘 모두에 동시에 결합하여 이를 달성할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-CD39 항원 결합 도메인, 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 다중특이적 결합 단백질, 이중특이적 항체 등)은 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 항원 결합 도메인은 바람직하고/하거나 개선된 특성을 제공하도록 디자인될 수 있거나 또는 변형될 수 있다.
일 실시형태에서, 항-CD39 항원-결합 단백질은 인간 CD39 폴리펩티드에 결합할 수 있고 이의 활성을 억제할 수 있으며, 이 항원-결합 단백질은 각각이 프레임워크 (예를 들어, 인간 기원의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크) 및 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 항원-결합 단백질은 CD39에 결합했을 때 CD39의 도메인 움직임을 제한한다. 임의로, VH 및/또는 VL 프레임워크 (예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)는 인간 기원이다.
일정한 실시형태에서, 결합 분자 및 도메인은 면역글로불린 가변 도메인으로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 2개 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 회합된 VL 및 VH 도메인의 형태일 수 있거나, 또는 단일 사슬 항원 결합 도메인 예컨대 scFv, VH 도메인, VL 도메인, dAb, V-NAR 도메인 또는 VHH 도메인일 수 있다.
일 양상에서, CD39 결합제는 완전한 인간 항체, 인간화 항체, 및 키메라 항체로부터 선택되는 항체이다.
일 양상에서, 작용제는 본 명세서에서 더욱 개시되는 바와 같이, 예를 들어 변형된, 인간 IgG1 불변 또는 Fc 도메인으로부터 유래된 불변 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체의 단편이다.
일 양상에서, 작용제는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig (라마 또는 낙타 Ig), VHH 단편, 단일 도메인 FV, 및 단일 사슬 항체 단편로부터 선택되는 항체 단편을 포함한다. 일 양상에서, 작용제는 scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR; 및 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체로부터 선택되는 합성 또는 반합성 항체-유래 분자를 포함한다. 작용제는 임의로 Fc 도메인을 더 포함할 수 있다.
일 양상에서, 항체는 적어도 부분적으로 정제된 형태이다.
일 양상에서, 항체는 본질적으로 단리된 형태이다.
항체는 당분야에 공지된 다양한 기술로 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항체는 항체 라이브러리 (예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 생성)로부터 선택하여 제조된다. 다른 실시형태에서, 항체는 CD39 폴리펩티드, 바람직하게 가용성 인간 CD39 세포외 도메인 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로, 인간이외의 동물, 바람직하게 마우스를 면역화하여 제조된다. CD39 폴리펩티드는 전체 길이 CD39 폴리펩티드의 단편 또는 유도체, 전형적으로 면역원성 단편, 즉, CD39 폴리펩티드를 발현하는 세포의 표면 상에 노출된 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 일부분일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 이러한 단편은 전형적으로 성숙한 폴리펩티드 서열의 적어도 약 7개의 연속되는 아미노산, 보다 더 바람직하게 이의 적어도 약 10개의 연속되는 아미노산을 함유한다. 전형적으로, 단편은 수용체의 세포외 도메인으로부터 본질적으로 유래된다. 일 실시형태에서, 면역원은 지질막, 전형적으로 세포의 표면에 야생형 인간 CD39 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 면역원은 온전한 세포, 특히 임의로 처리되거나 또는 용해된, 온전한 인간 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리펩티드는 재조합 CD39 폴리펩티드이다.
항원으로 인간이외의 포유동물을 면역화하는 단계는 마우스에서 항체의 생성을 자극하기 위해 당분야에 충분히 공지된 임의 방식으로 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]을 참조하고, 이의 전체 개시 내용은 본 명세서에서 참조로 편입됨). 항체를 생성하는 하이브리도마의 단리는 충분히 공지되어 있고 당분야에 공지된 임의 방식으로 수행될 수 있다.
항체는 또한 예를 들어, 그 전체 개시 내용이 본 명세서에서 참조로 편입되는, 문헌 [Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544]에 개시된 바와 같이, 면역글로불린의 조합 라이브러리의 선택에 의해 생성될 수 있다.
CD39, 특히 단일클론 항체 I-394와 CD39 상의 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 영역에 결합하는 하나 이상의 항체의 동정은 항체 경쟁성을 평가할 수 있는 다양한 면역학적 스크리닝 어세이 중 어느 하나를 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 많은 이러한 어세이는 통상적으로 실시되고 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, 특히 참조로 본 명세서에 도입되는, 1997년 8월 26일 공개된 미국 특허 제5,660,827호 참조).
예를 들어, 조사하려는 시험 항체가 상이한 공급 동물로부터 수득되거나, 또는 심지어 상이한 Ig 이소타입인 경우, 대조군 (예를 들어, I-394) 및 시험 항체를 혼합 (또는 사전흡착)하고 CD39 폴리펩티드를 함유하는 샘플에 적용하는 단순 경쟁 어세이가 적용될 수 있다. 웨스턴 블롯팅을 기반으로 하는 프로토콜 및 BIACORE 분석의 사용은 이러한 경쟁 실험에서 사용하기 적합하다.
일정한 실시형태에서, CD39 항원 샘플에 적용하기 전에 일정 시간 기간 동안 대조군 항체 (예를 들어, I-394)와 다양한 양의 시험 항체 (예를 들어, 약 1:10 또는 약 1:100)를 사전 혼합한다. 다른 실시형태에서, 대조군 및 다양한 양의 시험 항체는 CD39 항원 샘플에 노출 동안 간단히 혼합될 수 있다. (예를 들어, 미결합된 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 기술의 사용에 의해) 결합된 항체와 유리 항체 및 (예를 들어, 종-특이적 또는 이소타입-특이적 2차 항체를 사용하거나 또는 검출가능한 표지로 특이적으로 표지된 I-394에 의해) I-394와 시험 항체를 구별할 수 있는 한, 시험 항체가 항원과 개별 I-394의 결합을 감소시키는지 여부를 결정할 수 있다. 완전하게 미관련된 항체의 부재 하에서 (표지된) 대조군 항체의 결합은 높은 대조군 값으로서 제공될 수 있다. 낮은 대조군 값은 표지된 (I-394) 항체를 정확하게 동일한 유형의 미표지된 항체 (I-394)와 인큐베이션시켜서 수득될 수 있는데, 여기서 경쟁이 일어나서 표지된 항체의 결합이 감소된다. 시험 어세이에서, 시험 항체의 존재 하에서 표지된 항체 반응의 유의한 감소는 CD39 상의 동일한 영역 또는 에피토프를 인식할 수 있는 시험 항체를 의미한다. 시험 항체는 약 1:10 내지 약 1:100의 I-394:시험 항체의 임의 비율에서, 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 또는 더 바람직하게 적어도 약 80% 또는 90% (예를 들어, 약 65-100%) 만큼 CD39 항원에 대한 I-394의 결합을 감소시키는 것을 선택할 수 있다. 바람직하게, 이러한 시험 항체는 CD39 항원에 대한 I-394의 결합을 적어도 약 90% (예를 들어, 약 95%) 만큼 감소시킬 것이다.
경쟁은 또한 예를 들어, 유세포측정 시험에 의해 평가될 수 있다. 이러한 시험에서, 소정 CD39 폴리펩티드를 보유하는 세포는 예를 들어, I-394와 먼저 인큐베이션될 수 있고, 그 다음으로 형광색소 또는 바이오틴으로 표지된 시험 항체와 인큐베이션될 수 있다. 항체는, 개별 I-394의 포화량과 사전인큐베이션 시 수득된 결합이 (형광에 의해 측정시) 개별 I-394와 사전인큐베이션하지 않은 항체에 의해 수득된 결합의 약 80%, 바람직하게 약 50%, 약 40% 또는 그 이하 (예를 들어, 약 30%, 20% 또는 10%)라면 I-394와 경쟁한다고 한다. 대안적으로, 항체는, 시험 항체의 포화량과 사전인큐베이션된 세포 상의 (형광색소 또는 바이오틴에 의해) 표지된 I-394항체에 의해 수득된 결합이 시험 항체와 사전인큐베이션하지 않고 수득된 결합의 약 80%, 바람직하게 약 50%, 약 40%, 또는 그 이하 (예를 들어, 약 30%, 20% 또는 10%)라면 I-394와 경쟁한다고 한다.
시험 항체가 사전흡착되어 포화 농도로 CD39 항원이 고정된 표면 상에 적용되는 단순 경쟁 어세이가 또한 적용될 수 있다. 단순 경쟁 어세이의 표면은 바람직하게 BIACORE 칩 (또는 표면 플라스몬 공명 분석에 적합한 다른 매질)이다. 대조군 항체 (예를 들어, I-394)가 그 다음으로 CD39-포화 농도로 표면과 접촉되고 CD39 및 대조군 항체의 표면 결합이 측정된다. 대조군 항체의 이러한 결합은 시험 항체의 부재 하에서 CD39-함유 표면과 대조군 항체의 결합과 비교된다. 시험 어세이에서, 시험 항체의 존재 하에서 대조군 항체에 의한 CD39-함유 표면의 결합의 유의한 감소는 시험 항체가 대조군 항체와 "교차-반응한다"는 것을 의미한다. 적어도 약 30% 이상, 바람직하게 약 40%으로 CD39 항원에 대한 대조군 (예컨대 I-394) 항체의 결합이 감소되는 임의의 시험 항체는 대조군 (예를 들어, I-394)과 경쟁하는 항체로 간주될 수 있다. 바람직하게, 이러한 시험 항체는 적어도 약 50% (예를 들어, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 또는 그 이상)로 CD39 항원에 대한 대조군 항체 (예를 들어, I-394)의 결합을 감소시킬 것이다. 대조군 및 시험 항체의 순서는 반전될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이며, 다시 말해서, 대조군 항체가 먼저 표면에 결합될 수 있고, 그 이후에 시험 항체가 경쟁 어세이에서 표면과 접촉된다. 바람직하게, CD39 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는 항체가 먼저 표면에 결합되는데, 제2 항체에 대해 확인된 결합의 감소 (항체가 교차-반응성이라고 가정)가 보다 큰 규모일 것으로 예상되기 때문이다. 이와 같은 어세이의 추가 예는 예를 들어, 문헌 [Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41]에 제공되어 있고, 이의 개시 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
일 실시형태에서, 항체는 가용성 CD39 및/또는 CD39-발현 세포, 예를 들어, 악성 세포에 결합하는 그들 능력을 시험하기 위한 면역어세이에서 검증된다. 예를 들어, 혈액 샘플 또는 종양 생검이 수행되고 가용성 CD39가 단리되고/되거나 종양 세포가 채취된다. 그 다음으로 sCD39 및/또는 세포에 대한 소정 항체의 능력을 당분야에 충분히 공지된 표준 방법을 사용해 평가한다. 항체는 예를 들어 개체 또는 환자의 상당한 백분율 (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상)로부터의 CD39를 발현하는 것으로 알려진 세포, 예를 들어 종양 세포의 실질적 비율 (예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상)에 결합할 수 있다. 항체는 환자에서 sCD39 및/또는 악성 세포의 존재 또는 수준을 결정하기 위한 진단 목적을 위해서, 예를 들어, 환자가 항-CD39 작용제에 의한 치료에 적합한지 여부를 평가하기 위한 생물마커로서, 또는 본 명세서에 기술된 치료 방법에서 사용을 위해 사용될 수 있다. sCD39 및/또는 세포에 대한 항체의 결합을 평가하기 위해서, 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적으로 표지되는 경우, 전형적으로 표지된 2차 항체가 첨가된다.
항체가 에피토프 영역 내에 결합하는지 여부의 결정은 당업자에게 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 맵핑/특징규명 방법의 일례로서, 항-CD39 항체에 대한 에피토프 영역은 CD39 단백질의 노출된 아민/카르복실의 화학적 변형을 사용하는 에피토프 "풋프린팅"에 의해 결정될 수 있다. 이러한 풋프린팅 기술의 특별한 일례는 HXMS (hydrogen-deuterium exchange detected by mass spectrometry)의 사용으로서, 수용체 및 리간드 단백질 아미드 양성자의 수소/중수소 교환, 결합, 및 역교환이 일어나고, 여기서 단백질 결합에 참여하는 골격 아미드 기는 역교환으로부터 보호되며 그리하여 중수소화된 채로 남게 된다. 관련 영역은 이 지점에서 펩티드 단백질가수분해, 고속 미세구경 고성능 액상 크로마토그래피 분리, 및/또는 전기분무 이온화 질량 분광법을 통해서 동정될 수 있다. 예를 들어, 다음을 참조한다: [Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999)], [Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A]. 적합한 에피토프 동정 기술의 다른 예는 핵 자기 공명 에피토프 맵핑 (NMR)으로서, 여기서는 전형적으로 항원 결합 펩티드, 예컨대 항체와 복합체를 형성하는 항체 및 유리 항체의 2차원 NMR 스펙트럼의 신호 위치를 비교한다. 전형적으로, 항원은 15N으로 선택적으로 동위원소 표지되어서 항원에 상응하는 신호만이 NMR-스펙트럼에서 확인되고 항원 결합 펩티드로부터의 신호는 보이지 않는다. 항원 결합 펩티드와 상호작용에 관여하는 아미노산으로부터 기원하는 항원 신호는 전형적으로 유리 항원의 스펙트럼과 비교하여 복합체의 스펙트럼에서 위치가 이동하게 되고, 결합에 관여하는 아미노산은 그러한 방식으로 동정될 수 있다. 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: [Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67]; [Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998)]; 및 [Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24].
에피토프 맵핑/특징규명은 또한 질량 분광분석 방법을 사용해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503] 및 [Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801]을 참조한다. 프로테아제 분해 기술은 또한 에피토프 맵핑 및 동정의 경우에 유용할 수 있다. 항원성 결정-관련 영역/서열은 예를 들어 프로테아제 분해에 의해, 예를 들어 트립신을 약 1:50의 비율로 CD39에 대해 사용하거나 또는 pH 7-8에서 o/n 분해하고, 펩티드 동정을 위한 질량 분광분석법 (MS)을 후속하여 결정될 수 있다. 항-CD39 결합제에 의해 트립신 절단으로부터 보호된 펩티드는 이후에 샘플을 트립신 분해하고 샘플을 항체와 인큐베이션시킨 후 예를 들어, 트립신에 의해 분해된 (그리하여 결합제에 대한 풋프린트가 밝혀짐) 샘플과 비교하여 동정될 수 있다. 키모트립신, 펩신 등과 같은 다른 효소가 역시 또는 대안적으로 유사한 에피토프 특징규명 방법에서 사용될 수 있다. 게다가, 효소적 분해는 잠재적인 항원성 결합부 서열이 표면 노출되지 않은 CD39 폴리펩티드의 영역 내에 있고, 그에 따라서 면역원성/항원성 관점에서 거의 관련이 없을 수 있는지 여부를 분석하기 위한 신속한 방법을 제공할 수 있다.
부위-지정 돌연변이유발법은 결합 에피토프를 설명하기 위해 유용한 다른 기술이다. 예를 들어, "알라닌-스캐닝"에서, 단백질 절편 내 각각의 잔기는 알라닌 잔기로 치환되고, 결합 친화성에 대한 결과가 측정된다. 돌연변이가 결합 친화성의 유의한 감소를 초래하면, 이것은 아마도 결합에 관여할 것이다. 구조적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체 (즉, 언폴딩된 단백질에 결합하지 않는 항체)는 알라닌-치환이 단백질의 전체 폴드에 영향을 미치지 않는다는 것을 검증하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386]; 및 [Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6]을 참조한다.
전자 현미경이 또한 에피토프 "풋프린팅"에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Wang et al., Nature 1992; 355:275-278]은 천연 동부콩 모자이크 바이러스의 캡시드 표면 상의 Fab-표면의 물리적 풋프린트를 결정하기 위해서, 저온전자 현미경, 3차원 이미지 재구성, 및 X-선 결정학의 협동 적용을 사용하였다.
에피토프 평가를 위한 "표지-무함유" 어세이의 다른 형태는 표면 플라스몬 공명 (SPR, BIACORE) 및 반사계 간섭 분광법 (RifS)을 포함한다. 예를 들어, [Fagerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14]; [Nice et al., J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168]; [Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311]; [Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944]를 참조한다.
항체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 본 명세서에 기술된 예시적인 경쟁 어세이 중 하나 이상에서 동정될 수 있다는 것을 또한 이해해야 한다.
척추동물 또는 세포에서 면역화 및 항체의 생성시에, 특정한 선택 단계가 청구된 바와 같은 항체를 단리하기 위해 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 특별한 실시형태에서, 개시 내용은 또한 이러한 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 (a) 인간 이외의 포유동물을 CD39 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로 면역화시키는 단계; 및 (b) 상기 면역화된 동물로부터 항체를 제조하는 단계; 및 (c) CD39에 결합할 수 있는 단계 (b) 유래 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 임의로, CD39에 결합할 수 있는 선택된 항체를 이후에 정제하여 CD39의 ATPase 활성을 억제하는 능력에 대해 시험한다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의 방법에 따름).
전형적으로, 본 명세서에 제공된 항-CD39 항체는 약 104 내지 약 1011 M-1 (예를 들어, 약 108 내지 약 1010 M-1) 범위의 CD39 폴리펩티드 (예를 들어, 본 명세서의 실시예에서 제조되는 바와 같은 단량체 CD39 폴리펩티드)에 대한 친화성을 갖는다. 예를 들어, 항-CD39 항체는 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 스크린 (예컨대 BIAcore™ SPR 분석 장치에 의한 분석에 의함)으로 결정하여, CD39에 대해서 1 x 10-9 M 미만의 평균 해리 상수 (KD)를 가질 수 있다. 보다 특정한 예시적인 양상에서, 개시 내용은 CD39에 대해서 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-10 M, 또는 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 KD를 갖는 항-CD39 항체를 제공한다.
항체는 예를 들어 약 100, 60, 10, 5, 또는 1 나노몰 이하, 바람직하게 나노몰 이하 (즉, 더 양호한 친화성)의 평균 KD 또는 임의로 약 500, 200, 100 또는 10 피코몰 이하의 평균 평균 KD 를 특징으로 할 수 있다. KD 는 예를 들어 칩 표면 상에 재조합적으로 생성된 인간 CD39 단백질을 고정시키고 나서, 용액 중 시험하려는 항체를 적용하여 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 방법은 (d) 항체 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399와 CD39에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있는 단계 (b)로부터 항체를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
임의의 실시형태의 일 양상에서, 본 발명에 따라서 제조된 항체는 단일클론 항체이다. 다른 양상에서, 본 발명에 따라서 항체를 생성하기 위해 사용되는 인간이외의 동물은 포유동물, 예컨대 설치류, 소과, 돼지류, 가금류, 말, 토끼, 염소 또는 양이다.
CD39 폴리펩티드 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 코딩하는 DNA는 하이브리도마로부터 단리되어서 적절한 숙주로 형질감염을 위한 적절한 발현 벡터에 위치된다. 다음으로 숙주는 항체, 또는 이의 변이체, 예컨대 단일클론 항체의 인간화 버전, 항체의 활성 단편, 항체의 항원 인식 부분을 포함하는 키메라 항체, 또는 검출가능한 모이어티를 포함하는 버전의 제조합 생산에 사용된다.
본 개시 내용의 단일클론 항체, 예를 들어, 항체 I-394를 코딩하는 DNA는 (예를 들어, 쥐과 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 통상의 절차를 사용해 쉽게 단리되어 서열분석될 수 있다. 일 양상에서, 본 명세서의 임의 실시형태의 항-CD39 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산이 제공된다. 단리되면, DNA는 발현 벡터에 위치될 수 있고, 그 다음에 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포를 형질감염시켜서, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 수득한다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 이러한 DNA 서열은 임의의 다수의 목적을 위해서, 예를 들어 항체를 인간화시키기 위해서, 단편 또는 유도체를 생산하기 위해서, 또는 항체의 결합 특이성을 최적화하기 위해, 예를 들어 항원 결합 부위에서, 항체의 서열을 변헝시키기 위해서, 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 (예를 들어, I-394)의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산 서열을 비롯하여, 이러한 핵산을 (예를 들어, 그의 게놈에) 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993)]; 및 [Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992)] 참조).
sCD39 및/또는 memCD39에 결합할 수 있고/있거나, 다른 바람직한 특성을 가질 수 있는 항체가 동정되면, 그들은 또한 전형적으로, 미관련 폴리펩티드를 포함하여, 다른 폴리펩티드에 결합하는 그들 능력에 대해, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 사용해 평가될 것이다. 이상적으로, 항체는 오직 CD39에 대해 실질적인 친화성으로 결합하고, 미관련 폴리펩티드, 또는 NTPDase 패밀리의 다른 폴리펩티드, 특히 CD39-L1, L2, L3 및 L4 또는 NTPDase8과 유의한 수준으로 결합하지 않는다. 그러나, CD39에 대한 친화성이 다른 미관련 폴리펩티드보다 실질적으로 크다면 (예를 들어, 10x, 100x, 500x, 1000x, 10,000x, 또는 그 이상), 그 항체는 본 발명의 방법에서 사용하기 적합하다는 것을 이해할 것이다.
일 실시형태에서, 항-CD39 항체는 인간 Fcγ 수용체, 예를 들어, CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 중 어느 하나 이상에 실질적으로 특이적인 결합을 갖지 않도록 제조될 수 있다. 이러한 항체는 Fcγ 수용체와의 결합이 결여되거나 또는 그 결합이 낮은 것으로 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 불변 영역을 포함하지 않는 (또는 이의 일부분을 포함하는) 항체 단편, 예컨대 F(ab')2 단편은 Fc 수용체 결합을 피하기 위해 사용될 수 있다. Fc 수용체 결합은 BIACORE 어세이에서 Fc 수용체 단백질과 항체의 결합을 시험하는 것을 포함하는, 당분야에 공지된 방법에 따라서 평가될 수 있다. 또한, 일반적으로 임의의 항체 IgG 이소타입은 Fc 수용체와의 결합을 최소화시키거나 또는 제거하기 위해 Fc 부분이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산 치환을 도입시켜서) 변형된 것이 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 개시 내용이 참조로 본 명세서에 편압되는 WO 03/101485 참조). Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 어세이 예컨대 세포 기반 어세이는 당분야에 충분히 공지되어 있고, 예를 들어, WO 03/101485에 기술되어 있다.
일 실시형태에서, 항체는 이펙터 세포와 최소의 상호작용을 갖는 "Fc 침묵" 항체를 야기시키는 Fc 영역 내 하나 이상의 특별한 돌연변이를 포함할 수 있다. 침묵화된 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역 내 돌연변이에 의해 수득될 수 있고 당분야에 공지되어 있다: N297A 돌연변이, LALA 돌연변이, (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20(6):685-691); 및 D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69) 또한 Heusser 등의 WO2012/065950을 참조하고, 이들 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다. 일 실시형태에서, 항체는 힌지 영역에 1, 2, 3 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG1 또는 IgG2이고 잔기 233-236, 임의로 233-238 (EU 번호매김)에 1, 2 또는 3개 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG4이고 잔기 327, 330 및/또는 331 (EU 번호매김)에 1, 2 또는 3개 치환을 포함한다. 침묵 Fc lgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 LALA 돌연변이체이다. Fc 침묵 돌연변이의 다른 예는 예를 들어 DAPA (D265A, P329A) 돌연변이로서 IgG1 항체에서 사용되는 바와 같은 잔기 D265, 또는 D265 및 P329의 돌연변이이다 (US 6,737,056). 다른 lgG1 항체는 잔기 N297에 돌연변이 (예를 들어, N297A, N297S 돌연변이)를 포함하고, 그 결과로 비글리코실화/무글리코실화 항체가 야기된다. 다른 침묵 돌연변이는 잔기 L234 및 G237에서의 치환 (L234A/G237A); S228, L235 및 R409에서의 치환 (S228P/L235E/R409K,T,M,L); 잔기 H268, V309, A330 및 A331 (H268Q/V309L/A330S/A331S)에서의 치환; 잔기 C220, C226, C229 및 P238에서의 치환 (C220S/C226S/C229S/P238S); 잔기 C226, C229, E233, L234 및 L235에서의 치환 (C226S/C229S/E233P/L234V/L235A); 잔기 K322, L235 및 L235에서의 치환 (K322A/L234A/L235A); 잔기 L234, L235 및 P331에서의 치환 (L234F/L235E/P331S); 잔기 234, 235 및 297에서의 치환; 잔기 E318, K320 및 K322에서의 치환 (L235E/E318A/K320A/K322A); 잔기에서의 치환 (V234A, G237A, P238S); 잔기 243 및 264에서의 치환; 잔기 297 및 299에서의 치환; EU 번호매김 체계에 의해 정의되는 잔기 233, 234, 235, 237, 및 238이 PAAAP, PAAAS SAAAS로부터 선택되는 서열을 포함하게 하는 치환 (WO2011/066501 참조)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 Fc 영역에 하나 이상의 특별한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 인간 lgG1 기원의 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 카밧 잔기(들) 234, 235, 237, 330 및/또는 331에 돌연변이를 포함한다. 이러한 Fc 도메인의 일례는 카밧 잔기 L234, L235 및 P331에 치환 (예를 들어, L234A/L235E/P331S 또는 (L234F/L235E/P331S)을 포함한다. 이러한 Fc 도메인의 다른 예는 카밧 잔기 L234, L235, G237 및 P331에 치환 (예를 들어, L234A/L235E/G237A/P331S)을 포함한다. 이러한 Fc 도메인의 다른 예는 카밧 잔기 L234, L235, G237, A330 및 P331에 치환 (예를 들어, L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, 및 P331X3 치환을 포함하는, 임의로 인간 IgG1 이소타입의 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 X1 은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2 은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3 은 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 임의로 X1 은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로 X2 는 글루탐산 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로 X3 은 세린 또는 이의 보존성 치환이다. 다른 실시형태에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, G237X4 치환 및 P331X4 치환을 포함하는, 임의로 인간 IgG1 이소타입의 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 X1 은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2 은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3 은 글리신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X4 는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 임의로 X1 은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로 X2 는 글루탐산 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로, X3 은 알라닌 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로 X4 는 세린 또는 이의 보존성 치환이다. 다른 실시형태에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, G237X4 치환, G330X4 치환, 및 P331X5 치환을 포함하는, 임의로, 인간 IgG1 이소타입의 Fc 도메인을 포함하고, X1 은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2 은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3 은 글리신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X4 는 알라닌 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X5 는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 임의로 X1 은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로 X2 는 글루탐산 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로, X3 은 알라닌 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로, X4 는 세린 또는 이의 보존성 치환이고; 임의로 X5 는 세린 또는 이의 보존성 치환이다. 본 명세서에서 사용되는 속기 표기법에서, 그 형태는 야생형 잔기: 폴리펩티드 내 위치: 돌연변이체 잔기이고, 잔기 위치는 카밧에 따른 EU 번호매김에 따라 표시된다.
일 실시형태에서, 항체는 하기의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 95% 또는 99%가 동일하지만 카밧 위치 234, 235 및 331의 아미노산 잔기 (밑줄표시)는 유지하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
일 실시형태에서, 항체는 하기의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 95% 또는 99%가 동일하지만 카밧 위치 234, 235 및 331의 아미노산 잔기 (밑줄표시)는 유지하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
일 실시형태에서, 항체는 하기의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 95% 또는 99%가 동일하지만 카밧 위치 234, 235, 237, 330 및 331의 아미노산 잔기 (밑줄표시)는 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
일 실시형태에서, 항체는 하기의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 95% 또는 99%가 동일하지만 카밧 위치 234, 235, 237 및 331의 아미노산 잔기 (밑줄표시)는 보유하는 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
Fc 침묵 항체는 그 결과로 전혀 없거나 또는 낮은 ADCC 활성을 초래하는데, 이것은 Fc 침묵 항체가 50% 이하의 특이적 세포 용해인 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 바람직하게 항체는 실질적으로 ADCC 활성이 결여되고, 예를 들어 Fc 침묵 항체는 5% 이하 또는 1% 이하의 ADCC 활성 (특이적 세포 용해)을 나타낸다. Fc 침묵 항체는 또한 CD39-발현의 표면에서 CD39의 FcγR-매개 교차-연결성의 결여를 야기시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 및 409로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 잔기에서 중쇄 불변 영역 내 치환을 갖는다 (중쇄 불변 영역 내 잔기의 번호매김은 카밧에 따른 EU 번호매김에 따름). 일 실시형태에서, 항체는 잔기 234, 235 및 322에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 잔기 234, 235 및 331에 치환을 갖는다. 일 실시형태에서, 항체는 잔기 234, 235, 237 및 331에 치환을 갖는다. 일 실시형태에서, 항체는 잔기 234, 235, 237, 330 및 331에 치환을 갖는다. 일 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 서브타입의 것이다. 아미노산 잔기는 카밧에 따른 EU 번호매김에 따라 표시된다.
일 실시형태에서, 항체는 항체의 생체내 반감기를 증가시키기 위해서 인간 FcRn 폴리펩티드와의 결합을 증가시키는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 예시적인 돌연변이는 [Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691]에 기술되어 있고, 이의 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다. 인간 IgG1 이소타입의 항체에서 사용되는 치환의 예는 잔기 M252, S254 및 T256에서의 치환; 잔기 T250 및 M428에서의 치환; 잔기 N434에서의 치환; 잔기 H433 및 N434에서의 치환; 잔기 T307, E380 및 N434에서의 치환; 잔기 T307, E380, 및 N434에서의 치환; 잔기 M252, S254, T256, H433, N434 및 436에서의 치환; 잔기 I253에서의 치환; 잔기 P257, N434, D376 및 N434에서의 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, 항체는 프로테아제에 의한 절단에 대해 감소된 감도를 부여하는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)는 종양형성과 연관된 가장 중요한 프로테아제 패밀리를 나타낸다. 암세포가 MMP를 발현할 수 있지만, 대량의 세포외 MMP가 종양을 침윤하는 상이한 유형의 기질 세포에 의해 제공되고 각각은 세포외 공간으로 방출되어 종양 주변 환경을 특이적으로 변경시키는, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 특별한 세트를 생산한다. 종양 미세 환경에 존재하는 MMP는 힌지 영역 내에서 항체를 절단시킬 수 있고 그에 따라 종양 부위 내에서 기능하도록 디자인된 치료 항체의 불활성화를 초래할 수 있다. 일 실시형태에서, 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인은 GluV8, IdeS, 젤라티나제 A (MMP2), 젤라티나제 B (MMP-9), 매트릭스 메탈로프로테아제-7 (MMP-7), 스트로멜리신 (MMP-3), 및 마크로파지 엘라스타제 (MMP-12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나, 2개, 3개 또는 그 이상 (또는 전부)에 의한 절단에 대해 감소된 감도를 갖는다. 일 실시형태에서, 절단에 대한 감도가 감소된 항체는 잔기 E233-L234 및/또는 L235에 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 잔기 E233, L234, L235 및 G236에 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 E233-L234-L235-G236 서열이 P233-V234-A235에 의해 치환 (G236은 결실됨)되도록, 하나 이상의 잔기 233-238에 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, WO99/58572 및 WO2012087746을 참조하고, 이의 개시 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다.
항원-결합 화합물은 임의의 바람직한 단계에서 이의 CD39의 효소 활성을 억제하는 능력, 특히 sCD39의 ATPase 활성을 차단하는 능력 및 가용성 CD39 단백질 및 임의로 추가로 CD39-발현 세포에 의해 ADP 및 AMP (및 CD73과 함께, 아데노신)의 생성을 감소시키는 능력, 및 이후에 림프구의 활성을 복구시키고/시키거나 림프구의 아데노신-매개 억제를 경감시키는 능력에 대해 평가될 수 있다.
항체의 억제 활성 (예를 들어, 면역 증강 잠재성)은 예를 들어 ATP의 소멸 (가수분해) 및/또는 AMP의 발생을 검출하기 위한 어세이에서 평가될 수 있다.
가용성 재조합 인간 CD39 단백질을 억제하는 항체의 능력은 시험 항체를 가용성 CD39 단백질 (예를 들어, 실시예, 방법에서 생성되는 바와 같고, 임의로 정제 태그 또는 다른 기능성 또는 비기능성 비-CD39-유래 아미노산 서열을 더 포함하는, SEQ ID NO 44 또는 45의 아미노산 서열을 갖는 단백질)와 인큐베이션시킨 이후에 ATP를 검출하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 실시예 방법을 참조한다. 간략하게, ATP는 용량 범위의 시험 항체를 실시예 1에 기술된 가용성 재조합 인간 CD39 단백질과 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키는 어세이에서 Cell Titer Glo™ (Promega)을 사용하여 정량할 수 있다. 20 μM ATP는 CTG 시약의 첨가 전에 37℃에서 추가 30분 동안 플레이트에 첨가된다. 발광된 빛은 암실에서 5분의 짧은 인큐베이션 기간 이후에 Enspire™ 광도계를 사용하여 정량된다.
CD39 단백질을 발현하는 세포를 억제하는 항체의 능력은 시험 항체를 세포 (예를 들어, Ramos 세포, CD39로 형질감염된 세포 등)와 인큐베이션한 이후 ATP를 검출하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 실시예, 방법을 참조한다. 세포는 1시간 동안 37℃에서 시험 항체와 인큐베이션될 수 있다. 그 다음으로 세포는 20 μM ATP와 추가 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다. 플레이트를 2분 동안 400g에서 원심분리시키고 세포 상청액을 발광 마이크로플레이트 (흰색 웰)로 옮긴다. CTG를 상청액에 첨가하고 발광되는 빛은 Enspire™ 광도계를 사용하여 암실에서 5분간 인큐베이션 후에 정량된다. 항-CD39 항체 효율은 항체 존재 하에서 발광되는 빛을 ATP 단독의 경우 (최대 발광) 및 ATP와 세포 함께인 경우 (최소 발광)와 비교하여 결정된다.
항체의 존재 하에서, ATP에서 AMP로의 가수분해의 감소, 및/또는 ATP의 증가 ATP 및/또는 AMP의 발생 감소는 항체가 CD39를 억제한다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 항체 조제물은 세포에 의해 발현되는 CD39 폴리펩티드의 효소 활성의 적어도 60% 감소를 야기시킬 수 있고, 바람직하게 항체는 실시예, 방법처럼, CD39 폴리펩티드를 발현하는 세포 (예를 들어, Ramos 세포)를 시험 항체와 인큐베이션한 후 Cell Titer Glo™ (Promega)을 사용하여 ATP를 검출하여 평가시에, 세포에서 CD39 폴리펩티드의 효소 활성의 적어도 70%, 80% 또는 90%의 감소를 야기시킨다.
일 실시형태에서, 항체 조제물은 (예를 들어, 세포의 부재 하에서) 가용성 재조합 CD39 폴리펩티드의 효소 활성의 적어도 60%의 감소를 야기시킬 수 있고, 바람직하게 예를 들어, 실시예, 방법처럼, 가용성 재조합 CD39 폴리펩티드를 시험 항체와 인큐베이션한 후 Cell Titer Glo™ (Promega)을 사용하여 ATP를 검출하여 평가시, 가용성 재조합 CD39 폴리펩티드의 효소 활성의 적어도 70%, 80% 또는 90% 감소를 야기시킬 수 있다.
항체의 활성은 또한 이의 면역 세포 (예를 들어, 아데노신 수용체-발현 면역 세포; A2A-수용체 발현 세포)의 활성을 조정하는 능력, 예를 들어, 림프구 활성의 아데노신-매개 억제를 경감시키거나, 또는 림프구 활성의 활성화를 야기시키는 능력에 대해 간접적 어세이에서 측정될 수 있다. 이것은 예를 들어 사이토카인-방출 어세이를 사용해 처리될 수 있다. 다른 예에서, 항체는 이의 림프구의 증식을 조정하는 능력에 대해 간접적인 어세이에서 평가될 수 있다.
일례에서, 항-CD39 항체 또는 항원 결합 도메인을 제조하거나 또는 동정하기 위한 방법이 제공되고, 이 방법은
(a) 인간 CD39 폴리펩티드에 결합하는 항체를 포함하는 다수의 샘플 (예를 들어, 세포 배양 상청액, 하이브리도마 상청액)을 제공하는 단계,
(b) 샘플에 대해서 각각 정제된 단일클론 항체를 포함하는 다수의 샘플을 수득하기 위해 정제 단계를 수행하고, 각각의 항체 샘플을 (예를 들어, 세포의 부재 하에서) 가용성 세포외 도메인 CD39 단백질과 접촉시키고 이의 ATPase 활성의 중화를 평가하는 단계, 및
(c) ATPase 활성의 중화를 야기시키는 단계 (b)의 항체를 선택하는 단계, 임의로 적어도 70%, 임의로 80% 또는 임의로 90%의 중화를 야기시키는 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 단계 (a)는 하나 이상의 인간이외의 포유동물(들)을 CD39 폴리펩티드로 면역화시키는 단계, 및 인간 CD39 폴리펩티드에 결합하는 항체를 포함하는 다수 샘플을 이러한 포유동물(들)로부터 수득하는 단계를 포함한다.
일례에서, 항-CD39 항체 또는 항원 결합 도메인를 제조하거나 또는 동정하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은
(a) 인간 CD39 폴리펩티드에 결합하는 다수의 정제된 항체를 제공하는 단계,
(b) 각각의 항체를 가용성 세포외 도메인 CD39 단백질과 접촉시키고 이의 ATPase 활성의 중화를 평가하는 단계, 및
(c) ATPase 활성의 중화를 적어도 70%, 임의로 80% 또는 임의로 90% 만큼 야기시키는 단계 (b)의 항체를 선택하는 단계
를 포함한다.
임의로, 방법은
(d) 각각의 항체를 CD39-발현 세포, 임의로 인간 B 세포, 임의로 Ramos 인간 림프종 세포와 접촉시키고 ATPase 활성의 중화를 평가하는 단계; 및
(e) 적어도 70%, 임의로 80% 또는 임의로 90% 만큼 ATPase 활성의 감소를 야기시키는 단계 (d)의 항체를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (b) 및 (c)는 단계 (d) 및 (e) 이전 또는 이후에 수행될 수 있다.
CD39 상의 에피토프
일 양상에서, 항체는 세포 표면에서 발현되는 CD39 상에 존재하는 항원성 결정부에 결합된다.
일 양상에서, 항체는 항체 I-394, I-395, I-396, I-397 또는 I-398와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항체는 항체 I-394, I-395, I-396, I-397 또는 I-398에 의해 결합되는 에피토프와 적어도 부분적으로 중복되거나, 또는 그 에피토프의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 CD39의 에피토프에 결합한다. 항체에 의해 결합되는 잔기는 CD39 폴리펩티드의 표면 상에, 예를 들어, 세포의 표면 상에 발현되는 CD39 폴리펩티드에 존재하는 것으로 명시될 수 있다.
CD39 돌연변이체에 의해 형질감염된 세포에 대한 항-CD39 항체의 결합을 측정할 수 있고 야생형 CD39 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO: 1)에 결합하는 항-CD39 항체의 능력과 비교될 수 있다. 항-CD39 항체 및 돌연변이체 CD39 폴리펩티드 (예를 들어, 표 1의 돌연변이체) 간 결합의 감소는 결합 친화성의 감소 (예를 들어, 특정한 돌연변이체를 발현하는 세포의 FACS 시험과 같은 기지의 방법에 의해서, 또는 돌연변이체 폴리펩티드와의 결합의 Biacore 시험에 의해 측정시) 및/또는 항-CD39 항체의 전체 결합 능력의 감소 (예를 들어, 폴리펩티드 농도에 대한 항-CD39 항체 농도의 그래프에서 Bmax의 감소로 입증되는 바와 같음)가 존재한다는 것을 의미한다. 결합의 유의한 감소는 돌연변이된 잔기가 항-CD39 항체와의 결합에 직접적으로 관여되거나 또는 항-CD39 항체가 CD39와 결합시 결합 단백질에 가까이 근접해 있다는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 결합의 유의한 감소는 항-CD39 항체 및 돌연변이체 CD39 폴리펩티드 간 결합 친화성 및/또는 능력이 항체 및 야생형 CD39 폴리펩티드간 결합에 비해서 40% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과로 감소된다는 것을 의미한다. 일정한 실시형태에서, 결합은 검출 한계치 미만으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 결합의 유의한 감소는 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대한 항-CD39 항체의 결합이 항-CD39 항체와 야생형 CD39 폴리펩티드 간에 관찰된 결합의 50% 미만 (예를 들어, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만)일 때 입증된다.
일부 실시형태에서, 항체 I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 또는 I-399에 의해 결합되는 아미노산 잔기를 포함하는 절편의 잔기가 상이한 아미노산으로 치환된 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대해서, 그러한 치환(들)을 포함하지 않는 야생형 CD39 폴리펩티드 (예를 들어, SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드)와의 결합과 비교하여, 유의하게 낮아진 결합을 보이는 항-CD39 항체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 항-CD39 항체 (예를 들어, I-394 이외)는 항체 I-394에 의해 결합되는 CD39 상의 에피토프에 결합되는 것이 제공된다.
본 명세서의 임의의 실시형태에서, 항체는 참조로 그 개시 내용이 본 명세서에 편입되는 PCT 공개 특허 출원 번호 WO2009/095478에서 참조되는 BY40, BY12 또는 BA54g (또는 이의 CDR을 공유하는 항체) 이외의 항체로서 특징될 수 있다.
일 양상에서, 항-CD39 항체는 Q96, N99, E143 및 R147 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기에 돌연변이를 갖는 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합을 갖고; 임의로, 돌연변이체 CD39 폴리펩티드는 돌연변이: Q96A, N99A, E143A 및 R147E를 갖는다. 일 양상에서, 항-CD39 항체는 Q96, N99, E143 및 R147 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 잔기)를 포함하는 CD39 상의 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, 항체는 각 경우에 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 CD39 폴리펩티드와 항체 간 결합에 비해서, R138, M139 및 E142 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 (또는 전체)의 잔기에서 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 항체는 각 경우에 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 CD39 폴리펩티드 및 항체 간 결합과 비교하여, K87, E100 및 D107 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 (또는 전부)의 잔기에서 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
일 실시형태에서, 항체는 각 경우에 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 CD39 폴리펩티드 및 항체 간 결합에 비해서, N371, L372, E375, K376 및 V377 (SEQ ID NO: 1 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 (또는 전부)의 잔기에서 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 CD39 폴리펩티드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
예시적인 항체 가변 영역 서열
본 개시 내용에 따른 예시적인 항-CD39 VH 및 VL 쌍은 항체 I-394의 것으로서, 이의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기에 열거되어 있고 (SEQ ID NO: 6), 이의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열도 하기에 열거되어 있다 (SEQ ID NO: 7). 카밧 번호매김에 따른 CDR은 SEQ ID NO: 6 및 7에서 밑줄표시되어 있다. 임의로, VH 및 VL은 인간 억셉터 프레임워크를 포함한다 (예를 들어, 이를 도입하도록 변형됨). 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 VH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3(예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함하는 VL을 포함한다.
항-CD39 항체는 예를 들어 아미노산 서열: DYNMH (SEQ ID NO: 8), 또는 이의 적어도 4개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상의 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR1; 아미노산 서열: YIVPLNGGSTFNQKFKG (SEQ ID NO: 9), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상의 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR2; 아미노산 서열: GGTRFAY (SEQ ID NO: 10), 또는 이의 적어도 4, 5 또는 6개의 인접한 아미노산을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR3; 아미노산 서열: RASESVDNFGVSFMY (SEQ ID NO: 11), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR1; 아미노산 서열: GASNQGS (SEQ ID NO: 12) 또는 이의 적어도 4, 5 또는 6개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR2 영역; 및/또는 아미노산 서열: QQTKEVPYT (SEQ ID NO: 13), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있거나 또는 결실될 수 있는 것인 I-394의 LCDR3 영역을 포함할 수 있다. CDR 위치는 카밧 번호매김에 따를 수 있다.
본 개시 내용에 따른 다른 예시적인 항-CD39 VH 및 VL 쌍은 항체 I-395의 것으로서, 이의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기에 열거되어 있고 (SEQ ID NO: 14), 이의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기에 열거되어 있다 (SEQ ID NO: 15). 카밧 번호매김에 따른 CDR은 SEQ ID NO: 14 및 15에 밑줄표시되어 있다. 임의로, VH 및 VL은 인간 억셉터 프레임워크를 포함한다 (예를 들어, 그를 포함하도록 변형됨). 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 VH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
항-CD39 항체는 예를 들어, 아미노산 서열: DYNMH (SEQ ID NO: 16), 또는 이의 적어도 4개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상의 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 것인 HCDR1; 아미노산 서열: YINPNNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 17), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 것인 HCDR2; 아미노산 서열: GGTRFAS (SEQ ID NO: 18), 또는 이의 적어도 4, 5, 6개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 것인 HCDR3; 아미노산 서열: RASESVDNYGISFMY (SEQ ID NO: 19), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR1; 아미노산 서열: AASTQGS (SEQ ID NO: 20) 또는 이의 적어도 4, 5 또는 6개의 인접한 아미노산을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 것인 LCDR2 영역; 및/또는 아미노산 서열: QQSKEVPFT (SEQ ID NO: 21), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있거나 또는 결실될 수 있는 것인 I-396의 LCDR3 영역을 포함할 수 있다. CDR 위치는 카밧 번호매김에 따를 수 있다.
본 개시 내용에 따른 다른 예시적인 항-CD39 VH 및 VL 쌍은 항체 I-396의 것이고, 이의 중쇄 가변 영역의 아미노산은 하기에 열거되어 있고 (SEQ ID NO: 22), 이의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열도 하기에 열거되어 있다 (SEQ ID NO: 23). 카밧 번호매김에 따른 CDR은 SEQ ID NO: 22 및 23에서 밑줄표시되어 있다. 임의로, VH 및 VL은 인간 억셉터 프레임워크를 포함한다 (예를 들어, 그를 도입하도록 변형됨). 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 VH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
항-CD39 항체는 예를 들어 아미노산 서열: DTYIN (SEQ ID NO: 24), 또는 이의 적어도 4개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR1; 아미노산 서열: RIDPANGNTKYDPKFQG (SEQ ID NO: 25), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR2; 아미노산 서열: WGYDDEEADYFDS (SEQ ID NO: 26), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR3; 아미노산 서열: RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 27), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR1; 아미노산 서열: AASNQGS (SEQ ID NO: 28) 또는 이의 적어도 4, 5 또는 6개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR2 영역; 및/또는 아미노산 서열: HQSKEVPWT (SEQ ID NO: 29), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있거나 또는 결실될 수 있는 것인 I-396의 LCDR3 영역을 포함할 수 있다. CDR 위치는 카밧 번호매김에 따를 수 있다.
본 개시 내용에 따른 다른 예시적인 항-CD39 VH 및 VL 쌍은 항체 I-399의 것이고, 이의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기에 열거되어 있고 (SEQ ID NO: 30), 이의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열도 하기에 열거되어 있다 (SEQ ID NO: 31). 카밧 번호매김에 따른 CDR은 SEQ ID NO: 30 및 31에서 밑줄표시되어 있다. 임의로, VH 및 VL은 인간 억셉터 프레임워크를 포함한다 (예를 들어, 그를 도입하도록 변형됨). 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 VH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따름)을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 카밧 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
항-CD39 항체는 예를 들어 아미노산 서열: SFWMN (SEQ ID NO: 32), 또는 이의 적어도 4개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR1; 아미노산 서열: EIDPSDFYTNSNQRFKG (SEQ ID NO: 33), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR2; 아미노산 서열: GDFGWYFDV (SEQ ID NO: 34), 또는 이의 적어도 4, 5 또는 6개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 HCDR3; 아미노산 서열: SASSSINSNYLH (SEQ ID NO: 35), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR1; 아미노산 서열: RTSNLAS (SEQ ID NO: 36) 또는 이의 적어도 4, 5 또는 6개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 것인 LCDR2 영역; 및/또는 아미노산 서열: QQGSSLPRT (SEQ ID NO: 37), 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하고, 임의로 이들 아미노산 중 하나 이상의 상이한 아미노산으로 치환될 수 있거나 또는 결실될 수 있는 것인 I-399의 LCDR3 영역을 포함할 수 있다. CDR 위치는 카밧 번호매김에 따를 수 있다.
임의의 I-394, I-395, I-396 및 I-399 항체에서, HCDR1, 2, 3 및 LCDR1, 2, 3 서열 (각각 CDR 독립적이거나, 또는 모든 CDR)은 카밧 번호매김 체계 (밑줄표시로 VH 및 VL 서열에 표시된 바와 같음)의 것, 코티아 번호매김 체계의 것, 또는 IMGT 번호매김 체계의 것, 또는 임의의 다른 적합한 번호매김 체계의 것이라고 명시될 수 있다.
임의 양상에서, 명시된 가변 영역, FR 및/또는 CDR 서열은 하나 이상의 서열 변형, 예를 들어, 치환 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 서열 변형)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 치환은 보존성 변형이다.
다른 양상에서, 항-CD39 화합물은 SEQ ID NO: 6의 VH 도메인과 적어도 약 60%, 70% 또는 80%의 서열 동일성, 임의로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 다른 양상에서, 항-CD39 항체는 SEQ ID NO: 7의 VL 도메인과 적어도 약 60%, 70% 또는 80%의 서열 동일성, 임의로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
항체의 단편 및 유도체 (이 용어는 달리 명시하거나 문맥에서 명확하게 반박하지 않으면, 본 출원에서 사용시 용어 "항체" 또는 "항체들"에 포괄됨)는 당분야에 공지된 기술로 제조될 수 있다. "단편"은 온전한 항체의 일부분, 일반적으로 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 제한없이 (1) 단일 사슬 Fv 분자 (2) 회합된 중쇄 모이어티없이, 오직 하나의 경쇄 가변 도메인, 또는 경쇄 가변 도메인의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드 및 (3) 회합된 경쇄 모이어티없이, 오직 하나의 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드를 포함하는, 인접한 아미노산 잔기의 하나의 미개재 서열로 이루어진 1차 구조를 갖는 폴리펩티드인 임의의 항체 단편 (본 명세서에서는 "단일 사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩티드"라고 함); 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 포함한다. 특히, 나노바디, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 또는 "dAb"를 포함한다.
일정한 실시형태에서, 항체를 생산하는 하이브리도마의 DNA는 발현 벡터로의 삽입 이전에, 예를 들어 상동성 비인간 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환시키거나 (예를 들어, [Morrison et al., PNAS pp. 6851 (1984)] 참조), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부분을 면역글로불린 코딩 서열과 공유적으로 연결시켜서 변형될 수 있다. 그러한 방식으로, "키메라" 또는 "하이브리드" 항체는 본래 항체의 결합 특이성을 갖는 것이 제조된다. 전형적으로, 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 치환한다.
임의로 항체는 인간화된다. 항체의 "인간화" 형태는 쥐과 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F (ab') 2, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수령체의 상보성-결정 영역 (CDR) 유래 잔기가 본래 항체의 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 유지하면서 본래 항체 (도너 항체)의 CDR 유래의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다.
일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 치환될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체는 수령체 항체 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개량하고 최적화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하게 될 것이고, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 본래 항체의 것에 상응하고 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 또한 최적으로 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린 것의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 보다 상세하게 문헌 [Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986)]; [Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988)]; [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992)]; [Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534]; 및 미국 특허 제4,816,567호를 참조하고, 이들 개시 내용의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 항체를 인간화시키기 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다.
인간화 항체를 만들기 위해, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적합 (best-fit)" 방법에 따라서, 항체의 가변 도메인의 서열은 기지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 마우스의 것에 가장 가까운 인간 서열이 이후 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 서브그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열 유래의 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).
CD39에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한가지 방법에 따라서, 인간화 항체는 부모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념 인간화 생성물의 분석 과정을 통해서 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 입수가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 입수가능하다. 이들 디스플레이의 검토는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 공통 서열로부터 선택하여 조합할 수 있고 바람직한 항체 특징을 획득하도록 서열을 유입시킬 수 있다.
"인간화" 단일클론 항체를 제조하는 다른 방법은 면역화를 위해 사용된 마우스로서 XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA)를 사용하는 것이다. XenoMouse는 이의 면역글로불린 유전자가 기능성 인간 면역글로불린 유전자로 치환된 것인 쥐과 숙주이다. 따라서, 이러한 마우스 또는 이 마우스의 B 세포로부터 만들어진 하이브리도마에 의해 생성되는 항체는 이미 인간화된 것이다. XenoMouse는 미국 특허 제6,162,963호에 기술되어 있고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
인간 항체는 또한 다양한 다른 기술에 따라서, 예컨대 면역화를 위해서, 인간 항체 레파토리를 발현하도록 조작된 다른 유전자이식 동물 (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255)을 사용하거나, 또는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 항체 레파토리로부터 선택하여 생성될 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있고 본 출원에 개시된 바와 같이 단일클론 항체로부터 출발하여 실시할 수 있다.
항-CD39 항체는 1 mg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 포함되는 약학 제제에 도입될 수 있고, 상기 제제는 2.0 내지 10.0의 pH를 갖는다. 제제는 완충제, 보존제(들), 등장화제(들), 킬레이트화제(들), 안정화제 및 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 약학 제제는 수성 제제이고, 즉 물을 포함하는 제제이다. 이러한 제제는 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가 실시형태에서, 약학 제제는 수성 용액이다. 용어 "수성 제제"는 적어도 50 %w/w의 물을 포함하는 제제로서 정의된다. 유사하게, 용어 "수성 용액"은 적어도 50 %w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50 %w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
다른 실시형태에서, 약학 제제는 냉동-건조 제제이고, 의사 또는 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.
다른 실시형태에서, 약학 제제는 임의의 사전 용해없이 사용 준비된 건조 제제 (예를 들어, 냉동-건조 또는 분무-건조)이다.
추가의 양상에서, 약학 제제는 이러한 항체 및 완충제의 수성 용액을 포함하고, 여기서 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 제제는 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 갖는다.
다른 실시형태에서, 제제의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0, 및 약 5.5 내지 약 7.5로 이루어진 목록에서 선택되는 범위로 존재한다.
추가 실시형태에서, 완충제는 소듐 아세테이트, 소듐 카보네이트, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 비신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 특별한 완충제의 각각의 하나가 대안적인 실시형태를 구성한다.
추가 실시형태에서, 제제는 약학적으로 허용가능한 보존제를 더 포함한다. 추가 실시형태에서, 제제는 등장화제를 더 포함한다. 추가 실시형태에서, 제제는 또한 킬레이트화제를 포함한다. 추가 실시형태에서 제제는 안정화제를 더 포함한다. 추가 실시형태에서, 제제는 계면활성제를 더 포함한다. 편의를 위해 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.
다른 성분들이 펩티드 약학 제제에 존재하는 것이 가능하다. 이러한 추가의 성분은 습윤제, 유화제, 항산화제, 증량제, 등장성 개질제, 킬레이트화제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔위터이온 (예를 들어, 아미노산 예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘)을 포함할 수 있다. 물론, 이러한 추가 성분은 약학 제제의 전체 안정성에 부정적으로 영향을 미쳐서는 안된다.
항체를 함유하는 약학 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 부위에서, 예를 들어 국소 부위에서, 예를 들어 피부 및 점막 부위에서, 흡수를 회피하는 부위에서, 예를 들어, 동맥내, 정맥내, 심장내에서의 투여, 및 흡수를 포함하는 부위, 예를 들어, 피부내, 피부하, 근육 내 또는 복부 내의 투여로 투여될 수 있다. 약학 조성물의 투여는 몇몇 투여 경로를 통해서, 예를 들어 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 혀, 설하, 구강, 입, 경구, 위 및 장, 코, 폐, 예를 들어, 세기관지 및 폐포를 통해서 또는 이의 조합을 통해서, 상피, 진피, 경피, 질, 직장, 눈, 예를 들어, 결막을 통해서, 뇨관 및 비경구를 통해서 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
적합한 항체 제제는 또한 이미 개발된 다른 치료적 단일클론 항체에 대한 경험을 조사하여 결정할 수 있다. 몇몇 단일클론 항체가 임상적 상황에서 효율적인 것으로 확인되었는데, 예컨대 리툭산 (리툭시맙), 허셉틴 (트라스투주맙), 졸레어 (오말리주맙), 벡사 (토시투모맙), 캄파트 (알렘투주맙), 제발린, 온코림 및 유사한 제제가 항체와 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 9.0 mg/mL 소듐 클로라이드, 7.35 mg/mL 소듐 시트레이트 이수화물, 0.7 mg/mL 폴리솔베이트 80, 및 주사용 멸균수에 IV 투여용으로 제제화된, 100 mg (10 mL) 또는 500 mg (50 mL)의 1회 사용 바이알 중에 10 mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다. 다른 실시형태에서, 항체는 약 20 mM Na-시트레이트, 약 150 mM NaCl를 포함하는 약 6.0의 pH의 제제로 공급된다.
질환의 진단 및 치료
본 명세서에 기술된 바와 같은 항-CD39 항체를 사용하여, 개체, 특히 인간 개체를 치료하기 위한 방법이 또한 제공된다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용은 인간 환자에게 투여를 위한 약학 조성물의 제조에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 용도를 제공한다. 전형적으로, 개체는 암 또는 감염성 질환 (예를 들어, 바이러스 감염, 박테리아 감염)을 앓거나, 또는 그에 대한 위험성이 있다. 일 실시형태에서, 개체는 순환계 및/또는 조직 샘플 (예를 들어, 종양 또는 종양-인접 조직 샘플)에 검출가능한 가용성 (세포외) CD39 단백질을 갖는다.
예를 들어, 일 양상에서, 림프구의 활성 복원 또는 강화를 필요로 하는 개체에서 림프구의 활성을 복원시키거나 또는 강화시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 개체에게 본 개시 내용의 중화성 항-CD39 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 항체는 CD39-L1, L2, L3 및/또는 L4와 결합하지 않고, 임의로 실질적으로 인간 CD16에 의해 결합되지 않고 (그리고 임의로 다른 인간 Fcγ 수용체 예컨대 CD32a, CD32b 또는 CD64에 의해 더 결합되지 않고), "혈관" CD39의 가용성 및 막 형태에 특이적으로 결합하여 이의 ATPase 활성을 중화시키는 인간 또는 인간화 항-CD39 항체일 수 있다. 이러한 항체는 혈관 CD39 이외의 이소폼에서의 결합 결여에 기인하여 원치않는 부작용 또는 독성이 감소될 것이고, 혈관구조 내 CD39-발현 내피 세포에 대한 고갈 또는 다른 Fc-매개 효과로 인한 원치않는 부작용 또는 독성이 감소될 수 있다.
일 실시형태에서, 이 방법은 증가된 림프구 활성이 유리하거나 또는 면역억제, 면역억제성 세포, 또는, 예를 들어, CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포에 의해 발생되는 아데노신에 의해 야기되거나 또는 그를 특징으로 하는 질환을 갖는 개체에서 림프구 (예를 들어, T 세포)의 활성을 증가시키도록 유도한다. 방법은 예를 들어 종양 미세환경 (및 그 안에서 CD39-매개 아데노신 생성)이 면역계에 의한 인식 결여 (면역 회피)에 기인하는 것으로 의심되는 고형 종양을 갖는 개체를 치료하는데 특히 유용할 것이다. 종양 환경 (종양 조직 또는 종양 인접 조직)은 예를 들어 CD39-발현 면역 세포, 예를 들어, CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포의 존재를 특징으로 할 수 있다.
보다 특히, 방법 및 조성물은 다양한 암 및 다른 증식성 질환, 및 감염성 질환의 치료를 위해 이용된다. 이들 방법은 림프구의 항-표적 세포 (예를 들어, 항-종양) 활성을 억제하는 아데노신을 감소시키고 가능하게 추가적으로 림프구의 항종양 활성을 증가시킬 수 있는 ATP를 증가시켜서 작동하기 때문에, 그들은 매우 광범위한 암 및 감염성 질환에 적용가능하다. 일 실시형태에서, 항-CD39 조성물은 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는, 예를 들어, PD-1 및 PD-L1 간 상호작용을 억제하는 작용제에 의한 치료에 약한 반응자 (또는 불감성)인 개체에서 암을 치료하는데 유용하다. 치료할 수 있는 암의 대표적인 예는 특히 종양 미세환경 내 아데노신이 항-종양 면역 반응을 억제하는데 강력한 역할을 할 수 있는 특정한 고형 종양을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체로 치료되는 인간 환자는 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)을 포함하는 두경부의 암, 유방암, 폐암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 거세 내성 전립선암 (CRPC), 골수종, 자궁암, 결장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 뇨관의 암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관생성, 척추축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평세포 암, 석면에 의해 유도된 것을 포함한 환경적으로 유도된 암, 예를 들어, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종/원발성 종격 B-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역아세포 큰 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 외투세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병, 균상 식균종, 역형성 큰세포 림프종, T-세포 림프종, 및 전구체 T-림프아구성 림프종을 포함하는 조혈 악성종, 및 상기 암의 임의 조합을 갖는다. 본 개시 내용은 또한 전이성 암의 치료에 적용가능하다. 환자는 치료 전, 그 동안 또는 그 이후에 상기 기술된 임상적 속성 중 하나 이상에 대해 시험될 수 있거나 또는 선택될 수 있다.
일 실시형태에서 항-CD39 항체는 예를 들어, 순환계 및/또는 조직, 예를 들어 종양 또는 종양 인접 조직에서 검출가능하고/하거나 상승된 수준의 가용성 (세포외) CD39 단백질을 특징으로 하는 암의 치료에서 사용된다.
일 실시형태에서 항-CD39 항체는 CD39를 발현하는 악성 세포를 특징으로 하는 암의 치료에서 사용된다.
일 실시형태에서, 항-CD39 항체는 CD39, 임의로 sCD39, 임의로 memCD39의 효소 활성의 중화를 위해서, 적어도 EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 의 혈핵 농도를 개체에서 (예를 들어, 1, 2, 3, 4주 동안, 및/또는 항원 결합 화합물의 후속 투여까지) 획득하고/하거나 유지하는데 유효한 양으로 투여된다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체의 활성량은 개체의 혈관외 조직에서, CD39, 임의로 sCD39, 임의로 memCD39의 효소 활성의 중화를 위해, EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 을 획득하는데 유효한 양이다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체의 활성량은 CD39, 임의로 sCD39, 임의로 memCD39의 효소 활성의 중화의 억제를 위해, EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 을 개체에서 획득 (또는 유지)하는데 유효한 양이다.
임의로, 일 실시형태에서, (예를 들어, 수용체 포화를 제공하는 것과 동일하거나 또는 실질적으로 낮은 농도에서 완전한 효능을 제공할 수 있는) ADCC에 의한 CD39-발현 종양 세포의 고갈을 유도하는 일부 항체와 대조적으로, 항-CD39 항체는 실질적인 Fcγ 수용체-매개 활성을 나타내지 않고, 바람직한 기간, 예를 들어, 1주, 2주, 1개월 동안, 항-CD39 항체의 다음 연속 투여까지, CD39 발현의 하향-조정을 실질적으로 야기하지 않고, 임의로 추가의 CD39의 효소 활성을 중화시키는데 유효한 양으로 투여된다.
일 실시형태에서, 항-CD39 항체는 ATP의 AMP로의 CD39-매개 이화작용의 억제를 위해서, (예를 들어, sCD39의 ATPase 활성의 중화를 평가하거나; 가용성 (세포외) CD39 단백질의 ATPase 활성의 중화를 평가하여, 실시예 5 참조) 적어도 EC50, 임의로 EC70, 임의로 실질적으로 EC100 의 혈액 농도를 개체에서 (예를 들어, 1, 2, 3, 4주 동안 및/또는 항-CD39 항체의 후속 투여까지) 획득 및/또는 유지하는데 유효한 양으로 투여된다.
일 실시형태에서, 개체에서 암을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 질환을 갖는 개체에게 항-CD39 항체를, (예를 들어, PBMC에서 평가시) 순환계에서 50%, 70%, 또는 완전한 (예를 들어, 90%) 수용체 포화 CD39-발현 세포에 요구되는 농도보다 더 높은, 순환계, 임의로 관심 혈관외 조직 (예를 들어, 종양 또는 종양 환경) 중 농도를 명시된 기간 동안 획득하거나 또는 유지하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 임의로 획득된 농도는 명시된 수용체 포화에 요구되는 농도보다 적어도 20%, 50% 또는 100% 더 높다.
일 실시형태에서, 개체에서 암을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 개체에게 항-CD39 항체를, (예를 들어, CD39-발현 세포, 예를 들어 실시예, 방법처럼 Ramos 세포 상에서 항-CD39 항체를 적정하여, 유세포측정법으로 평가시) CD39-발현 세포와의 결합에 대해 EC50, 임의로 EC70 또는 임의로 EC100 보다 더 높은, 순환계, 임의로 관심 혈관외 조직 (예를 들어, 종양 또는 종양 환경) 중 농도를 명시된 기간 동안 획득하거나 또는 유지하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 임의로 획득된 농도는 CD39-발현 세포와의 결합에 대해서, EC50, 임의로 EC70 또는 임의로 EC100 보다 적어도 20%, 50% 또는 100% 더 높다.
EC50, EC70 또는 EC100 은 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이 CD39의 효소 활성의 중화, 예를 들어 B 세포에서 ATPase 활성의 중화에 대해서 ATP에서 AMP (또는 ATP에서 하류 아데노신)로의 가수분해를 정량하여, 예를 들어 세포 어세이에서 평가될 수 있다. 실시예, 방법을 참조한다. CD39의 효소 활성의 중화와 관련하여 "EC50"은 효소 활성의 중화와 관련하여 이의 최대 반응 또는 효과의 50%를 생성시키는 항-CD39 항체의 효율적인 농도를 의미한다. CD39의 효소 활성의 중화와 관련하여 "EC70"은 이의 최대 반응 또는 효과의 70%를 생성하는 항-CD39 항체의 효율적인 농도를 의미한다. CD39의 효소 활성의 중화와 관련하여 "EC100"은 효소 활성의 이러한 중화와 관련하여 이의 실질적으로 최대 반응 또는 효과를 생성시키는 항-CD39 항체의 효율적인 농도를 의미한다.
일부 실시형태에서, 특히 고형 종양의 치료를 위해서, 획득되는 농도는 효소 활성의 중화에 대해 적어도 EC50 또는 EC70, 임의로 약, 또는 적어도 약 EC100 에 상응하는 조직 (혈관 외부, 예를 들어 종양 또는 종양 환경) 내 농도를 야기하도록 디자인된다
일 실시형태에서, 항-CD39 항체의 양은 1 내지 20 mg/체중kg이다. 일 실시형태에서, 그 양은 개체에게, 매주, 2주마다, 1개월 마다 또는 2개월 마다 투여된다.
일 실시형태에서 암을 갖는 인간 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 개체에게 적어도 1회의 투여 주기 (임의로 적어도 2, 3, 4회 또는 그 이상의 투여 주기) 동안 본 개시 내용의 항-CD39 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 주기는 8주 이하의 기간이고, 적어도 1회 주기의 각각의 경우에, 항-CD39 항체의 1, 2, 3 또는 4회 용량이 1 내지 20 mg/체중kg의 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체는 정맥내 주입으로 투여된다.
인간을 치료하기 위한 적합한 치료 프로토콜은 예를 들어, 항-CD39 항체의 본 명세서에 개시된 바와 같인 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 방법은 항-CD39 항체의 적어도 1회 용량이 투여되는 적어도 1회의 투여 주기를 포함한다. 임의로, 항- CD39 항체의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 용량이 투여된다. 일 실시형태에서, 투여 주기는 2주 내지 8주이다.
일 실시형태에서, 개체에서 질환 (예를 들어, 암, 고형 종양, 혈액학적 종양)을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법이 제공되고, 이 방법은 질환 (예를 들어, 암, 고형 종양, 혈액학적 종양)을 갖는 개체에게 적어도 1회 투여 주기 동안 CD39의 효소 활성을 중화시키는 항-CD39 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 투여 주기는 항-CD39 항체의 적어도 1차 및 2차 (및 임의로 3차, 4차, 5차, 6차, 7차 및/또는 8차 이상) 투여를 포함하고, 여기서 항-CD39 항체는 적어도 0.1 μg/ml, 임의로 적어도 0.2 μg/ml, 임의로 적어도 1 μg/ml, 또는 임의로 적어도 2 μg/ml (예를 들어, 혈액학적 종양 치료의 경우), 또는 임의로 적어도 약 1 μg/ml, 2 μg/ml, 10 μg/ml, 또는 20 μg/ml, 예를 들어, 1 내지 100 μg/ml, 1 내지 50 μg/ml, 1 내지 20 μg/ml, 또는 1 내지 10 μg/ml (예를 들어, 고형 종양 치료의 경우, 혈액학적 종양 치료의 경우)의 항-CD39 항체의 혈액 (혈청) 농도를 2회 연속 투여 사이에 획득하거나 또는 유지하는 유효한 양으로 투여된다. 일 실시형태에서, 명시된 연속적인 혈액 농도가 유지되고, 혈액 농도는 명시된 기간 (예를 들어, 항체의 2회 투여 사이, 주일 수, 1주, 2주, 3주 4주)의 지속 기간동안 실질적으로 명시된 혈액 농도 이하로 하락되지 않으며, 즉, 혈액 농도가 명시된 기간 동안 다양할 수 있지만, 유지되는 명시된 혈액 농도는 최소 또는 "최저" 농도를 의미한다. 일 실시형태에서, 항-CD39 항체의 치료적 활성량은 항체의 투여 후 적어도 약 1주, 약 2주, 또는 약 1개월의 기간 동안 CD39의 효소 활성의 중화를 위해 혈액 및/또는 조직에서, (적어도) EC50 농도, 임의로 EC70 농도, 임의로 EC100 농도를 제공할 수 있는 이러한 항체의 양이다.
본 개시 내용의 항-CD39 항체에 의한 치료 과정 이전 또는 그 동안에, 가용성 (세포외) CD39 단백질, CD39-발현 세포, 아데노신, ATP, ADP 및/또는 AMP 수준의 존재 또는 수준은 환자가 치료에 적합한지 여부를 평가하기 위해 (예를 들어, 환자가 치료에 반응할 공산이 있는지 여부를 예측하기 위해) 환자의 종양 내에서 및/또는 그에 인접하여 평가될 수 있다. 증가된 존재 또는 수준의 가용성 (세포외) CD39, CD39-발현 세포, 아데노신, ATP, ADP 및/또는 AMP의 수준은 개체가 본 개시 내용의 항-CD39 항체 (제한없이 기질-결합 CD39를 억제하는 항체 포함)에 의한 치료에 적합하다 (예를 들어, 이득을 얻을 수 있다)는 것을 의미할 수 있다.
본 개시 내용의 항-CD39 항체에 의한 치료 과정 이전 또는 동안에, 아데노신, ADP 및/또는 AMP 수준은 또한 임의로 환자가 항-CD39 항체에 의한 치료로부터 이득을 얻는지 여부를 평가하기 위해 환자의 종양 내에서 및/또는 그에 인접하여 평가될 수 있다. 치료 (또는 항체의 투약) 이전 수준과 비교하여 투여 (또는 항체의 투약) 이후에 비교된 감소된 수준의 아데노신, ATP, ADP 및/또는 AMP는 개체가 본 개시 내용의 항-CD39 항체 (제한없이 기질-결합 CD39를 억제하는 항체 포함)에 의한 치료로 이득을 얻는다는 것을 의미할 수 있다. 임의로, 환자가 항-CD39 항체에 의한 치료로 이득을 얻으면, 방법은 환자에게 항-CD39 항체의 추가 용량을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다 (예를 들어, 계속 치료).
일 실시형태에서, 환자의 종양 조직 샘플 내에서 및/또는 그에 인접하여 아데노신, ADP 및/또는 AMP 수준을 평가하는 단계는 암 환자 유래 조직, 예를 들어, 암 조직, 암 주변 또는 그 근처의 조직, 암 인접 조직, 인접 비종양성 조직 또는 정상 인접 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 조직의 생물학적 조직을 환자로부터 수득하는 단계, 및 조직 내에서 아데노신, ATP, ADP 및/또는 AMP 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 환자로부터의 수준은 예를 들어 건강한 개체에 상응하는, 기준 수준에 대해 그 수준을 비교할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시 내용은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에서 암을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은
a) 순환계 또는 종양 환경에서, 임의로 종양 내에서 및/또는 인접한 조직 내에서, 가용성 (세포외) CD39 단백질 및/또는 CD39-발현 세포를 검출하는 단계, 및
b) 가용성 (세포외) CD39 단백질 및/또는 CD39-발현 세포가 순환계 또는 종양 환경에, 임의로 (예를 들어, 건강한 개체 또는 항-CD39 항체로부터 실질적인 이득을 유도하지 않는 개체에 상응하는) 기준 수준과 비교하여 증가된 수준으로 포함된다고 결정되면, 개체에게 항-CD39 항체를 투여하는 단계를 포함한다. CD39-발현 세포는 종양 세포 또는 백혈구, 예를 들어 순환성 또는 종양 침윤성 세포, 예를 들어, CD4 T 세포, CD8 T 세포, TReg 세포, B 세포를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시 내용은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에서 암을 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은
a) 개체가 임의로 순환계에, 임의로 종양 내에 및/또는 인접한 조직 내에 검출가능한 가용성 (세포외) CD39를 갖는지 여부를 평가하는 단계, 및
b) 임의로 (예를 들어, 건강한 개체 또는 본 개시 내용의 항-CD39 항체로부터 실질적인 이득을 유도하지 않는 개체에 상응하는) 기준 수준과 비교하여 증가된 수준으로 가용성 (세포외) CD39의 검출 시, 개체에게 본 개시 내용의 항-CD39 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
임의로, 임의의 방법에서, 종양 환경 내에서 가용성 CD39 단백질 및/또는 CD39-발현 세포 (또는 아데노신, ATP, ADP 및/또는 AMP)를 검출하는 단계는 암 조직 및/또는 암의 주변 또는 그에 인접한 조직 (예를 들어, 암 인접 조직, 인접 비종양성 조직 또는 정상 인접 조직)을 포함하는 생물학적 샘플을 개체로부터 수득하는 단계, 및 sCD39 단백질, CD39-발현 세포 (또는 아데노신, ATP, ADP 및/또는 AMP)의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. CD39-발현 세포는 예를 들어, 종양 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, TReg 세포, B 세포를 포함할 수 있다.
암을 갖는 개체는 순환 세포 세포 또는 종양 미세환경 내 세포 (예를 들어, 종양 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, TReg 세포, B 세포) 상에서 CD39의 발현 및/또는 sCD39의 존재를 평가하기 위한 이전 검출 단계와 함께 또는 없이 항-CD39 항체로 치료될 수 있다. 임의로, 치료 방법은 개체 유래의 혈액 또는 종양으로부터의 생물학적 샘플 (예를 들어, 암 조직, 암 주변 또는 그에 인접한 조직, 암 인접 조직, 인접 비종양성 조직 또는 정상 인접 조직)에서 CD39 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. CD39를 발현하는 (예를 들어, 기준과 비교하여, 현저하게 발현하고, 높은 수준으로 CD39를 발현하고, 높은 강도로 항-CD39 항체에 의해 염색) 세포를 포함한다는 결정은 환자가 CD39를 억제하는 작용제에 의한 치료로부터 강력한 이득을 가질 수 있는 암을 갖는다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 방법은 생물학적 샘플 중 CD39 핵산 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 결정하는 단계 및 건강한 개체에 상응하는 기준 수준에 대해 그 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플이 sCD39 단백질 및/또는 CD39 핵산 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 기준 수준과 비교하여 증가된 수준으로 포함한다는 결정은 환자가 본 개시 내용의 항-CD39 항체에 의해 유리하게 치료될 수 있는 암을 갖는다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 CD39 폴리펩티드를 검출하는 단계는 가용성 세포외 CD39 단백질을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 CD39 폴리펩티드를 검출하는 단계는 악성 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, TReg 세포, B 세포의 표면 상에서 발현되는 CD39 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플이 CD39 핵산 또는 폴리펩티드를 현저하게 발현하는 세포를 포함한다는 결정은 환자가 본 개시 내용의 항-CD39 항체에 의해 유리하게 치료될 수 있는 암을 갖는다는 것을 의미한다. CD39 폴리펩티드를 언급시 "현저하게 발현되는"은 CD39 폴리펩티드 가 소정 환자로부터 채취된 세포의 실질적인 수에서 발현된다는 것을 의미한다. 용어 "현저하게 발현되는"의 정의가 정확한 백분율 값으로 한정되지 않지만, 일부 예에서, "현저하게 발현되는"이라고 하는 수용체는 환자로부터 채취된 종양 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 그 이상에 존재할 것이다.
개체가 CD39 폴리펩티드를 발현하는 세포를 특징으로 하는 암을 갖는지 여부를 결정하는 단계는 예를 들어 암 환경 (예를 들어, 종양 또는 종양 인접 조직) 유래의 세포를 포함하는 개체로부터 (예를 들어, 생검을 수행하여) 생물학적 샘플을 수득하는 단계, CD39 폴리펩티드에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계, 및 세포가 그들 표면 상에 CD39를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 임의로, 개체가 CD39를 발현하는 세포를 갖는지 여부를 결정하는 단계는 면역조직화학 어세이를 수행하는 단계를 포함한다.
항체 조성물은 단일요법으로서 또는 항체를 투여하려는 특정한 치료 목적을 위해 정상적으로 이용되는 작용제를 포함하여, 하나 이상의 다른 치료제와의 병용 치료로서 사용될 수 있다. 추가 치료제는 정상적으로 치료하려는 특정한 질환 또는 병태에 대한 단일요법에서 그 작용제에 대해 전형적으로 사용되는 양 및 치료 용법으로 투여될 것이다. 이러한 치료제는 제한없이 항암제 및 화학요법제, 예를 들어, 종양 세포로부터 ATP의 세포외 방출을 야기시킬 수 있는 화학요법제를 포함한다.
일 실시형태에서, 항-CD39 중화 항체는 인간 CD16에 대한 결합은 결여되어 있지만 CD16-발현 이펙터 세포 (예를 들어, NK 또는 이펙터 T 세포)의 활성은 강화시킨다. 따라서, 일 실시형태에서, 제2 또는 추가적인 제2 치료제는 예를 들어, NK 세포에 의해 발현되는 CD16을 통해서, 결합되는 세포에 대해 ADCC를 유도시킬 수 있는 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질이다. 전형적으로, 이러한 항체 또는 다른 단백질은 관심 항원, 예를 들어 종양 세포 상에 존재하는 항원 (종양 항원)에 결합하는 도메인, 및 이의 Fc 도메인 또는 일부분을 포함하게 될 것이고, 항원 결합 도메인을 통한 항원과의 결합 및 Fc 도메인을 통한 Fcγ 수용체 (예를 들어, CD16)와의 결합을 나타낼 것이다. 일 실시형태에서, 이의 ADCC 활성은 CD16에 의해서 적어도 부분적으로 매개될 것이다. 일 실시형태에서, 추가적인 치료제는 천연 또는 변형된 인간 Fc 도메인, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG3 항체 유래 Fc 도메인을 갖는 항체이다. 용어 "항체-의존제 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 당분야에서 충분히 이해되는 용어이고, Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 이후에 표적 세포의 용해를 야기시키는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 비특이적 세포독성 세포는 자연 살해 (NK) 세포, 마크로파지, 단핵구, 호중구 및 호산구를 포함한다. 용어 "ADCC-유도 항체"는 당업자에게 공지된 어세이(들)로 측정시 ADCC를 입증하는 항체를 의미한다. 이러한 활성은 전형적으로 다양한 FcR과 Fc 영역의 결합을 특징으로 한다. 임의의 특정한 기전에 국한하지 않으나, 당업자는 ADCC를 입증하는 항체의 능력이 예를 들어, 이의 서브클래스 (예컨대 lgG1 또는 lgG3) 덕분일 수 있거나, Fc 영역에 도입된 돌연변이에 의한 것일 수 있거나, 또는 항체의 Fc 영역 내 탄수화물 패턴에 대한 변형에 의한 것일 수 있음을 인식할 것이다. ADCC를 유도하는 항체의 예는 리툭시맙 (림프종, CLL 치료용), 트라스투주맙 (유방암 치료용), 알렘투주맙 (만성 림프구성 백혈병 치료용) 및 세툭시맙 (직결장암, 두경부 편평 세포 암종 치료용)을 포함한다. ADCC-증강 항체의 예는 제한없이 GA-101 (저푸코실화 항-CD20), 마르게툭시맙 (Fc 증강된 항-HER2), 메폴리주맙, MEDI-551 (Fc 조작된 항-CD19), 오비누투주맙 (당-조작/저푸코실화 항-CD20), 오카라투주맙 (Fc 조작된 항-CD20), XmAb® 5574/MOR208 (Fc 조작된 항-CD19)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-CD39 중화 항체는 특히, 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 작용제에 의한 치료에 약한 반응자 (또는 불감성)인 개체에서, 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는, 예를 들어 PD-1 및 PD-L1 간 상호작용을 억제하는, 작용제의 효능을 증강시킨다. 따라서, 일 실시형태에서, 제2 또는 추가적인 제2 치료제는 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 항체 또는 다른 작용제이다.
프로그램된 사멸 (Programmed Death) 1 (PD-1) ("프로그램된 세포 사멸 (Programmed Cell Death) 1"이라고도 함)은 CD28 수용체 패밀리의 억제 구성원이다. 완전한 인간 PD-1 서열은 GenBank 수탁 번호 U64863 하에 확인할 수 있다. PD-1의 억제 활성의 억제 또는 중화는 PD-L1-유도된 PD-1 신호전달을 방지하는 폴리펩티드 작용제 (예를 들어, 항체, Fc 도메인에 융합된 폴리펩티드, 이뮤노어드헤신 등)의 사용을 포함할 수 있다. 시판되고 있거나 또는 임상 평가 중인 PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 적어도 6종의 작용제가 현재 존재한다. 한 작용제는 BMS-936558 (니보루맙/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; 이전명 MDX-1106)이다. 니볼루맙 (상표명 Opdivo®)은 PD-1 및 CD80 둘 모두에 PD-L1 리간드의 결합을 억제하는 FDA-승인된 완전한 인간 IgG4 항-PD-L1 mAb이고 그 개시 내용이 참조로 본 명세서에 편입되는 WO 2006/121168에서 항체 5C4로서 기술되어 있다. 골수종 환자의 경우, 가장 유의한 OR은 3 mg/kg의 용량에서 관찰되었고, 반면 다른 암 유형의 경우에는 10 mg/kg 이었다. 니볼루맙은 일반적으로 암 진행까지 3주 마다 10 mg/kg 이 투약된다. 용어 "인간 PD-1의 억제 활성을 감소시키다", "PD-1을 중화시키다" 또는 "인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키다"는 PD-1이 이의 하나 이상의 결합 파트너, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2와 PD-1의 상호작용으로 인한 이의 신호 전달 능력에서 억제되는 과정을 의미한다. PD-1의 억제 활성을 중화시키는 작용제는 PD-1와 이의 하나 이상의 결합 파트너, 예컨대 PD-L1, PD-L2의 상호작용에 의한 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐기시키거나 또는 방해한다. 그리하여 이러한 작용제는 T-세포 이펙터 기능, 예컨대 증식, 사이토카인 생성 및/또는 세포독성을 증강시키기 위해서, T 림프구 상에 발현되는 세포 표면 단백질을 통해서 또는 그에 의해 매개되는 음성적 공자극성 신호를 감소시킬 수 있다.
람프롤리주맙 또는 펨브롤리주맙 (상표명 Keytruda®)이라고도 하는, MK-3475 (Merck 사의 인간 IgG4 항-PD1 mAb)는 골수종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었고 다른 암에서 시험 중이다. 펨브롤리주맙은 질환 진행까지 2주 또는 3주마다 2 mg/kg 또는 10 mg/kg 에서 시험되었다. Merck 3745 또는 SCH-900475라고도 하는 MK-3475는 또한 WO2009/114335에 기술되어 있다.
MPDL3280A/RG7446 (Roche/Genentech 사의 아제톨리주맙, 상표명 Tecentriq™, 항-PD-L1)은 FcγR 결합 및 결과적인 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 최소화시켜서 효능 및 안전성을 최적화하도록 디자인된 조작된 Fc 도메인을 함유하는 인간 항-PD-L1 mAb이다. ≤ 1, 10, 15, 및 25 mg/kg의 용량의 MPDL3280A가 최대 1년 동안 3주 마다 투여되었다. 3기 시험에서, MPDL3280A는 NSCLC에서 3주 마다 정맥내 주입으로 1200 mg이 투여된다.
AMP-224 (암플리뮨 및 GSK)는 Fc 도메인에 융합된 PD-L2 세포외 도메인을 포함하는 이뮤노어드헤신이다. PD-1을 중화시키는 작용제의 다른 예는 PD-L2에 결합하여 PD-1 및 PD-L2 간 상호작용을 차단하는 항체 (항-PD-L2 항체)를 포함한다.
피들리주맙 (CT-011; CureTech) (CureTech/Teva 사의 인간화 IgG1 항-PD1 mAb), 피들리주맙 (CT-011; CureTech) (예를 들어, WO2009/101611 참조)이 다른 예이고, 이 작용제는 리툭시맙-감응성 재발 FL을 갖는 30명 환자에서 시험되었는데, CT-011의 제1 주입 이후 2주에 시작하여, 4주 동안 매주 375 mg/m2의 용량의 리툭시맙과 조합하여 4회 주입을 위해 4주 마다 3 mg/kg 정맥내 CT-011이 처치되었다.
추가의 공지된 PD-1 항체 및 다른 PD-1억제제는 AMP-224 (GSK가 특허받은 B7-DC/IgG1 융합 단백질), WO 2012/145493에 기술된 AMP-514, WO2011/066389 및 US2013/034559에 기술된 항체 MEDI-4736 (둘발루맙, 상표명 Imfinzi™, AstraZeneca/Medimmune이 개발한 항-PD-L1), WO2010/077634에 기술된 항체 YW243.55.S70 (항-PD-L1), WO2007/005874에 기술된 Bristol-Myers Squibb 사가 개발항 항-PD-L1 항체인, BMS-936559로도 알려진 MDX-1105, 및 그 개시 내용이 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 및 WO2013/019906에 기술된 항체 및 억제제를 포함한다. 항-PD1 항체의 추가 예는 WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.)에 개시되어 있는데, 예를 들어 각각 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 8의 경쇄 가변 도메인 CDR 1, 2 및 3, 및 각각 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 항체 중쇄 가변 도메인 CDR 1, 2 및 3을 갖는 항체이고, 여기서 SEQ ID NO 참조는 WO2015/085847에 따른 번호매김이고, 이의 개시 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. PD-1 또는 PD-L1와의 결합에 대해 임의의 이들 항체와 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 항-PD-1 항체는 펨프롤리주맙이다 (Merck & Co에서 Keytruda™으로 시판, 예를 들어, 또한 WO 2009/114335를 참조하고 이의 개시 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킴).
일부 실시형태에서, PD-1 중화제는 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하는 항-PD-L1 mAb이다. 일부 실시형태에서, PD-1 중화제는 PD-1과 PD-L1의 결합을 억제는 항-PD1 mAb이다. 일부 실시형태에서, PD-1 중화제는 이뮤노어드헤신 (예를 들어, 불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 어드헤신)이다.
치료 방법에서, CD39-결합 화합물 및 제2 치료제는 개별적으로, 함께 또는 순차적으로, 또는 칵테일로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 이전에 투여된다. 예를 들어, CD39-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 이전 대략 0일 내지 30일에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD39-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 이전 약 30분 내지 약 2주, 약 30분 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 1일, 또는 약 1일 내지 5일에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD39-결합 화합물은 치료제의 투여와 동시발생적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, CD39-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 이후에 투여된다. 예를 들어, CD39-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 이후 대략 0일 내지 30일에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD39-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 이후 약 30분 내지 약 2주, 약 30분 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 1일, 또는 약 1일 내지 5일에 투여된다.
실시예
방법
CD39 돌연변이체의 생성
CD39 돌연변이체는 PCR로 생성시켰다. 증폭된 서열을 아가로스 겔 상에서 러닝시켰고 Macherey Nagel PCR 클린-업 겔 추출 키트 (참조 740609)를 사용해 정제하였다. 각 돌연변이체에 대해 생성된 정제된 PCR 생성물은 이후에 ClonTech InFusion 시스템을 사용하여 발현 벡터에 결찰시켰다. 돌연변이된 서열을 함유하는 벡터는 미니프렙으로 제조하였고 서열분석하였다. 서열분석 후, 돌연변이된 서열을 함유하는 벡터는 Promega PureYield™ 플라스미드 미디프렙 시스텝을 사용하여 미디프렙으로 제조하였다. HEK293T 세포는 DMEM 배지 (Invitrogen)에서 성장시켰고, Invitrogen의 Lipofectamine 2000을 사용하여 벡터로 형질감염시켰으며, 이식유전자 발현을 시험하기 전에 48시간 동안 CO2 인큐베이터에 37℃에서 인큐베이션시켰다. 돌연변이체는 하기 표에 표시된 바와 같이 Hek-293T 세포에 형질감염시켰다. 하기 표 1에서 표적화된 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 번호매김을 사용하여 표시된다.
표 1
가용성 huCD39의 클로닝, 생성 및 정제
분자 생물학
huCD39 단백질은 하기의 프라이머를 사용하여 인간 PBMC cDNA로부터 클로닝되었다: TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGGAAGATACAAAGGAGTC (SEQ ID NO: 42) (전방향), 및 CCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCGA CATAGGTGGAGTGGGAGAG (SEQ ID NO: 43) (역방향). 정제된 PCR 생성물은 InFusion 클로닝 시스템을 사용하여 발현 벡터에 클로닝되었다. M2 태그 (FLAG 태그, SEQ ID NO: 45에 밑줄표시)는 정제 단계를 위해 단백질의 C-말단에 첨가되었고, CD39 세포외 도메인 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 45)이 임의의 실시형태에서, 임의로, M2 태그가 결여되었다고 명시될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
huCD39 단백질의 발현 및 정제
클로닝된 서열의 검증 이후에, CHO 세포는 핵도입되었고 생성된 풀은 서브클로닝하여 huCD39 단백질을 생성하는 세포 클론을 수득하였다. 롤러에서 성장시킨 huCD30 클론 유래의 상층액을 회수하였고 M2 크로마토그래피 컬럼을 사용해 정제하였으며 M2 펩티드를 사용해 용리시켰다. 다음으로 정제된 단백질을 S200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하였다. 단량체에 상응하는 정제된 단백질은 TBS PH7.5 완충액에 배합시켰다. M2 태그가 없는 CD39-M2 세포외 도메인 재조합 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같았다:
M2 태그를 갖는 CD39-M2 세포외 도메인 재조합 단백질의 최종 아미노산 서열은 다음과 같았다:
가용성 CD39의 효소 활성의 억제
생성된 가용성 CD39 단백질의 효소 활성의 항체에 의한 억제는 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 발생시키는 시약의 사용을 통해서 ATP 가수분해의 평가를 가능하게 하는 Cell Titer Glo™ (Promega, 참조 G7571)를 사용하여 평가하였다. 이러한 방식으로, 가용성-CD39-매개 ATP 가수분해의 억제를 평가할 수 있다. 간략하게, 100 μg/ml 내지 6x10-3 μg/ml의 용량 범위의 항-CD39 항체를 방법 부문에 기술된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 45)을 갖는 400 ng/ml의 가용성 재조합 인간 CD39 단백질과 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 20 μM ATP가 CTG (Cell Titer Glo) 시약의 첨가 전에 추가 30분 동안 37℃에서 플레이트에 첨가되었다. 발광되는 빛은 암실에서 5분의 짧은 인큐베이션 기간 이후에 Enspire™ 광도계를 사용하여 정량되었다. 항-CD39 항체 효능은 항체 존재 하에서 발광된 빛을 ATP 단독 (최대 발광) 및 가용성 CD39 단백질과 함께한 ATP (최소 발광)와 비교하여 결정하였다.
세포 CD39의 효소 활성의 억제
항체에 의한 CD39-발현 세포에서 CD39 효소 활성의 억제는 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 발생시키는 시약의 사용을 통해서 ATP 가수분해의 평가를 가능하게 하는 Cell Titer Glo™ (Promega, 참조 G7571)를 사용하여 평가하였다. 따라서, 어세이는 세포 배양 상청액 중 CD39에 의해 가수분해된 ATP의 억제의 평가가 가능하도록 디자인되었다. 간략하게, 5x104 Ramos 인간 림프종 세포, 5x103 인간 CD39-발현 CHO 세포, 사이노몰거스 CD39-발현 CHO 세포 및 마우스 CD39-발현 CHO 세포를 1시간 동안 37℃에서 30 μg/ml 내지 5x10-4 μg/ml의 항-CD39 항체와 인큐베이션시켰다. 그 다음으로 세포를 20 μM ATP와 추가 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 2분 동안 400g에서 원심분리하였고 50 μl의 세포 상청액을 발광 마이크로플레이트 (흰색 웰)로 옮겼다. 50 μl의 CellTiter-Glo® 시약 (CTG)을 상청액에 첨가하였고 발광되는 빛을 Enspire™ 광도계를 사용하여 암실에서 5분 인큐베이션 후에 정량하였다. 항-CD39 항체 효능은 항체의 존재 하에서 발광된 빛을 ATP 단독 (최대 발광) 및 세포와 함께한 ATP (최소 발광)와 비교하여 결정하였다.
항체의 생성: 마우스에서 면역화 및 스크리닝
항-인간 CD39 항체를 수득하기 위해서, Balb/c 마우스를 상기 기술된 재조합 인간 CD39-M2 세포외 도메인 재조합 단백질로 면역화시켰다. 마우스는 50 μg의 CD39 단백질 및 완전 프로인트 보강제의 에멀션으로 1회 1차-면역접종을 받았고, 50 μg의 CD39 단백질 및 불완전 프로인트 보강제의 에멀션으로 2차 면역접종을 복강내로 받았으며, 최종적으로 정맥내로 10 μg의 CD39 단백질로 부스팅되었다. 면역 비장 세포는 부스팅 이후 3일에 X63.Ag8.653 불멸화 B 세포와 융합시켰고, 조사된 비장 세포의 존재 하에서 배양시켰다. 하이브리도마는 반고형 메틸셀룰로스-함유 배지에 플레이팅시켰고 성장된 클론은 clonepix 2 장비 (Molecular Devices)를 사용해 선택하였다.
실시예 1: 기지의 중화 CD39 mAb의 에피토프 맵핑
어떻게 항체가 세포 CD39의 효소적 (ATPase) 활성을 억제할 수 있는 가에 대한 통찰력을 얻기 위해서, 우리는 세포 어세이에서 CD39의 ATPase 활성을 억제하는 것으로 보고된 항체가 결합하는 에피토프를 조사하였다: PCT 공개 특허 출원 번호 WO2009/095478에 개시된 BY40.
항-CD39 항체의 에피토프를 정의하기 위해서, 우리는 CD39의 표면 상의 분자 표면에 노출된 아미노산의 치환에 의해 정의되는 CD39 돌연변이체를 디자인하였다. 돌연변이체는 SEQ ID NO: 1의 번호매김을 사용하여, 표 1에 표시된 바와 같이, Hek-293T 세포에 형질감염시켰다.
I-394의 용량 범위 (10 - 2.5 - 0.625 - 0.1563 - 0.0391 - 0.0098 - 0.0024 - 0.0006 μg/ml)를 유세포측정을 통해서 20종의 생성된 돌연변이체에서 시험하였다. BY40 항체 둘 모두는 임의의 다른 돌연변이체에 대한 결합의 소실없이, CD39의 돌연변이체 5를 발현하는 세포에 대한 결합의 완전한 소실을 가졌다. 돌연변이체 5는 잔기 Q96, N99, E143 및 R147에 아미노산 치환을 함유한다. CD39의 표면 상에서 돌연변이체 5의 위치는 도 3A에 도시되어 있다.
실시예 2: 기지의 중화 CD39 mAb는 재조합 가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성을 억제할 수 없다
세포 어세이에서 CD39의 ATPase 활성을 억제하는 것으로 보고된 2종 항체 (BY40 및 BY12)는 재조합 가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성을 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 평가되었다. 상기 기술된 바와 같이 생성된 가용성 CD39 단백질의 효소 활성의 항체에 의한 억제는 Cell Titer Glo™ (Promega, 참조 G7571)를 사용해 평가되었다. 세포 CD39 단백질의 효소 활성의 항체에 의한 억제는 상기 표시된 대로 평가되었다.
예상한 바와 같이, BY40은 세포에서 CD39 단백질의 ATPase 활성을 억제하였다. 그러나, BY40는 가용성 CD39 단백질의 효소 활성을 억제할 수 없었다. 도 2B는 본 명세서에서 동정된 신규 항체와 BY40의 비교를 도시한다.
실시예 3: sCD39 활성을 차단하는 신규한 mAb에 대한 스크리닝
일련의 면역접종은 sCD39의 ATPase 활성을 중화시키는 항체를 찾기 위해 수행되었다. 항-인간 CD39 항체를 수득하기 위해서, 상기 기술된 재조합 인간 CD39-M2 세포외 도메인 재조합 단백질로 동물을 면역화시켰다. 총 15회의 면역화가 상이한 프로토콜 및 상이한 동물을 사용해 수행되었다. 상이한 마우스 품종, 래트 및 토끼가 포함되었다.
초기 면역화 프로토콜에서, 1차 스크리닝은 야생형 CHO 및 huCD39를 발현하는 CHO 세포주를 사용하여 유세포측정을 통해 성장하는 클론의 상청액 (SN)을 시험하는 단계를 포함하였다. 세포는 각각 0.1 μM 및 0.005 μM의 CFSE로 염색시켰다. 유세포측정 스크리닝을 위해서, 모든 세포는 동일하게 혼합하였고, 상청액 중 반응 항체의 존재는 APC로 표지된 염소 항-마우스 다클론 항체 (pAb)로 확인하였다. huCD39에 결합된 항체의 경우, 상기 기술되고 개발된 스크리닝 어세이 (방법)를 사용하여 가용성 CD39의 효소 활성의 억제에 대해 상청액을 스크리닝하였다.
결과는 수많은 특이적 CD39-결합 항체를 수득할 수 있었지만, 임의의 이들 면역화에 의한 항체의 어떠한 것도 가용성 CD39의 효소 활성의 억제를 보이지 않았다. 한가지 가능성은 CD39 상의 우성 에피토프가 CD39의 촉매 부위에 또는 그 근처에 적합하게 위치된 에피토프를 포함하지 않는다는 것이다. 세포 CD39를 억제하는 이용가능한 소수의 항체 및 항체를 사용하여 효소의 촉매 부위를 억제시 알려진 어려움의 관점에서, sCD39를 중화시키는 항체의 부재는 가용성 (세포외 도메인) CD39를 억제하는 항체를 수득하는 것이 가능하지 않다는 것을 의미할 수 있다. 다른 가능성은 특히 가용성 CD39를 억제할 수 있는 임의 항체의 결여가 sCD39 차단 어세이의 검증을 방해하므로, 비기능적 스크리닝 어세이 및/또는 부적절하게 폴딩되거나 또는 기능하는 가용성 CD39 단백질과 관련된다.
가용성 CD39를 억제할 수 있는 항체의 부재 관점에서, 항체 BY40의 에피토프에 의해 동정시 CD39의 활성 부위에 결합하는 항체의 생성을 촉진하도록 디자인된 스크리닝 프로토콜을 사용하여 추가 면역화를 수행하였다. 간략하게, 1차 스크리닝은 이전 면역화에서 처럼, 야생형 CHO 및 huCD39를 발현하는 CHO 세포주를 사용하는 유세포측정에 의해 성장하는 클론의 상청액 (SN)을 시험하고, 이후 표 1에 표시된 바와 같이, 야생형 CD39와 비교하여, CD39 돌연변이체 5를 발현하는 Hek-293T 세포와의 결합 소실에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. 돌연변이체 5는 잔기 Q96, N99, E143 및 R147에 치환을 갖는다. 그러나, 역시 결과는 돌연변이체 5와의 결합 소실을 보이는 수많은 특이적 CD39-결합 항체를 수득할 수 있었지만, 임의의 초기 면역화에 의한 항체의 어떠한 것도 가용성 CD39의 효소 활성의 임의 억제를 보이는 것은 없었다는 것을 보여준다.
실시예 4: 에피토프-지정 스크리닝의 일부로서 sCD39 활성을 억제하는 제1 항체의 동정
BY40-유사 항체와 경쟁하지 않는 항체를 갖기 위해서 Q96, N99, E143 및 R147 영역 (돌연변이체 5에 의해 정의)에 결합하지 않는 항-CD39 항체를 동정하고자 하였다. CD39의 ATPase 활성을 차단하는 어떠한 능력도 가질 필요가 없는 이러한 항체는 예를 들어, 세포 CD39를 억제하는 BY40 또는 BY40-유사 항체의 존재 하에서 세포 상의 유리 Cd39 단백질을 검출하고 정량하기 위해, BY40 결합 부위에 결합하는 세포 CD39를 억제하는 항체의 약리학 실험에 유용할 수 있다.
하이브리도마를 CD39 돌연변이체 5와의 결합 소실에 대해 스크리닝한 실시예 3의 면역화의 결과로부터 출발하여, CD39 돌연변이체 5와의 결합 소실을 보이는 것이 아닌 하이브리도마를 선택하였다. 이러한 하이브리도마 (I-394)는 돌연변이체 5와의 결합의 부분 감소로 인해 아마도 광범위한 풀 중 하나였지만, 돌연변이체 5와의 결합을 상실하지 않았고 따라서 초기에 보유되지 않았다.
가용성 CD39의 효소 활성의 억제에 대한 추가 면역화로부터의 상청액의 진행중인 스크리닝의 상황에서, 클로닝되어 생성된 항체 I-394가 대조군으로서 포함되었다. 놀랍게도, 항체 I-394가 에피토프-지정 스크리닝에서 유지된 클론 중 하나가 아님에도 불구하고, 이 항체는 상기 기술된 어세이 (방법)에서 가용성 CD39의 효소 활성의 강력한 억제를 보였다
I-394는 N-연결 글리코실화의 결여 및 인간 Fcγ 수용체 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및 CD64와의 결합 결여를 야기시키는 돌연변이 L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (카밧 EU 번호매김)를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 갖는 인간 불변 영역을 갖도록 변형되어 생성되었다. 간략하게, I-394 항체의 VH 및 Vk 서열 (각각 SEQ ID NO: 6 및 7에 표시된 VH 및 Vk 가변 영역)은 각각 상기 언급된 돌연변이 및 huCk 불변 도메인을 보유하는 huIgG1 불변 도메인을 함유하는 발현 벡터에 클로닝되었다. 2종의 수득된 벡터를 CHO 세포주에 공동 형질감염시켰다. 확립된 세포 풀을 사용하여 CHO 배지 중에서 항체를 생성시켰다. 그 다음으로 항체는 단백질 A를 사용하여 정제되었다. I-394의 개별 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 하기에 표시되어 있다 (카밧 CDR은 밑줄표시됨).
I-394 중쇄 가변 도메인 서열:
I-394 경쇄 가변 도메인 서열:
다음으로 항체 I-394는 CD39의 표면 상에 분자 표면에서 노출된 아미노산의 치환에 의해 정의되는 CD39 돌연변이체와의 결합 소실에 대해 시험되었다. 표 1에 표시된 바와 같이, SEQ ID NO: 1의 번호매김을 사용한 돌연변이체를 Hek-293T 세포로 형질감염시켰다. 항체 I-394의 용량 범위는 유세포측정을 통해 20종 돌연변이체에 대해 시험되었다. 도 3B에 도시된 바와 같이, I-394는 CD39의 돌연변이체 19를 발현하는 세포와의 결합의 완전한 소실을 보였다. 돌연변이체 19는 잔기 R138, M139 및 E142에 치환을 포함한다. 따라서 I-394의 코어 에피토프는 하나 이상 (또는 전부)의 잔기 R138, M139 및 E142를 포함한다.
돌연변이체 5와의 결합을 상실하고 가용성 CD39가 아닌 세포 CD39를 억제하는 능력을 갖는 이전 항체 BY40과 달리, 항체 I-394는 인접한 돌연변이체 19와의 결합을 상실하였고, 돌연변이체 5와의 결합은 강력하게 감소되었다 (그러나 돌연변이체 5와의 일부 잔여 결합 존재). 흥미롭게도, 돌연변이체 19의 잔기는 잔기 5와 매우 근접하거나 또는 인접하여, I-394는 BY40과 비교해 에피토프의 이동을 나타낼 수 있다. 따라서 항체 I-394는 가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성의 억제를 가능하게 하는 항-CD39 항체에 대한 가치있는 신규 에피토프를 제시한다. 또한 가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성을 중화하는 추가 항체를 검출하기 위한 스크리닝 어세이의 검증 및 시험을 가능하게 하는 특이적 양성 대조군을 제공한다.
실시예 5: sCD39-중화 mAb에 대한 비-에피토프 지정 스크리닝
가용성 CD39의 항체-매개 억제가 가능하다는 것을 의미하는 실시예 4의 결과를 기반으로, sCD39의 ATPase 활성을 중화시키는 항체를 찾기 위해서 실시예 3의 상이한 프로토콜을 사용한 상이한 면역화로부터의 융합체가 고안되었다.
ATPase 억제에 대한 스크리닝을 위한 상이한 접근법이 평가되었다. 한 실험에서, I-394 항체는 가용성 CD39의 ATPase 활성을 억제하는 능력에 대해 음성으로 확인된 실시예 3의 면역화의 하이브리도마 유래의 상청액을 섞는데 사용되었다. 상청액에 I-394의 이러한 첨가는 CD39의 ATPase 활성을 억제하는 음성 상청액의 능력을 복원시키지 않았다. 다음으로 항체 I-394는 단백질 A 코팅된 비드를 사용하여 음성 상청액으로부터 정제되었고, 우리는 정제된 I-394가 다시 ATPase 활성을 억제할 수 있고 복원되었다는 것을 관찰하였다.
전술한 결과의 관점에서, 새로운 면역화 및 스크리닝 프로토콜은 신규 및 과거 면역화에 의해 성장하는 클론을 가용성 CD39 또는 세포 CD39 ATPase 활성의 억제의 평가 없이, 에피토프에 대한 스크리닝 편중없이 야생형 CHO 및 huCD39를 발현하는 CHO 세포주를 사용해 유세포측정으로 스크리닝하는 것이 개발되었다. 돌연변이체 5 또는 19에 대한 결합 소실과 관련된 데이타가 일부 하이브리도마로부터 입수가능하였지만, 이러한 데이타는 클론 선택을 위해 사용되지 않고 단지 ATPase 차단 어세이에서 음성 결과의 사건에서 클로닝의 하이브리도마를 구제하는 목적을 위해 보유되었다. CD39에 결합하는 하이브리도마가 선택되었고 클로닝되었고, 하기 프로토콜에 따라 단백질 A를 사용하여 정제되었다:
- 300 μl의 하이브리도마 상층액을 10 μl의 단백질 A 비드에 첨가한다.
- NaCl을 1.5 M의 최종 농도로 첨가한다.
- 튜브를 3-4시간 동안 4℃에서 회전시킨다.
- 1분간 1500 rpm에서 원심분리한다.
- 상청액을 제거하고 3회 1 ml의 TBS로 세척한다.
- 3차 세척 후 모든 TBS를 제거한다.
- 50 μl의 시트레이트 0.1 M, pH 3를 첨가하고, 균질화시키고 RT에서 5분 동인 인큐베이션시킨다.
- 비드를 1분 동안 1500 rpm에서 원심분리한다.
- 50 μl의 용리액을 회수하고 신속하게 450 μl의 TBS를 첨가하고 4℃에 보관한다.
다음으로 수득된 항체는 I-394와 유사한 정도로 CD39의 ATPase 활성을 억제하는 능력에 대해 비교 어세이에서 스크리닝되었다. 가용성 및 세포 CD39의 효소 활성의 억제에 사용된 어세이는 상기에 기술된 바와 같다 (방법). 놀랍게도, 이러한 방식으로 생성된 예시적인 항체 중에서, 몇몇은 가용성 CD39의 억제 (뿐만 아니라 세포 CD39의 억제)를 보였다. 도 1은 양성 대조군 I-394 항체와 비교하여 항체 I-397, I-398 및 I-399를 보여주는 대표적인 스크리닝 결과이다. 유사하게, 상이한 면역화에 의한 항체 I-395 및 I-396은 가용성 CD39 단백질의 효소 활성을 억제하였다. 도 2A 및 2B는 더 많은 양의 항체가 가용성 및 세포 CD39 중화 둘 모두를 위한 추가 실험에 이용가능한 항체 I-395 및 I-396에 대한 결과를 도시한다. 도 2A는 항체 I-395 및 I-396 둘 모두는 BY40 및 I-394 항체와 비교하여 세포-막 결합된 CD39를 억제하고, I-394 및 I-395 둘 모두는 BY40과 비교하여 세포 CD39의 최대 억제 및 보다 큰 역가를 보인다는 것을 도시한다. 도 2B는 항체 I-395 및 I-396 둘 모두가 BY40 및 I-394 항체와 비교하여 가용성 CD39를 억제한다는 것을 도시한다. BY40가 임의 농도에서 가용성 CD39를 억제하지 않지만, I-394, I-395 및 I-396은 모두가 최대 역가를 보여주는 I-394에 의해, 그 다음으로 보다 낮은 역가를 갖는 I-395 및 그 다음 I-396 에 의해, 가용성 CD39를 억제하였다.
수득된 결과는 하이브리도마 상청액 중 인자(들)가 세포 배양 및 가용성 CD39 어세이 둘 모두에서 ATP를 신속하게 가수분해하여, 그에 따라 ATP에 대한 신호가 통상의 방법을 사용하는 항체의 스크리닝에서 검출되지 않는 가능성을 제기한다. 가용성 인자는 예를 들어 융합 파트너에 의해 생성되는 CD39 또는 일부 다른 효소일 수 있다.
다음으로, I-394에 대해 본 명세서에서 표시된 바와 동일한 방식으로, N-연결 글리코실화의 결여 및 인간 Fcγ 수용체 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및 CD64와의 결합 결여를 야기하는 돌연변이 L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (카밧 EU 번호매김)를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 갖는 인간 불변 영역을 갖도로 변형된, 항체를 클로닝하였다. 다음으로 최종 항체를 적정하고 역가에 따라 항체를 순위매기도록 EC50 및 IC50 결정을 평가하기 위해 실시예 7-9 (적정, ATPase 활성의 억제)에 표시된 바와 같은 보다 상세한 활성 평가를 수행할 수 있다.
실시예 6: sCD39 중화 mAb의 에피토프 맵핑
실시예 4에 표시된 바와 같이, I-394는 CD39의 돌연변이체 19를 발현하는 세포와의 결합의 완전한 소실을 보였지만, 돌연변이체 5와의 결합은 소실되지 않았다. 실시예 5의 추가 항-CD39 항체의 에피토프를 정의하기 위해서, 그들을 실시예 1 및 표 1에 기술된 바와 같은 CD39 돌연변이체의 패널과의 결합의 소실에 대해 시험하였다. 돌연변이체는 SEQ ID NO: 1의 번호매김을 사용하여 표 1에 표시된 바와 같이, Hek-293T 세포에 형질감염시켰다. 용량 범위의 시험 항체 (10 - 2.5 - 0.625 - 0.1563 - 0.0391 - 0.0098 - 0.0024 - 0.0006 μg/ml)는 유세포측정에 의해 20종의 생성된 돌연변이체에 대해 시험되었다.
결과는 가용성 CD39를 억제하는 능력에 대해 실시예 5에서 선택된 항체가 몇몇 상이한 에피토프를 나타낸다는 것을 보여주었다. 실시예 5에서 가용성 세포외 CD39의 억제를 보여주는 항체 중에서, 항체 I-395는 잔기 Q96, N99, E143 및 R147에 치환을 갖는 돌연변이체 5와의 결합 소실, 및 또한 잔기 R138, M139 및 E142에 치환을 갖는 돌연변이체 19와의 결합 소실을 보이는 항체의 예이다. 돌연변이체 19는 잔기 R138, M139 및 E142에 치환을 포함한다. 따라서 I-395의 CD39 상의 코어 에피토프는 잔기 Q96, N99, E143 및 R147 중 1, 2, 3 또는 4개를 비롯하여 잔기 R138, M139 및 E142 중 1, 2, 또는 3개를 포함한다.
다른 한편으로 항체 I-398은 잔기 R138, M139 및 E142에 치환을 갖는 돌연변이체 19와의 결합의 소실을 보이지만, 잔기 Q96, N99, E143 및 R147에 치환을 갖는 돌연변이체 5와의 결합의 소실이나 또는 감소를 갖지 않는 항체의 예이다.
실시예 5에서 가용성 세포외 CD39의 억제를 보인 다른 항체는 매우 상이한 에피토프를 가졌고, 돌연변이체 5 또는 19와의 결합의 소실을 보이지 않아서, 가용성 CD39가 또한 sCD39 상의 다른 부위와의 결합에 의해 억제될 수 있다는 것을 시사한다. 일부 항체의 경우에, 표 1의 20종 돌연변이체 중 하나와의 결합 소실은 CD39 상의 결합 부위의 국재화를 가능하게 하였지만, 나머지의 경우 임의의 20종 돌연변이체와의 결합이 소실되지 않아서 결합 부위는 결정되어야 하는 채로 남아있다. 실시예 5에서 가용성 CD39의 ATPase 활성의 억제를 보이는 항체 중에서, 항체 I-396은 임의의 다른 20종 돌연변이체와의 결합 소실없이, 치환 K87A, E100A 및 D107A을 갖는 돌연변이체 15와의 결합 소실을 보였다. 따라서 이 항체의 CD39 상의 코어 에피토프는 잔기 K87, E100 및 D107 중 하나 이상 (또는 전부)을 포함한다. 항체 I-399는 임의의 다른 20종 돌연변이체와의 결합 소실없이, 치환 N371K, L372K, E375A, K376G, V377A 및 K376 내지 V377 사이에 발린의 삽입 (표 1에서 "삽입 377V")을 갖는 돌연변이체 11과의 결합 소실을 보였다. 따라서 이 항체의 CD39 상의 코어 에피토프는 하나 이상 (또는 전체)의 잔기 N371, L372, E375, K376 및 V377을 포함한다. 도 3A는 CD39 단백질의 표면 상에서 돌연변이체 5 (M5), 15 (M15) 및 19 (M19)의 돌연변이된 잔기의 위치를 도시한다. 도 3B는 상이한 항체에 대한 돌연변이체 5, 15 및 19의 결합 결과를 도시한다.
따라서 결과는 가용성 CD39를 억제하는 항체가 상이한 에피토프에 대해서 수득될 수 있다는 것을 보여준다. 에피토프는 가용성 CD39는 억제하지 않고 오직 세포 CD39를 억제하는 BY40 또는 BY40-유사 항체의 결합 부위에 인접하여 위치된 돌연변이체 19의 하나 이상의 잔기에 의해 정의되는 에피토프 (돌연변이체 5와의 결합은 소실), BY40 또는 BY40-유사 항체와 비교하여 가능하게 약간의 이동을 의미하는 돌연변이체 19의 하나 이상의 잔기와 또한 부분적으로 돌연변이체 6에 의해 정의되는 에피토프, 돌연변이체 5의 잔기가 아닌 돌연변이체 19의 하나 이상의 잔기에 의해 정의되는 에피토프를 비롯하여, 다른 에피토프 예컨대 돌연변이체 11의 하나 이상의 잔기 또는 돌연변이체 15의 하나 이상의 잔기, 또는 추가로 에피토프의 위치를 결정해야 되는 채로 남겨진 임의의 돌연변이체 5, 15 또는 10와의 임의의 결합 감소를 갖지 않는 다른 항체에 의해 정의되는 것들을 포함한다.
실시예 7: 유세포측정에 의한 CD39 발현 세포 상에서 항체 적정
항체 I-394는 인간 CD39를 발현하는 CHO 세포, 사이노몰거스 (마카카 파시쿨라리스 (macaca fascicularis)) CD39를 발현하는 CHO 세포, 쥐과 CD39를 발현하는 CHO 세포, 및 인간 Ramos 림프종 세포 (ATCC™, 참조 CRL-1596)와의 결합에 대해 2회 반복 실험에서 시험되었다. 세포는 30 μg/ml 내지 5x10-4 μg/ml의 다양한 농도의 미표지된 항-CD39 항체와 30분 동안 4℃에서 인큐베이션되었다. 세척 후에, 세포는 염소 항-마우스 H+L 표지된 2차 항체와 30분 동안 4℃에서 인큐베이션되었다.
결과는 도 4에 도시되어 있다. 항체 I-394는 인간 CD39를 발현하는 세포 (CHO-huCD39), 사이노몰거스 CD39를 발현하는 세포 (CHO-cyCD39) 및 Ramos 림프종 세포에 결합하였지만, 쥐과 CD39를 발현하는 세포 (CHO-moCD39)에는 결합하지 않았다. I-394는 각각 제1 및 제2 실험 세트에서 0.16 μg/ml 및 0.19 μg/ml의 EC50 값으로 Ramos 세포에 결합하였다. 몇몇 다른 항-CD39 항체는 Ramos 세포와의 결합에 대해 비슷한 EC50 값을 보였다.
실시예 8: 세포 ATPase 활성의 억제를 위한 IC50 결정
CD39-발현 세포에서 CD39의 ATPase 활성의 항체 I-394에 의한 억제는 상기 (방법)에 기술된 바와 같이 세포 CD39의 효소 활성의 억제에 사용되는 어세이를 사용하여 평가되었다.
결과는 도 5에 도시되어 있다. I-394는 종양 (Ramos) 세포에서 CD39 효소 활성을 차단하는데서 고도로 강력하고, 시험된 모든 다른 항체와 비교하여 보다 큰 역가를 갖는다. I-394는 또한 인간 CD39를 발현하는 세포 (CHO-huCD39), 및 사이노몰거스 CD39를 발현하는 세포 (CHO-cyCD39)에서 CD39 효소 활성을 차단한다. 쥐과 CD39를 발현하는 세포 (CHO-moCD39)는 음성 대조군으로서 표시된다. 계산된 IC50 (50,000개 Ramos 세포에 의해 발현되는 CD39의 효소 활성의 50%의 억제)은 0.05 μg/ml이다. 획득된 최대 억제는 81.6%이다. 이소타입 대조군은 효과가 없었다.
실시예 9: 재조합 가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성의 억제를 위한 IC50 결정
가용성 CD39 단백질의 ATPase 활성의 항체 I-394에 의한 억제는 상기 (방법)에 기술된 바와 같이 가용성 CD39의 효소 활성의 억제에 사용된 어세이를 사용해 평가하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. I-394는 가용성 CD39 단백질의 효소 활성을 억제한다. 비교 시에 항체 BY40은 가용성 CD39 단백질의 효소 활성을 억제하지 않았다. 계산된 IC50 은 0.003 μg/ml이었다. 획득된 최대 억제는 74.9%이다.
실시예 10: CD39-L1, L2, L3, L4 이소폼에 대한 ELISA 적정
항체 I-394는 500 ng/ml 또는 1μg/ml로 PBS 1X에 4℃에서 밤새 96웰 플레이트에 코팅시킨 하기 표시된 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 CD39 이소폼 (Rec-huCD39 이소폼)과의 결합에 대해 시험되었다. 웰은 TBS Tween 20으로 세척하였고, TBS 차단 완충액 중에 RT에서 2시간 동안 더욱 포화시켰다. 용량 범위 농도의 1차 항체를 TBS 차단 완충액 중에 2시간 동안 RT에서 인큐베이션시켰다. 웰은 TBS Tween 20에서 세척하였다. 2차 항체 (TBS 차단 완충액 중 GAM-HRP 또는 GAH-HRP)는 1시간 동안 RT에서 인큐베이션시켰고, TMB로 발색시켰다. 광학 밀도는 Enspire™ 상에서 OD=450에서 측정하였다.
클로닝된 huCD39의 아미노산 서열　(혈관 이소폼):
NTPDase2 또는 ENTPD2로도 알려진 인간 CD39-L1:
NTPDase6 또는 ENTPD6로도 알려진 인간 CD39-L2:
NTPDase3 또는 ENTPD3로도 알려진 인간 CD39-L3:
NTPDase5 또는 ENTPD5로도 알려진 인간 CD39-L4:
I-394는 CD39에 결합하였지만 이소폼 CD39-L1, CD39-L2, CD39-L3 또는 CD39-L4 중 어느 것에도 결합하지 않았다. 이소타입 대조군 항체 (IC)는 임의의 CD39 또는 CD39-L 분자에 결합하지 않았다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.
실시예 11: 수지상 세포의 활성화
ATP가 프로염증성을 갖지만, ATP의 CD39-매개 이화작용은 수지상 세포 (DC) 활성화를 손상시킬 수 있고, 결국 종양 항원에 대한 광범위한 획득 면역 반응을 변경시킬 수 있다고 여겨진다. 항-CD39 항체를 사용한 CD39 차단이 ATP의 존재 하에서 수지상 세포 (DC) 활성화의 CD39-매개 변경을 극복할 수 있는지 여부를 평가하기 위해서, 우리는 ATP의 존재 하에서 단핵구-유래 DC (moDC)를 항-CD39 항체와 인큐베이션시켰다.
간략하게, 인간 단핵구는 인간의 건강한 혈액으로부터 정제하였고 6일 동안 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 MoDC로 분화시켰다. 다음으로 MoDC는 24시간 동안 ATP (Sigma, 0.25 - 1 mM)의 존재 하에서 활성화되었고 DC 활성화는 유세포측정법을 통해서 CD80, CD83 및 HLA-DR 발현을 분석하여 평가되었다. 일부 경우에서, MoDC는 1시간 동안 CD39 억제제: ARL6716 (Tocris, 250 μM), CD73 억제제: APCP (Tocris 50 μM), 항-CD39 차단 항체 I-394 또는 BY40 (BY40의 경우 WO2009/095478 참조), 또는 항-CD73 차단 항체의 존재 하에서 사전인큐베이션되었다. LPS (Invivogen, 10 ng/ml)는 양성 대조군으로서 사용되었다. CD4 T 세포 활성화에 대한 ATP-매개 DC 활성화의 최종 효과를 평가하기 위해서, ATP-활성화된 DC를 세척시킨 후 5일 동안 혼합 림프구 반응 (MLR)을 위해 동종이계 CD4 T 세포 (1 MoDC / 4 T 세포의 비율)와 인큐베이션시켰다. T 세포 활성화 및 증식은 유세포측정법에 의한 Cell Trace Violet 희석 및 CD25 발현을 통해 분석되었다 (도 8).
결과는 도 9, 10 및 11에 도시되어 있다. 음성 대조군 (배지)의 존재 하에서, moDC 활성화는 1 mM ATP의 존재 하에서 관찰되었지만, 0.125 mM, 0.25 mM 또는 0.5 mM의 ATP는 moDC 활성화를 허용하지 않았다. 활성부위에 결합하여 CD39 효소 활성을 완전히 차단하는 것으로 여겨지는 CD39의 화학적 억제제의 첨가는 0.125 mM, 0.25 mM 또는 0.5 mM 각각에서 moDC 활성화를 야기시켰다. 그러나, 항-CD39 항체 예컨대 BY40 또는 항-CD73 항체는 수지상 세포 (CD)의 ATP-유도된 활성화를 촉진할 수 없었고, 항체가 ATP 이화작용을 피하도록 충분히 효소 활성을 차단할 수 없다는 것을 시사한다. 놀랍게도, CD39의 ATPase 활성을 실질적으로 완전하게 차단하고 그에 따라 ATP의 축적을 가능하게 할 수 있는 항-CD39 차단 항체 I-394 (농도 10 μg/ml로 도면에 도시)는 각각 0.125 mM, 0.25 mM 또는 0.5 mM에서 HLA-DR 또는 CD83 발현을 통해 평기 시 moDC 활성화를 가능하게 하였다 (도 9 및 10). 흥미롭게도, ATP의 존재 하에서 활성화된 MoDC는 MLR 어세이에서 더 양호한 T 세포 활성화 및 증식을 유도할 수 있었다. 게다가, ATP-매개 MoDC 활성화 by 항-CD39 차단 항체 I-394에 의한 ATP-매개 MoDC 활성화의 증강은 그 결과로 더 높은 T 세포 증식 및 활성화를 일으켰다 (도 11).
APT의 존재 하에서 DC를 활성화시키는 CD39 억제제의 능력의 평가는 높은 정도의 CD39의 억제를 획득할 수 있는 항-CD39 항체를 동정하고 평가하는 방법을 제공한다.
DC에 대해 CD39에 의해 발휘되는 면역억제 효과를 경감시키기 위해 항-CD39 항체를 사용하는 가능성은 특히 종양 세포 상의 항원에 대한 획득 면역 반응의 증강을 제공한다. 뿐만 아니라, 이러한 항-CD39 항체는 화학요법제의 면역원성 효과를 증강시키기 위해 사용될 때 특히 흥미로울 수 있다. 종양 세포의 괴사를 야기시키는 수많은 화학요법제는 ATP를 유도시킬 수 있고, 항-CD39 항체와의 병용은 이들 상황에서 항종양 반응을 증가시키는데 특히 유용할 수 있다.
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요소 또는 요소들과 관련하여 "포함하는", "가지는", "포괄하는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용하는 본 명세서의 임의의 양상 또는 실시형태의 본 명세서에서의 설명은 달리 명시하지 않거나 또는 문맥에서 명백하게 반박하지 않으면, 특정한 요소 또는 요소들로 "이루어지거나", "본질적으로 이루어지거나", 또는 "포함하는" 본 명세서의 유사한 양상 또는 실시형태에 대한 뒷받침을 제공하고자 한다 (예를 들어, 특정한 효소를 포함하는 것으로 본 명세서에서 기술된 조성물은 달리 명시하지 않거나 또는 문맥에서 명백하게 반박하지 않으면, 그 요소로 이루어진 조성물을 또한 설명하는 것으로 이해해야 함).
본 명세서에서 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하려는 의도이고 달리 청구하지 않으면 본 발명의 범주의 제한을 의미하는 것이 아니다. 명세서의 어떠한 언어도 임의의 비청구 요소를 본 발명의 실시에서 본질적인 것을 의미하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> INNATE PHARMA <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER <130> CD39-6 <150> US 62/471,994 <151> 2017-03-16 <150> US 62/586,220 <151> 2017-11-15 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 510 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 1 Met Glu Asp Thr Lys Glu Ser Asn Val Lys Thr Phe Cys Ser Lys Asn 1 5 10 15 Ile Leu Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu 20 25 30 Leu Ala Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys 35 40 45 Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile 50 55 60 Tyr Lys Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln 65 70 75 80 Val Glu Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln 85 90 95 Lys Val Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala 100 105 110 Arg Glu Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu 115 120 125 Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Ala Asp Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro 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<213> Mus musculus <400> 26 Trp Gly Tyr Asp Asp Glu Glu Ala Asp Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 His Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Pro Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Met Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Phe Tyr Thr Asn Ser Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Phe Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 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<213> Mus musculus <400> 36 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 38 <211> 330 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 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Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser 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Cys Ser Lys Asn 1 5 10 15 Ile Leu Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu 20 25 30 Leu Ala Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys 35 40 45 Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile 50 55 60 Tyr Lys Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln 65 70 75 80 Val Glu Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln 85 90 95 Lys Val Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala 100 105 110 Arg Glu Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu 115 120 125 Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu 130 135 140 Ala Asp Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro 145 150 155 160 Phe Asp Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala 165 170 175 Tyr Gly Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys 180 185 190 Thr Arg Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr 195 200 205 Phe Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val 210 215 220 Pro Gln Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr 245 250 255 Gly Lys Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val 260 265 270 Ala Ser Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys 275 280 285 Lys Val Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg 290 295 300 Phe Glu Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly 305 310 315 320 Asn Tyr Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser 325 330 335 Tyr Cys Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro 340 345 350 Leu Gln Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys 355 360 365 Phe Leu Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu 370 375 380 Met Met Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser 385 390 395 400 Tyr Ala Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly 405 410 415 Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp 420 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Leu Ser Asn Tyr Pro 145 150 155 160 Phe Asp Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala 165 170 175 Tyr Gly Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys 180 185 190 Thr Arg Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr 195 200 205 Phe Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val 210 215 220 Pro Gln Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr 245 250 255 Gly Lys Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val 260 265 270 Ala Ser Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys 275 280 285 Lys Val Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg 290 295 300 Phe Glu Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly 305 310 315 320 Asn Tyr Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser 325 330 335 Tyr Cys Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro 340 345 350 Leu Gln Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys 355 360 365 Phe Leu Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu 370 375 380 Met Met Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser 385 390 395 400 Tyr Ala Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly 405 410 415 Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp 420 425 430 Ser Trp Glu His Ile His Phe Ile Gly Lys Ile Gln Gly Ser Asp Ala 435 440 445 Gly Trp Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met Ile Pro Ala 450 455 460 Glu Gln Pro Leu Ser Thr Pro Leu Ser His Ser Thr Tyr Val Asp Tyr 465 470 475 480 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 485

Claims (64)

  1. 가용성 세포외 도메인 인간 CD39 (NTPDase1) 단백질에 결합하여 그것의 ATPase 활성을 억제할 수 있는 항체 또는 항체 단편으로서, 하기를 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편:
    (a) 아미노산 서열 DYNMH (SEQ ID NO: 8); YIVPLNGGSTFNQKFKG (SEQ ID NO: 9); 및 GGTRFAY (SEQ ID NO: 10)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 아미노산 서열 RASESVDNFGVSFMY (SEQ ID NO: 11); GASNQGS (SEQ ID NO: 12); 및 QQTKEVPYT (SEQ ID NO: 13)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 아미노산 서열 DYNMH (SEQ ID NO: 16); YINPNNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 17); 및 GGTRFAS (SEQ ID NO: 18)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 아미노산 서열 RASESVDNYGISFMY (SEQ ID NO: 19); AASTQGS (SEQ ID NO: 20); 및 QQSKEVPFT (SEQ ID NO: 21)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 아미노산 서열 DTYIN (SEQ ID NO: 24); RIDPANGNTKYDPKFQG (SEQ ID NO: 25); 및 WGYDDEEADYFDS (SEQ ID NO: 26)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 아미노산 서열 RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 27); AASNQGS (SEQ ID NO: 28); 및 HQSKEVPWT (SEQ ID NO: 29)을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (d) 아미노산 서열 SFWMN (SEQ ID NO: 32); EIDPSDFYTNSNQRFKG (SEQ ID NO: 33); 및 GDFGWYFDV (SEQ ID NO: 34)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 아미노산 서열 SASSSINSNYLH (SEQ ID NO: 35); RTSNLAS (SEQ ID NO: 36); 및 QQGSSLPRT (SEQ ID NO: 37)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 외생적으로 첨가된 ATP의 존재 하에서 CD39 단백질의 ATPase 활성을 억제하는 것인 항체 또는 항체 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 세포의 표면에서 인간 CD39 단백질에 결합할 수 있고 세포의 표면에서 상기 CD39 단백질의 ATPase 활성을 억제할 수 있는 것인 항체 또는 항체 단편.
  4. 제1항에 있어서, 항체는 Fc 도메인 및 인간 Fcγ 수용체 간 결합을 감소시키도록 변형된 인간 Fc 도메인을 갖는 항체이고, 항체는 L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S 의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 생성시키는 재조합 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한 것인 항체 또는 항체 단편.
  9. 제8항에 있어서, 암은 백혈병, 방광암, 신경교종, 교아세포종, 난소암, 골수종, 전립선암, 갑상선암, 식도암 또는 유방암인 항체 또는 항체 단편.
  10. 제8항에 있어서, 암은 폐암인 항체 또는 항체 단편.
  11. 제8항에 있어서, 암은 췌장암인 항체 또는 항체 단편.
  12. 제8항에 있어서, 암은 두경부암인 항체 또는 항체 단편.
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