WO2022237723A1 - 抗cd39抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

提供了抗CD39抗体、其抗原结合片段及其医药用途，还提供了包含所述抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体、包含抗CD39抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及所述抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。所述抗体能够与CD39特异性结合，展现出良好的抑制肿瘤生长的效果和较好的安全性。

Description

抗CD39抗体及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗CD39的抗体或其抗原结合片段。
背景技术
NTPDase 1(胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1)，也称为CD39，会水解细胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)，生成一磷酸腺苷(AMP)，AMP进一步被另一种酶CD73(胞外-5'-核苷酸酶)水解，生成腺苷，腺苷结合腺苷受体并抑制T细胞和自然杀伤(NK)细胞反应，从而抑制免疫系统。通过CD73/CD39途径生成腺苷被认为是调节性T细胞(Treg)免疫抑制功能的主要机制。
人CD39是510个氨基酸的蛋白质，具有7个可能的N-连接糖基化位点、11个半胱氨酸残基和2个跨膜区域。从结构上而言，其是由2个跨膜结构域、包含NH2-及COOH-端区段的小型细胞质结构域、以及由5个高度保守性结构域所组成的大型细胞外疏水性结构域进行表征，所述高度保守性结构域称为腺苷三磷酸双磷酸酶保守性区域(ACR)1至5，其对于酶的分解代谢活性至关重要。虽然CD39通常由在分子两端处的两个跨膜结构域锚定到膜，但最近还报道了CD39的可溶性催化活性形式可以在人类和小鼠循环中找到(Yegutkin等人，(2012)《美国实验生物学会联合会期刊(FASEB J.)》26(9):3875-3883)。
CD39组成性表达于脾脏、胸腺、肺脏及胎盘，且在这些组织中，其主要与内皮细胞和免疫细胞群如调节性T细胞(Treg)、自然杀伤(NK)细胞有关。CD39的表达在许多实体肿瘤(solid tumor)中增加，例如，结直肠癌、头颈癌、胰腺癌(Kunzli et al.,Am J Physiol,2006,292:223-230)、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌(Li et al.,Oncoimmunology,2017,6:6)、慢性淋巴细胞性白血病(Pulte et al.,Clin Lymphoma Myeloma Leuk,2011,11(4):367-372)和淋巴瘤、黑色素瘤(Dzhandzhugazyan et al.,FEBS Letters,1998,430:227-230)、卵巢癌、以及前列腺癌等。
由于CD39连同其他酶将ATP、ADP及AMP降解为腺苷，腺苷结合腺苷受体并抑制T细胞和自然杀伤(NK)细胞反应，从而抑制免疫系统。CD39调节剂可通过肿瘤特异性T细胞的激活、克隆扩增，从而激活效应T淋巴细胞进行肿瘤细胞的杀伤，因此CD39调节剂是针对这些癌症类型的潜在疗法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的抗CD39的抗体或其抗原结合片段，其能够与CD39特异性结合，对CD39水解ATP的酶活性具有显著抑制作用，较好地逆转CD4+T细胞的增殖抑制，而且展现出良好的抑制肿瘤生长的效果，同时没有毒副作用，具有较好的安全性。
本发明提供一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，所述的重链可变区包含至少1个如下HCDR：
HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；和/或
轻链可变区，所述的轻链可变区包含至少1个如下LCDR：
LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；
LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或所述的抗体轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其抗原结合片段，进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，和/或进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，和/或所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为鼠源抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的鼠源抗体或其片段，其进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的鼠源抗体或其片段，其进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为嵌合抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39嵌合抗体或其片段，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，或与SEQ ID NO:10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为人源化抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，其重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人种系重链IGHV1-2*02或其变体的FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，其轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区，优选包含人种系轻链IGKV1-33*01或其变体的FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11、12、13、14或15所示，或与SEQ ID NO:11、12、13、14或15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16或17所示，或与SEQ ID NO:16或17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序 列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与 SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4或其变体的重链恒定区，更优选所述的人源IgG4重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，或与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39人源化抗体或其片段，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选人源κ或其变体的轻链恒定区，更优选人源κ轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，或与SEQ ID NO:19具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
本领域技术人员根据上述的抗体重轻链可变区和恒定区的氨基酸序列，可以容易地知道上述抗体重链、轻链的全序列，并以此得知抗体序列全信息。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其片段，其轻链变体优选在轻链可变区有0-10个氨基酸变化。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗CD39抗体或其片段，其重链变体优选在重链可变区有0-10个氨基酸变化。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段选自Fab、Fv、scFv、Fab’或F(ab’) 2。
本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料可以是：
(1)一种编码如上所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的DNA分子；所述DNA分子可以分别编码抗体的重链和轻链部分，本领域技术人员根据抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，可以推知DNA序列，并为其设置合适的表达元件，使DNA分子能够表达本发明的抗体或其抗原结合片段；
(2)含有如上所述的DNA分子的表达载体；
(3)含有如上所述的DNA分子或表达载体的宿主细胞，或上述宿主细胞经培养后获得的培养液、菌悬液等培养物。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的宿主细胞，其中所述的宿主细胞 优选为人胚肾293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
本发明进一步提供一种生产抗CD39抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：培养如上所述的宿主细胞；进一步地，还包括从获得的培养物中分离抗体；以及对所述抗体进行纯化。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有根据本发明所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明进一步提供一种检测或诊断试剂盒，其含有根据本发明所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，用于检测、诊断、预后CD39或CD39介导的疾病或病症。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段、生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)在制备用于治疗或预防CD39介导的疾病或病症的药物中的用途。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段、生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)、药物组合物以及试剂盒在检测、诊断、预后CD39或CD39介导的疾病或病症中的用途。
本发明进一步提供一种治疗和预防CD39介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的根据本发明所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段、生物材料(如DNA分子、表达载体、宿主细胞及其培养物)或药物组合物。
本发明所述的CD39介导的疾病或病症为表达CD39的肿瘤，更优选为多发性骨髓瘤、结直肠癌、头颈癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、垂体癌、食管癌、软组织肉瘤、腹膜癌、胶质细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、胆管癌或胆囊癌。
附图说明
图1：嵌合抗体F03及对照抗体对细胞表面人CD39的结合活性。
图2：嵌合抗体F03及对照抗体对细胞表面CD39水解ATP的酶活性的抑制作用。
图3：人源化抗体逆转T细胞增殖抑制的作用。
图4：人源化抗体的体内抗多发性骨髓瘤效果。
图5：人源化抗体的体内抗黑色素瘤效果。
具体实施方式
术语和定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本发明所述的抗体是指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其变体的重链恒定区。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的抗CD39的单克隆抗体。制备时用CD39抗原注射试验对象(鼠)，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD39抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人抗体恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗CD39嵌合抗体的重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区，优选地，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示。所述的抗CD39嵌合抗体的轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区，优选地，抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。嵌合抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4重链 恒定区。嵌合抗体的轻链恒定区可选自人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选包含人源κ轻链恒定区。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指在不显著影响抗原结合特性的情况下，将非人来源(如小鼠)的CDR序列移植到人的抗体可变区框架。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应的缺点。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区进行最少反向突变，以保持活性。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有与人CD39抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’) 2片段、Fv片段和scFv片段，包含本发明所述的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中的一个或多个CDR区。
Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(scFv)。
Fab片段即由VL、VH、CL、CH1结构域组成的单价片段。
F(ab’) 2即由通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab’片段形成的二价片段。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人CD39或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
本发明所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
“亲和性(affinity)”或“结合性”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合对象(例如抗原)之间非共价交互作用的总和强度。除非另外表明，本发明中所使用的“亲和性(binding affinity)”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1交互作用的固有结合亲和力。分子X对其结合对象Y的亲和性通常以解离常数(KD)表示。亲和性可通过本领域已知的常用方法进行测定，包括本发明所述的那些，例如可使用例如表面等离子体共振(SPR)技术诸如仪器进行测定。
“特异性结合(specific binding或specifically binds to)”、“对...具有特异性(specific for)”、“选择性结合(selectively binds)”和“对...具有选择性(selective for)”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原的表位意指与非特异性或选择性交互作用有测定上不同的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合相较于对照分子的结合来测定。特异性结合亦可通过与类似于靶标的对照分子(诸如过量的未标示靶标)的竞争来测定。本发明使用的术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原交互作用的解离速率常数。此值亦称为k解离值。本发明使用的术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定抗体-抗原交互作用的缔合速率常数。此值亦称为k缔合值。本发明使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原交互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种抗CD39抗体或其抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻，如根据本领域已知的统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。在本发明中，所述抗体轻链或重链的变体即为在轻链或重链中发生0-10个氨基酸的“保守修饰”或“保守置换或取代”，本领域技术人员可以预期该变体具有与修饰或取代前基本相同的活性。此外，本发明中所述的抗体轻链或重链的变体还包括回复突变后的结果，即将人源化抗体FR区个别人源模板的氨基酸回复突变回相应位点的鼠源氨基 酸。本领域技术人员可以预期该变体具有与回复突变前的人源化抗体以及包含相同CDR的鼠源抗体相当或更好的活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症或症状的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要根据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同一的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同一性。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。本领域技术人员可以判断序列同一性百分比所表示的变化的碱基数或氨基酸数量。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞株”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同，包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
在本发明中，CD39蛋白的UniProtKB/Swiss-Prot登记号为P49961.1。本发明使用构建的过表达人CD39的HEK293细胞为抗原免疫小鼠，使其发生免疫反应产生抗CD39的鼠源抗体。
“CD39”和“CD39抗原(CD39antigen)”以及“CD39蛋白”在本发明中可互换使用。CD39也称为胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(基因：ENTPD1；蛋白质：NTPDase1，见www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/953)。CD39也曾被称为ATPD酶及SPG64。上述这些术语各自可互换使用。除非另行说明，所述术语包括由细胞天然表达或由经CD39基因转染的细胞表达的人CD39的任何变体、亚型及物种同源物。
SK-MEL-28是一种人黑色素瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39，用于检测抗CD39抗体对CD39的亲和力以及酶活抑制作用。将该细胞接种到CB17/SCID小鼠上建立的黑色素瘤模型，用于检测抗CD39抗体的体内抗肿瘤效果。
CD4+T细胞表达CD39和CD73，通过顺序反应可将周围环境中的ATP水解成腺苷，进而抑制CD4+T细胞的增殖。在富含ATP的环境中，加入抗CD39抗体，其能够抑制CD4+T细胞表面的CD39介导的ATP水解，从而解除CD4+T细胞的增殖抑制。
CD3/CD28 beads用于激活T细胞的增殖。
MOLP-8是一种人多发性骨髓瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39，将该细胞接种到CB17/SCID小鼠上建立的多发性骨髓瘤模型，用于检测抗CD39抗体的体内抗肿瘤效果。
本发明中涉及的编码抗CD39抗体的CDR、可变区或轻重链的DNA序列可以根据相应的氨基酸序列设计，这是本领域的常规技术。
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂或材料，为市场购买的常规试剂或材料。
实施例1 抗CD39鼠源抗体的筛选
1.1人CD39过表达细胞系的构建
将编码人CD39全长氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot；P49961.1)的核苷酸序列克隆到pLVX-IRES-Puro载体(Clontech，产品目录号：632183)，标记为pLVX-hCD39-IRES-Puro。
将pLVX-hCD39-IRES-Puro分别转染空白细胞HEK293细胞和CHOK1细胞，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，得到过表达人CD39的稳定细胞系，分别标记为HEK293-hCD39细胞和CHOK1-hCD39细胞。
1.2杂交瘤的制备和抗体筛选
6-8周龄的Balb/c和SJL小鼠(上海斯莱克)接收后在SPF(无特定病原体)条件下饲养。将上述HEK293-hCD39细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬为1-2×10 7细胞/mL的细胞悬液。每只小鼠免疫时腹腔注射0.5mL HEK293-hCD39细胞悬液。初次和第二次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫间隔3周，共免疫3次。
除初次免疫以外，每次加强免疫1周后采血，用FACS检测血清中产生抗人CD39抗体的效价和特异性。选择血清抗体效价较好的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)进行细胞融合制备杂交瘤细胞。具体方法为在融合前再进行一次加强免疫，3-5天后处死小鼠，收集脾细胞，用DMEM培养基(Gibco)清洗细胞3次，然后按活细胞数目2:1～4:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)混合，采用电融合法进行细胞融合。
融合后的细胞重悬于DMEM(Gibco)+20％胎牛血清+1×HT(Invitrogen)中，以100μL/孔接种在96孔板中，并在24小时后添加100μL DMEM+20％胎牛血清+2×HAT(Invitrogen)，将细胞培养板置于5％CO 2、37℃培养箱中。当细胞集落直径达到1-2毫米(通常在融合后10-14天)时，用
Figure PCTCN2022091703-appb-000001
eX3细胞生物学高内涵分析平台(Acumen)测定细胞上清对 CHOK1-hCD39的结合活性，挑选平均荧光强度(MFI)较高的阳性克隆扩增到24孔板，在DMEM+20％胎牛血清+1×HT中扩大培养。培养3天后取24孔板上清，进行二次筛选，FACS测定细胞上清对CHOK1-hCD39的结合活性(方法参照实施例2.2.1)，同时检测细胞上清对SK-MEL-28(ATCC)细胞膜表面CD39的酶活的抑制作用(方法参照实施例2.2.2)。
根据24孔板筛选结果，挑选酶活抑制较强的阳性母克隆，用有限稀释法在96孔板中进行亚克隆，在DMEM+20％胎牛血清+1×HT中，37℃、5％CO 2条件下培养。亚克隆7天后用Acumen进行初筛，挑选结合CHOK1-hCD39的阳性亚克隆扩增到24孔板继续培养。3天后二筛，检测细胞上清对CHOK1-hCD39的结合活性，以及对SK-MEL-28细胞膜表面CD39的酶活的抑制作用。
根据24孔板检测结果，将优选的亚克隆置于T75细胞培养瓶扩大培养，扩增后的亚克隆重悬于DMEM+15％胎牛血清+10％DMSO，在液氮中长期冻存，即得到本发明的杂交瘤细胞，其产生的抗体即为本发明的抗CD39鼠源单克隆抗体mF03。
1.3鼠源抗体氨基酸测序
对鼠源抗体mF03的可变区进行测序：提取实施例1筛选的杂交瘤细胞的mRNA，逆转录为cDNA后，通过通用引物进行PCR，将PCR得到的DNA产物进行测序分析，再翻译成氨基酸序列，并对可变区序列使用Kabat规则进行CDR区分析，得到结果如表1所示。
表1 抗人CD39鼠源抗体mF03的氨基酸序列
名称 序列编号
重链CDR1 SEQ ID NO:1
重链CDR2 SEQ ID NO:2
重链CDR3 SEQ ID NO:3
轻链CDR1 SEQ ID NO:4
轻链CDR2 SEQ ID NO:5
轻链CDR3 SEQ ID NO:6
重链可变区 SEQ ID NO:7
轻链可变区 SEQ ID NO:8
实施例2 嵌合抗体的制备和活性检测
2.1嵌合抗体的制备
根据本发明鼠源抗体mF03的重链、轻链可变区的氨基酸序列合成cDNA，并分别定向插入含有信号肽和人源重链IgG4(S228P)恒定区、信号肽和人源轻链kappa恒定区基因的表达载体pCDNA3.4(Invitrogen，A14697)，随后将轻重链以1:1混合，瞬转CHO-S细胞(Thermo)，收集表达上清，用MabSelect PrismA(GE,10293703)纯化CHO-S细胞表达的嵌合抗体，命名为F03。
表2 嵌合抗体F03的氨基酸序列
抗体名称 重链 轻链
F03 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10
2.2嵌合抗体活性检测
2.2.1亲和力
通过FACS法检测本发明的嵌合抗体F03与细胞膜表面CD39的结合情况。具体而言，收集CHOK1-hCD39细胞以1-3×10 5个细胞/孔加入96孔板中，同时加入梯度稀释的嵌合抗体F03(用1×PBS稀释抗体至16.7μg/mL作为首浓度，3倍梯度稀释)，4℃孵育30分钟；PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人IgG Fc二抗(Jackson immunoresearch，109095008)，4℃孵育30分钟；PBS洗涤，之后使用FACS仪(Beckman)检测细胞荧光强度。通过GraphPad软件处理数据。
同时参照美国专利US20190062448A1记载的抗体序列和方法制备得到抗体31895，用于阳性对照组，进行对照试验。抗体31895又被称为TTX-030，目前Tizona公司将其用于临床试验。
结果如图1所示，本发明的嵌合抗体F03和对照抗体31895对细胞膜表面人CD39的结合活性相近似。
2.2.2对细胞表面CD39酶活的抑制
将SK-MEL-28细胞以1.2-2.5×10 5个/mL、50μL/孔接种到96孔平板的孔中；加入用EMEM+10％FBS(ATCC)培养基梯度稀释的嵌合抗体F03(首浓度为1.67μg/mL，3倍梯度稀释)，37℃孵育过夜；弃去上清，用PBS洗涤细胞一次，加入40μM ATP(Sigma，A7699)，37℃孵育1小时；300g离心5min，将上清液转移到96孔可拆不透光细胞板(Thermo，463201)，1:1加入CTG溶液(
Figure PCTCN2022091703-appb-000002
Luminescent Cell Viability Assay，Promega G7571)，避光10分钟后用多功能酶标仪(Molecular Devices)检测化学发光读数。同时，设置ATP对照孔(不加入SK-MEL-28细胞和抗体，加入与实验组等量的ATP，其他同实验组)；细胞+ATP对照孔(加入SK-MEL-28细胞和ATP，不加入抗体，其他同实验组)；阳性对照孔(以实施例2.2.1中的抗体31895作为阳性对照抗体，其他同实验组)。酶活抑制率计算公式：((细胞+ATP+抗体)-(细胞+ATP))/(ATP-(细胞+ATP))×100％。
结果如图2所示，本发明的嵌合抗体F03能够较好的抑制细胞表面CD39水解ATP的酶活性，且其抑制效果优于阳性对照抗体31895。
实施例3 人源化抗体的制备和检测
3.1人源化序列设计和抗体制备
在本发明鼠源抗体mF03重链可变区、轻链可变区的基础上进行人源化改造。将鼠源抗体重链和轻链的6个CDR嫁接到与鼠源FR区具有较高相似度的人源模板上。通过序列 比对(NCBI-Igblast)，选择与mF03重链可变区、轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为人源模板，其中重链可变区模板为人种系重链IGHV1-2％*02，轻链可变区的模板为人种系轻链IGKV1-33*01。
CDR移植完成的抗体通过同源建模，预测在鼠抗FR区中可能决定抗体结构的关键氨基酸，采用回复突变的方法，将FR区个别人源模板的氨基酸回复突变回相应位点的鼠源氨基酸。
对得到的人源化抗体进行测序：根据人源化抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列合成cDNA，并插入含有信号肽和人IgG4(S228P)重链恒定区、含有信号肽和人轻链kappa恒定区基因的pcDNA3.4表达载体中，得到全长抗体的表达质粒。重链和轻链表达质粒共转染CHO-S细胞，培养后收获上清进行用MabSelect PrismA纯化，得到本发明的人源化抗体。
表3 人源化抗体序列
Figure PCTCN2022091703-appb-000003
3.2人源化抗体的检测
3.2.1亲和力和ATP酶活抑制的测定
参照实施例2.2.1和2.2.2方法，检测本发明人源化抗体对SK-MEL-28细胞的亲和力以及对SK-MEL-28细胞表面CD39水解ATP的酶活的抑制作用。
结果如表4所示，F03-6～F03-15与SK-MEL-28细胞的亲和力与嵌合抗体F03相当；F03-6～F03-15对细胞表面CD39水解ATP的酶活抑制作用与嵌合抗体F03相当。
表4 人源化抗体的细胞亲和力和酶活抑制作用
Figure PCTCN2022091703-appb-000004
Figure PCTCN2022091703-appb-000005
3.2.2 CD4+T细胞增殖抑制测定
复苏冻存的人外周血淋巴细胞(PBMC)，在1640+10％FBS(Gibco)培养基中过夜培养，用miltenyi biotec(cat#130-096-533)试剂盒从PBMC中分离CD4+T细胞；将分离的CD4+T细胞用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)染色，得到CD4+T-CFSE。将CD4+T-CFSE与CD3/CD28 beads(Gibco，11161D)按照5：1混合后，将细胞按照1.25×10 5/孔进行铺板(50μL/孔)，加入50μL梯度稀释的待测抗体，在孵箱中作用30min-60min；最后每孔加入50μL的500-1000μM ATP，置于细胞孵箱作用3～5天，用流式细胞仪检测CD4+T细胞的增殖。
同时参照WO2019096900A1记载的抗体序列和方法制备得到I-394抗体用于阳性对照组；设置的对照组包括：1)激活的CD4+T-CFSE对照组，该组不加入抗体和ATP，其他与实验组相同，代表T细胞在正常状态下可被激活；2)激活的CD4+T-CFSE+ATP对照组，该组不加入抗体，其他与实验组相同，代表的是加入ATP后T细胞的增殖受到抑制；实验组考察的是待测抗体是否具有逆转T细胞的增殖抑制作用。
结果如图3所示：本发明人源化抗体可以较好的逆转CD4+T细胞的增殖抑制，且F03-14和F03-15的效果优于阳性对照抗体I-394。
3.2.3表面等离子体共振法测定亲和力
使用Biacore 8K(GE，生物分子相互作用分析仪)测定人源化抗体与重组抗原的结合动力学。具体而言，将抗人IgG Fc抗体直接固定在生物传感器芯片上，捕获待测抗体。以抗原hCD39-ECD-His(ACRO，CD9-H52H4)为流动相，使用7个浓度梯度(首浓度200nM，2倍梯度稀释)。测定结合速率常数ka(M -1s -1)和解离速率常数kd(s -1)。然后使用公式：KD＝kd/ka，根据动力学速率常数计算抗体和相关靶蛋白之间反应的平衡解离常数KD(M)。结果如表5所示，本发明的人源化抗体保持了嵌合抗体F03对靶抗原的高亲和力。
表5 人源化抗体的亲和力
抗体编号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
F03 9.43E+04 2.52E-04 2.67E-09
F03-11 8.01E+04 3.36E-04 4.20E-09
F03-12 8.99E+04 3.31E-04 3.68E-09
F03-14 6.98E+04 3.10E-04 4.43E-09
F03-15 5.28E+04 1.76E-04 3.33E-09
3.2.4体内抗多发性骨髓瘤活性
CB17/SCID小鼠(上海斯莱克，6～8周)随机分组，每组5只，第0天，于每只小鼠的右腹侧接种5×10 6个MOLP-8细胞(多发性骨髓瘤细胞，DSMZ)；第1天开始给药(包括本发明抗体F03-12、F03-14、F03-15，对照抗体31895，空白对照组注射与实验组等体积的PBS)，静脉注射与腹腔注射交替进行，一周给药2次，连续给药3周，实验组小鼠注射抗体(F03-12、F03-14、F03-15)的剂量为10mg/kg，31895对照组小鼠注射抗体的剂量为20mg/kg。随时间推移监测肿瘤生长，测量方法为用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，并通过公式TV＝(长×宽 2)/2计算肿瘤体积，每组小鼠取肿瘤体积的平均值作肿瘤生长曲线图。
结果如图4所示，截止第25天，人源化抗体和阳性对照31895均展示较好的抑制肿瘤生长的作用，并且人源化抗体F03-12、F03-14、F03-15优于阳性对照31895。
3.2.5体内抗黑色素瘤活性
CB17/SCID小鼠(上海斯莱克，6～8周)随机分组，每组5只，第0天，于每只小鼠的右腹侧接种1×10 7个SK-MEL-28细胞(黑色素瘤细胞，ATCC)，细胞事先与等体积的基质胶(康宁)混合；第1天开始给药(本发明抗体F03-14，空白对照组注射与实验组等体积的PBS)，静脉注射与腹腔注射交替进行，一周给药2次，连续给药3周，每只小鼠注射抗体的剂量为10mg/kg。随时间推移监测肿瘤生长，测量方法为用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，并通过公式TV＝(长×宽 2)/2计算肿瘤体积，每组小鼠取肿瘤体积的平均值作肿瘤生长曲线图。
结果如图5所示，与空白对照相比，F03-14展示较好的抑制肿瘤生长的作用。
序列：
Figure PCTCN2022091703-appb-000006
Figure PCTCN2022091703-appb-000007
Figure PCTCN2022091703-appb-000008

Claims (14)

  1. 抗CD39抗体或其抗原结合片段，其包含：
    重链可变区，所述重链可变区包含至少1个如下HCDR：
    HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
    HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
    HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；和/或
    轻链可变区，所述轻链可变区包含至少1个如下LCDR：
    LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；
    LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
    LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列；
    优选地，其中所述的重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或
    所述的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  2. 如权利要求1所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区，和/或进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区；
    优选地，其中所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
  3. 如权利要求1-2任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，为鼠源抗体或其抗原结合片段，进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，和/或进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
  4. 如权利要求1-2任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，为嵌合抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区；
    优选地，所述嵌合抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，或与SEQ ID NO:10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
  5. 如权利要求1所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，为人源化抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人种系重链IGHV1-2*02或其变体的FR区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区，优选包含人种系轻链IGKV1-33*01或其变体的FR区；
    优选地，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11、12、13、14或15所示，或与SEQ ID NO:11、12、13、14或15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16或17所示，或与SEQ ID NO:16或17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；
    进一步优选地，所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者
    所述抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
  6. 如权利要求5所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选包含人源κ或其变体的轻链恒定区；
    优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，或与SEQ ID NO:18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，和/或轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，或与SEQ ID NO:19具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
  7. 如权利要求1-6任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段选自Fab、Fv、scFv、Fab’或F(ab’) 2。
  8. 一种生物材料，为
    (1)编码如权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段的DNA分子；
    (2)含有如(1)所述的DNA分子的表达载体；
    (3)含有如(1)所述的DNA分子或如(2)所述的表达载体的宿主细胞或其培养物，其中所述的宿主细胞优选为人胚肾293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
  9. 一种生产抗CD39抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：培养权利要求8所述的宿主细胞；优选地，还包括从获得的培养物中分离抗体，以及对所述抗体进行纯化。
  10. 一种药物组合物，其含有如权利要求1-7任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
  11. 一种检测或诊断试剂盒，其含有权利要求1-7任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段。
  12. 如权利要求1-7任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段、如权利要求8所述的生物材料在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防CD39介导的疾病或病症；优选地，所述的CD39介导的疾病或病症为表达CD39的肿瘤，更优选为多发性骨髓瘤、结直肠癌、头颈癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、垂体癌、食管癌、软组织肉瘤、腹膜癌、胶质细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、胆管癌或胆囊癌。
  13. 一种治疗或预防CD39介导的疾病或病症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的权利要求1-7任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段、或权利要求8所述的生物材料、或权利要求10所述的药物组合物；优选地，所述的CD39介导的疾病或病症为表达CD39的肿瘤，更优选为多发性骨髓瘤、结直肠癌、头颈癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、垂体癌、食管癌、软组织肉瘤、腹膜癌、胶质细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、胆管癌或胆囊癌。
  14. 如权利要求1-7任一项所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段、如权利要求8所述的生物材料、如权利要求10所述的药物组合物或如权利要求11所述的试剂盒，在检测、诊断、预后CD39或CD39介导的疾病或病症中的用途；优选地，所述的CD39介导的疾病或病症为表达CD39的肿瘤，更优选为多发性骨髓瘤、结直肠癌、头颈癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、垂体癌、食管癌、软组织肉瘤、腹膜癌、胶质细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、胆管癌或胆囊癌。
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