MX2010012031A - Anticuerpos anti-il-6/il-6r y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos que reconocen el complejo de IL-6/IL-6R. La invención proporciona también métodos de uso de tales anticuerpos monoclonales como materiales terapéuticos, de diagnóstico y profilácticos.

Description

ICUERPOS ANTI-IL-6/IL-6R Y METODOS DE USO DE LOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio icitud Provisional de los Estados Unidqs No. 61/1 sentada el 13 de Mayo de 2008, y la S visional de los Estados Unidos No. 61/1 sentada el 25 de Septiembre dé 2008, cuyo conte orpora por referencia en su totalidad en la prese CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general eración de anticuerpos monoclonales , por ejemp icuerpos monoclonales totalmente humanos, que r complejo IL-6/IL-6R, a los anticuerpos monoclona mplo, los anticuerpos totalmente humanos que r to el com le o IL-6 IL-6R como IL-6R a los mé és de un complejo receptor que consiste de un r cífico de IL-6 (IL-6R) y una subunidad de trans señal (gpl30) . La señalización desregulada de do implicada en la patogénesis de muchas enferm s como el mieloma múltiple, enfer inmunitarias y el cáncer de próstata. En consec ste una necesidad de terapias que neutralic ividades biológicas de IL-6 y/o IL-6R.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anti clonales tales como los anticuerpos monoc lmente humanos que reconocen la ínterleucina 6 a a la membrana ("IL-6") cuando se forma en un c el receptor de IL-6 (es decir, el complejo hum -6R ("IL-6Rc") (es decir, el IL-6Rc expresado rficie celular o en forma soluble) ) . Los anticue a IL-6Rc, en donde éstos también se unen a IL- decir, cuando no está formado en complejo con IL El problema a ser resuelto por la p ención es la generación de anticuerpos que se lejo formado por IL-6R y la IL-6 para evitar ón del complejo IL-6/IL-6R ("IL-6RC") a la glico smembranal gpl30 y posterior señalización (ta 0 trans) , que se activa por el complejo de señal 6Rc/gpl30.

Los anticuerpos de la invención modul mplo, bloquean, inhiben, reducen, anta tralizan o interfieren de otra manera con la int re IL-6Rc y gpl30. La unión de IL-6 e IL-6R par complejo IL-6Rc permite que IL-6Rc interactú cie de otro modo con gpl30, una glico smembranal. En particular, la unión de IL-6 duce a la homodimerización enlazada a disulfuro A diferencia de los anticuerpos que se une IL-6R de forma individual, por ejemplo, en la e la IL-6 se une a IL-6R, los anticuerpos nción no inhiben o interfieren de otro modo eracción entre IL-6 e IL-6R para formar el compl Los anticuerpos de la invención, por lo tanto, concentraciones que son significativamente más ba concentraciones necesarias para los anticuer quean o interfieren con la interacción entre IL-6 por ejemplo, los anticuerpos que compiten con IL rse a IL-6R, o viceversa. En algunas modalida centración de los anticuerpos de la invención es veces menor que la concentración necesaria icuerpo que bloquea o interfiere de otro modo eracción entre IL-6 e IL-6R. Para anticuerp quean o interfieren de otro modo con la inte re IL-6 e IL-6R se debe usar una ran concent nción incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 39B9 cuerpo 39B9 VL5, el anticuerpo 12A y el anticue rnativamente , el anticuerpo monoclonal es un ant se une al mismo epítopo que el anticuerpo 39B9 cuerpo 39B9 VL5, el anticuerpo 12A y el anticue s anticuerpos se denominan, respectivamente, sivo, anticuerpos uhuIL-6Rc" . Los anticuerpos uyen anticuerpos monoclonales totalmente human anticuerpos monoclonales humanizados y anti éricos . Estos anticuerpos muestran especifici Rc e IL-6R, y se ha demostrado que modula plo, bloquean, inhiben, reducen, antag ralizan o interfieren de otro modo con la señal acelular mediada por IL-6Rc (señalización c s) .

En una modalidad preferida, los anti lmente humanos de la invención inclu en lementariedad de la cadena pesada que deter on 3 (CDR3), en donde X es M o L; y (iv) la se aminoácidos consensual TAVXYCAR (SEQ ID NO: 45) on de marco 3 (FRW3) , en donde X es F o Y.

Por ejemplo, en una de las moda feridas, el anticuerpo huIL-6Rc incluye la secue oácidos QQSNSYPLT (SEQ ID NO: 26) en la región na ligera, la secuencia de amin LFDTTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 33) en la región na pesada, la secuencia de aminoácidos DRDILTDYY ID NO: 36) en la región CDR3 de cadena pesad encia de aminoácidos TAVYYCAR (SEQ ID NO: 39) ión FR 3. Este anticuerpo se conoce aquí c icuerpo NI-12OIA.

En otra de las modalidades preferid icuerpo huIL-6Rc incluye la secuencia de amin SYPLT (SEQ ID NO: 26) en la re ión CDR3 de NSYPLT (SEQ ID NO: 26) en ,1a región CDR3 de era, la secuencia de aminoácidos GilPAFETTKYAQKF NO: 34) en la región CDR2 de cadena pesada, la se aminoácidos DRDILTDYYPLGGMDV (SEQ ID NO: 37) ión CDR3 cadena pesada, y la secuencia de ami YYCAR (SEQ ID NO: 39) en la región FRW3. Este ant conoce aquí como el anticuerpo NI-1201C.

En otra de las modalidades preferid icuerpo huIL-6Rc incluye la secuencia de ami QSYPLT (SEQ ID NO: 32) en la región CDR3 de era, la secuencia de aminoácidos GIIPAFETTKYAQKF NO: 34) en la región CDR2 de cadena pesada, la s aminoácidos DRDILTDYYPLGGMDV (SEQ ID NO: 37) ión CDR3 de cadena pesada, y la secuencia de ami YYCAR (SEQ ID NO: 39) en la región FRW3. Este ant conoce aquí como el anticuerpo ID NI-1201D.

En otras modalidades el anticuer o Los anticuerpos totalmente humanos ención contienen una región variable de cadena tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID 12. Los anticuerpos totalmente humanos de la i tienen una región variable de cadena ligera que t uencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 4, 6, 1 anticuerpo se une a IL-6R, a IL-6R formado en c IL-6 (es decir, IL-6Rc) o ambos.

Los tres CDRs de cadena pesada inclu ión 1 que determina la complementariedad de la ada variable (VH) (CDR1) que incluye una secue noácidos por lo menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99 ntica a una secuencia seleccionada del grupo for SEQ ID NOS: 15, 18 y 21; una región 2 que deter plementariedad de VH (CDR2) que incluye una secue noácidos or lo menos 90% 92% 95% 97% 98% 99 Los tres CDRs de cadenas ligeras incluyen cadena ligera variable (VL) que incluye una secue oácidos por lo menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99 tica a una secuencia seleccionada del grupo form ID NO: 24, 27, 28 y 30; un CDR2 de VL, que incl encia de aminoácidos por lo menos 90%, 92%, 5 , 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácido ID NO: 25, y un CDR3 de VL, que incluye una se aminoácidos por lo menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo la SEQ ID NO: 26, 29, 31 y 32. El anticuerpo s 6R, IL-6R formado en complejo con IL-6 {es dec ) o ambos.

Los anticuerpos huIL-6Rc provistos en la p anticuerpos totalmente humanos que se unen al c 6/IL-6R (IL-6Rc) y evitan que IL-6Rc se una a g o ue la cascada de señalización intracelular oácidos en IL-6 y/o IL-6R humano. Los anticuerpo nción se unen inmunoespecíficamente a IL-6RC e donde el anticuerpo se une a un epítopo que incl ás residuos de aminoácidos de IL-6 y/o IL-6R hum ferencia, los anticuerpos huIL-6Rc aquí descr a un epitopo en el dominio 3 del receptor de IL . Más preferentemente, el epítopo al que se u icuerpos huIL-6Rc incluye por lo menos la secue oácidos AERSKT (SEQ ID NO: 46) .

Los anticuerpos de la invención también i icuerpos totalmente humanos que se unen específi L-6Rc, y los anticuerpos que se unen específi o a IL-6Rc como a IL-6R, en donde el ant enta una inhibición superior al 50% de IL-6 act iada de la vía JAK/STAT y la cascada de MA plo, los anticuerpos de la presente invención pr ibición su erior al 55%; 60%, 65%, 70%, 75%, 80 iado con tales patologías, mediante la adminis un anticuerpo monoclonal de la invención (por e cuerpo monoclonal totalmente humano) a un sujet se desea tal tratamiento o prevención. El s ar es, por ejemplo, un humano. El anticuerpo mon administra en una cantidad suficiente para enir o aliviar un síntoma asociado con la patolo idad de anticuerpo monoclonal suficiente para t enir la patología en el sujeto es, por ejemp idad que es suficiente para reducir la act cida por IL-6Rc de la vía JAK/STAT o la cas . Por ejemplo, la activación inducida por IL-6R JAK/STAT o la cascada de MAPK se reduce cuando e activación de STAT3 en presencia de un ant clonal de la invención es mayor o igual al 5 , 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95 0% m s ba o ue un nivel de control de la activa cuerpo monoclonal totalmente humano) incluye plo, la sepsis, el cáncer (por ejemplo, la enf mieloma múltiple (MM) , carcinoma de células ) , leucemia de células plasmáticas, linfoma, tr nfoproliferativo (BLPD) , y cáncer de pro rción ósea, osteoporosis , caquexia, pso erulonefritis proliferativa mesangial , sarc si, linfoma relacionado con el SIDA, y enfer lamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide, a pática juvenil de inicio sis rgammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, rosa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , esc tiple, enfermedad de Castleman, gammapatia d ma cardiaco, asma, asma alérgica y diabetes ndiente de insulina autoinmunitaria) .

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo nción ueden incluir un anticuerpo de la invenci sis, cáncer (por ejemplo, enfermedad del tiple ( ) , carcinoma de células renales (RCC) , 1 células plasmáticas, linfoma, trastor foproliferativo (BLPD) , y cáncer de próstata) , re , osteoporosis, caquexia, psoriasis, glomerulo liferativa mesangial, sarcoma de Kaposi, acionado con el SIDA, y enfermedades inflamatori plo, artritis reumatoide juvenil de inicio si ritis idiopática, hipergammaglobulinemia, enferm n, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico lerosis múltiple, enfermedad de Castlem n, gammap , mixoma cardiaco, asma, asma alérgica y litus dependiente de insulina autoinmunitariá icuerpos de la invención también se utiliza ctivos en equipos de diagnóstico o como herramie gnóstico, o estos anticuerpos pueden ser utiliz a os de com etencia ara enerar reactivos tera é Las Figuras 3A y 3B son una se straciones que representan la capacidad del ant 1201 para bloquear la fosforilación de STAT-3 i la señalización cis de IL-6.

La Figura 4 es una gráfica que repres acidad del anticuerpo NI- 1201 para bloqu alización trans de IL-6 mediada por la prot ión del complejo IL-6/IL-6R humano soluble ( ) .

La figura 5 es una gráfica que repres ón del anticuerpo NI-1201 unido a IL-6R unid bran .

Las Figuras 6A-6D son una serie de ilust ráficas que representan el mapeo del epítopo de IL-6R.

Las Figuras 7A y 7B son una ilustració fica que representa la capacidad del anticuerpo rficie celular) . La invención proporciona icuerpos monoclonales que se unen específicament en donde los anticuerpos también se unen a do no están como complejo con IL-6. Estos anti enominan colectivamente como anticuerpos whuIL-6 icuerpo es por ejemplo, un anticuerpo totalmente Los anticuerpos de la invención s cíficamente a IL-6Rc y/o tanto a IL-6Rc como I e el anticuerpo se une a un epítopo que incluy residuos de aminoácidos de IL-6, IL-6R hum S .

Los anticuerpos de la presente invención IL-6Rc y/o tanto a IL-6Rc como al epítopo de una constante de unión en equilibrio (Kd) de ejemplo, < 100 nM, de preferencia < 10 nM, ferentemente < 1 nM. Por ejemplo, los anticuerpo rovistos en la resente muestran un K en el in imula la movilización de la energía que llev eratura corporal aumentada. IL-ß puede ser se los macrófagos en respuesta a moléculas micr cíficas, conocidas como patrones moleculares as atógenos (PAMP) . Estos PAMP se unen a moléc cción muy importantes del sistema inmunitario ados receptores tipo Toll (TLR) , que están prese superficie celular {o en los compart acelulares) que inducen cascadas de señal acelular que originan la producción de ci lamatorias. IL-6 también es esencial para el crec hibridoma y se encuentra en muchos medios de el lementarios como el Briclon.

IL-6 señala a través de un complejo rece cina tipo 1 de superficie celular que consist na IL-6R de unión al ligando (también conoci 26) el com onente l30 de transduccion d ivando de este modo el receptor. Estos complejos as regiones intracelulares de gpl30 para inic ada de transducción de señal a través de tores de transcripción, cinasas Janus ( sductores de Señales y Activadores de la Transe ?) . Por consiguiente, la neutralización lización de IL-ß es una estrategia tera ncial en el tratamiento de trastornos com plo, sepsis, cáncer (por ejemplo, enfermedad de tiple (MM) , carcinoma de células renales (CCR) , 1 células plasmáticas, linfoma, tr foproliferativo B (BLPD) , y cáncer de pró rción ósea, osteoporosis , caquexia, pso erulonefritis proliferativa mesangial, sarc si, linfoma relacionado con el SIDA, y enfe lamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide, a ática uvenil de inicio sis cional de IL-6Rc. Las actividades funcionales de luyen, por ejemplo, la señalización intracel és de la activación de la vía JAK/STAT y la act la cascada de MAPK, la producción de proteínas da, la producción de anticuerpos y la diferenciac liferación celulares. Por ejemplo, los anticuerpo inhiben total o parcialmente la actividad funci 6Rc al modular, bloquear, inhibir, redu agonización, neutralizar, o de otra manera int cial o completamente con la unión de IL- onente gpl30 del receptor de transducción de señ Se considera . que los anticuerpos ían, bloquean, inhiben, reducen, anta tralizan o interfieren de otro modo completamente ividad funcional de IL-6Rc cuando el nivel de ac cional de IL-6Rc en presencia del anticuerpo huI minuido por lo menos el 95%, por ejemplo, en 96 plo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80% en comparación con el nivel de actividad de IL falta de unión con un anticuerpo huIL-6Rc descrit sente .

Definiciones A menos que se indique lo contrario, los t ntíficos y técnicos utilizados en relación sente invención, tendrán los ' significados ent nmente por los que tienen experiencia ordinari nica. Además, a menos que se requiera de otro m contexto, los términos en singular incluir ralidades y los términos en plural inclui gular. En general, las nomenclaturas utiliza exión con, y técnicas de, cultivo de células y t logia molecular y química de proteínas y o inucleótidos e hibridación descritas en la prese eriores se realizan generalmente de acuerdo odos convencionales conocidos en la técnica cribe en varias referencias generales y más espe se citan y analizan a lo largo de la p ecificación. Véase por ejemplo, Sambrook ecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. , Col or Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ( nomenclaturas utilizadas en conexión con, cedimientos de laboratorio y técnicas de la lítica, química orgánica sintética, y la química armacéutica descritos en la presente son los que ocidos y de uso común en la técnica. Se nicas estándares para la síntesis química, ico, preparación farmacéutica, formula inistración, y tratamiento de los pacientes.

Según lo utilizado de acuerdo con la p cripción, los siguientes términos, a menos Tal como se utiliza en la presente, el icuerpo" se refiere a las moléculas de inmunogl orciones inmunológicamente activas de molécu noglobulina (Ig) , es decir, moléculas que conti o de unión al antígeno que se une específi unorreacciona con) a un antígeno. Por " cíficamente" o " immunorreacciona con" o "á ra" se entiende que el anticuerpo reacciona co determinantes antigénicos del antígeno desead ciona con otros polipéptidos o se une en afinida baja (Kd > 10"6) . Los anticuerpos incluye ricción, fragmentos policlonales, monocl éricos, dAB (anticuerpo de dominio) , de illa, Fab Fab, y F(ab,)2, scFvs, y una biblio esión de Fab.

Se sabe que la unidad estructural bás icuer o com rende un tetrámero. Cada tetrám ral, las moléculas de anticuerpos obtenidas nos se relacionan con alguna de las clases Ig i IgE e IgD, que se diferencian entre sí raleza de la cadena pesada presente en la mo nas clases tienen subclases también, tales com , y otros. Además, en los seres humanos, la ra puede ser una cadena kappa o una cadena lambd El término "anticuerpo monoclonal" ( posición de anticuerpo monoclonal" , como se úti presente, se refiere a una población de moléc cuerpos que contienen solamente una especie mo la molécula de anticuerpo que consiste de u ucto génico de cadena ligera y un único producto cadena pesada. En particular, las region rminan la complementariedad (CDR) del ant clonal son idénticas en todas las moléculas ación. Los anticuerpos monoclonales contienen u IgG-L, IgG2/ y otras. Además, en los seres huma na ligera puede ser una cadena kappa o una da.

El término "sitio de unión al antíg ción de unión" se refiere a la parte de la molé noglobulina que participa en la unión al antíg o de unión al antígeno está formado por resi oácidos de las regiones variables N- terminales í cadenas pesadas ("H") y ligeras ("L"). Tres tra rgentes dentro de las regiones V de las cadenas ligeras, a las que se denominan como "r rvariables" , se interponen entre tramos flanq conservados conocidos como "regiones de marco" , este modo, el término "FR" se refiere a las sec aminoácidos que se encuentran naturalmente e centes a, las regiones hipervariables no lobulinas . En una molécula de anticuer o, l lementariedad" , o "CDR" . La asignación oácidos a cada dominio está de acuerdo c iniciones de las Secuencias Kabat de Proteí rés Inmunológico (National Institutes of esda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk 1. 196: 901-917 (1987), Chothia et al. Nature 34 (1989) .

Como se utiliza en la presente, el ítopo" incluye cualquier determinante de proteín tener unión específica a una inmunoglobulina o fr la misma, o un receptor de células T. El ítopo" incluye cualquier determinante de proteín tener unión específica a una inmunoglobulina o r células T. Los determinantes epitópicos por lo sisten de agrupaciones de superficie químicamente moléculas tales como aminoácidos o cadenas later car y usualmente tienen características espe produce entre una molécula de inmunoglobulin ígeno para el que la inmunoglobulina es específ rza, o afinidad de interacciones de unión inmu puede expresar en términos de la consta ociación (Kd) de la interacción, en donde una resenta una mayor afinidad. Las propiedades d unológica de polipéptidos seleccionados se ntificar utilizando métodos bien conocidos ica. Uno de estos métodos implica la medición ocidades de formación y disociación de sitio de ígeno/complejo de antígeno, en donde esas vel enden de las concentraciones de los socios plejos, la afinidad de la interacción, y los pa métricos que también influyen en la velocidad e ecciones. De este modo, tanto la "constante de v ivada" (Kon) como la "constante de velocidad ina f) se pueden determinar mediante el cálculo ilibrio (Kd) es < 1 µ?, de preferencia < 100 ferentemente < 10 nM, y lo más preferentemente < ta aproximadamente 1 pM, según lo medido por es como ensayos de unión de radioligando o ilares conocidos por los expertos en la técnica.

El término "polinucleótido aislado" c liza en la presente significará un polinucleó e genómico, o de origen sintético o alguna com los mismos, que en virtud de su orig linucleótido aislado" (1) no se asocia con la t una porción de un polinucleótido en el linucleótido aislado" se encuentra en la natural á enlazado operativamente a un polinucleótido á enlazado en la naturaleza, o (3) no se produc uraleza como parte de una secuencia más gran inucleótidos de acuerdo con la invención inclu éculas de ácido nucleico que codifican pa mismos, que en virtud de su origen, o fu ivación, la "proteína aislada" (1) no se aso teínas que se encuentran en la naturaleza, ( re de otras proteínas de la misma fuente, por e re de proteínas marinas, (3) se expresa por una una especie diferente, o (4) no se produce raleza .

El término "polipéptido" . se utiliza sente como un término genérico para referirs teína nativa, fragmentos, o análogos de una se ipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de la p iva, y los análogos son especies del género polip polipéptidos de acuerdo con la invención compren éculas de inmunoglobulina de cadena pesada repres las SEQ ID NOS: 2, 8 y 12, y las moléc noglobulina de cadena ligera representadas en NOS: 4, 6, 10 14, así como moléculas de anti ejemplo, una secuencia ele polipéptido o polinuc está presente en un organismo (incluyendo los se puede aislar de una fuente en la naturaleza y a. sido modificada intencionalmente por el hombr oratorio o de otra manera, es de origen natural.

El término "enlazado operativamente" c liza en la presente, se refiere a las posiciones ponentes que se describen como están en una relac permite funcionar en su forma propuesta. Una se control "enlazada operativamente" a una secue ificación se liga de tal manera que la expresió uencia de codificación se realiza en con patibles con las secuencias de control.

El término "secuencia de control" como se la presente, se refiere a las secuenc inucleótidos que sean necesarias para efect resión el rocesamiento de secuencias de codif tende que incluya, como mínimo, todos los comp presencia sea esencial para la expr esamiento, y también puede incluir comp ionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemp encias guías y las secuencias de socios de fus ino "polinucleótido" a que se refiere en la pr ifica un boro polimérico de nucleótidos de por l bases de longitud, ya sean ribonucleót xinucleótidos o una forma modificada de cualqui nucleótido. El término incluye formas de hebra s le de ADN.

El término "oligonucleótido" a que se ref presente incluye nucleótidos de origen natu ificados, enlazados entre sí por enlac onucleótidos de origen natural y de origen no n oligonucleótidos son un subconjunto de polinuel generalmente comprende una longitud de 200 El término "nucleótidos de origen natural" refiere en la presente incluye desoxirribonucleó onucleótidos . El término "nucleótidos modifica se refiere en la presente incluye los nucleóti os de azúcar; modificados o sustituidos y simila ino "enlaces de oligonucleótidos" al que se ref presente incluye enlaces de oligonucleótidos tal forotioato, fosforoditioato, fosforosele forodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforani foronmidato, y similares. Véase por ejemplo, La al. Nucí. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al.

. Soc. 106: 6077 (1984), Stein et al. Nucí. Aci 3209 (1988), Zon et al. Anti Cáncer Drug Design 91) ; Zon et al. Oligonucleotids and Analogs: A Pr roach, pp 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford Uni SS, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec et al. Pat Estados Unidos No. 5,151,510; U lmann and tidades apreciables de unión detectable a leicos no específicos. Las condiciones d rosidad se pueden utilizar para lograr condici ridación selectiva como se conoce en la técni cute en la presente. En general, la homolo uencia de ácidos nucleicos entre los polinucle oligonucleótidos , y los fragmentos de la inve secuencia de ácido nucleico de interés será a 80%, y más típicamente, de preferencia con ho a vez mayores de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 10 uencias de aminoácidos son homologas si exi tidad parcial o completa entre sus secuenci mplo, el 85% de homología significa que el 85% noácidos son idénticos cuando las dos secuen nean para igualarse al máximo. Se permiten íos (en cualquiera de las dos secuencias que se i las lon itudes de es acios vacíos que se igu penalización por espacio vacío de 6 o más. Ver D ., en Atlas of Protein Sequence and Structure, (Volumen 5, National Biomedical Research Fou 72) ) y el Suplemento 2 para este volumen, pp 1- secuencias o partes de ellas son más preferen logas si sus aminoácidos son mayores o iguales tico cuando se alinean óptimamente utiliza rama ALIGN. El término "corresponde a" se utiliz sente en el sentido de que una secuen inucleótidos es homologa (es decir, es idént rietamente relacionadas evolutivamente) a la tota na porción de una secuencia de polinucleóti erencia, o que una secuencia de polipéptidos es i una secuencia de polipéptidos de referenc traposición, el término "complementaria a" se uti presente en el sentido de que la se lementaria es homologa a la totalidad o a una encial" , "porcentaje de identidad secuenci entidad sustancial" . Una "secuencia de referen secuencia definida usada como base para una comp encial de una secuencia de referencia y puede conjunto de una secuencia más grande, por ejempl segmento de un ADNc de longitud completa o secue es que figuran en un listado de secuencias render un ADNc completo o secuencia de genes, eral, una secuencia de referencia de al me leótidos ó 6 aminoácidos de longitud, con frecue lo menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de long frecuencia de por lo menos 48 nucleótidos no cidos de longitud. Ya que dos secuenc inucleótidos o aminoácidos puede cada una (1) co secuencia (es decir, una porción de la se pleta de polinucleótidos o aminoácidos) que es re las dos moléculas (2) uede com render ade iciones de nucleótidos contiguos ó 6 aminoáci de una secuencia de polinucleótidos o secue noácidos puede ser comparada con una secue erencia de al menos 18 secuencias de nucl tiguos o 6 aminoácidos y en donde la porción uencia de polinucleótidos en la ventana de comp de comprender adiciones, supresiones, sustituci ilares (es decir, espacios vacíos) , del 20 por c os en comparación con la secuencia de referencia luye adiciones o supresiones) para la alineación las dos secuencias. La alineación óptima de sec a alinear una ventana de comparación se puede iante el algoritmo de homología local de erman Adv. Appl . Math. 2: 482 (1981), medi oritmo de alineación de homología de Needleman y Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el mé ueda de similitud de Pearson Li man Proc. Nati erados por los diversos métodos .

El término "identidad secuencial" signif secuencias de polinucleótidos o aminoácid ticas (es decir, en una base de nucleóti leótido o de residuo por residuo) en la ven aración. El término "porcentaje de i uencial" se calcula mediante la comparación uencias alineadas de forma óptima sobre la ven paración, determinar el número de posiciones ies la base de ácido nucleico idéntico (por ejem C, G, U o I) o residuo se produce en ambas sec a obtener el número de posiciones igualadas, div ero de posiciones igualadas entre el número t iciones en la ventana de comparación (es de año de la ventana) , y multiplicar el resultado a obtener el porcentaje de identidad secuenc mino "identidad sustancial" como se utiliza leótidos (6 aminoácidos) , con frecuencia más tana de por lo menos 24-48 posiciones de nucleóti aminoácidos) , en donde el porcentaje de i uencial se calcula mediante la comparación uencia de referencia con la secuencia que puede resiones o adiciones que suman el 20 por ciento la secuencia de referencia sobre la vent aración. La secuencia de referencia puede conjunto de una secuencia más grande.

Como se utiliza en la presente, los noácidos convencionales y sus abreviaturas e erdo al uso convencional . Ver Immunology - A S Edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds . , ociates, Sunderland 7 Mass. (1991)). Los estereoi r ejemplo, los D-aminoácidos) de los veinte ami vencionales , aminoácidos no naturales tale noácidos , -disustituidos, aminoácidos de N- roxiprolina) . En la notación de polipéptido utili presente, la dirección de la izquierda es la di no-terminal y la dirección de la derecha es la di oxi-terminal , de acuerdo con el uso y co ándares .

Del mismo modo, a menos que se especif trario, el extremo izquierdo de las secuenc inucleótidos de una sola hebra es el extremo 5' ección de la izquierda de las secuenc inucleótidos de doble hebra que se conoce ección 5'. La dirección de 5' a la adición 3' nscripciones nacientes de AR se conoce co iones de secuencia de dirección de transcripció ra de ADN que tienen la misma secuencia del AR 5' al extremo 5' de la transcripción de ominan como "secuencias corriente arriba" , las secuencia en la hebra de ADN que tienen l to de identidad secuencial, de preferencia al m por ciento de identidad secuencial, más preferen menos el 95 por ciento de identidad secuencial, erentemente por lo menos el 99 por ciento de id encial .

De preferencia, las posiciones de residuos idénticos difieren por sustituciones conservad oácidos .

Las sustituciones conservadoras de aminoác eren a la capacidad de intercambio de resid en cadenas laterales similares. Por ejemplo, u minoácidos que tienen cadenas laterales alifátic ado por glicina, alanina, valina, leuci leucina; un grupo de aminoácidos que tienen rales alifáticas-hidroxilo está formado por s nina; un grupo de aminoácidos que tienen rales que contienen amida está formado por aspar lalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- ámico-aspártico, y asparagina-glutamina .

Según lo discutido en la presente, p aciones en las secuencias de aminoácidos culas de anticuerpos o inmunoglobulinas se con abarcadas por la presente invención, siempre iaciones en la secuencia de aminoácidos mante S el 75%, más preferentemente al menos 80%, 90%, preferentemente 99%. En particular, se con tituciones conservadoras de aminoácidos. Los ree servadores son los que tienen lugar dentro lia de aminoácidos que están relacionados enas laterales. Los aminoácidos genéti ificados se dividen generalmente en las familia oácidos ácidos son aspartato, glutamato oácidos básicos son lisina, arginina, histidi oácidos no polares son alanina, valina, 1 oácidos incluyen: (i) , serina y treonina, que lia alifática-hidroxi ; (ii) asparagina y glutami la familia que contiene amida; (iii) alanina, iña e isoleucina, que son los familia alifática; lalanina, triptófano y tirosina, que son la ática. Por ejemplo, es razonable esperar plazo aislado de una leucina con una isole na, un aspartato con un glutamato, una treonina na, o un reemplazo similar de un aminoácido oácido estructuralmente relacionado no tendrá un rtante en la unión o las propiedades de la m ltante, especialmente si el reemplazo no imp oácido en un sitio de marco. Si un cam oácidos da por resultado un péptido funcional, S rminar fácilmente analizando la actividad esp derivado de polipéptido. Los ensayos se descr lie en la resente. Fra mentos o análo os de mo lizan métodos informáticos de comparación ntificar las porciones previstas de secuen inios de la conformación de proteínas que se prod as proteínas de estructura y/o función conoci odos para identificar las secuencias de proteínas egan en una estructura tridimensional conoci ocen. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). o, los ejemplos anteriores demuestran que los e la técnica pueden reconocer las porciones de sec onformaciones estructurales que pueden ser uti a definir los dominios estructurales y funcion erdo con la invención.

Las sustituciones preferidas de aminoáci ellas que: (1) reducen la susceptibilidad teólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxi alteran la afinidad de unión para formar compl teínas 4 alteran las afinidades de unión dominios que forman contactos intermolecular titución conservadora de aminoácidos no debe tancialmente las características estructurales encia progenitora (por ejemplo, un aminoác plazo no debe tender a romper una hélice que se la secuencia progenitora, o perturbar otros t ructura secundaria que caractericen a la se enitora) . Ejemplos de estructuras secunda ciarias de polipéptidos , reconocidas se descr teins, Structures and Molecular Principies (Cre , . H. Freeman and Company, New York roduction to Protein Structure (C. Branden y J. ., Garland Publishing, New York, N.Y. (199 rnton et at . Nature 354:105 (1991).

El término "fragmento de polipéptido" liza en la presente, se refiere a un polipépt e una su resión amino-terminal /o carboxi-te preferentemente al menos de 70 aminoácidos de la ino "análogo" como se utiliza en la prese iere a polipéptidos que están comprendidos ento de al menos 25 aminoácidos, que tiene id tancial a una porción de una secuencia de amin cida y que tiene una unión específica a IL-to a IL-6Rc como a IL-6R, bajo las condiciones ad unión. Típicamente, los análogos de polip renden una sustitución conservadora de aminoác ción o supresión) con respecto a la secuencia de ral . Los análogos típicamente son por lo meno oácidos de largo, de preferencia al me oácidos o más de longitud, y a menudo pueden gos como un polipéptido de origen natural.

Los análogos de péptidos se utilizan com la industria farmacéutica como fármacos no pep propiedades análogas a las del péptido de la pla efecto equivalente terapéutico o profilácti eral, los peptidomiméticos son estructur ilares a un polipéptido paradigma (es dec ipéptido que tiene una propiedad bioquímica o ac acológica) , tal como anticuerpo humano, pero ti ás enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos ace seleccionado del grupo que consiste de: -C -, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans) , -COCH2-, CH( CH2SO-, por métodos bien conocidos en la técn titución sistemática de uno o más aminoácidos encia de consenso con un D-aminoácido del mis r ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) s lizar para generar péptidos más estables. Adem tidos restringidos que comprenden una secuen senso o una variación de la secuencia de c tancialmente idéntica pueden ser generados por ocidos en la técnica (Rizo Gierasch Ann. Rev. queta" o "etiquetado" se refieren a la incorpora marcador detectable, por ejemplo, median rporación de un aminoácido radiomarcado o acopla péptido de porciones biotinilo que pued ctadas por avidina marcada (por ejemplo, estrept contiene un marcador fluorescente o de la ac mática que puede ser detectada por métodos óp rimétricos) . En ciertas situaciones, la eti ador también puede ser terapéutico. En la téc cen y se pueden utilizar varios métodos de eti polipéptidos y glicoproteínas . Ejemplos de et polipéptidos incluyen, sin restricción ientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejem 15N, 35S, 90Y, "Te, inln, 125I, 131I), mar rescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lant foros), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, per rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fo acéutico o fármaco" como se utiliza en la prese ere a un compuesto químico o composición c cir un efecto terapéutico deseado cuando se adm ectamente a un paciente .

En la presente se utilizan otros término ica de acuerdo con el uso convencional en la t se ejemplifica por el Diccionario McGraw-H inos químicos (Parker, S. Ed., McGraw-Hil cisco (1985) ) .

El término "agente antineoplásico" se úti presente para referirse a los agentes que ti iedad funcional de inhibir el desarrollo o pro un neoplasma en un ser humano, en particular una igna (cancerosa) , tal como un carcinoma, s foma, o leucemia. La inhibición de la metástasis uencia una propiedad de los agentes antineoplási Como se usa en la presente, "sustanci Por lo general, una composición sustanci comprenderá más de aproximadamente 80 por ci s las especies macromoleculares presentes osición, más preferentemente más de aproxima 90%, 95% y 99%. Más preferentemente, la especie purifica hasta la homogeneidad esencial osición no se , pueden detectar especies contam los métodos de detección convencionales) en d osición consiste esencialmente de una especi omolecular .

Las enfermedades autoinmunitarias incluy plo, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (S na enfermedad viral con un componente autoinmuni ecia areata, espondilitis anquilosante, sínd fosfolípidos , enfermedad autoinmunitaria de A ia hemolítica autoinmunitaria, ne inmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del nil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta es omialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, s Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, f onar idiopática, púrpura trombocitopénica idi ) , nefropatía de IgA, diabetes mellitus dependi lina, artritis crónica juvenil (enfermedad de itis reumatoide juvenil, enfermedad de M rmedad mixta del tejido conectivo, esclerosis mú tenia gravis, anemia perniciosa, poliarteritis condritis, síndromes poliglandulares , poli ática, polimiositis y dermatomi maglobulinemia primaria, cirrosis- biliar pr iasis, artritis psoriásica, fenómenos de R rome de Reiter, fiebre reumática, artritis reum oidosis, esclerodermia (esclerosis sistémica pro ) , también conocida como esclerosis sistémica rome de S ó ren, síndrome del hombre rí ido, rosclerosis , asma bronquial, eczema, glomerulone ermedad del injerto versus hospedero, olíticas, osteoartritis , sepsis, ac ebrovascular, trasplante de tejidos y culitis, retinopatía diabética y lesión ucida por ventilador.

Los cánceres incluyen, por ejemplo, enfer loma múltiple (MM) , carcinoma de células renales cemia de células plasmáticas, linfoma, t foproliferativo B (BLPD) , y cáncer de próstata. icuerpos huIL-6Rc Los anticuerpos monoclonales de la invenci mplo, anticuerpos monoclonales completamente nen la capacidad de inhibir la señalización iada por IL-6Rc. La inhibición se determin m lo utilizando el ensa o celular descrito Cada uno de los anticuerpos monoclonales h ritos en la presente incluye una región vari na pesada (VH) y una región variable de cadena ) , como se muestra en las secuencias de aminoá os nucleicos correspondientes listadas a continu Los anticuerpos 39B9 VL1 y 39B9 VL5 compar on variable de cadena pesada común (SEQ ID ficada por la secuencia de ácido nucleico most EQ ID NO: 1.

Secuencia de ácido nucleico >39B9 VL1-VH 1) AGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGT AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTAT GCGCCAGGCCGCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATC GATACAACAAAGTACGCACAGCAGTrCCAGGGCAGAGTCACGATT CGAATCCACGAGCACAGCCTAGATGGAGCTGAGCACCCTGAGATCT GGCCGTATTTTACTGTGCGAGAGATCGGGATATTTTGACTGATTATT GGCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT Secuencia de ácidos nucleicos >39B9 VL1- O: 3) CCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGTTTTAGCC CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCA GTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAAC AGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC Secuencia de aminoácidos >39B9 VL1-VL ( 4) FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSYPLTFGGGTKVEIKR El anticuerpo 39B9 VL5 incluye una iable de cadena ligera (SEQ ID NO: 6) codificada encia de cido nucleico mostrada en la SEQ ID NO Secuencia de ácidos nucleicos >39B9 VL5- Secuencia de aminoácidos >39B9 VL5-VL {SEQ LMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPI LLIYD RFSGSGSGTDFTLTL SSLQPEDFATYYCQQSNSYPLTFGGGTKVEIÍ R El anticuerpo 12A incluye una región vari na pesada (SEQ ID NO: 8 ) codificada por la secue o nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 7 .

Secuencia de ácidos nucleicos > 12A VH (SEQ AGGTGCAGCTGGTGGAGTCTrGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGACAT CCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATT AAATAATAATTACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCAT CAATTCCAAGAAAAAGGTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGC GGCTGTGTATTACTGTGTGAGAGCGTCCCCTAACTGGGGTCTTCTT GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT 3 Secuencia de aminoácidos > 12A VH SE ID N Secuencia de ácidos nucleicos >12A VL (SEQ AAATTGTGTTGACACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGG CACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCC CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTGC GTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATT CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAA AGTTACCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA Secuencia de aminoácidos >12A VL (SEQ ID N LTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPG APiLLIYD SGSGSGTDFTLTlSSLQPEDFATYYCQQFNSYPITFGQGTRLEIKR El anticuerpo 5C incluye una región vari na pesada (SEQ ID NO: 12) codificada por la se cido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 11 Secuencia de ácido nucleico >5C VH (SEQ Secuencia de aminoácidos >5C VH (SEQ ID NO QLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYDMYWVRQAPGKGLEW YYADSVKGRFTlSRDMSí NTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASPN TLVTVSS El anticuerpo 5C incluye una región vari na ligera (SEQ ID NO: 14) codificada por la se cido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 13 Secuencia de ácido nucleico >5C VL (SEQ CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGC AGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAT CCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTT1 GCAACTTATTACTGTCA TAGTTACCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAA Secuencia de aminoácidos >5C VL (SEQ ID NO inaciones de las mismas. la 1. Secuencias VH CDR de clones de anticuerpos unen y neutralizan la actividad biológica de IL- Secuencias VL CDR de clones de anticuerpo unen y neutralizan IL-6Rc nibre del VL CDR1 VL CDR2 VL Clon 9 VL1 RASQGISSVLA DASSLES QQSNSYP L inidos por E.A. Kabat et al. (Ver Kabat, EA, ences of Protein of immunological interest, ción, Departamento de Salud y Servicios Humanos dos Unidos, Oficina de Impresión del Gobierno ados Unidos (1991) ) .

En la invención también se incluy icuerpos que se unen al mismo epítopo co icuerpos descritos en la presente. Por ejemp icuerpos de la invención se unen específicament en donde el anticuerpo se une a un epítopo que o más residuos de aminoácidos en IL-6R huma plo, GenBank Acceso No. P08887) . Los anticuerpo ención se unen específicamente a IL-6RC, en d icuerpo se une a un epítopo que incluye uno iduos de aminoácidos de IL-6 (por ejemplo, eso No. NP_000591) , IL-6R (por ejemplo, GenBank P08887 o ambos . cuerpo monoclonal de la invención, como se mues disminución en la unión por el anticuerpo monocl invención, entonces los dos anticuerpos monoclon al mismo epítopo, o a uno estrechamente relacio Un método alternativo para determinar cuerpo monoclonal tiene la especificidad del ant clonal de la invención es preincubar el ant clonal de la. invención con proteína soluble de I R (con las que normalmente se reactiva) inuación agregar el anticuerpo monoclonal que ando para determinar si el anticuerpo monoclonal probando se inhibe en su capacidad de unirse a tanto a IL-6RC como a IL-6R. Si el ant clonal que se está probando se inhibe, enton probabilidad, tiene la misma especificidad epi ncionalmente equivalente, como el anticuerpo mon a invención.

Los diversos procedimientos conocidos nica se pueden utilizar para la producc icuerpos monoclonales dirigidos contra IL-6Rc y/ 6Rc como IL-6R, o contra fragmentos de der ólogos u ortólogos de análogos de los mismos . ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harl e D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Pres ing Harbor, NY, incorporado en la presen erencia) . Los anticuerpos completamente human éculas de anticuerpos en donde la secuencia c to de la cadena ligera como de la cadena pesada CDR, surgen de los genes humanos. Estos anticue ominan "anticuerpos humanos" , o "anti pletamente humanos" en la presente. Los anti oclonales humanos se preparan, por ejemplo, uti procedimientos descritos en los Ejemplos tinuación. Los anticuer os monoclonales humanos 3. Proc Nati Acacl Sci EUA 80: 2026-2030) o medi sformación de células B humanas con el Virus de r in vitro (ver Colé et al . , 1985 En: ON IBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., Los anticuerpos se purifican mediante t conocidas, como la cromatografía de a lizando proteína A o proteína G, que prop cipalmente la fracción IgG de suero teriormente , o, alternativamente, el antígeno esp es el ob etivo de la inmunoglobulina buscada topo del mismo, puede ser inmovilizado en una purificar el anticuerpo específico inmune m atografía de inmunoafinidad . La purificac moglobulinas se analiza, por ejemplo, por D. Wi Scientist, publicado por The Scientist delfia PA, Vol. 14, No. 8 (17 de abril de 2000), rana y/o soluble, tal como, por ejemplo, IL-6RC rata o de humano o un fragmento inmunogénico, der iante del mismo. Alternativamente, el animal se i células transfectadas con un vector que conti écula de ácido nucleico que codifica para IL-6Rc que IL-6Rc se expresa y se asocia con la superf células transfectadas , Alternativamente, icuerpos se obtienen por la selección de una bib contiene secuencias de dominio de unión al ant icuerpo para la unión a IL-6Rc. Esta biblio ara, por ejemplo, en el bacteriófago , como fusi teína o péptido a una proteína de recubrimi teriófago que se expresa en la superficie tículas de fago ensamblado y las secuencias de ificación contenidas dentro de las partículas d decir, "la biblioteca desplegada de fagos" ridomas resultantes de fusiones de mieloma/cé ducen o son capaces de producir anticuerpos r n específicamente al agente inmu ernativamente, los linfocitos pueden ser inmuniz ro .

El agente inmunizante típicamente incl igeno de la proteína, un fragmento del mismo teína de fusión del mismo. En general, se focitos de sangre periférica si se desean cél gen humano, o bien se utilizan células del ulas de nodulos linfáticos si se desean fue íferos no humanos. Los linfocitos luego se fusio línea celular inmortalizada utilizando un ag ión adecuado, tal como polietilenglicol , para fo ula de hibridoma (Goding, Monoclonal Anti nciples and Practice, Academic Press, (1986) ) . Las líneas celulares inmortalizadas usualme ulas de mamífero transformadas en articular cél HPRT) , el medio de cultivo para los hi icamente incluirá hipoxantina, aminopterina y t edio HAT"), sustancias que impiden el crecimi ulas deficientes en HGPRT.

Las lineas celulares inmortalizadas pre aquellas que se fusionan de manera eficiente, s o nivel de expresión estable de anticuerpo ulas productoras de anticuerpos seleccionados, sibles a un ,medio tal como HAT. Las líneas c ortalizadas más preferidas son las líneas de mié ón, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Ce tribución Celular del Instituto Salk, San ifornia, y la American Type Culture Collect assas, Virginia. También se han descrito ulares de mieloma humano y de heteromieloma de ón para la producción de anticuerpos monoclonale bor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur yo de unión in vitro, tal como el radioinmun ) o ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas ( s técnicas y ensayos son conocidos en la técn idad de unión del anticuerpo monoclonal pue plo, determinarse mediante el análisis de Scatc on y Pollard, Anal. Biochem. , 107: 220 (1980). las aplicaciones terapéuticas de anti clonales, es importante identificar anticuerp an un alto grado de especificidad y una alta a nión por el antígeno objeto.

Después de que se identifican las cél idoma deseadas, los clones se pueden subclonar m edimientos de dilución limitante y cultivar dos convencionales. (Ver Goding, Monoclonal Anti ciples and Practice, Academic Press, (1986) . Los medios de cultivo adecuados para es uyen, por ejemplo, Medio de Eagle modifica ctroforesis en gel, diálisis, o cromatogra nidad.

Los anticuerpos monoclonales también se borar por métodos de ADN recombinante , tales c critos en la Patente de los Estados Unid 16,567. ADN que codifica para los anti oclonales de la invención puede ser aislado fácil uenciado utilizando procedimientos convencional mplo, mediante el uso de sondas de oligonucleóti capaces de unirse específicamente a los ge ifican para las cadenas pesadas y ligeras de anti inos) . Las células de hibridoma de la invención O una fuente preferida de tal ADN. Una vez aisl puede ser colocado en vectores de expresión, qu transfectan en células hospederas tales como las de simio, células de ovario de hámster chino ( ulas de mieloma ue no roducen de otra ma encia de codificación de inmunoglobulina la tota e de la secuencia que codifica para un polipép noglobulina. Este polipéptido no inmunoglobulin sustituido por los dominios constantes de un ant la invención, o puede ser sustituido por los d ables de un sitio de combinación del antígeno cuerpo de la invención para crear un ant lenté quimérico . cuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de la i uyen anticuerpos completamente humanos o anti nizados. Estos anticuerpos son adecuados p nistración a los seres humanos sin gener uesta inmunitaria por el humano cont noglobulina administrada.

Un anticuer o huIL-6Rc se enera, or e , que se incorporan por referencia en la prese procedimiento, se clasifica una bib inatoria de fago que lleva pares aleatorios nas ligeras y pesadas utilizando fuente nat mbinante de IL-6Rc o fragmentos del mismo. cedimiento, un anticuerpo huIL-6Rc puede ser pr iante un proceso en donde por lo menos un p ceso incluye la inmunización de un animal trans humano con la proteína IL-6Rc humana. E cedimiento, algunos de los sitios endógenos de ada y/o ligera kappa de este animal xenogénico no sido desactivados y son incapaces de real rganización necesaria para generar los gen ifican para las inmunog1obulinas en respuest ígeno. Además, al menos un sitio de la cadena ana y por lo menos un sitio de la cadena ligera sido transíectados establemente en el animal. mplo, véase la Patente de los Estados Unidos ,181 y No. 6, 150,584, que se incorporan por ref la presente en su totalidad. Esta estrategia gen stró en relación con la generación de las p as de XenoMouseMR que se publicó en 1994. Ver G Nature Genetics 7: 13-21 (1994), que se incorp erencia en la presente en su totalidad. Véanse t Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,l 50,584, 6,114,598, 6,075,181 y 5,939,598 y las P onesas Nos. 3 068 180 B2 , 3 068 506 B2 y 3 068 5 ente Europea No. EP 0 463 151 Bl y Soli ernacionales de Patente Nos. WO 94/02602, WO 96 98/24893, WO 00/76310 y miembros de f acionados.

En un procedimiento alternativo, otr lizado un procedimiento de "minisitio" en el io de I ex ena es imitado a través de la inclu 89,215; 5,789,650; 5,814,318.; 5,877; 397; 5,8 23,010 y 6,255,458; y la Patente Europea No. 0 y las Solicitudes de Patente Internacional 03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/226 12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/144 13852, y WO 98/24884 y miembros de la acionados.

También se ha demostrado la generac icuerpos humanos a partir de los ratones en los és de la fusión microcelular, se han intr ndes piezas de cromosomas o cromosomas complet icitudes de Patente Europea Nos. 773 288 y 843 96 Las respuestas de anticuerpos antirratón VIA) han llevado a la industria a preparar anti éricos o humanizados de otra manera. Mientras icuerpos quiméricos tienen una región constante re ión variable inmunitaria, se espera que se o cida también se logra a través de técni nización, quimerización y despliegue uti iotecas apropiadas. Se apreciará que los anti nos o anticuerpos de otras especies se pueden hu rimatizar usando técnicas bien conocidas en la m e, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14 3) y Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12 2 ) . El anticuerpo de interés puede ser modific niería genética mediante técnicas de ADN recom sustituir los dominios de bisagra CH1, CH2 , CH3 nio de marco con la correspondiente secuencia se el documento WO 92102190 y las Patentes dos Unidos Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,6 93,792; 5,714,350 y 5,777,085). Además, el uso Ig para la construcción de los genes quimér noglobulina se conoce en la técnica (Liu .A.S. 84: 3439 (1987) y J. Immunol. 139: 3521 ( icuerpo se funde después a las secuencias de la stante humana. Las secuencias de genes de las stantes humanas se pueden encontrar en Kabat 91) Sequences of Proteins of immunological In .H. Publicación No, 91-3242. Los genes humanos ion C están disponibles a partir de clones conoci cción del isotipo se guiará por las funciones ef adas, tales como la fijación del compleme ividad en la citotoxicidad celular dependie icuerpos. Se prefieren los isotipos IgGl, IgG3 lquiera de las regiones constantes de cadena na, kappa o lambda, se puede utilizar. El ant érico, humanizado se expresa entonces mediante encionales .

Los fragmentos de anticuerpos, tales c ' )2 Y Fab se pueden preparar mediante la escisió teína intacta, por ejemplo, por la proteasa o e án como cebadores para introducir sitios de. rest es en la región J para el enlace posterior entos de la región V a los segmentos de la r na. El ADNc de la región C puede ser mod ante mutagénesis dirigida al sitio para col o de restricción en la posición análoga en la se na .

Los vectores de expresión incluyen pí ovirus, episomas derivados de YACS, EBV, y sim vector conveniente es uno que codifica pa encia de inmunog1obulina CH o CL huma ionalidad completa, con sitios de rest piados manipulados por ingeniería genética p lquier secuencia VH y VL se pueda insertar y e ilmente. En tales vectores, usualmente se pro lme entre el sitio del donador del empalme en la nsertada y el sitio aceptor del empalme anteri 83)), el virus LTR del sarcoma de Rous (Gorman .A.S. 79: 6777 (1982)), y el virus LTR de 1 ina de Moloney (Grosschedl et al. Cell 41: 885 bién, como se apreciará, se pueden utiliz motores nativos de Ig y similares.

Además, los anticuerpos humanos o los anti otras especies se pueden generar a través de tec > pantalla, que incluyen, sin limitación, pant os , pantalla retroviral, pantalla ribosomal, icas, utilizando técnicas bien conocidas en la las moléculas resultantes pueden ser somet uración adicional, como maduración de afinidad, es técnicas son bien conocidas en la materia. Wr Crit, Reviews in Immunol . 12125-168 (1992), ckthun PNAS EUA 94: 4937-4942 (1997) ( osomal) , Parmley y Smith Gene 73: 305-318 talla de fagos), Scott, TIBS, vol . 17: 241-245 Utilizando estas técnicas, se pueden icuerpos para las células que expresan IL-6Rc, bles de IL-6Rc, epítopos o péptidos del mi liotecas de expresión para éstos (Véase, por ejem nte de los Estados Unidos No. 5, 703,057 teriormente pueden ser seleccionados como se de riormente para las actividades descritas sente .

Los anticuerpos huIL-6Rc de la invención expresados por un vector que contiene un segm que codifica para el anticuerpo de cadena crito anteriorménte . Éstos pueden incluir vectores, liposom udo, ADN ayudado por adyuvante, pistola de éteres, etc. Los vectores incluyen conjugados es como el descrito en el documento WO 93/647 ne orción ob eto ( or e em lo, un li ando a un r Los vectores pueden ser cromosómicos , no cromo ntéticos .

Los vectores preferidos incluyen v les, proteínas de fusión y conjugados químic ores retrovirales incluyen virus de leucemia mu ney. Se prefieren los vectores virales de ADN ores incluyen vectores de la viruela tale ores orthopox o avipox, vectores de virus del s como el vector del virus del herpes simple se Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64: 487 , F. , et al., en DNA Cloning: Mammalian Syst er, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford, Ingl 95) ; Geller, A. I. et al., Proc . Nati. Acad. Sc 7603 (1993); Geller, A. I, et al., Proc. Nati . EUA 87: 1149 (1990), vectores de adenovirus l LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993); Da al., Nat. Genet 3: 219 (1993); Yang, et al., J o nucleico en células neuronales. El vec ovirus da por resultado una expresión a más cort oximadamente 2 meses) que el virus adeno-a oximadamente 4 meses) , que a su vez es más co vectores VHS. El vector particular elegido depen célula diana y la condición que se esté trata oducción puede ser mediante técnicas est ndar plo, infección, transíección, transducc sformación . Algunos ejemplos de los mo sferencia de genes incluyen, por ejemplo, ADN d ipitación de CaP04, DEAE-dextrano, electropo ión de protoplastos , lipofección, microinyecc las, y vectores virales.

El vector puede ser empleado para dir tivo esencialmente cualquier célula diana desea plo, la inyección estereot xica puede ser ut diri ir los vectores or e em lo adenovirus . Sci. EUA 91: 2076-2080 (1994); Morrison et a Physiol. 266: 292-305 (1994)). Otros métodos que se incluyen catéteres, inyección intra nteral, intraperitoneal y subcutánea y oral s de administración conocidas.

Estos vectores pueden ser utilizado resar grandes cantidades de anticuerpos que se lizar en una variedad de maneras. Por ejempl ctar la presencia de IL-6Rc y/o IL-6R en una m anticuerpo se puede también utilizar para tratar terrumpir la señalización relacionada con IL-6Rc Las técnicas se pueden adaptar para la pro anticuerpos de cadena única, específicos pa teína antigénica de la invención (véase, por ejem ente de los Estados Unidos No. 4,946,778). Adem odos se pueden adaptar para construir bibliot resión de F (véase, or ejemplo, Huse, et al écula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab g iante la reducción de los puentes disulfuro gmento F(ab,)2; (iii) un fragmento Fab generado medi tamiento de la molécula de anticuerpo con papaí te reductor y (iv) fragmentos Fv.

La invención también incluye fragmentos a de F„, ^ab' ^ab' Y ^iabi)2 ° fragmentos del complejo a , anticuerpos anti-IL-6R o anti-IL-6Rc de una icuerpos biespecíficos anti-IL-6R, y/o anti-I icuerpos heteroconjugados anti-IL- 6R y/o anti-IL- Los anticuerpos biespecíficos son anticuer nen especificidades de unión de por al me ígenos diferentes. En el presente caso, una ecificidades de unión es por IL-6Rc o IL-6R. El etivo de unión es cualquier otro antígeno, y ve una proteína de la superficie celular o rec nidad del rece tor. das y ligeras de las inmunoglobulinas , estos hib dromas) producen una mezcla potencial d rentes moléculas de anticuerpos, de las cuales s e la estructura biespecifica correcta. La purif la molécula correcta se realiza usualmente S de cromatografía de afinidad. Procedi ilares se describen en el documento O 93 licado el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker J. 10: 3655-3659 (1991) .

Los dominios variables de anticuerpos ecificidades de unión deseadas (sitios de combina icuerpo-antígeno) se pueden fusionar a las secuen noglobulina de dominio constante. La fusión ferencia con un dominio constante de la cadena pe noglobulina, que comprende por lo menos parte iones de bisagra CH2 y CH3. Es preferible t era re ión constante de la cadena esada (CH , Methods in Enzimology, 121: 210 (1986) .

De acuerdo con otro método descrito mento WO 96/27011, la interfaz entre un culas de anticuerpos se puede diseñar m niería genética para maximizar el porcent rodímeros que se recuperan de cultivo de mbinantes . La interfaz preferida comprende al me e de la región CH3 de un dominio consta icuerpos . En este método, una o más pequeñas rales de aminoácidos de la interfaz de la cula del anticuerpo se sustituyen con cadenas la grandes (por ejemplo, tirosina o tript idades" compensatorias de tamaño idéntico o si o las cadenas laterales de gran tamaño se crea rfaz de la segunda molécula de anticuerpo medi itución de las grandes cadenas laterales de amin las más e ueñas ( or e em lo, alanina o tre plo, los anticuerpos biespecífieos se pueden p izando enlace químico. Brennan et al. 229:81 5) describen un procedimiento en donde los anti ctos son escindidos proteolíticamente para mentos F(ab,)2. Estos fragmentos se reducen en pr agente formador de complejo ditiol, arsenita estabilizar ditioles vecinales y prevenir la fo disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' ge o se convertirán en derivados de tionitrob ) . Uno de los derivados de Fab' -TNB enton nvierte en Fab' -tiol mediante reducció aptoetilamina y se mezcla con una cantidad eq otro derivado de Fab' -TNB para formar el ant pecífico. Los anticuerpos biespecífieos pro en ser utilizados como agentes para la inmovil ctiva de enzimas.

Adicionalmente, los fra mentos de Fab' se as células que sobreexpresan el receptor de Er las T humanas normales, así como activar la ac ca de linfocitos citotóxicos humanos contra ob umor de mama humana.

También se han descrito varias técnica orar y aislar fragmentos de anticuerpos biespe ctamente del cultivo de células recombinante plo, los anticuerpos biespecífieos han sido pro lizando cremalleras de leucina. Kostelny et nol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Los péptidos nallera de leucina de las proteínas Fos y zaron a las porciones de Fab' de dos anti rentes mediante la fusión de genes. Los homodím icuerpos se redujeron en la región de la bisag ar monómeros y volver a oxidarse para for rodímeros de anticuerpos. Este método también pu lizado para la producción de anticuerpos de homod secuencia, los dominios de VH y VL de un fragm forzados a aparearse con los dominios compleme VL Y vH de otro fragmento, formando así dos si ón al antígeno. También se ha informado d rategia para la elaboración de fragmentos de anti specíficos mediante el uso de dímeros Fv de u ena (sFv) . Véase, Gruber et al., J. Immunol . 15 Se contemplan los anticuerpos con más encías. Por ejemplo, se pueden preparar anti específicos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (19 Los anticuerpos biespecífieos ejempla den unir a dos epítopos diferentes, por lo menos cuales se origina en el antígeno de la proteín ención. Alternativamente, un brazo anti-antigé molécula de inmunoglobulina se puede combinar zo que se une a una molécula de activación ZO de unión al antígeno y un brazo que se un te citotóxico o un quelante de radionúclido BE, DTPA, DOTA, o TETA, Otro anticuerpo biespecí rés se une al antígeno de la proteína descrit sente y además se une al factor tisular (FT) , Los anticuerpos heterocon ugados están tro del alcance de la presente invenció icuerpos heteroconjugados se componen de dos anti lentemente unidos. Estos anticuerpos, por ejemp propuestos para dirigir las células del nitario a las células no deseadas (véase la Pat Estados Unidos No. 4, 676,980), y para el trat infección por VIH (véase los documentos WO 91/00 200373; EP 03089). Se contempla que los anti en ser preparados in vitro usando métodos conoc química de proteínas sintéticas, que incluyen lican agentes de reticulación. Por ejemplo, se rar, por ejemplo, la eficacia, del anticuerpo amiento de enfermedades y trastornos asociados lización aberrante de IL-6. Por ejemplo, uno o duos de cisteína se pueden introducir en la reg que permite la formación de enlaces di rcatenario en esta región. El anticuerpo homod generado puede tener mejor capacidad de internal el aumento de muerte celular mediada por el comp la citotoxicidad celular dependiente de anti C) . (Véase Carón et al., J. Exp Med, 176: 11 92) y Shopes, J. Immunol . , 148: 2918-2922 rnativamente , un anticuerpo puede ser diseñado m eniería genética para que tenga dos regiones Fe y to puede tener mejor lisis del complemento y acidades de ADCC. (Ver Stevenson et al., Anti g Design, 3: 219-230 (1989)).

La invención se refiere tambi érica, cadena A de la exotoxina (a par domonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cade ina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, prote rites fordii, proteínas de diantina, proteí tolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhib ordica charantia, curcina, crotina, inhibi aonaria officinalis, gelonina, mito trictocina, fenomicina, enomicina, y los tricót variedad de radionüclidos están disponibles ucción de anticuerpos radioconjugados . Los e luyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re.

Conjugados de anticuerpos y agente citóte ucen usando una variedad de agentes bifuncion lamiento de proteínas tales como propionato cinimidil-3-- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolan ivados bifuncionales de imidoésteres (tale imidato de dimetilo-HCL) , ásteres activos (tal nce 238: 1098 (1987) . El ácido 1-isotiocianatobe dietilen-triaminpentaacético marcado con carb DTPA) es un agente quelante ejemplar p ligación de radionucleótidos al anticuerpo. mento WO94/11026) .

Los expertos en la técnica reconocerán variedad de posibles porciones se pueden acopla cuerpos resultantes de la invención. (Véas plo, "Conjúgate Vaccines" , Contribution obiology and Immunology, J.M. Cruse y R.E. Lew . ) , Carger Press, Nueva York, (1989), cuyo co leto se incorpora a la presente por referencia) .

El acoplamiento se puede lograr por CU ción química que una a las dos moléculas, si do el anticuerpo y la otra porción manteng ectivas actividades. Este enlace puede incluir nismos químicos, por ejemplo, unión covalente, ención, a otras moléculas. Por ejemplo, los age plamiento representativos pueden incluir co ánicos tales . como tioésteres, carbodiimidas , ést cinimida, diisocianatos , glutaraldehído, diazobe ametilen-diaminas . Esta lista no pretende ser ex las diversas clases de agentes de acoplamiento c la técnica, sino, más bien, es un ejemplo de los acoplamiento más comunes. (Ver Killen y Lindstro un. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al Immun iews 62: 185-216 (1982), y Vitetta et al., Scie 8 (1987) .

Enlazadores preferidos se describen eratura. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. cer Res. 44: 201-208 (1984) que describe el uso ter de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) bién, la Patente de los Estados Unidos No. 5, describe el uso de derivado de acetil-h lfosuccinimidil-ß- [3- ( 2 -piridilditio) -propionamid anoato (Pierce Chem. Co. Ca . # 2165-G) ; y (v) su hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., io) conjugada a EDC .

Los enlazadores descritos anteriormente co onentes que tienen atributos diferentes, lo que onjugados con diferentes propiedades físico-qu ejemplo, los sulfa-NHS-ésteres de alquil-carbo más estables que los sulfo-NHS-ésteres de carbó áticos . Los enlazadores que contienen NHS-és os solubles que los sulfo-NHS-ésteres . Adem azador SMPT contiene un enlace disulfuro estéri edido, y puede formar conjugados con una abilidad. Los enlaces disulfuro, son en general ables que otros enlaces, porque el enlace disul indido in vi tro, dando por resultado menos c onible. Sulfo-NHS, en articular, puede mej cidos en la técnica, tal como se describe en Eps , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82: 3688 (1985); H , Proc, Nati Acad. Sci. EUA, 77: 4030 (1980), y P los Estados Unidos No. 4,485,045 y 4,544,545. nte de los Estados Unidos No. 5, 013,556 se de somas con mejor tiempo de circulación.

Liposomas particularmente útiles pued rados por el método de evaporación de fase inve composición lipídica que comprende fosfatidil esterol y fosfatidiletanolamina derivatizada -PE) . Los liposomas se extruyen a través de fil ño de poro definido para producir liposomas etro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerp sente invención pueden ser conjugados a los 11 O se describe en Martin et al. , J. Biol . Chem -288 (1982) a través de una reacción de interca lfuro. formulario conocido por todos los q acéuticos: Remington's Pharmaceutical Science , Mack Publishing Company, Easton, PA (1975 icular el Capítulo 87 por Blaug, Seymour, en el s formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, entos, geles, ceras, aceites, llpidos, vesícu ienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tale fectinMR) , conjugados de ADN, pastas anhid rción, emulsiones aceite en agua y agua en lsiones carbowax (polietilenglicoles de varios culares) , geles semisólidos, y mezclas semisóli tengan carbowax. Cualquiera de las mezclas ant e ser apropiada en los tratamientos y tera rdo con la presente invención, siempre rediente activo en la formulación no se inactive ulación y la formulación sea fisiológi atible tolerable con la ruta de administración J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) y las c para obtener información adicional relaciona ulaciones, excipientes y portadores bien conoci químicos f rmacéuticos.

En una modalidad, los anticuerpos neion, que incluyen un anticuerpo monoclonal nción (por ejemplo, un anticuerpo mon letamente humano) , pueden utilizarse como péuticos . Tales agentes generalmente se emplear nosticar, pronosticar, monitorear, tratar, aliv enir una enfermedad o patología asociada lización aberrante de IL-6 en un sujeto. Un péutico se lleva a cabo mediante la identifica sujeto, por ejemplo, un paciente humano que sufr riesgo de desarrollar) una enfermedad o tr ciado con señalización aberrante de IL-6, por e trastorno inflamatorio tal como artritis reum rferir con la unión del objetivo (por ejemplo, un ligando endógeno (por ejemplo, gpl30) al que ralmente . Por ejemplo, el anticuerpo se une al o odula, bloques, inhibe, reduce, antagoniza, neut otra manera interfiere con la señalización de I Las enfermedades o trastornos relacionados lización aberrante de IL-6 incluyen sepsis, cane plo, la enfermedad del mieloma múltiple ( M) , ca células renales (RCC) , leucemia de células plasm foma, trastornos B- linfoproliferativo (BLPD) , y próstata), resorción ósea, osteoporosis , ca iasis, glomerulonef itis proliferativa mes oma de Kaposi, linforna relacionado con el rmedades inflamatorias (por ejemplo, a atoide, artritis idiopática juvenil de émico, hipergammaglobulinemia, enfermedad de itis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico ida u otros patrones anormales de respi lofríos, confusión, desorientación, agitación, , disnea, infecciones pulmonares, insufi iaca, insuficiencia respiratoria, edema, aume , recaídas mucopurulentas, caquexia, sibilancias cabeza, y síntomas abdominales tales como, por e r abdominal, diarrea o estreñimiento. Los s ciados con trastornos relacionados con el nitario, por ejemplo, inflamación, fiebre, pérd tito, pérdida de peso, síntomas abdominales, tale ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estreñi or o afecciones en las articulaciones (artr iga, salpullido, anemia, la sensibilidad extrema nómeno de Raynaud) , debilidad muscular, fatiga mu ios en el tono de la piel o tejido, falta de os patrones anormales de respiración, dolor en e onstricción de los músculos del pecho, ritmo c tivo que, en algunos casos, interfiere ionamiento del objetivo. La cantidad requerida p inistrada además dependerá de la afinidad de un icuerpo por su antígeno específico, y también de la velocidad a la que se agota un ant inistrado a partir del volumen libre de otro su se administra. Los intervalos comunes para dosif péuticamente eficaz de un anticuerpo o fragm icuerpo de la invención pueden ser, a modo de eje rictivo, desde aproximadamente 0.1 mg/kg d oral hasta 50 mg/kg de peso corporal. Las frec dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, s al día a una vez por semana.

La eficacia del tratamiento se determ iación con cualquier método conocido para diagn tratar el trastorno inflamatorio relacion icular. El alivio de uno o más síntomas del tr ra IL-6Rc y/o tanto contra IL-6Rc tanto contra I en utilizar en métodos conocidos en la t cionados con la localización y/o cuantificación (por ejemplo, para usarse en la medición de los IL-6Rc y/o tanto IL-6Rc como IL-6R en m iológicas apropiadas, para usarse en méto nóstico, para usarse en la formación de im teínas, y similares) . En una modalidad dad icuerpos específicos para IL-6Rc y/o tanto para para IL-6R, o derivado, fragmento, análogo u h mismo, que contienen el dominio de unión al a ivado de anticuerpo, se utilizan como com acológicamente activos (denominados en lo sucesi teriales Terapéuticos" ) .

En otra modalidad, un anticuerpo específi 6Rc se puede utilizar para aislar a un IL-6R, polipéptido de IL-6, mediante técnicas está ilitar por acoplamiento (es decir, enlace físic anticuerpo a una sustancia detectable. Ejem ancias detectables incluyen varias enzimas, téticos, materiales fluorescentes, mat iniscentes, materiales bioluminiscentes y mat iactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas i xidasa de rábano picante, fosfatasa alcali ctosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de co uados del grupo prostético i eptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemp riales fluorescentes adecuados incluyen umbeli resceína, isotiocianato de fluoresceína, ro lorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de da eritrina, un ejemplo de un material lumin luye luminol; ejemplos de materiales biolumini luyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y ejem riales radiactivos adecuados inclu en 125I, 131I liza un anticuerpo intacto, o un fragmento de r ejemplo, Fab, scFv, o F(ab)2) . El término "etiqu respecto a la sonda o anticuerpo, pretende aba uetado directo de la sonda o anticuerpo m lamiento (es decir, enlace físicamente) tancia detectable a la sonda o anticuerpo, a uetado indirecto de la sonda ó anticuerpo TT ctividad con otro reactivo que está direc uetado. Ejemplos de etiquetado indirecto incl cción de un anticuerpo primario utiliza icuerpo secundario marcado fluorescenteme uetado en el extremo de una sonda de ADN con bio manera que éste se puede detectar con estrept cada fluorescentemente. El término "muestra bio tende incluir tejidos, células y fluidos bio lados de un sujeto, así como tejidos, células y sentes en un sujeto. En el uso del término w técnicas in vitro para la detección de una p ito incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a SAS) , inmunomanchado de Western, inmunoprecipita inmunofluorescencia . Las técnicas in vitro p cción de un ADN genómico analito incluyen hibrid Southern. Procedimientos para la conducc noensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Practice: Methods in Molecular Biology", vol . 4 ther (Ed. ) Human Press, Totowa, NJ, unoassay" , E. Diamandis y T. Christopoulus , A s, Inc., San Diego, CA, 1996, y "Practice and Th me Immunoassay" , P. Tijssen, Elsevier lishers, Amsterdam, 1985. Adem s, las técnicas la detección de una proteína analito i oducir en un sujeto un anticuerpo proteico eti i-analito. Por ejemplo, el anticuerpo se puede et un marcador radiactivo, cu a resencia ubica pueden incorporar en las composiciones farmac uadas para la administración. Se proporcion cipios y consideraciones implicados en la prep tales composiciones, así como la orientación cción de los componentes, por ejemplo, en Remi maceutical Sciences: The Science and Pract rmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., Ed Pub. Co., Easton, Pa: 1995; Drug Abs ncement: Concepts, Posibilities , Limitátion ds, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa. eptide And Protein Drug Delivery (Advances in Par enees, Vol . 4.), 1991, M. Dekker, Nueva York.

Tales composiciones comprenden tipicame icuerpo y un portador farmacéuticamente ace do se utilizan fragmentos de anticuerpos, el fr inhibidor más pequeño que se une especifícam inio de unión de la proteína objetivo es el pre Como se utiliza en la presente, el rtador farmacéuticamente aceptable" pretende lquiera y todos los solventes, medios de disp brimientos, agentes antibacterianos y antifú tes isotónicos y de retraso de la absorc ilares, compatibles con la administración farmac portadores adecuados se describen en la edic iente de Remington's Pharmaceutical Sciences, u referencia estándar en el campo, que se incorpo sente por referencia. Los ejemplos preferidos d tadores o diluyentes incluyen, sin restricción, e ción salina, solución de Ringer, solución de de lbúmina sérica humana al 5%. También se pueden u osomas y vehículos no acuosos tales como aceites uso de tales medios y agentes para las sus acéuticamente activas es muy conocido en la t o en la medida en que cualquier medio o da. Ejemplos de rutas de administración incl enteral, por ejemplo, la administración intra radérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhal sdérmica (es decir, tópica) , transmucosa, y reet ciones o suspensiones utilizadas para la api enteral, intradérmica o subcutánea pueden incl ientes componentes: un diluyente estéril como inyección, solución salina, aceites ietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u entes sintéticos; agentes antibacterianos tal hol bencílico o metil-parabenos; antioxidante el ácido ascórbico o bisulfito de sodio; lantes tales como ácido etilendiaminotetra A) ; amortiguadores tales como acetatos, cit fatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad 0 cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ácidos o bases, tales como ácido clorhíd portadores adecuados incluyen solución iológica, agua bacteriostática, Cremophor ELMR sippany, NJ) o solución salina amortiguada con S) . En todos los casos, la composición debe ser ebe ser fluida en la medida en que exista capac ectarla fácilmente. Debe ser estable en las cond fabricación y almacenamiento, y se debe preservar acción contaminante de microorganismos tale terias y hongos. El portador puede ser un sol io de dispersión que contenga, por ejemplo, ol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilengl ietilenglicol líquido, y similares) , y mezclas ad los mismos. La fluidez apropiada se puede manten plo, mediante el uso de un recubrimiento tal itina, mediante el mantenimiento del tamaño de pa erido en el caso de la dispersión y por el factantes . La revención de la acción de microor retrase la absorción, por ejemplo, monoestea minio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se arar mediante la incorporación del compuesto ac cantidad requerida en un solvente apropiado co combinación de los ingredientes en eriormente, según sea necesario, seguido erilización filtrada. Generalmente, las dispersi paran mediante la incorporación del compuesto ac vehículo estéril que contiene un medio de dis ico y los otros ingredientes necesarios merados anteriormente. En el caso de polvos es a la preparación de soluciones inyectables est métodos de preparación son el secado al vací filización que produce un polvo del principio act lquier ingrediente adicional que desee de una s viamente filtrada estéril del mismo. e el compuesto en el portador fluido se mente y se gira y se expectora o se ingiere. tinantes farmacéuticamente compatibles, y/o mat antes se pueden incluir como parte de la compo tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y si en contener cualquiera de los siguientes ingred mpuestos de naturaleza similar: un aglutinante t elulosa microcristalina, goma de tragacanto o ge excipiente tal como el almidón o lactosa, un ag integración tal como el ácido algínico, Prim idón de maíz; un lubricante tal como el estea esio o Sterotes; un deslizante, como el dió icio coloidal; un agente edulcorante tal c rosa o sacarina; o un agente saborizante tal ta, el salicilato de metilo, o saborizante de nar Para la administración por inhalació uestos se distribuyen en la forma de un r la técnica, e incluyen, por ejemplo, p inistración transmucosa, detergentes, sales bili ivados del ácido fusídico. La administración tran puede lograr mediante el uso de rocíos nas sitorios. Para la administración transdérmic uestos activos se formulan en ungüentos, p s, o cremas como generalmente se conoce en la té Los compuestos también se pueden prepa a de supositorios (por ejemplo, con ba sitorios convencionales, tales como manteca de S glicéridos) o enemas de retención p inistración rectal.

En una modalidad, los compuestos act aran con portadores que protegerán al compuesto rápida eliminación del cuerpo, como formulaci ración sostenida/controlada, que incluyen impl temas de administración microencapsulados . Se iante técnicas de coacervación o polime erfacial, por ejemplo, hidroxiraetilcelul rocápsulas de gelatina y microcápsul i (metacrilato de metilo), respectivamente, temas coloidales de administración de fármac mplo, liposomas, microesferas de a roemulsiones , nanoparticulas , y nanocápsulas) roemulsiones .

Se pueden preparar preparaciones de li tenida. Ejemplos adecuados de preparació eración sostenida incluyen las matrices semipe polímeros hidrof bicos sólidos que contie icuerpo, cuyas matrices están en forma de a formados, por ejemplo, películas o microc mpios de matrices de liberación sostenida iésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidr acrilato) o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas iten la liberación de moléculas por más de 10 tos hidrogeles liberan proteínas por periodos de cortos .

Los materiales también se pueden rcialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceu También se pueden utilizar suspensiones lipo incluyen liposomas dirigidos a las células inf anticuerpos monoclonales para antigenos virales) tadores farmacéuticamente aceptables. Estos pue arados de acuerdo con métodos conocidos p rtos en la técnica, por ejemplo, como se describ nte de los Estados Unidos No. 4, 522,811.

Es especialmente ventajoso formular compos ies o parenterales en forma de dosificación u facilitar la administración y la uniformidad is. La forma de dosificación unitaria, como se us senté se refiere a unidades físicamente dis a alcanzar, y las limitaciones inherentes a la la composición como un compuesto activo ? tamiento de individuos .

Las composiciones farmacéuticas se pueden un recipiente, paquete, o surtidor junto c trucciones para su administración.

La formulación también puede contener má uesto activo que sea necesario para la ind ticular que se está tratando, preferentemente a actividades complementarias que no ativamente a los demás. Como alternativa, o ade osición puede comprender un agente que mej ción, como, por ejemplo, un agente citotóxico, ci nte quimioterapéutico, o agente inhibido cimiento. Tales moléculas están presentes adecua combinación, en cantidades que sean eficaces para isto. a simultánea o secuencial . Si se administra d encial, en el inicio de la administración del uesto, el primero de los dos compuestos de pref e siendo detectable en concentraciones eficace io de tratamiento.

Por ejemplo, la terapia de combinació luir uno o más anticuerpos de la invención cofor , y/o coadministrados con, uno o más péuticos adicionales, por ejemplo, una o cinas e inhibidores del factor de creci nosupresores , agentes antiinflamatorios, inhi abólicos, inhibidores de enzimas, y/o otóxicos o citostáticos , como se describe c alle a continuación. Tales terapias de comb den utilizar ventajosamente dosis más bajas tes terapéuticos administrados, evitando así p icidades o complicaciones asociadas con las factor de crecimiento {por ejemplo, rec bles, inhibidores de péptidos, moléculas pe iones de ligandos) ; o anticuerpos o fragmentos d antígeno de los mismos que se unen a otros ob ejemplo, anticuerpos que se unen a otras cito ores de crecimiento, sus receptores, u otras mo la superficie celular) , y citocinas antiinflámat istas de las mismas.

En otras modalidades, los anticuerpos nción se utilizan como adyuvantes de vacunas rmedades autoinmunitarias , enfermedades inflama . La combinación de adyuvantes para el tratami s tipos de trastornos son adecuados para us inación con una amplia variedad de an enientes de autoantígenos objetivos, es antígenos, que participan en la autoinmunid plo, la proteína básica de mielina; auto-an geno está incluido en la composición antigénica. ño y Generación de Otros Materiales Terapéuticos De acuerdo con la presente invención y c la actividad de los anticuerpos que se produce cterizan en la presente con respecto a IL-6 ilita el diseño de otras modalidades terapéuti de porciones de anticuerpos. Tales moda luyen, sin limitación, materiales terapéuticos av anticuerpos, tales como anticuerpos biespec notoxinas, y materiales terapéuticos radiomarca ración de materiales terapéuticos de péptidos, t ticas, en particular intracuerpos, mat péuticos antisentido, y moléculas pequeñas.

Por ejemplo, en relación con anti specífieos, se pueden generar anticuerpos biespe comprenden (i) dos anticuerpos, uno c cificidad ara IL-6RC /o tanto ara IL-6RC co cidas, por ejemplo, en relación con (i) y (ii ejemplo, Fanger et al.. Immunol Methods 4: 72-81 ight et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 relación con (iii) Véase, por ejemplo, Traune Int. J. Cáncer (Suppl.) 7: 51-52 (1992).

En relación con inmunotoxinas , los anti en ser modificados para actuar como inmuno lizando técnicas que son bien conocidas en la m e por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14: 252 e también la Patente de los Estados Unidos ,594. En relación con la preparación de anti iomarcados, tales anticuerpos modificados tam en preparar fácilmente utilizando las técnicas conocidas en la materia. Véase por ejemplo, J al. en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655- ión, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven ( se también las Patentes de los Estados Unid cuerpos de la invención o la selección de bibl éptidos, se pueden generar péptidos terapéuticos jan contra IL-6Rc y/o tanto contra IL-6Rc como R. El diseño y evaluación de materiales terapéut idos se discute en relación con Houghten echniques 13: 412-421 (1992), Houghten PNAS -5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13: 2), Blake y Litzi-Davis Bioconjugate Chem. 3: 2) . Las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas pueden preparar, y de una manera similar, en r porciones peptídicas como se mencionó anteriorm ción con anticuerpos. Suponiendo que la molécula y/o tanto de IL-6Rc como de IL-6R (o una for una variante de empalme o de forma alternat ionalmente activa en un proceso de la enfe ién será posible diseñar materiales terapéuti s y antisentido para ésta a través de t de técnicas terapéuticas genéticas que i acuerpos podría comprobarse que es partícul ajoso. Véase por ejemplo, Chen et al. Huma apy 5: 595-601 (1994) y Marasco Gene Therapy 4 97) . El diseño general y las consider cionadas con materiales terapéuticos genéticos discute en la Solicitud de Patente Internacional 8137.

El conocimiento obtenido de la estructur cula de IL-SRc y sus interacciones con otras mo acuerdo con la presente invención,, como los anti la invención, y otros, se puede utilizar para ionalmente modalidades terapéuticas adicionales. tido, las técnicas de diseño racional de fármaco la cristalografía de rayos X, modelado mo ado (o asistido) por computadora (CA ) , r titativa o cualitativa de estructura-actividad Capsey et al. Genetically Engineered Human Ther s (Stockton Press, NY (1988)). Además, las bibl inatorias pueden ser diseñadas y sintetiz izadas en los programas de clasificación, tal trabajos de clasificación de alto rendimiento. dos de Clasificación La invención proporciona métodos ( minados en la presente como "ensayos de clasific identificar moduladores, es decir, compue tes candidatos o de prueba (por ejemplo, pé idomiméticos , pequeñas moléculas u otros f rmac ían o interfieren de otro modo con la unión de I 0, o compuestos o agentes candidatos o de pru ían o interfieren de otro modo con la func lización del receptor de IL-6. También se propo métodos de identificación de com uestos útiles nidos utilizando cualquiera de los nu edimientos en los métodos de biblioteca combi cidos en la técnica, que incluyen: bibl ógicas; bibliotecas de fase sólida o fase de so lelas espacialmente direccionables ; métodos de s bibliotecas que requieren deconvolución; el mé ioteca de "una esfera-un compuesto" ; y méto esis de bibliotecas que utilizan selecc atografía de afinidad. El procedimiento de bibl ógicas se limita a las bibliotecas de pé tras que los otros cuatro procedimientos se ap bibliotecas de compuestos de péptidos, oligóm idos o pequeñas moléculas. (Véase, por ejempl . Anticancer Drug Design 12: 145) .

Una "molécula pequeña" como se utiliza ent , se entiende que se refiere a una composic e un peso molecular de menos de aproximadamente Ejemplos de métodos para la síntes iotecas moleculares se pueden encontrar en la t ejemplo en: DeWitt et al., 1993. Proc . Nati. Aca 90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Nati. Acad. S 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Ch ; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carr , 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 33: 2059; Car , 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, y l., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.

Las bibliotecas de compuestos se pueden pr solución (véase, por ejemplo, Houghten, echniques 13: 412-421), o en esferas (ver La re 354: 82-84), en chips (ver Fodor, 1993 Natu 556) , bacterias (véase la Patente de los Estados 5, 223,409), esporas (véase la Patente de los os No. 5, 233,409), plásmidos (véase Culi, et al . Nati. Acad. Sci. EUA 89: 1865-1869) o en fagos ígeno-anticuerpo, en donde una interrupción iejo indica que el compuesto candidato mod ión de señalización de IL-6RC y/o la interacció e IL-6R. Por ejemplo, el anticuerpo es el ant clonal 39B9 VL1 y el antígeno es rnativamente , el anticuerpo monoclonal es 39 , o 5C, y el antígeno es IL-6Rc o IL-6R.

En otra modalidad, se proporciona una p ble de IL-6RC y/o tanto de IL-6Rc como de IL-6 nción y se expone por lo menos a un ant clonal neutralizante. La formación de un comp ígeno-anticuerpo se detecta, y uno o más coi idatos se introducen en el complejo. Si el comp ígeno-anticuerpo se altera después de la introduc o más compuestos candidatos, los compuestos can útiles para tratar trastornos asociados lización aberrante de IL-6. uestos de prueba se pueden marcar con 125I, 35S, ya sea directa o indirectamente, y el radio ctado por conteo directo de radioemisión o por centelleo. Alternativamente, los compuestos de en ser marcados enzimáticamente con, por e xidasa de rábano picante, fosfatasa lcal iferasa, y la etiqueta enzim tica detectada medi rminación de la conversión de un sustrato adec ucto .

En una modalidad, el ensayo comprende p acto un complejo de antígeno-anticuerpo uesto de prueba, y determinar la capacid uesto de prueba para interactuar con el antíge manera alterar el complejo existente de an cuerpo.- En esta modalidad, la determinación cidad del compuesto de prueba para interactuar geno y/o alterar el complejo de antígeno-ant determinación de la capacidad del compuesto de modular el complejo de antígeno-anticuerpo s ar, por ejemplo, mediante la determinación cidad del antígeno para unirse a o interactuar icuerpo, en presencia del compuesto de prueba.

Los expertos en la técnica reconocerán lquiera de los métodos de clasificación descrito enté, el anticuerpo puede ser un ant ralizante, tal como el anticuerpo monoclonal 39 9 VL5, 12A y 5C, cada uno de los cuales m rfiere de otro modo con la . activación mediada p a vía JAK/STAT y/o cascada de MAPK.

Los métodos de clasificación descritos enté se pueden realizar como un ensayo bas las o como un ensayo libre de células . Los es de células de la invención son susceptibles sea de la forma soluble o la forma unida a la m cilglucosida, n-dodecilmaltósido, octa lglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Tritón" on0 X-114, Thesit®, - Isotridecipoli (éte englicol)n, sulfonato de N-dodecil-N, N-dim io-l-propano, sulfonato de midopropil) dimetilaminiol- 1-propano (CHAPS) , onato de 3 - (3 -colamidopropil) dimetilaminiol-2-h opano (CHAPSO) .

En más de una modalidad, puede ser d vilizar o el anticuerpo o el antígeno para facil ración de complejos de formas no complejas de s después de la introducción del compuesto can como para dar cabida a la automatización del ens rvación del complejo de antígeno-anticuer encia y en ausencia de un compuesto candidato, s ar en cualquier recipiente adecuado para conte tivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen pi tatión, que después se combinan con el compu eba, y la mezcla se incuba en condiciones propici formación de complejos (por ejemplo, en cond iológicas para la sal y el pH) . Después bación, las esferas o los pozos de pla rotitulación se lavan para eliminar cual onentes no unidos, la matriz inmovilizada en el esferas, el complejo determinado, ya sea directa irectamente . Alternativamente, los complejos se ociar de la matriz, y el nivel de formación de co antígeno-anticuerpo se puede determinar uti nicas estándares.

Otras técnicas para inmovilizar las prote rices también se pueden utilizar en los ens sificación de la invención. Por ejemplo, ya icuerpo (por ejemplo, 39B9 VL1, 39B9 VL5 , 12A y 5 ígeno (por ejemplo, IL-6Rc y/o tanto la proteína rnativamente , otros anticuerpos reaccionan icuerpo o antígeno de interés, · pero que no inte la formación del complejo de anticuerpo-antí rés, pueden ser derivatizados a los pozos de la ? anticuerpo o antígeno no unido, atrapado en lo iante conjugación de anticuerpos. Métodos para d s complejos, además de los descritos anteriormen complejos inmovilizados con GST, inclu nodetección de complejos utilizando esos icuerpos que reaccionan con el anticuerpo o antig La invención se refiere además a nuevos tificados por cualquiera de los ensay sificación y usos mencionados anteriorment tamientos como se describe en la presente .. nóstico y Formulaciones Profilácticas Los MAbs huIL-6Rc de la invención se util torno linfoproliferativo B (BLPD) , y c n stata) , resorción ósea, osteoporosis , ca iasis, glomerulonefritis proliferativa mes oma de Kaposi, linforna relacionado con el rmedades inflamatorias (por ejemplo, a atoide, artritis idiop tica juvenil de témico, hipergammaglobulinemia, enfermedad de itis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico lerosis múltiple, enfermedad de Castlemán, gammap , mixoma cardiaco, asma, asma alérgica y d litus dependiente de insulina autoinmunitaria isposición del paciente o del órgano a una o va enfermedades autoinmunitarias o inflam cionadas anteriormente se puede determinar ti cadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.

En otra modalidad de la invención, un anta IL-6Rc o tanto de IL-6Rc como IL-6R tal orción ósea, osteoporosis , caquexia, pso erulonefritis proliferativa mesangial, sarc osi, linfoma relacionado con el SIDA, y enfer lamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide, a opática juvenil de inicio sis ergammaglobulinemia, enfermedad de Crohn, erosa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , esc tiple, enfermedad de Castleman, gammapatía oma cardiaco, asma, asma alérgica y diabetes endiente de insulina autoinmunitaria) . Despu gnóstico, un antagonista de IL-6Rc y/o tanto de 0 de IL-6R, tal como un anticuerpo huIL-inistra para mitigar o revertir los efectos icación clínica asociada con una o varias ermedades mencionadas anteriormente, tales co mplo, sin limitación, sepsis, cáncer (por e loma múlti le (MM) carcinoma de células renales rosa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , esc iple, enfermedad de Castlemán, gammapatía d ma cardiaco, asma, asma alérgica y diabetes m ndiente de insulina autoinmunitaria) .

Los anticuerpos de la invención tambi es en la detección de IL-6Rc y/o tanto de IL-6R R en muestras de pacientes y, por lo tanto son diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos huIL invención se utilizan en ensayos in vitro, por e A para detectar los niveles de IL-6Rc y/o tanto como de IL-6R en una muestra del paciente.

En una modalidad, un anticuerpo huIL-6Rc nción se inmoviliza en un soporte sólido (por e o los pozos de una placa de microtitulació cuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de cualquier IL-6Rc y/o tanto IL-6Rc como IL- en estar presentes en una muestra de prueba. A ígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra d un sujeto sospechoso de tener niveles de a culante considerado para ser el diagnóstico logía. Después de enjuagar la muestra o está ba, el soporte sólido se trata con un icuerpo que es marcado detectablemente . El icuerpo marcado sirve como anticuerpo de detecc l de etiqueta detectable se mide, y la concen antígeno de IL-6Rc y/o tanto de IL-6RC como de I muestra de prueba se determina por comparación a estándar desarrollada a partir de las m ndares .

Se apreciará que con base en los res nidos utilizando los anticuerpos huIL-6Rc nción en un ensayo de diagnóstico in vitro, es ctar una enfermedad (por ejemplo, una ind ica asociada con isquemia, un trastorno autoinmu a etapa de progresión o terapia, se diseña una centraciones del antígeno que se pueden con acterísticas de cada etapa.

Todas las publicaciones y documentos de p ados en la presente se incorporan a la prese erencia como si cada publicación o documento se i ecífica e individualmente para ser incorpora erencia en la presente. La cita de publicac umentos de patentes no pretende ser un reconocimi cualquiera es técnica anterior pertinen stituye ninguna admisión en cuanto al conteni ha de la misma. La invención ahora se ha descrito descripción escrita, los expertos en la onocerán que la invención se puede practicar iedad de modalidades y que la descripción anterio mplos a continuación son para fines de ilustraci limitación de las reivindicaciones que siguen.

PLO 1: Clonación, expresión y purificac rleucina 6 (IL-6) , receptor de IL-6 (IL-6R) iejo de IL-6/IL-6R (IL-6Rc) Los ADNc que codifican para IL-6R (Acc 30) , IL-6 humana (Acceso No. BC015511) , IL molgus, IL-6 de cynomolgus (Acceso No. AB0005 R de ratón (Acceso No. N _010559) e. IL-6 d eso No. NM_031168) se amplificaron por PCR a pa derivado de células mononucleares de sangre per C) y se clonó en el vector PCR4 OPO (Invit ués de un paso posterior de PCR, una Etiqueta ?? dity, Denver CO) se introdujo en el extremo C encia de codificación de citocina. Estas constru o se subclonaron en vectores correspondientes resión de cualquiera de las formas solubles rana de IL-6, IL-6R e IL-6RC. La proteína recom IL-6Rc humana soluble (shuIL-6Rc) se eneró medi 14.4 para las formas solubles. La secuen ificación de citocinas fue seguida por un s rada al ribosoma interno viral (IRES) y un se cer cistrón para la coexpresión del vector BirA vector pEAK8 contiene el gen de resiste omicina, el antígeno nuclear 1 de EBV (EBNA1 gen oriP de la replicacion. EBNA1 y oriP son nec a la propagación del vector pEAK8 como el ADN e células humanas y la generación de transfe ables . Células transíectadas establemente se obt pués de 7-10 días de cultivo en presencia de 2 x omicina. Las células resistentes a puromic andieron y se utilizaron para la producción de c uble. La actividad biológica de IL-6R, IL-6 e quetado con His, humano, de ratón y de cyno ol aron en varios ensayos funcionales y resulta arables a los reactivos de fuentes comerciales nes en los que se suprimió la expresión de g icuerpos de ratón y se sustituyeron con la expré es de anticuerpos humanos. Se utilizaron tres c nes transgénicos : 1) Ratón HuMab® (Medarex, Princeton, NJ) 2) Ratón KM*, una cruza entre ratón n TC de Kirin (Kirin Pharma Company, Japón) 3) Ratón KM (FC RIIb-KO) , una cepa n ??F, en el que ha sido inactivado el gen Fcg ifica para el receptor IIB de Fe gamma inhibidor.

Los ratones, fueron inmunizados, ya s las de ovario de hámster chino que expresaban ño en la superficie celular (CH0/IL-6Rc) o con ño soluble (shuIL-6Rc) .

En general, todos los animales recibieron cciones intraperitonealmente (i.p.) o subcután c.) con CH0/IL-6RC o IL-6RC emulsificado en ad 42 50 pg shuIL-6Rc, i.p. en RIBI 56 20 pg shuIL-6Rc, s.c. en RIBI 70 10 pg shuIL-6Rc, s.c. en PBS 84 10 pg shuIL-6Rc, s.c. en PBS 87 5 pg shuIL-6Rc, s.c. en PBS Los sueros de animales inmunizados se exa iódicamente mediante análisis de citometría d a detectar la presencia de IgG humana dirigida a en comparación con las células CHO solas. Para ridomas, se retiraron de los ratones los fáticos poplíteos, inguinales, paraaó axilares, cervicales, axiales, y braquiales irieron con colagenasa y ADNasa. La suspens ulas simples de las células de los nodulos linfát ció en una relación 1:1 con células de mieloma suspendieron en Medio de Citofusión d selección HAT y se sembraron en 44 a 52 placa s a una concentración celular ele 0.1-O. lenocitos por pozo en 200 µ? de medio. La selec ridomas procedió durante 14 días . La fusión los linfáticos de los ratones inmunizados d ltado . la generación de hibridomas producto cuerpos específicos para IL-6RC. Catorce días la fusión, las placas que contenían hibrid niñaron para detectar la presencia de IgG humana a a CHO/IL-6RC humano.

PLO 3: Ensayos biológicos para la- actividad de I Todos los ensayos descritos en la pres aron a cabo en paralelo con un anticuerpo mo 1 humano control a IL-6R humano (Patente de los dos No. 5, 817,790, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: e se le denomina como "mAB control" . Adem esa ubicuamente por las células mientras que e un perfil de expresión reducida en los hepato número limitado de células inmunitarias . Una ble, de origen natural de IL-6R (sIL6R) se gen proteólisis de la forma de membrana o por rencial de ARNm de IL-6R. El SIL-6R se combina c formar el complejo IL-6/IL-6R soluble (IL-6Rc z de activar las células positivas para g tivas para mIL-6R. Este mecanismo se d lización trans, mientras que la señalización a la unión de IL-6 a mIL-6R y el acoplamiento post 0 se denomina señalización cis (Taga et al., , 58 : 573-581) .

Ensayos funcionales de IL-6: células BAF- -130) , una línea celular pro-B de ratón trans gpl30 humano, proliferan en presencia de IL-6 y (Fig. 1) . Del mismo modo, células BAF-130 transf el complejo nativo. Células BAF-130 (lxlO4 célu ozo) se incubaron durante 72 horas en una plac s de fondo plano en RPMI suplementado con suero l al 0.5% en presencia de mAbs de prueba (mAb C Gl o NI-1201) con huIL-6 + shuIL-6R (Figs. 1A iferación se evaluó utilizando el react iferación celular WST-1 (Roche) de acuerdo rucciones del fabricante. En resumen, despu odo de cultivo, se agregaron 20 1 del reactiv el medio y se incubaron a 37 °C en C02 al 5% du s. La absorbancia (450-650 nm) se midió us or de microplacas. Los resultados demuestran neutraliza la actividad del IL-6Rc nati azmente que el mAb control.

Para el análisis de señalización cis, las -130/IL-6R se incubaron con diferentes dosis de cantidad fija de IL-6 (Fig. 2A) . Por el contrar PLO 4: Variantes de anticuerpos huIL-6Rc Las variantes de los anticuerpos huIL- oran usando cualquiera de una variedad de t nocidas en la materia. Por ejemplo, los anticue variante huIL-6Rc incluyen anticuerpos que tiene modificaciones de aminoácidos, tales como, por e sustitución de aminoácidos, en la posición dentr encia del anticuerpo.

Los lugares preferidos para las sustituci oácidos · se muestran como residuos subrayad ritas, más adelante en la Tabla 3. Los resi oácidos en negritas/subrayados se pueden reempla lquier residuo de aminoácido. En modalidades pref residuos de aminoácidos en negritas/subraya plazados con los residuos de aminoácidos mostra lante en la Tabla 3. En estas modalidades, el ant rende (i) la secuencia de aminoácidos de c lementariedad de la cadena pesada { CDR3 ) , en don L; y (iv) la secuencia de aminoácidos de c YCAR (SEQ ID NO: 45) en la región 3 de marco (FR e X es F o Y.

El anticuerpo tipo silvestre NI-1201 (NI-1 figura en la Tabla 3 comprende la secuen oácidos QQSNSYPLT (SEQ ID NO : 26) en la región na ligera, la secuencia de amin LFDTTKYAQQFQG (SEQ ID NO: 16) en la región na pesada, la secuencia de aminoácidos DRDILTDYY ID NO: 36) en la región CDR3 de cadena pesad encia de aminoácidos TAVFYCAR (SEQ ID NO: 38) on FRW3.

El anticuerpo NI -1201 -A que figura en la rende la secuencia de aminoácidos QQSNSYPLT (SEQ en la región CDR3 de la cadena ligera, la secue oácidos GIIPLFDTTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 33) en la 2 de cadena pesada, la secuencia de amin ILTDYYPLGGMDV (SEQ ID NO: 37) en la región na pesada, y la secuencia de aminoácidos TAVYY O: 39) en la región FRW3.

El anticuerpo NI-1201-C que figura en la rende la secuencia de aminoácidos QQSNSYPLT (SEQ ID a región CDR3 de cadena ligera, la secuencia de ami AFETTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 34) en la región CDR2 d da, la secuencia de aminoácidos DRDILTDYYPLGGMDV (SE en la región CDR3 de cadena pesada, y la secue oácidos TAVYYCAR (SEQ ID NO: 39) en la región FRW3.

El anticuerpo NI-1201-D que figura en la rende la secuencia de aminoácidos QQSQSYPLT (SEQ ID a región CDR3 de cadena ligera, la secuencia de ami AFETTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 34) en la región CDR2 d da, la secuencia de aminoácidos DRDILTDYYPLGGMDV (SE en la región CDR3 de cadena pesada, y la secue O: 39) en la región FRW3.

El anticuerpo NI-1201-F que figura en la prende la secuencia de aminoácidos QQSNSYPLT (SEQ en la región CDR3 de cadena ligera, la secue noácidos GIIPAFDTTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 35) en la 2 de cadena pesada, la secuencia de amin ILTDYYPLGGMDV (SEQ ID NO: 37) en la región ena pesada, y la secuencia de aminoácidos TAVYYC O: 39) en la región FR 3.

El anticuerpo NI-1201-G que figura en la rende la secuencia de aminoácidos QQSQSYPLT (SEQ en la región CDR3 de cadena ligera, la secue oácidos GilPAFDTTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 35) en la 2 de cadena pesada, la secuencia de amin ILTDYYPLGG DV (SEQ ID NO: 37) en la región ena pesada, y la secuencia de aminoácidos TAVYYC O: 39) en la re ión FRW3. 201-C QQSNSYPLT GilPAFETTKYAQKFQG DRDILTDYYPLGGMDV 201-D QQSQSYPLT GilPAFETTKYAQKFQG DRDILTDYYPLGG DV 201-E QQSQSYPLT GIIPLFDTTKYAQKFQG DRDILTDYYPLGGMDV 201-F QQSNSYPLT GI PAFDTTKYAQKFQG DRDILTDYYPLGGMDV 201-G QQSQSYPLT GIIPAFDTTKYAQKFQG DRDILTDYYPLGGMDV PLO 5: NI-1201 bloquea la fosforilación de cida por la señalización cis de IL-6 Después de una privación de suero por 24 células HepG2 de carcinoma hepatocelular itivas a mIL-6R (ATCC) se incubaron durante 10 concentraciones indicadas de hIL-6 (Fig. 3A) , o i de IL-6 con las concentraciones indicadas de control o NI-1201 WT (Fig. 3B) . Después de la I amortiguador de muestra, las proteínas se analiz nomanchado de Western de SDS-PAGE, utiliza icuerpo monoclonal antifosfo-STAT3 , P-STAT3 (tec señalización celular) . Las manchas se quitaro PLO 6: NI-1201 bloquea la señalización trans iada por shuIL-6Rc Las células PICO fueron transí sitoriamente con el plásmido reportero de Luc endiente del promotor STAT3) . 2.5xl04 células p sembraron en placas de 96 pozos de fondo plano contenía suero fetal bovino al 0.5%. Después sión celular por 4-6 horas, las células P ivaron con 30 ng/ml de shuIL-6Rc con dosis c res de mAbs indicados. 18 horas después, el me inado y el ensayo de luciferasa se llevó izando el sistema de Ensayo de Lucíferas tante (Promega) en un analizador ioluminiscencia . Todas las variantes de NI-i ralizaron, de una forma dependiente de la do vidad de shuIL-6Rc mientras que el mAb con ueó la actividad del com le o reformado (Fi . 4 s primarios no conjugados (mAb Control, mAbs h 1201) se detectó con IgG Alexa Fluor 647 antihu ra (H+L) (Invitrogen) . Cada experimento se real licado. La media de intensidad de fluorescenci representa y demuestra una afinidad aumentada a NI- 1201 por IL-6R membranal en comparación con trol (Fig. 5) .

La afinidad y cinética de unión de los can 1201 (A-D) , NI-1201 WT y mAb control se caracte un instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, U cia) . Se utilizó un chip CM5 Biacore y se inm 0 RU (unidades de respuesta) de una IgG Fe ant acore AB, Uppsala, Suecia) mediante la quim NHS . Esta superficie se utilizó para captu didatos de NI-1201, NI-1201 WT y el mAb cont erficie se regeneró después de cada ciclo de in cloruro de magnesio 3M en 20 1/min, por 30 s inuto durante 3 minutos, seguida por 12 min po de disociación y la temperatura se fijó en 25 os se ajustaron de acuerdo a un modelo de Langmui determinaron los valores Kon, KoCC y KD. Las afini constantes cinéticas de variantes A-D de NI-12 1 T y mAb control se resumen en la Tabla firmación de los ensayos funcionales utilizando ivo o preformado, NI-1201 demostró una a anomolar por el complejo, mientras que el mAb ostró unión mensurable.

Constantes cinéticas y de afinidad medida Biacore Analito Muestra K„ (1/Ms) K„„ (1/s) NI-1201 A 8.29E+05 U OE-04 1.

Nl-1201 B 8.75E+05 9.40E-05 1.

NI- 1201 WT 4.31E+04 2.43E-04 5.6 mAb Control N.D. N.D. N NI- 1201 A 1.04E+05 2.13E-04 2.0 NI-1201 B U5E+05 2.07E-04 1.8 NI- 1201 C l. UE+05 2.25E-04 2.0 scyIL-6R NI-1201 D 1.12E+05 2.00E-04 1.7 NI-1201 WT 1.06E+05 2.15E-04 2.0 mAb Control 2.68E+04 4.63E-04 1.7 L-6R = Receptor de IL-6 humano soluble; shuIL-6Rc - comp ptor de IL-6/IL-6 humano soluble; scyIL-6R = Receptor de cynomolgus soluble; N.D . = no se detectó unión.

PLO 8: Mapeo del epítopo de anticuerpos huIL-6Rc Construcción de quimeras de IL-6R e I n mutado : Cada modificación se realizó en l ble de IL-6R se a re ó en un vector D ecifican las proteínas quiméricas de huIL-6R/l ón (Fig. 6A) y las proteínas de IL-6R de ra tienen sustituciones de aminoácidos humanos inios D3 (Fig. 6B) . Se utilizaron cebado gonucleótidos mutagénicos que se supe cialmente para la amplificación por PCR de secue terminales en cualquier lado de los cruces d IL-6R de ratón o regiones sustituidas, seguido lamiento de gel y recocido de los productos naturalizados . Los productos de PCR de longitud c ron digeridos mediante EcoRI y Bgl I y se . ligaro tor pDisplayMR (Invitrogen) . Las células P tivaron en medio DMEM suplementado con suero al al 10% y L-glutamina 4 mM. Las células se se placas de 12 a 24 horas antes de la transfecci er 40-50% de confluencia en placas de 6 poz nsfecciones de vectores pDisplay* (Invitrog metría de flujo (Figs. 6B-D) . La expresión rficie celular de cada IL-6R quimérico se izando un anticuerpo CD126PE antihumano o un C rratón {BD Pharmingen) . La unión del mA contro se detectó utilizando una IgG antihumana d ) Alexa Fluor 647 (Invitrogen) . Los datos demo NI-1201 reconoce un epitopo distinto en huIL-6R Control .

PLO 9: NI-1201 presenta reacción cruzada y neu Re de mono cynomolgus Se muestra la homología de secuencia de pr IL-6R entre la especie humana y la indicada (Fi se describe en el Ejemplo 6, las células sfectaron transitoriamente con el plásmido repor ferasa (promotor dependiente de STAT3) y se ac 25 ng/ml de IL-6 de cynomolgus + 250 ng/ml de s

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo completamente humano se une al complejo de IL-6/IL-6R (IL-6Rc) y ev complejo del receptor IL-6/IL-6 (IL-6Rc) se una tal manera que la cascada de señalización intra ada por gpl30 no se activa en presencia del anti donde el anticuerpo bloquea de manera cruz cuerpo seleccionado del grupo que comprende: (i) un anticuerpo que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos QQSXSYPL on 3 que determina la complementariedad de la ra (CDR3) , en donde X es N o Q; (b) la secuencia de amin X1FX2TTKYAQX3FQG en la región 2 que determ lementariedad de la cadena pesada (CDR2) , en d o A, X2 es D o E, y X3 es Q o K; (c) la secuencia de aminoácidos DRDILTDYY la SEQ ID NO: 4; (iii) un anticuerpo que comprende la secue oácidos QQSNSYPLT en la región CDR3 de cadena secuencia de aminoácidos GIIPLFDTTKYAQKFQG en la de cadena pesada, la secuencia de amin ILTDYYPMGGMDV en la región CDR3 de cadena pesad encia de aminoácidos TAVYYCAR en la región FR 3 (iv) un anticuerpo que comprende la secue oácidos QQSNSYPLT en la región CDR3 de cadena secuencia de aminoácidos GIIPLFDTTKYAQKFQG en la 2 de cadena pesada, la secuencia de amin ILTDYYPLGG DV en la región CDR3 de cadena pesad encia de aminoácidos TAVYYCAR en la región FRW3; (v) un anticuerpo que comprende la secue oácidos QQSNSYPLT en la región CDR3 de cadena secuencia de aminoácidos GIIPAFETTKYAQKFQG en la de cadena pesada, la secuencia de amin 2. El anticuerpo según la reivindicació de el anticuerpo tiene una afinidad de al menos IL-6RC. 3. El anticuerpo según la reivindicació de el anticuerpo tiene una afinidad de al menos IL-6RC. 4. El anticuerpo según la reivindicació de el anticuerpo se une a un epítopo en el domini eptor de IL-6 (IL-6R) , en donde el epítopo compre enos la secuencia de aminoácidos AERSKT. 5. El anticuerpo según la reivindicació de el anticuerpo no modula la interacción entre 6R. 6. El anticuerpo según la reivindicació de el anticuerpo se une también al IL-6R. 7. El anticuerpo según la reivindicació e el anticuerpo comprende una región CDR1 de oácidos de la SEQ ID NO: 26. 8. El anticuerpo aislado segú indicación 1, en donde el anticuerpo comprende: (a) una región CDR1 de VH que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, 18 ó 2 (b) una región CDR2 de VH que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, 19, ó 35; (c) una región CDR3 de VH que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, 20, 2 (d) una región CDR1 de ' VL que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, 21, 28 (e) una región CDR2 de VL que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; y (f ) una región CDR3 de VL que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, 29, 31 11. El anticuerpo según .la reivindicació e el anticuerpo es un isotipo de IgGl. 12. El anticuerpo según la reivindicació e el anticuerpo comprende una secuencia vari na pesada que comprende una secuencia de amin eccionada de la SEQ ID NO: 2, 8, ó 12 y una se iable de cadena ligera que comprende la secue o cidos de la SEQ ID NO: 4, 6, 10 ó 14. 13. Un anticuerpo antiIL-6Rc mon letamente humano aislado, o fragmento del mi de el anticuerpo comprende: (a) una región CDR1 de VH que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, 18 ó 2 (b) una región CDR2 de VH que compre encia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, 19, Ó 35; (c) una región CDR3 de VH que compre en donde el anticuerpo se une al complejo L-6R. 14. El anticuerpo según la reivindicación de el anticuerpo se une también a IL-6R. 15. El anticuerpo según la reivindicación de el anticuerpo es un isotipo de IgG. 16. El anticuerpo según la reivindicación de el anticuerpo es un isotipo de IgGl . 17. El anticuerpo según la reivindicación de el anticuerpo comprende una secuencia vari ena pesada que comprende una secuencia de ami eccionada de la SEQ ID NO: 2, 8, 6 12 y una se iable de cadena ligera que comprende la secue noácidos de la SEQ ID NO: 4, 6, 10 ó 14. 18. El anticuerpo según la reivindicación de el anticuerpo comprende una secuencia vari ena pesada que comprende la secuencia de ami rmedad de Crohn, psoriasis, esclerosis múltiple n sujeto, el método comprende administrar el ant n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 a un lo necesita en una cantidad suficiente para ali oma de la indicación clínica asociada con a atoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, esc tiple o asma. 21. El método según la reivindicación e el sujeto es un ser humano. 22. Un método para aliviar un síntoma eer, enfermedad autoinmunitaria o tr lamatorio, el método comprende administrar un ant n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 a un lo necesita en una cantidad suficiente para toma del cáncer, enfermedad autoinmunitaria o tr lamatorio en el sujeto. 23. El método según la reivindicación