JPH1066582A - Ｉｌ−６のヘリックスｄ領域を認識する抗体の遺伝子断片等 - Google Patents
Ｉｌ−６のヘリックスｄ領域を認識する抗体の遺伝子断片等Info
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- JPH1066582A JPH1066582A JP8242525A JP24252596A JPH1066582A JP H1066582 A JPH1066582 A JP H1066582A JP 8242525 A JP8242525 A JP 8242525A JP 24252596 A JP24252596 A JP 24252596A JP H1066582 A JPH1066582 A JP H1066582A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】自己免疫疾患の要因であるＩＬ−６に対する抗
体であって、ＩＬ−６の作用抑制効果を有する抗体のキ
メラ抗体等を作製するために必要な遺伝子断片等を提供
する。 【解決手段】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＨ鎖のＶ領域をコ−ドする遺伝子断片又はＩＬ−６
のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域をコ
−ドする遺伝子断片。
体であって、ＩＬ−６の作用抑制効果を有する抗体のキ
メラ抗体等を作製するために必要な遺伝子断片等を提供
する。 【解決手段】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＨ鎖のＶ領域をコ−ドする遺伝子断片又はＩＬ−６
のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域をコ
−ドする遺伝子断片。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＩＬ−６（インタ
ーロイキン−６）のヘリックスＤ領域を認識する抗体の
遺伝子断片等に関するものである。
ーロイキン−６）のヘリックスＤ領域を認識する抗体の
遺伝子断片等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＩＬ−６は、免疫、造血、炎症等の生体
防御系において重要な役割を果たしており、また生体の
増殖分化に広く関与する蛋白質であるが、その過剰産生
は自己免疫疾患の病因因子であることも知られている
（平野、International Journalof Cell Cloning 、９
巻、１６６頁、１９９１年）。従って、自己免疫疾患等
の治療に当たっては、生体内でのＩＬ−６の作用を人為
的に抑制することが必要である。
防御系において重要な役割を果たしており、また生体の
増殖分化に広く関与する蛋白質であるが、その過剰産生
は自己免疫疾患の病因因子であることも知られている
（平野、International Journalof Cell Cloning 、９
巻、１６６頁、１９９１年）。従って、自己免疫疾患等
の治療に当たっては、生体内でのＩＬ−６の作用を人為
的に抑制することが必要である。
【０００３】ＩＬ−６の生理作用の発現には、ＩＬ−６
レセプタ−（特開平２−２８８８９８号参照）やシグナ
ル伝達因子であるｇｐ１３０蛋白質（特願平２−１４０
０６９号参照）が必要であることが報告されている。従
ってＩＬ−６の作用抑制には、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセ
プター及びｇｐ１３０蛋白質の相互作用を妨害すること
が考えられる。
レセプタ−（特開平２−２８８８９８号参照）やシグナ
ル伝達因子であるｇｐ１３０蛋白質（特願平２−１４０
０６９号参照）が必要であることが報告されている。従
ってＩＬ−６の作用抑制には、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセ
プター及びｇｐ１３０蛋白質の相互作用を妨害すること
が考えられる。
【０００４】ＩＬ−６、ＩＬ−６レセプター及びｇｐ１
３０蛋白質間の相互作用を妨害し得るものとしては、抗
ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６レセプタ−抗体、抗ｇｐ１３
０蛋白質抗体等の各種抗体が知られている。
３０蛋白質間の相互作用を妨害し得るものとしては、抗
ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６レセプタ−抗体、抗ｇｐ１３
０蛋白質抗体等の各種抗体が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】抗ＩＬ−６モノクロ−
ナル抗体をＩＬ−６阻害剤として開発する場合、種々の
課題がある。まず、多くの抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗
体の中からＩＬ−６の作用抑制剤として適当な抗体を選
別することが必要となるが、簡便な選別手法はなく、個
々の抗体について実際にＩＬ−６の作用抑制効果を調べ
なければならない等、非常に多くの労力を要する。この
問題を解決するためには、ＩＬ−６の作用抑制効果が高
い抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗体の認識するエピト−プ
を同定した上で、抗体がそのエピト−プを認識するかど
うかを調べる方法が必要である。
ナル抗体をＩＬ−６阻害剤として開発する場合、種々の
課題がある。まず、多くの抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗
体の中からＩＬ−６の作用抑制剤として適当な抗体を選
別することが必要となるが、簡便な選別手法はなく、個
々の抗体について実際にＩＬ−６の作用抑制効果を調べ
なければならない等、非常に多くの労力を要する。この
問題を解決するためには、ＩＬ−６の作用抑制効果が高
い抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗体の認識するエピト−プ
を同定した上で、抗体がそのエピト−プを認識するかど
うかを調べる方法が必要である。
【０００６】第２の問題は、モノクロ−ナル抗体を体内
診断薬や治療薬として使用するには、該抗体を大量に投
与したり反復して投与することが必要となることであ
る。通常のマウス由来抗体は、製造が比較的容易である
反面、ヒトに投与するとマウス抗体を認識する抗体がヒ
ト血清中に現れるため（Levyら、Annu. Rev. Med. 、３
４巻、１０７頁、１９８３年）、マウス由来抗体をヒト
に大量投与又は反復投与した場合には免疫応答によるア
ナフィラキシ−の危険性が高くなったり、投与した抗体
が急速に分解を受けてしまい、その本来の活性が失われ
てしまう。これを解決するためにはヒト型のモノクロー
ナル抗体等を使用すればよいが、ヒトＢ細胞の集団から
目的とする抗体を産生するＢ細胞を単離し、これに不死
化能を与えて培養することは極めて困難である。
診断薬や治療薬として使用するには、該抗体を大量に投
与したり反復して投与することが必要となることであ
る。通常のマウス由来抗体は、製造が比較的容易である
反面、ヒトに投与するとマウス抗体を認識する抗体がヒ
ト血清中に現れるため（Levyら、Annu. Rev. Med. 、３
４巻、１０７頁、１９８３年）、マウス由来抗体をヒト
に大量投与又は反復投与した場合には免疫応答によるア
ナフィラキシ−の危険性が高くなったり、投与した抗体
が急速に分解を受けてしまい、その本来の活性が失われ
てしまう。これを解決するためにはヒト型のモノクロー
ナル抗体等を使用すればよいが、ヒトＢ細胞の集団から
目的とする抗体を産生するＢ細胞を単離し、これに不死
化能を与えて培養することは極めて困難である。
【０００７】最近、上記第２の問題を解決するものとし
てマウス−ヒトキメラ抗体が提案されている。マウス−
ヒトキメラ抗体はヒト以外の動物種由来の抗原結合領域
（即ち可変領域；Ｖ領域）とヒト由来の不変領域（Ｃ領
域）から成る抗体（Oi and Morrison, Biotechnology、
４巻、２１４頁、１９８６年参照）で、ヒト由来のＣ領
域は前記免疫応答を受けない。またいわゆるヒト化型抗
体も提案されている。ヒト化型抗体は、ヒト以外の動物
種由来の抗原結合最少領域（即ちＣＤＲ領域）と、ヒト
由来のその他のＶ領域及びＣ領域からなる抗体であり、
マウス−ヒトキメラ抗体に比べて前記免疫応答を受ける
可能性を更に減少することが可能である。
てマウス−ヒトキメラ抗体が提案されている。マウス−
ヒトキメラ抗体はヒト以外の動物種由来の抗原結合領域
（即ち可変領域；Ｖ領域）とヒト由来の不変領域（Ｃ領
域）から成る抗体（Oi and Morrison, Biotechnology、
４巻、２１４頁、１９８６年参照）で、ヒト由来のＣ領
域は前記免疫応答を受けない。またいわゆるヒト化型抗
体も提案されている。ヒト化型抗体は、ヒト以外の動物
種由来の抗原結合最少領域（即ちＣＤＲ領域）と、ヒト
由来のその他のＶ領域及びＣ領域からなる抗体であり、
マウス−ヒトキメラ抗体に比べて前記免疫応答を受ける
可能性を更に減少することが可能である。
【０００８】これら以外にも、体内診断薬又は治療薬と
しての抗体の機能を高めるため、抗体と他の蛋白質との
融合蛋白質や、Ｖ領域のみから成る抗体も提案されてい
る（例えば、Wardら、Nature、３４１巻、５４４頁、１
９８９年参照）。
しての抗体の機能を高めるため、抗体と他の蛋白質との
融合蛋白質や、Ｖ領域のみから成る抗体も提案されてい
る（例えば、Wardら、Nature、３４１巻、５４４頁、１
９８９年参照）。
【０００９】ＩＬ−６を認識する抗体を体内診断薬や治
療薬として使用するには、キメラ抗体等、以上に述べた
抗体を作製することが必要であるが、そのためには該抗
体のＨ鎖及びＬ鎖をコ−ドする遺伝子を得ることが必要
である。
療薬として使用するには、キメラ抗体等、以上に述べた
抗体を作製することが必要であるが、そのためには該抗
体のＨ鎖及びＬ鎖をコ−ドする遺伝子を得ることが必要
である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
に鑑みて抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗体のＨ鎖またはＬ
鎖の遺伝子について鋭意研究した結果、そのＶ領域をコ
ードする遺伝子を見出し、前記課題を解決するに至っ
た。
に鑑みて抗ＩＬ−６モノクロ−ナル抗体のＨ鎖またはＬ
鎖の遺伝子について鋭意研究した結果、そのＶ領域をコ
ードする遺伝子を見出し、前記課題を解決するに至っ
た。
【００１１】即ち本発明は、ＩＬ−６のヘリックスＤ領
域を認識する抗体のＨ鎖のＶ領域又はＩＬ−６のヘリッ
クスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域である。また
本発明は、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体
のＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子、特に配列番号１の
塩基配列で表される遺伝子断片である。更に本発明は、
ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ
領域、特に配列番号２の塩基配列で表される遺伝子断片
である。以下、本発明を詳細に説明する。
域を認識する抗体のＨ鎖のＶ領域又はＩＬ−６のヘリッ
クスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域である。また
本発明は、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体
のＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子、特に配列番号１の
塩基配列で表される遺伝子断片である。更に本発明は、
ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ
領域、特に配列番号２の塩基配列で表される遺伝子断片
である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】本発明のＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認
識する抗体のＨ鎖のＶ領域又はＬ鎖のＶ領域をコードす
る遺伝子断片としては、それぞれ配列番号１又は２の塩
基配列で表されるものを例示できる。これら遺伝子断片
は、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗ＩＬ−６
モノクローナル抗体（例えばＭＨ１６６、Matsuda ら、
Eur. J. Immunol.、１８巻、９５１頁、１９８８年参
照）を産生するハイブリド−マを出発材料にして、例え
ば実施例１に示す方法で単離することができる。また、
本明細書に開示した配列番号１又は２の塩基配列を手が
かりに、例えば通常のＤＮＡ合成機を使用することによ
っても調製できる。なお本発明の遺伝子断片は、目的に
より１個又は複数個の塩基が付加され、１個又は複数個
の塩基が欠失され、或いは１個又は複数個の塩基が置換
されていても良い。
識する抗体のＨ鎖のＶ領域又はＬ鎖のＶ領域をコードす
る遺伝子断片としては、それぞれ配列番号１又は２の塩
基配列で表されるものを例示できる。これら遺伝子断片
は、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗ＩＬ−６
モノクローナル抗体（例えばＭＨ１６６、Matsuda ら、
Eur. J. Immunol.、１８巻、９５１頁、１９８８年参
照）を産生するハイブリド−マを出発材料にして、例え
ば実施例１に示す方法で単離することができる。また、
本明細書に開示した配列番号１又は２の塩基配列を手が
かりに、例えば通常のＤＮＡ合成機を使用することによ
っても調製できる。なお本発明の遺伝子断片は、目的に
より１個又は複数個の塩基が付加され、１個又は複数個
の塩基が欠失され、或いは１個又は複数個の塩基が置換
されていても良い。
【００１３】本発明のＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認
識する抗体のＨ鎖のＶ領域又はＬ鎖のＶ領域は、前記し
た種々の遺伝子断片でコ−ドされ、又は前記した種々の
遺伝子断片の遺伝情報に従って合成等されたものであ
り、それぞれ配列番号１又は２のアミノ酸配列で表され
るものを例示できる。これらは、後述するように前記遺
伝子領域を用いることで遺伝子工学的に調製したり、本
明細書に開示した配列番号１又は２のアミノ酸配列を手
がかりに、例えば通常のペプチド合成機を使用すること
によって調製できる。なお本発明のＶ領域は、目的によ
り１個又は複数個のアミノ酸残基が付加され、１個又は
複数個のアミノ酸残基が欠失され、１個又は複数個のア
ミノ酸残基が置換されていても良い。
識する抗体のＨ鎖のＶ領域又はＬ鎖のＶ領域は、前記し
た種々の遺伝子断片でコ−ドされ、又は前記した種々の
遺伝子断片の遺伝情報に従って合成等されたものであ
り、それぞれ配列番号１又は２のアミノ酸配列で表され
るものを例示できる。これらは、後述するように前記遺
伝子領域を用いることで遺伝子工学的に調製したり、本
明細書に開示した配列番号１又は２のアミノ酸配列を手
がかりに、例えば通常のペプチド合成機を使用すること
によって調製できる。なお本発明のＶ領域は、目的によ
り１個又は複数個のアミノ酸残基が付加され、１個又は
複数個のアミノ酸残基が欠失され、１個又は複数個のア
ミノ酸残基が置換されていても良い。
【００１４】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＨ鎖のＶ領域又はＬ鎖のＶ領域を遺伝子工学的に製
造したり、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体
を遺伝子工学的に製造するには、例えば前記配列番号１
又は２、或いは配列番号１及び２に示された遺伝子断片
等の全部又は一部を含むベクタ−を使用することが好ま
しい。
体のＨ鎖のＶ領域又はＬ鎖のＶ領域を遺伝子工学的に製
造したり、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体
を遺伝子工学的に製造するには、例えば前記配列番号１
又は２、或いは配列番号１及び２に示された遺伝子断片
等の全部又は一部を含むベクタ−を使用することが好ま
しい。
【００１５】このようなベクタ−は、適当な宿主細胞中
で遺伝子断片を発現させることができるものであれば制
限はなく、例えば本発明の遺伝子断片以外に遺伝子断片
を発現（転写）させるためのプロモ−タ−／オペレ−タ
−、遺伝子断片の発現（転写）を終了させるためのタ−
ミネ−タ−、宿主細胞中での複製のための遺伝子等、公
知の遺伝子配列を含んでいても良い。
で遺伝子断片を発現させることができるものであれば制
限はなく、例えば本発明の遺伝子断片以外に遺伝子断片
を発現（転写）させるためのプロモ−タ−／オペレ−タ
−、遺伝子断片の発現（転写）を終了させるためのタ−
ミネ−タ−、宿主細胞中での複製のための遺伝子等、公
知の遺伝子配列を含んでいても良い。
【００１６】このベクタ−に、ヒト抗体のＣ領域をコ−
ドする遺伝子断片を更に付加することにより、マウス−
ヒトキメラ抗体のＨ鎖又はＬ鎖、或いはＨ鎖及びＬ鎖を
製造するためのベクタ−とすることができる。この場
合、ヒト抗体の遺伝子断片については、そのＨ鎖Ｃ領域
をコードする遺伝子断片は本発明のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子断片にフレ−ムが一致した状態となるよう
に、Ｌ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子断片は本発明のＬ鎖
Ｖ領域をコードする遺伝子断片にフレ−ムが一致した状
態となるように調製する。なおヒト抗体のＨ鎖またはＬ
鎖のＣ領域をコ−ドする遺伝子断片は従来公知である
（例えばKameyamaら、FEBS Lett.、２４４巻、３０１
頁、１９８９年）。
ドする遺伝子断片を更に付加することにより、マウス−
ヒトキメラ抗体のＨ鎖又はＬ鎖、或いはＨ鎖及びＬ鎖を
製造するためのベクタ−とすることができる。この場
合、ヒト抗体の遺伝子断片については、そのＨ鎖Ｃ領域
をコードする遺伝子断片は本発明のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子断片にフレ−ムが一致した状態となるよう
に、Ｌ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子断片は本発明のＬ鎖
Ｖ領域をコードする遺伝子断片にフレ−ムが一致した状
態となるように調製する。なおヒト抗体のＨ鎖またはＬ
鎖のＣ領域をコ−ドする遺伝子断片は従来公知である
（例えばKameyamaら、FEBS Lett.、２４４巻、３０１
頁、１９８９年）。
【００１７】これらベクタ−のうち、例えばＩＬ−６の
ヘリックスＤ領域を認識するマウス−ヒトキメラ抗体を
製造するためのベクタ−としては、例えば配列番号１の
塩基配列で表される遺伝子断片の全部又は一部、配列番
号２の塩基配列で表される遺伝子断片の全部又は一部、
ヒト抗体のＨ鎖のＣ領域をコ−ドする遺伝子断片及びヒ
ト抗体のＬ鎖のＣ領域をコ−ドする遺伝子断片を含み、
宿主細胞中で、該遺伝子断片を発現させることができる
ベクタ−等である。前記した通り、このベクターは、Ｈ
鎖Ｃ領域をコードする遺伝子断片はＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子断片にフレ−ムが一致した状態となるよう
に、Ｌ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子断片はＬ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子断片にフレ−ムが一致した状態となる
ように構築する。
ヘリックスＤ領域を認識するマウス−ヒトキメラ抗体を
製造するためのベクタ−としては、例えば配列番号１の
塩基配列で表される遺伝子断片の全部又は一部、配列番
号２の塩基配列で表される遺伝子断片の全部又は一部、
ヒト抗体のＨ鎖のＣ領域をコ−ドする遺伝子断片及びヒ
ト抗体のＬ鎖のＣ領域をコ−ドする遺伝子断片を含み、
宿主細胞中で、該遺伝子断片を発現させることができる
ベクタ−等である。前記した通り、このベクターは、Ｈ
鎖Ｃ領域をコードする遺伝子断片はＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子断片にフレ−ムが一致した状態となるよう
に、Ｌ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子断片はＬ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子断片にフレ−ムが一致した状態となる
ように構築する。
【００１８】例えば配列番号１の塩基配列で表される遺
伝子断片及び配列番号２の塩基配列で表される遺伝子断
片を含むベクタ−によれば、抗体のＣ領域を含まない、
Ｖ領域のみから成るＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識
する抗体（Ｆｖ抗体）を製造することができる。
伝子断片及び配列番号２の塩基配列で表される遺伝子断
片を含むベクタ−によれば、抗体のＣ領域を含まない、
Ｖ領域のみから成るＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識
する抗体（Ｆｖ抗体）を製造することができる。
【００１９】以上に説明したベクタ−による宿主細胞の
形質転換は通常の方法に従えば良く、特に制限はない。
例えばベクタ−が大腸菌を対象とするものであれば大腸
菌を宿主として使用し、酵母を対象とするものであれば
酵母を宿主として使用すれば良い。
形質転換は通常の方法に従えば良く、特に制限はない。
例えばベクタ−が大腸菌を対象とするものであれば大腸
菌を宿主として使用し、酵母を対象とするものであれば
酵母を宿主として使用すれば良い。
【００２０】このようにして形質転換した宿主細胞を適
当な条件下で培養することで、種々の形態のＩＬ−６の
ヘリックスＤ領域を認識する抗体を製造することができ
る。例えば、前記したベクタ−を選択して使用すること
で、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＨ鎖
のＶ領域のみを含む抗体（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリッ
クスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域のみを含む抗
体（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する
抗体のＨ鎖のＶ領域とヒト抗体のＨ鎖のＣ領域を含むキ
メラ抗体（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認
識する抗体のＬ鎖のＶ領域とヒト抗体のＬ鎖のＣ領域の
キメラ抗体（蛋白質）等のほか、ＩＬ−６のヘリックス
Ｄ領域を認識する抗体のＨ鎖のＶ領域（蛋白質）、ヒト
抗体のＨ鎖のＣ領域（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリックス
Ｄ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域（蛋白質）、ヒト
抗体のＬ鎖のＣ領域を含むキメラ抗体（蛋白質）等も得
ることができる。無論、前記の通りＶ領域のみから成る
ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体（Ｆｖ抗
体）も製造できる。
当な条件下で培養することで、種々の形態のＩＬ−６の
ヘリックスＤ領域を認識する抗体を製造することができ
る。例えば、前記したベクタ−を選択して使用すること
で、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＨ鎖
のＶ領域のみを含む抗体（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリッ
クスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域のみを含む抗
体（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する
抗体のＨ鎖のＶ領域とヒト抗体のＨ鎖のＣ領域を含むキ
メラ抗体（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認
識する抗体のＬ鎖のＶ領域とヒト抗体のＬ鎖のＣ領域の
キメラ抗体（蛋白質）等のほか、ＩＬ−６のヘリックス
Ｄ領域を認識する抗体のＨ鎖のＶ領域（蛋白質）、ヒト
抗体のＨ鎖のＣ領域（蛋白質）、ＩＬ−６のヘリックス
Ｄ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域（蛋白質）、ヒト
抗体のＬ鎖のＣ領域を含むキメラ抗体（蛋白質）等も得
ることができる。無論、前記の通りＶ領域のみから成る
ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体（Ｆｖ抗
体）も製造できる。
【００２１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
るために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。
るために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。
【００２２】実施例１ ＭＨ１６６抗体遺伝子の単離 ＲＰＭＩ１６４０で培養した１×１０6 個のＭＨ１６６
ハイブリド−マ（Matsuda ら、Eur. J. Immunol.、１８
巻、９５１頁、１９８８年）から、ｍＲＮＡ抽出キット
（ファルマシア製）により、ＭＨ１６６ハイブリド−マ
のｍＲＮＡを調製し、常法に従ってｃＤＮＡを調製し
た。
ハイブリド−マ（Matsuda ら、Eur. J. Immunol.、１８
巻、９５１頁、１９８８年）から、ｍＲＮＡ抽出キット
（ファルマシア製）により、ＭＨ１６６ハイブリド−マ
のｍＲＮＡを調製し、常法に従ってｃＤＮＡを調製し
た。
【００２３】次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、Ｈ鎖Ｎ末
端側プライマ−ＮＨ；５´−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡ
ＧＧＴＣＣＡＧ（Ａ）ＣＴＧ（Ｔ）Ｃ−３´及びＨ鎖Ｃ
末端側プライマ−ＣＨ１γ１；５´−ＡＧＧＣＴＴＧＴ
ＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴ−３´
（下線部は制限酵素部位）を用いてＰＣＲ（ポリメレー
スチェーンリアクション）を行い、抗体のＨ鎖Ｖ領域と
Ｃ１領域をコ−ドするＤＮＡ断片を増幅した。増幅した
ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化して得られ
たＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したｐ
ＵＣ１８（宝酒造（株）製）に挿入してｐＵＣ１８−Ｍ
Ｈ１６６Ｈを構築した。
端側プライマ−ＮＨ；５´−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡ
ＧＧＴＣＣＡＧ（Ａ）ＣＴＧ（Ｔ）Ｃ−３´及びＨ鎖Ｃ
末端側プライマ−ＣＨ１γ１；５´−ＡＧＧＣＴＴＧＴ
ＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴ−３´
（下線部は制限酵素部位）を用いてＰＣＲ（ポリメレー
スチェーンリアクション）を行い、抗体のＨ鎖Ｖ領域と
Ｃ１領域をコ−ドするＤＮＡ断片を増幅した。増幅した
ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化して得られ
たＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したｐ
ＵＣ１８（宝酒造（株）製）に挿入してｐＵＣ１８−Ｍ
Ｈ１６６Ｈを構築した。
【００２４】一方、同ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｌ鎖Ｎ末端
側プライマ−Ｌ２；５´−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴ
ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３´及びＬ
鎖Ｃ末端側プライマ−ＣＬＰｓｔ；５´−ＴＣＣＴＣＴ
ＧＣＡＧＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴ
ＧＡＡ−３´（下線部は制限酵素部位）を用いてＰＣＲ
を行い、抗体のＬ鎖をコ−ドするＤＮＡ断片を増幅し
た。増幅したＤＮＡ断片をＳａｃＩで消化して得られた
ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化したｐ
ＵＣ１８に挿入してｐＵＣ１８−ＭＨ１６６Ｌを構築し
た。
側プライマ−Ｌ２；５´−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴ
ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３´及びＬ
鎖Ｃ末端側プライマ−ＣＬＰｓｔ；５´−ＴＣＣＴＣＴ
ＧＣＡＧＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴ
ＧＡＡ−３´（下線部は制限酵素部位）を用いてＰＣＲ
を行い、抗体のＬ鎖をコ−ドするＤＮＡ断片を増幅し
た。増幅したＤＮＡ断片をＳａｃＩで消化して得られた
ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化したｐ
ＵＣ１８に挿入してｐＵＣ１８−ＭＨ１６６Ｌを構築し
た。
【００２５】実施例２ ＭＨ１６６抗体遺伝子の塩基配
列の決定 実施例１のようにして単離したＭＨ１６６抗体のＨ鎖の
Ｖ領域及びＬ鎖のＶ領域をコードする遺伝子断片の塩基
配列を常法により決定した。決定した塩基配列と、当該
塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列
番号１又は配列番号２の通りである。
列の決定 実施例１のようにして単離したＭＨ１６６抗体のＨ鎖の
Ｖ領域及びＬ鎖のＶ領域をコードする遺伝子断片の塩基
配列を常法により決定した。決定した塩基配列と、当該
塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列
番号１又は配列番号２の通りである。
【００２６】実施例３．ＭＨ１６６抗体の認識するエピ
ト−プの決定 最初に、ｐＥＴベクタ−（宝酒造（株）製）により、１
８４アミノ酸から構成される全長ＩＬ−６と、ＩＬ−６
のＣ末端２４残基（Ｄ領域）を欠失させた変異体（以下
ＩＬ−６ΔＤとする）を通常の条件で発現させた。ＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥの結果（図１）で明らかなように、ＩＬ−
６を発現させたときの不溶性画分（レ−ン２）とＩＬ−
６ΔＤを発現させたときの不溶性画分（レ−ン４）で、
２４残基に相当する分子量の差が確認された。
ト−プの決定 最初に、ｐＥＴベクタ−（宝酒造（株）製）により、１
８４アミノ酸から構成される全長ＩＬ−６と、ＩＬ−６
のＣ末端２４残基（Ｄ領域）を欠失させた変異体（以下
ＩＬ−６ΔＤとする）を通常の条件で発現させた。ＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥの結果（図１）で明らかなように、ＩＬ−
６を発現させたときの不溶性画分（レ−ン２）とＩＬ−
６ΔＤを発現させたときの不溶性画分（レ−ン４）で、
２４残基に相当する分子量の差が確認された。
【００２７】さらに、ＭＨ１６６を用いたウエスタンブ
ロットの結果（図２）で明らかなように、ＭＨ１６６抗
体は全長ＩＬ−６（１８４アミノ酸）と結合するが、Ｉ
Ｌ−６ΔＤ（ＩＬ−６のＣ末端２４残基を欠失させた変
異体）とは結合しなかった。以上の結果は、モノクロー
ナル抗体ＭＨ１６６の認識部位（エピトープ）が、ＩＬ
−６のＤヘリックス領域（１６０−１８４）内に存在す
ることを示す。
ロットの結果（図２）で明らかなように、ＭＨ１６６抗
体は全長ＩＬ−６（１８４アミノ酸）と結合するが、Ｉ
Ｌ−６ΔＤ（ＩＬ−６のＣ末端２４残基を欠失させた変
異体）とは結合しなかった。以上の結果は、モノクロー
ナル抗体ＭＨ１６６の認識部位（エピトープ）が、ＩＬ
−６のＤヘリックス領域（１６０−１８４）内に存在す
ることを示す。
【００２８】
【発明の効果】本発明で提供されるＩＬ−６のヘリック
スＤ領域を認識する抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＶ領域をコ−
ドする遺伝子断片、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識
する抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＶ領域等を利用することで、
種々の付加機能を有する抗体を大量に生産することが可
能である。これらは、ＩＬ−６の生理的役割の解析に重
要であり、ミエロ−マや各種自己免疫疾患に対する治療
薬診断薬開発に大きな意義をもつものである。
スＤ領域を認識する抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＶ領域をコ−
ドする遺伝子断片、ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識
する抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＶ領域等を利用することで、
種々の付加機能を有する抗体を大量に生産することが可
能である。これらは、ＩＬ−６の生理的役割の解析に重
要であり、ミエロ−マや各種自己免疫疾患に対する治療
薬診断薬開発に大きな意義をもつものである。
【００２９】本発明の遺伝子断片等はＩＬ−６の作用の
発現に重要な領域でであるヘリックスＤ領域を認識する
抗体（蛋白質）をコードするものであるため、ＩＬ−６
とＩＬ−６のシグナル伝達因子の相互作用を妨害し得る
抗体（蛋白質）として自己免疫疾患の治療薬等に応用可
能である。
発現に重要な領域でであるヘリックスＤ領域を認識する
抗体（蛋白質）をコードするものであるため、ＩＬ−６
とＩＬ−６のシグナル伝達因子の相互作用を妨害し得る
抗体（蛋白質）として自己免疫疾患の治療薬等に応用可
能である。
【図１】実施例３における電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧ
Ｅ）のパタ−ンを示す写真である。左から順に、レ−ン
１はＩＬ−６の可溶性画分、レ−ン２はＩＬ−６の不溶
性画分、レ−ン３はＩＬ−６ΔＤの可溶性画分、レ−ン
４はＩＬ−６ΔＤの不溶性画分、レーンＭは分子量マー
カを供し、ＣＢＢで染色したときのパタ−ンである。レ
ーンＭのバンドは、それぞれ下から順に、１４．４、２
０．０、３０．０、４３．０、６７．０、９４．０ｋＤ
ａのバンドである。
Ｅ）のパタ−ンを示す写真である。左から順に、レ−ン
１はＩＬ−６の可溶性画分、レ−ン２はＩＬ−６の不溶
性画分、レ−ン３はＩＬ−６ΔＤの可溶性画分、レ−ン
４はＩＬ−６ΔＤの不溶性画分、レーンＭは分子量マー
カを供し、ＣＢＢで染色したときのパタ−ンである。レ
ーンＭのバンドは、それぞれ下から順に、１４．４、２
０．０、３０．０、４３．０、６７．０、９４．０ｋＤ
ａのバンドである。
【図２】実施例３における電気泳動のパタ−ンを示す写
真である。レ−ン１はＩＬ−６の不溶性画分、レ−ン２
はＩＬ−６ΔＤの不溶性画分を供し、抗ＩＬ−６抗体Ｍ
Ｈ１６６を用いてウエスタンブロットを行ったときのパ
タ−ンである。
真である。レ−ン１はＩＬ−６の不溶性画分、レ−ン２
はＩＬ−６ΔＤの不溶性画分を供し、抗ＩＬ−６抗体Ｍ
Ｈ１６６を用いてウエスタンブロットを行ったときのパ
タ−ンである。
配列番号：１ 配列の長さ：３６３ 配列の型：核酸 配列の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 セルライン：ハイブリド−マＭＨ１６６ 配列 GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala TCA GTG AAG ATG TCC TGT AAG GCG TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAC 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr TAC ATG AAG TGG GTG AAG CAG AGT CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT 144 Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile GGA GAA ATT AAT CCT AAA AGT GGG GGT TCT AGG TAC AAC CAG AAG TTC 192 Gly Glu Ile Asn Pro Lys Ser Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Gln Lys Phe AAG GGC AAG GCC ACA ATG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAC TAC TGT 288 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys GCA AGA GTG GGT TAC TAC GCC GAG GGC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT 336 Ala Arg Val Gly Tyr Tyr Ala Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 配列番号：２ 配列の長さ：３３６ 配列の型：核酸 配列の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 セルライン：ハイブリド−マＭＨ１６６ 配列 GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48 Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT AGT TAT 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr GGC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro AAA CTC CTC ATC TAT GCA GCA TCC AAC CAA GTA TCC GGG GTC CCT GCC 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Val Ser Gly Val Pro Ala AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His CCT ATG GAG GAG GAC GAT ACT GCA ATG TAT TTC TGT CAG CAA AGT AAG 288 Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys GAG GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG 336 Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＣ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＣＵ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Claims (8)
- 【請求項１】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＨ鎖のＶ領域をコ−ドする遺伝子断片。 - 【請求項２】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＬ鎖のＶ領域をコ−ドする遺伝子断片。 - 【請求項３】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＨ鎖のＶ領域。 - 【請求項４】ＩＬ−６のヘリックスＤ領域を認識する抗
体のＬ鎖のＶ領域。 - 【請求項５】配列番号１の塩基配列で表されるＩＬ−６
のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＨ鎖のＶ領域をコ
−ドする遺伝子断片。 - 【請求項６】配列番号２の塩基配列で表されるＩＬ−６
のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領域をコ
−ドする遺伝子断片。 - 【請求項７】配列番号１のアミノ酸配列で表されるＩＬ
−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＨ鎖のＶ領
域。 - 【請求項８】配列番号２のアミノ酸配列で表されるＩＬ
−６のヘリックスＤ領域を認識する抗体のＬ鎖のＶ領
域。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8242525A JPH1066582A (ja) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | Ｉｌ−６のヘリックスｄ領域を認識する抗体の遺伝子断片等 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8242525A JPH1066582A (ja) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | Ｉｌ−６のヘリックスｄ領域を認識する抗体の遺伝子断片等 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066582A true JPH1066582A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=17090417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8242525A Pending JPH1066582A (ja) | 1996-08-27 | 1996-08-27 | Ｉｌ−６のヘリックスｄ領域を認識する抗体の遺伝子断片等 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1066582A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8034344B2 (en) | 2008-05-13 | 2011-10-11 | Novimmune S.A. | Anti-IL-6/IL-6R antibodies and methods of use thereof |
| US8153128B2 (en) | 2006-11-30 | 2012-04-10 | Medimmune Limited | Antibodies specific for the complex of interleukin-6 and the interleukin-6 receptor |
| US8198414B2 (en) | 2006-11-30 | 2012-06-12 | Medimmune Limited | Anti-human IL-6 antibodies |
| US11203636B2 (en) | 2017-02-01 | 2021-12-21 | Yale University | Treatment of existing left ventricular heart failure |
| US11384143B2 (en) | 2018-01-05 | 2022-07-12 | Novo Nordisk A/S | Methods for treating IL-6 mediated inflammation without immunosuppression |
-
1996
- 1996-08-27 JP JP8242525A patent/JPH1066582A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8153128B2 (en) | 2006-11-30 | 2012-04-10 | Medimmune Limited | Antibodies specific for the complex of interleukin-6 and the interleukin-6 receptor |
| US8198414B2 (en) | 2006-11-30 | 2012-06-12 | Medimmune Limited | Anti-human IL-6 antibodies |
| EP2628751A2 (en) | 2006-11-30 | 2013-08-21 | AstraZeneca AB | Binding members for interleukin-6 and use thereof |
| US9005620B2 (en) | 2006-11-30 | 2015-04-14 | Medimmune Limited | Compounds |
| US8034344B2 (en) | 2008-05-13 | 2011-10-11 | Novimmune S.A. | Anti-IL-6/IL-6R antibodies and methods of use thereof |
| US8337849B2 (en) | 2008-05-13 | 2012-12-25 | Novimmune S.A. | Anti-IL6/IL-6R antibodies |
| US9234034B2 (en) | 2008-05-13 | 2016-01-12 | Novimmune S.A. | Methods of treating autoimmune diseases using anti-IL6/IL-6R complex antibodies |
| US9828430B2 (en) | 2008-05-13 | 2017-11-28 | Novimmune S.A. | Anti-IL-6/IL-6R antibodies |
| US10759862B2 (en) | 2008-05-13 | 2020-09-01 | Novimmune, S.A. | Anti-IL-6/IL-6R antibodies and methods of use thereof |
| US11613582B2 (en) | 2008-05-13 | 2023-03-28 | Novimmune S.A. | Anti-IL-6/IL-6R antibodies and methods of use thereof |
| US11203636B2 (en) | 2017-02-01 | 2021-12-21 | Yale University | Treatment of existing left ventricular heart failure |
| US11384143B2 (en) | 2018-01-05 | 2022-07-12 | Novo Nordisk A/S | Methods for treating IL-6 mediated inflammation without immunosuppression |
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