WO2005063986A1

WO2005063986A1 - 免疫応答調節蛋白質

Info

Publication number: WO2005063986A1
Application number: PCT/JP2004/019810
Authority: WO
Inventors: Mikio Yamamoto; Saburo Saito; Kinya Nagata; Kazuyuki Ogawa; Kunou Suzuki; Masahiro Iwasaki; Shoichi Takano; Naoki Yamamoto; Tohru Wakatsuki; Nobutake Akiyama
Original assignee: Bml, Inc.
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-12-27
Publication date: 2005-07-14
Also published as: JP2007068402A

Abstract

この発明は、ヒトの精製蛋白質であって、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2における1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質と、この蛋白質をコードするヒト遺伝子およびこの蛋白質に対する抗体を提供する。これらの蛋白質、遺伝子、抗体は、例えば免疫関連疾患の診断、予防、治療等に有用である。

Description

明細書免疫応答調節蛋白質

技術分野この出願の発明は、免疫応答を調節する新規なヒト免疫応答調節遺伝子とヒト免疫応答調節蛋白質に関するものである。

' 背景赚免疫システムは、生体防御に必須の役割を担っている。免疫システムの活性化は、細胞間、細胞内あるいは細胞外に分泌される多彩な微量蛋白物質によって調節されている。免疫細胞は、これらの分子を介して恒常性を保ちながら生体防御に働いている。一方、免疫システムの破綻は、重篤な感染症を引き起こすばかりでなく、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全や癌などさまざまな疾患を引き起こす。したがって、免疫を調節する微量蛋白物質の解明は、免疫システムが関与した様々な病態を正確に把握し有効な治療方針を立てるうえで重要であり、それらを医薬として使用すればさまざまな免疫異常疾患の克服が可能になると考えられている。免疫応答の調節に関与する蛋白質としては、例えば、インターロイキン（ I L ) 1〜29、リピド A、ホスホリパーゼ A 2、エンド毒素、ブドウ球菌ェンテロトキシン Bおよび他の毒素、 I型インターフェロン、 II型イン夕一フエロン、腫瘍壊死因子、トランスフォ一ミング増殖因子- /3 ( 「T G F— /3」）、リンホ毒素、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（CSF) 、単球マクロファージ CSF、顆粒球 CSF、血管上皮増殖因子、アンギオテンシン、トランスフォーミング増殖因子、熱ショックタンパク質、血液型の糖鎖部分、 Rh 因子、線維芽細胞増殖因子、ケモカイン等が知られているが、これらの既知の微量蛋白質のみではさまざまな免疫異常疾患の病態が説明できないことからさらに多数の未知免疫応答調節物質が存在することが予想されている。また一方で、これらの免疫応答調節物質の有効な使用方法も大きく進展しており、例えば金属コロイド等と結合させた標識化送達系と、これを用いた免疫応答調節方法およびモノクローナル抗体の産生方法等が提案されている（特表 2002-503639号公報）。

発明の開示免疫応答を促進あるいは制御する微量蛋白質はそれ自身が発癌およびアレルギ一、自己免疫疾患、慢性感染症などの免疫異常に関連した様々な疾患を予防あるいは是正する医薬品となりうるのみならず、病態を正確に把握するための診断マ一力一としても有用であり、また抗体医薬品や低分子医薬品を開発するための夕一ゲッ卜蛋白質としての可能性を秘めている。また、免疫賦活作用を持ったものはワクチン添加物としても有用である。従って、できるだけ多くの免疫関連蛋白質を得ることが望まれている。この出願の発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒトの新規な免疫応答調節蛋白質とその遺伝子、抗体ならびにそれらを利用した発明を提供することを課題としている。この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。すなわち、第 1 の発明は、ヒトの単離遺伝子であって、配列番号 2 のァミノ酸配列、または配列番号 2 における 1 若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードする免疫応答調節遺伝子である。この第 1発明の免疫応答調節遺伝子の一態様は、転写産物 mRNAから合成される cDNAが配列番号 1の塩基配列を有する遺伝子である。第 2の発明は、前記第 1発明の免疫応答調節遺伝子のゲノム DNA、 mRNA、 cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチドである。第 3の発明は、前記第 1発明の免疫応答調節遺伝子または第 2発明の精製ポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレォチドである。第 4の発明は、前記第 1発明の免疫応答調節遺伝子または第 2発明の精製ポリヌクレオチドを PCR増幅するプライマーセットである。第 5の発明は、前記第 2発明の精製ポリヌクレオチドあるいは前記第 3発明のオリゴヌクレオチドを保有する組換えベクターである。第 6の発明は、前記第 5発明の組換えべクタ一による形質転換細胞である。第 7 の発明は、ヒトの精製蛋白質であって、配列番号 2 のアミノ酸配列または配列番号 2 における 1 若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質である。この第 7発明の免疫応答調節蛋白質の一態様は、前記第 1 発明の免疫応答調節遺伝子または前記第 2 発明のポリヌクレオチドの発現産物である蛋白質である。第 8 の発明は、前記第 7発明の免疫応答調節蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチドである。この第 8発明のペプチドの一態様は、配列番号 2における第 1- 164アミノ酸残基の連続 8以上のァミノ酸配列からなるペプチドである。第 9 の発明は、前記第 7発明の免疫応答調節蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。また第 10の発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイプリド一マ細胞である。第 11の発明は、免疫応答調節を目的とした医薬組成物であって、

(a) 前記第 2発明のポリヌクレオチド；

(b) 前記第 5発明の組換えベクター；

(c) 前記第 7発明の免疫応答調節蛋白質；

(d) 前記第 8発明のぺプチド；および

(e) 前記第 9発明のモノクローナル抗体またはポリクロ一ナル抗体、

からなる群より選択される 1以上を含むことを特徴とする医薬組成物である。この医薬組成物には例えば、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、免疫賦活剤、ワクチン製剤が包含される。第 12の発明は、前記第 1発明の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であつて、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法である。この第 12発明の方法においては、遺伝子発現産物が mRNAであること、または第 7発明の免疫応答調節蛋白質であることを具体的な態様としている。第 13の発明は、前記第 7発明の免疫応答調蛋白質が過剰に機能発現している細胞または動物である。第 14の発明は、任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であつて、前記第 13発明の動物に抗原物質を投与する工程と、この動物から抗体耷単離する工程を含むことを特徴とする方法である。なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖に i3 -N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、 GTP、 CTP、 UTP ; または dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) 力 S 100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは 2-99個連結した分子を言う。「蛋白質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）または非天然の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。またこの発明において、「1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基への置換」とは、この発明の免疫応答調節蛋白質の機能が実質的に変化しない範囲において、全アミノ酸配列における 30%以下、好ましくは 20%以下、さらに好ましくは 10 %以下のアミノ酸残基が付加、欠失または置換していることを意味する。この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明 »実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の医薬組成物の調製は Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的には IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。 .

図面の簡単な説明図 1は、 Thlおよび Th2細胞における UKClmRNAの発現をノーザンプロッティング法で解析した結果を示す。図 2は、大腸菌由来の UKC1 リコンビナント蛋白質の SDS-PAGE解析の結果を示す。クマジーブリリアントブルー染色。レーン 1 は分子量マーカ一、レーン 2は His-ss-UKCl、レーン 3は UKC1-His。図 3 は、 pcDNA3.1(-)を遺伝子導入した COS-7 細胞（Control) 、 cD- UKC1 を遺伝子導入した COS-7細胞（UKC1) 、非刺激 Th 2細胞（Control) および PMA/ionomycin 刺激した Th 2細胞 (PMA/ion) のそれぞれの培養上清を CX-2 抗体を用いて免疫沈降し、 EndoF処理（+) あるいは非処理（-) 後にウェスターンブロット解析した結果を示す。図 4は、 COS-7細胞由来 UKC1蛋白質の SDS-PAGE解析像。中央のレーンは CX2 抗体結合カラムを用いて精製した UKC1 蛋白質、右のレーンは精製 UKC1を Endo Fで処理し糖鎖を除いた標品の SDS-PAGE像を示す。図 5 は、 UKC1 ELISA の標準曲線。 2種の抗 UKC1 モノクローナル抗体 (CX2および CX10) を用いたサンドイッチ ELISAにおける標準 UKC1蛋白質の反応曲線を示す。縦軸は 592ナノメーターにおける OD値、横軸は UCK1の濃度（ng/nil) を示す。図 6は、 Thlおよび Th2細胞における UKC1の産生。 Thlおよび Th2細胞を PMA+ionomycin存在下（刺激）および非存在下（非刺激）に 37 で 24時間培養した培養上清中の UKC1の濃度を ELISAで定量した結果を示す。図 7は、スギ花粉、 PPDおよび PHAに対するヒ卜末梢血単核細胞の増殖応答におよぼす UKC1 の影響を示す。ヒ卜末梢血単核球を精製 UKC1 の存在下 (UKC1) および非存在下（Control) に、スギ抗原、 PPD および PHA で刺激し、 5 日目の細胞の DNA合成を ³H-thymidineの取り込みで評価した。縦軸は 3H-thvmidine取込み量（CPM) である。図 8は、 UKC1蛋白によるマウス B細胞の増殖刺激活性能を示す。 UKC1蛋白による B細胞増殖刺激活性は、培養 24〜40時間に ³H-thymidineをパルスして B細胞の増殖反応を DNA合成能として評価した。縦軸は ³H- thymidine取込み量（CPM) である。 1 は PBS (コントロール）、 2 は His-hPGDS ( 5 g/ml) 、 3は His-ss-UKCl (5 g/ml) 、 4は UKCl-His ( 1.2 g/ml) であある。図 9 は、 UKCl 蛋白による抗原特異的 Th2 細胞の増殖抑制活性を示す。 UKC1蛋白存在下で、スギ花粉アレルゲン Cry j 1 特異的なマウス Th2細胞の Cry j 1 に対する増殖反応を抑制できるか、培養 48〜64時間に 3H-thymidine をパルスして、 T細胞の増殖反応を DNA 合成能として評価した。縦軸は ³H- thymidine 取込み量（CPM) である。 1 は抗原なし、 2 は Cry j 1 (2.5 M g/ml) 、 3は Cry j 1 (2.5 M g/ml) +His-hPGDS (5 i g/ml) 、 4は Cry j 1

( 2.5 PL g/ml) +His-ss-UKCl ( 5 /1 g/ml) 、 5 は Cry j 1 ( 2.5 g/ml) +UKC1-His (5 μ g/ml) である。図 10は、 UKClによるヒト B細胞の増殖促進作用を示すグラフである。縦軸は 3H-thymidine 取込み量（CPM) である。 1 は B 細胞 +培地（コントロール）、 2は B細胞 +天然型 UKC1 (40 ng/ml) である。図 11は、 UCK1 による OVA免疫マウスの抗体産生増強作用を示すグラフである。血清中の OVAに対する IgG抗体は OVAを固相化抗原とした ELISA法で測定した。グラフの縦軸は抗体価（ELISAの吸光度が最大値の 1Z2を示す血清希釈倍数）を示す。 1は OVA+ICAで免疫したマウス血清、 2は OVA+FCAで免疫したマウス血清、 3は OVA+UKC1+ICAで免疫したマウス血清である。

発明を βするための最良の形態この発明の免疫応答調節遺伝子は、免疫応答調節蛋白質（以下「UKC1」と記載することがある）をコードするヒ卜遺伝子であり、具体的には配列番号 2 のアミノ酸配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードするヒト遺伝子である。そして UKC1遺伝子はその cDNAが配列番号 1の塩基配列を有している。

UKC1 遺伝子はこの発明によって提供されるオリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーを用いてスクリーニングすることによって単離することができる。プローブは、例えばこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（例えば cDNA) の一部配列（15bp以上）またはその相補配列を利用する事ができる。プローブによるスクリーニングは、ゲノム DNA とプローブとの特異的なハイプリダイゼーシヨンを可能とするス卜リンジェントな条件下で行うことができる。ストリンジェン卜条件は、ハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によつて規定される。例えば、米国特許 No.6，100,037 等に開示されている条件を採用することができる。またプローブの標識は、ラジオアイソトープ（RI) 法または非 RI法によって行うことができるが、非 RI法を用いることが好ましレ^ 非 RI法としては、蛍光標識法、ピオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シァニン色素（例えば、 Cy DyeTMシリーズの Cy3、 Cy5等）、ローダミン 6G試薬、 N-ァセトキシ -N²-ァセチルァミノフルオレン（AAF) 、 AAIF (AAF のヨウ素誘導体）などを使用することができる。

UKC1遺伝子はまた、適当なプライマーセットを用い、ヒトゲノム DNAあるいは当該遺伝子を発現している細胞から調整した cDNA を铸型として PCR (Polymerase Chain Reaction) 法によって増幅することもできる。プライマ —セットはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（cDNA) から選択した一部配列（15bp以上）の 2以上の組み合わせによって作成することができる。また、 cDNAの 5，側の 1 プライマーを用いた 5， RACE法によって遺伝子の上流を、 cDNAの 3 ' 側の 1 プライマーを用いた 3 ' RACE法によって遺伝子の下流部分を PCR増幅することもできる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することもできる。プライマーのサイズ（塩基数）は、铸型 DNA との間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、 15- 40塩基、望ましくは 15-30塩基である。ただし、 LA(long and accurate) PCR を行う場合には、少なくても 30 塩基が効率的である。センス鎖（5 ' 末端側）とアンチセンス鎖（3 ' 末端側）からなる 1組あるいは一対（2本）のプライマ一が互いにァニールしないよう、両プライマ一間の相補的配列を避けるようにする。さらに、铸型 DNA との安定な結合を確保するため GC含量を約 50%にし、プライマ一内において GC-richあるいは AT-richが偏在しないようにする。ァ二一リング温度は Tm (melting temperature) に依存するので、特異性の高い PCR産物をえるため、 Tm値が 55-65でで互いに近似したプライマ一を選定する。また、 PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約 0.1から約 1 Z Mになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えば OligoTM [National Bioscience Inc. (米国）製レ GENETYX (ソフトウェア開発（株）（日本）製）等を用いることもできる。このようにして得られた全長ゲノム遺伝子は、例えば、 PCR 法、 NASBN (Nucleic acid sequence based axnplincation )法、 TMA (Transcnotion― mediated amplification ) 法おょぴ SDA ( Strand Displacement Amplification) 法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することもできる。そして、この UKC1 ゲノム遺伝子からは、この遺伝子が転写する mRNA、 mRNAから合成した cDNAなどの精製ポリヌクレオチド（DNA断片や RNA断片）を調製することができる。例えば、 cDNA はヒト細胞から抽出したポリ (A) +RNAを铸型として合成することができる。ヒト細胞としては、 UKC1 を発現していれば生体より摘出したものでも培養細胞でも良い。 cDNAは、公知の方法 ( Mol.Cell.Biol.2, 167- 170, 1982; J.Gene 25,263-269, 1983; Gene, 150， 243-250， 1994) を用いて合成することができる。あるいは、この発明によって提供される情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いて、ヒ卜細胞から単離した mRNAを鍀型とする RT-PCR法を用いて、目的 cDNAを合成することもできる。または、 DNA オリゴ合成機によって部分配列を合成し、それを酵素的手法およびサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせる事によっても目的 cDNAを合成することもできる。このようにして調製される cDNAは、具体的には配列番号 1 の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、 UKC1 蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。また、これらのポリヌクレオチドは、生体に UKC1 蛋白質を過剰発現させるための遺伝子材料 (導入遺伝子）としても使用することができる。なお、 cDNAを、 UKC1蛋白質を遺伝子工学的に作成するため、あるいは導入遺伝子として使用する場合には、配列番号 1 の全長でなくてもよく、例えば少なくともそれぞれの蛋白質コード領域（CDS) を構成するポリヌクレオチド配列でよい。また目的の抗原に対する動物の抗原認識を向上させるために遺伝子導入する場合には、例えば、配列番号 1の塩基配列のうちの連続 60以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用することもできる。このようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えば cDNA を適当な制限酵素で切断して作成することもでき、あるいは文献（例えば Carruthers ( 1982 ) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams ( 1983 ) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov ( 1997 ) Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel

( 1995 ) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers ( 1994 ) Biochemistry 33:7886-7896; Narang ( 1979 ) Meth. Enzymol. 68:90; Brown ( 1979 ) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage ( 1981 ) Tetra. Lett. 22: 1859; 米国特許第 4,458,066 号）に記載されているような周知の化学合成技術により、 in vitroにおいて合成することができる。この発明の組換えべク夕一はクローニングベクターまたは発現ベクターであり、ィンサ一トとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宣のものを使用する。例えば、 cDNA またはその ORF 領域をインサ一卜として UKC1 蛋白質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。また UKC1 遺伝子のゲノム DNA をィンサートとする場合には、 BAC ( Bacterial Artificial Chromosome) ベクタ一ゃコスミドベクター等を使用することもできる。この発明の形質転換細胞は、例えば、 UKC1 蛋白質を大量製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシゥム法、リボゾーム法、 DEAE デキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調整することができる。この発明の UKC1 蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株から特異的な抗体等を用いて単離する方法、配列番号 2 のアミノ酸配列に基づいて化学合成によってぺプチドを調整する方法、あるいはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（cDNAまたはその翻訳領域）を用いて組換え DNA技術で生産する方法などにより取得できるが、組換え DNA技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば前記のポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によって RNA を調整し、これを铸型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビ卜ロで蛋白質を発現できる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現べクタ一に組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を大量に発現させる事ができる。

UKC1 蛋白質をインビトロ発現させて生産させる塲合には、前記のポリヌクレオチドを、 RNA ポリメラ一ゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えべクタ一を作成し、このべクタ一を、プロモーターに対応する RNAポリメラーゼを含むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、 UKC1 蛋白質をインビトロで生産することができる。 RNA ポリメラ一ゼプロモ一夕一としては、 T3、 T7、 SP6などが例示できる。これらの RNA ポリメラ一ゼプロモーターを含むベクタ一としては、 pKAl、 pCDM8、 pT3/ Τ718、 ρΤ7/319> pBluescriptllなどが例示できる。

UKC1蛋白質を大腸菌などの微生物で DNAを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、 DNA クローニング部位、ターミネ一夕一配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、このポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってもこのポリヌクレオチドがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、 pUC 系、 p BluescriptII、 pET発現システム、 p GEX発現システムなどが例示できる。

UKC1蛋白質を、真核細胞で DNAを発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモ一夕一、スプラインシング頜域、ポリ（A) 付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、 UKC1 蛋白質を真核細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pSVK3、 pSVL、 pBK-CMV、 pBK-RSV、 EBV ベクター、 pRS、 pYE82 などが例示できる。また、 pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、 pEGFP-Nl > pEGFP-Cl などを発現べクタ一として用いれば、 His タグ、 FLAG タグ、 GFPなど各種タグを付加した融合蛋白質として UKC1 蛋白質を発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞 COS-7、チャイニーズハムスター卵巣細胞 CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカッメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、 U C1 蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現べクタ一を真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾ一ム法、 DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。

UKC1 蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、 SDS - PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法および UKC1 に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む）、などが挙げられる。なお、以上の方法によって得られる組換え UKC1 蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、ダル夕チオン- S-トランスフェラーゼ (GST) や緑色蛍光蛋白質（GFP) との融合蛋白質などが例示できる。さらに、前記発明の蛋白質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。従つて.、修飾された蛋白質も前記発明の蛋白質の範囲に含まれる。このような翻訳後の修飾としては、 N末端メチォニンの脱離、 N末端ァセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア一ゼによる限定分解、ミストレイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。この発明のペプチドは、 UKC1 蛋白質の一部分からなるペプチド断片である。すなわち、配列番号 2における連続 8アミノ酸配列、 9~30アミノ酸配列、 31 〜60アミノ酸配列、 61〜： L 10アミノ酸配列、 111~ 160アミノ酸配列のぺプチドである。さらに具体的には、配列番号 2における第 1- 164アミノ酸残基の連続 8 以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。すなわち、後記実施例で示したように、 UKC1蛋白質は免疫細胞活性化作用を有している。従って、 UKC1 の部分ペプチドは例えば抗原を融合させることによって、動物に抗原認識を向上させる原料と用いることができると共に、過剰投与等により動物に免疫寛容を生じさせるために使用することもできる。これらのペプチドは、前記の UKC1 蛋白質を任意の蛋白分解酵素で切断することによって調整することができる。また、配列番号 2 のアミノ酸配列に基づき、公知のペプチド合成法（Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149- 2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000) によつて作成することもできる。また、これらのペプチドは天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばダルタルアルデヒド、 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、 2 官能マレイミド、 Ν,Ν' -ジシクロへキシルカルボジイミド（DCC) 、または Ν，： N' -ジイソプロピルカルポジイミド（DIC) 等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン (例えば、 -C (=0) -CH₂-に対する- C (=0) -NH-) 、アミノメチレン（CH₂- NH) 、エチレン、ォレフィン（CH = CH) 、エーテル（CH2-0) 、チォエーテル（CH₂-S) 、テトラゾ一ル（CN₄-) 、チアゾール、レトロアミド、チォアミド、またはエステルを含む（例えば、 Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7， pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Mar cell Dekker, NYを参照) 。この発明の抗体は動物由来の UKC1 に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。具体的には、精製 UKC1 蛋白質やその部分ペプチドを抗原として調整される抗体である。この発明の抗体には、 UKC1 蛋白質のェピトープに結合することができる全体分子、および Fab、 F(ab ' )₂、 Fv 断片等が全て含まれる。例えばポリクローナル抗体の場合には、前記の UKC1 蛋白質またはペプチドを抗原として動物を免役した後、血清から得ることができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ゥシ、ゥマ、プ夕、ィヌ、ネコ、サル、ニヮトリなどが用いられる。また、ヒトへの治療を目的としてヒト型抗体を得たい場合はヒト免疫グロプリン遺伝子を保有する組換え動物も用いられる。免疫抗原ペプチドによる動物の免疫は公知の方法（例えば、村松繁、他編、実験生物学講座 14、免疫生物学、丸善株式会社、昭和 60 年；日本生化学会編、続生化学実験講座 5、免疫生化学研究法、東京化学同人、 1986 年；日本生化学会編、新生化学実験講座 12、分子免疫学 III、抗原 ·抗体 ·補体、東京化学同人、 1992 年などに記載された方法）に準じて行うことができる。例えば、一般的方法としては、抗原ペプチドを哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより免疫を行うことができる。また、抗原ペプチドをアジバントと共に投与してもよレ。アジュバントとしては、例えばフロイント完全（または不完全）アジュパント、リビ（Ribi) アジュバント、百日咳ワクチン、 BCG、リピッド八、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、その動物から採血した血液から調製することができる。また、モノクローナル抗体は公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、. 1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996 ； Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987 など）に従い作製することができる。またこの発明の抗体には、各種の標識（酵素、放射性同位体、蛍光色素、ピオチン等の低分子、毒素等）を結合したものも含まれる。これらの抗体は、例えば、血液、尿、組織片等の臨床検体や培養細胞中の UKC 1 蛋白質を検出し病態を把握する診断的目的に用いられる。その場合は目的に合わせてウエスタンブロッテイング、免疫沈降法、免疫組織化学的方法、フ口一サイトメトリ一、 RIA、 ELISA法などが使用できる。また、これらの抗体は、後述の実施例に示すように、天然型 UKC1 あるいはリコンビナント UKC 1 を含む資料から UKC1 を精製する際に有用である。また特異的抗体は実験動物等に投与することにより内在性 UKC1 を中和し免疫応答を調節する目的にも使用することができる。また、動物由来モノクローナル抗体をヒト化した.もの、あるいはヒト免疫グロプリン遺伝子を保有する動物より作成したヒト型モノクローナル抗体はヒトへ投与して疾患の診断や治療、予防の目的で使用される。第 11発明は、前記のポリヌクレオチド、組換えベクター、免疫応答調節蛋白質、ペプチドおよび抗体からなる群より選択される 1以上の成分を含むことを特徵とする、免疫応答調節を目的とした医薬組成物である。前記の各成分は、公知の方法 ·手段によって、生体あるいは細胞内に導入可能な形態として製剤化される。薬剤形態としては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、または公知のウィルスベクター（レトロウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス等）に組み込むようにすればよい。このような薬剤を遺伝子治療の手法により生体内に導入することによって、生体細胞内で免疫応答調節蛋白質を発現させることができる。また、免疫応答調節蛋白質またはべプチドを生体内に導入可能な形態とするためには、例えば、この蛋白質やべプチドの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液に蛋白質またはペプチドを混合して製剤化することができる。生体の組織あるいは細胞を一旦体外に取り出し、インビトロでこれらの UKC1 蛋白質あるいはペプチドで処理し所望の形質を誘導した後に生体に戻す方法もある。また、生体より取り出した組織あるいは細胞に UKC1 遺伝子発現ベクターを導入した後に生体に戻すことも治療のひとつの形態として可能である。そのような場合は、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ BioPORTER ( Gene Therapy Systems 社、米国）、 Chariot (Active Motif 社、米国）等）を採用することもできる。このようにして製剤化された医薬組成物は例えば、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、免疫賦活剤、ワクチン製剤等である。第 12の発明は、前記第 1発明の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法である。発現産物として mRNA を対象とする場合には、例えば、定量的なプローブ八イブリダィゼーシヨンやマイクロアレイを用いて行うことができる。標識 DNA プローブを用いた八イブリダィゼーシヨン法としては、具体的には、例えば AUele-specnic Oligonucleotide Probe 法、 Oligonucleotide Ligation Assay 法、 Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの測定は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料（例えば血液等）から単離した mRNA を铸型として、 cDNA を合成し、 PCR増幅する。その際に、標識 dNTPを取り込ませて標識 cDNAとする。この標識 cDNA をマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキヤプチヤープロ一ブ（オリゴヌクレオチド）にハイブリダィズした cDNA を定量的に検出する。八イブリダィゼーションは、 96穴もしくは 384穴プラスチックプレートに分注して標識 cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、 l~ 100 nl程度とすることができる。ハイブリダィゼーシヨンは、室温〜 70での温度範囲で、 6~20 時間の範囲で実施することが好ましい。八イブリダィゼーシヨン終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識 cDNA を除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) を用いることが好ましい。緩衝液としては、クェン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クェン酸緩衝液を用いることが好ましい。あるいはまた、被験者から単離した mRNAを铸型とし、前記第 4発明のブライマーセットを用いた定量的 RT-PCRによっても mRNA量を測定することがでぎる。さらに、発現産物としてこの発明の免疫応答調節蛋白質を対象とする場合には、第 9 発明の抗体を用いる方法が好ましい。特に標識化抗体を用いることによつて、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、 turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の EIA に用いられる酵素、例えば、ぺルォキシダーゼ、 /3—ガラクトシダ一ゼ、アルカリフォスファターゼ、ダルコ一スォキシダ一ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース- 6-リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質ゃ補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてべルォキシダーゼを使用する場合には、 3,3',5，5'—テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファタ—ゼを用いる場合には、パラニトロフエノール等を用いることができる。放射性同位体としては、 ¹²⁵1や ³H等の通常の RIA で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルォレツセンスイソチオシァネート（FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート（TRITC) 等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウン夕一等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。また、フローサイトメーターを用いて測定することもできる。さらに、 1 次抗体と標識化 2 次抗体を用いたサンドイッチ法 (標識として酵素を用いた場合には「ELISA 法」）も好ましく用いることがでさる。次に、 UKC1蛋白質が過剰に機能発現している第 13発明の細胞または動物について説明する。この動物または細胞は、例えば、動物に UKC1 蛋白質溶液を注射する方法；特許文献 1に記載されているような金属コロイドと UKC1 蛋白質を結合させて動物に投与する方法；レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクタ一を用いた遺伝子治療の方法に準じて動物に活性型 UKC1 遺伝子（すなわち、高発現プロモーター等を連結した精製ポリヌクレオチド）を導入する方法；リン酸カルシウム法、リボソームや赤血球ゴ一ストを使用する方法、エレクトロポーレーション法、ガラスピぺットを用いた微量注入法等によって細胞に UKC1遺伝子を導入する方法等によって作成することができる。さらに、これらの動物や細胞は、公知のトランスジエニック動物作成法（例えば、 Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980) に従って作成することができる。すなわち、活性型 UKC1 遺伝子を非ヒト動物（好ましくはマウスまたはラット）の分化全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に UKC1 遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジエニック動物を作成することができる。分化全能性細胞への遺伝子導入法としては、トランスジエニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、外来遺伝子 DNAの物理的注入（マイクロインジェクシヨン）法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（尾部先端等）から DNAを抽出し、サザンブロット解析や PCRアツセィにより導入した外来遺伝子の存在を確認することによって、 2倍体染色体の一方に外来遺伝子が導入された初代のへテロ接合体動物が得られ、このへテロ接合体同士を交配することによってホモ接合体動物が獲られる。この発明のトランスジェニック動物には、初代へテロ接合体動物、ヘテロ接合体同士を交配して得られるホモ接合体動物、それらの子孫動物、またはそれらの胎児が含まれる。

第 14の発明は、任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であつて、前記第 13発明の動物に抗原を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法である。具体的には、第 13発明の動物作成と同一の手段（例えば、動物に UKC1 蛋白質を投与する方法や、遺伝子治療の方法に準じて動物に UKC1遺伝子を導入する方法等）で動物体内での UKC1蛋白質の活性を上昇させると共に、任意の抗原物質を動物に投与する。 UKC1 蛋白質の投与や高発現によって動物の免疫応答が活性化されるため、効率よく抗体を作成することが可能となる。またこの第 14発明における別の態様は、活性型 UKC1 遺伝子を体細胞に有する卜ランスジエニック動物を用いて抗体を作成する方法である。この動物は導入 UKC1遺伝子の高発現によって UKC1蛋白質を過剰に発現し、高い免疫応答能を有するため、効率良く抗体を産生する。なお、抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、前記第 9 発明の抗体と同一の手続で作成することができる。

実施例次に実施例を示し、この発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、 DNA の組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（ "Molecular Cloning, Laboratory Maimal" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) に従った。制限酵素おょぴ各種修飾酵素は特に記載のない場合には、 Invitrogen 社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従つた。

実施例 1

UKC1遺 β? ^現の検出ヒト Thl および Th2 細胞は既報（Nagata et al.. J Immunol: 1999; 162(3) : 1278-8630) に従い健常人末梢血リンパ球より作成した。

UKC 1遺伝子発現検出用のプローブは、 22 merのセンスプライマ一（CAGC CCAGCCATCCGGGCATAT：配列番号 3) および 22 merのアンチセンスプライマ一（CCGAGGGCTCCCCCAGGGAG：配列番号 4) を用い、ヒト Th2細胞の poly(A)+RNAを铸型として RT-PCR法により増幅して得た。

得られた PCR 産物（590 bp) をランダムプライミング法を用いた市販の 32_P 標識用キット（宝酒造製）を用いて標識し、これを放射性プローブとして、ノーザンブロティング法にて種々のヒト組織や細胞株における UKC 1 mRNAの発現を調べた。種々のヒト組織由来 mRNA を含む市販のマルチティシューブロットメンブレン（Clonetech 社製）を用いて調べたところいずれの組織においても明瞭な mRNAの発現は確認されなかった。次に Thlおよび Th2細胞における UKC 1 mRNAの発現を調べた。 Thlおよび Th2細胞を PMA (20 ng/ml) と ionomycin (1 g/ml)の存在下および非存在下に 37でで 6時間培養後、細胞から total RNAを抽出し、ノーザンブロッテイング法で UKC1 mRNAの発現を解析したところ、刺激した Th2細胞に約 1. 1 kbの UKC 1 mRNAが顕著に発現しており、非刺激 Thl、 Th2細胞および刺激した Thl細胞には殆ど発現していなかった（図 1) 。このように UKC1 遺伝子の発現はヒト組織中で極めて限定されており、 1 例としては刺激を受けた Th2 細胞で選択的に発現されることが分かった。実施例 2

UKC1遺伝子 cDNAのクローニング所望の cDNAの全長をクローニングするために、 UKC1 mRNAの発現が高い細胞から λファージ cDNA ライブラリ一を調製した。すなわち、 PMA (20 ng/ml) と ionomycin U μ. g/ml) の存在下 37°Cで 6時間培養後のヒト Th2 細胞より total RNAを抽出し、オリゴ（dT) ビーズ（Pr omega社製）を用いて、 poly(A)+RNA を精製した。次に、市販の cDNA クローニングキット ( Invitrogen 社製）を用いて、 2本鎖 cDNA を合成し、その両端に EcoRI(Notl)アダプターを付加した後に、 ZAP Express (Stratagene 社製）の EcoRI サイトにクローニングした。これに引続き、市販のキット（Stratagene 社製）を用いて、インピトロで上記 λファージにおけるパッケージングを完了した。このパッケージング産物を大腸菌 XLl-Bleu MRF， (Stratagene 社製）に感染させ、約 1.7 X 10⁵個の組換え λファージを得た。次に、上記実施例 1で作成した 590 bpの PCR産物をランダムプライミング法を用いた市販の 32 _P標識用キット（宝酒造製）を用いて標識し、これを放射性プローブとして、プラークハイプリダイゼ一シヨン法により λファージライブラリ一のスクリ一ニングを行い複数の cDNAクローンを得た。最も長い cDNAクローンは poly (A)部分を除いて全長 913bpからなり、 492bpのオープンリーディングフレーム（ORF) 、 37 bpの 5，非翻訳領域および 384 bpの 3'非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号 1) 。 ORFは 164アミノ酸残基からなる蛋白質をコードおり、分泌蛋白質の特徴的なシグナル配列が存在していた（配列番号 2) 。

実施例 3

リコンビナント UKC1の作製上記実施例 2でクロ一ニングした UKC1 cDNAクローンの全長（アダプター配列を含む）を pcDNA3.1(-) (Invitrogen社製）の BamHI/Hindlllサイトにサブクローニングし哺乳類細胞用の発現ベクターを作成した（以下 pcD-UKCl と呼ぶ）。また一方で、上記実施例 2でクローニングした UKCl cDNAクローンの翻訳領域を PQE30ベクター（キアゲン）にサブクローニングし、 Hisタグの C末に UKC1蛋白質の全長が融合した融合蛋白質を発現する大腸菌用の発現ベクタ一を作成した（以下 pQE-H-ss-UKCl と呼ぶ）。さらには、上記実施例 2でクローニングした UKCl cDNAクローンの翻訳領域のうちシグナルぺプチド配列を除いた分泌蛋白質部分に相当する領域だけを含み、サブクローニング用の制限酵素サイトを付加したフラグメントを PCRにより増幅した。 PCRプライマ一は Ndelサイトを付加した 30 merのセンスプライマー（AAACATATGTC CCACACGTTGCCCGTCCGT:配列番号 5) と Xholサイトを付加した 30 mer のアンチセンスプライマー（TTTCTCGAGAGTGGTGGCCTGTTGGGCTCC：配列番号 6) を用いた。

PCR 産物を KOD ポリメラーゼ（東洋紡社製）により平滑化し、 pZero-2.0 の EcoRV部位に挿入し、宿主大腸菌 DH-5 a FT (Invitorgen社製）に形質転換を行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、 PCR 反応中に増幅エラ一が生ぜず、目的の構造を有するクロ一ンを選択した。このプラスミドから Ndelから Xholのフラグメントを pET30-A (Novagen社製）の Ndelから Xholの間に挿入し宿主大腸菌 DH-5 Q; FT (Invitorgen 社製）に形質転換を行った。塩基配列を確認し、 c DNAの ORFの His タグが融合した蛋白質として発現されるクローンを選択した。このクローンを LB培地で 37T:で 16 時間培養し、発現プラスミド DNA (pET-UKC-H) を精製した。

プラスミド PQE-H-ss-UKC と pET-UKC-H はそれぞれ宿主大腸菌 JM-109 (東洋紡社製）と BL21-Codon Plus (Stratagene 社製)に形質転換を行った。次に IPTG により蛋白質の誘導を行い、宿主に UKC 1 蛋白質の発現を誘導した。大腸菌を遠心により回収後、 8 M尿素を含む PBS緩衝液に懸濁し、凍結融解処理を行った後、超音波で破砕した。破砕液を遠心操作により上清を分離し、ニッケル NTA-レジン（Qiagen社製）により精製した。尿素を含む精製液をゲル濾過により分離し、 UKC1 蛋白質を含む画分を集めた後、 PBS に対して透析し、遠心操作により不溶物を除去した。得られたリコンビナント蛋白質はそれぞれ

His-ss-UKClおよび UKCl-Hisと称し以下の実験に用いた（図 2) 。

また、パキュロウィルスで分泌型の UKC1 蛋白質を作らせることもできる。まずパキュロウィルス発現プラスミド pAC-GP67-B (Invitrogen社製）を踌型として、センスプライマー（AATCCATgggAATgCTACTAgTAAATCAgT：配列番号 7) と UKC1 の配列を含むアンチセンスプライマ一（CAACGTGTGGGAC GCCGCAAAGGCAGAATG：配列番号 8) を用いて PCRを行い、パキュロウィルスのシグナル配列を増幅した。プラスミド DNA (pcD-UKCl) を铸型として、バキュロウィルスの一部シグナル配列を含み配列番号 8 の相補鎖であり、かつ UKC1 のシグナル配列の切断点の下流の配列を含むプライマー（TTTGCGGCG TCCCACACGTTGCCCGTCCGT：配列番号 9) とアンチセンスプライマー（TT TGAATTCTTAAGTGGTGGCCTGTTGGG：配列番号 10) を用いて PCRを行い、 UKC1の部分 cDNAを増幅した。

この cDNAと前述のパキュロウィルスのシグナル配列の DNAの混合物を铸型として、センスプライマー（配列番号 7) とアンチセンスプライマー（配列番号 10) を用いて PCR を行い、パキュロウィルスのシグナル配列と UKC1 のシグナル配列の切断点の下流の配列が融合した DNA (配列番号 11 ) を増幅し、 KOD ポリメラーゼ（東洋紡社製）により平滑化し、 pZero-2.0 の EcoRV部位に挿入し、宿主大腸菌 DH-5 Q! FT (Invitorgen社製）に形質転換を行った。目的の構造を持つクローンを選択し、プラスミドを精製した。このプラスミドを Spelと EcoRIで切断し、得られたフラグメントをパキュロウィルス発現プラスミド pAC-GP67-B の Spel と EcoRI の間に挿入し、宿主大腸菌 DH-5 a FT (Invitorgen 社製）に形質転換を行った。目的の構造を持つクローンを選択し、プラスミドを精製した。得られたプラスミドを Pharmingen社のプロトコルに従い、 UKC1 蛋白質を発現する組換えバキュロウィルスを作成し、 UKC 蛋白質を無蛋白質培地の中に放出させると共に、昆虫細胞を回収した。上清と細胞から SDSにより蛋白質を溶解させ、ウエスタンプロットをおこない、 UKC蛋白質が発現し、放出されていることを確認すると共に、糖鎖修飾がされていることを電気泳動的に確認した。

実施例 4

UKC1抗体の作成】実施例 3で得られた大腸菌由来のリコンビナント UKC1蛋白質 His- SS- UKC1 をフロイント完全アジュバントとともに BALB/c マウスの腹腔に免疫した。二回目以降は同一蛋白質をフロイント不完全アジュバントとともにほぼ 2 週間のインターバルをおいて数回追加免疫を行った。最終免疫から 2 週間後に採血し、ポリクロ一ナル抗体を精製すると共に、脾臓細胞からモノクローナル抗体の作成を行った。モノクローナル抗体は COS-7細胞に発現させた UKC1蛋白質に対する反応性をもとにスクリーニングした。すなわち、 pcD-UKCl およびコント口ールの pcDNA3.1(-)プラスミドを遺伝子導入して 24時間培養後の COS-7細胞をトリプシン · EDTA処理でいったん回収し、スライドグラス上にてさらに 6 時間培養後、ホルマリン固定、 NP-40 処理を施したものをそれぞれ抗原陽性および抗原陰性スライドとし、 FITC 標識ャギ抗マウスィムノグロプリン抗体 (Biosource International社製）を用いた蛍光抗体間接法にて UKC1 特異的なモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択した。 1 回の細胞融合で 24種の UKC1特異的モノクローナル抗体を得た。このうちウエスタンブロッテイングに使えなおかつ互いにェピト一プが異なる 2 種のモノクローナル抗体 (CX-2および CX- 10、いずれもマウス IgGl抗体）を選択した。

実施例 5

UKC1蛋白質の検出

UKC1 蛋白質は実施例 4 で述べたように特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に検出できる他、分子の性状の解析や定性の目的ではウエスタンプロッティングなどでも検出できる。例えば図 3 にはウェスタンブロッテイングの結果を示す。ここでは、まず pcD-UKClおよびコントロールプラスミド pcDNA3.1(-)を導入した COS-7 の培養上清および、 PMA (20 ng/ml) と ionomycin ( 1 g/ml) の存在下、非存在下で 6 時間培養したヒト Th2 細胞の培養上清を抗 UKC1モノクローナル抗体 CX-2で免疫沈降した。次にそれぞれの免疫沈降物を 2等分し、一方はそのまま、もう一方は EndoF処理をして全ての糖鎖をはずした後に SDS- PAGEに供し、ピオチン標識 CX-2抗体をプローブとしてウェスタンブロット解析を行った結果を示している。図 3 に示す結果より、アミノ酸配列から予想されたように UKC1 が分泌蛋白質であり、糖鎖が付加されており、糖鎖をはずした場合の分子量は約 16K ダルトンであることが確認された。また pcD-UKCl に由来する UKC1蛋白質が Th2細胞に由来する天然型の UKC1 と同様の分子構造を有することが確認された。さらに、図 1 に示すような遺伝子発現解析の結果から予想されたように UKC1 は刺激に応答して産生分泌されることが蛋白質のレベルで確認された。

実施例 6

UKC1蛋白質の定量

UKC 1 蛋白質は既存の免疫学的定量法例えば ELISA法などを用いて簡便に定量することができる。 UKC1 を定量するに当たってはできるだけ天然型に近い UKC1 標準品を調整する必要がある。この目的で、 pcD-UKCl を遺伝子導入した COS-7細胞の培養上清を、 CX- 2抗体を結合した Affi- Gel 10 (パイオラド社製）のカラムにアプライし、 PBSおよび 2Mの NaClを含む PBSでよく洗浄した後に pH2.5のダリシン塩酸バッファーで溶出したところ高純度の UKC1標準品を得ることができた（図 4) 。この標準品中の主要蛋白質が UKC1 であることは EndoFで糖鎖をはずすと約 16Kダルトンの単一分子量のパンドになること（図 4) およびウエスタンブロッテイングでモノクローナル抗体に特異的に反応することで確認された。次に CX-10抗体を固相化抗体、ピオチン化した CX- 2抗体を検出抗体とするサンドウイツチ ELISAを構築した。上記 UKC1標準品を用いた標準曲線を図 5に示す。また実際にヒト Thl細胞おょぴ Th2細胞の刺激、非刺激培養上清を測定した結果を図 6に示す。

実施例 7

UKC1蛋白質のヒト末梢血単核球に対する作用健常成人末梢血より単核細胞（以下 PBMC と略す）を分離し、 His-ss-UKCl および対照の大腸菌由来の His タグ付きリコンビナント蛋白質 [ここでは造血器型プロス夕グランデイン D2 合成酵素（hPGDS) を用いた] の存在下に 23 時間培養し、培養上清中のサイト力インを Human Cytokine LINCOplex kit (Linco Research 社製）で測定した。 UKC1 を添加すると IL-6、 IL- 10、 IL- 13、 IFN-ァの産生が誘導されることから UKC1 は免疫細胞とりわけ単球系の細胞を強力に活性化することが確認された（表 1 の上段）。次に、低濃度の PHA 刺激下に同様の実験を行った。その結果 UKC1は Thl関連のサイトカインである IL- 12や IFN-ァの産生を有意に促進し、一方で Th2関連サイトカインである IL-4、 IL-5、 IL- 13 の産生を抑制した（表 1 の下段）。この結果は UKC1 はァレルギ一性の免疫応答に抑制的に作用することを示している。このことを確認するために、 PBMCのスギ花粉アレルゲン、 PPD (典型的な Thl 関連抗原、結核菌成分）および低濃度の PHAに対する増殖応答を ³H-thymidine ( Ιμθί) の取り込みで測定する系に、 COS-7 由来の UKC1 ( l g/ml) を添加して影響を調ベた。その結果 UKC1 は PPDや PHAに対する増殖応答には影響せず、スギ花粉アレルゲンに対する増殖応答だけを選択的に抑制した（図 7) 。

表 1

UKClのヒ卜末梢血単核細胞のサイ卜力イン産生におよぼす影響添加物（ g/ml) PHA * IL-2** IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-12p70 IL-13 IFN-γ なし [-] く 3.2 く 3.2 <3.2 く 3.2 <3.2 <3.2 く 3.2 <3.2

His- ss- UKC1 (3) [-] く 3.2 <3.2 く 3.2 )10000 3000 く 3.2 40 18

His-ss-UKC1 (0.3) [-] く 3.2 <3.2 <3.2 〉10000 1700 <3.2 22 <3.2

His- ss- UKC1 (0, 03) [-] く 3.2 <3.2 く 3.2 〉10000 650 く 3.2 12 く 3.2

His— ss— UKC1 (0.003) [-] <3.2 く 3.2 く 3.2 )10000 22 <3.2 く 3.2 <3.2

His-hPGDS(5) [-] <3.2 く 3.2 <3.2 45 <3.2 く 3· 2 く 3.2 <3.2 なし [+] 1000 32 15 800 250 20 1200 800

His-ss-UKCI (3) [+] 450 16 7.5 〉10000 3100 30 800 2100

His-ss-UKC1 (0.3) [+] 700 13 6 )10000 2500 28 800 1600

His-ss- UKC1 (0.03) [+] 1000 16 4 )10000 1500 45 1000 1900

His- SS-UKC1 (0.003) [+] 1500 33 12 〉10000 450 60 1250 2000

His-hPGDS(5) [+] 1600 42 16 1900 460 24 1600 950 培地のみ [-] く 3.2 く 3.2 <3.2 <3.2 <3.2 く 3.2 く 3.2 <3.2

* PHA濃度は 1 g/ml

** サイト力イン濃度は 2ゥエルの平均（pg/ml)

5 実施例 8

UKC1によるマウス B細胞の増殖刺激活性】リポポリサッカライド（LPS) 非応答性マウス C3H/HeJ の脾臓細胞から、 B220に対する magnetic beads付着抗体（BD社製）を用いて B細胞を分離し0 た。 96ゥエルプレートに 6X10⁵個の B細胞を UKC1蛋白の存在、非存在下で 40時間培養した。培養 24~40時間に ³H-thymidine (ΐμθί) をパルスし、その取り込みを液体シンチレーシヨンカウンター（BD 社製）で測定した。それぞれの UKC 蛋白は、大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体（CX-2) ァフィ二ティーカラムを用いて精製した。この結果は図 8 に示したとおり、 His-ss-5 UKCl蛋白および UKC-His蛋白は、 C3H/HeJマウス B細胞に対し増殖活性を示した。なお、コントロールの His-hPGDS蛋白では増殖活性は認められなかつた。このように、 UKC1 は B 細胞に作用して増殖活性を示す蛋白であることが確認された。

実施例 9

UKC1によるマウス抗原特異的 Th2細胞の増殖抑制スギ花粉アレルゲン Cry j 1に特異的に増殖するマウス Th2細胞株 2 X 10⁴個、マイトマイシン処理した抗原提示細胞 6 X 10⁵個、および抗原として Cry j 1 (2.5 μ_δ/πι1) に UKC 1蛋白の存在、非存在下で 64時間培養した。培養 48〜 64 時間に ³H-thymidine ( Ιμθί) をパルスし、その取り込みを液体シンチレ一シヨンカウンター（BD社製）で測定した。それぞれの UKC蛋白は、大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体（CX-2) ァフィ二ティーカラムを用いて精製した。この結果はこの図 9に示したとおり、 UKC1はスギ花粉アレルゲン Cry j 1 特異的 Th2細胞の Cry j 1 に対する増殖反応を抑制することができる蛋白であることが確認された。このように UKC1 蛋白は、 Th2細胞の抗原特異的増殖反応を抑制する活性をもつ蛋白である。

実施例 10 健常成人末梢血より得た PBMC から抗 CD19 抗体を結合した magnetic beads (Miltenyi Biotec社製）を用いて B細胞を分離した。 96 ゥエルプレートに 1 X 10⁵の B細胞を天然型 UKC1蛋白の存在、非存在下で 120時間培養した。培養 104-120時間に ³H-thyniidine ( ΐμθΐ) をパルスし、その取込みを液体シンチレーシヨンカウンタ一（BD 社製）で測定した。天然型 UKC1 蛋白質は、刺激したヒト Th2細胞の培養上清からモノクローナル抗体（CX-2) ァフィ二ティ一カラムを用いて精製した。この結果は図 10 に示した通り、ヒト Th2 細胞由来 UKC1蛋白質はヒト B細胞に対して増殖活性を示した。なおコント口ールの培地のみではほとんど増殖活性は認められなかった。このように天然型 UKC1 はヒ卜 B 細胞に作用して増殖活性を示す蛋白質であることが確認された。

実施例 11

UKC1蛋白質の in vivoでの免疫応答に対する効果をみるために、マウスの抗体レスポンスに対する影響を調べた。 BALB/c マウス（各群 5 匹）の腹腔内に、卵白アルブミン（OVA) +フロイント不完全アジュバント（ICA) 、 OVA+フロイント完全アジュパント（FCA) 、あるいは OVA+UKC1蛋白質 +ICAの混合液を投与した。ここでは大腸菌由来の UKC1 蛋白質（His-ss-UKCl) を用いた。投与後 5週間後にそれぞれのマウスの OVAに対する血清抗体価を測定したところ、 OVA + ICA または OVA+FCA投与群に比べ OVA+UKC1+ICA投与群では OVA に対する血清抗体価の顕著な上昇が認められた（図 11 ) 。このように UKC1は in vivoにおいて強い免疫賦活作用を示すことが確認された。

産業上の利用可能性以上に詳しく説明したとおり、この発明によってヒトを含む動物に免疫を活性化させる免疫応答調節蛋白質とその遺伝子および特異的抗体が提供される。また、この発明のポリヌクレオチドを利用することによって、前記蛋白質を大量に製造することができる。この遺伝子、蛋白質あるいは抗体は癌、アレルギー、自己免疫疾患、種々の炎症性疾患を含む免疫関連疾患の予防、治療に効果を発揮することが期待される。ワクチンの効果増強物質としても有用である。また遺伝子あるいは抗体は上記免疫関連疾患の病態の把握や治療効果の評価に有用である。また、本発明の免疫応答調節蛋白質とその特異的なレセプターの相互作用に対するアン夕ゴニスト、ァゴニストのスクリーニング系を提供する。そのようなアン夕ゴニスト、ァゴニストも上記免疫関連疾患の予防、治療薬として有望である。一方、蛋白質および融合蛋白質を、実験動物を免疫する際に用いる事により、効率良く免疫を行うことができ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体において、簡便に多種な抗体を得ることができる。実験動物において免疫を効率良く行える事は、自己免疫疾患等の免疫異常のモデルマウス作成が効率良く行える。

Claims

請求の範囲

1. ヒトの単離遺伝子であって、配列番号 2 のアミノ酸配列、または配列番号 2 における 1 若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードする免疫応答調節遺伝子。

2. 転写産物 mRNAから合成される cDNAが配列番号 1の塩基配列を有する請求項 1の免疫応答調節遺伝子。

3. 請求項 1の免疫応答調節遺伝子のゲノム DNA、 mRNA、 cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。

4. 請求項 1 の免疫応答調節遺伝子または請求項 3 の精製ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするオリゴヌクレオチド。

5. 請求項 1 の免疫応答調節遺伝子または請求項 3 の精製ポリヌクレオチドを PCR増幅するプライマ一セット。

6. 請求項 3 の精製ポリヌクレオチドあるいは請求項 4のオリゴヌクレォチドを保有する組換えベクター。

7. 請求項 6の組換えべクタ一による形質転換細胞。

8. ヒトの精製蛋白質であって、配列番号 2 のアミノ酸配列、または配列番号 2 における 1 若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のァミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質。

9. 請求項 1 の免疫応答調節遺伝子または請求項 3のポリヌクレオチドの発現産物である請求項 9の免疫応答調節蛋白質。

10. 請求項 8 の免疫応答調節蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチド。

11. 配列番号 2における第 1-164アミノ酸残基の連続 8以上のアミノ酸配列からなる請求項 10のペプチド。

12. 請求項 8の免疫応答調節蛋白質および請求項 10のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。

13. 請求項 1 2のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞。

14. 免疫応答調節を目的とした医薬組成物であって、

(a) 請求項 3のポリヌクレオチド；

(b) 請求項 6の組換えべクタ一；

(c) 請求項 8または 9の免疫応答調節蛋白質；

(d) 請求項 10または 11のペプチド；および

(e) 請求項 12のモノクローナル抗体またはポリクロ一ナル抗体、

からなる群より選択される 1以上を含むことを特徴とする医薬組成物。

15. 請求項 1 の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であつて、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法。

16. 遺伝子発現産物が mRNAである請求項 15の方法。

17. 遺伝子発現産物が、請求項 8の免疫応答調節蛋白質である請求項 15 の方法。

18. 請求項 8 の免疫応答調節蛋白質が過剰発現している細胞おょぴ動物。

19. 任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であって、請求項 18の動物に抗原物質を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法。