JP4602772B2 - Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 - Google Patents
Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4602772B2 JP4602772B2 JP2004564543A JP2004564543A JP4602772B2 JP 4602772 B2 JP4602772 B2 JP 4602772B2 JP 2004564543 A JP2004564543 A JP 2004564543A JP 2004564543 A JP2004564543 A JP 2004564543A JP 4602772 B2 JP4602772 B2 JP 4602772B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- gene
- cell
- cells
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims description 57
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 title description 68
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 144
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 claims description 141
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 claims description 141
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 76
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 54
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 53
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 42
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 35
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 31
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 17
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 8
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 63
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 58
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 26
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 25
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 25
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 25
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 25
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 25
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 22
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 12
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 12
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 6
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 6
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- -1 For example Substances 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 4
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 4
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 4
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 108700041737 bcl-2 Genes Proteins 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 101100103015 Mus musculus Wt1 gene Proteins 0.000 description 3
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 208000009527 Refractory anemia Diseases 0.000 description 3
- 206010072684 Refractory cytopenia with unilineage dysplasia Diseases 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- UYUXSRADSPPKRZ-SKNVOMKLSA-N D-glucurono-6,3-lactone Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H]1OC(=O)[C@@H](O)[C@H]1O UYUXSRADSPPKRZ-SKNVOMKLSA-N 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 2
- 102000007503 Retinoblastoma-Binding Protein 7 Human genes 0.000 description 2
- 108010071000 Retinoblastoma-Binding Protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010042291 Serum Response Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100022056 Serum response factor Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 108091007916 Zinc finger transcription factors Proteins 0.000 description 2
- 102000038627 Zinc finger transcription factors Human genes 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000013549 childhood kidney neoplasm Diseases 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108700021654 myb Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 108091008726 retinoic acid receptors α Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 210000001086 DN3 alpha-beta immature T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001570 DN4 alpha-beta immature T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100023792 ETS domain-containing protein Elk-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710130332 ETS domain-containing protein Elk-4 Proteins 0.000 description 1
- 101710202200 Endolysin A Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102100036050 Phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A Human genes 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710138742 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase H Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700025832 Serum Response Element Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108700025700 Wilms Tumor Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 101150087725 ais gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000002791 cfu-m Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000004306 dn1 thymic pro-t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- GATNOFPXSDHULC-UHFFFAOYSA-N ethylphosphonic acid Chemical compound CCP(O)(O)=O GATNOFPXSDHULC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 229960001309 procaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、および該動物から樹立された細胞に関する。また、本発明は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法に関する。
ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となる遺伝子として単離された［特許文献１、非特許文献１、２］。この遺伝子はジンクフィンガー転写因子をコードし、組織発生、細胞の増殖および分化、ならびにアポトーシスに重要な役割を果たす［非特許文献３］。ＷＴ１遺伝子が破壊されたマウスは泌尿生殖器系に欠陥があり、胎生１３．５日の時点で死亡することが示されており、これは心不全のためと考えられている［非特許文献４］。
野生型ＷＴ１遺伝子は、病型を問わないほぼすべての白血病［非特許文献５〜１０］、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）［非特許文献１１］および発作性夜間血色素尿症［非特許文献１２］において高発現される。ＭＤＳにおけるＷＴ１遺伝子の発現は、疾患が不応性貧血（ＲＡ）から芽球増加を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ）を経て移行期ＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−ｔ）へと進行するに伴って増加する。さらに、野生型ＷＴ１遺伝子は、肺癌および乳癌［特許文献５、非特許文献１３〜２７］をはじめとする、さまざまな種類の固形腫瘍でも過剰発現されている。これらの所見から、本発明者らはＷＴ１遺伝子に発癌作用があると考えるに至った。
ＷＴ１遺伝子は当初、癌抑制遺伝子に分類されていた［非特許文献３］。しかし、ＷＴ１アンチセンスオリゴマーの投与によって白血病細胞および固形腫瘍細胞の増殖は阻害された［特許文献２、３、非特許文献２３、２８、２９］。また、ＷＴ１タンパク質が癌ワクチンとして利用しうることが判明している［特許文献４］。一方、野生型ＷＴ１遺伝子の構成的発現によって骨髄球系前駆細胞の分化は妨げられ、その代わりに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対する細胞増殖が誘導された［非特許文献３０、３１］。これらの結果は、ＷＴ１遺伝子が癌抑制遺伝子としての作用ではなく、発癌作用を発揮することを強く示すものである。
赤芽球系白血病細胞株Ｋ５６２および骨髄球系細胞株ＨＬ−６０はいずれも、その分化に伴ってＷＴ１を発現しなくなる［非特許文献３２、３３］。ヒトのＣＤ３４＋骨髄球系または赤芽球系前駆細胞はＷＴ１を発現するが、ＣＤ３４−細胞は発現しなくなる［非特許文献１０、３４］。これらの結果から、ＷＴ１遺伝子が骨髄球系および赤芽球系の前駆細胞の分化に関与することが示唆されている。さらに、野生型ＷＴ１遺伝子は急性リンパ球性白血病の大半で発現されている。しかし、ＷＴ１遺伝子がリンパ球系前駆細胞の発生および分化に関与することを示す直接的な証拠は得られていない。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
［特許文献１］特開平４−５０３０１４
［特許文献２］特開平９−１０４６２９
［特許文献３］特開平１１−３５４８４
［特許文献４］ＷＯ ００／０６６０２
［特許文献５］ＷＯ ９８／３９３５４
［非特許文献１］Ｃａｌｌ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０；６０：５０９
［非特許文献２］Ｇｅｓｓｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３：７７４
［非特許文献３］Ｍｅｎｋｅ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１
［非特許文献４］Ｍｏｏｒｅ ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９９９；１２６：１８４５
［非特許文献５］Ｍｉｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９２；６：４０５
［非特許文献６］Ｍｉｙａｇｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９３；７：９７０
［非特許文献７］Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８４：３０７１
［非特許文献８］Ｂｒｉｅｇｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９４；８：２１３８
［非特許文献９］Ｍｅｎｓｓｅｎ ＨＤ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９５；９：１０６０
［非特許文献１０］Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１４０５
［非特許文献１１］Ｔａｍａｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３：３９３
［非特許文献１２］Ｓｈｉｃｈｉｓｈｉｍａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：２２
［非特許文献１３］Ｐａｒｋ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１９９３；４：４１５
［非特許文献１４］Ｂｒｕｅｎｉｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；１１：３９３
［非特許文献１５］Ｖｉｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５７：５１５
［非特許文献１６］Ｗａｌｋｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９４；５４：３１０１
［非特許文献１７］Ｒｏｄｅｃｋ Ｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５９：７８
［非特許文献１８］Ｌａｄａｎｙｉ Ｍ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｗ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９４；５４：２８３７
［非特許文献１９］Ａｍｉｎ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５；１４６：３４４
［非特許文献２０］Ｌａｎｇｅｒａｋ ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．１９９５；１２：８７
［非特許文献２１］Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ ＧＢ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９７；９４：８１３２
［非特許文献２２］Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＣＥ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；７８：１８２
［非特許文献２３］Ｏｊｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；９０：１９４
［非特許文献２４］Ｈａｒａｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．１９９９；３：３５７
［非特許文献２５］Ｍｅｎｓｓｅｎ ＨＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００；１２６：２２６
［非特許文献２６］Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；８：１１６７
［非特許文献２７］Ｏｊｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；１００：３０４
［非特許文献２８］Ｙａｍａｇａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８７：２８７８
［非特許文献２９］Ａｌｇａｒ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９６；１２：１００５
［非特許文献３０］Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９
［非特許文献３１］Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９
［非特許文献３２］Ｐｈｅｌａｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ．１９９４；５：６７７
［非特許文献３３］Ｓｅｋｉｙａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：１８７６
［非特許文献３４］Ｈｏｓｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００２；１１６：４０９
野生型ＷＴ１遺伝子は、病型を問わないほぼすべての白血病［非特許文献５〜１０］、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）［非特許文献１１］および発作性夜間血色素尿症［非特許文献１２］において高発現される。ＭＤＳにおけるＷＴ１遺伝子の発現は、疾患が不応性貧血（ＲＡ）から芽球増加を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ）を経て移行期ＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−ｔ）へと進行するに伴って増加する。さらに、野生型ＷＴ１遺伝子は、肺癌および乳癌［特許文献５、非特許文献１３〜２７］をはじめとする、さまざまな種類の固形腫瘍でも過剰発現されている。これらの所見から、本発明者らはＷＴ１遺伝子に発癌作用があると考えるに至った。
ＷＴ１遺伝子は当初、癌抑制遺伝子に分類されていた［非特許文献３］。しかし、ＷＴ１アンチセンスオリゴマーの投与によって白血病細胞および固形腫瘍細胞の増殖は阻害された［特許文献２、３、非特許文献２３、２８、２９］。また、ＷＴ１タンパク質が癌ワクチンとして利用しうることが判明している［特許文献４］。一方、野生型ＷＴ１遺伝子の構成的発現によって骨髄球系前駆細胞の分化は妨げられ、その代わりに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対する細胞増殖が誘導された［非特許文献３０、３１］。これらの結果は、ＷＴ１遺伝子が癌抑制遺伝子としての作用ではなく、発癌作用を発揮することを強く示すものである。
赤芽球系白血病細胞株Ｋ５６２および骨髄球系細胞株ＨＬ−６０はいずれも、その分化に伴ってＷＴ１を発現しなくなる［非特許文献３２、３３］。ヒトのＣＤ３４＋骨髄球系または赤芽球系前駆細胞はＷＴ１を発現するが、ＣＤ３４−細胞は発現しなくなる［非特許文献１０、３４］。これらの結果から、ＷＴ１遺伝子が骨髄球系および赤芽球系の前駆細胞の分化に関与することが示唆されている。さらに、野生型ＷＴ１遺伝子は急性リンパ球性白血病の大半で発現されている。しかし、ＷＴ１遺伝子がリンパ球系前駆細胞の発生および分化に関与することを示す直接的な証拠は得られていない。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
［特許文献１］特開平４−５０３０１４
［特許文献２］特開平９−１０４６２９
［特許文献３］特開平１１−３５４８４
［特許文献４］ＷＯ ００／０６６０２
［特許文献５］ＷＯ ９８／３９３５４
［非特許文献１］Ｃａｌｌ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０；６０：５０９
［非特許文献２］Ｇｅｓｓｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３：７７４
［非特許文献３］Ｍｅｎｋｅ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１
［非特許文献４］Ｍｏｏｒｅ ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９９９；１２６：１８４５
［非特許文献５］Ｍｉｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９２；６：４０５
［非特許文献６］Ｍｉｙａｇｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９３；７：９７０
［非特許文献７］Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８４：３０７１
［非特許文献８］Ｂｒｉｅｇｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９４；８：２１３８
［非特許文献９］Ｍｅｎｓｓｅｎ ＨＤ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９５；９：１０６０
［非特許文献１０］Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１４０５
［非特許文献１１］Ｔａｍａｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３：３９３
［非特許文献１２］Ｓｈｉｃｈｉｓｈｉｍａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：２２
［非特許文献１３］Ｐａｒｋ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１９９３；４：４１５
［非特許文献１４］Ｂｒｕｅｎｉｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；１１：３９３
［非特許文献１５］Ｖｉｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５７：５１５
［非特許文献１６］Ｗａｌｋｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９４；５４：３１０１
［非特許文献１７］Ｒｏｄｅｃｋ Ｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５９：７８
［非特許文献１８］Ｌａｄａｎｙｉ Ｍ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｗ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９４；５４：２８３７
［非特許文献１９］Ａｍｉｎ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５；１４６：３４４
［非特許文献２０］Ｌａｎｇｅｒａｋ ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．１９９５；１２：８７
［非特許文献２１］Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ ＧＢ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９７；９４：８１３２
［非特許文献２２］Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＣＥ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；７８：１８２
［非特許文献２３］Ｏｊｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；９０：１９４
［非特許文献２４］Ｈａｒａｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．１９９９；３：３５７
［非特許文献２５］Ｍｅｎｓｓｅｎ ＨＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００；１２６：２２６
［非特許文献２６］Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；８：１１６７
［非特許文献２７］Ｏｊｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；１００：３０４
［非特許文献２８］Ｙａｍａｇａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８７：２８７８
［非特許文献２９］Ａｌｇａｒ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９６；１２：１００５
［非特許文献３０］Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９
［非特許文献３１］Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９
［非特許文献３２］Ｐｈｅｌａｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ．１９９４；５：６７７
［非特許文献３３］Ｓｅｋｉｙａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：１８７６
［非特許文献３４］Ｈｏｓｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００２；１１６：４０９
本発明は、ＷＴ１タンパク質の機能を生体レベルにおいて明らかにすることを目的とする。さらに本発明は、得られた知見を基に、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。より具体的には、本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＷＴ１タンパク質の機能を生体レベルにおいて明らかにするため、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１ ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターが導入されたＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作出した。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討するために、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の胸腺細胞を、ＦＡＣＳにより、ＨＳＡ、ＣＤ４およびＣＤ８の発現に関して分析した。その結果、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。さらに、胸腺細胞の４つのＤＮサブセット（ＤＮ１、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−；ＤＮ２、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋；ＤＮ３、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋；ＤＮ４、ＣＤ４４−ＣＤ２５−）のうちどのサブセットが増加したかを明らかにするために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関してＦＡＣＳ分析した。その結果、４つのＤＮサブセットのうちＣＤ４４＋ＣＤ２５−であるＤＮ１、＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が同腹仔の場合よりも有意に多かったが（７４．２％対１８．７％）、ＤＮ２（１．５％対２４．８％）およびＤＮ３（２．０％対３７．３％）は有意に少なかった。＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスでは、正常同腹仔との比較で４つのＤＮサブセットの割合に有意差は認められなかったが、１２週齢のＷＴ１−ＴｇマウスではＤＮ胸腺細胞が有意に多かった。ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＤＮ胸腺細胞の増加とは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスのいずれの系統ともに正常同腹仔よりも少なかった。
さらに、本発明のＷＴ１−Ｔｇマウスでは、胸腺の腫大が起こり、急性リンパ性白血病が起こることが判明した。
以上の結果は、ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現により、Ｔ細胞系列の胸腺内分化がブロックされ、その後リンパ性白血病が発症することを示すものである。従って、ＷＴ１遺伝子がＴ細胞系列の発生および分化に関与することが初めて判明した。
即ち、本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法に関し、以下の〔１〕〜〔１４〕を提供するものである。
〔１〕ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔２〕ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物。
〔３〕非ヒト動物がげっ歯類である、〔１〕または〔２〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔４〕げっ歯類がマウスである、〔３〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔５〕ＷＴ１タンパク質が１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型ＷＴ１タンパク質である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔６〕白血病の症状を呈する〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞。
〔８〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する工程
〔９〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１３〕ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤。
〔１４〕化合物がヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である、〔１３〕に記載の薬剤。
本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物の態様として、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は白血病のモデル動物としての用途を有する。本発明は、このような本発明のトランスジェニック非ヒト動物の用途もまた提供する。本発明における白血病の種類は、特に制限はないが、例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられる。
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｎａｋａｇａｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：１４８９）は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となるＤＮＡとして単離された［Ｃａｌｌ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０；６０：５０９、Ｇｅｓｓｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３：７７４、特開平４−５０３０１４］。ＷＴ１タンパク質は、ジンクフィンガー転写因子であり、組織発生、細胞の増殖および分化、ならびにアポトーシスに重要な役割を果たす［Ｍｅｎｋｅ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１］。ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡは２つのスプライス部位で選択的スプライシングを受けるため、４つの異なるスプライス形態（１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋、１７ＡＡ−／ＫＴＳ−、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−、および、１７ＡＡ−／ＫＴＳ＋）が生じることが判明している［Ｈｅｒｗｉｔｔ ＳＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：８５８８、Ｄａｖｉｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。本発明におけるＷＴ１タンパク質のスプライス形態としては、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明において、「Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されているトランスジェニック非ヒト動物」とは、Ｔ細胞系列の分化または発生が抑制されている状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。また、「Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができるトランスジェニック非ヒト動物」とは、ＷＴ１タンパク質の発現を誘導することにより、Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制しうる状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。
本発明における「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いて遺伝子の発現を人為的に改変するのに適した非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）であり、最も好ましくはマウスである。
トランスジェニック動物の作製方法は公知である。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）に記載の方法により、トランスジェニック動物を得ることができる。具体的には、ＷＴ１をコードするＤＮＡを動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とするトランスジェニックマウスを作製することができる。遺伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞などが挙げられる。より詳細には、後述の実施例に記載の方法により、トランスジェニック動物の作製を行うことができる。当業者においては、上記の方法を適宜改変して、所望の遺伝子の発現が改変されたトランスジェニック動物を作製することが可能である。
上記の「ＷＴ１をコードするＤＮＡ」は、該ＤＮＡを導入すべき動物の細胞において発現可能なプロモーターに連結した組み換え遺伝子コンストラクト（発現ベクター）とするのが一般的である。本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、適当な宿主を利用してクローニング可能なベクターに、前記ＷＴ１をコードするＤＮＡと、その上流にプロモーターとを挿入し、クローニングすることによって構築することができる。
本発明に利用することができるプロモーターとしては、動物細胞で発現可能なプロモーターであれば特に制限されないが、リンパ球で選択的に遺伝子発現が可能なプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターとしてはｌｃｋプロモーターが知られている。ｌｃｋプロモーターを有する遺伝子コンストラクトを使用することで、リンパ球に選択的にＷＴ１タンパク質が発現したトランスジェニック動物を作出することが可能である。本発明に利用することができるその他のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーターを挙げることができる。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）２７７，１０８）に従って、上記コンストラクトを作製することができる。
また、本発明に使用可能なベクターとしては、導入遺伝子を動物の生体内で広範囲に発現誘導でき得るものであればよく、当業者において周知の発現ベクターを利用することができる。例えば、ｌｃｋ−ｈＧＨベクターなどを挙げることができる。
適当な制限酵素によって前記ベクターから切り出した組み換え遺伝子コンストラクトは、十分に精製されトランスジェニック動物の作製に用いられる。通常、トランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに、前記コンストラクトを導入することによって作製される。コンストラクトを導入する細胞としては、通常、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、より具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、通常８細胞期以前のものが利用される。上記コンストラクトの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が公知である。さらに、こうして得られた形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることによりトランスジェニック動物を作製することも可能である。
上記コンストラクトを導入する細胞は、トランスジェニック動物の作製が可能なあらゆる非ヒト動物に由来する細胞であることができる。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、あるいはネコ等の細胞を利用することができる。マウスの場合、例えば、排卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させることにより、コンストラクトの導入が可能な受精卵を回収することができる。マウス受精卵では、一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入される。コンストラクトを導入した細胞は、体外での培養の後、導入に成功したと思われる細胞が代理母の卵管に移植され、トランスジェニックキメラ動物が誕生する。代理母には、通常、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
生まれたトランスジェニックキメラ動物は、ＷＴ１をコードするＤＮＡが組み込まれていることを確認した上で、Ｆ１動物の誕生のために正常な動物と交配させる。一般にコンストラクトとして導入した外来ＤＮＡは、ゲノムの同一の部分に複数コピーが直列に組み込まれる。通常はこの組み込みコピー数が多いほど、多量の遺伝子発現につながり、より明瞭な表現型が期待できるためである。体細胞ゲノムにおいて、ＷＴ１をコードするＤＮＡが正しい方向で組み込まれていることは、コンストラクトに特異的なプライマーを用いたＰＣＲや特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって確認することができる。
この交配の結果誕生するＦ１動物の中で、体細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を有するもの（ヘテロザイゴート）は、生殖細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を伝えることができるトランスジェニック動物である。Ｆ１動物の中から体細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を保持するものを選び、これらを両親とすることによって、Ｆ２動物であるホモザイゴートを得ることができる。
本発明のＷＴ１トランスジェニック動物は、ＷＴ１の発現が改変されたものであれば、上記のトランスジェニック動物のいずれの世代の動物であってもよい。例えば、ＷＴ１の外来ＤＮＡをヘテロで保持するトランスジェニック動物であっても、この外来性のＷＴ１が発現しているものであれば、本発明のＷＴ１トランスジェニック動物として利用可能である。
また、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞を提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）に従って細胞株を樹立することが可能である。
また、本発明は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法によって単離されるＴ細胞系列の分化または発生を促進する化合物は、免疫賦活剤、抗癌剤、感染症治療剤として利用でき、Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制する化合物は、免疫抑制剤、急性及び慢性リンパ性白血病の治療薬として利用することができる。
以下に本発明のスクリーニング方法の態様を例示するが、本発明のスクリーニング方法は、これらに限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
第一の態様においては、次いで、該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する。次いで、該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する。この方法によって、単離された化合物は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する可能性があり、後述する他のスクリーニング方法の被検化合物として使用することができる。
ＷＴ１タンパク質を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＷＴ１タンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＷＴ１タンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＷＴ１タンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＷＴ１タンパク質、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＷＴ１タンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＷＴ１タンパク質に対する抗体は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＷＴ１タンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＷＴ１タンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＷＴ１タンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＷＴ１タンパク質に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、ＷＴ１タンパク質を用いて、該ＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＷＴ１タンパク質と上記フィルターとを反応させ、ＷＴ１タンパク質と結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＷＴ１タンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１タンパク質に融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＷＴ１タンパク質またはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
ＷＴ１タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＷＴ１タンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検化合物を適用する。この場合の被検化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検化合物を適用した後、カラムを洗浄し、ＷＴ１タンパク質に結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、ＷＴ１タンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＷＴ１タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＷＴ１タンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＷＴ１タンパク質と被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。
また、本発明におけるスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、被検化合物を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的に、また注射等により行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。
本発明におけるスクリーニング方法の別の態様としては、次いで、該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する。トランスジェニック非ヒト動物からのＴ細胞系列の調製や調製したＴ細胞系列の分化または発生の測定は、実施例に記載の方法のように、当業者に周知の方法によって行うことができる。
第二の態様としては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる。第三の態様に用いられるＷＴ１タンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
また、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞としては、内在性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞、または外来性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
また、上記外来性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＷＴ１タンパク質を有する細胞は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＷＴ１タンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
また、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
また、本発明において「接触」は、ＷＴ１タンパク質の状態に応じて行う。例えば、ＷＴ１タンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＷＴ１タンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
第三の態様では、次いで、上記ＷＴ１タンパク質の活性を測定する。ＷＴ１タンパク質の活性としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−α鎖遺伝子（Ｇａｓｈｌｅｒ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２；８９：１０９８４−１０９８８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１遺伝子（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１２７１−２１２７５）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ遺伝子（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２；２５７：６７４−６７８）、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子（Ｗｅｒｎｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９：５８２８−５８３２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子（Ｅｎｇｌｅｒｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９５；１４：４６６２−４６７５）、ＲＡＲ−α遺伝子（Ｇｏｏｄｙｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９５；１０：１１２５−１１２９）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子（ＭｃＣａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２３７８５−２３７８９）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子（Ｌｉ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９；２４７：２５７−２６６）、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子（Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；１９：１６４１−１６４８）などの転写抑制活性、および、プロテイン４６結合網膜芽細胞腫抑制因子（ＲｂＡｐ４６）遺伝子（Ｇｕａｎ ＬＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：２７０４７−２７０５０）、Ｄａｘ−１遺伝子（Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：２２８９−２２９９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｍａｙｏ ＮＷ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：３９９０−４００３）などの転写活性が挙げられる。
第三の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ここで、「機能的に結合した」とは、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡもまた含まれる。
第四の態様においては、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、ＷＴ１遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、ＷＴ１遺伝子からコードされるＷＴ１タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該ＷＴ１タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＷＴ１タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＷＴ１タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
第四の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−α鎖遺伝子（Ｇａｓｈｌｅｒ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２；８９：１０９８４−１０９８８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１遺伝子（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１２７１−２１２７５）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ遺伝子（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２；２５７：６７４−６７８）、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子（Ｗｅｒｎｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９：５８２８−５８３２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子（Ｅｎｇｌｅｒｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９５；１４：４６６２−４６７５）、ＲＡＲ−α遺伝子（Ｇｏｏｄｙｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９５；１０：１１２５−１１２９）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子（ＭｃＣａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２３７８５−２３７８９）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子（Ｌｉ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９；２４７：２５７−２６６）、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子（Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９；１９：１６４１−１６４８）、プロテイン４６結合網膜芽細胞腫抑制因子（ＲｂＡｐ４６）遺伝子（Ｇｕａｎ ＬＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：２７０４７−２７０５０）、Ｄａｘ−１遺伝子（Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：２２８９−２２９９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｍａｙｏ ＮＷ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：３９９０−４００３）のプロモーター領域などを使用することができる。
第五の態様においては、次いで、上記細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。
また、本発明は、ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤を提供する。Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制するための薬剤としては、ＷＴ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する薬剤、本発明のスクリーニング方法によって単離される化合物等が例示できる。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、特開平９−１０４６２９や特開平１１−３５４８４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド等を使用することができる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＷＴ１タンパク質ＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＷＴ１タンパク質の産生細胞に作用して、該ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＷＴ１タンパク質の発現を抑制することにより、結果的にＷＴ１タンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明の化合物をヒトや他の動物のための薬剤として使用する場合には、本発明の化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
本発明者らは、ＷＴ１タンパク質の機能を生体レベルにおいて明らかにするため、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１ ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターが導入されたＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作出した。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討するために、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の胸腺細胞を、ＦＡＣＳにより、ＨＳＡ、ＣＤ４およびＣＤ８の発現に関して分析した。その結果、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。さらに、胸腺細胞の４つのＤＮサブセット（ＤＮ１、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−；ＤＮ２、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋；ＤＮ３、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋；ＤＮ４、ＣＤ４４−ＣＤ２５−）のうちどのサブセットが増加したかを明らかにするために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関してＦＡＣＳ分析した。その結果、４つのＤＮサブセットのうちＣＤ４４＋ＣＤ２５−であるＤＮ１、＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が同腹仔の場合よりも有意に多かったが（７４．２％対１８．７％）、ＤＮ２（１．５％対２４．８％）およびＤＮ３（２．０％対３７．３％）は有意に少なかった。＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスでは、正常同腹仔との比較で４つのＤＮサブセットの割合に有意差は認められなかったが、１２週齢のＷＴ１−ＴｇマウスではＤＮ胸腺細胞が有意に多かった。ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＤＮ胸腺細胞の増加とは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスのいずれの系統ともに正常同腹仔よりも少なかった。
さらに、本発明のＷＴ１−Ｔｇマウスでは、胸腺の腫大が起こり、急性リンパ性白血病が起こることが判明した。
以上の結果は、ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現により、Ｔ細胞系列の胸腺内分化がブロックされ、その後リンパ性白血病が発症することを示すものである。従って、ＷＴ１遺伝子がＴ細胞系列の発生および分化に関与することが初めて判明した。
即ち、本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法に関し、以下の〔１〕〜〔１４〕を提供するものである。
〔１〕ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔２〕ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物。
〔３〕非ヒト動物がげっ歯類である、〔１〕または〔２〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔４〕げっ歯類がマウスである、〔３〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔５〕ＷＴ１タンパク質が１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型ＷＴ１タンパク質である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔６〕白血病の症状を呈する〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞。
〔８〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する工程
〔９〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１３〕ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤。
〔１４〕化合物がヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である、〔１３〕に記載の薬剤。
本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物の態様として、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は白血病のモデル動物としての用途を有する。本発明は、このような本発明のトランスジェニック非ヒト動物の用途もまた提供する。本発明における白血病の種類は、特に制限はないが、例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられる。
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｎａｋａｇａｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：１４８９）は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となるＤＮＡとして単離された［Ｃａｌｌ ＫＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０；６０：５０９、Ｇｅｓｓｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３：７７４、特開平４−５０３０１４］。ＷＴ１タンパク質は、ジンクフィンガー転写因子であり、組織発生、細胞の増殖および分化、ならびにアポトーシスに重要な役割を果たす［Ｍｅｎｋｅ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１］。ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡは２つのスプライス部位で選択的スプライシングを受けるため、４つの異なるスプライス形態（１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋、１７ＡＡ−／ＫＴＳ−、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−、および、１７ＡＡ−／ＫＴＳ＋）が生じることが判明している［Ｈｅｒｗｉｔｔ ＳＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：８５８８、Ｄａｖｉｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。本発明におけるＷＴ１タンパク質のスプライス形態としては、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明において、「Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されているトランスジェニック非ヒト動物」とは、Ｔ細胞系列の分化または発生が抑制されている状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。また、「Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができるトランスジェニック非ヒト動物」とは、ＷＴ１タンパク質の発現を誘導することにより、Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制しうる状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。
本発明における「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いて遺伝子の発現を人為的に改変するのに適した非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）であり、最も好ましくはマウスである。
トランスジェニック動物の作製方法は公知である。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）に記載の方法により、トランスジェニック動物を得ることができる。具体的には、ＷＴ１をコードするＤＮＡを動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とするトランスジェニックマウスを作製することができる。遺伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞などが挙げられる。より詳細には、後述の実施例に記載の方法により、トランスジェニック動物の作製を行うことができる。当業者においては、上記の方法を適宜改変して、所望の遺伝子の発現が改変されたトランスジェニック動物を作製することが可能である。
上記の「ＷＴ１をコードするＤＮＡ」は、該ＤＮＡを導入すべき動物の細胞において発現可能なプロモーターに連結した組み換え遺伝子コンストラクト（発現ベクター）とするのが一般的である。本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、適当な宿主を利用してクローニング可能なベクターに、前記ＷＴ１をコードするＤＮＡと、その上流にプロモーターとを挿入し、クローニングすることによって構築することができる。
本発明に利用することができるプロモーターとしては、動物細胞で発現可能なプロモーターであれば特に制限されないが、リンパ球で選択的に遺伝子発現が可能なプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターとしてはｌｃｋプロモーターが知られている。ｌｃｋプロモーターを有する遺伝子コンストラクトを使用することで、リンパ球に選択的にＷＴ１タンパク質が発現したトランスジェニック動物を作出することが可能である。本発明に利用することができるその他のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーターを挙げることができる。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）２７７，１０８）に従って、上記コンストラクトを作製することができる。
また、本発明に使用可能なベクターとしては、導入遺伝子を動物の生体内で広範囲に発現誘導でき得るものであればよく、当業者において周知の発現ベクターを利用することができる。例えば、ｌｃｋ−ｈＧＨベクターなどを挙げることができる。
適当な制限酵素によって前記ベクターから切り出した組み換え遺伝子コンストラクトは、十分に精製されトランスジェニック動物の作製に用いられる。通常、トランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに、前記コンストラクトを導入することによって作製される。コンストラクトを導入する細胞としては、通常、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、より具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、通常８細胞期以前のものが利用される。上記コンストラクトの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が公知である。さらに、こうして得られた形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることによりトランスジェニック動物を作製することも可能である。
上記コンストラクトを導入する細胞は、トランスジェニック動物の作製が可能なあらゆる非ヒト動物に由来する細胞であることができる。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、あるいはネコ等の細胞を利用することができる。マウスの場合、例えば、排卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させることにより、コンストラクトの導入が可能な受精卵を回収することができる。マウス受精卵では、一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入される。コンストラクトを導入した細胞は、体外での培養の後、導入に成功したと思われる細胞が代理母の卵管に移植され、トランスジェニックキメラ動物が誕生する。代理母には、通常、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
生まれたトランスジェニックキメラ動物は、ＷＴ１をコードするＤＮＡが組み込まれていることを確認した上で、Ｆ１動物の誕生のために正常な動物と交配させる。一般にコンストラクトとして導入した外来ＤＮＡは、ゲノムの同一の部分に複数コピーが直列に組み込まれる。通常はこの組み込みコピー数が多いほど、多量の遺伝子発現につながり、より明瞭な表現型が期待できるためである。体細胞ゲノムにおいて、ＷＴ１をコードするＤＮＡが正しい方向で組み込まれていることは、コンストラクトに特異的なプライマーを用いたＰＣＲや特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって確認することができる。
この交配の結果誕生するＦ１動物の中で、体細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を有するもの（ヘテロザイゴート）は、生殖細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を伝えることができるトランスジェニック動物である。Ｆ１動物の中から体細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を保持するものを選び、これらを両親とすることによって、Ｆ２動物であるホモザイゴートを得ることができる。
本発明のＷＴ１トランスジェニック動物は、ＷＴ１の発現が改変されたものであれば、上記のトランスジェニック動物のいずれの世代の動物であってもよい。例えば、ＷＴ１の外来ＤＮＡをヘテロで保持するトランスジェニック動物であっても、この外来性のＷＴ１が発現しているものであれば、本発明のＷＴ１トランスジェニック動物として利用可能である。
また、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞を提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）に従って細胞株を樹立することが可能である。
また、本発明は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法によって単離されるＴ細胞系列の分化または発生を促進する化合物は、免疫賦活剤、抗癌剤、感染症治療剤として利用でき、Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制する化合物は、免疫抑制剤、急性及び慢性リンパ性白血病の治療薬として利用することができる。
以下に本発明のスクリーニング方法の態様を例示するが、本発明のスクリーニング方法は、これらに限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
第一の態様においては、次いで、該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する。次いで、該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する。この方法によって、単離された化合物は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する可能性があり、後述する他のスクリーニング方法の被検化合物として使用することができる。
ＷＴ１タンパク質を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＷＴ１タンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＷＴ１タンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＷＴ１タンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＷＴ１タンパク質、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＷＴ１タンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＷＴ１タンパク質に対する抗体は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＷＴ１タンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＷＴ１タンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＷＴ１タンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＷＴ１タンパク質に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、ＷＴ１タンパク質を用いて、該ＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＷＴ１タンパク質と上記フィルターとを反応させ、ＷＴ１タンパク質と結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＷＴ１タンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１タンパク質に融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＷＴ１タンパク質またはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
ＷＴ１タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＷＴ１タンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検化合物を適用する。この場合の被検化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検化合物を適用した後、カラムを洗浄し、ＷＴ１タンパク質に結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、ＷＴ１タンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＷＴ１タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＷＴ１タンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＷＴ１タンパク質と被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。
また、本発明におけるスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、被検化合物を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的に、また注射等により行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。
本発明におけるスクリーニング方法の別の態様としては、次いで、該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する。トランスジェニック非ヒト動物からのＴ細胞系列の調製や調製したＴ細胞系列の分化または発生の測定は、実施例に記載の方法のように、当業者に周知の方法によって行うことができる。
第二の態様としては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる。第三の態様に用いられるＷＴ１タンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
また、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞としては、内在性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞、または外来性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
また、上記外来性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＷＴ１タンパク質を有する細胞は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＷＴ１タンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
また、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
また、本発明において「接触」は、ＷＴ１タンパク質の状態に応じて行う。例えば、ＷＴ１タンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＷＴ１タンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
第三の態様では、次いで、上記ＷＴ１タンパク質の活性を測定する。ＷＴ１タンパク質の活性としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−α鎖遺伝子（Ｇａｓｈｌｅｒ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２；８９：１０９８４−１０９８８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１遺伝子（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１２７１−２１２７５）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ遺伝子（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２；２５７：６７４−６７８）、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子（Ｗｅｒｎｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９：５８２８−５８３２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子（Ｅｎｇｌｅｒｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９５；１４：４６６２−４６７５）、ＲＡＲ−α遺伝子（Ｇｏｏｄｙｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９５；１０：１１２５−１１２９）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子（ＭｃＣａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２３７８５−２３７８９）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子（Ｌｉ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９；２４７：２５７−２６６）、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子（Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；１９：１６４１−１６４８）などの転写抑制活性、および、プロテイン４６結合網膜芽細胞腫抑制因子（ＲｂＡｐ４６）遺伝子（Ｇｕａｎ ＬＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：２７０４７−２７０５０）、Ｄａｘ−１遺伝子（Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：２２８９−２２９９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｍａｙｏ ＮＷ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：３９９０−４００３）などの転写活性が挙げられる。
第三の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ここで、「機能的に結合した」とは、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡもまた含まれる。
第四の態様においては、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、ＷＴ１遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、ＷＴ１遺伝子からコードされるＷＴ１タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該ＷＴ１タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＷＴ１タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＷＴ１タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
第四の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−α鎖遺伝子（Ｇａｓｈｌｅｒ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２；８９：１０９８４−１０９８８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１遺伝子（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１２７１−２１２７５）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ遺伝子（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＩＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２；２５７：６７４−６７８）、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子（Ｗｅｒｎｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９：５８２８−５８３２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子（Ｅｎｇｌｅｒｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９５；１４：４６６２−４６７５）、ＲＡＲ−α遺伝子（Ｇｏｏｄｙｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９５；１０：１１２５−１１２９）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子（ＭｃＣａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２３７８５−２３７８９）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子（Ｌｉ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９；２４７：２５７−２６６）、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子（Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９９；１９：１６４１−１６４８）、プロテイン４６結合網膜芽細胞腫抑制因子（ＲｂＡｐ４６）遺伝子（Ｇｕａｎ ＬＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：２７０４７−２７０５０）、Ｄａｘ−１遺伝子（Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：２２８９−２２９９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｍａｙｏ ＮＷ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９；１８：３９９０−４００３）のプロモーター領域などを使用することができる。
第五の態様においては、次いで、上記細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。
また、本発明は、ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤を提供する。Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制するための薬剤としては、ＷＴ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する薬剤、本発明のスクリーニング方法によって単離される化合物等が例示できる。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、特開平９−１０４６２９や特開平１１−３５４８４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド等を使用することができる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＷＴ１タンパク質ＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＷＴ１タンパク質の産生細胞に作用して、該ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＷＴ１タンパク質の発現を抑制することにより、結果的にＷＴ１タンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明の化合物をヒトや他の動物のための薬剤として使用する場合には、本発明の化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
図１は、胸腺の全細胞数を示したグラフである。６週齢または１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）の全胸腺細胞数を測定した。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。
図２は、ＷＴ１−トランスジェニックマウスにおけるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ胸腺細胞の増加を示す図およびグラフである。（Ａ）胸腺細胞を抗ＣＤ４−ＰＥ抗体、抗ＣＤ８−ＰＥ抗体、抗ＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ３−ＰＥ抗体、抗Ｂ２２０ビオチン、抗Ｇｒ−１ビオチン、抗ＣＤ１１ｂビオチンおよびストレプトアビジン−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ゲートはＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−細胞（ＤＮ Ｔ担当胸腺細胞）に対して設定し、数値は胸腺細胞全体に占めるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−細胞の比率を指す。ＴｇはＷＴ１−トランスジェニックマウス、ＬＭは正常同腹仔を示す。（Ｂ）および（Ｃ）６週齢および１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）および正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）のＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−胸腺細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス６〜７匹から得た結果の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。
図３は、ＷＴ１トランスジェニックマウスのＤＮ胸腺細胞におけるＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットの増加を示す図およびグラフである。（Ａ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスのゲート処理後のＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関して分析した。（Ｂ）および（Ｃ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）および正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）におけるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス７匹から得た結果の平均である。
図４は、ＷＴ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ）と正常同腹仔（ＬＭ）との、６週齢と１年齢での胸腺を示した写真である。ＷＴ１トランスジェニックマウスの１年齢の胸腺は腫大し、急性リンパ性白血病が発症したことを示している。
図５は、ＷＴ１トランスジェニックマウスの脾臓におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の増加を示す図およびグラフである。（Ａ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞をＣＤ４およびＣＤ８の発現に関して分析した。数値は４群の各々に該当する細胞の比率を指す。（Ｂ）ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらにＴＣＲβの発現に関して分析した。（Ｃ）および（Ｄ）６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の割合の平均（Ｃ）および全細胞数（Ｄ）を示している。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。
図６は、ＷＴ１−トランスジェニックマウスの脾臓において増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞を含むことを示すグラフである。ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞を、抗ＣＤ４ Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗ＴＣＲβ−ＦＩＴＣおよび抗ＴＣＲγδ−ＰＥ抗体で染色した。（Ａ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞全体に占めるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ−細胞（ｄｏｔｔｅｄ ｂａｒ）およびＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ＋細胞（ｓｏｌｉｄ ｂａｒ）の比率を示している。（Ｂ）および（Ｃ）６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδ＋細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。
図７は、ＣＤ８＋ＴＣＲγδ細胞のＣＤ８分子はＣＤ８αβであることを示す図である。ＣＤ８＋ＴＣＲγδ細胞の比率が高い１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスの脾細胞を、抗ＴＣＲγδ−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ８α−ＰＥ抗体または抗ＣＤ８β−ＰＥ抗体で二重染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。
図２は、ＷＴ１−トランスジェニックマウスにおけるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ胸腺細胞の増加を示す図およびグラフである。（Ａ）胸腺細胞を抗ＣＤ４−ＰＥ抗体、抗ＣＤ８−ＰＥ抗体、抗ＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ３−ＰＥ抗体、抗Ｂ２２０ビオチン、抗Ｇｒ−１ビオチン、抗ＣＤ１１ｂビオチンおよびストレプトアビジン−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ゲートはＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−細胞（ＤＮ Ｔ担当胸腺細胞）に対して設定し、数値は胸腺細胞全体に占めるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−細胞の比率を指す。ＴｇはＷＴ１−トランスジェニックマウス、ＬＭは正常同腹仔を示す。（Ｂ）および（Ｃ）６週齢および１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）および正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）のＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−胸腺細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス６〜７匹から得た結果の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。
図３は、ＷＴ１トランスジェニックマウスのＤＮ胸腺細胞におけるＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットの増加を示す図およびグラフである。（Ａ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスのゲート処理後のＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関して分析した。（Ｂ）および（Ｃ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）および正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）におけるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス７匹から得た結果の平均である。
図４は、ＷＴ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ）と正常同腹仔（ＬＭ）との、６週齢と１年齢での胸腺を示した写真である。ＷＴ１トランスジェニックマウスの１年齢の胸腺は腫大し、急性リンパ性白血病が発症したことを示している。
図５は、ＷＴ１トランスジェニックマウスの脾臓におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の増加を示す図およびグラフである。（Ａ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞をＣＤ４およびＣＤ８の発現に関して分析した。数値は４群の各々に該当する細胞の比率を指す。（Ｂ）ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらにＴＣＲβの発現に関して分析した。（Ｃ）および（Ｄ）６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の割合の平均（Ｃ）および全細胞数（Ｄ）を示している。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。
図６は、ＷＴ１−トランスジェニックマウスの脾臓において増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞を含むことを示すグラフである。ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞を、抗ＣＤ４ Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗ＴＣＲβ−ＦＩＴＣおよび抗ＴＣＲγδ−ＰＥ抗体で染色した。（Ａ）１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞全体に占めるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ−細胞（ｄｏｔｔｅｄ ｂａｒ）およびＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ＋細胞（ｓｏｌｉｄ ｂａｒ）の比率を示している。（Ｂ）および（Ｃ）６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ ｂａｒ）におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδ＋細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。
図７は、ＣＤ８＋ＴＣＲγδ細胞のＣＤ８分子はＣＤ８αβであることを示す図である。ＣＤ８＋ＴＣＲγδ細胞の比率が高い１２週齢の＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスの脾細胞を、抗ＴＣＲγδ−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ８α−ＰＥ抗体または抗ＣＤ８β−ＰＥ抗体で二重染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）ｌｃｋｐｒ−ＷＴ１の構築
この構築物は、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型［Ｎａｋａｇａｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：１４８９］のマウスＷＴ１ ｃＤＮＡを含む１．５ｋｂのＳａｕ ３ＡＩ断片（国立がんセンター研究所（日本）のＨ．Ｎａｋａｇａｍａ博士から寄贈）をｌｃｋ−ｈＧＨベクター［Ｃｈａｆｆｉｎ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９：３８２１］中に挿入することによって作製した。
（２）トランスジェニックマウス
１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１ ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵に微量注入した。続いて、注入後の卵を偽妊娠させた代理母に移植し［Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：１０５］、２つの異なるトランスジェニックマウス（＃２１および＃３５）をファウンダーとして樹立した。これらの系統からの子孫を、ＰＣＲによる尾部ＤＮＡの分析によってＷＴ１導入遺伝子の存在に関してスクリーニングし、ＷＴ１導入遺伝子を有する雄の子孫をＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌と交配させた。トランスジェニックマウスの胸腺から単離したＷＴ１導入遺伝子の配列解析により、ＷＴ１導入遺伝子に変異がないことを確認した。
（３）逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌＴＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造者のプロトコールに従って用いて、胸腺細胞から全ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡへの変換にはオリゴｄＴプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を用い、総容積を３０μｌとした［Ｔａｍａｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３：３９３］。
ＷＴ１の発現レベルはＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって定量化した。ＰＣＲ反応は、５００ｎＭの各プライマーおよび１００ｎＭのプローブを最終容量５μｌとして含む、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。ｃＤＮＡの増幅にはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ−７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、４０サイクル（変性は９５℃で１５秒間／アニーリングおよび伸長は５９℃で１分間）の増幅を行った。以下のプライマーおよびプローブを用いた。マウスＷＴ１、順方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号：１）；逆方向プライマー：５’−ＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＡ−３’（配列番号：２）、プローブ：５−ＦＡＭ−ＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：３）。β−グルクロニダーゼ、順方向プライマー：５’−ＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号：４）；逆方向プライマー；５’−ＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣ−３’（配列番号：５）、プローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＧＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：６）。ＲＴ−ＰＣＲに関するＲＮＡのローディング量および個々の試料に関するＲＮＡ分解の差異を標準化するために、ＷＴ１遺伝子の発現をβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現で割った値を相対的なＷＴ１発現レベルとして用い、マウスＷＴ１をトランスフェクトしたＣ１４９８細胞［Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；２０：１９５］におけるＷＴ１遺伝子の発現を１．０と定義した。
（４）フローサイトメトリー分析
新たに調製した胸腺細胞、脾細胞または末梢血単核細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させた。細胞の染色は以前の記載の通りに行った［Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１４０５］。直接染色に関しては、非特異的な結合を少なくするために細胞をまず抗マウスＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体モノクローン抗体（ｍＡｂ）とともに４℃で２０分間インキュベートし［Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：１０５］、続いて適切な濃度のｍＡｂを４℃で３０分間用いて３色または４色による細胞表面染色を行った。用いた抗体は以下の通りである：抗マウスＨＳＡ−ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗マウスＣＤ４−ＰＥ、抗マウスＣＤ４ Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗マウスＣＤ８−ＰＥ、抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ８−ＡＰＣ、抗マウスＣＤ４４−Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ、抗マウスＴＣＲβ−ＦＩＴＣ、抗マウスＴＣＲβ−ＡＰＣ、抗マウスＴＣＲγδ−ＰＥ。抗マウスＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体を除き、抗体はすべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。０．５％ＦＣＳを含む１００μｌのＰＢＳ中で細胞を３回洗浄し、０．５％ＦＣＳを含む１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた上で、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析した。
（５）統計分析
統計学的有意性はスチューデントのｔ検定によって分析した。
［実施例１］ＷＴ１トランスジェニックマウスの胸腺におけるＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブのＣＤ４４＋ＣＤ２５−（ＤＮ１）細胞の増加
ＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスおよび正常同腹仔の胸腺細胞におけるＷＴ１導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺細胞はいずれもＷＴ１導入遺伝子を発現したが、正常同腹仔の胸腺細胞は発現しなかった（非提示データ）。ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の全胸腺細胞数を測定した結果、図１に示すとおり、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺細胞の絶対数は、正常同腹仔の胸腺細胞数よりも有意に少なく、ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の成長抑制が示された。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討するために、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の胸腺細胞を、ＦＡＣＳにより、ＨＳＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｂ２２０、Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｂの発現に関して分析した。図２Ａ、Ｂに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。一方、図２Ｃに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ細胞の総数は、６週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より少なく、ＷＴ１−Ｔｇマウスの全胸腺細胞数が減少したためと考えられる。胸腺細胞の４つのＤＮサブセット（ＤＮ１、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−；ＤＮ２、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋；ＤＮ３、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋；ＤＮ４、ＣＤ４４−ＣＤ２５−）のうちどのサブセットが増加したかを明らかにするために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関してＦＡＣＳ分析した。図３に示す通り、４つのＤＮサブセットのうちＣＤ４４＋ＣＤ２５−ＤＮ１の比率および全細胞数は、＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が同腹仔の場合よりも有意に多かったが（７４．２％対１８．７％）、ＤＮ２（１．５％対２４．８％）およびＤＮ３（２．０％対３７．３％）は有意に少なかった。＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスでは、正常同腹仔との比較で４つのＤＮサブセットの割合に有意差は認められなかったが（非提示データ）、１２週齢のＷＴ１−ＴｇマウスではＤＮ胸腺細胞が有意に多かった。ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＤＮ胸腺細胞の増加とは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスのいずれの系統ともに正常同腹仔よりも少なかった（非提示データ）。
胸腺細胞におけるＷＴ１遺伝子のｌｃｋプロモーター駆動性発現により、Ｔ細胞系列の分化が妨げられた。ＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットはＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が正常同腹仔よりも有意に多く、一方、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２サブセットおよびＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３サブセットはＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が有意に少なかった。ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ細胞の胸腺内分化は、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１からＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２およびＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３細胞を経てＣＤ４４−ＣＤ２５−のＤＮ４細胞へと進行することがよく知られているため［Ｇｏｄｆｒｅｙ ＤＩ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；１５０：４２４４、Ｈｏｆｆｍａｎ ＥＳ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．１９９６；１０：９４８、Ｖｏｌｌ ＲＥ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０００；１３：６７７］、これらの結果から、ＷＴ１遺伝子のｌｃｋプロモーター駆動性発現によってＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットからＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２サブセットへの分化がブロックされることが示された。ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現がＤＮ胸腺細胞の分化をブロックしたという本発明者らの今回の結果は、胸腺細胞においてｌｃｋプロモーター活性があるという事実と一致する［Ｍａｒｔｈ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８５；４３：３９３、Ｗｉｌｄｉｎ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１７３：３８３］。赤芽球系細胞または骨髄球系細胞ではＷＴ１発現と分化との間に明瞭な相関があることがよく知られている。赤芽球系白血病細胞株Ｋ５６２および骨髄球系白血病細胞株ＨＬ−６０はいずれも、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはレチノイン酸、およびレチノイン酸によって誘導した分化に伴ってＷＴ１を発現しなくなる［Ｐｈｅｌａｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ．１９９４；５：６７７、Ｓｅｋｉｙａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：１８７６］。その反対に、ＷＴ１遺伝子の構成的発現により、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に反応して起こる骨髄球系前駆細胞３２Ｄ ｃｌ３およびマウス正常骨髄球系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧおよびＣＦＵ−Ｍ）の分化が妨げられる［Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９、Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９］。しかし、構成的なＷＴ１発現によってリンパ球の分化が妨げられるか否かという問題は本実施例を行う前は不明なままであった。したがって、本発明者らの今回の発明により、Ｔ細胞系列の発生および分化に対するＷＴ１遺伝子の関与を初めて報告することができた。なお、本発明のＷＴ１−Ｔｇマウスでは、胸腺の腫大が起こり、急性リンパ性白血病が起こることが判明した（図４）。
［実施例２］ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の増加
ＷＴ１−Ｔｇマウスにおける末梢Ｔ細胞系列の変化を調べるために、１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＴＣＲβ抗体で三重染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。図５Ａに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞はＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓の方が正常同腹仔の場合よりも多かったため、以降の分析には脾細胞をＣＤ８およびＴＣＲβの発現に関して提示させた。図５Ｂに示す通り、ＷＴ１−Ｔｇマウスと正常同腹仔との間にはＣＤ８およびＴＣＲβの発現に関して明らかに異なる像が認められた。ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＷＴ１−Ｔｇマウスの方が正常同腹仔よりも有意に多かった。末梢血単核細胞に関する同じ分析でも上記のものと同じ結果が得られた（非提示データ）。図５Ｃ、Ｄに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の比率および絶対数の増加は、＃２１系統および＃３５系統のいずれのＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓においても観察された。また、６週齢または１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺ではいずれの系統とも正常同腹仔に比べてＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞のわずかな増加が観察された（非提示データ）。
［実施例３］増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＴＣＲγδＴ細胞を含む
ＷＴ１−Ｔｇマウスの両系統の脾臓および末梢血で増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団を、抗ＴＣＲδγ抗体を用いてさらに分析した。図６Ａに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団の約４９％はＴＣＲδγＴ細胞であった。ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団の残りの５１％の細胞系列を明らかにすることはできなかった。図６Ｂ、Ｃに示す通り、ＴＣＲδγＴ細胞の比率および絶対数の増加は６週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓でも既に観察された。末梢血のＦＡＣＳ分析でも同様の結果が得られた（非提示データ）。
ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓および末梢血において有意に増加した。この所見に関して考えられる説明は以下の通りである。すなわち、ＴＣＲγδＴ細胞はＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３サブセットから生じることが報告されている［Ｃａｐｏｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８；９５：１２５２２、Ｌｉｖａｋ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２：２５７５、Ｓｈｏｒｔｍａｎ Ｋ ａｎｄ Ｗｕ Ｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１４：２９］。ＤＮ１段階からＤＮ２段階への分化経路がＷＴ１−Ｔｇマウスではブロックされており、ＴＣＲαβＴ細胞の生成に至る胸腺細胞の主な分化経路が制限されるため、ＤＮ３からＴＣＲγδＴ細胞への分化経路が進行しやすくなり、このためにＴＣＲγδＴ細胞が多く生じたと考えられる。また、これらの結果は、ＤＮ１胸腺細胞からＴＣＲγδＴ細胞に至る分化経路の存在を示唆する可能性もある。
ＷＴ１遺伝子は２つのスプライス部位で選択的スプライシングを受けるため、４つの異なるスプライス形態（１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋、１７ＡＡ−／ＫＴＳ−、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−、および、１７ＡＡ−／ＫＴＳ＋）が生じる［Ｈｅｒｗｉｔｔ ＳＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：８５８８、Ｄａｖｉｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。４つのスプライス形態のそれぞれの機能については現在も議論がある［Ｄａｖｉｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。本発明者らの以前の研究では、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋非スプライス型の構成的発現により、骨髄球系前駆細胞株３２Ｄ ｃｌ３およびマウス正常骨髄球系前駆細胞の分化がいずれも妨げられることを示した［Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９、Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９］。本実施例では、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のｌｃｋプロモーター駆動性発現によって胸腺におけるＴ細胞系列の初期分化が阻げられることを初めて記載した。
［実施例４］ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は胸腺由来である
ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞が、胸腺由来、あるいは胸腺外由来か否かを調べるため、抗ＣＤ８α抗体および抗ＣＤ８β抗体を用いたＦＡＣＳ分析を行った。図７に示す通り、多数のＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞がＣＤ８αβであった。この結果からＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は胸腺由来であることがわかった。
（１）ｌｃｋｐｒ−ＷＴ１の構築
この構築物は、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型［Ｎａｋａｇａｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：１４８９］のマウスＷＴ１ ｃＤＮＡを含む１．５ｋｂのＳａｕ ３ＡＩ断片（国立がんセンター研究所（日本）のＨ．Ｎａｋａｇａｍａ博士から寄贈）をｌｃｋ−ｈＧＨベクター［Ｃｈａｆｆｉｎ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９：３８２１］中に挿入することによって作製した。
（２）トランスジェニックマウス
１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１ ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵に微量注入した。続いて、注入後の卵を偽妊娠させた代理母に移植し［Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：１０５］、２つの異なるトランスジェニックマウス（＃２１および＃３５）をファウンダーとして樹立した。これらの系統からの子孫を、ＰＣＲによる尾部ＤＮＡの分析によってＷＴ１導入遺伝子の存在に関してスクリーニングし、ＷＴ１導入遺伝子を有する雄の子孫をＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌と交配させた。トランスジェニックマウスの胸腺から単離したＷＴ１導入遺伝子の配列解析により、ＷＴ１導入遺伝子に変異がないことを確認した。
（３）逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌＴＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造者のプロトコールに従って用いて、胸腺細胞から全ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡへの変換にはオリゴｄＴプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を用い、総容積を３０μｌとした［Ｔａｍａｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３：３９３］。
ＷＴ１の発現レベルはＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって定量化した。ＰＣＲ反応は、５００ｎＭの各プライマーおよび１００ｎＭのプローブを最終容量５μｌとして含む、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行った。ｃＤＮＡの増幅にはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ−７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、４０サイクル（変性は９５℃で１５秒間／アニーリングおよび伸長は５９℃で１分間）の増幅を行った。以下のプライマーおよびプローブを用いた。マウスＷＴ１、順方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号：１）；逆方向プライマー：５’−ＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＡ−３’（配列番号：２）、プローブ：５−ＦＡＭ−ＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：３）。β−グルクロニダーゼ、順方向プライマー：５’−ＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号：４）；逆方向プライマー；５’−ＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣ−３’（配列番号：５）、プローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＧＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：６）。ＲＴ−ＰＣＲに関するＲＮＡのローディング量および個々の試料に関するＲＮＡ分解の差異を標準化するために、ＷＴ１遺伝子の発現をβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現で割った値を相対的なＷＴ１発現レベルとして用い、マウスＷＴ１をトランスフェクトしたＣ１４９８細胞［Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；２０：１９５］におけるＷＴ１遺伝子の発現を１．０と定義した。
（４）フローサイトメトリー分析
新たに調製した胸腺細胞、脾細胞または末梢血単核細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させた。細胞の染色は以前の記載の通りに行った［Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１４０５］。直接染色に関しては、非特異的な結合を少なくするために細胞をまず抗マウスＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体モノクローン抗体（ｍＡｂ）とともに４℃で２０分間インキュベートし［Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：１０５］、続いて適切な濃度のｍＡｂを４℃で３０分間用いて３色または４色による細胞表面染色を行った。用いた抗体は以下の通りである：抗マウスＨＳＡ−ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗マウスＣＤ４−ＰＥ、抗マウスＣＤ４ Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗マウスＣＤ８−ＰＥ、抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ８−ＡＰＣ、抗マウスＣＤ４４−Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ、抗マウスＴＣＲβ−ＦＩＴＣ、抗マウスＴＣＲβ−ＡＰＣ、抗マウスＴＣＲγδ−ＰＥ。抗マウスＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体を除き、抗体はすべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。０．５％ＦＣＳを含む１００μｌのＰＢＳ中で細胞を３回洗浄し、０．５％ＦＣＳを含む１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた上で、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析した。
（５）統計分析
統計学的有意性はスチューデントのｔ検定によって分析した。
［実施例１］ＷＴ１トランスジェニックマウスの胸腺におけるＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブのＣＤ４４＋ＣＤ２５−（ＤＮ１）細胞の増加
ＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスおよび正常同腹仔の胸腺細胞におけるＷＴ１導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺細胞はいずれもＷＴ１導入遺伝子を発現したが、正常同腹仔の胸腺細胞は発現しなかった（非提示データ）。ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の全胸腺細胞数を測定した結果、図１に示すとおり、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺細胞の絶対数は、正常同腹仔の胸腺細胞数よりも有意に少なく、ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の成長抑制が示された。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討するために、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の胸腺細胞を、ＦＡＣＳにより、ＨＳＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｂ２２０、Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｂの発現に関して分析した。図２Ａ、Ｂに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。一方、図２Ｃに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ細胞の総数は、６週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より少なく、ＷＴ１−Ｔｇマウスの全胸腺細胞数が減少したためと考えられる。胸腺細胞の４つのＤＮサブセット（ＤＮ１、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−；ＤＮ２、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋；ＤＮ３、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋；ＤＮ４、ＣＤ４４−ＣＤ２５−）のうちどのサブセットが増加したかを明らかにするために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関してＦＡＣＳ分析した。図３に示す通り、４つのＤＮサブセットのうちＣＤ４４＋ＣＤ２５−ＤＮ１の比率および全細胞数は、＃２１ ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が同腹仔の場合よりも有意に多かったが（７４．２％対１８．７％）、ＤＮ２（１．５％対２４．８％）およびＤＮ３（２．０％対３７．３％）は有意に少なかった。＃３５ ＷＴ１−Ｔｇマウスでは、正常同腹仔との比較で４つのＤＮサブセットの割合に有意差は認められなかったが（非提示データ）、１２週齢のＷＴ１−ＴｇマウスではＤＮ胸腺細胞が有意に多かった。ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＤＮ胸腺細胞の増加とは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスのいずれの系統ともに正常同腹仔よりも少なかった（非提示データ）。
胸腺細胞におけるＷＴ１遺伝子のｌｃｋプロモーター駆動性発現により、Ｔ細胞系列の分化が妨げられた。ＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットはＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が正常同腹仔よりも有意に多く、一方、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２サブセットおよびＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３サブセットはＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が有意に少なかった。ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ細胞の胸腺内分化は、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１からＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２およびＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３細胞を経てＣＤ４４−ＣＤ２５−のＤＮ４細胞へと進行することがよく知られているため［Ｇｏｄｆｒｅｙ ＤＩ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；１５０：４２４４、Ｈｏｆｆｍａｎ ＥＳ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．１９９６；１０：９４８、Ｖｏｌｌ ＲＥ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０００；１３：６７７］、これらの結果から、ＷＴ１遺伝子のｌｃｋプロモーター駆動性発現によってＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットからＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２サブセットへの分化がブロックされることが示された。ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現がＤＮ胸腺細胞の分化をブロックしたという本発明者らの今回の結果は、胸腺細胞においてｌｃｋプロモーター活性があるという事実と一致する［Ｍａｒｔｈ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８５；４３：３９３、Ｗｉｌｄｉｎ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１７３：３８３］。赤芽球系細胞または骨髄球系細胞ではＷＴ１発現と分化との間に明瞭な相関があることがよく知られている。赤芽球系白血病細胞株Ｋ５６２および骨髄球系白血病細胞株ＨＬ−６０はいずれも、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはレチノイン酸、およびレチノイン酸によって誘導した分化に伴ってＷＴ１を発現しなくなる［Ｐｈｅｌａｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ．１９９４；５：６７７、Ｓｅｋｉｙａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：１８７６］。その反対に、ＷＴ１遺伝子の構成的発現により、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に反応して起こる骨髄球系前駆細胞３２Ｄ ｃｌ３およびマウス正常骨髄球系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧおよびＣＦＵ−Ｍ）の分化が妨げられる［Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９、Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９］。しかし、構成的なＷＴ１発現によってリンパ球の分化が妨げられるか否かという問題は本実施例を行う前は不明なままであった。したがって、本発明者らの今回の発明により、Ｔ細胞系列の発生および分化に対するＷＴ１遺伝子の関与を初めて報告することができた。なお、本発明のＷＴ１−Ｔｇマウスでは、胸腺の腫大が起こり、急性リンパ性白血病が起こることが判明した（図４）。
［実施例２］ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の増加
ＷＴ１−Ｔｇマウスにおける末梢Ｔ細胞系列の変化を調べるために、１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＴＣＲβ抗体で三重染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。図５Ａに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞はＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓の方が正常同腹仔の場合よりも多かったため、以降の分析には脾細胞をＣＤ８およびＴＣＲβの発現に関して提示させた。図５Ｂに示す通り、ＷＴ１−Ｔｇマウスと正常同腹仔との間にはＣＤ８およびＴＣＲβの発現に関して明らかに異なる像が認められた。ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＷＴ１−Ｔｇマウスの方が正常同腹仔よりも有意に多かった。末梢血単核細胞に関する同じ分析でも上記のものと同じ結果が得られた（非提示データ）。図５Ｃ、Ｄに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の比率および絶対数の増加は、＃２１系統および＃３５系統のいずれのＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓においても観察された。また、６週齢または１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺ではいずれの系統とも正常同腹仔に比べてＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞のわずかな増加が観察された（非提示データ）。
［実施例３］増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＴＣＲγδＴ細胞を含む
ＷＴ１−Ｔｇマウスの両系統の脾臓および末梢血で増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団を、抗ＴＣＲδγ抗体を用いてさらに分析した。図６Ａに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団の約４９％はＴＣＲδγＴ細胞であった。ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団の残りの５１％の細胞系列を明らかにすることはできなかった。図６Ｂ、Ｃに示す通り、ＴＣＲδγＴ細胞の比率および絶対数の増加は６週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓でも既に観察された。末梢血のＦＡＣＳ分析でも同様の結果が得られた（非提示データ）。
ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓および末梢血において有意に増加した。この所見に関して考えられる説明は以下の通りである。すなわち、ＴＣＲγδＴ細胞はＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３サブセットから生じることが報告されている［Ｃａｐｏｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８；９５：１２５２２、Ｌｉｖａｋ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２：２５７５、Ｓｈｏｒｔｍａｎ Ｋ ａｎｄ Ｗｕ Ｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１４：２９］。ＤＮ１段階からＤＮ２段階への分化経路がＷＴ１−Ｔｇマウスではブロックされており、ＴＣＲαβＴ細胞の生成に至る胸腺細胞の主な分化経路が制限されるため、ＤＮ３からＴＣＲγδＴ細胞への分化経路が進行しやすくなり、このためにＴＣＲγδＴ細胞が多く生じたと考えられる。また、これらの結果は、ＤＮ１胸腺細胞からＴＣＲγδＴ細胞に至る分化経路の存在を示唆する可能性もある。
ＷＴ１遺伝子は２つのスプライス部位で選択的スプライシングを受けるため、４つの異なるスプライス形態（１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋、１７ＡＡ−／ＫＴＳ−、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−、および、１７ＡＡ−／ＫＴＳ＋）が生じる［Ｈｅｒｗｉｔｔ ＳＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：８５８８、Ｄａｖｉｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。４つのスプライス形態のそれぞれの機能については現在も議論がある［Ｄａｖｉｅｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。本発明者らの以前の研究では、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋非スプライス型の構成的発現により、骨髄球系前駆細胞株３２Ｄ ｃｌ３およびマウス正常骨髄球系前駆細胞の分化がいずれも妨げられることを示した［Ｉｎｏｕｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９、Ｔｓｕｂｏｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９］。本実施例では、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のｌｃｋプロモーター駆動性発現によって胸腺におけるＴ細胞系列の初期分化が阻げられることを初めて記載した。
［実施例４］ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は胸腺由来である
ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞が、胸腺由来、あるいは胸腺外由来か否かを調べるため、抗ＣＤ８α抗体および抗ＣＤ８β抗体を用いたＦＡＣＳ分析を行った。図７に示す通り、多数のＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞がＣＤ８αβであった。この結果からＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は胸腺由来であることがわかった。
４匹のＷＴ１−Ｔｇマウスから発生した白血病細胞にＷＴ１アンチセンスオリゴマーを投与したところ、増殖が抑制された。このことは、導入したＷＴ１遺伝子が発癌に関与していることを示している。また、４匹のＷＴ１−Ｔｇマウス由来の白血病細胞について、ＴＣＲのＶβレセプターを解析したところ、２匹からの細胞についてはオリゴクローナルであり、残り２匹からの細胞についてはモノクローナルであった。このことは、４匹のＷＴ１−Ｔｇマウスから発症した白血病細胞の形質が多様であることを示している。
本発明により、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法が提供される。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は急性リンパ性白血病を起こすことから、本非ヒト動物を用いることにより優れた白血病治療薬のスクリーニングを容易に行うことができるといった利点を有する。
Claims (7)
17AA＋/KTS−スプライス型 WT1タンパク質をコードするDNAが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
17AA＋/KTS−スプライス型 WT1タンパク質をコードするDNAの導入により、T細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、T細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物。
非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
げっ歯類がマウスである、請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
白血病の症状を呈する請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された胸腺細胞であって、17AA＋/KTS−スプライス型 WT1タンパク質をコードするDNAが導入された細胞。
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、T細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物のT細胞系列の分化または発生を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、T細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する工程
（ａ）被検化合物を請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物のT細胞系列の分化または発生を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、T細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する工程
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002379735 | 2002-12-27 | ||
| JP2002379735 | 2002-12-27 | ||
| PCT/JP2003/016896 WO2004060055A1 (ja) | 2002-12-27 | 2003-12-26 | Wt1遺伝子トランスジェニック動物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010144518A Division JP2011004742A (ja) | 2002-12-27 | 2010-06-25 | Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2004060055A1 JPWO2004060055A1 (ja) | 2006-05-11 |
| JP4602772B2 true JP4602772B2 (ja) | 2010-12-22 |
Family
ID=32708405
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004564543A Expired - Fee Related JP4602772B2 (ja) | 2002-12-27 | 2003-12-26 | Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 |
| JP2010144518A Pending JP2011004742A (ja) | 2002-12-27 | 2010-06-25 | Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010144518A Pending JP2011004742A (ja) | 2002-12-27 | 2010-06-25 | Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP4602772B2 (ja) |
| AU (1) | AU2003292681A1 (ja) |
| WO (1) | WO2004060055A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5087571A (en) * | 1984-06-22 | 1992-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal |
| US4736866A (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic non-human mammals |
| US5489743A (en) * | 1993-01-19 | 1996-02-06 | Amgen Inc. | Transgenic animal models for thrombocytopenia |
| US5667981A (en) * | 1994-05-13 | 1997-09-16 | Childrens Hospital Of Los Angeles | Diagnostics and treatments for cancers expressing tyrosine phosphorylated CRKL protein |
-
2003
- 2003-12-26 AU AU2003292681A patent/AU2003292681A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-26 WO PCT/JP2003/016896 patent/WO2004060055A1/ja active Application Filing
- 2003-12-26 JP JP2004564543A patent/JP4602772B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-06-25 JP JP2010144518A patent/JP2011004742A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003292681A1 (en) | 2004-07-29 |
| WO2004060055A1 (ja) | 2004-07-22 |
| JPWO2004060055A1 (ja) | 2006-05-11 |
| JP2011004742A (ja) | 2011-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102658190B1 (ko) | 인간화된 sirpa-il15 녹인 마우스 및 이의 이용 방법 | |
| US5565321A (en) | Detection of mutations in a CD40 ligand gene | |
| US20240009247A1 (en) | Methods of treating lysosomal disorders | |
| US20100166784A1 (en) | Method and compositions for modulating th17 cell development | |
| AU2022200784B2 (en) | Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception | |
| US20150139999A1 (en) | Interferon antagonists, antibodies thereto, and associated methods of use | |
| KR20220139926A (ko) | 인공 시냅스 | |
| JP2000510333A (ja) | 因子活性を調節することによりｔ細胞サブセットを制御するための方法及び組成物 | |
| JP5093776B2 (ja) | 病態の状態をリアルタイムで観察可能なモデル動物とそれを可能にする遺伝子構築物及びその使用 | |
| EP0679191B1 (en) | Detection and treatment of mutations in a cd40 ligand gene | |
| EP1504261A2 (en) | A t cell subpopulation regulating gut immunity | |
| JP4533627B2 (ja) | Ｔ−ｂｅｔ組成物およびそれらの使用方法 | |
| JP4602772B2 (ja) | Ｗｔ１遺伝子トランスジェニック動物 | |
| KR20180110107A (ko) | 돌연변이 키뉴레니나아제 유전자를 갖는 비인간 동물 | |
| JPWO2003055507A1 (ja) | 拒食症又は生活習慣病治療薬及びそのスクリーニング方法 | |
| JP2000500645A (ja) | Ａｉｏｌｏｓ遺伝子 | |
| ES2304983T3 (es) | Un modelo animal para estudiar señalizacion hormonal y un metodo de modulacion de la señalizacion. | |
| CN113817770B (zh) | Cd73基因人源化的非人动物的构建方法及应用 | |
| JP4484708B2 (ja) | 自己免疫疾患を治療する方法および自己免疫疾患の治療化合物をスクリーニングする方法 | |
| KR20230148824A (ko) | 핵산을 전달하기 위한 조성물 및 방법 | |
| JPWO2004074483A1 (ja) | Ｔｓｇ遺伝子ノックアウト動物 | |
| WO1993004168A1 (en) | Transgenic non-human animal model for developing and testing therapies to treat sepsis | |
| Lund | The regulation and expression of mouse mammary tumor virus genes and gene products in B lymphocytes | |
| EP1390483A2 (en) | Gene encoding molecular motor protein and diagnosis method for the disease related to the gene | |
| JP2002504357A (ja) | Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091007 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091202 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100106 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100225 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100325 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100625 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100811 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100816 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100902 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100930 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131008 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |