JPH06220100A - インターフェロン−α／β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インターフェロン−α／β結合タンパク質、
そのムテイン体および融合タンパク質、それらの塩なら
びに機能を有する誘導体および活性画分、該タンパク質
の製造法、該タンパク質をコードするＤＮＡ分子、該Ｄ
ＮＡ分子を含む発現媒体、該媒体で形質転換された宿主
細胞、前記タンパク質の組換え体および前記タンパク質
を含有する医薬組成物。 【効果】 本発明によれば、新規の可溶性ＩＦＮ−α／
β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有する医
薬組成物が提供され、過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ
−βが存在する状態をともなう疾患などの予防、治療、
診断などに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インターフェロン−α
／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α／β結合タンパク
質）、そのムテイン体および融合タンパク質およびその
塩、ならびにそれらの機能を有する誘導体および活性画
分、のみならずその製造法およびそれを含有する医薬組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｉ型インターフェロン（インターフェロ
ン−αおよびインターフェロン−β、（ＩＦＮ−αおよ
びＩＦＮ−β））は、ウイルス感染に対する耐性を付与
する能力により規定される、構造的に関連したサイトカ
インのファミリーの構成要素である。Ｉ型ＩＦＮの他の
多くの生物学的活性が報告されており、そのなかには細
胞増殖の阻害やクラスＩ ＭＨＣ抗原の誘導およびその
他のいくつかの免疫調節活性⁽¹⁾ が含まれる。ＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−βは、Ｃ型肝炎^(2、3)およびウイルス
性疣贅^(4、5)などの種々のウイルス性疾患のみならず毛
様細胞性白血病⁽⁶⁾ 、慢性骨髄性白血病⁽⁷⁾ およびカポ
ジ肉腫⁽⁸⁾ などのある種の悪性疾患の治療に有用であ
る。

【０００３】他のサイトカインのばあいと同様に、ＩＦ
Ｎ−αはあらゆるＩＦＮ−αのサブタイプのみならずＩ
ＦＮ−βにも特異性を示す細胞表面レセプターと結合す
ることにより、その生物学的活性を発揮する⁽⁹⁾ 。ヒト
ＩＦＮ−αのレセプターは同定され、ダウディ(Daudi)
細胞よりクローン化された⁽¹⁰⁾。クローン化されたレセ
プターは１つの膜貫通ドメイン、１つの細胞外ドメイン
および１つの細胞内ドメインをもっていた。マウス細胞
中で発現すると、このレセプターによりマウス細胞にヒ
トＩＦＮ−αＢへの応答性が付与されたが、他のＩＦＮ
−αおよびＩＦＮ−β種には有意に応答せず、ＩＦＮ−
βおよび種々のＩＦＮ−αのサブタイプへの応答にはさ
らなる成分が関与しているかもしれないことが示唆され
た。

【０００４】いくつかの他の研究により、ＩＦＮ−αお
よびＩＦＮ−βの結合に関係するさらなる成分またはレ
セプターサブユニットの存在が示された^{（11〜13）}。さ
らに前記のレセプター⁽¹⁰⁾が、すべてのＩＦＮ−αおよ
びＩＦＮ−β種の結合に関与していることが主張された
⁽¹⁴⁾。

【０００５】個々の細胞に結合しているレセプターの細
胞外リガンド結合ドメインに対応する可溶性サイトカイ
ンレセプターが過去に同定されている。これらの中には
とくにＩＬ−６、ＩＦＮ−γ^{（15、16、17）}、ＴＮＦ
⁽¹⁸⁾、ＩＬ−１^{（19、20）}、ＩＬ−４⁽¹⁹⁾およびＩＬ−
２⁽²¹⁾の可溶性のレセプターが含まれる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】免疫疾患の予防、治
療、診断などのために有用な、新規なタンパク質が望ま
れていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＩＦＮ−α／
β結合タンパク質、そのムテイン体および融合タンパク
質およびその塩、その機能を有する誘導体ならびに活性
画分を提供する。

【０００８】本明細書中では前記したレセプター⁽¹⁰⁾は
「ＩＦＮ−αＲＡ」とよび、その可溶性類縁体は「ｓＩ
ＦＮ−αＲＡ」とよぶ。

【０００９】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、天然の
ソースから作られてよい。すなわち、健常人もしくは患
者からえられた血清または尿のようなヒトの体液由来で
あってよい。

【００１０】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、組換え
ＤＮＡ法により作られてもよい。

【００１１】このように本発明はまたＩＦＮ−α／β結
合タンパク質の製造法をも提供する。

【００１２】前記製造法の１つは、ＩＦＮ−αまたはＩ
ＦＮ−βが結合したカラムに体液を通すことによりヒト
体液から結合タンパク質を単離し、結合したＩＦＮ−α
／β結合タンパク質を溶出することを含んでなる。結合
タンパク質はそののち、サイズ排除クロマトグラフィー
の工程により均一にまで精製される。

【００１３】他の方法は、抗ＩＦＮ−α／βレセプター
抗体が結合したカラムに体液を通すことによりヒト体液
より結合タンパク質を単離し、カラムについた結合タン
パク質を溶出することを含んでなる。

【００１４】好ましくはヒト体液は尿またはヒト血清で
ある。

【００１５】既知のＩＦＮ−αＲＡの可溶性型とは対照
的に、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質はヒトＩＦＮ−α
２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βの生
物学的活性を阻害する。ＩＦＮ−α／β結合タンパク質
のアミノ酸配列分析により、その配列はＩＦＮ−αＲＡ
を含む他の既知のタンパク質のいずれとも異なることが
明らかになっている。

【００１６】これらの発見のゆえに本発明のＩＦＮ−α
／β結合タンパク質がＩＦＮ−α／βレセプターの成分
であるかまたは新規ＩＦＮ−α／βレセプターの可溶性
型であるということが可能である。

【００１７】さらに本発明は、ＩＦＮ−α／β結合タン
パク質、融合タンパク質、ムテイン体またはそれらの活
性画分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分
子、該ＤＮＡ分子を含む複製可能な発現媒体、それらで
形質転換された宿主および該形質転換宿主の発現によっ
て作られたタンパク質に関する。「ＤＮＡ分子」という
語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれ
らの組合せを含む。

【００１８】また本発明は、前記ＤＮＡ分子とハイブリ
ダイズし、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質と同じ生物学
的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子に関
する。

【００１９】また本発明は、ＩＦＮ−α／β結合タンパ
ク質を含んでなる、過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−
βが内在的に合成されたり、外から投与されたような状
態を治療するための医薬組成物に関する。

【００２０】

【実施例】抗ＩＦＮ−αＲＡモノクローナル抗体を用い
て、ヒト血清および尿中の既知の ⁽¹⁰⁾ＩＦＮ−αレセプ
ターの可溶性型を同定した。ＩＦＮ−α治療中の毛様細
胞性白血病患者の血清中には検出可能なレベルのｓＩＦ
Ｎ−αＲＡが見出されたが、一方健常人血清中のｓＩＦ
Ｎ−αＲＡのレベルは検出限界を下回っていた。このこ
とは、ＩＦＮ治療がｓＩＦＮ−ＲＡの流出または遊離を
増大させるかもしれないということを示唆する。健常人
コントロールの血清と比較してＩＦＮ−αの治療を受け
ている患者の血清中には50ＫのＩＦＮ−α結合タンパク
質が同様に増大することが観察された。

【００２１】血清中に見出される可溶性ＩＦＮ−αＲＡ
は、組換えＩＦＮ−αＲＡに対して作ったモノクローナ
ル抗体21.4を用いて行なったウェスタンブロッティング
によって決定したところ分子量55Ｋのタンパク質であっ
た。同じ手法を用いることにより、類似のサイズの可溶
性ＩＦＮ−αＲＡがヒトダウディ細胞の培養培地中にも
存在することが示唆された。正常尿を用いてえられた結
果からは、尿には血清および細胞培養培地中からの可溶
性レセプターの分子量よりも約10Ｋ低い分子量を有する
ｓＩＦＮ−αＲＡが含まれることが示された。

【００２２】平行した１組の実験で、血清（図１ｃ）お
よび尿（図２ｂ）を ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢ（分子量25
Ｋ）とクロスリンクさせ、抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.
74-3を用いて免疫沈降を行なった。分子量が約75Ｋ（血
清）および約65Ｋ（尿）のＩＦＮ−α結合タンパク質の
クロスリンクした産物を認めた。最初はこれらのバンド
がすでに既知であるＩＦＮ−αＲＡ⁽¹⁰⁾の可溶型の産物
であると想定されたが、単離、分析の結果（下記のとお
り）別のタンパク質、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質が
血清および尿中に存在することが見出された。

【００２３】２つのクロマトグラフィーの工程を含む手
順によって正常尿からＩＦＮ−α／β結合タンパク質を
単離した。粗尿タンパク質を、アガロースにＩＦＮ−α
２を結合してなるカラムに付した。カラムを洗浄し、結
合タンパク質を低ｐＨで溶出した。そののち溶出タンパ
ク質をサイズ排除ＨＰＬＣによって分離し、種々のタン
パク質のピークをえて、26、27、28（図５）の画分に溶
出しているそのうちの１つを ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２と特
異的に反応しうることより同定した。このタンパク質は
さらにＮ−末端ミクロ配列分析により特徴づけを行な
い、その結果配列番号１で示される主配列をそのＮ−末
端ドメインに有することがわかった。

【００２４】加えて、主配列のＮ−末端で３つの付加的
アミノ酸残基（Ｉｌｅ−ＸＸＸ−Ｔｙｒ）を有するポリ
ペプチドを少量成分として検出した（ＸＸＸは、未同定
のアミノ酸を示すが、このアミノ酸は、用いた方法によ
ると検出不能なＣｙｓであると考えられる。このアミノ
酸がＳｅｒであることもありうるが可能性はより低
い）。前記の結果えられた配列は、既知のＩＦＮ−αＲ
Ａ⁽¹⁰⁾のものと完全に異なっていた。またそれは他の既
知タンパク質のいずれの配列とも異なっており、ファス
トＡ（ＦａｓｔＡ）およびＴファストＡ（ＴＦａｓｔ
Ａ）プログラム⁽²⁴⁾の両方を用いてスイスプロット(Swi
ssprot) およびジーンバンク(Genebank)データライブラ
リーと比較することにより決定したところ、既知のＤＮ
Ａ配列のいずれによってもコードされていない。よっ
て、これは新規のタンパク質であり、ＩＦＮ−α／β結
合タンパク質とよぶ。この精製ＩＦＮ−α／β結合タン
パク質は、ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降に
より決定したところＭＡｂ 21.4と反応しなかったの
で、さらにそれが既知のＩＦＮ−αＲＡと相異なること
が示された。

【００２５】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のサンプル
をブロムシアンで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分離
し、これでえられた10Ｋよりも小さなペプチドである消
化断片の１つより配列番号２で示される内部配列がえら
れた（Ｍｅｔが実際の配列の先頭である）。

【００２６】また結合タンパク質は、ＩＦＮ−βがアガ
ロースに結合されてなるカラムでのクロマトグラフィー
と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって
も、正常尿から単離された。ＩＦＮ−αアガロース／ス
ペロース12（superose 12)法からの画分26〜29およびＩ
ＦＮ−βアガロース／スペロース12法からの画分26〜28
をＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により分析すると、分子量
40,000の同一の単一バンドがえられた（図６、それぞれ
レーン26〜29と26´〜28´）。このように、ＩＦＮ−α
またはＩＦＮ−βアガロースのいずれかのリガンドアフ
ィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除
クロマトグラフィーの組合せで、いずれのばあいでも均
一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質がえられた。前記し
たレセプター⁽¹⁰⁾はＩＦＮ−βとはあまり反応しないの
で、新規に単離したＩＦＮ−α／β結合タンパク質がそ
の結合特性において既知のレセプターと異なっているこ
とが明白である。

【００２７】ＩＦＮ−α２アガロースまたはＩＦＮ−β
アガロースカラムのいずれかで単離されたＩＦＮ−α／
β結合タンパク質の ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２への結合は、
ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦ
Ｎ−βを含む種々のＩ型ＩＦＮによって阻害されたが、
（II型）ＩＦＮ−γによっては阻害されなかった。

【００２８】均一な尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク質
は、その標識リガンド（ ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２）への結
合能を保持しており、共有クロスリンキングによって分
子量60Ｋの複合体を形成した。その分子量はＩＦＮ−α
／β結合タンパク質と20ＫのＩＦＮ−α２との１：１複
合体に相当する。クロスリンキングの反応に、非標識Ｉ
ＦＮ−α２を過剰に添加するとシグナルが消失し、それ
によって本タンパク質とＩＦＮ−αとの相互作用の特異
性が立証された（図７）。

【００２９】さらに、精製ＩＦＮ−α／β結合タンパク
質はＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよび
ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を阻害したが、ＩＦＮ−γ
の該活性は阻害せず、このタンパク質が普遍的なＩ型Ｉ
ＦＮ結合タンパク質であることが示唆された。かくのご
とく、該タンパク質はＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの生
物学的活性を妨げるか変化させることのできる有用な薬
剤である。均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質がＩ型
ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）に結合するの
で、我々はこの相互作用に他のポリペプチドは何ら必要
でないと結論している。このようにＩＦＮ−α／β結合
タンパク質は自律性ＩＦＮ−α／β結合タンパク質とし
て機能しているように思われ、必ずしも、たとえばＩＦ
Ｎ−αＲＡおよびＩＦＮ−α／βレセプターの両方を含
んでなるような、もっと複雑なレセプターのサブユニッ
トではない。

【００３０】これまでに可溶性サイトカインレセプター
の生理学的な役割は確証されていない。これらレセプタ
ーの２つの生成機作が提案されている：膜結合レセプタ
ーのタンパク分解性切断、たとえば可溶性ＩＬ−２Ｒ
⁽²⁵⁾ならびにＩＬ−４⁽²⁶⁾およびＩＬ−７⁽²⁷⁾のばあい
のようなｍＲＮＡの代替スプライシングである。可溶性
レセプターは、その特異的リガンドに結合し、ＴＮＦ系
^{（28、29）}において見られるように生物学的活性を阻害
することによるかまたはＩＬ−６系⁽³⁰⁾で立証されるよ
うにそれらの活性を増強することによりそれらの活性を
変化させる。組換え可溶性ＴＮＦレセプター（ＴＢＰ−
ＴＮＦ結合タンパク質としても知られている）は、動物
モデルにおいて敗血のショックを防ぐことが見出され
⁽³¹⁾、またＩＬ−１レセプターの可溶型はマウスの同種
（異系）移植レシピエントにおける生体内同種（異系）
反応性の発生に対する顕著な阻害効果を有することが見
出された⁽³²⁾。

【００３１】同じように本発明のＩＦＮ−α／β結合タ
ンパク質は、ＩＦＮ−α⁽³⁴⁾またはＩＦＮ−βが異常に
発現しているたとえばＩ型糖尿病⁽³³⁾および自己免疫疾
患、移植拒絶、エイズならびに類似の疾患のようなばあ
いにＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β活性の調節剤としての
使用が見出されうる。このように本タンパク質は過剰の
ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが内在的に合成されたり外
から投与されたりしているようないかなる条件下でも使
用されてよい。

【００３２】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質およびその
ムテイン体、融合タンパク質、それらの塩、その機能を
有する誘導体ならびにその活性画分が、哺乳動物におけ
る自己免疫疾患および他の炎症を治療することが示され
る。

【００３３】さらに本発明は、製薬上許容しうる担体な
らびに本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質またはそ
の活性ムテイン体、融合タンパク質、それらの塩ならび
に機能を有するそれらの誘導体または活性画分を含んで
なる医薬組成物に関する。

【００３４】投与法は類似製剤の投与について認められ
るいずれの方法によることも可能であり、治療の条件に
依存する。たとえば静脈内、筋肉、皮下などの局所注射
または局所投与、もしくは注入による継続的な投与など
が可能である。

【００３５】本発明の医薬組成物は、ＩＦＮ−α／β結
合タンパク質またはその誘導体を製薬上許容しうる担
体、安定化剤および賦形剤とともに混合して投与用に調
製し、たとえば投薬バイアル内に凍結乾燥品とするなど
して投薬形態に調製される。投与すべき活性成分の量は
投与経路、治療されるべき疾患および患者の状態に依存
するが、１回につき0.1 〜１mgである。たとえば局所注
射では、静脈内注入よりも体重を基礎としたタンパク量
は低値しか必要としないであろう。

【００３６】ここで用いられる「ムテイン体」という語
は、天然のＩＦＮ−α／β結合タンパク質の１つまたは
それ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換さ
れたかまたは削除された、もしくはＩＦＮ−α／β結合
タンパク質の天然の配列に１つまたはそれ以上のアミノ
酸残基が付加されたＩＦＮ−α／β結合タンパク質の類
縁体であってその結果えられる産物の活性があまり変化
していないものをいう。これらムテイン体は、既知の合
成および／または部位特異的突然変異誘発技術もしくは
他の好適な技術により調製される。

【００３７】「融合タンパク質」という語は、体液中で
の残存時間の長い別のタンパク質と融合したＩＦＮ−α
／β結合タンパク質またはそのムテイン体を含むポリペ
プチドをいう。ＩＦＮ−α／β結合タンパク質はこのよ
うに別のタンパク質、ポリペプチドなど、たとえばイム
ノグロブリンまたはその断片と融合されてもよい。

【００３８】ここで用いられる「塩」という語は、ＩＦ
Ｎ−α／β結合タンパク質、ムテイン体および融合タン
パク質のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩
の両方をいう。カルボキシル基の塩は当該技術分野の既
知の方法によって作られ、たとえばナトリウム、カルシ
ウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩などの無機塩およ
びたとえばトリエタノールアミンのようなアミン類、ア
ルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどと
形成される有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩は、た
とえば塩酸または硫酸のような無機酸との塩およびたと
えば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩を含む。

【００３９】ここで用いられる「機能を有する誘導体」
は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質ならびにその融合タ
ンパク質およびムテイン体の誘導体であって、当該技術
分野で既知の方法で残基上の側鎖またはＮ−もしくはＣ
−末端基として生じる官能基から調製されてもよく、そ
れらが製薬上許容しうるままである、すなわちタンパク
質の活性を破壊せず、それを含む成分が毒性を付与しな
いような限りにおいて本発明中に含まれる。これらの誘
導体としては、たとえば抗原性の部位をマスクしさらに
体液中でのＩＦＮ−α／β結合タンパク質の残存を延長
しうるポリエチレングリコール側鎖を含んでよい。他の
誘導体としては、カルボキシル基の脂肪酸エステル、ア
ンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンとの反応に
よるカルボキシル基のアミド、アシル部分(moiety)（た
とえばアルカノイルまたは炭素環アロイル基）とで形成
されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体
またはアシル部分とで形成される遊離水酸基（たとえば
セリンまたはスレオニン残基の水酸基）のＯ−アシル誘
導体を含む。

【００４０】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、その融合
タンパク質およびそのムテイン体の「活性画分」は、本
発明では該タンパク質分子自体またはそれに分子もしく
は残基、たとえば糖もしくはリン酸残基が結合したもの
のポリペプチド鎖のすべての断片または前駆体、あるい
はタンパク分子または糖残基自身の凝集物であって該画
分が同一の生物学的および／または薬物的活性を有する
ものをいう。

【００４１】下記の実施例によって本発明を示すが、も
とより本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００４２】材料 患者血清はダン アデルカ(Dan Aderka)博士（イチロフ
ホスピタル(IchilovHospital)、テル アビブ、イス
ラエル）より入手した。正常個体の1000- 倍濃縮⁽¹⁵⁾粗
尿タンパク質は、セロノ ラボラトリーズ(Serono Labo
ratories) （ローマ、イタリア）より入手し、アガロー
ス ヒドラジド（シグマ社製）に固定した抗−ＩＦＮ−
α ＭＡｂ No.74.3は、前に述べられた⁽²²⁾ように調製
しジ−Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミジル スベレート
(DSS) はピアス社より入手した。

【００４３】インターフェロン 組換えＩＦＮ−α２（２×10⁸ ユニット／mg）はチュー
リッヒ大学のシー ワイズマン(C.Weismann)博士により
提供された。ＩＦＮ−α２はクロラミンＴ法⁽³⁵⁾の変法
により標識した。手短に述べると、７μｇのＩＦＮ−α
２を１mg／mlのクロラミンＴ存在下で１ｍCiのＮａ ¹²⁵
Ｉを用いて標識し（氷上、20秒間）４×10⁷ cpm ／μｇ
の比活性とした。ＩＦＮ−αＢはチバ−ガイギー社より
入手し、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βはインター−ラ
ボ(Inter-Lab) 社、（ネス−ジオナ(Ness-Ziona)、イス
ラエル）より入手した。

【００４４】実施例１ ＭＡｂ 21.4を用いたヒト血清および尿のウェスタンブ
ロッティング 正常ヒト血清（ＮＨＳ）、毛様細胞性白血病（ＨＣＬ）
血清および粗尿タンパク質のサンプルを、非還元条件下
で⁽³⁶⁾ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロース膜
（シュライヒャー アンド シュエル(Schleicher and
Schuell)社製、0.45μｍ）に25ｍＭトリス、1.92ｍＭグ
リシン、20％メタノール中、電気的に転写した。転写に
つづいて膜をブロッキング緩衝液（0.05％ツイーン-20
および0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、10％脱
脂ミルク）とインキュベートし、組換えＩＦＮ−αＲＡ
に対して調製した抗−ＩＦＮ−αＲＡ抗体21.4と室温に
て２時間インキュベートした。ニトロセルロース膜を0.
05％ツイーン-20 含有ＰＢＳで洗浄し、 ¹²⁵Ｉ−ヤギ
抗−マウス抗体（ブロッキング緩衝液中0.7 ×10⁶ cpm
／ml）と４℃にて一晩インキュベートした。膜を洗浄
後、乾燥してオートラジオグラフィーを行なった。

【００４５】ＨＣＬ血清は、分子量55Ｋの弱いバンドを
示し（図１、レーンＣおよびＤ）、一方ＮＨＳ中にはこ
のようなバンドは認められなかった（図１、レーン
Ｂ）。レーンＢ〜Ｄに見られる高分子量タンパク質（約
150 Ｋ）はおそらくはイムノグロブリンであろう。

【００４６】粗尿タンパク質（１μｌ、1000- 倍濃縮）
の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次に抗−ＩＦＮ−α
ＲＡ ＭＡｂ 21.4を用いてウェスタンブロッティング
を行なった。分子量45Ｋのタンパク質のバンドを検出し
た（図２ａ）。同じレーン中に見られる高分子量タンパ
ク質（150 Ｋ）は、タンパク質配列分析によってヒトイ
ムノグロブリンであると同定された。これは、1000- 倍
濃縮尿中、ヒトイムノグロブリンと２次抗体（ ¹²⁵Ｉ−
ヤギ 抗−マウス抗体）との交叉反応のために検出され
うるものである。

【００４７】実施例２ 未処理血清および尿のクロスリンキングおよび免疫沈降 血清または尿のサンプルを、100 倍過剰量の非標識ＩＦ
Ｎ−α２の非存在下または存在下で ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α
Ｂ（300,000cpm）と４℃にて１時間インキュベートし
た。そののちジメチルスルフォキシド（Ｍｅ₂ ＳＯ）中
に溶解したＤＳＳを最終濃度が１ｍＭとなるように添加
し、混液を４℃にて20分間放置した。１Ｍトリス塩酸ｐ
Ｈ7.5 および１Ｍ塩化ナトリウムを最終濃度が100 ｍＭ
となるように添加して反応を停止した。アガロースヒド
ラジドに固定した抗−ＩＦＮ−αＭＡｂ 74-3⁽²²⁾（25
μｌ、７mg／ml）を添加して試料を免疫沈降させた。４
℃にて一晩インキュベートしたのち、ビーズをＰＢＳで
３回洗浄し、２％メルカプトエタノールを含むサンプル
用緩衝液中に懸濁して、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
続いてオートラジオグラフィーにて分析した。

【００４８】免疫沈降をしなくてもＨＣＬ血清中には分
子量75Ｋの特異的であるが弱いバンドが認められた（図
１、レーンＦ）。クロスリンクした産物を固定化抗−Ｉ
ＦＮ−α ＭＡｂ 74-3を用いた免疫沈降により濃縮し
た。実際、おそらく25Ｋの¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢにクロ
スリンクした50Ｋのタンパク質からなる、中央が75Ｋ近
辺の幅広いバンドが、ＨＣＬ血清中に明瞭に認められた
（図１、レーンＨおよびＪ）が、ＮＨＳ中には認められ
なかった（図１、レーンＬ）。過剰の非標識ＩＦＮ−α
ＢおよびＩＦＮ−α２の両者の存在下のばあいを除き、
クロスリンキング実験をくり返してこの結合の特異性を
立証した。事実、75Ｋのバンドは有意に減少した（図
１、レーンＩおよびＫ）。特異的な（置換可能な）75Ｋ
のバンドに加えて、いくつかの置換可能でないバンド
（50Ｋ、80Ｋ、97Ｋおよび100 より大 Ｋ）が認められ
た。80Ｋのバンド（図１、レーンＨ〜Ｍに明瞭に見られ
る）は75Ｋのバンドと完全には分離されえなかった。

【００４９】尿の40Ｋのタンパク質のリガンド結合能
は、過剰量の非標識ＩＦＮ−αＢの存在下または非存在
下にて ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢと未処理尿のサンプルとを
インキュベートし、そののちＤＳＳを用いてクロスリン
キングすることにより確認した。続いて抗−ＩＦＮ−α
ＭＡｂ 74-3を用いて免疫沈降して、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行ない、分子量65Ｋの特異的なクロスリンキングの
産物を検出した（図２ｂ）。この複合体は、血清からえ
られたものより10Ｋだけ小さかった。

【００５０】実施例３ ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の単離 製造業者の指示に従って、アフィゲル−10(Affigel−1
0）（１ml、バイオラッド(BioRad)社製）にＩＦＮ−α
２（５mg）を結合させてカラムにつめた。粗尿タンパク
質（1000倍濃縮、10ｇ、250ml ）を流速0.25ml／min で
カラムに付した。カラムは0.5 Ｍ塩化ナトリウム含有リ
ン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）250ml 、つぎにＰＢＳ
（10ml）を用いて洗浄した。そののち結合したタンパク
質（75μｇ）を0.25ｍＭクエン酸ｐＨ2.2 で溶出し、直
ちに１Ｍ炭酸ナトリウムで中和した。１mlずつ画分を集
めた。その画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によっ
て分析し（図３）、タンパク量をフルオレサミンを用い
て測定した。種々の画分について、実施例２に述べたよ
うに ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２とのクロスリンキング、免疫
沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
を行なって分析した。未処理尿中ならびにＩＦＮ−α２
−アガロースおよびＩＦＮ−β−アガロースカラムの両
方から溶出した画分中にＩＦＮ−α／β結合タンパク質
が見出された（図４）。

【００５１】溶出画分をスペロース12カラム（１×30c
m、ファルマシア社、スウェーデン）に一部（0.3ml 、1
1μｇ）付した。カラムはリン酸緩衝性生理食塩水およ
び0.02％アジ化ナトリウムで前もって平衡化しておき、
流速0.5ml ／min にて溶出し、１分ごとの画分を集めた
（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により測定す
ると40Ｋの均一なタンパク質として画分26〜28（７μ
ｇ）にＩＦＮ−α／β結合タンパク質が溶出した（図
６）。250 リットルの尿から約25μｇの純粋なタンパク
質を回収した。ＩＦＮ−βアガロースカラムに続いてス
ペロース12カラムを行なって粗尿タンパク質を精製した
ばあいにも、同様の結果がえられた。

【００５２】実施例４ タンパク質配列分析 実施例３のスペロース12カラムの画分27（４μｇタンパ
ク質）をＰＶＤＦ膜（プロ−スピン(Pro-Spin)、アプラ
イド バイオシステムズ(Applied Biosystems)社、米
国）に吸着させ、その膜をモデル４７５ マイクロシー
ケンサー（アプライド バイオシステムズ社製）で、タ
ンパク質配列分析に付した。

【００５３】配列番号１で示される主配列をえた。

【００５４】それに加えて前記主配列のＮ−末端で３つ
の付加的なアミノ酸残基（Ｉｌｅ−ＸＸＸ−Ｔｙｒ）を
有する第２のポリペプチドを検出した（ＸＸＸは、未同
定のアミノ酸を示すが、このアミノ酸は用いられた方法
によると検出不能なＣｙｓであると考えられる。このア
ミノ酸がＳｅｒであることもありうるが、可能性はより
低い）。

【００５５】えられた配列は、既知のＩＦＮ−αレセプ
ターＡ⁽¹⁰⁾の配列と完全に異なっており、他の既知のタ
ンパク質のいずれとも異なっていた。また、ＦａｓｔＡ
およびＴＦａｓｔＡ⁽²⁴⁾のプログラムによってSwisspro
t およびGenebankのデータベースを検索して決定したと
ころ、既知のＤＮＡ配列によりコードされるいずれのタ
ンパク質とも異なっていた。このように本タンパク質
は、新規のタンパク質であった。

【００５６】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のサンプル
をブロムシアンで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して
ＰＶＤＦ膜にブロットした。10Ｋより小さい、ペプチド
の１つは配列番号２で示される内部配列を与えた（Ｍｅ
ｔが実際の配列の先頭である）。

【００５７】純粋なｓＩＦＮ−αレセプターはＩＦＮ−
αＲＡに対応する配列を含んでいないので、実施例２に
述べた尿の結合タンパク質はｓＩＦＮ−αＲＡではない
と考えられた。血清中の主たるｓＩＦＮ−αレセプター
もＩＦＮ−α／β結合タンパク質であり、ｓＩＦＮ−α
ＲＡではないという可能性がある。

【００５８】実施例５ 純粋なＩＦＮ−α／β結合タンパク質のクロスリンキン
グおよび免疫沈降 ＩＦＮ−α２またはＩＦＮ−βカラムで精製した尿のＩ
ＦＮ−α／β結合タンパク質またはさらにスペロース12
カラムで精製した尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク質の
サンプルを、100 倍過剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存
在下または存在下にて ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（10⁶ cpm
）と４℃で１時間インキュベートした。そののちジメ
チルスルホキシド（Ｍｅ₂ ＳＯ）中に溶解したＤＳＳを
最終濃度が１ｍＭとなるように添加し、混液を４℃にて
20分間放置した。１Ｍトリス塩酸ｐＨ7.5 および１Ｍ塩
化ナトリウムを最終濃度が100 ｍＭとなるように添加し
て反応を停止した。アガロースヒドラジドに固定した抗
−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 74-3⁽²²⁾（25μｌ、７mg／ml）
を添加して試料を免疫沈降させた。４℃にて一晩インキ
ュベートしたのち、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２％
メルカプトエタノールを含むサンプル用緩衝液中に懸濁
して、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（7.5 ％アクリルア
ミド）、続いてオートラジオグラフィーにて分析した。
分子量約60Ｋの特異的なクロスリンク産物がすべての画
分に見られ、過剰の非標識ＩＦＮ−α２存在下では完全
に消えていた（図７）。

【００５９】実施例６ クロスリンキング実験における ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の
各種Ｉ型ＩＦＮでの置き換え 均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質（40ng）を３〜67
0 倍過剰量の非標識ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦ
Ｎ−αＣ、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γの非存在下また
は存在下で ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（10⁶ cpm ）と４℃に
て１時間インキュベートした。そののちジメチルスルフ
ォキシド（Ｍｅ₂ ＳＯ）中に溶解したＤＳＳを最終濃度
が１ｍＭとなるように添加し、混液を４℃にて20分間放
置した。１Ｍトリス塩酸ｐＨ7.5 および１Ｍ塩化ナトリ
ウムを最終濃度が100 ｍＭとなるように添加して反応を
停止した。アガロースヒドラジドに固定した抗−ＩＦＮ
−α ＭＡｂ 74-3⁽²²⁾（25μｌ、７mg／ml）を添加し
て試料を免疫沈降させた。４℃にて一晩インキュベート
したのち、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２％メルカプ
トエタノールを含むサンプル用緩衝液中に懸濁して、そ
の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（7.5 ％アクリルアミド）、
続いてオートラジオグラフィーにて分析した（図６）。
¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２のＩＦＮ−α／β結合タンパク質
との結合の阻止において、すべてのＩ型ＩＦＮが等しく
有効であることを見出した。この結果より、ＩＦＮ−α
／β結合タンパク質が、前記したＩＦＮ−αＢのみに特
異的なＩＦＮ−αＲＡ⁽¹⁰⁾とは異なることが示された。

【００６０】実施例７ ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−αおよび
ＩＦＮ−β活性の阻害 実験は、ＩＦＮ活性測定に用いられる細胞変性効果（Ｃ
ＰＥ）阻害分析⁽³⁷⁾に基づいて行なった。抗ウイルス活
性は、ヒトＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γの
ＮＩＨ参照標準に対して検量した。下記の手順を用い
た：96−平底ウェルプレート中、10％ＦＣＳ添加ＭＥＭ
100 μｌ中に20,000細胞／ウェルを播種してＷＩＳＨ細
胞（ヒト羊膜細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−25）のコンフル
エントな細胞単層を調製した（１日目）。プレートを５
％ＣＯ₂ 存在下、37℃でインキュベートした。２日目に
標準ＩＦＮ−β（10μｌ、1000Ｕ／ml）を別のプレート
中（65μｌ）に連続的に２倍希釈した。可溶性ＩＦＮ−
α／βＲ（10μｌ、４μｇ／ml、ＩＦＮ−αカラムなら
びにスペロース12カラムにて精製）を標準ＩＦＮ−β希
釈液中に添加した。1000Ｕ／mlのＩＦＮ−αを中和する
に足る抗−ＩＦＮ−α中和モノクローナル抗体（25μ
ｌ、Ｎｏ．９−３⁽²²⁾）をＩＦＮ−α２アガロースカラ
ムからリークしたＩＦＮ−α２を中和するために各ウェ
ルに加えた。混液を37℃にて90分間放置したのち、ＷＩ
ＳＨ細胞の入ったプレートに移し、直ちに水疱性口内炎
ウイルス（ＶＳＶ、50μｌ、220 ＰＦＵ／細胞）を用い
て攻撃した。プレートを37℃で一晩インキュベートし
た。標準ＩＦＮ−βに対して検量し、分析を行なった。
３日目、ウイルスの攻撃から約20時間後に、細胞変性効
果を顕微鏡下で評点し、単層をクリスタルバイオレット
にて染色した（図９）。

【００６１】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、ＩＦＮ
−βの抗ウイルス活性を完全に阻害することが見出され
た（図７、Ｅ）。阻害の程度に基づいて、最小力価2.5
×10⁵ 抗−ＩＦＮ−β ユニット／mgレセプターを計算
した。平行した実験で、ＩＦＮ−βカラムで精製したＩ
ＦＮ−α／β結合タンパク質によってＩＦＮ−α２を同
じように中和した。実験は抗−ＩＦＮ−β中和ポリクロ
ーナル抗体存在下で行なった（図９、Ｉ）。別の実験に
よりＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、ＩＦＮ−βを阻
害すると同程度にＩＦＮ−αＢおよびＩＦＮ−αＣの抗
ウイルス活性を阻害することが明らかになった（図1
0）。

【００６２】実施例８ マウスの免疫、細胞融合およびスクリーニング Ｂａｌｂ／ｃマウスに尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク
質の均一なサンプル（１μｇ／マウス／インジェクショ
ン）を４回注射する。転化ｓＲＩＡ（後述）によって最
高の力価を示すマウスを融合用に選択する。脾臓リンパ
球をＮＳＯ−１ミエローマ変異（ＮＳＯ）細胞（シー
ミルスタイン(C.Milstein)、ＭＲＣ、ケンブリッジ、英
国により提供）と融合する。転化ｓＲＩＡにより抗−Ｉ
ＦＮ−α／βＲ抗体の存在に関してハイブリドーマの上
清を調べる。96−ウェルプレートをアフィニティで精製
したヤギ抗−マウス抗体で被覆し、続いてハイブリドー
マの上清さらに ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α／βＲを添加する。
平行して、ＩＦＮ−α／β抗ウイルス活性の中和に関し
てハイブリドーマを調べる。抗−ＩＦＮ−α／βＲ抗体
を分泌していると認められたハイブリドーマを限界希釈
法によってクローン化しさらにもう一度クローン化す
る。

【００６３】実施例９ ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の組換え生産 組換えＩＦＮ−α／β結合タンパク質を生産するため
に、ポリペプチドの配列を、配列番号３で示されるペプ
チド配列（256 パーミュテーション）および配列番号４
で示されるペプチド配列（192 パーミュテーション）に
対応する２つのオリゴヌクレオチド配列に逆翻訳する。

【００６４】プローブを［³²Ｐ］で５´−標識し、遺伝
子およびＩＦＮ−α／β結合タンパク質のｍＲＮＡに対
応するｃＤＮＡを含む、遺伝子およびｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするのに用いる。陽性クローンを
単離し、それらの配列を決定し、それらに相補的な配列
が含まれていたばあいには、全長のｍＲＮＡに対応する
ｃＤＮＡクローンを単離するべく、より特異的なプロー
ブとしてそれらを用いる。

【００６５】単離したｃＤＮＡは、至適なオリゴヌクレ
オチドを用いて部位特異的突然変異誘発に付し、ＩＦＮ
−α／β結合タンパク質の最後の必須コドンの後ろに終
止コドンとポリアデニル化部位を挿入する。そののちこ
の構築体を当該技術分野においてよく知られている技術
⁽³⁸⁾によって適切に構築した発現ベクター内に挿入す
る。２本鎖のｃＤＮＡをホモポリメリックテイリングま
たはリストリクションリンキングにより、合成ＤＮＡリ
ンカーまたは平滑末端ライゲーション法を用いてプラス
ミドベクターに連結する。ＤＮＡ分子を連結するために
ＤＮＡリガーゼを用い、望まない連結を防ぐためにアル
カリホスファターゼでＤＮＡ鎖を処理する。

【００６６】また別の方法としては、配列番号３で示さ
れるペプチドに対応するオリゴヌクレオチドの混合物を
オリゴ（ｄＴ）またはｃＤＮＡライブラリーの構築に用
いたλファージ内にある２つのフランキング配列のうち
１つに対応するオリゴマーと混ぜ合わせる。ｃＤＮＡラ
イブラリー全体からのＤＮＡの鋳型を用いたポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーとして混合物を用
いる。実施例４で述べたポリペプチドをコードする領域
が存在しているかどうかを確認するために、配列を分析
することによって増幅したＤＮＡのバンドの特徴づけを
行なう。それから、当該技術分野において知られた方法
によって、可溶性ＩＦＮ−α／βＲのｍＲＮＡよりなる
ｃＤＮＡを発現ベクターに導入して組換えタンパク質を
生産し、精製する。

【００６７】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を含んでな
る融合タンパク質たとえばＩｇＧ₁重鎖の定常部を含む
タンパク質の産生は、下記のように行なうことができ
る：ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のＤＮＡを至適なオ
リゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘発に付
し、コード配列のすぐ後ろに特徴的な制限酵素切断部位
を導入する。ＩｇＧ₁ 重鎖の定常部をもつプラスミド、
たとえばｐＲＫＣＯ４₂Ｆｃ₁ ⁽³⁹⁾を同様の部位特異的
突然変異誘発に付して、融合タンパク質の方の翻訳がな
されるようにＩｇＧ₁ 重鎖のＡｓｐ 216の可能な限り近
くに同じ特徴的制限酵素切断部位を導入する。前記の特
徴的な制限酵素切断部位で消化することにより、５´非
翻訳配列とＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードする
配列よりなるｄｓＤＮＡ断片を調製する。変異させたｐ
ＲＫＣＤ４₂ Ｆｃ₁ も同様に消化して、プラスミドとＩ
ｇＧ₁ 配列を含む大きな断片を作る。そののち２つの断
片を連結して、Ｎ−端にＩＦＮ−α／β結合タンパク質
とＩｇＧ₁ 、重鎖の約227 のＣ末端アミノ酸（ヒンジ領
域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）よりなるポリ
ペプチド前駆体をコードする新規プラスミドを作成す
る。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適切な制限
酵素を用いた消化によってプラスミドより単離し、有効
な発現ベクターに挿入することができる。

【００６８】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、そのムテ
イン体または融合タンパク質の発現を可能とするため
に、発現ベクターはまた、遺伝子発現、およびタンパク
質の生産が可能となるように所望のタンパク質をコード
するＤＮＡに連結した転写および翻訳を調節する情報を
含んだ特異的なヌクレオチド配列をも含んでなるものと
する。最初に、遺伝子を転写させるために、ポリメラー
ゼが結合して転写の過程が開始される、ＲＮＡポリメラ
ーゼによる認識が可能なプロモーターを前につけねばな
らない。このようなプロモーターとして相異なる効率で
働く種々のものが用いられている（強いプロモーターや
弱いプロモーター）。それらは、原核および真核細胞そ
れぞれに対して相異なる。

【００６９】本発明において使用可能なプロモーター
は、たとえばλバクテリオファージのｉｎｔプロモータ
ー、ｐＢＲ 322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロ
モーターおよびｐＢＲ 325のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターな
どの構成性プロモーターもしくは、λバクテリオファー
ジの主たる右側および左側プロモーター（Ｐ_L およびＰ
_R ）や大腸菌ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、
ｏｍｐＦ、およびｇａｌプロモーターまたはｔｒｐ−ｌ
ａｃハイブリッドプロモーターなどの誘導性プロモータ
ーであってよい（グリック、ビー アール (Glick,B.
R.)(1987) J.Ind.Microbiol.1 :277-282）。

【００７０】大量のｍＲＮＡを作り出す強いプロモータ
ーを使用することのほかに、原核細胞において高レベル
の遺伝子発現をなしとげるために、ｍＲＮＡの効率よい
翻訳を保証するようにリボソーム−結合部位を用いるこ
とも必要である。１つの例としては、開始コドンから16
ＳＲＮＡの３´−末端配列と相補的な配列を適性に配置
したシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）がある。

【００７１】真核性宿主のために、宿主の性質によっ
て、異なる転写および翻訳調節配列を用いてもよい。こ
れらの配列は、調節シグナルが高いレベルで発現する特
定の遺伝子に結合する、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウ
イルスおよびＳＶなどのウイルスのソースなどからえて
もよい。例としては、ヘルペスウイルスのＴＫプロモー
ター、ＳＶ40初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プ
ロモーターなどがあげられる。遺伝子の発現を調節でき
るように、抑制および活性化を許容する転写開始調節シ
グナルを選択してもよい。

【００７２】本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質も
しくはその断片またはそれらのムテイン体もしくは融合
タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および作動
可能に連結された転写および翻訳調節シグナルからなる
ＤＮＡ分子を、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体に組
み込むことができるベクターに挿入する。それらの染色
体へ導入されたＤＮＡを安定に組み込んでいる細胞を選
択しうるように、発現ベクターを含有する宿主細胞の選
択を許容する１つまたはそれ以上のマーカーを用いる。
マーカーは栄養要求性宿主に原栄養性(prototrophy) 、
たとえば抗生物質または銅などの重金属に対する殺菌耐
性(biocide resistance)などであってよい。選択しうる
マーカー遺伝子は発現されるべくＤＮＡ遺伝子配列に直
接連結されうるか、またはコトランスフェクションによ
って同じ細胞へ導入されうるかいずれでもよい。追加の
要素も一本鎖結合タンパク質ｍＲＮＡを至適に合成する
ために必要とされるかもしれない。これらの要素は転写
プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルに加え
てスプライスシグナルを含んでもよい。このような要素
を取り込むｃＤＮＡ発現ベクターにはオカヤマ、エイチ
(Okayama,H.)により、(1983) Mol.Cel.Biol.3 :280に記
載されたものを含む。

【００７３】好ましい実施態様では、導入されるＤＮＡ
分子はレシピエント宿主(recipienthost)において自律
複製しうるプラスミドもしくはウイルス性ベクター中に
取り込まれる。特定のプラスミドまたはウイルス性ベク
ターを選択するのに重要な因子には、ベクターを含有す
るレシピエント細胞を認識し、かつベクターを含有しな
いレシピエント細胞から選択することができる容易性、
特定の宿主における所望のベクターのコピー数、および
異なる種の宿主細胞間をベクターが「シャトル」しうる
ことが望ましいかどうかということが含まれる。

【００７４】好ましい原核性のベクターには、たとえば
ｐＢＲ 322、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ101 、ｐＡＣＹＣ 184
などの大腸菌において複製可能なプラスミドなどのプラ
スミド（マニアティス(Maniatis)ら、op.cit. 参照）、
ｐＣ 194、ｐＣ 221およびｐＴ 127などのバチルス属の
プラスミド（グリックザン、ティー(Gryczan,T.)、“Th
e Molecular Biology of the Bacilli”，Academic Pre
ss,NY(1982),p307〜329 ）、ｐＩＪ 101を含むストレプ
トミセス属のプラスミド（ケンダル、ケージェイ（Kend
all,K.J.) ら、(1987)J.Bacteriol.169 :4177-4183) 、
φＣ31などのストレプトミセス属のバクテリオファージ
（チャター、ケーエフ（Chater,KF)ら、“Sixth Intern
ational Symposium on Actinomycetales Biology”，Ak
ademiai Kaido,Budapest,Hungary(1986),p45〜54）およ
びシュードモナス属のプラスミド（ジョン、ジェー エ
フ(John,J.F.) ら、(1986) Rev.Infect.Dis.8 :693-70
4）およびイザキ、ケー(Izaki,K.)、(1978)Jpn.J.Bacte
riol.33:729-742参照）が含まれる。

【００７５】好ましい真核性プラスミドには、ＢＰＶ、
ワクシニア、ＳＶ40、2-ミクロンサークル（2-micron c
ircle)など、またはそれらの誘導体が含まれる。これら
のプラスミドは当該技術分野においてよく知られている
（ボツシュタイン、ディー(Botstein,D.) ら、(1982)Mi
ami Wint.Symp.19:265-274; ブローチ、ジェイアール(B
roach,JR.)、“The Molecular Biology of the Yeast S
accharomyces:Life Cycle and Inheritance ”，Cold S
pring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,p.44
5 〜470(1981);Broach,J.R.,(1982)Cell 28:203-204;ボ
ロン、ディーピー)(Bollon,D.P.)ら、(1980) J.Clin.He
matol.Oncol.10:39-48; およびマニアティス、ティー(M
aniatis,T.) 、“Cell Biology:A Comprehensive Treat
ise,Vol.3: Gene Expression”，Academic Press,NY,p.
563 〜608(1980) 参照）。

【００７６】一旦、構成体(construct(s))を含有するベ
クターまたはＤＮＡ配列が発現用に調製されれば、発現
ベクターは適した宿主細胞中に、形質転換、トランスフ
ェクション、リポフェクション、接合、原形質融合、エ
レクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ダイレ
クトマイクロインジェクションなどのさまざまな種類の
適した手段のいかなるものによって導入してもよい。

【００７７】本発明に用いられる宿主細胞は原核細胞で
あってもよいし真核細胞であってもよい。好ましい原核
性宿主には、大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス
属、シュードモナス属、サルモネラ属およびセラチア属
などのバクテリアなどが含まれる。最も好ましい原核性
宿主は大腸菌である。とくに重要なバクテリア性の宿主
には、大腸菌Ｋ12株294 （ＡＴＣＣ 31446）、大腸菌Ｘ
1776（ＡＴＣＣ 31537）、大腸菌Ｗ3110（Ｆ^- 、ラムダ
^- 、原栄養性（ＡＴＣＣ 27325）、およびネズミチフス
菌または霊菌などの腸内細菌、および種々のシュードモ
ナス種が含まれる。このような条件下では、本発明のタ
ンパク質はグリコシル化されない。原核性宿主は発現プ
ラスミドにおいてレプリコンおよび制御配列と適合しな
ければならない。

【００７８】しかしながら、本発明のＩＦＮ−α／β結
合タンパク質はおそらくグリコシル化されたタンパク質
であるので、原核性宿主よりも真核性宿主が好ましい。
好ましい真核性宿主はたとえば、ヒト、サル、マウスお
よびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの
哺乳動物細胞である。それらの細胞では正しい部位での
グリコシル化に加えて正しい折りたたみ構造形成および
正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分子に翻
訳後に修飾が与えられるため好ましい。また、酵母細胞
および昆虫細胞は高いマンノースグリコシル化を含む翻
訳後のペプチドの修飾を行ないうる。強力なプロモータ
ー配列と酵母においておよび昆虫細胞において所望のタ
ンパク質の産生に利用できる多コピー数のプラスミドと
を利用する多数の組換えＤＮＡストラテジーが存在す
る。酵母細胞はクローン化された哺乳動物遺伝子産物上
のリーダー配列を認識し、リーダー配列を担うペプチド
を分泌する。

【００７９】ベクターを導入後、宿主細胞は、ベクター
含有細胞を選択的に生長させる、選択培地で生長させ
る。クローン化された遺伝子配列の発現により、ＩＦＮ
−α／β結合タンパク質、融合タンパク質またはムテイ
ン体、またはそれらの断片が生産される。ついで、発現
されたタンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィ
ー、電気泳動などを含むいかなる通常の手順によって、
または、カラムにつめられたゲルマトリックス上に固定
された抗−ＩＦＮ−α／β結合タンパク質モノクローナ
ル抗体を用いる、アフィニティークロマトグラフィーに
よって、単離および精製がなされる。前記組換えＩＦＮ
−α／β結合タンパク質を含有する粗調製品をカラムに
通し、それによって夾雑物は通過するであろうけれども
ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は特異な抗体によってカ
ラムに結合されるであろう。洗浄後、本発明のタンパク
質は高いまたは低いｐＨ、たとえばｐＨ11またはｐＨ２
でゲルから溶出される。

【００８０】参考文献 １．Taylor, J.L. and Grossberg, S.E. (1990), Recen
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【００８１】

【発明の効果】本発明によれば、新規の可溶性ＩＦＮ−
α／β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有す
る医薬組成物が提供される。該タンパク質は、過剰量の
ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが存在するような状態をと
もなう疾患などの予防、治療、診断などに有用である。

【００８２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 起 源：ホモサピエンス、尿 配 列 Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Arg Thr Phe Lys Ile Arg Leu 1 5 10 15 Arg

【００８３】配列番号：２ 配列の長さ：23 配列の型：アミノ酸 起 源：ホモサピエンス、尿 配 列 Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu Glu Leu Gln Phe Asp Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln 20

【００８４】配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 起 源：ホモサピエンス、尿

【００８５】配列番号：４ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 起 源：ホモサピエンス、尿

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）ヒト血清を電気泳動したのち抗−ＩＦＮ
−αＲＡ ＭＡｂ（No.21.4 ）を用いてウェスタンブロ
ッティングを行なったものを示す写真である。レーン：
Ａ：分子量マーカー（Ｋ）；Ｂ：正常ヒト血清（ＮＨ
Ｓ、５μｌ）；ＣおよびＤ：毛様細胞性白血病（ＨＣ
Ｌ）患者からの血清（それぞれ５μｌ、１μｌ）。 （ｂ） ¹²⁵Ｉ−標識−ＩＦＮ−αＢ（見かけの分子量25
Ｋ）と体液中のＩＦＮ−α結合タンパク質よりなるクロ
スリンクされた複合体を電気泳動したもののオートラジ
オグラムを示す写真である。レーン：Ｅ：分子量マーカ
ー（Ｋ）；Ｆ： ^{1 25}Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクし
たＨＣＬ患者からの血清（５μｌ）；Ｇ：¹²⁵Ｉ−ＩＦ
Ｎ−αＢとクロスリンクしたＮＨＳ（５μｌ）。 （ｃ）（ｂ）のクロスリンクした複合体を引き続き抗−
ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3⁽²²⁾を用いて免疫沈降（Ｉ
ｐｔｎ）を行なったものを電気泳動したもののオートラ
ジオグラムを示す写真である。レーン：Ｈ〜Ｋ：それぞ
れ非標識物なし（Ｈ、Ｊ）、過剰量の非標識ＩＦＮ−α
２存在下（Ｉ）、過剰量の非標識ＩＦＮ−αＢ存在下
（Ｋ）で ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクしたＨＣ
Ｌ患者からの血清（50μｌ）；ＬおよびＭ：それぞれ非
標識物なし（Ｌ）、過剰量の非標識ＩＦＮ−α２存在下
（Ｍ）で ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクした正常
ヒト血清（50μｌ）；Ｎ：分子量マーカー（Ｋ）。

【図２】（ａ）尿のｓＩＦＮ−αＲＡを電気泳動したの
ち抗−ＩＦＮ−αＲＡ ＭＡｂNo.21.4 を用いてウェス
タンブロッティングを行なったものを示す写真である。
レーン：Ａ：分子量マーカー（Ｋ）；Ｂ：未処理の尿
（１μｌ）。 （ｂ） ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢと尿ＩＦＮ−α結合タンパ
ク質をクロスリンクして複合体形成後免疫沈降を行なっ
たものを電気泳動したもののオートラジオグラムを示す
写真である。レーン：Ｃ： ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロ
スリンクして抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3⁽²²⁾を用
いて免疫沈降した100 倍濃縮の尿タンパク質（100 μ
ｌ）；Ｄ：クロスリンキングの前に過剰量の非標識ＩＦ
Ｎ−αＢを添加した以外はＣに同じ；Ｅ：分子量マーカ
ー（Ｋ）。

【図３】リガンドアフィニティーで精製したＩＦＮ−α
／β結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す写
真である。粗尿タンパク質（250 リットルの尿より10
ｇ）をＩＦＮ−α２−アガロースまたはＩＦＮ−β−ア
ガロースに付し、カラムを洗浄後ｐＨ2.2 にて結合タン
パク質を溶出した。溶出画分を中和し、一部を非還元条
件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10％）ならびに銀染色により
分析した。レーン：Ａ：粗尿タンパク質（1.5 μｇ）；
Ｂ〜Ｅ：ＩＦＮ−α２−アガロースカラムからの最終カ
ラム洗浄画分（Ｂ）とカラム溶出画分（Ｃ〜Ｅ）、Ｃ：
溶出１（90ng）；Ｄ：溶出２（600ng）；Ｅ：溶出３（1
50ng ）；Ｆ〜Ｈ：ＩＦＮ−β−アガロースカラムから
の溶出画分、Ｆ：溶出１（450ng ）；Ｇ：溶出２（120n
g)；Ｈ：溶出３（45ng）。分子量マーカー（Ｋ）は、右
側に示す。

【図４】¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（見かけの分子量20Ｋ）
とクロスリンクして複合体を形成したのち抗−ＩＦＮ−
α ＭＡｂ No.74-3を用いて免疫沈降を行ない、ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.
5 ％）に付したもののオートラジオグラムを示す写真で
ある。レーン：Ａ、Ｂ：それぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ
−α２非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）でクロスリン
クした粗尿タンパク質（100 μｌ）；Ｃ、Ｄ：それぞれ
過剰量の非標識ＩＦＮ−α２非存在下（Ｃ）または存在
下（Ｄ）でクロスリンクしたＩＦＮ−α２−アガロース
カラムの溶出２（50μｌ）；Ｅ、Ｆ：それぞれ過剰量の
非標識ＩＦＮ−α２非存在下（Ｅ）または存在下（Ｆ）
でクロスリンクしたＩＦＮ−β−アガロースカラムの溶
出２（50μｌ）；Ｇ：分子量マーカー（Ｋ）は、右側に
示す。

【図５】ＩＦＮ−α−アガロースカラムからの尿ＩＦＮ
−α／β結合タンパク質（溶出２、300 μｌ）のサイズ
排除クロマトグラフィーの溶出パターンである。リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に前もって平衡化したスペ
ロース12カラム（１×30cm、ファルマシア（Pharmacia
）社、スウェーデン）で、流量0.5 ml／min にて行な
い、１分間（0.5ml ）の画分を集めた。カラムはＵＶに
より280nm でモニターした。カラムは示した分子量マー
カー（Ｋで表示）にて検量した。30−炭酸脱水素酵素；
67−ウシ血清アルブミン； 150−イムノグロブリン。

【図６】精製ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の一部の非
還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（10％）を示す写真である。ゲルは銀
染色を行なった。レーン：16、17、24〜29：ＩＦＮ−α
−アガロースで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質
を付した図５のスペロース12カラムの16、17および24〜
29の各画分（30μｌ）；26´〜28´：ＩＦＮ−β−アガ
ロースで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質を付し
たスペロース12カラムの26〜28の各画分；Ｌ´：ＩＦＮ
−β−アガロースで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパ
ク質；ＳＢ：サンプル緩衝液；Ｍ：右に示すごとき分子
量マーカー。

【図７】クロスリンクした複合体を抗−ＩＦＮ−α Ｍ
Ａｂ No.74-3⁽²²⁾を用いて免疫沈降したものを電気泳動
したもののオートラジオグラムを示す写真である。レー
ン：Ａ、Ｂ：ＩＦＮ−α２−アガロースで部分精製した
尿ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の一部を、それぞれ過
剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存在下（Ａ）、存在下
（Ｂ）にて ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（10⁶ cpm ）とクロス
リンクしたもの；Ｃ、Ｄ：スペロース12カラム（図５参
照）の画分26の均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質の
一部を用いて前記Ａ、Ｂと同じ手順で行なったもの；
Ｅ、ＦならびにＧ、Ｈ：スペロース12カラムのそれぞれ
画分27ならびに28を用いてＣ、Ｄと同じ手順で行なった
もの。分子量マーカー（Ｋ）は右側に示す。

【図８】競合するＩＦＮの存在または非存在下で ¹²⁵Ｉ
−ＩＦＮ−α２とクロスリンクした均一なＩＦＮ−α／
β結合タンパク質の複合体を電気泳動したもののオート
ラジオグラムを示す写真である。レーン：Ａ〜Ｄ：ＩＦ
Ｎ−α２−アガロースからのＩＦＮ−α／β結合タンパ
ク質のそれぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−αＣ存在下（３
倍、Ａ）、ＩＦＮ−αＢ存在下（33倍、Ｂ）、ＩＦＮ−
α２存在下（670倍、Ｃ）およびＩＦＮ−β存在下（400
倍、Ｄ）でのクロスリンキング；Ｅ：競合するＩＦＮ
非存在下でのクロスリンキング；Ｆ：過剰量（400 倍）
の非標識ＩＦＮ−γ存在下でのクロスリンキング；Ｇ：
分子量マーカー（右側に示す）；Ｈ〜Ｋ：ＩＦＮ−β−
アガロースカラムからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質
のそれぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存在下
（Ｈ）、存在下（670 倍、Ｉ）、ＩＦＮ−β存在下（40
0 倍、Ｊ）およびＩＦＮ−γ存在下（400 倍、Ｋ）での
クロスリンキング；Ｌ： ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２のそれ自
身とのクロスリンキング（レセプター非存在）。

【図９】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮの
抗ウイルス活性の阻害を示すウェルの写真である。ＩＦ
Ｎ活性は右から左方向へと２倍希釈していって、滴定し
た。保護された細胞は、ウェル中暗く見えるが、一方ウ
イルスで溶解した細胞は、明るく見える。配列は以下の
とおりである。 Ａ：標準（Ｓｔｄ）ＩＦＮ−β（右端のウェルで20u/m
l）２倍希釈； Ｂ：前記Ｓｔｄ ＩＦＮ−βプラス中和抗−ＩＦＮ−α
ＭＡｂ No.9-3⁽²²⁾； Ｃ：ＩＦＮ−α２−アガロースおよびスペロース12カラ
ムで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質の画分27中
に存在するリークした（leaked）ＩＦＮ−α２の滴定； Ｄ：スペロース12カラムの画分27中のリークしたＩＦＮ
−α２抗ウイルス活性のＭＡｂ 9-3を用いた中和； Ｅ：Ｓｔｄ ＩＦＮ−β（右端のウェルで20u/ml）２倍
希釈、プラス抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 9-3プラスＩＦＮ
−α／β結合タンパク質（画分27、40ng／ウェル）、Ｉ
ＦＮ−α２−アガロースカラムからのＩＦＮ−α／β結
合タンパク質によるＩＦＮ−βの完全なかつ特異的な阻
害を示す； Ｆ：Ｓｔｄ ＩＦＮ−β（右端のウェルで20u/ml）２倍
希釈； Ｇ：Ｓｔｄ ＩＦＮ−γ（すべてのウェルで10u/ml）プ
ラスＩＦＮ−α２カラムからのＩＦＮ−α／β結合タン
パク質（画分27、40ng）プラス抗−ＩＦＮ−αＭＡｂ 9
-3； Ｈ：Ｓｔｄ ＩＦＮ−γ（右端のウェルで20u/ml）２倍
希釈、プラス抗−ＩＦＮ−α２ ＭＡｂ 9-3； Ｉ：Ｓｔｄ ＩＦＮ−α２（右端のウェルで20u/ml）２
倍希釈、プラス抗−ＩＦＮ−β ポリクローナル抗体プ
ラスＩＦＮ−βアガロース／スペロース12カラムからの
ＩＦＮ−α／β結合タンパク質（画分27、0.4 ng／ウェ
ル未満）、ＩＦＮ−β−アガロースカラムからのＩＦＮ
−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−α２の完全なか
つ特異的な阻害を示す； Ｊ：Ｉと同様のＳｔｄ ＩＦＮ−α２希釈プラス抗−Ｉ
ＦＮ−β ポリクローナル抗体。

【図１０】ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ
−αＢおよびＩＦＮ−αＣの抗ウイルス活性の阻害を示
す（詳細は図９参照）ウェルの写真である。配列は以下
のとおりである。 Ａ：ＩＦＮ−αＢ（右端のウェルで20u/ml）； Ｂ：Ａと同一プラス抗−ＩＦＮ−α２ ＭＡｂ No.9-3
、ＭＡｂがＩＦＮ−αＢを中和しないことを示す； Ｃ：ＩＦＮ−αＣ（右端のウェルで20u/ml）； Ｄ：Ｃと同一プラス抗−ＩＦＮ−α２ ＭＡｂ No.9-3
、ＭＡｂがＩＦＮ−αＣを中和しないことを示す； ウェルＥ１：ＩＦＮ−αＢ（20u/ml）プラスＭＡｂ No.
9-3 プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α
２アガロース／スペロース12カラムの画分27、0.1 μ
ｇ）、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−α
Ｂの完全な阻害を示す； ウェルＥ２：ＩＦＮ−αＣ（20u/ml）プラスＭＡｂ No.
9-3 プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α
２アガロース／スペロース12カラムの画分27、0.1 μ
ｇ）、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−α
Ｃの完全な阻害を示す； ウェルＥ３：ＩＦＮ−β（20u/ml）プラスＭＡｂ No.9-
3 プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α２
アガロース／スペロース12カラムの画分27、0.1 μ
ｇ）、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−β
の完全な阻害を示す； ウェルＥ４〜Ｅ６：ＭＡｂ No.9-3 の存在下、それぞれ
コントロールのＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦ
Ｎ−β（各ウェル 20u／ml）； ウェルＥ７：コントロール、ウイルスのみ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 3/20 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (72)発明者 ダニエラ ノビック イスラエル国、レホボト、ハナッシ ハリ ション ストリート 40

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、そのム
   テイン体および融合タンパク質、それらの塩ならびに機
   能を有する誘導体および活性画分。
2. 【請求項２】 分子量が約40ｋＤである請求項１記載の
   ＩＦＮ−α／β結合タンパク質。
3. 【請求項３】 分子量が約50ｋＤである請求項１記載の
   ＩＦＮ−α／β結合タンパク質。
4. 【請求項４】 Ｎ末端ドメインに配列番号１で示される
   アミノ酸配列を含有する請求項１、２または３記載のＩ
   ＦＮ−α／β結合タンパク質。
5. 【請求項５】 配列番号２で示される内部配列をさらに
   含有する請求項４記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク
   質。
6. 【請求項６】 ヒト体液をクロマトグラフィーのカラム
   に通し、引き続き精製を行なうことによりヒト体液から
   ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を単離することを含んで
   なるＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法。
7. 【請求項７】 ＩＦＮ−α２が結合したクロマトグラフ
   ィーのカラムを用いる請求項６記載の製造法。
8. 【請求項８】 ＩＦＮ−βが結合したクロマトグラフィ
   ーのカラムを用いる請求項６記載の製造法。
9. 【請求項９】 抗−ＩＦＮ−α／β結合タンパク質抗体
   が結合したクロマトグラフィーのカラムを用いる請求項
   ６記載の製造法。
10. 【請求項１０】 体液が、尿である請求項６、７、８ま
    たは９記載の製造法。
11. 【請求項１１】 用いる尿が、未処理の形である請求項
    10記載の製造法。
12. 【請求項１２】 用いる尿が、濃縮尿タンパク質の形で
    ある請求項10記載の製造法。
13. 【請求項１３】 体液が血清である請求項６、７、８ま
    たは９記載の製造法。
14. 【請求項１４】 ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、その
    融合タンパク質およびムテイン体、それらの塩、機能を
    有する誘導体ならびに活性画分をコードするヌクレオチ
    ド配列を含むＤＮＡ分子。
15. 【請求項１５】 請求項14記載のＤＮＡ分子とハイブリ
    ダイズし、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質と同じ生物学
    的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
16. 【請求項１６】 請求項14または15記載のＤＮＡ分子を
    含んでなり、形質転換宿主細胞内でＩＦＮ−α／β結合
    タンパク質または同じ生物学的活性を有するタンパク質
    を発現することのできる複製可能な発現媒体。
17. 【請求項１７】 請求項16記載の発現媒体で形質転換さ
    れた宿主細胞。
18. 【請求項１８】 原核細胞である請求項17記載の形質転
    換宿主細胞。
19. 【請求項１９】 真核細胞である請求項17記載の形質転
    換宿主細胞。
20. 【請求項２０】 請求項17記載の形質転換宿主細胞を培
    養し、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を回収することを
    含んでなる組換え可溶性ＩＦＮ−α／βレセプタータン
    パク質の製造法。
21. 【請求項２１】 請求項１記載の組換えＩＦＮ−α／β
    結合タンパク質。
22. 【請求項２２】 ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を含有
    する、過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが内在的に
    合成されたり、外から投与されたような状態を治療する
    ための医薬組成物。