JP2004254695A

JP2004254695A - インターフェロン−α／β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有する医薬組成物

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Publication number: JP2004254695A
Application number: JP2004090279A
Authority: JP
Inventors: Menachem Rubinstein; ルビンシュタインメナケム; Daniela Novick; ノビックダニエラ
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2004-09-16
Also published as: CA2105449A1; JP3662264B2; AU4609693A; PT588177E; JP3907661B2; ATE189262T1; ES2142840T3; IL106591A0; JPH06220100A; DK0588177T3; DE69327693D1; EP0588177A2; IL106591A; JP2005162762A; DE69327693T2; AU674523B2; EP0588177A3; EP0588177B1; GR3032891T3; CA2105449C

Abstract

【課題】インターフェロン−α／β結合タンパク質、そのムテイン体および融合タンパク質、それらの塩ならびに機能を有する誘導体および活性画分、該タンパク質の製造法、該タンパク質をコードするＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含む発現媒体、該媒体で形質転換された宿主細胞、前記タンパク質の組換え体および前記タンパク質を含有する医薬組成物。
【解決手段】本発明によれば、新規の可溶性ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有する医薬組成物が提供され、過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが存在する状態をともなう疾患などの予防、治療、診断などに有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、インターフェロン−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α／β結合タンパク質）、そのムテイン体および融合タンパク質およびその塩、ならびにそれらの機能を有する誘導体および活性画分、のみならずその製造法およびそれを含有する医薬組成物に関する。

Ｉ型インターフェロン（インターフェロン−αおよびインターフェロン−β、（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β））は、ウイルス感染に対する耐性を付与する能力により規定される、構造的に関連したサイトカインのファミリーの構成要素である。Ｉ型ＩＦＮの他の多くの生物学的活性が報告されており、そのなかには細胞増殖の阻害やクラスＩＭＨＣ抗原の誘導およびその他のいくつかの免疫調節活性⁽¹⁾が含まれる。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、Ｃ型肝炎^(2、3)およびウイルス性疣贅^(4、5)などの種々のウイルス性疾患のみならず毛様細胞性白血病⁽⁶⁾、慢性骨髄性白血病⁽⁷⁾およびカポジ肉腫⁽⁸⁾などのある種の悪性疾患の治療に有用である。

他のサイトカインのばあいと同様に、ＩＦＮ−αはあらゆるＩＦＮ−αのサブタイプのみならずＩＦＮ−βにも特異性を示す細胞表面レセプターと結合することにより、その生物学的活性を発揮する⁽⁹⁾。ヒトＩＦＮ−αのレセプターは同定され、ダウディ（Daudi）細胞よりクローン化された⁽¹⁰⁾。クローン化されたレセプターは１つの膜貫通ドメイン、１つの細胞外ドメインおよび１つの細胞内ドメインをもっていた。マウス細胞中で発現すると、このレセプターによりマウス細胞にヒトＩＦＮ−αＢへの応答性が付与されたが、他のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β種には有意に応答せず、ＩＦＮ−βおよび種々のＩＦＮ−αのサブタイプへの応答にはさらなる成分が関与しているかもしれないことが示唆された。

いくつかの他の研究により、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの結合に関係するさらなる成分またはレセプターサブユニットの存在が示された^{（11〜13）}。さらに前記のレセプター⁽¹⁰⁾が、すべてのＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β種の結合に関与していることが主張された⁽¹⁴⁾。

個々の細胞に結合しているレセプターの細胞外リガンド結合ドメインに対応する可溶性サイトカインレセプターが過去に同定されている。これらの中にはとくにＩＬ−６、ＩＦＮ−γ^{(15、16、17)}、ＴＮＦ⁽¹⁸⁾、ＩＬ−１^(19、20)、ＩＬ−４⁽¹⁹⁾およびＩＬ−２⁽²¹⁾の可溶性のレセプターが含まれる。

免疫疾患の予防、治療、診断などのために有用な、新規なタンパク質が望まれていた。

本発明は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、そのムテイン体および融合タンパク質およびその塩、その機能を有する誘導体ならびに活性画分を提供する。

本明細書中では前記したレセプター⁽¹⁰⁾は「ＩＦＮ−αＲＡ」とよび、その可溶性類縁体は「ｓＩＦＮ−αＲＡ」とよぶ。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、天然のソースから作られてよい。すなわち、健常人もしくは患者からえられた血清または尿のようなヒトの体液由来であってよい。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、組換えＤＮＡ法により作られてもよい。

このように本発明はまたＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法をも提供する。

前記製造法の１つは、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが結合したカラムに体液を通すことによりヒト体液から結合タンパク質を単離し、結合したＩＦＮ−α／β結合タンパク質を溶出することを含んでなる。結合タンパク質はそののち、サイズ排除クロマトグラフィーの工程により均一にまで精製される。

他の方法は、抗ＩＦＮ−α／βレセプター抗体が結合したカラムに体液を通すことによりヒト体液より結合タンパク質を単離し、カラムについた結合タンパク質を溶出することを含んでなる。

好ましくはヒト体液は尿またはヒト血清である。

既知のＩＦＮ−αＲＡの可溶性型とは対照的に、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質はヒトＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βの生物学的活性を阻害する。ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のアミノ酸配列分析により、その配列はＩＦＮ−αＲＡを含む他の既知のタンパク質のいずれとも異なることが明らかになっている。

これらの発見のゆえに本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質がＩＦＮ−α／βレセプターの成分であるかまたは新規ＩＦＮ−α／βレセプターの可溶性型であるということが可能である。

さらに本発明は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、融合タンパク質、ムテイン体またはそれらの活性画分をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含む複製可能な発現媒体、それらで形質転換された宿主および該形質転換宿主の発現によって作られたタンパク質に関する。「ＤＮＡ分子」という語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組合せを含む。

また本発明は、前記ＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子に関する。

また本発明は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を含んでなる、過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが内在的に合成されたり、外から投与されたような状態を治療するための医薬組成物に関する。

本発明によれば、新規の可溶性ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有する医薬組成物が提供される。該タンパク質は、過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが存在するような状態をともなう疾患などの予防、治療、診断などに有用である。

抗ＩＦＮ−αＲＡモノクローナル抗体を用いて、ヒト血清および尿中の既知の⁽¹⁰⁾ＩＦＮ−αレセプターの可溶性型を同定した。ＩＦＮ−α治療中の毛様細胞性白血病患者の血清中には検出可能なレベルのｓＩＦＮ−αＲＡが見出されたが、一方健常人血清中のｓＩＦＮ−αＲＡのレベルは検出限界を下回っていた。このことは、ＩＦＮ治療がｓＩＦＮ−ＲＡの流出または遊離を増大させるかもしれないということを示唆する。健常人コントロールの血清と比較してＩＦＮ−αの治療を受けている患者の血清中には50ＫのＩＦＮ−α結合タンパク質が同様に増大することが観察された。

血清中に見出される可溶性ＩＦＮ−αＲＡは、組換えＩＦＮ−αＲＡに対して作ったモノクローナル抗体21.4を用いて行なったウェスタンブロッティングによって決定したところ分子量55Ｋのタンパク質であった。同じ手法を用いることにより、類似のサイズの可溶性ＩＦＮ−αＲＡがヒトダウディ細胞の培養培地中にも存在することが示唆された。正常尿を用いてえられた結果からは、尿には血清および細胞培養培地中からの可溶性レセプターの分子量よりも約10Ｋ低い分子量を有するｓＩＦＮ−αＲＡが含まれることが示された。

平行した１組の実験で、血清（図１ｃ）および尿（図２ｂ）を¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢ（分子量25Ｋ）とクロスリンクさせ、抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3を用いて免疫沈降を行なった。分子量が約75Ｋ（血清）および約65Ｋ（尿）のＩＦＮ−α結合タンパク質のクロスリンクした産物を認めた。最初はこれらのバンドがすでに既知であるＩＦＮ−αＲＡ⁽¹⁰⁾の可溶型の産物であると想定されたが、単離、分析の結果（下記のとおり）別のタンパク質、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質が血清および尿中に存在することが見出された。

２つのクロマトグラフィーの工程を含む手順によって正常尿からＩＦＮ−α／β結合タンパク質を単離した。粗尿タンパク質を、アガロースにＩＦＮ−α２を結合してなるカラムに付した。カラムを洗浄し、結合タンパク質を低ｐＨで溶出した。そののち溶出タンパク質をサイズ排除ＨＰＬＣによって分離し、種々のタンパク質のピークをえて、26、27、28（図５）の画分に溶出しているそのうちの１つを¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２と特異的に反応しうることより同定した。このタンパク質はさらにＮ−末端ミクロ配列分析により特徴づけを行ない、その結果配列番号１で示される主配列をそのＮ−末端ドメインに有することがわかった。

加えて、主配列のＮ−末端で３つの付加的アミノ酸残基（Ｉｌｅ−ＸＸＸ−Ｔｙｒ）を有するポリペプチドを少量成分として検出した（ＸＸＸは、未同定のアミノ酸を示すが、このアミノ酸は、用いた方法によると検出不能なＣｙｓであると考えられる。このアミノ酸がＳｅｒであることもありうるが可能性はより低い）。前記の結果えられた配列は、既知のＩＦＮ−αＲＡ⁽¹⁰⁾のものと完全に異なっていた。またそれは他の既知タンパク質のいずれの配列とも異なっており、ファストＡ（ＦａｓｔＡ）およびＴファストＡ（ＴＦａｓｔＡ）プログラム⁽²⁴⁾の両方を用いてスイスプロット（Swissprot）およびジーンバンク（Genebank）データライブラリーと比較することにより決定したところ、既知のＤＮＡ配列のいずれによってもコードされていない。よって、これは新規のタンパク質であり、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質とよぶ。この精製ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降により決定したところＭＡｂ 21.4と反応しなかったので、さらにそれが既知のＩＦＮ−αＲＡと相異なることが示された。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のサンプルをブロムシアンで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分離し、これでえられた10Ｋよりも小さなペプチドである消化断片の１つより配列番号２で示される内部配列がえられた（Ｍｅｔが実際の配列の先頭である）。

また結合タンパク質は、ＩＦＮ−βがアガロースに結合されてなるカラムでのクロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーによっても、正常尿から単離された。ＩＦＮ−αアガロース／スペロース12（superose 12）法からの画分26〜29およびＩＦＮ−βアガロース／スペロース12法からの画分26〜28をＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により分析すると、分子量40,000の同一の単一バンドがえられた（図６、それぞれレーン26〜29と26′〜28′）。このように、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βアガロースのいずれかのリガンドアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーの組合せで、いずれのばあいでも均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質がえられた。前記したレセプター⁽¹⁰⁾はＩＦＮ−βとはあまり反応しないので、新規に単離したＩＦＮ−α／β結合タンパク質がその結合特性において既知のレセプターと異なっていることが明白である。

ＩＦＮ−α２アガロースまたはＩＦＮ−βアガロースカラムのいずれかで単離されたＩＦＮ−α／β結合タンパク質の¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２への結合は、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βを含む種々のＩ型ＩＦＮによって阻害されたが、（II型）ＩＦＮ−γによっては阻害されなかった。

均一な尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、その標識リガンド（¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２）への結合能を保持しており、共有クロスリンキングによって分子量60Ｋの複合体を形成した。その分子量はＩＦＮ−α／β結合タンパク質と20ＫのＩＦＮ−α２との１：１複合体に相当する。クロスリンキングの反応に、非標識ＩＦＮ−α２を過剰に添加するとシグナルが消失し、それによって本タンパク質とＩＦＮ−αとの相互作用の特異性が立証された（図７）。

さらに、精製ＩＦＮ−α／β結合タンパク質はＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を阻害したが、ＩＦＮ−γの該活性は阻害せず、このタンパク質が普遍的なＩ型ＩＦＮ結合タンパク質であることが示唆された。かくのごとく、該タンパク質はＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの生物学的活性を妨げるか変化させることのできる有用な薬剤である。均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質がＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）に結合するので、我々はこの相互作用に他のポリペプチドは何ら必要でないと結論している。このようにＩＦＮ−α／β結合タンパク質は自律性ＩＦＮ−α／β結合タンパク質として機能しているように思われ、必ずしも、たとえばＩＦＮ−αＲＡおよびＩＦＮ−α／βレセプターの両方を含んでなるような、もっと複雑なレセプターのサブユニットではない。

これまでに可溶性サイトカインレセプターの生理学的な役割は確証されていない。これらレセプターの２つの生成機作が提案されている：膜結合レセプターのタンパク分解性切断、たとえば可溶性ＩＬ−２Ｒ⁽²⁵⁾ならびにＩＬ−４⁽²⁶⁾およびＩＬ−７⁽²⁷⁾のばあいのようなｍＲＮＡの代替スプライシングである。可溶性レセプターは、その特異的リガンドに結合し、ＴＮＦ系^(28、29)において見られるように生物学的活性を阻害することによるかまたはＩＬ−６系⁽³⁰⁾で立証されるようにそれらの活性を増強することによりそれらの活性を変化させる。組換え可溶性ＴＮＦレセプター（ＴＢＰ−ＴＮＦ結合タンパク質としても知られている）は、動物モデルにおいて敗血のショックを防ぐことが見出され⁽³¹⁾、またＩＬ−１レセプターの可溶型はマウスの同種（異系）移植レシピエントにおける生体内同種（異系）反応性の発生に対する顕著な阻害効果を有することが見出された⁽³²⁾。

同じように本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、ＩＦＮ−α⁽³⁴⁾またはＩＦＮ−βが異常に発現しているたとえばＩ型糖尿病⁽³³⁾および自己免疫疾患、移植拒絶、エイズならびに類似の疾患のようなばあいにＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β活性の調節剤としての使用が見出されうる。このように本タンパク質は過剰のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが内在的に合成されたり外から投与されたりしているようないかなる条件下でも使用されてよい。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質およびそのムテイン体、融合タンパク質、それらの塩、その機能を有する誘導体ならびにその活性画分が、哺乳動物における自己免疫疾患および他の炎症を治療することが示される。

さらに本発明は、製薬上許容しうる担体ならびに本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質またはその活性ムテイン体、融合タンパク質、それらの塩ならびに機能を有するそれらの誘導体または活性画分を含んでなる医薬組成物に関する。

投与法は類似製剤の投与について認められるいずれの方法によることも可能であり、治療の条件に依存する。たとえば静脈内、筋肉、皮下などの局所注射または局所投与、もしくは注入による継続的な投与などが可能である。

本発明の医薬組成物は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質またはその誘導体を製薬上許容しうる担体、安定化剤および賦形剤とともに混合して投与用に調製し、たとえば投薬バイアル内に凍結乾燥品とするなどして投薬形態に調製される。投与すべき活性成分の量は投与経路、治療されるべき疾患および患者の状態に依存するが、１回につき0.1〜１mgである。たとえば局所注射では、静脈内注入よりも体重を基礎としたタンパク量は低値しか必要としないであろう。

ここで用いられる「ムテイン体」という語は、天然のＩＦＮ−α／β結合タンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換されたかまたは削除された、もしくはＩＦＮ−α／β結合タンパク質の天然の配列に１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が付加されたＩＦＮ−α／β結合タンパク質の類縁体であってその結果えられる産物の活性があまり変化していないものをいう。これらムテイン体は、既知の合成および／または部位特異的突然変異誘発技術もしくは他の好適な技術により調製される。

「融合タンパク質」という語は、体液中での残存時間の長い別のタンパク質と融合したＩＦＮ−α／β結合タンパク質またはそのムテイン体を含むポリペプチドをいう。ＩＦＮ−α／β結合タンパク質はこのように別のタンパク質、ポリペプチドなど、たとえばイムノグロブリンまたはその断片と融合されてもよい。

ここで用いられる「塩」という語は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、ムテイン体および融合タンパク質のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は当該技術分野の既知の方法によって作られ、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩などの無機塩およびたとえばトリエタノールアミンのようなアミン類、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどと形成される有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩は、たとえば塩酸または硫酸のような無機酸との塩およびたとえば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩を含む。

ここで用いられる「機能を有する誘導体」は、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質ならびにその融合タンパク質およびムテイン体の誘導体であって、当該技術分野で既知の方法で残基上の側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端基として生じる官能基から調製されてもよく、それらが製薬上許容しうるままである、すなわちタンパク質の活性を破壊せず、それを含む成分が毒性を付与しないような限りにおいて本発明中に含まれる。これらの誘導体としては、たとえば抗原性の部位をマスクしさらに体液中でのＩＦＮ−α／β結合タンパク質の残存を延長しうるポリエチレングリコール側鎖を含んでよい。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪酸エステル、アンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（moiety）（たとえばアルカノイルまたは炭素環アロイル基）とで形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分とで形成される遊離水酸基（たとえばセリンまたはスレオニン残基の水酸基）のＯ−アシル誘導体を含む。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、その融合タンパク質およびそのムテイン体の「活性画分」は、本発明では該タンパク質分子自体またはそれに分子もしくは残基、たとえば糖もしくはリン酸残基が結合したもののポリペプチド鎖のすべての断片または前駆体、あるいはタンパク分子または糖残基自身の凝集物であって該画分が同一の生物学的および／または薬物的活性を有するものをいう。

下記の実施例によって本発明を示すが、もとより本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

材料
患者血清はダンアデルカ（Dan Aderka）博士（イチロフホスピタル（Ichilov Hospital）、テルアビブ、イスラエル）より入手した。正常個体の1000-倍濃縮⁽¹⁵⁾粗尿タンパク質は、セロノラボラトリーズ（Serono Laboratories）（ローマ、イタリア）より入手し、アガロースヒドラジド（シグマ社製）に固定した抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74.3は、前に述べられた⁽²²⁾ように調製しジ−Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミジルスベレート（DSS）はピアス社より入手した。

インターフェロン
組換えＩＦＮ−α２（２×10⁸ユニット／mg）はチューリッヒ大学のシーワイズマン（C.Weismann）博士により提供された。ＩＦＮ−α２はクロラミンＴ法⁽³⁵⁾の変法により標識した。手短に述べると、７μｇのＩＦＮ−α２を１mg／mlのクロラミンＴ存在下で１ｍCiのＮａ¹²⁵Ｉを用いて標識し（氷上、20秒間）４×10⁷cpm／μｇの比活性とした。ＩＦＮ−αＢはチバ−ガイギー社より入手し、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−βはインター−ラボ（Inter-Lab）社、（ネス−ジオナ（Ness-Ziona）、イスラエル）より入手した。

実施例１
ＭＡｂ 21.4を用いたヒト血清および尿のウェスタンブロッティング
正常ヒト血清（ＮＨＳ）、毛様細胞性白血病（ＨＣＬ）血清および粗尿タンパク質のサンプルを、非還元条件下で⁽³⁶⁾ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロース膜（シュライヒャーアンドシュエル（Schleicher and Schuell）社製、0.45μｍ）に25ｍＭトリス、1.92ｍＭグリシン、20％メタノール中、電気的に転写した。転写につづいて膜をブロッキング緩衝液（0.05％ツイーン-20および0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、10％脱脂ミルク）とインキュベートし、組換えＩＦＮ−αＲＡに対して調製した抗−ＩＦＮ−αＲＡ抗体21.4と室温にて２時間インキュベートした。ニトロセルロース膜を0.05％ツイーン-20含有ＰＢＳで洗浄し、¹²⁵Ｉ−ヤギ抗−マウス抗体（ブロッキング緩衝液中0.7×10⁶cpm／ml）と４℃にて一晩インキュベートした。膜を洗浄後、乾燥してオートラジオグラフィーを行なった。

ＨＣＬ血清は、分子量55Ｋの弱いバンドを示し（図１、レーンＣおよびＤ）、一方ＮＨＳ中にはこのようなバンドは認められなかった（図１、レーンＢ）。レーンＢ〜Ｄに見られる高分子量タンパク質（約150Ｋ）はおそらくはイムノグロブリンであろう。

粗尿タンパク質（１μｌ、1000-倍濃縮）の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次に抗−ＩＦＮ−αＲＡＭＡｂ 21.4を用いてウェスタンブロッティングを行なった。分子量45Ｋのタンパク質のバンドを検出した（図２ａ）。同じレーン中に見られる高分子量タンパク質（150Ｋ）は、タンパク質配列分析によってヒトイムノグロブリンであると同定された。これは、1000-倍濃縮尿中、ヒトイムノグロブリンと２次抗体（¹²⁵Ｉ−ヤギ抗−マウス抗体）との交叉反応のために検出されうるものである。

実施例２
未処理血清および尿のクロスリンキングおよび免疫沈降
血清または尿のサンプルを、100倍過剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存在下または存在下で¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢ（300,000cpm）と４℃にて１時間インキュベートした。そののちジメチルスルフォキシド（Ｍｅ₂ＳＯ）中に溶解したＤＳＳを最終濃度が１ｍＭとなるように添加し、混液を４℃にて20分間放置した。１Ｍトリス塩酸ｐＨ7.5および１Ｍ塩化ナトリウムを最終濃度が100ｍＭとなるように添加して反応を停止した。アガロースヒドラジドに固定した抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 74-3⁽²²⁾（25μｌ、７mg／ml）を添加して試料を免疫沈降させた。４℃にて一晩インキュベートしたのち、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２％メルカプトエタノールを含むサンプル用緩衝液中に懸濁して、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィーにて分析した。

免疫沈降をしなくてもＨＣＬ血清中には分子量75Ｋの特異的であるが弱いバンドが認められた（図１、レーンＦ）。クロスリンクした産物を固定化抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 74-3を用いた免疫沈降により濃縮した。実際、おそらく25Ｋの¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢにクロスリンクした50Ｋのタンパク質からなる、中央が75Ｋ近辺の幅広いバンドが、ＨＣＬ血清中に明瞭に認められた（図１、レーンＨおよびＪ）が、ＮＨＳ中には認められなかった（図１、レーンＬ）。過剰の非標識ＩＦＮ−αＢおよびＩＦＮ−α２の両者の存在下のばあいを除き、クロスリンキング実験をくり返してこの結合の特異性を立証した。事実、75Ｋのバンドは有意に減少した（図１、レーンＩおよびＫ）。特異的な（置換可能な）75Ｋのバンドに加えて、いくつかの置換可能でないバンド（50Ｋ、80Ｋ、97Ｋおよび100より大Ｋ）が認められた。80Ｋのバンド（図１、レーンＨ〜Ｍに明瞭に見られる）は75Ｋのバンドと完全には分離されえなかった。

尿の40Ｋのタンパク質のリガンド結合能は、過剰量の非標識ＩＦＮ−αＢの存在下または非存在下にて¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢと未処理尿のサンプルとをインキュベートし、そののちＤＳＳを用いてクロスリンキングすることにより確認した。続いて抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 74-3を用いて免疫沈降して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、分子量65Ｋの特異的なクロスリンキングの産物を検出した（図２ｂ）。この複合体は、血清からえられたものより10Ｋだけ小さかった。

実施例３
ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の単離
製造業者の指示に従って、アフィゲル−10（Affigel−10）（１ml、バイオラッド（BioRad）社製）にＩＦＮ−α２（５mg）を結合させてカラムにつめた。粗尿タンパク質（1000倍濃縮、10ｇ、250ml）を流速0.25ml／minでカラムに付した。カラムは0.5Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）250ml、つぎにＰＢＳ（10ml）を用いて洗浄した。そののち結合したタンパク質（75μｇ）を0.25ｍＭクエン酸ｐＨ2.2で溶出し、直ちに１Ｍ炭酸ナトリウムで中和した。１mlずつ画分を集めた。その画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析し（図３）、タンパク量をフルオレサミンを用いて測定した。種々の画分について、実施例２に述べたように¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２とのクロスリンキング、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行なって分析した。未処理尿中ならびにＩＦＮ−α２−アガロースおよびＩＦＮ−β−アガロースカラムの両方から溶出した画分中にＩＦＮ−α／β結合タンパク質が見出された（図４）。

溶出画分をスペロース12カラム（１×30cm、ファルマシア社、スウェーデン）に一部（0.3ml、11μｇ）付した。カラムはリン酸緩衝性生理食塩水および0.02％アジ化ナトリウムで前もって平衡化しておき、流速0.5ml／minにて溶出し、１分ごとの画分を集めた（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により測定すると40Ｋの均一なタンパク質として画分26〜28（７μｇ）にＩＦＮ−α／β結合タンパク質が溶出した（図６）。250リットルの尿から約25μｇの純粋なタンパク質を回収した。ＩＦＮ−βアガロースカラムに続いてスペロース12カラムを行なって粗尿タンパク質を精製したばあいにも、同様の結果がえられた。

実施例４
タンパク質配列分析
実施例３のスペロース12カラムの画分27（４μｇタンパク質）をＰＶＤＦ膜（プロ−スピン（Pro-Spin）、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社、米国）に吸着させ、その膜をモデル４７５マイクロシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）で、タンパク質配列分析に付した。

配列番号１で示される主配列をえた。

それに加えて前記主配列のＮ−末端で３つの付加的なアミノ酸残基（Ｉｌｅ−ＸＸＸ−Ｔｙｒ）を有する第２のポリペプチドを検出した（ＸＸＸは、未同定のアミノ酸を示すが、このアミノ酸は用いられた方法によると検出不能なＣｙｓであると考えられる。このアミノ酸がＳｅｒであることもありうるが、可能性はより低い）。

えられた配列は、既知のＩＦＮ−αレセプターＡ⁽¹⁰⁾の配列と完全に異なっており、他の既知のタンパク質のいずれとも異なっていた。また、ＦａｓｔＡおよびＴＦａｓｔＡ⁽²⁴⁾のプログラムによってSwissprotおよびGenebankのデータベースを検索して決定したところ、既知のＤＮＡ配列によりコードされるいずれのタンパク質とも異なっていた。このように本タンパク質は、新規のタンパク質であった。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のサンプルをブロムシアンで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰＶＤＦ膜にブロットした。10Ｋより小さい、ペプチドの１つは配列番号２で示される内部配列を与えた（Ｍｅｔが実際の配列の先頭である）。

純粋なｓＩＦＮ−αレセプターはＩＦＮ−αＲＡに対応する配列を含んでいないので、実施例２に述べた尿の結合タンパク質はｓＩＦＮ−αＲＡではないと考えられた。血清中の主たるｓＩＦＮ−αレセプターもＩＦＮ−α／β結合タンパク質であり、ｓＩＦＮ−αＲＡではないという可能性がある。

実施例５
純粋なＩＦＮ−α／β結合タンパク質のクロスリンキングおよび免疫沈降
ＩＦＮ−α２またはＩＦＮ−βカラムで精製した尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク質またはさらにスペロース12カラムで精製した尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク質のサンプルを、100倍過剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存在下または存在下にて¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（10⁶cpm）と４℃で１時間インキュベートした。そののちジメチルスルホキシド（Ｍｅ₂ＳＯ）中に溶解したＤＳＳを最終濃度が１ｍＭとなるように添加し、混液を４℃にて20分間放置した。１Ｍトリス塩酸ｐＨ7.5および１Ｍ塩化ナトリウムを最終濃度が100ｍＭとなるように添加して反応を停止した。アガロースヒドラジドに固定した抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 74-3⁽²²⁾（25μｌ、７mg／ml）を添加して試料を免疫沈降させた。４℃にて一晩インキュベートしたのち、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２％メルカプトエタノールを含むサンプル用緩衝液中に懸濁して、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（7.5％アクリルアミド）、続いてオートラジオグラフィーにて分析した。分子量約60Ｋの特異的なクロスリンク産物がすべての画分に見られ、過剰の非標識ＩＦＮ−α２存在下では完全に消えていた（図７）。

実施例６
クロスリンキング実験における¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２の各種Ｉ型ＩＦＮでの置き換え
均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質（40ng）を３〜670倍過剰量の非標識ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣ、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γの非存在下または存在下で¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（10⁶cpm）と４℃にて１時間インキュベートした。そののちジメチルスルフォキシド（Ｍｅ₂ＳＯ）中に溶解したＤＳＳを最終濃度が１ｍＭとなるように添加し、混液を４℃にて20分間放置した。１Ｍトリス塩酸ｐＨ7.5および１Ｍ塩化ナトリウムを最終濃度が100ｍＭとなるように添加して反応を停止した。アガロースヒドラジドに固定した抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 74-3⁽²²⁾（25μｌ、７mg／ml）を添加して試料を免疫沈降させた。４℃にて一晩インキュベートしたのち、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、２％メルカプトエタノールを含むサンプル用緩衝液中に懸濁して、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（7.5％アクリルアミド）、続いてオートラジオグラフィーにて分析した（図６）。¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２のＩＦＮ−α／β結合タンパク質との結合の阻止において、すべてのＩ型ＩＦＮが等しく有効であることを見出した。この結果より、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質が、前記したＩＦＮ−αＢのみに特異的なＩＦＮ−αＲＡ⁽¹⁰⁾とは異なることが示された。

実施例７
ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β活性の阻害
実験は、ＩＦＮ活性測定に用いられる細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害分析⁽³⁷⁾に基づいて行なった。抗ウイルス活性は、ヒトＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γのＮＩＨ参照標準に対して検量した。下記の手順を用いた：
96−平底ウェルプレート中、10％ＦＣＳ添加ＭＥＭ100μｌ中に20,000細胞／ウェルを播種してＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜細胞、ＡＴＣＣＣＣＬ−25）のコンフルエントな細胞単層を調製した（１日目）。プレートを５％ＣＯ₂存在下、37℃でインキュベートした。２日目に標準ＩＦＮ−β（10μｌ、1000Ｕ／ml）を別のプレート中（65μｌ）に連続的に２倍希釈した。可溶性ＩＦＮ−α／βＲ（10μｌ、４μｇ／ml、ＩＦＮ−αカラムならびにスペロース12カラムにて精製）を標準ＩＦＮ−β希釈液中に添加した。1000Ｕ／mlのＩＦＮ−αを中和するに足る抗−ＩＦＮ−α中和モノクローナル抗体（25μｌ、Ｎｏ．９−３⁽²²⁾）をＩＦＮ−α２アガロースカラムからリークしたＩＦＮ−α２を中和するために各ウェルに加えた。混液を37℃にて90分間放置したのち、ＷＩＳＨ細胞の入ったプレートに移し、直ちに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、50μｌ、220ＰＦＵ／細胞）を用いて攻撃した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。標準ＩＦＮ−βに対して検量し、分析を行なった。３日目、ウイルスの攻撃から約20時間後に、細胞変性効果を顕微鏡下で評点し、単層をクリスタルバイオレットにて染色した（図９）。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性を完全に阻害することが見出された（図７、Ｅ）。阻害の程度に基づいて、最小力価2.5×10⁵抗−ＩＦＮ−βユニット／mgレセプターを計算した。平行した実験で、ＩＦＮ−βカラムで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質によってＩＦＮ−α２を同じように中和した。実験は抗−ＩＦＮ−β中和ポリクローナル抗体存在下で行なった（図９、Ｉ）。別の実験によりＩＦＮ−α／β結合タンパク質は、ＩＦＮ−βを阻害すると同程度にＩＦＮ−αＢおよびＩＦＮ−αＣの抗ウイルス活性を阻害することが明らかになった（図10）。

実施例８
マウスの免疫、細胞融合およびスクリーニング
Ｂａｌｂ／ｃマウスに尿のＩＦＮ−α／β結合タンパク質の均一なサンプル（１μｇ／マウス／インジェクション）を４回注射する。転化ｓＲＩＡ（後述）によって最高の力価を示すマウスを融合用に選択する。脾臓リンパ球をＮＳＯ−１ミエローマ変異（ＮＳＯ）細胞（シーミルスタイン（C.Milstein）、ＭＲＣ、ケンブリッジ、英国により提供）と融合する。転化ｓＲＩＡにより抗−ＩＦＮ−α／βＲ抗体の存在に関してハイブリドーマの上清を調べる。96−ウェルプレートをアフィニティで精製したヤギ抗−マウス抗体で被覆し、続いてハイブリドーマの上清さらに¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α／βＲを添加する。平行して、ＩＦＮ−α／β抗ウイルス活性の中和に関してハイブリドーマを調べる。抗−ＩＦＮ−α／βＲ抗体を分泌していると認められたハイブリドーマを限界希釈法によってクローン化しさらにもう一度クローン化する。

実施例９
ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の組換え生産
組換えＩＦＮ−α／β結合タンパク質を生産するために、ポリペプチドの配列を、配列番号３で示されるペプチド配列（256パーミュテーション）および配列番号４で示されるペプチド配列（192パーミュテーション）に対応する２つのオリゴヌクレオチド配列に逆翻訳する。

プローブを［³²Ｐ］で５′−標識し、遺伝子およびＩＦＮ−α／β結合タンパク質のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含む、遺伝子およびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いる。陽性クローンを単離し、それらの配列を決定し、それらに相補的な配列が含まれていたばあいには、全長のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンを単離するべく、より特異的なプローブとしてそれらを用いる。

単離したｃＤＮＡは、至適なオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘発に付し、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の最後の必須コドンの後ろに終止コドンとポリアデニル化部位を挿入する。そののちこの構築体を当該技術分野においてよく知られている技術⁽³⁸⁾によって適切に構築した発現ベクター内に挿入する。２本鎖のｃＤＮＡをホモポリメリックテイリングまたはリストリクションリンキングにより、合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端ライゲーション法を用いてプラスミドベクターに連結する。ＤＮＡ分子を連結するためにＤＮＡリガーゼを用い、望まない連結を防ぐためにアルカリホスファターゼでＤＮＡ鎖を処理する。

また別の方法としては、配列番号３で示されるペプチドに対応するオリゴヌクレオチドの混合物をオリゴ（ｄＴ）またはｃＤＮＡライブラリーの構築に用いたλファージ内にある２つのフランキング配列のうち１つに対応するオリゴマーと混ぜ合わせる。ｃＤＮＡライブラリー全体からのＤＮＡの鋳型を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーとして混合物を用いる。実施例４で述べたポリペプチドをコードする領域が存在しているかどうかを確認するために、配列を分析することによって増幅したＤＮＡのバンドの特徴づけを行なう。それから、当該技術分野において知られた方法によって、可溶性ＩＦＮ−α／βＲのｍＲＮＡよりなるｃＤＮＡを発現ベクターに導入して組換えタンパク質を生産し、精製する。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質たとえばＩｇＧ₁重鎖の定常部を含むタンパク質の産生は、下記のように行なうことができる：ＩＦＮ−α／β結合タンパク質のＤＮＡを至適なオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘発に付し、コード配列のすぐ後ろに特徴的な制限酵素切断部位を導入する。ＩｇＧ₁重鎖の定常部をもつプラスミド、たとえばｐＲＫＣＯ４₂Ｆｃ₁ ⁽³⁹⁾を同様の部位特異的突然変異誘発に付して、融合タンパク質の方の翻訳がなされるようにＩｇＧ₁重鎖のＡｓｐ216の可能な限り近くに同じ特徴的制限酵素切断部位を導入する。前記の特徴的な制限酵素切断部位で消化することにより、５′非翻訳配列とＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードする配列よりなるｄｓＤＮＡ断片を調製する。変異させたｐＲＫＣＤ４₂Ｆｃ₁も同様に消化して、プラスミドとＩｇＧ₁配列を含む大きな断片を作る。そののち２つの断片を連結して、Ｎ−端にＩＦＮ−α／β結合タンパク質とＩｇＧ₁、重鎖の約227のＣ末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）よりなるポリペプチド前駆体をコードする新規プラスミドを作成する。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適切な制限酵素を用いた消化によってプラスミドより単離し、有効な発現ベクターに挿入することができる。

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、そのムテイン体または融合タンパク質の発現を可能とするために、発現ベクターはまた、遺伝子発現、およびタンパク質の生産が可能となるように所望のタンパク質をコードするＤＮＡに連結した転写および翻訳を調節する情報を含んだ特異的なヌクレオチド配列をも含んでなるものとする。最初に、遺伝子を転写させるために、ポリメラーゼが結合して転写の過程が開始される、ＲＮＡポリメラーゼによる認識が可能なプロモーターを前につけねばならない。このようなプロモーターとして相異なる効率で働く種々のものが用いられている（強いプロモーターや弱いプロモーター）。それらは、原核および真核細胞それぞれに対して相異なる。

本発明において使用可能なプロモーターは、たとえばλバクテリオファージのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターおよびｐＢＲ325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどの構成性プロモーターもしくは、λバクテリオファージの主たる右側および左側プロモーター（Ｐ_LおよびＰ_R）や大腸菌ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｏｍｐＦ、およびｇａｌプロモーターまたはｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーターなどの誘導性プロモーターであってよい（グリック、ビーアール（Glick,B.R.）（1987）J.Ind.Microbiol.1 :277-282）。

大量のｍＲＮＡを作り出す強いプロモーターを使用することのほかに、原核細胞において高レベルの遺伝子発現をなしとげるために、ｍＲＮＡの効率よい翻訳を保証するようにリボソーム−結合部位を用いることも必要である。１つの例としては、開始コドンから16ＳＲＮＡの３′−末端配列と相補的な配列を適性に配置したシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）がある。

真核性宿主のために、宿主の性質によって、異なる転写および翻訳調節配列を用いてもよい。これらの配列は、調節シグナルが高いレベルで発現する特定の遺伝子に結合する、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスおよびＳＶなどのウイルスのソースなどからえてもよい。例としては、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ40初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどがあげられる。遺伝子の発現を調節できるように、抑制および活性化を許容する転写開始調節シグナルを選択してもよい。

本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質もしくはその断片またはそれらのムテイン体もしくは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および作動可能に連結された転写および翻訳調節シグナルからなるＤＮＡ分子を、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体に組み込むことができるベクターに挿入する。それらの染色体へ導入されたＤＮＡを安定に組み込んでいる細胞を選択しうるように、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を許容する１つまたはそれ以上のマーカーを用いる。マーカーは栄養要求性宿主に原栄養性（prototrophy）、たとえば抗生物質または銅などの重金属に対する殺菌耐性（biocide resistance）などであってよい。選択しうるマーカー遺伝子は発現されるべくＤＮＡ遺伝子配列に直接連結されうるか、またはコトランスフェクションによって同じ細胞へ導入されうるかいずれでもよい。追加の要素も一本鎖結合タンパク質ｍＲＮＡを至適に合成するために必要とされるかもしれない。これらの要素は転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルに加えてスプライスシグナルを含んでもよい。このような要素を取り込むｃＤＮＡ発現ベクターにはオカヤマ、エイチ（Okayama,H.）により、（1983）Mol.Cel.Biol.3 :280に記載されたものを含む。

好ましい実施態様では、導入されるＤＮＡ分子はレシピエント宿主（recipient host）において自律複製しうるプラスミドもしくはウイルス性ベクター中に取り込まれる。特定のプラスミドまたはウイルス性ベクターを選択するのに重要な因子には、ベクターを含有するレシピエント細胞を認識し、かつベクターを含有しないレシピエント細胞から選択することができる容易性、特定の宿主における所望のベクターのコピー数、および異なる種の宿主細胞間をベクターが「シャトル」しうることが望ましいかどうかということが含まれる。

好ましい原核性のベクターには、たとえばｐＢＲ322、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ101、ｐＡＣＹＣ184などの大腸菌において複製可能なプラスミドなどのプラスミド（マニアティス（Maniatis）ら、op.cit.参照）、ｐＣ194、ｐＣ221およびｐＴ127などのバチルス属のプラスミド（グリックザン、ティー（Gryczan,T.）、“The Molecular Biology of the Bacilli”，Academic Press,NY（1982）,p307〜329）、ｐＩＪ101を含むストレプトミセス属のプラスミド（ケンダル、ケージェイ（Kendall,K.J.）ら、（1987）J.Bacteriol.169 :4177-4183）、φＣ31などのストレプトミセス属のバクテリオファージ（チャター、ケーエフ（Chater,KF）ら、“Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology”，Akademiai Kaido,Budapest,Hungary（1986）,p45〜54）およびシュードモナス属のプラスミド（ジョン、ジェーエフ（John,J.F.）ら、（1986）Rev.Infect.Dis.8 :693-704）およびイザキ、ケー（Izaki,K.）、（1978）Jpn.J.Bacteriol.33 :729-742参照）が含まれる。

好ましい真核性プラスミドには、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ40、2-ミクロンサークル（2-micron circle）など、またはそれらの誘導体が含まれる。これらのプラスミドは当該技術分野においてよく知られている（ボツシュタイン、ディー（Botstein,D.）ら、（1982）Miami Wint.Symp.19:265-274;ブローチ、ジェイアール（Broach,JR.）、“The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance”，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,p.445〜470（1981）;Broach,J.R.,（1982）Cell 28:203-204;ボロン、ディーピー）（Bollon,D.P.）ら、（1980）J.Clin.Hematol.Oncol.10:39-48;およびマニアティス、ティー（Maniatis,T.）、“Cell Biology:A Comprehensive Treatise,Vol.3:Gene Expression”，Academic Press,NY,p.563〜608（1980）参照）。

一旦、構成体（construct（s））を含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現用に調製されれば、発現ベクターは適した宿主細胞中に、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、接合、原形質融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ダイレクトマイクロインジェクションなどのさまざまな種類の適した手段のいかなるものによって導入してもよい。

本発明に用いられる宿主細胞は原核細胞であってもよいし真核細胞であってもよい。好ましい原核性宿主には、大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、サルモネラ属およびセラチア属などのバクテリアなどが含まれる。最も好ましい原核性宿主は大腸菌である。とくに重要なバクテリア性の宿主には、大腸菌Ｋ12株294（ＡＴＣＣ31446）、大腸菌Ｘ1776（ＡＴＣＣ31537）、大腸菌Ｗ3110（Ｆ^-、ラムダ^-、原栄養性（ＡＴＣＣ27325）、およびネズミチフス菌または霊菌などの腸内細菌、および種々のシュードモナス種が含まれる。このような条件下では、本発明のタンパク質はグリコシル化されない。原核性宿主は発現プラスミドにおいてレプリコンおよび制御配列と適合しなければならない。

しかしながら、本発明のＩＦＮ−α／β結合タンパク質はおそらくグリコシル化されたタンパク質であるので、原核性宿主よりも真核性宿主が好ましい。好ましい真核性宿主はたとえば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。それらの細胞では正しい部位でのグリコシル化に加えて正しい折りたたみ構造形成および正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分子に翻訳後に修飾が与えられるため好ましい。また、酵母細胞および昆虫細胞は高いマンノースグリコシル化を含む翻訳後のペプチドの修飾を行ないうる。強力なプロモーター配列と酵母においておよび昆虫細胞において所望のタンパク質の産生に利用できる多コピー数のプラスミドとを利用する多数の組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母細胞はクローン化された哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を担うペプチドを分泌する。

ベクターを導入後、宿主細胞は、ベクター含有細胞を選択的に生長させる、選択培地で生長させる。クローン化された遺伝子配列の発現により、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質、融合タンパク質またはムテイン体、またはそれらの断片が生産される。ついで、発現されたタンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含むいかなる通常の手順によって、または、カラムにつめられたゲルマトリックス上に固定された抗−ＩＦＮ−α／β結合タンパク質モノクローナル抗体を用いる、アフィニティークロマトグラフィーによって、単離および精製がなされる。前記組換えＩＦＮ−α／β結合タンパク質を含有する粗調製品をカラムに通し、それによって夾雑物は通過するであろうけれどもＩＦＮ−α／β結合タンパク質は特異な抗体によってカラムに結合されるであろう。洗浄後、本発明のタンパク質は高いまたは低いｐＨ、たとえばｐＨ11またはｐＨ２でゲルから溶出される。

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39．Byrn R.A. et al., 1990, Nature (London) 344, 667-670.

［配列の表示］
配列番号：１
配列の長さ：17
配列の型：アミノ酸
起源：ホモサピエンス、尿
配列
Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Arg Thr Phe Lys Ile Arg Leu
1 5 10 15
Arg

配列番号：２
配列の長さ：23
配列の型：アミノ酸
起源：ホモサピエンス、尿
配列
Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu Glu Leu Gln Phe Asp Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln
20

配列番号：３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
起源：ホモサピエンス、尿
配列
Tyr Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu
1 5

配列番号：４
配列の長さ：10
配列の型：アミノ酸
起源：ホモサピエンス、尿
配列
Tyr Thr Asp Glu Ser Arg Thr Phe Lys Ile
1 5 10

（ａ）ヒト血清を電気泳動したのち抗−ＩＦＮ−αＲＡＭＡｂ（No.21.4）を用いてウェスタンブロッティングを行なったものを示す写真である。レーン：Ａ：分子量マーカー（Ｋ）；Ｂ：正常ヒト血清（ＮＨＳ、５μｌ）；ＣおよびＤ：毛様細胞性白血病（ＨＣＬ）患者からの血清（それぞれ５μｌ、１μｌ）。（ｂ）¹²⁵Ｉ−標識−ＩＦＮ−αＢ（見かけの分子量25Ｋ）と体液中のＩＦＮ−α結合タンパク質よりなるクロスリンクされた複合体を電気泳動したもののオートラジオグラムを示す写真である。レーン：Ｅ：分子量マーカー（Ｋ）；Ｆ：¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクしたＨＣＬ患者からの血清（５μｌ）；Ｇ：¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクしたＮＨＳ（５μｌ）。（ｃ）（ｂ）のクロスリンクした複合体を引き続き抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3⁽²²⁾を用いて免疫沈降（Ｉｐｔｎ）を行なったものを電気泳動したもののオートラジオグラムを示す写真である。レーン：Ｈ〜Ｋ：それぞれ非標識物なし（Ｈ、Ｊ）、過剰量の非標識ＩＦＮ−α２存在下（Ｉ）、過剰量の非標識ＩＦＮ−αＢ存在下（Ｋ）で¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクしたＨＣＬ患者からの血清（50μｌ）；ＬおよびＭ：それぞれ非標識物なし（Ｌ）、過剰量の非標識ＩＦＮ−α２存在下（Ｍ）で¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクした正常ヒト血清（50μｌ）；Ｎ：分子量マーカー（Ｋ）。（ａ）尿のｓＩＦＮ−αＲＡを電気泳動したのち抗−ＩＦＮ−αＲＡＭＡｂ No.21.4を用いてウェスタンブロッティングを行なったものを示す写真である。レーン：Ａ：分子量マーカー（Ｋ）；Ｂ：未処理の尿（１μｌ）。（ｂ）¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢと尿ＩＦＮ−α結合タンパク質をクロスリンクして複合体形成後免疫沈降を行なったものを電気泳動したもののオートラジオグラムを示す写真である。レーン：Ｃ：¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−αＢとクロスリンクして抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3⁽²²⁾を用いて免疫沈降した100倍濃縮の尿タンパク質（100μｌ）；Ｄ：クロスリンキングの前に過剰量の非標識ＩＦＮ−αＢを添加した以外はＣに同じ；Ｅ：分子量マーカー（Ｋ）。リガンドアフィニティーで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す写真である。粗尿タンパク質（250リットルの尿より10ｇ）をＩＦＮ−α２−アガロースまたはＩＦＮ−β−アガロースに付し、カラムを洗浄後ｐＨ2.2にて結合タンパク質を溶出した。溶出画分を中和し、一部を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10％）ならびに銀染色により分析した。レーン：Ａ：粗尿タンパク質（1.5μｇ）；Ｂ〜Ｅ：ＩＦＮ−α２−アガロースカラムからの最終カラム洗浄画分（Ｂ）とカラム溶出画分（Ｃ〜Ｅ）、Ｃ：溶出１（90ng）；Ｄ：溶出２（600ng）；Ｅ：溶出３（150ng）；Ｆ〜Ｈ：ＩＦＮ−β−アガロースカラムからの溶出画分、Ｆ：溶出１（450ng）；Ｇ：溶出２（120ng）；Ｈ：溶出３（45ng）。分子量マーカー（Ｋ）は、右側に示す。 ¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（見かけの分子量20Ｋ）とクロスリンクして複合体を形成したのち抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3を用いて免疫沈降を行ない、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.5％）に付したもののオートラジオグラムを示す写真である。レーン：Ａ、Ｂ：それぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−α２非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）でクロスリンクした粗尿タンパク質（100μｌ）；Ｃ、Ｄ：それぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−α２非存在下（Ｃ）または存在下（Ｄ）でクロスリンクしたＩＦＮ−α２−アガロースカラムの溶出２（50μｌ）；Ｅ、Ｆ：それぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−α２非存在下（Ｅ）または存在下（Ｆ）でクロスリンクしたＩＦＮ−β−アガロースカラムの溶出２（50μｌ）；Ｇ：分子量マーカー（Ｋ）は、右側に示す。ＩＦＮ−α−アガロースカラムからの尿ＩＦＮ−α／β結合タンパク質（溶出２、300μｌ）のサイズ排除クロマトグラフィーの溶出パターンである。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に前もって平衡化したスペロース12カラム（１×30cm、ファルマシア（Pharmacia）社、スウェーデン）で、流量0.5ml／minにて行ない、１分間（0.5ml）の画分を集めた。カラムはＵＶにより280nmでモニターした。カラムは示した分子量マーカー（Ｋで表示）にて検量した。30−炭酸脱水素酵素；67−ウシ血清アルブミン；150−イムノグロブリン。精製ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の一部の非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％）を示す写真である。ゲルは銀染色を行なった。レーン：16、17、24〜29：ＩＦＮ−α−アガロースで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質を付した図５のスペロース12カラムの16、17および24〜29の各画分（30μｌ）；26′〜28′：ＩＦＮ−β−アガロースで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質を付したスペロース12カラムの26〜28の各画分；Ｌ′：ＩＦＮ−β−アガロースで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質；ＳＢ：サンプル緩衝液；Ｍ：右に示すごとき分子量マーカー。クロスリンクした複合体を抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.74-3⁽²²⁾を用いて免疫沈降したものを電気泳動したもののオートラジオグラムを示す写真である。レーン：Ａ、Ｂ：ＩＦＮ−α２−アガロースで部分精製した尿ＩＦＮ−α／β結合タンパク質の一部を、それぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存在下（Ａ）、存在下（Ｂ）にて¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２（10⁶cpm）とクロスリンクしたもの；Ｃ、Ｄ：スペロース12カラム（図５参照）の画分26の均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質の一部を用いて前記Ａ、Ｂと同じ手順で行なったもの；Ｅ、ＦならびにＧ、Ｈ：スペロース12カラムのそれぞれ画分27ならびに28を用いてＣ、Ｄと同じ手順で行なったもの。分子量マーカー（Ｋ）は右側に示す。競合するＩＦＮの存在または非存在下で¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２とクロスリンクした均一なＩＦＮ−α／β結合タンパク質の複合体を電気泳動したもののオートラジオグラムを示す写真である。レーン：Ａ〜Ｄ：ＩＦＮ−α２−アガロースからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質のそれぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−αＣ存在下（３倍、Ａ）、ＩＦＮ−αＢ存在下（33倍、Ｂ）、ＩＦＮ−α２存在下（670倍、Ｃ）およびＩＦＮ−β存在下（400倍、Ｄ）でのクロスリンキング；Ｅ：競合するＩＦＮ非存在下でのクロスリンキング；Ｆ：過剰量（400倍）の非標識ＩＦＮ−γ存在下でのクロスリンキング；Ｇ：分子量マーカー（右側に示す）；Ｈ〜Ｋ：ＩＦＮ−β−アガロースカラムからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質のそれぞれ過剰量の非標識ＩＦＮ−α２の非存在下（Ｈ）、存在下（670倍、Ｉ）、ＩＦＮ−β存在下（400倍、Ｊ）およびＩＦＮ−γ存在下（400倍、Ｋ）でのクロスリンキング；Ｌ：¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２のそれ自身とのクロスリンキング（レセプター非存在）。ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮの抗ウイルス活性の阻害を示すウェルの写真である。ＩＦＮ活性は右から左方向へと２倍希釈していって、滴定した。保護された細胞は、ウェル中暗く見えるが、一方ウイルスで溶解した細胞は、明るく見える。配列は以下のとおりである。Ａ：標準（Ｓｔｄ）ＩＦＮ−β（右端のウェルで20u/ml）２倍希釈；Ｂ：前記ＳｔｄＩＦＮ−βプラス中和抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ No.9-3⁽²²⁾；Ｃ：ＩＦＮ−α２−アガロースおよびスペロース12カラムで精製したＩＦＮ−α／β結合タンパク質の画分27中に存在するリークした（leaked）ＩＦＮ−α２の滴定；Ｄ：スペロース12カラムの画分27中のリークしたＩＦＮ−α２抗ウイルス活性のＭＡｂ 9-3を用いた中和；Ｅ：ＳｔｄＩＦＮ−β（右端のウェルで20u/ml）２倍希釈、プラス抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 9-3プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（画分27、40ng／ウェル）、ＩＦＮ−α２−アガロースカラムからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−βの完全なかつ特異的な阻害を示す；Ｆ：ＳｔｄＩＦＮ−β（右端のウェルで20u/ml）２倍希釈；Ｇ：ＳｔｄＩＦＮ−γ（すべてのウェルで10u/ml）プラスＩＦＮ−α２カラムからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質（画分27、40ng）プラス抗−ＩＦＮ−α ＭＡｂ 9-3；Ｈ：ＳｔｄＩＦＮ−γ（右端のウェルで20u/ml）２倍希釈、プラス抗−ＩＦＮ−α２ＭＡｂ 9-3；Ｉ：ＳｔｄＩＦＮ−α２（右端のウェルで20u/ml）２倍希釈、プラス抗−ＩＦＮ−β ポリクローナル抗体プラスＩＦＮ−βアガロース／スペロース12カラムからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質（画分27、0.4ng／ウェル未満）、ＩＦＮ−β−アガロースカラムからのＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−α２の完全なかつ特異的な阻害を示す；Ｊ：Ｉと同様のＳｔｄＩＦＮ−α２希釈プラス抗−ＩＦＮ−β ポリクローナル抗体。ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−αＢおよびＩＦＮ−αＣの抗ウイルス活性の阻害を示す（詳細は図９参照）ウェルの写真である。配列は以下のとおりである。Ａ：ＩＦＮ−αＢ（右端のウェルで20u/ml）；Ｂ：Ａと同一プラス抗−ＩＦＮ−α２ＭＡｂ No.9-3、ＭＡｂがＩＦＮ−αＢを中和しないことを示す；Ｃ：ＩＦＮ−αＣ（右端のウェルで20u/ml）；Ｄ：Ｃと同一プラス抗−ＩＦＮ−α２ＭＡｂ No.9-3、ＭＡｂがＩＦＮ−αＣを中和しないことを示す；ウェルＥ１：ＩＦＮ−αＢ（20u/ml）プラスＭＡｂ No.9-3 プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α２アガロース／スペロース12カラムの画分27、0.1μｇ）、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−αＢの完全な阻害を示す；ウェルＥ２：ＩＦＮ−αＣ（20u/ml）プラスＭＡｂ No.9-3 プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α２アガロース／スペロース12カラムの画分27、0.1μｇ）、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−αＣの完全な阻害を示す；ウェルＥ３：ＩＦＮ−β（20u/ml）プラスＭＡｂ No.9-3 プラスＩＦＮ−α／β結合タンパク質（ＩＦＮ−α２アガロース／スペロース12カラムの画分27、0.1μｇ）、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質によるＩＦＮ−βの完全な阻害を示す；ウェルＥ４〜Ｅ６：ＭＡｂ No.9-3 の存在下、それぞれコントロールのＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣおよびＩＦＮ−β（各ウェル20u／ml）；ウェルＥ７：コントロール、ウイルスのみ。

Claims

ＩＦＮ−α／β結合タンパク質であって、ヒト血清から得ることができ、ヒト血清から得た場合、分子量が約５０ｋＤであるＩＦＮ−α／β結合タンパク質またはその融合タンパク質もしくは塩。
ヒト血清をクロマトグラフィーのカラムに通し、引き続き精製を行なうことによりヒト血清からＩＦＮ−α／β結合タンパク質を単離することを含んでなるＩＦＮ−α／β結合タンパク質の製造法。
ＩＦＮ−α２が結合したクロマトグラフィーのカラムを用いる請求項２記載の製造法。
ＩＦＮ−βが結合したクロマトグラフィーのカラムを用いる請求項２記載の製造法。
抗−ＩＦＮ−α／β結合タンパク質抗体が結合したクロマトグラフィーのカラムを用いる請求項２記載の製造法。
請求項１記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
請求項６記載のＤＮＡ分子を含んでなり、形質転換宿主細胞内でＩＦＮ−α／β結合タンパク質または同じ生物学的活性を有するタンパク質を発現することのできる複製可能な発現媒体。
請求項７記載の発現媒体で形質転換された宿主細胞。
原核細胞である請求項８記載の形質転換宿主細胞。
真核細胞である請求項８記載の形質転換宿主細胞。
請求項８記載の形質転換宿主細胞を培養し、ＩＦＮ−α／β結合タンパク質を回収することを含んでなる組換え可溶性ＩＦＮ−α／βレセプタータンパク質の製造法。
請求項１記載の組換えＩＦＮ−α／β結合タンパク質。
請求項１または１２記載のＩＦＮ−α／β結合タンパク質を含有する医薬組成物であって、糖尿病、自己免疫疾患、移植拒絶およびエイズからなる群より選択される過剰量のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βが内在的に合成されたり、外から投与されたような状態を治療するための医薬組成物。
状態が自己免疫疾患または炎症である請求項１３記載の医薬組成物。