PT588177E - Proteina de ligacao dos interferoes alfa/beta sua preparacao e composicoes farmaceuticas que a contem - Google Patents

Description

Descrição “Proteína de ligação dos interferões α/β, sua preparação e composições farmacêuticas que a contêm” A presente invenção refere-se a uma proteína de ligação dos interferões α/β (proteína de ligação dos EFN-α/β), às suas muteínas e proteínas fundidas e seus sais, seus derivados funcionais e suas fracções activas e também à sua produção e às composições farmacêuticas que a contêm.

Os interferões de tipo I (interferão α e interferão β (IFN-α e IFN-β)) constituem uma família de citoquinas estruturalmente afins definidas pela sua capacidade para conferir resistência contra as infecções virais. Foram já descritas muitas outras actividades biológicas dos IFN de tipo I, incluindo a inibição da proliferação celular, a indução de antigénios do CPH (o mesmo que MHC) de classe I e várias outras actividades imunorreguladoras(1). O IFN-α e o IFN-β são úteis para o tratamento de diversas doenças virais, incluindo a hepatite C e as verrugas virais(4 ;i) e também determinadas doenças malignas, tais como a leucemia das células filamentosas(6), a leucemia mielogenosa crónica(7) e o sarcoma de Kaposi(8j.

Tal como sucede no caso de outras citoquinas, também o IFN-α exerce as suas actividades biológicas ligando-se a um receptor da superfície celular que é específico para todos os subtipos de IFN-α, o mesmo sendo válido para o IFN-β^. Foi identificado um receptor do IFN-α humano e clonado a partir das células de Daudi(l0). O receptor clonado possui um domínio transmembranar singular, um domínio extracelular e um domínio intracelular. Ao ser

expresso em células de murinos, este receptor confere-lhes reactividade ao IFN-αΒ humano, mas não confere reactividade significativa a outras espécies de IFN-α e IFN-β, significando isso que pode haver outros componentes implicados na resposta ao IFN-β e a diversos sub-tipos de IFN-a.

Foram efectuados outros estudos que permitiram concluir que há componentes complementares ou subunidades receptoras implicadas na ligação do IFN-α e do ΙΡΝ-β(11'13). Além disso, foi objecto de reivindicação o facto de o receptor já descrito (,0) estar implicado na ligação de todas as espécies de IFN-α e IFN-P(14).

Também foram já identificados no passado receptores solúveis das citoquinas que correspondem aos domínios extracelulares dos respectivos receptores associados às células onde se ligam os ligandos. Entre outros refere-se os receptores solúveis de IL-6, EFN-y(15,16,17), FNT (o mesmo que TNF)(18), IL-1(19 20), IL-4(19) e IL-2(2,). A presente invenção proporciona uma proteína de ligação dos IFN-α/β que possui a sequência interna de aminoácidos Met-Val-Lis-Phe-Pro-Ser-De-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln--Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln, uma proteína de fusão que contém a referida proteína, muteínas, derivados funcionais ou fracções activas ou sais de qualquer das substâncias referidas antes e que também se ligam aos IFN-α/β. O receptor(10) anteriormente descrito é aqui designado por “EFN-ocRA” e o seu análogo solúvel é aqui designado por “sIFN-aRA”. A proteína de ligação dos IFN-α/β da presente invenção pode ser produzida a partir de fontes naturais, isto é, pode ser obtida a partir de fluidos humanos, tais como os soros extraídos de pessoas saudáveis ou doentes, ou a partir da urina. 3 A proteína de ligação dos IFN-α/β da presente invenção também pode ser produzida por métodos do ADN recombinante.

Assim, a presente invenção proporciona também métodos para a preparação da proteína de ligação dos IFN-α/β.

Um desses métodos consiste em isolar a proteína de ligação a partir de fluidos humanos, fazendo passar esses fluidos por uma coluna à qual vá acoplar-se o IFN-α ou o IFN-β e efectuando depois a eluição da proteína de ligação dos IFN-α/β acoplados. Depois purifica-se a proteína de ligação até ficar homogénea, num passo de cromatografia de exclusão dimensional. Há outro método que consiste em isolar a proteína de ligação a partir de fluidos humanos, fazendo passar esses fluidos através de uma coluna à qual se vai acoplar o anticorpo anti-receptor dos IFN-α/β e efectuando a eluição da proteína de ligação acoplada.

Os fluidos humanos preferíveis são a urina e o soro de seres humanos.

Ao contrário da forma solúvel do IFN-aRA conhecido, a proteína de ligação dos IFN--α/β inibe as actividades biológicas dos EFN-ct2, IFN-ctB, IFN-aC e IFN-β humanos. A análise da sequência proteica da proteína de ligação dos IFN-α/β permitiu concluir que essa sequência é diferente da sequência de qualquer outras proteína conhecida, incluindo o IFN-aRA. À luz destas conclusões, é possível que a proteína de ligação dos IFN-α/β de acordo com a invenção possa ser um componente do receptor dos EFN-α/β ou uma forma solúvel de um novo receptor dos IFN-α/β. A presente invenção também diz respeito a moléculas de ADN que compreendem a sequência nucleotídica que codifica a proteína de ligação dos EFN-α/β descrita antes, uma proteína de fusão que contém a referida proteína, muteínas, seus derivados funcionais ou suas />4 4 fracções activas, veículos de expressão replicáveis que contêm as referidas moléculas de ADN, hospedeiros transformados com tais transformantes e as proteínas produzidas por expressão desses hospedeiros transformados. A expressão “moléculas de ADN” procura abranger o ADN genómico, o ADNc, o ADN sintético e suas combinações. A invenção também diz respeito às moléculas de ADN que hibridam com as moléculas anteriormente citadas e que codificam proteínas que também se ligam aos IFN-α/β. A invenção ainda diz respeito às composições farmacêuticas que incorporem as proteínas de ligação dos IFN-α/β, referidas antes.

Descrição das Figuras Figura 1 (a) autorradiograma à Western de soros humanos com AcM (o mesmo que MAB) anti-IFN-aRA (n° 21.4). Pistas: - A: indicadores de pesos moleculares (K); B: soro humano normal (SHN, 5pL); C e D: soro retirado de um paciente com leucemia das células filamentosas (LCF, o mesmo que HCL) (respectivamente 5 pL e 1 pL). (b) autorradiograma de complexos interligados constituídos por IFN-αΒ marcado com 125I (peso molecular aparente de 25K) e por uma proteína de ligação do IFN-α em fluidos corporais. Pistas:- E: indicadores de pesos moleculares (K); F: soro (5pL) retirado de um paciente com LCF interligado com 125I-IFN-aB; G: SHN (5pL) interligado com 123I-IFN-aB. (c) autorradiograma dos complexos interligados de (b), a seguir à imunoprecipitação com o AcM anti-IFN-β n° 74-3(22). Pistas: H-K: soro (50 pL) retirado de pacientes com LCF interligado com 123I-IFN-aB na ausência (pistas H e J) ou na presença de um excesso de IFN--al frio (pista I) ou com excesso de IFN-αΒ frio (pista K). Pistas L e M: soro humano normal 5 (50 pL) interligado com l25I-IFN-ccB na ausência (pista L) ou na presença (pista N) de excesso de EFN-a2 frio; pista N: indicadores de pesos moleculares (K).

Figura 2 (a) autorradiograma à Western do sIFN-aRA de urina com o AcM anti-IFN-aRA n° 21.4. Pistas:- A: indicadores de pesos moleculares (K); B: urina natural (1 pL). (b) autorradiograma de um complexo interligado de proteína de ligação do IFN-a urinário e de l25I-IFN-aB a seguir à Iptç. Pistas:- C: proteínas urinárias concentradas 100 vezes (100 pL) e interligadas ao l2:,I-IFN-aB e imunoprecipitadas com o AcM anti-IFN-α n° 74-3(22); D: idêntica a C, com a excepção de se ter acrescentado um excesso de IFN-αΒ não marcado antes da interligação; E: indicadores de pesos moleculares (K). A figura 3 ilustra o resultado de EGPA-DSS (o mesmo que SDS-PAGE) (electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio) da proteína de ligação dos IFN-α/β purificados por afinidade do ligando. As proteínas urinárias naturais (10 g retirados de 250 L de urina) foram carregadas, em alternativa, em IFN-a2-agarose ou IFN^-agarose, efectuou--se a lavagem das colunas e realizou-se a eluição das proteínas acopladas a pH 2,2. As fracções obtidas por eluição foram neutralizadas e tomadas aliquotas que foram analisadas por EGPA--DSS (10%) em condições não redutoras e efectuando a contrastação com prata. As pistas são:-A: proteínas urinárias naturais (carga de 1,5 pg); B-E: produto de lavagem final da coluna (B) e produtos das eluições a partir de IFN-a2-agarose> C: eluição 1 (90 ng); D: eluição 2 (600 ng); E: eluição 3 (150 ng); F-H: produtos das eluições a partir da coluna do IFN-β:- F: eluição 1 (450 ng); G: eluição 2 (120 ng); H: eluição 3 (45 ng). Os indicadores de pesos moleculares (K) estão indicados do lado direito.

1 ____ A figura 4 mostra um autorradiograma de complexos interligados de I-IFN-a2 (peso molecular aparente de 20K) a seguir à Iptç com o AcM anti-EFN-α n° 74-3 e após a EGPA--DSS (a 7,5%). Pistas: A, B: proteínas urinárias naturais (100 μι) interligadas na ausência (A) ou na presença (B) de um excesso de EFN-a2 não marcado; C, D: eluição 2 (50 pL) da coluna de EFN-oc2-agarose na ausência (C) ou na presença (D) de um excesso de IFN-a2 não marcado; E, F: eluição 2 (50 pL) da coluna de IFN-P-agarose na ausência (E) ou na presença (F) de um excesso de IFN-a2 não marcado; G: indicadores dos pesos moleculares (indicados do lado direito) da pista K. A figura 5 traduz uma cromatografia de exclusão dimensional da proteína urinária de ligação dos IFN-α/β, a partir de uma coluna de IFN-a-agarose (eluição 2, 300 pL) realizada numa coluna carregada com ‘Superose 12’ (1 x 30 cm, Pharmacia, Suécia) previamente equilibrada em solução salina tamponada com fosfato (STP) a trabalhar com um caudal de 0,5 mL/minuto. Efectuou-se a colheita das fracções correspondentes a 1 minuto (0,5 mL). A coluna foi verificada por UV a 280 nm. Calibrou-se a coluna com os indicadores de pesos moleculares assinalados (na pista K): 30 - anidrase carbónica. 67 - albumina de soro de bovino;: 150 - imunoglobulina. A figura 6 traduz os resultados de EGPA-DSS (a 10%) em condições não redutoras, realizada com aliquotas da proteína de ligação dos IFN-α/β purificados. Contrastou-se o gel com prata. As pistas são: carga de proteína de ligação dos EFN-α/β purificada sobre IFN-oc-agarose; pistas 16, 17, 24-29: respectivamente as fracções (30 pL) 16, 17 e 24-28 da coluna de ‘Superose 12’ da figura 5; pistas 26’-28’: respectivamente as fracções 26-28 de uma coluna de ‘Superose 12’ da proteína de ligação dos IFN-α/β purificada com EFN-P-agarose; pista L’: proteína de ligação dos ÍFN-α/β purificada sobre IFN-p-agarose; pista SB: o tampão de amostragem; pista M: indicadores dos pesos moleculares, conforme assinalado do lado direito. A figura 7 ilustra um autorradiograma dos complexos interligados a seguir à Iptç com o AcM anti-IFN-α n° 74-3(22). Pistas: A e B são aliquotas da proteína urinária de ligação dos EFN-α/β, parcialmente purificada sobre IFN-a2-agarose e interligada com l25I-IFN-ot2 (106 cpm) na ausência (pista A) ou na presença (pista B) de um excesso de IFN-a2 não marcado. Pistas C e D: procedimento idêntico aos das pistas A e B executado com aliquotas da proteína de ligação homogénea dos IFN-α/β, provenientes da fracção 26 da coluna de ‘Superose 12’ (ver a figura 5). Pistas E, F e G, H - procedimento idêntico ao realizado para as pistas C e D, mas com as fracções 27 e 28 (respectivamente) da coluna de ‘Superose 12’. Os indicadores de pesos moleculares (K) estão assinalados do lado direito. A figura 8 ilustra um autorradiograma dos complexos interligados da proteína de ligação homogénea dos IFN-α/β com ,25I-EFN-a2 na presença ou na ausência dos IFN qualificados. As pistas são: A - D, interligação da proteína de ligação dos IFN-α/β, proveniente da coluna de IFN-a2-agarose na presença de um excesso de IFN-aC não marcado (3 vezes, pista A); IFN-aB (33 vezes, pista B); IFN-a2 (670 vezes, pista C); IFN-β (400 vezes, pista D); pista E: interligação na ausência dos IFN qualificados ; pista F: interligação na presença de um excesso de 400 vezes de IFN-γ não marcado; pista G: indicadores dos pesos moleculares (assinalados do lado direito); pistas Η - K: interligação da proteína de ligação dos IFN-α/β proveniente da coluna de IFN^-agarose na ausência (pista H) ou na presença de um excesso de IFN-(x2 não marcado (670 vezes, pista I), IFN-β (400 vezes, pista J) e IFN-γ (400 vezes, pista K); pista L: u5l-IFN-a2 interligado com ele próprio (sem receptor).

A figura 9 ilustra a inibição da actividade antiviral dos IFN por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β. Titulou-se a actividade dos IFN por meio de diluições para metade, no sentido da direita para a esquerda. As células protegidas aparecem escuras na cavidade, ao passo que as células lisadas pelo vírus aparecem claras. As linhas identificadas são as seguintes: A. IFN-β padrão (pdr.) (20 u/mL na cavidade mais à direita), diluído para metade. B. IFN-β pdr. conforme indicado antes, mais o AcM neutralizante anti-EFN-α n° 9-3(22). C. Titulação do EFN-a2 derramado presente na fracção 27 da proteína de ligação dos IFN--α/β purificada pelas colunas de IFN-a2-agarose e ‘Superose 12’. D. Neutralização da actividade antiviral do EFN-a2 que escapou na fracção 27 da coluna de ‘Superose 12’ por acção do AcM 9-3. E. EFN-β pdr. (20 u/mL na cavidade mais à direita) diluído para metade, mais o AcM 9-3 anti-IFN-α mais a proteína de ligação do IFN-α/β (fracção 27, 40 ng/cavidade), demonstrando a inibição completa e específica do IFN-β por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β a partir da coluna de IFN-a2-agarose,. F. IFN pdr. (20 u/mL na cavidade mais à direita) diluído para metade. G. IFN-γ pdr. (10 u/mL em qualquer das cavidades) mais a proteína de ligação dos IFN--α/β proveniente da coluna de IFN-a2 (fracção 27,40 ng) mais o AcM anti-IFN-a 9-3. H. IFN-γ pdr. (20 u/mL na cavidade mais à direita) diluído para metade, mais o AcM 9-3 anti-a2. IFN-a2 pdr. (20 u/mL na cavidade mais à direita) diluído para metade mais os anticorpos policlonais anti-IFN-β, mais a proteína de ligação dos IFN-α/β (fracção 27, I. aproximadamente 0,4 ng/cavidade) proveniente das colunas de IFN^-agarose/‘Superose 12’, revelando a inibição completa e especifica do IFN-a2 por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β proveniente da coluna de IFN-P-agarose. J. Diluições de lFN-ot2 pdr. tal como na linha I mais os anticorpos policlonais anti-IFN-β. A figura 10 ilustra a inibição da actividade antiviral do IFN-aB e do DFN-aC por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β. (Para os pormenores veja-se a figura 9).

As linhas indicadas são: A. IFN-aB (20 u/mL na cavidade mais à direita); B. Idêntica à linha A, conjuntamente com o AcM n° 9-3 anti-EFN-a2, comprovando que o AcM não neutraliza o IFN-aB; C. IFN-aC (20 u/mL na coluna mais à direita); D. Idêntica à linha C, conjuntamente com o AcM n° 9-3 anti-EFN-a2, revelando que o AcM não neutraliza o IFN-aC;

Cavidade El: IFN-aB (20 u/mL), mais o AcM n° 9-3, mais a proteína de ligação dos IFN-α/β (fracção 27, proveniente das colunas de IFN-a2-agarose/’Superose 12’, 0,1 pg) revelando a inibição completa do IFN-αΒ por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β.

Cavidade E2: IFN-aC (20 u/mL), mais o AcM n° 9-3, mais a proteína de ligação dos IFN-α/β (fracção 27, proveniente das colunas de EFN-a2-agarose/’Superose 12’, 0,1 pg) revelando a inibição completa do IFN-aC por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β.

Cavidade E3: IFN-β (20 u/mL), mais o AcM n° 9-3, mais a proteína de ligação dos IFN-α/β (fracção 27, proveniente das colunas de BFN-a2-agarose/’Superose 12’, 0,1 pg) revelando a inibição completa do IFN-β por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β. 10

Cavidades E4-E6: contêm respectivamente os IFN-αΒ, IFN-aC e EFN-β de contraprova, (20 u/mL em cada uma) na presença do AcM n° 9-3.

Cavidade E7: apenas o vírus de contraprova.

DESCRICÀO MINUCIOSA DA INVENÇÃO

Procedeu-se à identificação de formas solúveis do receptor conhecido(10) do IFN-α no soro e na urina de seres humanos com a ajuda de anticorpos monoclonais anti-IFN-aRA. Foram observados níveis detectáveis de sIFN-aRA nos soros de pacientes com leucemia das células filamentosas que estavam a ser objecto de tratamento com o IFN-α, ao passo que o nível de sIFN-aRA no soro humano normal estava abaixo do limite de detecção. Isto significa que o tratamento com o IFN pode aumentar a emissão ou libertação de sLFN-aRA(23). Observou--se um aumento idêntico da proteína de ligação do IFN-α de 50K no soro de pacientes tratados com o IFN-α, comparativamente com o soro de indivíduos saudáveis de contraprova. O IFN-aRA solúvel encontrado no soro é uma proteína com um peso molecular de 55K, conforme determinado pelas autorradiografias à Western com o anticorpo monoclonal 21.4, dirigido contra o IFN-aRA recombinante. Utilizando as mesmas técnicas foi possível obter sinais indicativos de que também se encontra presente um IFN-aRA solúvel, de tamanho idêntico, no meio de cultura de células de Daudi humanas. Os resultados obtidos com urina normal indicam que esta contém um sIFN-aRA que possui um peso molecular que é cerca de 10K menor do que o peso molecular do receptor solúvel obtido a partir do soro e do meio de cultura das células.

//

Num conjunto paralelo de experiências efectuou-se a interligação de soro (figura lc) e de urina (figura 2b) com 125I-IFN-aB (peso molecular de 25K) e realizou-se a imunoprecipitação com o AcM n° 74-3 anti-IFN-α. Foram identificados produtos interligados de uma proteína de ligação do IFN-α com pesos moleculares de cerca de 75 K (soro) e cerca de 65K (urina). Inicialmente presumiu-se que estas bandas eram produtos da versão solúvel do já conhecido IFN-aRA(10), mas ao efectuar o isolamento e a análise (ver infra) comprovou-se no entanto que havia outra proteína, a proteína de ligação dos IFN-α/β, presente no soro e na urina.

Isolou-se então a proteína de ligação dos EFN-α/β a partir de urina normal, por um procedimento envolvendo dois passos cromatográficos. Com as proteínas da urina normal carregou-se uma coluna com uma carga de IFN-a2 ligado a agarose. Lavou-se a coluna e efectuou-se a eluição das proteínas acopladas, trabalhando com um valor baixo de pH. Efectuou-se então a resolução das proteínas resultantes da eluição, utilizando para tal a CLER de exclusão dimensional para se obter vários picos proteicos, tendo um deles, observado na eluição das ffacções 26, 27 e 28 (figura 5), sido identificado pela sua capacidade para reagir de forma específica com 123I-IFN-a2. Esta proteína foi ainda caracterizada por análise da mi-crossequência do terminal N que permitiu obter a seguinte sequência principal no seu domínio do terminal N:

Asp-Ser-Pro-Asp-Tir-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lis-lle-Arg-Leu-Arg 1...5. ... 10 .... 15 . .

Além disso, detectou-se um polipeptido que possui mais 3 resíduos aminoácidos (Ile--XXX-Tir) no terminal N da sequência principal, constituindo um componente secundário (XXX designa um aminoácido não identificado, admitindo-se no entanto que esse aminoácido seja Cis, o qual não pode ser detectado pelo método utilizado. Com menor probabilidade também é admissível que esse aminoácido seja Ser). A sequência resultante é totalmente diferente da sequência do conhecido IFN-aRA(10). Também é diferente das sequências de quaisquer outras proteínas conhecidas e não é codificada por nenhuma sequência conhecida de ADN, conforme se determinou comparando-a com os elementos existentes nas bases de dados ‘Swissprot’ e ‘Genebank’, utilizando para o efeito os dois programas informáticos ‘FastA’ e TFastA,(24). Assim sendo, estamos perante uma nova proteína, designada por proteína de ligação dos IFN-α/β. Esta proteína pura de ligação dos IFN-α/β não reagiu com o AcM 21.4 conforme se determinou pelas autorradiografias à Western e por imunoprecipitação, significando isso mais uma vez que é diferente da proteína conhecida IFN-aRA.

Fez-se digerir uma amostra da proteína de ligação dos EFN-α/β com CNBr, efectuou--se a sua resolução sobre EGPA-DSS e a partir de um dos fragmentos de digestão resultantes, que era um péptido com menos de 10K, obteve-se a seguinte sequência interna (o resíduo Met antecede a sequência real):

Met-Val-Lis-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-. . . . 5 . . . . 10 . . . . 15 .

Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln . . . 20 . .23

Também se isolou a proteína de ligação a partir de urina normal por cromatografia numa coluna carregada com IFN-β ligado a agarose, seguindo-se a cromatografia de exclusão dimensional. A análise das fracções 26-29, a seguir ao procedimento envolvendo EFN-a--agarose/Superose 12, e das fracções 26-28, a seguir ao procedimento envolvendo IFN-β--agarose/Superose 12 por EGPA-DSS e contrastação com prata, deu origem à mesma banda singular com o peso molecular de 40 000 (figura 6, respectivamente pistas 26-29 e 26’-28).

Assim, a combinação da cromatografia por afinidade do ligando, quer sobre IFN-a-agarose quer sobre IFN-P-agarose, seguindo-se a cromatografia de exclusão dimensional, proporcionou nos dois casos uma proteína homogénea de ligação dos EFN-α/β. Uma vez que o receptor<10) anteriormente descrito não reage bem com o IFN-β, é evidente que a nova proteína isolada de ligação dos IFN-α/β e diferente do receptor conhecido no que diz respeito às suas propriedades de ligação. A ligação de 125I-IFN-a2 à proteína de ligação do IFN-oc/β, isolada quer na coluna de IFN-a2-agarose quer na coluna de IFN^-agarose, foi inibida por diversos IFN de tipo I, incluindo os IFN-a2, IFN-αΒ, IFN-aC e IFN-β, mas não foi inibida pelo IFN-γ (tipo U). A proteína urinária homogénea de ligação do IFN-α/β manteve a capacidade para se ligar ao seu ligando marcado (123I-IFN-a2), e a seguir à interligação covalente formou-se um complexo com o peso molecular de 60K. Este peso molecular corresponde ao de um complexo à razão de 1:1 da proteína de ligação dos IFN-α/β e do EFN-a2 de 20K. A adição em excesso de IFN-a2 não marcado às reacções de interligação suprimiu o sinal, o que comprova a especificidade da interacção entre esta proteína e o IFN-α (figura 7).

Além do mais, a proteína pura de ligação dos IFN-α/β inibiu a actividade antiviral dos IFN-a2, IFN-αΒ, IFN-aC e IFN-β, mas não a do IFN-γ, o que significa que é uma proteína de ligação dos IFN de tipo I geral. Assim sendo, constitui um agente útil capaz de bloquear ou modular as actividades biológicas do IFN-α e do IFN-β. Uma vez que a proteína homogénea de ligação dos IFN-αβ se liga aos IFN de tipo I (EFN-α e IFN-β), conclui-se que tal ligação não está dependente da associação com qualquer outro polipeptido. Assim, admite--se que a proteína de ligação dos IFN-α/β funcione como uma proteína autónoma de ligação 14 dos IFN-α/β e que não seja necessariamente uma subunidade de um receptor mais complexo, v.g. compreendendo tanto o receptor IFN-aRA como o receptor dos IFN-α/β.

Até ao momento ainda não foi determinada a função fisiológica dos receptores solúveis das citoquinas. Foram já propostos dois mecanismos de formação destes receptores: a clivagem proteolítica do receptor fixado à membrana, v.g. o IL-2R solúvel(25) e a junção alternativa do ARNm, tal como sucede no caso dos IL-4(26) e IL-7(27). Os receptores solúveis ligam-se aos seus ligandos específicos e modulam a sua actividade quer inibindo a actividade biológica, conforme se comprovou no sistema dos FNT (o mesmo que TNF/28’ quer aumentando a sua actividade, conforme se demonstrou com o sistema dos IL-6(30). Descobriu-se que o receptor solúvel e recombinante dos FNT (também designado por proteína de ligação de PTB-FNT (o mesmo que TBP-TNF)) evitava o choque céptico em modelos de animais(3l) e comprovou-se que as formas solúveis do receptor IL-1 possuem efeitos inibitórios profundos sobre o desenvolvimento da alorreactividade in vivo em animais receptores(32) de aloenxertos de murganho. A proteína de ligação dos IFN-α/β também pode ser utilizada como moduladora da actividade dos IFN-α e IFN-β, v.g. na diabetes(33) de tipo I e nas doenças de natureza auto-imunitária, nas rejeições de enxertos, na SIDA e em doenças semelhantes, em que haja uma expressão aberrante do IFN-a(34). Assim, tal proteína pode ser utilizada em todas a doenças em que seja produzido endogenamente um excesso de IFN-α ou IFN-β ou em que esse excesso seja administrado por via exógena. A proteína de ligação dos IFN-α/β e as suas muteínas, proteínas fundidas e seus sais, derivados funcionais e as suas fracções activas são indicados para o tratamento de doenças de natureza autoimunitária e de outras inflamações dos mamíferos.

A presente invenção também diz respeito às composições farmacêuticas constituídas por um veículo farmaceuticamente aceitável e pela proteína de ligação dos IFN-α/β da invenção, ou pelas suas muteínas activas, proteínas fundidas e seus sais, derivados funcionais ou suas fracções activas. O método de administração pode ser realizado segundo qualquer modo de administração aceite para agentes idênticos e irá depender do estado de saúde que se pretenda tratar, v.g., por via intravenosa, intramuscular, subcutânea ou por injecção local ou ainda por aplicação tópica ou de forma contínua por infusão, etc..

As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas para administração misturando a proteína de ligação dos IFN-α/β ou os seus derivados ou veículos, agentes estabilizadores e excipientes fisiologicamente aceitáveis, e são preparadas numa forma de dosagem, v.g. por liofilização, em frascos de doseamento. A quantidade de composto activo que irá ser administrada vai depender da via de administração, da doença que se pretende tratar e do estado de saúde do paciente. Por exemplo, para uma injecção local irá ser necessária uma quantidade de proteína, calculada em relação ao peso corporal, menor do que por infusão intravenosa. O termo “muteínas” aqui utilizado refere-se aos análogos da proteína de ligação dos IFN-α/β em que um ou vários resíduos aminoácidos da proteína natural de ligação dos IFN--α/β são substituídos por resíduos aminoácidos diferentes, ou são mesmo suprimidos, ou aqueles em que um ou vários resíduos aminoácidos são acrescentados à sequência natural da proteína de ligação dos IFN-α/β sem modificar de forma considerável a actividade do produto resultante. Estas muteínas são preparadas por técnicas conhecidas de síntese e/ou por técnicas de mutagenese dirigida ao local ou ainda por meio de quaisquer técnicas adequadas para o efeito. A expressão “proteína fundida” refere-se a um polipeptido constituído pela proteína de ligação dos EFN-α/β ou por uma sua muteína fundida com outra proteína que tenha um período de residência maior nos fluidos corporais. Assim, a proteína de ligação dos IFN-α/β pode ser fundida com outra proteína, com um polipeptido ou com uma substância idêntica, v.g. uma imunoglobulina ou um seu fragmento. O teimo “sais” aqui utilizado abrange tanto os sais de grupos carboxilo como os sais de grupos amino da proteína de ligação dos IFN-α/β, suas muteínas e suas proteínas fundidas, obtidos por adição de ácidos. Os sais de grupos carboxilo podem ser obtidos por métodos conhecidos na especiahdade e compreendem os sais inorgânicos, por exemplo, os sais de sódio, cálcio, amónio, férricos ou de zinco e não só e também os sais derivados de bases orgânicas, tais como os que são formados, por exemplo, com aminas, por exemplo, trietanolamina, arginina ou Usina, piperidina, procaína e não só. Os sais de adição de ácidos compreendem, por exemplo, os sais derivados de ácidos minerais, tais como os seleccionados entre ácido clorídrico ou ácido sulfurico, e os sais derivados de ácidos orgânicos, tais como por exemplo o ácido acético ou o ácido oxábco. A expressão “derivados funcionais” aqui utilizada abrange os derivados da proteína de Ugação dos IFN-α/β e as suas proteínas fundidas e as respectivas muteínas, podendo ser preparados a partir de grupos funcionais que ocorram sob a forma de cadeias secundárias nos resíduos ou nos grupos dos terminais N ou C, por métodos conhecidos na especialidade, considerando-se incorporados na invenção desde que sejam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, não destruam a actividade da proteína nem confiram propriedades tóxicas às composições que os 17 contenham. Estes derivados podem compreender, por exemplo, as cadeias laterais de poli-etileno-glicol que possam dissimular os locais antigénicos e aumentar o período de residência da proteína de ligação dos IFN-α/β nos fluidos coiporais. Como exemplos de outros derivados refere-se os ésteres alifáticos de grupos carboxilo e as amidas de grupos carboxilo por reacção com amónia ou com aminas primárias ou secundárias, os derivados N-acílicos de grupos amino livres dos resíduos aminoácidos formados com radicais acilo (v.g. grupos alcanoílo ou grupos aroílo carbocíclicos) ou os derivados O-acílicos de grupos hidroxilo livres (por exemplo, os obtidos com os resíduos serilo ou treonilo) formados com radicais acilo. A expressão “fracções activas” da proteína de ligação dos IFN-α/β, suas proteínas fundidas e suas muteínas, de acordo com a presente invenção, designa qualquer fragmento ou qualquer precursor da cadeia polipeptídica da molécula proteica por si só ou conjuntamente com moléculas ou resíduos associados que lhes estejam ligados, v.g. os resíduos açúcar ou fosfato, ou os agregados da molécula proteica ou os próprios resíduos açúcar, desde que a referida ffacção tenha a mesma actividade biológica e/ou farmacêutica.

Seguidamente ilustrar-se-á a presente invenção por meio de exemplos não limitativos.

Materiais

Os soros dos pacientes foram fornecidos pelo Dr. Dan Aderka (Ichilov Hospital, Tel--Aviv, Israel). As proteínas urinárias naturais de indivíduos normais, concentradas 1000 vezes(l5), foram obtidas nos Laboratórios Serono de Roma, Itália; os AcM n° 74.3 anti-DFN-α imobilizados sobre agarose com hidrazida (Sigma) foram preparados conforme descrito antes(22); o suberato de di-N-hidroxi-succinimidilo (SDS, o mesmo que DSS) foi fornecido por ‘Pierce’.

Interferões O IFN-a2 recombinante (2xl08 unidades/mg) foi amavelmente fornecido pelo Dr. C. Weismann da Universidade de Zurique. Marcou-se o IFN-a2 de acordo com uma modificação do método (35) da cloramina T. Dito de forma abreviada, marcou-se 7 pg de IFN-α com 1 mCi de Na125! na presença de cloramina T na concentração de 1 mg/mL (20 segundos sobre gelo) até se obter uma actividade específica de 4xl07 cpm/pg. O IFN-αΒ foi adquirido em Ciba--Geigy; os DFN-aC e IFN-β foram fornecidos por Inter-Lab Ltd., Ness-Ziona, Israel. EXEMPLO 1: autorradioerafias à Western para soros e urina de seres humanos com o AcM n°21.4

Submeteu-se amostras de soro humano normal (SHN), de soro de leucemia das células filamentosas (LCF) e de proteínas urinárias naturais, a EGPA-DSS em condições não redutoras(36) e efectuou-se a electrotransferência (em Tris 25 mM, glicina 1,92 mM e com 20% de metanol) para folhas de nitrocelulose (Schleicher e SchuelI, 0,45 pm). A seguir à electrotransferência efectuou-se a incubação da folha com tampão de bloqueio (10% de leite magro em STP que continha 0,05% de Tween 20 e 0,02% de azida de sódio) e a seguir manteve-se durante 2 horas à temperatura ambiente com o anticorpo 21.4 anti-IFN-aRA preparado contra o IFN--aRA recombinante. Lavou-se a folha de nitrocelulose com STP contendo 0,05% de Tween 20 e efectuou-se a incubação de um dia para o outro a 4°C com anti-anticorpos de murganho conjugados na cabra e marcados com 12:,I (0,7zl06 cpm/mL, em tampão de bloqueio). Lavou--se o material transferido, secou-se e autorradiografou-se. O soro de LCF (o mesmo que HCL) revelou uma banda fraca com o peso molecular de 55K (figura 1, pistas C e D), não tendo sido observada tal banda no SHN (figura 1, pista

B). A proteína de elevado peso molecular observada nas pistas B-D (cerca de 150 K) era muito provavelmente imunoglobulina.

Submeteu-se uma amostra de proteínas urinárias naturais (1 pL, concentrada 1000 vezes) a EGPA-DSS , seguindo-se autorradiografias à Western com o AcM 21.4 anti-DFN-aRA. Detectou-se uma banda proteica com o peso molecular de 45K (figura 2a). Identificou-se a proteína de elevado peso molecular observada na mesma pista (150K) pela análise da sequência proteica e pela imunoglobulina humana que foi possível detectar na urina concentrada 10 vezes, devido à interreacção do segundo anticorpo (anti-anticoipos do murganho conjugados na cabra e marcados com 12;>í) com as imunoglobulinas humanas. EXEMPLO 2: interligação e imunoprecipitacão de soro e urina naturais. «2«

Efectuou-se a incubação de amostras de soro ou urina (1 hora a 4°C) com I-IFN-aB, (300 000 cpm) na ausência ou na presença de um excesso 100 vezes superior de IFN-a2 não marcado. A seguir acrescentou-se SDS (o mesmo que DSS), dissolvido em dimetilsulfóxido (Me2SO), até uma concentração final de 1 mM e deixou-se a mistura em repouso durante 20 minutos a 4°C. Interrompeu-se a reacção por adição de Tris-HCl 1 M a pH 7,5 e NaCl 1M até uma concentração final de 100 mM. A imunoprecipitação das amostras teve lugar por adição do AcM 74-3 anti-EFN-a imobilizado sobre agarose com hidrazida (25 pL, 7 mg/mL)^. A seguir à incubação (de um dia para o outro a 4°C) efectuou-se a lavagem das esférulas 3 vezes com STP e colocou-se o produto obtido em suspensão num tampão de amostragem que continha 2% de mercaptoetanol, tendo os sobrenadantes sido analisados por EGPA-DSS a que se seguiu a autorradiografia. 20

Observou-se uma banda específica, embora fraca, com o peso molecular de 75K no soro de LCF, mesmo sem a imunoprecipitação (figura 1, pista F). O produto interligado foi enriquecido por Iptç com o AcM 74-3 anti-IFN-α imobilizado. Com efeito, observou-se nitidamente uma banda larga centrada em tomo de 75K, constituída provavelmente por uma proteína de 50K interligada ao 125I-IFN-aB de 25K nos soros de LCF (pistas H e J), mas não no SHN (pista L). Verificou-se a especificidade desta ligação repetindo as experiências de interligação, mas na presença de um excesso de IFN-αΒ e !FN-a2 frios. Com efeito, a banda de 75K foi significativamente reduzida (pistas I e K). Para além da banda específica de 75K (deslocável), foram observadas algumas bandas não deslocáveis (50, 80, 97 e >100K). Não foi possível resolver completamente a banda de 80K (observada nitidamente nas pistas H-M) a partir da banda de 75K.

Confirmou-se a capacidade da proteína urinária de 40K para se ligar ao ligando incubando uma amostra de urina natural com o 125I-IFN-aB na presença ou na ausência de um excesso de IFN-αΒ não marcado e depois efectuou-se a interligação com SDS. A seguir à Iptç com o AcM 74-3 anti-IFN-α e após a EGPA-DSS detectou-se um produto específico interligado com o peso molecular de 65 K (figura 2b). Este complexo era 10K menor do que aquele que foi obtido a partir do soro. EXEMPLO 3: isolamento de uma proteína de ligação dos IFN-α/β

Acoplou-se IFN-a2 (5 mg) a ‘Affigel-10’ (1 mL, BioRad), em conformidade com as instruções do fabricante, e introduziu-se numa coluna. Com as proteínas urinárias naturais (concentradas 1000 vezes, 10 g, 250 mL) carregou-se a coluna a trabalhar com um caudal de 0,25 mL/minuto. Lavou-se a coluna com 250 mL de NaCl 0,5 M em solução salina

21 tamponada com fosfato (STP) a que se seguiu a lavagem com STP (10 mL). Realizou-se a eluição das proteínas ligadas (75 pg) com ácido cítrico 0,25 M a pH 2,2 que foi imediatamente neutralizado com Na2CC>3 1M. Foram colhidas fracções de 1 mL. Essas fracções foram analisadas por EGPA-DSS e contrastadas com prata (figura 3), tendo sido determinado o teor proteico com fluorescamina. Efectuou-se uma análise das diversas fracções por interligação com 125I-IFN-oc2 e por Iptç, EGPA-DSS e autoiradiografia, conforme descrito no exemplo 2. Descobriu-se a existência de uma proteína de ligação dos IFN-α/β na urina natural e nas fracções resultantes da eluição das colunas de IFN-a2-agarose e IFN-3-agarose (figura 4).

As fracções resultantes da eluição foram aplicadas a uma coluna de ‘Superose 12’ (1 x 30 cm, Pharmacia, Suécia), em aliquotas de 0,3 mL (11 pg). Equilibrou-se previamente a coluna e efectuou-se a eluição com solução salina tamponada com fosfato e azida de sódio (0,02%) com um débito de 0,5 mL/minuto, tendo sido colhidas fracções ao fim de 1 minuto (figura 5). A eluição da proteína dos IFN-α/β teve lugar nas fracções 26-28 (7 pg) sob a forma de uma proteína homogénea de 40K, conforme determinado por EGPA-DSS e contrastação com prata (figura 6). Recuperou-se cerca de 25 pg de proteína pura a partir de 250 L de urina. Foram obtidos resultados idênticos ao purificar proteínas urinárias naturais numa coluna de ΙΡΝ-β-agarose seguida imediatamente por uma coluna de ‘Superose 12’. EXEMPLO 4: análise da sequência proteica

Fez-se adsorver a fracção 27 (4 pg de proteína) da coluna de ‘Superose 12’ do Exemplo 3 sobre uma membrana de ‘PVDF’ (Pro-Spin, Applied Biosystems, EUA) e submeteu-se a membrana a uma análise da sequência proteica, utilizando para tal um microssequenciador de Modelo 475 (Applied Biosystems, EUA). 22

Obteve-se a seguinte sequência principal:

Asp-Ser-Pro-Asp-Tir-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lis-Ile-Arg-Leu-Arg 1...5.. 10 . ... 15 .

Além disso, detectou-se um polipeptido secundário com mais três resíduos amino-ácidos (De-xxx-Tir) no terminal N da sequência principal (o símbolo xxx designa um amino-ácido não identificado, assumindo-se no entanto que se trata do aminoácido Cis que não pode ser detectado pelo método utilizado. Com menor probabilidade admite-se que possa ser o aminoácido Ser). A sequência resultante é completamente diferente a sequência já conhecida do receptor A(10) do DFN-a e é diferente da sequência de qualquer outra proteína conhecida. Também é diferente da sequência de qualquer proteína codificada de uma sequência conhecida de ADN, conforme determinado ao efectuar uma pesquisa nos bancos de dados ‘Swissprot’ e ‘Genebank’ por meio dos programas informáticos ‘FastA’ e ‘TFastA,(24). Assim sendo, esta proteína é uma proteína nova.

Fez-se digerir uma amostra da proteína de ligação dos EFN-α/β com CNBr, efectuou--se a resolução sobre EGPA-DSS e transferiu-se para uma membrana de ‘PVDF’. Um dos péptidos, com menos de 10K, tinha a seguinte sequência interna (Met vem antes da sequência verdadeira):

Met-Val-Lis-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-GIu-Glu-Glu-Leu-GIn-Phe-Asp-Leu-. . . . 5 . . . . 10 . ... 15 .

Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln . . . 20 . .23

Uma vez que o receptor puro de sIFN-α não continha uma sequência correspondente ao IFN-aRA, concluiu-se que a proteína de ligação urinária descrita no exemplo 2 não é 23' sDFN-aRA. Admite-se que o receptor principal do sIFN-α no soro seja também a proteína de ligação dos DFN-α/β e não a sIFN-aRA. EXEMPLO 5: interligação e imunoprecipitação da proteína pura de ligação dos IFN-α/β

Com amostras da proteína urinária de ligação dos IFN-α/β, purificada em colunas de IFN-a2 ou IFN-β, ou ainda mais purificada numa coluna de ‘Superose 12’, efectuou-se a incubação (1 hora a 4°C) com 125I-IFN-a2 (106 cpm) na ausência ou na presença de um excesso 110 vezes maior de IFN-a2 não marcado. Acrescentou-se então SDS dissolvido em dimetil-sulfóxido (Me2SO) até à concentração final de 1 mM e deixou-se a mistura em repouso durante 20 minutos a 4°C. Interrompeu-se a reacção por adição de Tris-HCl 1M a pH 7,5 e NaCl 1M até à concentração final de 100 mM. Realizou-se a imunoprecipitação das amostras por adição do AcM 74-3 anti-IFN-α imobilizado sobre agarose com hidrazida (25 pL, 7 mg/mL)(22). A seguir à incubação realizada de um dia para o outro a 4°C efectuou-se a lavagem das esfé-rulas duas vezes com STP, colocou-se em suspensão em tampão de amostragem que continha mercaptoetanol a 2% e efectuou-se a análise dos sobrenadantes por EGPA-DSS (acrilamida a 7,5%) a que se seguiu a autorradiografia. Observou-se um produto específico interligado com um peso molecular com cerca de 60K em todas as fracções, tendo sido eliminado totalmente na presença de uma quantidade em excesso de IFN-a2 não marcado (figura 7). EXEMPLO 6: deslocamento do l25I-IFN-a2 por accão de diversos IFN de tipo I na experiência de interligação

Efectuou-se a incubação (1 hora a 4°C) da proteína de ligação dos IFN-α/β (40 ng) com 125I-IFN-a (106 cpm) na ausência ou na presença de um excesso 3 670 vezes superior das 24 substâncias IFN-a2, IFN-αΒ, IFN-aC, IFN-β ou IFN-γ não marcadas. Dissolveu-se SDS em dimetilsulfóxido (Me2SO) e acrescentou-se até à concentração final de 1 mM e a seguir deixou-se a mistura em repouso durante 20 minutos a 4°C. Interrompeu-se a reacção por adição de Tris-HCl 1M a pH 7,5 e NaCl 1M até à concentração final de 100 mM. Efectuou-se a imuno-precipitação das amostras por adição de AcM 74-3 anti-DFN-a imobilizado sobre agarose com hidrazida (25 pL, 7 mg/mL)(22). A seguir à incubação efectuada de um dia para o outro a 4°C procedeu-se à lavagem das esférulas duas vezes com STP, colocou-se em suspensão em tampão de amostragem que continha 2% de mercaptoetanol e efectuou-se a análise dos sobre-nadantes por EGPA-DSS (acrilamida a 7,5%) a que se seguiu a autorradiografia (figura 6). Verificou-se que todos os IFN de tipo I eram iguaJmente eficazes na inibição da ligação de 125I-IFN-a2 à proteína de ligação dos IFN-oc/β. Este resultado indica que a proteína de ligação dos EFN-α/β é diferente da substância anteriormente descria IFN-aRA que é específica apenas para o IFN-aB(10). EXEMPLO 7: inibição da actividade dos IFN-α e IFN-β por accão da proteína de ligação dos IFN-oc/β

Esta experiência baseou-se no ensaio de inibição do efeito citopático (ECP) utilizado para medir a actividade(37) dos IFN. Calibrou-se a actividade antiviral em presença de padrões de referência ‘NIH’ das substâncias IFN-a, IFN-β e IFN-γ humanas. Utilizou-se o procedimento a seguir descrito.

Procedeu-se à preparação de monocamadas confluentes de células WISH (ATCC CCL-25) no Io dia, inoculando 20 000 células/cavidade em 100 pL de MEM enriquecido com 10% de SFB (o mesmo que FCS) em placas de 96 cavidades de fundo plano. Efectuou-se a incubação das placas a 37°C em atmosfera com 5% de C02. Ao 2o dia diluiu-se o IFN-β padrão (10 pL, 1000 U/mL) duas vezes sequencialmente numa placa separada (65 pL). Juntou-se ÍFN-a/pR solúvel (10 pL, 4 pg/mL, purificado numa coluna de IFN-α e numa coluna de ‘Superose 12’) às diluições padrão de IFN-β. Juntou-se a cada cavidade o anticorpo monoclonal anti-IFN-α neutralizante (25 pL, n° 9-3(22)) em quantidade suficiente para neutralizar o IFN-a, à razão de 1000 U/mL, com o intuito de neutralizar o IFN-a2 que escapou da coluna de IFN--a2-agarose. Deixou-se a mistura em repouso durante 90 minutos a 37°C e depois transferiu--se para a placa com as células ‘WISH’, seguindo-se imediatamente o estímulo com o vírus da estomatite vesicular (VEV, 50 pL, 220 UFP/célula). Efectuou-se a incubação das placas de um dia para o outro a 37°C. A calibração do ensaio foi realizada em presença de IFN-β padrão. Ao 3o dia, cerca de 20 horas após a estimulação com o vírus, avaliou-se o efeito citopático por via microscópica e contrastou-se a monocamada com violeta-de-cristal (figura 9).

Descobriu-se que a proteína de ligação dos IFN-α/β inibiu completamente a acção antiviral do IFN-β (figura 7, E). Com base na intensidade da inibição calculou-se uma titulação mínima de 2,5 x IO3 unidades de anti-IFN-β por cada miligrama (mg) de receptor. Numa experiência paralela neutralizou-se de forma idêntica !FN-a2 por acção da proteína de ligação dos IFN-α/β que havia sido purificada numa coluna de IFN-β. Realizou-se o teste na presença de anticorpos policlonais anti-IFN-β neutralizantes (figura 9, I). Uma outra experiência revelou que a proteína de ligação dos IFN-α/β inibe a actividade antiviral do IFN-aB e do IFN-aC com a mesma intensidade com que inibe o IFN-β (figura 10).

EXEMPLO 8: imunização de murganhos, fusão celular e pesquisa

Injectou-se murganhos da estirpe Balb/c 4 vezes com uma preparação homogénea de proteína urinária de ligação dos IFN-α/β (1 pg/murganho/injecção). Escolheu-se para fusão o murganho que revelou a mais elevada titulação por meio de um RIEs ( o mesmo que sRIA) invertido (ver infra). Os seus linfócitos esplénicos foram fundidos com células da variante do mieloma NSO-1 (células NSO), amavelmente cedidas por C. Milstein, MRC, Cambridge, R.U.). Testou-se os sobrenadantes do hibridoma para pesquisar a presença de anticorpos anti-IFN-oc/pR por meio de um RIEs invertido. Recobriu-se placas de 96 cavidades com anti-anticorpos de murganho conjugados na cabra e purificados por afinidade, seguindo-se a adição dos sobrenadantes do hibridoma e de I25I-IFN-a/pR. Em simultâneo, confirmou-se que os hibridomas neutralizavam a actividade antiviral dos IFN-α/β. Os hibridomas para os quais se comprovou que segregavam anticorpos anti-IFN-α/β foram clonados e reclonados pela técnica da diluição limitante. EXEMPLO 9: produção recombinante da proteína de ligação dos IFN-α/β

Para a produção recombinante da proteína de ligação dos IFN-α/β retroverteu-se (tradução inversa) a sequência polipeptídica de modo a ser traduzida em duas sequências oligonucleotídicas correspondentes às seguintes sequências peptídicas: 1) Tir-Asp-Ser-Pro-Asp-Tir-Tre-Asp-Glu (256 permutações) 2) T ir-T re-Asp-Glu-Ser-Arg-T re-Phe-Lis-Ile (192 permutações)

Efectuou-se a marcação das sondas em 5’ com [32P] e foram então utilizadas para a pesquisa de bibliotecas genómicas e de ADNc que continham o gene e o ADNc correspondentes ao ARNm da proteína de ligação dos IFN-α/β. Isolou-se os clones positivos, determinou-se as suas sequências e no caso de conterem uma sequência complementar foram utilizados como sondas hibridantes mais específicas para isolar um clone de ADNc correspondente ao ARNm de comprimento completo.

Submeteu-se o ADNc isolado a uma mutagenese dirigida ao local com oligonucleótidos adequados, por forma a inserir um codão de terminação e um local de poliadenilação a seguir ao último codão essencial da proteína de ligação dos IFN-α/β. Depois inseriu-se este arquétipo em vectores de expressão adequadamente construídos por técnicas bem conhecidas na especialidade(38). Ligou-se o ADNc de cadeia dupla aos vectores plasmídicos por técnicas de junção de apêndices homopoliméricos ou por técnicas de ligação restritivas, implicando a utilização de ligadores de ADN sintéticos ou as técnicas de ligação de extremidades a condizer. Foram utilizadas ligases de ADN para ligar as moléculas de ADN, tendo sido evitadas as junções indesejadas por tratamento das cadeias de ADN com fosfatase alcalina.

Em alternativa combina-se a mistura oligonucleotídica correspondente ao péptido 1) com oligo(dT) ou então com um oligómero correspondente a uma das duas sequências flanqueadoras existentes no fago λ, utilizadas para a construção da biblioteca de ADNc. As misturas são utilizadas como iniciadores para uma reacção em cadeia com polimerase (RCP) com uma matriz de ADN proveniente da biblioteca de ADNc integral. As bandas de ADN amplificado foram caracterizadas por análise das sequências para confirmar a presença de uma região que codifica o polipeptido do exemplo 4. Depois introduziu-se o ADNc que compreende o ARNm dos IFN-a^R solúveis num vector de expressão, produziu-se a proteína recombinante e purificou-se por técnicas conhecidas na especialidade. A produção de uma proteína fundida, que compreende a proteína de ligação dos IFN--α/β e v.g. a região constante da cadeia pesada da IgGi, pode ser conseguida conforme a seguir se descreve. Submete-se a proteína de ligação dos IFN-α/β ao ADN a uma mutagenese dirigida ao local com oligonucleótidos adequados, por fornia a que seja introduzido um único local de restrição imediatamente após a sequência codificante. Submete-se um plasmídeo portador da região constante da cadeia pesada da IgGi, v.g. o pRKC042Fc!(39), a uma mutagenese semelhante dirigida ao local, para introduzir o mesmo local único de restrição tão próximo quanto possível de Asp 216 da cadeia pesada de IgGi, de modo a permitir a tradução em fase da proteína fundida. Prepara-se um fragmento de ADNds (o mesmo que dsDNA), constituído por sequências não traduzidas em 5’ e que codificam a proteína de ligação dos IFN-α/β por digestão nos locais únicos de restrição. O pRKCDdaFci mutacionado é igualmente digerido para gerar um fragmento grande que contém as sequências plasmídica e da IgGi. Os dois fragmentos são então ligados para gerarem um novo plasmídeo que codifica um percursor polipeptídico constituído pela proteína de ligação dos IFN-α/β no terminal N e cerca de 227 aminoácidos do terminal C da cadeia pesada da IgGi (região de articulação e domínios CH2 e CH3). É possível isolar o ADN que codifica a proteína fundida a partir do plasmídeo, por digestão com enzimas de restrição adequadas, e inseri-lo depois num vector de expressão eficiente.

Para que seja possível realizar a expressão das proteínas de ligação dos IFN-α/β, suas muteínas ou proteínas fundidas, um vector de expressão deve conter também as sequências nucleotídicas específicas que contêm a informação reguladora transcripcional e traducional ligada ao ADN que codifica a proteína desejada, por forma a permitir a expressão génica e a produção da proteína. Em primeiro lugar, para que o gene seja transcripto, deve ser precedido por um promotor reconhecível pela polimerase do ARN, ligando-se-lhe esta e iniciando pois o processo de transcrição. Presentemente são utilizados diversos promotores deste tipo, os quais funcionam com eficiências diferentes (promotores fortes e fracos). São diferentes para células procarióticas e eucarióticas.

Os promotores utilizáveis na presente invenção podem ser constitutivos, por exemplo, o promotor int do bacteriófago λ, o promotor bla do gene da β-lactamase de pBR322, e o promotor CAT do gene pPR325 da cloranfenicol-acetil-transferase, etc., ou então pode ser induzível, tal como sucede com os promotores procarióticos que compreendem os promotores principais direito e esquerdo do bacteriófago λ (PL e PR), os promotores trp, recA, lacZ, Lací, ompF e gal de E. coli ou o promotor híbrido trp-lac, etc. (Glick, B.R. (1987) J. Ind. Microbiol. 1:277-282).

Para além de serem utilizados promotores fortes para gerar grandes quantidades de ARNm, para se conseguir níveis elevados de expressão génica nas células procarióticas, é necessário utilizar também locais de ligação ribossómicos para garantir que o ARNm seja traduzido eficientemente. Como exemplo refere-se a, sequência de Shine-Dalgamo (Sequência SD) colocada convenientemente a partir do codão de iniciação e complementar da sequência do terminal 3’ do ARN 16S.

No caso dos hospedeiros eucarióticos é possível utilizar diferentes sequências reguladoras transcripcionais e traducionais, dependendo isso da natureza do hospedeiro. Podem ser obtidas a partir de fontes virais, tais como adenovírus, vírus do papiloma dos bovinos, vírus dos símios ou semelhantes, em que os sinais reguladores estão associados a um gene particular que possui um nível elevado de expressão. Como exemplos refere-se o promotor TK do vírus do herpes, o promotor SV40 cuja expressão ocorre mais cedo, o promotor do gene gal4 das leveduras, etc.. É possível seleccionar sinais reguladores do início da transcrição que permitam a repressão e a activação, de modo a que possa ser modulada a expressão dos genes. A molécula de ADN que compreende a sequência nucleotídica que codifica a proteína de ligação dos IFN-α/β da presente invenção, ou os seus fragmentos ou as suas muteínas ou as suas proteínas fundidas, e os sinais reguladores transcrípcionais e traducionais funcionalmente ligados são inseridos num vector que é capaz de integrar as sequências desejadas do gene no cromossoma de uma célula do hospedeiro. Para que seja possível seleccionar as células onde esteja estavelmente integrado o ADN introduzido nos seus cromossomas recorre-se à utilização de um ou vários marcadores que permitam a selecção das células hospedeiras que contêm o vector de expressão. O marcador pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrópico, resistência aos biocidas, v.g. aos antibióticos, ou aos metais pesados, tais como o cobre e não só. O gene marcador seleccionável pode ser ligado directamente às sequências de ADN do gene que se pretende exprimir ou então pode ser introduzido na mesma célula por cotransfecção. Eventualmente poderão ser necessários elementos complementares para uma síntese óptima do ARNm de cadeia singular da proteína de ligação. Estes elementos podem compreender sinais de junção e também promotores de transcrição, intensificadores e sinais de terminação. Os vectores de expressão de ADNc que incorporam tais elementos compreendem os descritos por Okayama, H., (1983) Mol.Cel.Biol. 3:280.

De acordo com uma variante preferencial, a molécula de ADN introduzida irá ser incorporada num plasmídeo ou vector virai capaz de replicação autónoma no hospedeiro destinatário. Os factores relevantes para a selecção de um plasmídeo particular ou de um vector virai são: a facilidade com que as células destinatárias que contêm o vector podem ser 31 reconhecidas e seleccionadas entre as células do hospedeiro destinatário que não contenham o vector; o número de cópias do vector que se pretende obter num hospedeiro particular; e ainda a eventualidade de se pretender “lançar” o vector entre células hospedeiras de espécies diferentes.

Os vectores procarióticos preferidos compreendem os plasmídeos tais como aqueles que são capazes de replicação em E. coli, por exemplo, pBR322, ColEl, pSClOl, pACYC 184, etc. (ver Maniatis et al, op. Cit.); os plasmídeos de bacilos tais como pC194, pC221, pT127, etc. (Giyczan, T., “The Molecular Biology of the Bacilli”, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329); os plasmídeos de Streptomyces incluindo o pIJlOl (Kendall, K.J. et al, (1987) J.Bacteriol. 169:4177-4183); os bacteriófagos de Streptomyces tais como o <j>X31 (Chater, KF. et al, em “Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology”, Akademiai Kaido, Budapest, Hungria (1986), pp. 45-54) e os plasmídeos de Pseudomonas (John, J.F., et al, (1986), Rev. Infect. Dis. 8:693-704 e Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742)

Os plasmídeos eucarióticos preferidos compreendem BPV, vaccinia, SV40, o circulo 2 pm, etc., ou os seus derivados. Tais plasmídeos são bem conhecidos na especialidade (Botstein, D., et al, (1982) Miami WintSymp. 19:265-274; Broach, JR., em “The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470 (1981); Broach, J.R, (1982) Cell 28:203-204; Bollon, D.P., et al, (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. .10:39-48; Maniatis, T., em “Cell Biology: A Comprehensive Treatise Vol. 3: gene Expression”, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980)).

Depois de o vector, ou a sequência de ADN que contém o(s) arquétipo(s), ter sido preparado para a expressão, é então possível inserir esse vector de expressão numa célula

hospedeira adequada, por qualquer um de diversos meios convenientes, por exemplo, transformação, transfecção, lipofecção, conjugação, fusão de protoplastos, electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, microinjecção directa, etc..

As células hospedeiras utilizáveis na presente invenção podem ser procarióticas ou eucarióticas. Os hospedeiros procarióticos preferidos são as bactérias, tais como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, etc.. O hospedeiro procariótico de maior preferência é Έ. coli. Os hospedeiros bacterianos com interesse particular são seleccionados entre as estirpes 294 K12 de E. coli (ATCC 31446), X1776 de E. coli.(ATCC 31537), W3110 de E. coli (F, λ', prototrópica (ATCC 27325)) e outras espécies de enterobactérias tais como Salmonella typhimurium ou Serratia narcescens e ainda diversas espécies de Pseudomonas. Em tais condições, a proteína não irá ser glicosilada. O hospedeiro procariótico deve ser compatível com as sequências do replicão e de controlo do plasmídeo de expressão.

No entanto, tendo em conta que a proteína de ligação dos IFN-oc/β é provavelmente uma proteína glicosilada, são preferíveis os hospedeiros eucarióticos, comparativamente com os hospedeiros procarióticos. Os hospedeiros eucarióticos preferidos são células de mamíferos, v.g. as células de seres humanos, macacos, murganhos e dos ovários do criceto chinês (OCC, o mesmo que CHO), pois proporcionam modificações pós-traduccionais às moléculas das proteínas, incluindo um desdobramento correcto, uma correcta formação de pontes dissulfureto e também a glicosilação nos locais correctos. As células de leveduras e as células de insectos também podem realizar modificações peptídicas pós-traduccionais, incluindo a glicosilação intensa da manose. Há inúmeras estratégias do ADN recombinante, em que são utilizadas sequências de promotores fortes e um número elevado de cópias de plasmídeos, que podem ser utilizadas para a produção das proteínas desejadas em células de leveduras e de insectos. 7½ 33

As células de leveduras reconhecem sequências líderes em produtos génicos de mamíferos clonados e segregam péptidos portadores das sequências líderes. A seguir à introdução do vector procede-se à criação das células hospedeiras em cultura num meio selectivo que permita efectuar a selecção em termos do crescimento das células que contêm o vector. A expressão das sequências génicas clonadas tem como resultado a produção da proteína de ligação dos IFN-α/β, uma proteína de fusão ou uma sua muteína ou um seu fragmento. A proteína expressa é depois isolada e purificada por qualquer procedimento convencional seleccionado entre extracção, precipitação, cromatografia, electroforese, ou procedimentos análogos, ou por cromatografia por afinidade, utilizando para tal anticorpos monoclonais anti-proteína de ligação dos IFN-α/β imobilizados numa matriz de gel contida numa coluna. Faz-se passar tais preparações impuras, que contêm a referida proteína de ligação recombinante dos IFN-α/β, através de uma coluna onde a proteína de ligação dos IFN-α/β irá ficar acoplada a essa coluna pelo anticorpo específico, passando no entanto as impurezas através da coluna referida. A seguir à lavagem efectua-se a eluição da proteína a partir do gel, para valores de pH elevados ou baixos, v.g. a pHl 1 ou a pH 2.

Referências 1. Taylor, J.L. e Grossberg, S.E. (1990), Recent progress in interferon research: molecular mechanisms of regulation, action, and virus circumvention, Virus Research L5, 1-26. 2. Bisceglie A.M., Martin, P., Kassianides, C., Lisker-Melman, M., Murray, L., Waggoner, J., Goodman, Z., Banks, M.S. e Hoofhagle, J.H. (1989). Recombinant interferon alpha therapy for chronic hepatitis C. A randomized, double-bind, placebo-controlled trail NEJM 321,1506-1510. 3. McDonnel, W.M. e Elta G.H. (1992) Acute Hepatitis C infection: Interferon finally succeeds. Gastroenterology (US), 103:1359-60. 4. Friedman-Kien, A.E., Eron, L.J., Conant, M., Growdon, W., Badiak, H., Bradstreet, P.W., Fedorczyk, D., Trout, R. e Plesse, T.F. (1988), Natural Interferon alfa for treatment of Condylomata Acuminata, J. Am. Med. Assn. 259, 533-538. 5. Mains, J. e Handley, J. (1992) Interferon: Current and future Clinicai Uses in infectious Disease Practice. Int. J. Std. AIDS, 3:4-9. 6. Berman, E., Heller, G., Kempin, S., Gee, T., Tran, L. e Clarkson, B. (1990), Incidence of response and long term follow up in patients with Hairy Cell Leukemia treated with recombinant interferon alfa-2a, Blood 75, 839-845. 7. Talpaz, M., Kantaqian, H.M., McCredie, K.B., Keating, M.J., Trujillo, J. e Gutterman (1987), Clinicai Investigation of human alpha interferon in Chronic Myelogenous Leukemia, Blood 69, 1280-1288. 8. De Wit, R., Schattenkerk, J.K.M.E., Boucher, C.A.B., Bakker, P.J.M., Veenhof, K.H.N. e Danner, S.A. (1988), Clinicai and virological effects of high-dose recombinant-α in disseminated Aids-related Kaposi’s sarcoma, Lancet 2, 1214-1222, 9. Branka, A.A. e Baglioni, C. (1981) Evidence tiiat types I and Π Interferons have different receptors. Nature, 294:768-770.

Referências (continuação) 10. Uze G., Lutfalla, G. e Gresser, I. (1990), genetic transfer of a functional human interferon α receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA, Cell 60, 225-234. 11. Colamonici, O.R. et al. (1990) Characterization of three monoclonal antibodies that recognize the interferon-a2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:7230-7234. 12. Platanias, L.C. et al. (1992) Expression of the IFN-α receptor in hairy cell leukemia, Brit. J. Haematology, 82:541-546. 13. Colaminici, O.R. et al. (1993) Identification of a novel subunit of the type I Interferon receptor localized to human chromosome 21, J. Biol. Chem., 268:10895-10899. 14. Benoit, P. et al. (1993) A monoclonal antibody to recombinant human EFN-α receptor inhibits biologic activity of several species of human IFN-a, IFN-β and IFN-omega, J. Immunol. 150:707-716. 15. Novick, D. Engelmann, H., Wallach, D. e Rubinstein, M. (1989), Soluble cytokine receptors are present in normal human urine, J. Exp. Med. 170, 1409-1414. 16. Novick, D. Engelmann, H., Wallach, D., Leitner, O., Revel, M. e Rubinstein, M. (1990), Purification of soluble cytokine-receptors from normal human urine by ligand--affinity and immuno-affinity chromatography, J. Chromatography 510, 331-337. 17. Novick, D. Engelmann, H., Revel, M., Leitner, O. e Rubinstein, M. (1991), Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELISA, and inhibition of ligand binding, Hydridoma 10, 137-146. 18. Engelmann, H., Novick, D. e Wallach, D. (1990), Two tumor-necrosis-factor binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross reactivity with cell surface tumor-necrosis-factor receptors, J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.

36

Referências (continuação) 19. Maliszewski, C.R. e Fanslow, W.C. (1990), Soluble receptors for IL-1 and IL-4. Biological activity and therapeutic potential. Trends in Biotechnol. 8., 324-329. 20. Eatsgate, J.A., Symons, J.A. e Duff G.W. (1990), Identification of an interleukin-l-beta binding protein in human plasma, FEBS LETTERS 260. 213-216. 21. Marcon, L., Frite, M.E., Kurman, C.C., Jensen, J.C. e Nelson, D.L. (1988), Soluble Tac peptide is present in the urine of normal inidividuals and átomo elevated leveis in patients with adult T-cell leukemia, Clin. Exp. Immunol. 73, 29-33. 22. Novick, D., Eshhar, Z. e Rubinstein, M. (1992), Monoclonal antibodies to human a--interferon and their use for affinity chromatography, J. Immunol. 129, 2244-2247. 23. Novick, D., Cohen, B. e Rubinstein, M. (1992), Soluble IFN-α receptor molecules are present in Body Fluids, FEBS Letters, 314:445-448. 24. Pearson, W.R. e lipman, D.G. (1988), Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:2444-2448. 25. Josimovic-Alasevic, O., Hermann, T. e Diamanstein, T. (1988), Demonstration of two distinct forms of released low-affinity type interleukin-2 receptors, Eur. J. Immunol. 18, 1855-1857. 26. Mosley, B., Beckamn, M.P., March, C. J., Idzerda, R.L., Gimpel, S.D., VandenBos, T., Friend, D., Alpert, A., Anderson, D., Jackson, J., Wignall, J.M., Smith, C., Gallis, B., Sims, J.E., Urdal, D., Widmer, M.B., Cosman, D. e Pari, L.S. (1989), The murine interleukin-4 receptor: molecular cloning and characteiization of secreted and membrane forms. Cell 59,335-348. 27. Goowin, R.G., Friend, D., Ziegler, S.F., March, C.J., Namen, A.E. e Park, L.S. (1990), Cloning of human and murine interleukin-7 receptors: demonstration of a soluble form and homology to a new receptor superfamily, Cell 60, 941-951.

Referências (continuação) 28. Engelmann, H., Aderka, D., Rubinstein, M., Rotman, D. e Wallach, D. (1989), A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity, J. Biol. Chem. 264, 11974-11980. 29. Seckinger, P., Isaaz, S. e Dayer, J.M. (1988), A human inhibitor of tumor necrosis factor alpha, J. Exp. Med. 167,1511-1516. 30. Novick, D., Shulman, L., Chen, L. e Revel, M. (1992), Enhancement of interleukin 6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies, Cytokine 4, 6-11. 31. Lesslauer, W., Taduchi, H., Gentz, R., Shlaeger, E.J., Brocldiaus, M., Grau, G., Piguet, P.F., Pointaire, P., Vassalli, P. e Loetscher, H. (1991), Bioactivty of recombinant human TNF receptor fragments, J. Cell. Biochem. (Suppl. 15F): 115. 32. Fanslow, F.W., Sims, J.E., Sasenfeld, H., Morrisey, P.J., Gillis, S., Dower, S.K. e Widmer, M.B. (1990), Regulation of alloreactivity in vivo by soluble form of the interleukin-1 receptor, Science 248, 739-742. 33. Stewart, T.A. (1993) Induction of type I diabetes by interferon-α in transgenic mice, Science, 260:1942-6. 34. Klippel, J.H., Carrete, S., Preble, D.T., Friedman, R.M. e Grimley P.M. (1985), Serum alpha interferon and lymphocyte inclusions in systemic lupus erythematosus. Annals of the Rheumatic Diseases 44, 104-108. 35. Hunter, M.W. (1978). Radioimmunoassay, In: The Handbok of Experimental Immunology, D.M. Weir (ed.) Oxford: Blackwell Press, pág. 141. 38

Referências (continuação) 36. Laemmli, U.K. (1970), Cleavage of structural protein during the assembly of head bacteriophage T4, Nature 227. 680-685. 37. Rubinstein, S et al. (1981) J. Virol. 37:755-758. 38. Maniatis et ai, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1982. 39. Bym, RA. et al., 1990, Nature (Londres) 344. 667-670.

Lisboa, 21 de Fevereiro de 2000

O Agente Oficiai da Propriedade Industrial

Rua do Salitre, 19S, r/e*Drt. 1250 LISBOA

Claims (25)

1 Reivindicações 1. Proteína de ligação dos IFN-α/β que possui uma sequência interna de aminoácidos Met--Val-Lis-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-GIu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-Glu--Glu-Gln, uma proteína de fusão que contém a referida proteína, suas muteínas, seus derivados funcionais ou suas fracções activas, ou os sais de qualquer uma das substâncias anteriores que ainda se liguem aos IFN-α/β.

2. Proteína de ligação dos IFN-α/β de acordo com a reivindicação 1, a qual possui um peso molecular de cerca de 40 kD.

3. Proteína de ligação dos IFN-α/β de acordo com a reivindicação 1, a qual possui um peso molecular de cerca de 50 kD.

4. Processo para a preparação de uma proteína de ligação dos IFN-α/β de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, o qual consiste em isolar a proteína de ligação a partir de fluidos humanos, fazendo passar esses fluidos através de uma coluna cromatográfica a que se segue a purificação.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que se utiliza uma coluna cromatográfica à qual ficam acoplados os IFN-a2.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que se utiliza uma coluna cromatográfica à qual ficam acoplados os IFN-β. 2

7. Processo de acordo com a reivindicações 4, em que se utilizar uma coluna cromato-gráfica à qual ficam acoplados os anticorpos anti-proteína de ligação dos IFN-α/β.

8. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 a 7, em que o fluido é a urina.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a urina utilizada está no seu estado natural.

10. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a urina utilizada está sob a forma de proteínas urinárias concentradas.

11. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 4 a 7, em que o fluido é o soro.

12. Molécula de ADN que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a proteína de ligação dos IFN-α/β de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, uma proteína de fusão que contém a referida proteína, as suas muteínas, os seus derivados funcionais ou as suas fracções activas.

13. Molécula de ADN que hibrida com a molécula de ADN de acordo com a reivindicação 12 e codifica uma proteína que ainda se liga aos IFN-α/β. <ty 3

14. Veículo de expressão replicável que compreende uma molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 12 ou 13 e que é capaz, numa célula de um hospedeiro transfor-mante, de expressar uma proteína de ligação dos IFN-α/β ou uma proteína que tenha a mesma actividade biológica.

15. Célula hospedeira transformada com um veículo de expressão de acordo com a reivindicação 14.

16. Célula hospedeira procariótica de acordo com a reivindicação 15.

17. Célula hospedeira eucariótica de acordo com a reivindicação 15.

18. Processo para a produção de uma proteína receptora dos IFN-α/β, recombinante e solúvel, o qual consiste em criar em cultura uma célula hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 15 e recuperar depois a proteína de ligação dos IFN-α/β.

19. Proteína de ligação dos IFN-α/β de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de ser uma proteína recombinante.

20. Composição farmacêutica que incorpore a proteína de ligação dos IFN-α/β, uma sua muteína ou um seu derivado funcional ou uma sua fracção activa ou um seu sal de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 òu 19 ou a proteína de ligação dos IFN-α/β produzida de acordo com o processo da reivindicação 18. 4

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, para o tratamento de doenças de natureza autoimunitária e para o tratamento de outras inflamações nos mamíferos.

22. Anticorpo dirigido contra a proteína de ligação dos EFN-α/β de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 ou 19 ou contra a proteína de ligação dos IFN-α/β produzida de acordo com o processo da reivindicação 18.

23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 22, o qual é um anticorpo monoclonal.

24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 22, o qual é um anticorpo policlonal.

25. Hibridoma produtor de um anticorpo de acordo com a reivindicação 23. Lisboa, 21 de Fevereiro de 2000

1 Resumo “Proteína de ligação dos interferões α/β, sua preparação e composições farmacêuticas que a contêm” A invenção proporciona uma proteína de ligação dos interferões-α/β e descreve também a sua preparação e as composições farmacêuticas que a contenham. Lisboa, 21 de Fevereiro de 2000