MXPA05004333A

MXPA05004333A - Antagonistas basados en el receptor il-1 y metodos de elaboracion y uso.

Info

Publication number: MXPA05004333A
Application number: MXPA05004333A
Authority: MX
Inventors: Stahl Neil
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2002-10-28
Filing date: 2003-10-24
Publication date: 2005-08-03
Also published as: BRPI0315652B1; US20090010879A1; IL168050A; JP2006518985A; ATE420970T1; US7927583B2; CN1878871A; CY1110675T1; JP4387309B2; AU2003284895B2; EP1572967B1; CA2502385A1; US7417134B2; CN1878871B; DK1572967T3; AU2003284895A1; US20030143697A1; WO2004039951A3; CA2502385C; LU91680I2

Abstract

La presente invencion proporciona un polipeptido de fusion capaz de enlazar la interleucina 1 (IL-1) para formar un complejo no funcional. Tambien se proporciona una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de fusion y metodos para hacer y usar el polipeptido de fusion.

Description

ANTAGONISTAS BASADOS EN EL RECEPTOR IL-1 Y METODOS ELABORACION Y USO A TECEEEX7ES DI LA INVENCIÓN La f ~rr.il ia C TF de citocinas juega papeles importantes en una aran variedad de procesos fisiológicos que proporcionan aplicacicr.es terapéuticas potenciales tanto para antagonistas come agonistas. -REVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un ob ete de la presente invención es la producción de antaaor.ista de citocina que son útiles en el ratamiento de trastornos o enfermedades relacionadas con la citocina. Otro objeto de la invención es el uso de los antagonistas de citocina descritos para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la citocina. Ct o objeto de la invención es la cons rucción de varios antagonistas de citocina IL-1 específicos llamados Traps IL-1 cada uno tiene diferentes secuencias pero todos son capaces de bloquear el enlace de IL-i a su receptor funcionando de esta manera cono antagonistas IL-1. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: El Trap humano IL-i bloquea ios efectos in vivo de huIL-1 administrado exógenamente . A ratones BALB/c se les dio inyección subcutánea de huIL-1 (0.3 µg/kg) en el tiempo 0. Veinticuatro horas antes de la inyección de huIL-1 los REF: 163061 animales se tratan previamente con ya sea el vehículo o un exceso molar de 150 veces del Trap huIL-1. Dos horas antes del sacrif cio (26 horas) , a los ratones se les vuelve a aplicar la prueba mmunogénica con una segunda inyección de huIL-1 (0.3 ug/kg, s.c.). Se colectan las muestras sanguíneas en varios puntos de tiempo y los sueros se evalúan para niveles de IL-1 (expresados como media +/- SEM; n=5 por grupo) . FIGURA 2: Trap IL-1 humana bloquea los efectos in vivo del IL-1 humano administrado exógenamente . FIGURA 3: Trap IL-1 humana bloquea ios efectos de IL-1 en articulaciones inflamadas. FIGURA 4-5: Trap IL-1 urino reduce la severidad de los síntomas de la artritis en un modelo de artritis inducida por colágeno acelerada por Zimosan (CIA) . FIGURA 6: Varias concentraciones de Trap IL-1 1649 se incuban en presencia de IL-lb humano 5 pM durante la noche a temperatura ambiente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión capaz de enlazar la citocina para formar un complejo no funcional que comprende: (a) una secuencia de nuclectido que codifica una primera fusión del componente de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la porción que se enlaza a la citocina del dominio extracelular del componente especí icamente determinado del receptor de citocina; (b) una secuencia de nucleótido que codifica un segundo componente del polipéptido de fusión que comprende la secuencia de aminoácido de la porción que se enlaza a la citocina del domino extraceiular del componente de transducción de señal de un receptor de citocina; y (c) una secuencia de nucleótido que codifica un tercer componente del polipéptido de fusión que comprende la secuencia de aminoácido de un componente uitimerizado . Por "porción que se enlaza a la citocina" significa que es la t rcicn mínima del dominio extraceiular necesaria para unir la citocina. Es aceptado por aquellos de experiencia en el arte que la característica que la define el receptor de citocina en la presencia de dos dominios de tipo fibronectma que contienen cisteínas canónicas y la caja WSXWS (SEQ ID NO: 26) (Bazan (1990) PNAS 87: 6934-6938) . Las secuencias que codifican los dominios extracelulares del componente de enlace del receptor de citocina y del componente de transducción de señal de receptor de citocina, también pueden usarse para crear el polipéptido de fusión de la invención. Similarmente , secuencias más largas que codifican secuencias más grandes de los componentes del receptor de citocina pueden usarse. Sin embargo, se contempla que fragmentos más pequeños que el dominio extraceiular funcionen para unir la citocina y por lo tanto, la invención contempla polipéptidos de función que comprenden la porción mínima del dominio extracelular para un r la citocina con una porción de unión de citocina. La invención comprende un "componente determinante específico" del receptor de citocina y un "componente de transducción de señal" del receptor de citocina. Sin tener en cuenta la nomenclatura usada para designar un componente o subunidad particular del receptor de citocina, alguien experto en el arte reconocería que el componente o la subunidad del receptor es el responsable de determinar el objetivo celular de la citocina y de esta manera conocerá que componente constituye el "componente determinante específico" . Similarmente , sin tener en cuenta la nomenclatura usada, alguien de experiencia en la técnica conocerá el componente o subunidad del receptor que constituirá el "componente de transducción de señal" . Como se usa en la presente el "componente de transducción de señal" es un componente del receptor nativo que no es el componente determinante específico y que no se une o se une débilmente a la citocina en ausencia del componente determinante específico. En el receptor nativo, el "componente de transducción de señal" puede participar en la señalización. Al preparar la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de la invención, el primero, segundo y tercer componentes del polipéptido de fusión se codifican en una hebra sencilla de nucleótidos que, cuando se expresan en ur_ sistema vector hospedaáor, producen una especie mcnoménca del polipepcido de fusión. Los monómeros de esta manera expresados luego se muí t imeri an debido a las interacciones entre los componentes multimerizantes (los componentes del tercer polipéptidc de fusión) . Al producir los polipéptidos de fusión de esta manera, se evita la necesidad de purificación de mezclas heterodiméricas que resultarían si el primero y el segundo componente se producen como moléculas separadas y luego se mul imerizan. Por ejemplo, la patente de EUA No. 5,470,954 concedida en 28 de Noviembre de 1995, describe la producción de proteínas heterodiméricas que funcionan como antagonistas CKTF o IL-6. Los heterodímeros se purifican de las líneas celulares cotransfectadas con los componentes aDroDiadcs alfa (a) y beta (b) . Los heterodímeros se separan luego de homodímeros usando métodos tales como la elusión pasiva a partir de geles preparativos, no desnaturalizados de poliacrilamida o al usar la cromatografía de intercambió de cationes de alta presión. La necesidad de esta etapa de purificación se evita por los métodos de la presente i ve ción . Además la solicitud internacional PCT WO 96/11213 publicada el 18 de Abril de 1996 titulada inhibidores IL-4 díméricos, establece que el solicitante ha preparado homodímeros en los cuales dos receptores IL-4 se unen por un espaciador poiimérico y han preparado heterodímeros en los cuales un receptor IL-4 se enlaza por un espaciador polimérico a una cadena gama del receptor IL-2. El espaciador polimérico descrito es pol letilenglicol (PEG) . Los 2 componentes del receptor, IL-4 y IL-2R gamma se expresan separadamente y se purifican. Los homodímeros y heterodímeros pegilados se producen entonces al juntar los componentes en conjunto usando reactivos PEG bifuncionales . Esta es una ventaja de la presente invención que evita la necesidad de consumo de tiempo y etapas de purificación y pegilacion costosas. En una modalidad de la invención, la secuencia de nucieótido aue codifica el primer componente está en dirección ascendente de la secuencia de nucieótido que codifica el segundo componente. En otra modalidad de la invención, la secuencia de nucieótido que codifica el primer componente está en dirección descendente de la secuencia de nucieótido que codifica el segundo componente. Pueden prepararse modalidades adicionales de la invención en las cuales el orden el primero, segundo y tercer componentes de polipéptido de fusión se reconfiguran . Por ejemplo, si la secuencia de nucieótido que codifica el primer componente se designa 1, la secuencia de nucieótido que codifica el segundo componente se designa 2, y la secuencia de nucieótido del tercer componente se designa 3, luego el orden de los componentes en el ácido nucleico aislado de la invención como se leen a partir de 5' hasta 3' puede ser cualquiera de las siguientes 6 combinaciones: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; 3,2,1. En modalidades específicas de la invención, la citocina unida per el poiipéptido de fusión es interleucina 1 /IL-1) . En modalidades preferidas de la invención, el componente mul imerizadc comprende un dominio derivado de inrr.ur.oglobul ina . Más específicamente el dominio derivado de globulina puede ser seleccionado del grupo que consiste del domino Fe de IgG, la cadena pesada IgG y la cadena ligera de IgG. Aún más específicamente, el dominio de inmunoglobulma puede ser seleccionado del grupo que consiste del dominio Fe de IgGi o IgG.;, la cadena pesada de IgGi o IgG y la cadena ligera de IgGi o IgG . En otra modalidad, el componente multimerizado puede ser el dominio Fe del cual los primeros 5 aminoácidos (incluyendo la cisteína) se han removido para producir un componente multimerizado referido como Fc(DCl). Alternativamente, el componente multimerizado puede ser un dominio Fe en el cual la cisteína dentro de los 5 primeros aminoácidos se ha substituido por otro aminoácido tal como, per ejemplo, serina o alanina. La presente invención también proporciona polipéptidos de fusión codificados por las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención. Preferiblemente, ios polipéptidos de fusión están en forma multimérica debido a la función del tercer componente, el componente muí imerizante . En una modalidad preferida el muítimerizante es un dímero. Los componentes multimerizantes apropiados son secuencias que codifican una región de articulación de cadena pesada de mmunoglobulma (Takahashi et al. (1SS2) Cell 29:671-679); secuencias de gen de inmunog1obu11na, y porciones de las mismas. En una modalidad preferida de la invención, las secuencias de gen de inmunog1obulina , especialmente una que codifica el domino Fe, se usan para codificar el componente mult imerizante . La presente invención abarca un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención como se describe en la presente. Una modalidad preferida de la invención es una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 que codifica el polipéptido de fusión que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido de fusión forma un multimero que es capaz de unirse a la citocina para formar una complejo no funcional; una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3 que codifica el polipéptido de fusión que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido de fusión forma un multimero que es capaz de unir la citocina para formar un complejo no funcional; y una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5 que codifica el polipéptido de fusión que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6, en donde el polipéptido de fusión forma un multímero que es capaz de unir la citocina para formar un complejo no uncional; así como polipéptidos de fusión codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas arriba. Otras modalidades preferidas de la invención son moléculas aisladas de ácido nucleico que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 que codifican polipéptidos de fusión que tiene las secuencias establecidas en SEQ . ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 respectivamente, en donde cada polipéptido de fusión forma un multímero que puede enlazar al IL-1 para formar un complejo no funcional . También se proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención como se describe en la presente en donde la molécula de ácido nucleico se liga operativamente a una secuencia de control de la expresión. También se proporciona un vector nospedador para la producción de un polipéptido de fusión que comprende el vector de expresión de la invención que se ha introducido dentro de una célula hospedadora adecuada para la expresión del polipéptido de la expresión. La célula hospedadora adecuada puede ser una célula bacteriana tal como E. coli, una célula de levadura tal como Pichia pastoris, una célula insecto tal como Spodoptera frugiperda , o una célula de mamíferos tal como'una célula COS, CKO, 293, BHK o NSO .

La presente invención también proporciona métodos para la producción de polipéptidos de fusión de la invención la hacer crecer células de los sistemas vector hospedador aquí descritos bajo condiciones que permiten la producción del pclipépt do de fusión y la recuperación del polipéptido de fusión así producido. Los heterodímeros sRa.-ß? preparados de conformidad con la presente invención proporcionan Traps efectivos para sus ligandos, el enlace de estos ligandos con esta afinidades en el intervalo picomolar sin provocar intermediarios funcionales. La tecnología aquí descrita se puede aplicar para desarrollar una citocina Trap para cualquier citocina que utilice un componente a que le otorgue especificidad así como un componente ß el cual cuando se enlaza al componente a de especif cidad tiene una mayor afinidad para la citocina que cualquier componente solo. De esta manera los antagonistas de conformidad con la invención incluyen antagonistas de la interleucina 1 (IL-1) . Los dominios extracelulares del vector a y ß se pueden preparar usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica.' Las moléculas del receptor útiles para practicar la presente invención se pueden preparar por clonación y expresión en un sistema de expresión procariótico o eucariótico. El gen receptor recombinante se puede expresar y purificar utilizando cualquier número de métodos. El gen que codifica el factor se puede subclonar en un vector de expresión bacteriano cal como por ejemplo, pero no a manera de limitación a pCPilO. Los factores recombinantes se pueden purificar por cualquier técnica que permita la formación subsecuente de una proteína estable biológicamente activa. Por ejemplo y no a manera de limitación, los factores se pueden recuperar a partir de células como proteínas solubles o como cuerpos de infusión a partir de los cuales se puede extraer cuantitativamente por clorohidrato de guanidinio 8M y diálisis. Con objeto de purificar además los factores, la cromatografía convencional de intercambio de iones, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía por fase inversa, o filtración por gel se pueden usar. Los receptores heterodiméricos sRa:p se pueden preparar por ingeniería usando regiones de fusión conocidas como se describen en la solicitud PCT publicada O 93/10151 que describe la producción de heterodímeros del receptor ß o se pueden preparar por el reticulado de dominios extracelulares por medios químicos. Los dominios utilizados pueden consistir del dominio extracelular completo de ios componentes a y ß o pueden consistir de murantes o fragmentos de los mismos que mantienen su capacidad para formar un complejo con su ligando y otros componentes en el complejo sRa:Pl. En una modalidad de la invención, los dominios extracej.uj.ares se preparan por ingeniería usanao cremalleras por leucmas. Los dominios de cremallera de leucina de los factores de transcripción humanos c-jun y c-fos se han demostrado que forman heterodímeros estables (Busch et al . (1990) Trenes Genetics 6:36-40; Gentz et al. (1985) Science 243:1695-1639) con estequiometría 1:1. Aunque los homodímeros i n-jun también se han demostrado que forman, son alrededor de 1000 veces menos estables que los heterodímeros un-fos. No se han detectado los homodímeros Fos-fos. El dominio de cremallera de leucina de cualquiera de c- un o c-fos se fusiona en la estructura de la terminación C de los dominios solubles o extracelulares de los componentes del receptor antes mencionado por genes quiméricos preparados gené icamente por ingeniería. Las fusiones pueden ser directas o pueden emplear un dominio del ligadura flexible tal como una región de articulación del IgG humano o ligaduras de polipéptidos que consisten de aminoácidos pequeños tales como glicina, serina, treonina o alanina, a diversas longitudes y combinaciones. Adicionalmente las proteínas quiméricas se pueden etiquetar por His-His-His-His-His-His (Kis6) (SEQ ID NO: 25) para permitir una purificación rápida por cromatografía de quelato de metal o por epítopos a los cuales están disponibles los anticuerpos para permitir la detección de inmunotransferencia Western, inmunoprecipitación o supresión o bloqueo de" la actividad bioensayo.

En o:ra modalidad el heterodímero sR ¡pi se prepara usando el dominio Fe del IgGl humano (Aruffo et al. (1991) Cell 67:35-44; . En contraste a lo último la formación de heterodímeros debe alcanzarse bioquímicamente ya que las moléculas que llevan el dominio Fe se expresarán como homodímeros ligados a bisulfuro. Así los homodímeros se pueden reducir bajo condiciones que favorezcan la disrupción de bisulfuros entres cadenas pero que no efectúen bisulfuros intracadenas . Luego los monómeros con diferentes porciones extracelulares se mezclan con cantidades equimolares y se oxidan para formar una mezcla de homo o heterodímero. Los componentes de esta mezcla ¦ se separan por técnicas cromatográficas . Alternativamente la formación de este tipo de heterodímeros se puede desviar por ingeniería genética y moléculas de expresión que consisten de la porción soluble o extracelular de los componentes del receptor seguido por el dominio Fe de hlgG, seguidos por las cremalleras de leucina c-jun o c-fos antes descritas (Kostelny et al. (1992) J. Immunol . 148:1547-1553) . Ya que estas cremalleras de leucina forman predominantemente heterodímeros se pueden usar para impulsar la formación de heterodímeros en donde sea deseable. En cuanto a las proteínas quiméricas que usan cremallera de leucina, estas también se pueden etiquetar con quelatos metálicos o un epítopo. Este dominio etiquetado se puede usar para la purificación rápida por cromatografía de quelato de metal y/o anticuerpos para permitir la transfección en ir.munocranferencia Western e inmunoprecip tación o supresión y bloqueo de la actividad de bioensayo. En modalidades adicionales se pueden preparar los heterodímeros usando otros dominios derivados de la inmunoglcbul ina que impulsan la formación de dímeros . Tales dominios incluyen por ejemplo, las cadenas pesadas de IgG (Cgl Y Cg4) así como las regiones constantes de las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (1) de las inmunogiob linas humanas. La heterodimerización de Cg con la cadena ligera sucede entre el dominio CH1 de Cg y la región constante de la cadena ligera (C- , y se estabiliza por la ligadura covalente de los dos dominios per medio de un puente de bisulfuro sencillo. De esta manera se pueden preparar constructos usando los dominios de inmuinoglobulina . Alterna ivamente, ios dominios de mmunoglobul ina incluyen dominios que se pueden derivar de los componentes del receptor de células T que impulsan la dimerización . En otra modalidad de la invención ios heterodímeros ??a:ß? se preparan por expresión como moléculas quiméricas que utilizan rizos flexibles de ligador. Un constructo de ADN que codifica la proteína quimérica se diseña de manera que expresa los dominios solubles o extracelulares fusionados juntos en Tándem ("cabeza a cabeza") por un rizo flexible. Este rizo puede ser completamente artificial (por ejemplo, repeticiones de poligiicma interrumpidas por senna o treonina c intervalos) o tomarse prestada de proteínas que se presentan naturalmente (por ejemplo, la región de articulación de hlgG) . Las moléculas se pueden preparar por ingeniería en las cuales el orden de los dominios solubles o extraceluiares fusionados se intercambia (por ejemplo, sIL6 a/nzo/sgp 130 c sgpl30/rizo/sIL-6Ra) y/o en las cuales la longitud y composición del rizo se varía para permitir la selección de moléculas con las características deseadas. Alternativamente, ios heterodímeros hechos de conformidad con la presente invención se pueden purificar a partir de líneas celulares cotransfectadas con los componentes adecuados a y ß. Los heterodímeros se pueden separar de los homodímeros usando métodos disponibles para aquellos expertos en la técnica. For ejemplo se pueden recuperar cantidades de heterodímeros limitadas por una elución pasiva a partir de geles preparativos de poliacrilamida no desnaturalizantes. Alternativamente, se purificar los heterodímeros usando una cromatografía de intercambio de cationes de alta presión. Se ha obtenido una purificación excelente usando una columna de intercambio de catión mono S. Se pueden determinar las dosis efectivas útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con IL-1 usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, Fingí, et al. (1975) The Pharmacological Basis of Therapeu ics , Goodman and Gilman, eds . Macmillan Publishing Co . , New York, p. 1-46). Las composiciones farmacéuticas para su uso de conformidad con la invención incluyen los antagonistas antes descritos en un portador liquido, sólido c semisólido farmacológicamente aceptable ligado un portador o molécula objetivo (por ejemplo, anticuerpo, hormona, factor de crecimiento etc) y/o incorporarse en los liposomas microcápsulas y preparaciones de liberación controlada (incluyendo ' células que expresan antagonistas) previo a la administración in vivo. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender uno o más de los antagonistas en una solución acuosa tal como agua estéril, solución salina, solución amortiguadora de fosfato o solución de dextrosa . Alternativamente los agentes activos pueden estar comprendidos en una formulación sólida (por ejemplo, cera), o semisólida (por ejemplo, gelatinosa) que pueden implantarse- en un paciente que necesite de tal tratamiento. La vía de administración puede ser cualquier modo de administración conocido en el arte incluyendo pero no limitado a intravenosa, intratecal subcutánea, por inyección en el tejido involucrado intra-arterial , intranasal, oral, o por medio de un dispositivo implantado. La administración puede resultar en la distribución del agente activo de la invención a lo largo del cuerpo en un área localizada. Por ejemplo en algunas condiciones que involucran regiones distantes del sistema nervioso puede ser deseable la administración intravenosa c intratecal del agente. En algunas situaciones se pueden colocar un agente activo que contenga el implante en c cerca del área presionada. Los implantes adecuados incluyen pero no se limitan a espuma de gel, cera o implantes basados en micropar ículas . EJEMPLOS Ejemplo 1. Clonación de los componentes del polipéptido de fusión . Los dominios extracelulares de los receptores de citocina humana se obtuvieron por técnicas de PCR estándar usando cADNs (CLQNTECH) , de tejido clonado en un vector de expresión pMT21 ÍGenetics Institu e, Inc.), y las secuencias se formaron por técnicas estándar usando un formador de secuencias de ADN ABI 373A y un kit de formador de secuencias de cicle ter inador Taq Dodeoxi (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . Para el IL-IRAcP, ios nucieótidos 1 hasta el 1074 (que corresponden a los aminoácidos 1-358) de la secuencia del Genbank AB006357 se clonaron. Para el IL-1R1 los nucieótidos 55 hasta 999 (corresponden a ios aminoácidos 19-333) de la secuencia Genbank X168S6, se clonaron. Ejemplo 2. Producción de los polipéptidos de fusión (Traps de citocina) . Las secuencias de nucieótidos que codifican los Traps de citocina se construyeron a partir de los ADN individuales clonadas (descritos supra) por técnicas de PCR y de clonación estándar. En cada caso se construyeron las secuencias en un cuadro de manera tal que la secuencia que codifica el primer componente del polipéptido de fusión se fusionó a la secuencia que codifica el segundo componente del polipéptido de fusión seguido por un dominio Fe (articulación, región CK2 y CH3 del IgGl humano) come el componente de multimerizacion. En algunos casos se insertaron nucleótidos adicionales en la estructura entre las secuencias que codifican el primero y segundo componentes del polipéptido de fusión para ayudar una región de ligadura entre los dos componentes. Ejemplo 3. Bioensayo de MRC5 para las Traps IL-1. Las células de fibroblasto de pulmón humano IL-1 que responden a IL-1 al secretar IL-6 y así se utilizaron para ensayar la capacidad de IL-1 Traps para bloquear la producción dependiente de IL-1 de IL-6. El IL1 Trap 1SC569 se probó contra IL- RI.Fc que es el dominio extraceiular del receptor tipo 1 IL-1 fusionado al dominio Fe. Se suspendieron las células MRC5 a 1 x 105 por mi de un medio y 0.1 mi de células que se forman en placas (10,000 células por pozo) en los pozos de. una placa de cultivo de 96 pozos. Se incubaron las placas por 24 horas a 37°C en un incubador de C0: humidificado al 5%. El IL-1 Trap y el IL-1 recombinante humano a dosis variables se preincuban en una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos por 2 horas a 37°C. 0.1 mi de esta mezcla se agregan a la placa de 96 pozos que contiene las células MRC5 de manera tai que la concentración final de IL-1 Trap es ??? y las concentraciones finales del IL-1 van desde 2.4 pM a 5nM. Los pozos de control contienen Trap solamente o nada. Las placas luego se incuban a 37°C durante 24 horas en un incubador CC2 hurnidificado al 5%. Se recolecta el sobrenadante y se ensaya para los niveles de IL-6 usando un kit de inmunoensayo de cuanticina R&D Systems de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Ejemplo 4. Bloqueo del IL-1 inyectado por IL-1 Trap in vivo La IL-l es una citocina proinflamatoria . La administración sistémica del IL-1 se ha demostrado que produce respuestas agudas en animales incluyendo hiperglicemia transitoria, hipcinsulinemia, fiebre, anorexia y niveles aumentados de suero de la interleucina 6 (IL-6) (Reimers, 1998) . Ya que los ratones tienen respuesta al IL-1 de murino y de humano el IL-1 se puede usar y los efectos de enlace in vivo de los antagonistas humanos IL-1 se pueden evaluar. Este modelo agudo de ratón se usó para determinar la capacidad de un IL-1 Trap humano para antagonizar los efectos in vivo del IL-1 humano administrado exógenamente . Esto proporciona una indicación rápida de eficacia in vivo del IL-1 Trap humano y se pueden usar como un ensayo para ayudar la selección de moléculas.

Diseño Experimental : Los ratones macho C57BL/6 se les dio una inyección subcutánea del IL-?ß (rhIL-?ß; 0.3 mg/kg) humano reccmbmante . Veinticuatro horas previas a la administración de rhIL-?ß se trataron los animales con vehículo, IL-1 Trap humano (un exceso molar de 50 o 150 veces, 0.18 o 0.54 mg/kg respectivamente), o un antagonista del receptor IL-1 de murino reco binante (rm IL-lra; exceso molar de 150 o 750 veces, 45.8 o 229 ,ug/kg respectivamente) . Se tomaron muestras de sangres dos horas después de la administración de rhIL-?ß y se ensayaron los sueros para niveles IL-6 usando un IL-6 ELISA de ratón. La administración exógena de rhIL-?ß incremento significativamente los niveles de suero IL-6. El oretratamiento con un exceso molar de 50 o 150 veces de hIL-1 Trap bloqueó la inducción de rhIL-?ß de IL-6. En contraste, la inyección de rmlL-lra a un exceso molar de 150 o 750 veces no bloqueó la inducción de IL-6. Resultados. La administración exógena del IL-1 humano resultó en una inducción dramática de niveles de IL-6 en suero. A un exceso molar de 150 veces, el IL-1 Trap humano bloqueó completamente el incremento de IL-6 (Figura 1) . Adicionalmente los efectos del IL-1 Trap humano persistieron, por al menos otras 24 horas, evitando un incremento de IL-6 a un cuando se volvió administrar IL-1 (Fig. 1) . Tal eficacia de larga duración sugiere la inyección diaria de un IL-1 Trap puede ser nc necesaria para aplicaciones crónicas.

En un experimente por separado IL-lra a un exceso molar de 150 veces o 750 veces no bloquee significativamente la inducción por IL-6. Por lo tanto en este paradigma IL-1 Trap aparece ser un blcqueador de la actividad de IL-1 (Fia. 2} . Ejemplo 5. Construcción de IL-1 Traps adicionales de cadena sencill . Las técnicas usadas para construir ios vectores de ADN aquí descritos son técnicas estándar de biología molecular bien conocidas por el técnico experimentado (ver per ejemplo, Sambrook, J. , ?. F. Fritsch And T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratcry Manual, Segunda edición, Vols 1, 2, y 3, 19S9; Current Prctocols m Molecular Biology Eds . Ausuble et al., Greene Publ . Assoc . Wiley Interscience , NY) . Toda la formación de secuencias de ADN se hace por técnicas estándar se hace por un rormador de secuencia de ADN A3I 373A y un formador de secuencia de un ciclo terminador Taq Dodeoxy (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . (a) Secuencia IL-i Trap 823. La secuencia IL-1 Trap 823 consiste del dominio extraceiular de IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1077 de SEQ ID NO: ) seguido per un dominio extraceiular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1076-2013 de SEQ ID NO: 7)) seguido por una parte de una región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgGl humano (que corresponde a los nucleótidos 2014-2703 de SEQ ID NO: 7) contienen una mutación en los nucleótidos 2017-2019 (TGT>GGA) para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO: 8) . (b) Secuencia IL-1 Trap 823-1198-B. La secuencia IL-1 Trap 823-1198-B consiste del dominio extracelular de IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1077 de SEQ ID NO: 9) seguido por un dominio extracelular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1078-2013 de SEQ ID NO: 9) ) seguido per extensión de aminoácidos (que corresponden a los nucleótidos 2014-2019 de SEQ ID NO: 9), seguido por una región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleótidos 2020-2709 de SEQ ID NO: 9) La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 10) . (c) Secuencia IL-1 Trap 823-1267-C. La secuencia IL-1 Trap 823-1267-B consiste del dominio extracelular de IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1077 de SEQ ID NO: 11) seguido por un dominio extracelular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1078-2013 de SEQ ID NO: 11)) seguido por extensión de aminoácidos (que corresponden a los nucleótidos 2014-2019 de SEQ ID NO: 9 de SEQ ID NO: 11), seguido por una región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleótidos 2020-2709 de SEQ ID NO: 11) que contienen una mutación en el nucleótido de 2047 (T>C) pa~ra cambiar una serina a una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del pclipéptidc de fusión como se establece en SEQ ID NO: 12. (d) Secuencia IL-1 Trap 570-FE. La secuencia IL-1 Trap 570 -FE consiste del dominio extracelular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1-966 de SEQ ID NO : 1 ) seguido por un dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 997-2013 de SEQ ID NO: 1) seguido por parte de la región de articulación , los dominios CH2 y CH2 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleótidos 2014 -2703 de SEQ ID NO: 1) que contiene una mutación en los nucleótidos 2017-2019 (TGT GGA) para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del pclipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO: 2) . (e) Secuencia IL-1 Trap 570-FE-3. La secuencia IL-1 Trap 570-FE-3 consiste del dominio extracelular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1-966 de SEQ ID NO : 3 ) seguido por un dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 997-2013 de SEQ ID NO: 3) seguido por una extensión de aminoácidos (que corresponde a los nucleótidos 2Q14-2019 de SEQ ID NO: 3) seguido por una región de articulación, los dominios CK2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleótidos 2020-2709 de SEQ ID NO: 3) . La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO : 4. (f) Secuencia IL-1 Trap 570-FE-C. La secuencia IL-1 Trap 570-FE-C consiste del dominio extracelular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1-996 de SEQ ID NO: 5) seguido por un dominio extracelular del IL-IRAcP humane (que corresponde a los nucleótidos 997-2013 de SEQ ID NO: 5) seguido por una extensión de aminoácidos (que corresponde a los nucleótidos 2014-2019 de SEQ ID NO: 5) seguido por una región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a ios nucleótidos 2020-2709 de SEQ ID NO: 5) que contiene una mutación en el nuclectido 2047 (T>C) para cambiar una serina a una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptide de fusión como se establece en SEQ ID NO: 6. (g) Secuencia IL-1 Trap 1647-CtF. La secuencia IL-1 Trap 1647-CtF consiste del dominio extracelular del IL-1RI humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1044 de SEQ ID NO: 13) seguido por un dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1045-2058 de SEQ ID NO: 13) seguido por una parte de una región de articulación, los dominios CK2 y CH3 del IgGl humano (que corresponde a los nucleótidos 2059-2748 de SEQ ID NO: 13) , que contienen una mutación en los nucleótidos 2062-2064 (TGT- >GGA) para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO: 14. (h; Secuencia IL-1 Trap 1647-CtF-B. La secuencia IL-1 Trap 1647-CtF-B consiste del dominio extracelular del IL-1RII humano (que corresponde a los nucleotidos 1-1044 de SEQ ID NO: 15) seguido per un dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleotidos 1045-2058 de SEQ ID NO: 15) seguido por una extensión de aminoácidos (que corresponde a ios nucleotidos 2059-2064 de SEQ ID NO: 15) seguido por una región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleotidos 2065-2754 de SEQ ID NO: 15) La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipeptido de fusión como se establece en SEQ ID NO: 16. (i) Secuencia IL-1 Trap 1647-CtF-C. La secuencia IL-1 Trap 1647-CtF-C consiste del dominio extracelular del IL-1RII humano (que corresponde a los nucleotidos 1-1044 de SEQ ID NO: 17) seguido por un dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleotidos 1045-2058 de SEQ ID NO: 17) seguido por una extensión de aminoácidos (que corresponde a los nucleotidos 2059-2064 de SEQ ID NO: 17) seguido por una región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleotidos 2065-2754 de SEQ ID NO: 17) que contienen una mutación en el nucleótido 2092 (T>C) para cambiar una serina a una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO: 17. (j) Secuencia IL-1 Trap 1649. La secuencia IL-1 Trap 1649 consiste del dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1074 de SEQ ID NO:19) seguido por un dominio extracelular del IL-1RII humano (que corresponde a los nucleótidos 1075-2058 de SEQ ID NO: 19) seguido por una parte de la región de articulación, los dominios CK2 y CH3 del IgGl humano (que corresponde a los nucleótidos 2065-2748 de SEQ ID NO: 19) que contiene una mutación en ios nucleótidos 2062-2064 (TGT- >GGA) para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO:20. (k) Secuencia IL-1 Trap 1649-B. La secuencia IL-1 Trap 1649-B consiste del dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1074 de SEQ ID NO:21) seguido por un dominio extracelular del IL-1RII humano (que corresponde a los nucleótidos 1075-2058 de SEQ ID NO: 21) seguido por una extensión de aminoácidos, (que corresponde a los nucleótidos 2059-2064) seguido por la región de articulación, los dominios CH2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleótidos 2065-2754 de SEQ ID NO: 21) . La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO:22. (1) Secuencia IL-1 Trap 1649-C. La secuencia IL-1 Trap 1649-C consiste del dominio extracelular del IL-IRAcP humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1074 de SEQ ID NO:23) seguido por un dominio extracelular del IL-1RII humano (que corresponde a los nucleótidos 1075-2058 de SEQ ID NO: 23) seguido por una extensión de aminoácidos, (que corresponde a los nucleótidos 2059-2064) seguido por la región de articulación, los dominios CK2 y CH3 del IgG4 humano (que corresponde a los nucleótidos 2065-2754 de SEQ ID NO: 23) contienen una mutación en el nucleótido 2092 (T>C) para cambiar una serina a una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia del polipéptido de fusión como se establece en SEQ ID NO: 24. Además de las secuencia antes descritas, las siguientes modificaciones a esas secuencia también se contemplan por la invención objetivo. 1. Para IL1 Traps 823, S23-1198.3, y 823-1267. C: Alternativa AcP: Un cambio en el nucleótido 1043 de A a C para cambiar el aminoácido de Lys a Thr . Inserción SG : Entre los nucleótidos 1077 y 1078 una inserción de los nucleótidos TCC GGA agregaría una extensión Ser Gly de aminoácidos entre los dos dominios de receptor de Trap. 2. Para IL1 Traps 570-FE, 570-FE,B, y 570. C: Alternativa AcP: Un cambio en el nucleótido 1979 de A a C para cambiar el aminoácido de Lys a Thr. Inserción SG: Entre los nucleótidos 996 y 977 una inserción de los nucleótidos TCC GGA agregaría una extensión Ser Gly de aminoácidos entre los dos dominios de receptor de Trap. 3. Para IL1 Traps 1647-CtF, 1647-CtF.B y 1647-CtF. C: Alternativa AcP: Un cambio en el nucleótido 2027 de A a C para cambiar el aminoácido de Lys a Thr. Inserción SG: Entre los nucleótidos 1044 y 1045 una inserción de los nucleótidos TCC GGA agregaría una extensión Ser Gly de aminoácidos entre los dos dominios de receptor de Trap. 4. Para IL1 Traps 1649, 1649-B, y 1649-C: Alternativa AcP: Un cambio en el nucleótido 1043 de A a C para cambiar el aminoácido de Lys a Thr. Inserción SG: Entre los nucleótidos 1074 y 1075 una inserción de los nucleótidos TCC GGA agregaría una extensión Ser Gly de aminoácidos entre los dos dominios de receptor de Trap. Además alguien de experiencia en la técnica reconocerá que puede ser deseable construir IL1 Traps en los cuales el dominio Fe se deriva de las inmunoglobulinas con alotipos diferentes. Ninguna de las modificaciones antes descritas alterara la capacidad de Trap's para enlazarse IL1. Ejemplo 6. Bloques IL-1 Trap humanos que afectan IL-1 en articulaciones inflamadas. Antecedentes: Zimosan es un extracto de la pared celular de levadura que cuando se inyectan la rodilla provoca una inflamación aguda y sobreregulación de IL-?ß en las articulaciones (Joosten et al. (1994) Clin Exp Immunol 97: 204-211) . Los condrocitos responderán a la inflamación y al IL-?ß local por la subregulación de las síntesis de prorecgl icanos , una característica de la artritis humana que contribuye a la destrucción gradual del cartílago en la articulación (van de Berg et al. (1982) Rheum Intl 1:165-169). Los antagonistas para IL-?ß se pueden usar para evaluar su capacidad para bloquear los efectos de las elevaciones inducidas por zirr.osan en IL-?ß. Materiales y Métodos: Ratones C57BL/6 machos anestesiados (Taconic; se les aplicó una inyección mtrarticular de Zimosan A (Sigma; 300µg en ??µ?) dentro de la articulación de la rodilla derecha a través del ligamento patelar. Se inyectó PVC estéril (10 µ?) dentro la articulación de la rodilla izcuierda a través del ligamento patelar. Veinticuatro horas orevi s1 a . s inyecciones i. a, se trataron los animales con vehículo o Hii-1 Trap 569 (19 mg/kg, s.c.) . Las patelas se retiraron 24 horas después de la inyección de zimosan con objeto de medir la síntesis de proteoglicanos como se describe por van den Ver et al. (1982) supra . Brevemente, cada patela y el ligamento asociado se incubaron a 3h a 37°C, 5% C02 en medio ÍRPMI con HEPES, HC03 , glutamina y penicilina/estreptomicina) que contienen ??µ??/t?? 35S-sulfate (NSW DuPo t) . Después de la incubación se lava el tejido y se fijo durante la noche en 10% formal ina (VWR) . El te ido luego se descalcificó en una solución descalcificante (J.T. Baker) durante 4 horas previo a la disección de la patela del tejido circundante. Luego se incubó cada patela durante la noche en Solvable (Packard) a 50°C. Se agregó fluido de escin ilación liquida Ultima Gold (Packard) y las muestras se contaron en un contador de escmtilación .liquida. Se reportaron los valores como la relación de cpm de zimosan patela/cpm del vehículo patela para cada animal. Resultados: La inyección intra-articular de zimosan reduce la síntesis de proteoglicanos por aproximadamente 50% con relación a la inyección de vehículo (Fig. 3) . La administración de hIL-1 Trap previo a la inyección con zimosan bloqueó la acción local de IL-?ß y la síntesis de oro eogl icano regresó hasta aproximadamente 90% del control. Estos datos demuestran que hIL-1 Trap 569 puede penetrar las articulaciones después de una inyección subcutánea para neutralizar efectivamente el efecto biológico de IL-1 dentro de esas articulaciones. Ejemplo 7. IL-1 Trap de murino reduce la severidad de los síntomas de la artritis en un modelo artritis (CIA) inducida por colágeno acelerada con Zimosan. Anteceden es: El IL-1 ha estado implicado en el desarrollo de inflamación y destrucción de cartílagos en artritis reumatoide (Dinarello (1996) Bllod 87 ( 6 ): 2095-2147 ; Wooley et al. (1993) Arthritis & Rheumatism 36 (9) : 1350-1314) . La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo animal ampliamente estudiado de poliartitris inflamatoria con similitudes a la artritis reumatoide; características histopatológicas comunes incluyen la inflamación y erosión de las articulaciones, hiperplasia sinovial , e infiltración de células inflamatorias (Joe et al. (1999) Mol Med Today 5:367-369) . Ya que los estudios previos han demostrado que diversos tratamientos anti-IL-1 tienen un efecto positivo en la reducción de ios síntomas de artritis en animales con CIA (van den Berg et al. (1994) Clin E xp Immunol 95: 237-243 ; Joosten et al. (1999) J Immunol 163: 5049-5055; van de Loo et al. (1992) J Rheumatol 19: 348-356) . Los solicitantes examinaron el efeccc de una versión murina del IL-1 Trap (mIL-1 Trap) en el avance de los síntomas del artritis en este modelo animal. La versión humano IL-1 Trap es pobremente de reacción cruzada con el IL-1 de roedores. El mIL-1 Trap consiste de un dominio extracelular de IL-IRAcP murino seguido por el dominio extracelular de IL-1RI murino, seguido por el murino CH2 y CH3 , articulación del IgG2A murino. Materiales y métodos. Ratones macho DBA-1 (Jackson Laboratories) se inmunizaron intradermalmente en la base de la cola con 100 g/50µl de colágeno tipo II de bovino (CII; Chondrex) emulsificado con adyuvante de Freund completo e incompleto (relación 2:1:1; Chondrex) y se reforzaron intradermalmente CII (100µg/50µl) emulsificado con adyuvante incompleto de Freund. el día 21. Ya que el CIA en los ratones DBA-1 sucede gradualmente durante un periodo prolongado de tiempo con una baja incidencia (Joosten et al. (1994) Clin Exp Immunol 97:204-211). Los solicitantes sincronizaron el comienzo de los síntomas de la artritis al inyectar a los animales mtraperitonealmente el día 30 con 3 mg de zimosan (Sigma) . Dos horas previas a la inyección con zimosan se distribuyeron aleatoriamente a los ratones en grupos de tratamiento y se inyectaron con vehículo o con mIL-1 Trap (31 o 10 mg/kg, 3 veces por semana, 8 inyecciones subcutáneas. Los síntomas de la artritis (registros ASI, como se describen por Wooley et al. (1993) Artritis & Rheumatism 36 (9) : 1305- 131 ) en las patas se evaluaron 3 veces por semana por individuos cegados a los grupos de tratamiento. Los animales se sacri icaron 24 horas después de la octava inyección tiempo en el cual se midió el ancho de la pata junto con las marcas ASI. Resultados. 5 días después de la inyección intraperitoneal de zimosan, los animales tratados con vehículo tuvieron un incremento importante en el registro ASI con relación a aquellos que recibieron mIL-1 Trap (Fig.4) con síntomas que alcanzaron un máximo de 10 a 14 días después de la inyección con zimosan. El IL-1 Trap murino actuó en una forma dependiente de la dosis de manera tal que los animales que reciben 10 mg/kg Trap tuvieron más síntomas de artritis (mayores que un registro ASI) que aquellos que reciben 31 mg/kg. Sin embargo, ambos grupos tratados con mIL-1 Trap tuvieron un grado significativamente menor de síntomas de artritis que el vehículo. Esta diferencia en el registro ASI también se refleja en el ancho de la pata al momento del sacrificio (Fig. 5). Los animales que reciben mIL-1 Trap tuvieron anchos de patas que fueron similares a aquellos animales inmunizados sin colágeno y sin tratamiento. Estos datos indican que mIL-1 Trap puede neutralizar efectivamente IL-1 y bloquear el desarrollo de las articulaciones artríticas . EJEMPLO 8. IL-1 Trap 1649 puede bloquear la actividad de IL-?ß Se incubaron diversas concentraciones de IL-1 Trap 1649 en presencia de IL-lb humana 5 pM durante la noche a temperatura ambiente. Luego se agregaron las mezclas a pozos por duplicado de células 293-NFkB (20,000 células/pozo) durante 5 horas a 37°C, 5% C02. Las células 293-NFkB contienen un plásmido reportero establemente integrado que posee un gen de luciferasa activado por un promotor que contiene los sitios 5 NFkB . La adición de IL-lb resulta en una expresión aumentada del gen de luciferasa. El reactivo Steady-Glo (Promega) se agregó a las células durante 15 minutos a temperatura ambiente y se cuantificó el gen de luciferasa como unidades relativas de luz (RLU) por lummometría . IL-1 Trap 1649 despliega un IC50 de 32 pM el cual indica un Kd de -30 pM (Fig. 6) . Estos datos indican que el IL-1 Trap 1649 bloquea potentemente el IL-1. La presente invención no se limitará en alcance por las modalidades específicas aquí descritas. De hecho diversas modificaciones de la invención además de aquellas aquí descritas serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras anexas. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito ia invención como antecede, se reclama cerne propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del .grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23, caracterizada porque la molécula aislada de ácido nucleico codifica un polipéptido de fusión que forma un multímero capaz de enlazar a la nterleucma 1 (IL-l) para formar un complejo nc funcional. 2. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con ia reivindicación 1 caracterizada porque codifica una secuencia ya seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 2C, 22 y 24, respectivamente.
3. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia es SEQ ID NO: .
4. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de fusión que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8.
5. Un vector caracterizado porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de conformidad cor. cualesquiera de las reivindicaciones 1-4 ligado operativamente a una secuencia de control de la expresión.
7. Ur. sistema vector hospedadcr para la producción de un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 6, en una célula adecuada hospedadora .
8. El sistema del vector hospedador de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la célula hospedadora es una célula bacteriana, célula de levadura, célula de insecto o célula de mamífero.
9. El sistema vector hospedador de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula hospedadora es una célula CHO .
10. Un método para la producción de un polipéptido de fusión, caracter zado porque comprende células crecientes del sistema vector hospedador de conformidad con la reivindicación 8, bajo condiciones que permiten la producción del polipéptido de fusión y la recuperación del polipéptido de fusión así producido .
11. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico de SEQ ID NO: I, 3 o 5 comprende 1 o más de los siguientes cambios. (a) el nucleótido 1979 cambia desde A hasta C; y (b) los nucleótidos TCC GGA se insertan entre los nucleótidos 596 y S77;
12. ?1 ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, 9 o 11 comprende uno o más de los siguientes cambios (a) el nucleótido 1043 de SEQ ID NO: 7, 9 o 11 cambia de A a la C; y (b) nucleótidos TCC GGA se insertan entre los nucleótidos IC77 y 1076.
13. ?1 ácido nucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico de SEQ ID NO: 13, 15 o 17 comprende uno o más de los siguientes cambios (a) el nucleótido 2027 cambia de A a la C; y (b) nucleótidos TCC GGA se insertan entre los nucleótidos 1044 y 1045.
14. El ácido nucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico de SEQ ID NO: 19, 21 o 23 comprende uno o más de los siguientes cambios (a) el nucleótido 1043 cambia de A a la C; y (b) los nucleótidos TCC GGA se insertan entre los nucleótidos 1074 y~1075.
15. Un polipéptido de fusión caracterizado porque se codifica por las moléculas de ácido nucleico de cualesquiera de las reivindicaciones 1 o 11-14.
16. Un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1€, 18, 20, 22 y 24.
17. Un multímero capaz de enlazar a IL-1 caracterizado porque forma un complejo no funcional que comprende un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 16. 1S. El multímero de conformidad con la reivindicación 17 caracterizado porque es un dímero. 19. El multímero de conformidad con la reivindicación 18 caracterizado porque cada polipéptido de fusión tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8.