ES2320338T3 - Antagonistas basados en receptores de il-1 y procedimientos de fabricacion y uso. - Google Patents
Antagonistas basados en receptores de il-1 y procedimientos de fabricacion y uso. Download PDFInfo
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de SEC. ID Nº 7, en la que la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido de fusión que forma un multímero capaz de unir la interleucina 1 (IL-1) para formar un complejo no funcional.
Description
Antagonistas basados en receptores de
IL-1 y procedimientos de fabricación y uso.
La familia de citocinas del CNTF desempeña
importantes funciones en una gran diversidad de procesos
fisiológicos que proporcionan potenciales aplicaciones terapéuticas
tanto para antagonistas como para agonistas.
El documento EP 1229047 (Regeneron Pharma)
divulga proteínas de fusión del receptor de interleucina 1 capaces
de unir la interleucina 1 para formar un complejo no funcional que
comprende una porción de unión a la interleucina 1 del dominio
extracelular del componente determinante de especificidad de un
receptor de interleucina 1, una proteína de unión a interleucina 1
del dominio extracelular del componente transductor de señal de
dicho receptor de interleucina 1 y un componente formador de
multímeros.
Un objeto de la presente invención es la
producción de antagonistas de citocinas que son útiles en el
tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con las
citocinas.
Otro objeto de la invención es el uso de los
antagonistas de citocinas descritos para el tratamiento de
enfermedades o trastornos relacionados con las citocinas.
Otro objeto de la invención es la construcción
de varios antagonistas específicos de la citocina
IL-1, denominados Trampas de IL-1,
teniendo cada uno diferentes secuencias pero todos con capacidad
para bloquear la unión de IL-1 a su receptor,
funcionando por consiguiente como antagonistas de
IL-1.
Fig. 1: La Trampa de IL-1 humana
bloquea los efectos in vivo de IL-1hu
administrada de manera exógena. Se administró a ratones BALB/c
IL-1hu (0,3 \mug/kg) por inyección subcutánea en
el tiempo 0. Veinticuatro horas antes de la inyección de
IL-1hu se trató previamente a los animales con
vehículo o con un exceso molar de 150 veces de Trampa de
IL-1hu. Dos horas antes del sacrificio (26 horas) se
desafió nuevamente a los ratones con una segunda inyección de
IL-1hu (0,3 \mug/kg, s.c.). Se recogieron muestras
de sangre en diversos puntos temporales y se ensayaron los niveles
séricos de IL-1 (expresados como media +/- EEM; n=5
por grupo).
Fig. 2: La Trampa de IL-1 humana
bloquea los efectos in vivo de IL-1 humana
administrada de manera exógena.
Fig. 3: La Trampa de IL-1 humana
bloquea los efectos de IL-1 en articulaciones
inflamadas.
Figuras 4-5: La Trampa de
IL-1 murina reduce la gravedad de los síntomas de
artritis en un modelo de artritis inducida con colágeno (CIA)
acelerada con zimosan.
Fig. 6: Se incubaron diversas concentraciones de
Trampa de IL-1 1649 en presencia de
IL-1b 5 pM durante la noche a temperatura
ambiente.
La presente divulgación proporciona una molécula
de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión
capaz de unir una citocina para formar un complejo no funcional que
comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un primer
componente del polipéptido de fusión que comprende la secuencia de
aminoácidos de la porción de unión a la citocina del dominio
extracelular del componente determinante de especificidad de un
receptor de la citocina; (b) una secuencia de nucleótidos que
codifica un segundo componente del polipéptido de fusión que
comprende la secuencia de aminoácidos de la porción de unión a la
citocina del dominio extracelular del componente transductor de
señal de un receptor de la citocina; y (c) una secuencia de
nucleótidos que codifica un tercer componente del polipéptido de
fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de un componente
formador de multímeros. En particular, la molécula de ácido nucleico
aislada comprende SEC. ID Nº: 7. La invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de
SEC. ID Nº: 7, en la que la molécula de ácido nucleico aislada
codifica un polipéptido de fusión que forma un multímero capaz de
unir interleucina 1 (IL-1) para formar un complejo
no funcional.
Se entiende por "porción de unión a la
citocina" a la mínima porción del dominio extracelular necesaria
para unir la citocina. Los expertos en la técnica aceptan que una
característica distintiva de un receptor de citocinas es la
presencia de dos dominios análogos a fibronectina que contienen
cisteínas de consenso y la presencia de la caja WSXWS (SEC. ID Nº:
26) (Bazan (1990) PNAS 87: 6934-6938). Las
secuencias que codifican los dominios extracelulares del componente
de unión del receptor de citocina y del componente transductor de
señal del receptor de citocina pueden también usarse para crear el
polipéptido de fusión de la invención. De manera similar, pueden
usarse secuencias más largas que codifican porciones mayores de los
componentes del receptor de citocina. Sin embargo, está contemplado
que los fragmentos más pequeños que el dominio extracelular
funcionarán para unir la citocina y por consiguiente, la invención
contempla polipéptidos de fusión que comprenden la mínima porción
del dominio extracelular necesario para unir la citocina como la
porción de unión a la citocina.
La invención comprende un "componente
determinante de especificidad" de un receptor de citocina y un
"componente transductor de señal" del receptor de citocina.
Independientemente de la nomenclatura usada para designar un
componente o subunidad particular de un receptor de citocina, un
experto en la técnica reconocerá qué componente o subunidad de un
receptor es responsable de determinar la diana celular de la
citocina, y por consiguiente sabrá qué componente constituye el
"componente determinante de especificidad". De manera similar,
independientemente de la nomenclatura usada, un experto en la
técnica sabrá qué componente o subunidad de un receptor constituirá
el "componente transductor de señal". Según se usa en este
documento, el "componente transductor de señal" es un
componente del receptor nativo que no es el componente determinante
de especificidad y que no se une ni se une débilmente a la citocina
en ausencia de un componente determinante de especificidad. En el
receptor nativo, el "componente transductor de señal" puede
participar en la señal.
En la preparación de la secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido de fusión de la invención, el
primer, el segundo y el tercer componente del polipéptido de fusión
se codifican en una única hebra de nucleótidos que, cuando se
expresa por medo de un sistema vector del huésped, produce una
especie monomérica del polipéptido de fusión. Los monómeros
expresados de esta manera forman multímeros posteriormente por las
interacciones entre los componentes formadores de multímeros (los
terceros componentes del polipéptido de fusión). La producción de
los polipéptidos de fusión en esta manera evita la necesidad de
purificación de mezclas de heterodímeros que podrían resultar si se
produjeran el primer y segundo componentes como moléculas separadas
y posteriormente se formasen los multímeros. Por ejemplo, la Patente
de EEUU Nº 5.470.952 concedida el 28 de noviembre de 1995 describe
la producción de proteínas heterodiméricas que funcionan como
antagonistas de CNTF o IL-6. Los heterodímeros se
purifican de líneas celulares cotransfectadas con los componentes
alfa (a) y beta (b) adecuados. Posteriormente se separan los
heterodímeros de los homodímeros usando procedimientos tales como
la elución pasiva de geles preparativos de poliacrilamida, no
desnaturalizantes o por medio del uso de cromatografía de
intercambio catiónico de alta presión. La necesidad de esta etapa de
purificación se evita por medio de los procedimientos de la
presente
invención.
invención.
Además, la Solicitud Internacional PCT WO
96/11213 publicada el 18 de abril de 1996, titulada Inhibidores
diméricos de IL-4, establece que el solicitante ha
preparado homodímeros en los que dos receptores de
IL-4 se unen por medio de un espaciador polimérico
y ha preparado heterodímeros en los que un receptor de
IL-4 se une por medio de un espaciador polimérico a
una cadena gamma del receptor de IL-2. El espaciador
polimérico descrito es polietilenglicol (PEG). Los dos componentes
del receptor, IL-4R e IL-2Rgamma se
expresan y purifican por separado. Posteriormente se producen
homodímeros y heterodímeros pegilados uniendo juntos los componentes
usando reactivos de PEG bifuncionales. Una ventaja de la presente
invención es evitar la necesidad de tales etapas de purificación y
pegilación, costosas y que consumen tiempo.
En una forma de realización de la invención, la
secuencia de nucleótidos que codifica el primer componente está
secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos que codifica el
segundo componente. En otra forma de realización de la invención,
la secuencia de nucleótidos que codifica el primer componente está
secuencia debajo de la secuencia de nucleótidos que codifica el
segundo componente. Pueden prepararse otras formas de realización
de la invención en las que se reorganiza el orden del primer,
segundo y tercer componente del polipéptido de fusión. Por ejemplo,
si la secuencia de nucleótidos que codifica el primer componente se
denomina 1, la secuencia de nucleótidos que codifica el segundo
componente se denomina 2 y la secuencia de nucleótidos que codifica
el tercer componente se denomina 3, entonces el orden de los
componentes en el ácido nucleico aislado de la invención según se
lee desde 5' hacia 3' puede estar en cualquiera de las siguientes
seis combinaciones: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; ó 3,2,1.
En formas de realización específicas de la
invención, la citocina unida por el polipéptido de fusión es
interleucina 1 (IL-1).
En formas de realización de preferencia de la
invención, el componente formador de multímeros comprende un
dominio derivado de inmunoglobulina. Más específicamente, el dominio
derivado de inmunoglobulina puede seleccionarse del grupo
constituido por el dominio Fc de IgG, la cadena pesada de IgG, y la
cadena liviana de IgG. Aún más específicamente, el dominio de
inmunoglobulina puede seleccionarse del grupo constituido por el
dominio Fc de IgG_{1} o IgG_{4}, la cadena pesada de IgG_{1}
o IgG_{4}, y la cadena liviana de IgG_{1} o IgG_{4}. En otra
forma de realización, el componente formador de multímeros puede ser
un dominio Fc del que se han eliminado los cinco primeros
aminoácidos (incluida una cisteína) para producir un componente
formador de multímeros denominado Fc(DC1). Como alternativa,
el componente formador de multímeros puede ser un dominio Fc en el
que se ha sustituido una cisteína dentro de los primeros cinco
aminoácidos por otro aminoácido tal como, por ejemplo, serina o
alanina.
La presente invención también proporciona
polipéptidos de fusión codificados por las moléculas de ácido
nucleico aisladas de la invención. De preferencia, los polipéptidos
de fusión están en forma multimérica, por la acción del tercer
componente, el componente formador de multímeros. En una forma de
realización de preferencia, el multímero es un dímero. Los
componentes formadores de multímeros adecuados son secuencias que
codifican una región de bisagra de cadenas pesadas de
inmunoglobulinas (Takahashi y col. (1982) Cell 29:
671-679); secuencias de genes de inmunoglobulinas y
sus porciones. En una forma de realización de preferencia de la
invención, se usan secuencias de genes de inmunoglobulinas, en
especial una que codifica el dominio Fc, para codificar el
componente formador de multímeros.
La presente invención también contempla un
vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención
según se describe en este documento.
Se describe una molécula de ácido nucleico
aislada que tiene la secuencia presentada en SEC. ID Nº: 1 que
codifica un polipéptido de fusión que tiene la secuencia presentada
en SEC. ID Nº: 2, en la que el polipéptido de fusión forma un
multímero que es capaz de unir una citocina para formar un complejo
no funcional; una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la
secuencia presentada en SEC. ID Nº: 3 que codifica un polipéptido de
fusión que tiene la secuencia presentada en SEC. ID Nº: 4, en la
que el polipéptido de fusión forma un multímero que es capaz de
unir una citocina para formar un complejo no funcional; y una
molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia
presentada en SEC. ID Nº: 5 que codifica un polipéptido de fusión
que tiene la secuencia presentada en SEC. ID Nº: 6, en la que el
polipéptido de fusión forma un multímero que es capaz de unir una
citocina para formar un complejo no funcional; así como polipéptidos
de fusión codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas
anteriormente.
Se describen moléculas de ácido nucleico
aisladas que tienen las secuencias presentadas en SEC. ID Nº: 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 que codifican polipéptidos de fusión que
tienen las secuencias presentadas en SEC. ID Nº: 8, 10, 12, 14, 16,
18, 20 y 22, respectivamente, en las que cada polipéptido de fusión
forma un multímero que es capaz de unir IL-1 para
formar un complejo no funcional.
También se proporciona un vector de expresión
que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención según
se describe en este documento, en el que la molécula de ácido
nucleico está unida de manera operativa a una secuencia de control
de expresión. También se proporciona un sistema
huésped-vector para la producción de un polipéptido
de fusión que comprende el vector de expresión de la invención que
se ha introducido en una célula huésped adecuada para la expresión
del polipéptido de fusión. La célula huésped adecuada puede ser una
célula bacteriana, tal como E. coli, una célula de levadura,
tal como Pichia pastoris, una célula de insecto, tal como
Spodoptera frugiperda, o una célula de mamífero, tales como
una célula COS, CHO, 293, BHK o NS0.
La presente invención también proporciona
procedimientos para producir polipéptidos de fusión de la invención
cultivando células de los sistemas huésped-vector
descritos en este documento, bajo condiciones que permitan la
producción de un polipéptido de fusión y la recuperación del
polipéptido de fusión producido de esa manera.
Los heterodímeros sR\alpha:\beta1 preparados
según la presente invención proporcionan Trampas eficaces para sus
ligandos, uniendo estos ligandos con afinidades del orden de los
picomoles sin crear intermedios funcionales. La tecnología descrita
en este documento puede aplicarse para desarrollar una Trampa de
citocina para cualquier citocina que utiliza un componente \alpha
que confiere especificidad, así como un componente \beta que,
cuando se une al componente \alpha, tiene mayor afinidad por la
citocina que cualquier componente solo. Por consiguiente, los
antagonistas según la invención incluyen antagonistas de
interleucina 1 (IL-1).
Los dominios \alpha y \beta extracelulares
del receptor pueden prepararse usando técnicas conocidas por los
expertos en la técnica. Las moléculas del receptor útiles para poner
en práctica la presente invención pueden prepararse por clonación y
expresión en un sistema de expresión procariota o eucariota. El gen
del receptor recombinante puede expresarse y purificarse utilizando
cualquier serie de procedimientos. Este gen que codifica el factor
puede subclonarse en un vector de expresión bacteriano, tal como por
ejemplo, pero no de manera limitante, pCP110.
Los factores recombinantes pueden purificarse
por cualquier técnica que permita la posterior formación de una
proteína estable, biológicamente activa. Por ejemplo, y no de manera
limitante, los factores pueden recuperarse de células como
proteínas solubles o como cuerpos de inclusión, de los que pueden
extraerse cuantitativamente por medio de clorhidrato de guanidinio
8M y diálisis. Para purificar más los factores, puede usarse
cromatografía de intercambio iónico convencional, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía en fase inversa o filtración
en gel.
Los receptores heterodiméricos
sR\alpha:\beta pueden fabricarse usando regiones de fusión
conocidas, como se describe en la solicitud PCT publicada WO
93/10151 que describe la producción de heterodímeros de receptores
\beta, o pueden prepararse por entrecruzamiento de dominios
extracelulares por medios químicos. Los dominios utilizados pueden
estar constituidos por el dominio extracelular completo de los
componentes \alpha y \beta, o pueden estar constituidos por
mutantes o fragmentos de los mismos que mantienen la capacidad para
formar un complejo con su ligando y otros componentes en el
complejo sR\alpha:\beta1.
En una forma de realización de la invención, los
dominios extracelulares se fabrican usando cremalleras de leucina.
Se ha mostrado que los dominios de las cremalleras de leucina de los
factores de transcripción c-jun y
c-fos humanos forman heterodímeros estables (Busch y
col. (1990) Trends Genetics 6: 36-40; Gentz y col.
(1989) Science 243: 1695-1699) con una
estequiometría 1:1. Aunque también se ha mostrado que se forman
homodímeros jun-jun, son aproximadamente 1000 veces
menos estables que los heterodímeros jun-fos. No se
han detectado homodímeros fos-fos.
El dominio de cremallera de leucina de
c-jun o c-fos se fusionan en marco
en el extremo C terminal de los dominios soluble o extracelular de
los componentes del receptor mencionados anteriormente fabricando
genéticamente genes quiméricos. Las fusiones pueden ser directas o
pueden utilizar un dominio de conector flexible, tal como la región
de bisagra de IgG humana, o conectores polipeptídicos constituidos
por aminoácidos pequeños tales como glicina, serina, treonina o
alanina, en diversas longitudes y combinaciones. Además, las
proteínas quiméricas pueden marcarse por medio de
His-His-His-His-His-His
(His6) (SEC. ID Nº: 25) para permitir la rápida purificación por
medio de cromatografía de quelatos metálicos, y/o por medio de
epítopos para los que están disponibles anticuerpos, para
permi-
tir la detección en transferencias western, inmunoprecipitación o depleción/bloqueo de la actividad en bioensayos.
tir la detección en transferencias western, inmunoprecipitación o depleción/bloqueo de la actividad en bioensayos.
En otra forma de realización, el heterodímero
sR\alpha:\beta1 se prepara usando el dominio Fc de IgG1 humana
(Aruffo y col. (1991) Cell 67: 35-44). En contraste
con el último, la formación de heterodímeros, debe alcanzarse
bioquímicamente, ya que las moléculas quiméricas que llevan el
dominio Fc se expresarán como homodímeros unidos por enlaces
disulfuro. Por consiguiente, los homodímeros pueden reducirse bajo
condiciones que favorezcan la interrupción de los disulfuros
intercadena pero no tengan efecto sobre los disulfuros intracadena.
A continuación se mezclan monómeros con diferentes porciones
extracelulares en cantidades equimolares y se oxidan para formar
una mezcla de homo y deterodímeros. Los componentes de esta mezcla
se separan por medio de técnicas cromatográficas. Como alternativa,
puede predisponerse la formación de este tipo de heterodímeros por
medio de ingeniería genética y moléculas de expresión que están
constituidas por la porción soluble o extracelular de los
componentes del receptor seguido por el dominio Fc de IgGh, seguido
por las cremalleras de leucina c-jun o el
c-fos descritas anteriormente (Kostelny y col.
(1992) J. Immunol. 148: 1547-1553). Como estas
cremalleras de leucina forman predominantemente heterodímeros,
pueden usarse para dirigir la formación de los heterodímeros donde
se desee. Como para las proteínas quiméricas descritas usando
cremalleras de leucina, estos pueden también marcarse con quelatos
metálicos o un epítopo. Este dominio marcado puede usarse para la
rápida purificación por medio de cromatografía de quelatos
metálicos, y/o por anticuerpos, para permitir la detección en
transferencias western, inmunoprecipitación, o depleción/bloqueo de
la actividad en bioensayos.
En otras formas de realización, pueden
prepararse heterodímeros usando otros dominios derivados de
inmunoglobulinas para dirigir la formación de dímeros. Tales
dominios incluyen, por ejemplo, las cadenas pesadas de IgG (Cg1 y
Cg4), así como las regiones constantes de las cadenas livianas kappa
(k) y lambda (l) de las inmunoglobulinas humanas. La
heterodimerización de Cg con la cadena liviana se produce entre el
dominio CH1 de Cg y la región constante de la cadena liviana
(C_{L}), y se estabiliza por medio de enlaces covalentes de los
dos dominios a través de un único puente disulfuro. Por
consiguiente, pueden prepararse construcciones usando estos dominios
de inmunoglobulinas. Como alternativa, los dominios de las
inmunoglobulinas incluyen dominios que pueden derivar de
componentes de receptores de células T que dirigen la
dimerización.
En otra forma de realización de la invención,
los heterodímeros sR\alpha:\beta1 se preparan por expresión
como moléculas quiméricas utilizando bucles de conectores flexibles.
Se diseña una construcción de ADN que codifica la proteína
quimérica para que exprese dos dominios solubles o extracelulares
fusionados juntos en tándem ("cabeza con cabeza") por medio de
un bucle flexible. Este bucle puede ser completamente artificial
(por ejemplo repeticiones de poliglicina interrumpidas por serina o
treonina en un determinado intervalo) o "prestado" de
proteínas que se presentan naturalmente (por ejemplo la región de
bisagra de IgGh). Pueden fabricarse moléculas en las que el orden
de los dominios solubles o extracelulares fusionados está cambiado
(por ejemplo sIL6Ra/bucle/sgp130 o
sgp130/bucle/sIL-6Ra) y/o en las que varía la
longitud y composición del bucle, para permitir la selección de
moléculas con características deseadas.
Como alternativa, los heterodímeros creados
según la presente invención pueden purificarse a partir de líneas
celulares cotransfectadas con los componentes \alpha y \beta
adecuados. Los heterodímeros pueden separarse de los homodímeros
usando procedimientos disponibles por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, pueden recuperarse cantidades limitadas de
heterodímeros por elución pasiva de geles preparativos de
poliacrilamida, no desnaturalizantes. Como alternativa, los
heterodímeros pueden purificarse usando cromatografía de intercambio
catiónico de alta presión. Se ha obtenido excelente purificación
usando una columna de intercambio catiónico Mono S.
Las dosis eficaces útiles para tratar
enfermedades o trastornos relacionados con IL-1
pueden determinarse usando procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Fingl, y col. (1975) The
Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds.
Macmillan Publishing Co., Nueva York, páginas
1-46). Las composiciones farmacéuticas para uso
según la invención incluyen los antagonistas descritos anteriormente
en un vehículo líquido, sólido o semisólido aceptable o molécula
marcadora (por ejemplo, anticuerpo, hormona, factor de crecimiento,
etc.) y/o incorporados en liposomas, microcápsulas y preparaciones
de liberación controlada (incluidas células que expresan
antagonistas) previo a la administración in vivo. Por
ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender uno o más de
los antagonistas en una disolución acuosa, tal como agua estéril,
disolución salina, tampón de fosfato o disolución de dextrosa. Como
alternativa, los agentes activos pueden estar comprendidos en una
formulación sólida (por ejemplo, cera) o semisólida (por ejemplo,
gelatinosa) que puede implantarse en un paciente que necesite tal
tratamiento. La vía de administración puede ser cualquier modo de
administración conocido en la técnica, incluidos pero no limitados
a, vía intravenosa, intratecal, subcutánea, por inyección en el
tejido implicado, vía intraarterial, intranasal, oral o a través de
un dispositivo implantado.
La administración puede dar como resultado la
distribución del agente activo de la invención a lo largo del
cuerpo o en un área localizada. Por ejemplo, en algunas condiciones
que incluyen regiones distantes del sistema nervioso, puede ser
deseable la administración intravenosa o intratecal del agente. En
algunas situaciones, puede colocarse un implante que contiene el
agente activo en o cerca del área lesionada. Los implantes adecuados
incluyen, pero no se limitan a, implantes basados en esponja de
gelatina "gelfoam", cera o micropartículas.
Los dominios extracelulares de los receptores de
citocinas humanos se obtuvieron por técnicas de PCR convencionales
usando ADNc de tejido (CLONTECH), se clonaron en el vector de
expresión, pMT21 (Genetics Institute, Inc.), y se secuenciaron las
secuencias por medio de técnicas convencionales usando un
secuenciador de ADN ABI 373A y el kit Taq Dideoxy Terminator Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Para el
IL-1RAcP, se clonaron los nucleótidos 1 hasta 1074
(correspondientes a los aminoácidos 1-358) de la
secuencia del Genbank, AB006357. Para el IL-1RI, se
clonaron los nucleótidos 55 hasta 999 (correspondientes a los
aminoácidos 19-333) de la secuencia del Genbank,
X16896.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de nucleótidos que codifican las
trampas de citocinas se construyeron a partir de los ADN
individuales clonados (descritos supra) por medio de
técnicas de clonación y PCR convencionales. En cada caso, las
secuencias se construyeron en marco de manera que la secuencia que
codifica el primer componente del polipéptido de fusión se
fusionaba con la secuencia que codifica el segundo componente del
polipéptido de fusión seguida por un dominio de Fc (bisagra, región
CH2 y CH3 de IgG1 humana) como el componente formador de multímeros.
En algunos casos se insertaron nucleótidos extra en marco entre las
secuencias que codifican el primer y el segundo componente del
polipéptido de fusión para añadir una región conectora entre los dos
componentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células fibroblásticas de pulmón humano MRC5
responden a IL-1 secretando IL-6 y
pos consiguiente se utilizaron para ensayar la capacidad de las
Trampas de IL-1 para bloquear la producción de
IL-6 dependiente de IL-1. Se probó
la Trampa de IL1 1SC569 frente a
EL-1-RI.Fe que es el dominio
extracelular del receptor de IL-1 Tipo I fusionado
a un dominio de Fc.
Se suspendieron células MRC5 a 1 x 10^{5}
células por ml en medio y se plaquearon 0,1 ml de células (10.000
células por pocillo) en los pocillos de una placa de cultivo tisular
de 96 pocillos. Se incubaron las placas durante 24 horas a 37ºC en
una incubadora con atmósfera húmeda de CO_{2} al 5%.
Se preincuban Trampa de IL-1 e
IL-1 recombinante humana en dosis variables en una
placa de cultivo tisular de 96 pocillos y se incuba durante 2 horas
a 37ºC. A continuación se añaden 0,1 ml de esta mezcla a la placa
de 96 pocillos que contiene las células MRC5 para que la
concentración final de Trampa de IL-1 sea 10nM y
las concentraciones finales de IL-1 varíen desde 2,4
pM hasta 5nM. Los pocillos de control contienen Trampa sola o no
contienen nada.
A continuación se incubaron las placas a 37ºC
durante 24 horas en una incubadora con atmósfera húmeda de CO_{2}
al 5%. Se recoge el sobrenadante y se ensayan los niveles de
IL-6 usando el kit Quantikine Immunoassay de
R&D Systems según las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
La IL-1 es una citocina
proinflamatoria. Se ha mostrado que la administración sistémica de
IL-1 provoca respuestas agudas en animales,
incluidas hiperglucemia transitoria, hipoisulinemia, fiebre,
anorexia y niveles aumentados de interleucina-6
(IL-6) (Reimers, 1998). Como los ratones responden
tanto a la IL-1 murina como a la humana, puede
usarse la IL-1 humana y pueden evaluarse los efectos
de unión de antagonistas específicos de IL-1 in
vivo. Este modelo agudo de ratón se usó para determinar la
capacidad de una Trampa de IL-1 humana para
antagonizar los efectos in vivo de IL-1
humana administrada de manera exógena. Esto proporciona una rápida
indicación de la eficacia de la Trampa de IL-1
humana in vivo y puede usarse como un ensayo para ayudar a
seleccionar moléculas.
Diseño Experimental; Se administró una
inyección subcutánea de IL-1\beta recombinante
humana (IL-1\betarh; 0,3 mg/kg) a ratones C57BL/6
macho. Veinticuatro horas antes de la administración de
IL-1\betarh, se trató a los animales con
vehículo, con Trampa de IL-1 569 (exceso molar de 50
o 150 veces; 0,18 ó 0,54 mg/kg, respectivamente), o antagonista del
receptor de IL-1 murino recombinante
(IL-1rarm; exceso molar de 150 ó 750 veces; 45,8 ó
229 \mug/kg, respectivamente). 2 horas tras la administración de
IL-1\betarh se tomaron muestras de sangre y se
analizaron los niveles de IL-6 usando un ELISA de
IL-6 de ratón. La administración exógena de
IL-1\betarh aumentó significativamente los
niveles de IL-6 en suero. El tratamiento previo con
un exceso molar de 50 ó 150 veces de Trampa de
IL-1h bloqueó la inducción de IL-6
por IL-1\betarh. Por el contrario, la inyección
de IL-1rarm en un exceso molar de 150 ó 750 veces no
bloqueó la inducción de IL-6.
Resultados, La administración exógena de
IL-1 humana dio como resultado una espectacular
inducción de los niveles de IL-6 en suero. En un
exceso molar de 150 veces, la Trampa de IL-1 bloqueó
completamente el aumento de IL-6 (Fig. 1). Además,
los efectos de la Trampa de IL-1 persistieron
durante al menos 24 horas, evitando un aumento de
IL-6 aún cuando se volvió a administrar
IL-1 (Fig. 1). Tal eficacia de larga duración
sugiere que la inyección diaria de una Trampa de
IL-1 puede no ser necesaria para aplicaciones
crónicas.
En un experimento separado,
IL-1ra en un exceso molar de 150 veces o 750 veces
no bloqueó significativamente la inducción de IL-6.
Por consiguiente, en este paradigma, la Trampa de
IL-1 parece ser un mejor bloqueador de la actividad
de IL-1 (Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Las técnicas usadas para construir los vectores
de ADN descritos en este documento son técnicas convencionales de
biología molecular bien conocidas por los expertos en la técnica
(véase por ejemplo, Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Volúmenes
1, 2 y 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds.
Ausubel y col., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Toda
la secuenciación de ADN se realiza por medio de técnicas
convencionales usando un secuenciador de ADN ABI 373A y el kit DNA
Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems,
Inc., Foster City, CA).
(a) Secuencia de la Trampa de
IL-1 823 Sequence - La Trampa de
IL-1 823 está constituida por el dominio
extracelular de IL-1RacP humano (que corresponde a
los nucleótidos 1-1077 de SEC. ID Nº: 7) seguido por
el dominio extracelular de IL-1RI humano (que
corresponde a los nucleótidos 1078-2013 de SEC. ID
Nº: 7)) seguido por una parte de la región bisagra, los dominios de
CH2 y CH3 de IgG1 humana (que corresponde a los nucleótidos
2014-2703 de SEC. ID Nº: 7) que contienen una
mutación en los nucleótidos 2017-2019 (TGT->GGA)
para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia de ácido
nucleico codifica la secuencia de polipéptidos de fusión como se
presenta en SEC. ID Nº: 8).
(b) Secuencia de la Trampa de
IL-1 823-1198-B - La
secuencia de la Trampa de IL-1
823-11198-B está constituida por el
dominio extracelular de IL-1RacP humano (que
corresponde a los nucleótidos 1-1077 de SEC. ID Nº:
9), seguido por el domino extracelular de IL-1RI
humano (que corresponde a los nucleótidos 1078-2013
de SEC. ID Nº: 9), seguido por una extensión de aminoácidos (que
corresponde a los nucleótidos 2014-2019 de SEC. ID
Nº: 9), seguido por la región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de
IgG4 humana (que corresponde a los nucleótidos
2020-2709 de SEC. ID Nº: 9). La secuencia de ácido
nucleico codifica la secuencia de polipéptidos de fusión como se
presenta en SEC. ID Nº: 10.
(c) Secuencia de la Trampa de
IL-1 823-1267-C - La
secuencia de la Trampa de IL-1
823-1267-C está constituida por el
dominio extracelular de IL-1RAcP humano (que
corresponde a los nucleótidos 1-1077 de SEC. ID Nº:
11), seguido por el domino extracelular de IL-1RI
humano (que corresponde a los nucleótidos 1078-2013
de SEC. ID Nº: 11), seguido por una extensión de aminoácidos (que
corresponde a los nucleótidos 2014-2019 de SEC. ID
Nº: 11), seguido por la región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de
IgG4 humana (que corresponde a los nucleótidos
2020-2709 de SEC. ID Nº: 11) que contiene una
mutación en el nucleótido 2047 (T>C) para cambiar una serina a
una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de
polipéptidos de fusión como se presenta en SEC. ID Nº: 12.
(d) Secuencia de la Trampa de
IL-1 570-FE - La secuencia de la
Trampa de IL-1 570-FE está
constituida por el dominio extracelular de IL-1RI
humano (que corresponde a los nucleótidos 1 hasta 996 de SEC. ID Nº:
1), seguido por el domino extracelular de IL-1RacP
humano (que corresponde a los nucleótidos 997-2013
de SEC. ID Nº: 1) seguido por parte de la región bisagra, los
dominios de CH2 y CH3 de IgG1 humana (que corresponde a los
nucleótidos 2014-2703 de SEC. ID Nº: 1) que contiene
una mutación en los nucleótidos 2017-2019
(TGT->GGA) para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia
de ácido nucleico codifica la secuencia de polipéptidos de fusión
como se presenta en SEC. ID Nº: 2.
(e) Secuencia de la Trampa de
IL-1 570-FE-B - La
secuencia de la Trampa de IL-1
570-FE-B está constituida por el
dominio extracelular de IL-1RI humano (que
corresponde a los nucleótidos 1 hasta 996 de SEC. ID Nº: 3),
seguido por el domino extracelular de IL-1RAcP (que
corresponde a los nucleótidos 997-2013 de SEC. ID
Nº: 3) seguido por una extensión de aminoácidos (que corresponde a
los nucleótidos 2014-2019 de SEC. ID Nº: 3) seguido
por la región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de IgG4 humana (que
corresponde a los nucleótidos 2020-2709 de SEC. ID
Nº: 3). La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de
polipéptidos de fusión como se presenta en
SEC. ID Nº: 4.
SEC. ID Nº: 4.
(f) Secuencia de la Trampa de
IL-1 570-FE-C - La
secuencia de la Trampa de IL-1
570-FE-C está constituida por el
dominio extracelular de IL-1RI humano (que
corresponde a los nucleótidos 1 hasta 996 de SEC. ID Nº: 5),
seguido por el domino extracelular de IL-1RAcP
humano (que corresponde a los nucleótidos 997-2013
de SEC. ID Nº: 5) seguido por una extensión de aminoácidos (que
corresponde a los nucleótidos 2014-2019 de SEC. ID
Nº: 5) seguido por la región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de
IgG4 humana (que corresponde a los nucleótidos
2020-2709 de SEC. ID Nº: 5) que contiene una
mutación en el nucleótido 2047 (T>C) para cambiar una serina a
una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de
polipéptidos de fusión como se presenta en SEC. ID Nº: 6.
(g) Secuencia de la Trampa de
IL-1 1647-CtF - La secuencia de la
Trampa de IL-1 1647-CtF está
constituida por el dominio extracelular de IL-1RII
humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1044 de
SEC. ID Nº: 13) seguido por el domino extracelular de
IL-1RacP humano (que corresponde a los nucleótidos
1045-2058 de SEC. ID Nº: 13) seguido por una parte
de la región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de IgG1 humana (que
corresponde a los nucleótidos 2059-2748 de SEC. ID
Nº: 13) que contiene una mutación en los nucleótidos
2062-2064 (TGT->GGA) para cambiar una cisteína a
una glicina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de
polipéptidos de fusión como se presenta en SEC. ID Nº: 14.
(h) Secuencia de la Trampa de
IL-1 1647-CtF-B - La
secuencia de la Trampa de IL-1
1647-CtF-B está constituida por el
dominio extracelular de IL-1RII humano (que
corresponde a los nucleótidos 1-1044 de SEC. ID Nº:
15) seguido por el domino extracelular de IL-1RacP
humano (que corresponde a los nucleótidos 1045-2058
de SEC. ID Nº: 15) seguido por una extensión de aminoácidos (que
corresponde a los nucleótidos 2059-2064 de SEC. ID
Nº: 15) seguido por la región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de
IgG4 humana (que corresponde a los nucleótidos
2065-2754 de SEC. ID Nº: 15). La secuencia de ácido
nucleico codifica la secuencia de polipéptidos de fusión como se
presenta en SEC. ID Nº: 16.
(i) Secuencia de la Trampa de
IL-1 1647-CtF-C - La
secuencia de la Trampa de IL-1
1647-CtF-C está constituida por el
dominio extracelular de IL-1RII humano (que
corresponde a los nucleótidos 1-1044 de SEC. ID Nº:
17) seguido por el domino extracelular de IL-1RacP
humano (que corresponde a los nucleótidos 1045-2058
de SEC. ID Nº: 17) seguido por una extensión de aminoácidos (que
corresponde a los nucleótidos 2059-2064 de SEC. ID
Nº: 17) seguido por una región bisagra, los dominios de CH2 y CH3 de
IgG4 humana (que corresponde a los nucleótidos
2065-2754 de SEC. ID Nº: 17) que contiene una
mutación en el nucleótido 2092 (T>C) para cambiar una serina a
una prolina. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de
polipéptidos de fusión como se presenta en SEC. ID Nº: 17.
(j) Secuencia de la Trampa de
IL-1 1649 - La secuencia de la Trampa de
IL-1 1649 está constituida por el dominio
extracelular de IL-IRAcP humano (que corresponde a
los nucleótidos 1-1074 de SEC. ID Nº: 19) seguido
por el domino extracelular de IL-1RII humano (que
corresponde a los nucleótidos 1075-2058 de SEC. ID
Nº: 19) seguido por una parte de la región bisagra, los dominios de
CH2 y CH3 de IgG1 humana (que corresponde a los nucleótidos
2059-2748 de SEC. ID Nº: 19) que contiene una
mutación en los nucleótidos 2062-2064 (TGT->GGA)
para cambiar una cisteína a una glicina. La secuencia de ácido
nucleico codifica la secuencia de polipéptidos de fusión como se
presenta en SEC. ID Nº: 20.
(k) Secuencia de la Trampa de
IL-1 1649-B - La secuencia de la
Trampa de IL-1 1649-B está
constituida por el dominio extracelular de IL-1RacP
humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1074 de
SEC. ID Nº: 21) seguido por el domino extracelular de
IL-1RII humano (que corresponde a los nucleótidos
1075-2058 de SEC. ID Nº: 21) seguido por una
extensión de aminoácidos (que corresponde a los nucleótidos
2059-2064) seguido por la región bisagra, los
dominios de CH2 y CH3 de IgG4 humana (que corresponde a los
nucleótidos 2065-2754 de SEC. ID Nº: 21). La
secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de polipéptidos de
fusión como se presenta en SEC. ID Nº: 22.
(l) Secuencia de la Trampa de
IL-1 1649-C - La secuencia de la
Trampa de IL-1 1649-C está
constituida por el dominio extracelular de IL-1RacP
humano (que corresponde a los nucleótidos 1-1074 de
SEC. ID Nº: 23) seguido por el domino extracelular de
IL-1RII humano (que corresponde a los nucleótidos
1075-2058 de SEC. ID Nº: 23) seguido por una
extensión de aminoácidos (que corresponde a los nucleótidos
2059-2064) seguido por la región bisagra, los
dominios de CH2 y CH3 de IgG4 humana (que corresponde a los
nucleótidos 2065-2754 de SEC. ID Nº: 23) que
contiene una mutación en el nucleótido 2092(T>C) para
cambiar una serina a una prolina. La secuencia de ácido nucleico
codifica la secuencia de polipéptidos de fusión como se presenta en
SEC. ID Nº: 24.
Además de las secuencias descritas supra,
también están contempladas por el tema de la invención las
siguientes modificaciones a esas secuencias.
1. Para las Trampas de IL1 823,
823-1198.B y 823-1267.C: alternativa
de AcP: Un cambio en el nucleótido 1043 de A a C para cambiar los
aminoácidos de Lys a Thr. Inserción de SG: Entre los nucleótidos
1077 y 1078 una inserción de los nucleótidos TCC GGA añadirá una
extensión de aminoácidos Ser Gly entre los dos dominios del
receptor de la Trampa.
2. Para las Trampas de IL1
570-FE, 570-FE.B y
570-FE.C: alternativa de AcP: Un cambio en el
nucleótido 1979 de A a C para cambiar el aminoácido de Lys a Thr.
Inserción de SG: Entre los nucleótidos 996 y 977 una inserción de
los nucleótidos TCC GGA añadirá una extensión de aminoácidos Ser Gly
entre los dos dominios del receptor de la Trampa.
3. Para las Trampas de IL1
1647-CtF, 1647-CtF.B y
1647-CtF.C: alternativa de AcP: Un cambio en el
nucleótido 2027 de A a C para cambiar el aminoácido de Lys a Thr.
Inserción de SG: Entre los nucleótidos 1044 y 1045 una inserción de
los nucleótidos TCC GGA añadirá una extensión de aminoácidos Ser Gly
entre los dos dominios del receptor de la Trampa.
4. Para las Trampas de IL1 1649,
1649-B y 1649-C: alternativa de AcP:
Un cambio en el nucleótido 1043 de A a C para cambiar el aminoácido
de Lys a Thr. Inserción de SG: Entre los nucleótidos 1074 y 1075 una
inserción de los nucleótidos TCC GGA añadirá una extensión de
aminoácidos Ser Gly entre los dos dominios del receptor de la
Trampa.
Además, un experto en la técnica reconocerá que
puede ser deseable construir Trampas de IL1 en las que los dominios
de Fc deriven de inmunoglobulinas con diferentes alotipos. Ninguna
de las modificaciones descritas supra alterará la capacidad
de las Trampas para unir la IL-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Antecedentes: El zimosan es un extracto
de la pared celular de las levaduras que cuando se inyecta en la
rodilla causa inflamación aguda y regulación positiva de
IL-1\beta en la articulación (Joosten y col.
(1994) Clin Exp Immunol 97: 204-211). Los
condrocitos responderán a la inflamación y a la
IL-1\beta en la articulación regulando
negativamente la síntesis de proteoglicanos, una característica de
la artritis humana que contribuye a la destrucción gradual del
cartílago de la articulación (van den Berg y col. (1982) Rheum Intl
1: 165-169). Los antagonistas para
IL-1\beta pueden usarse para evaluar su capacidad
para bloquear los efectos de las elevaciones de
IL-1\beta inducidas por zimosan.
Materiales y procedimientos: Se
administró una inyección intraarticular (i.a.) de zimoxan A (Sigma;
300 \mug en 10 \mul) a ratones C57BL/6 macho anestesiados, en
la articulación de la rodilla derecha a través del ligamento
patelar. Se inyectó PBS estéril i.a. (10 \mul) en la articulación
de la rodilla izquierda a través del ligamento patelar.
Veinticuatro horas antes de las inyecciones i.a., se trataron los
animales con vehículo o Trampa de IL-1h 569 (19
mg/kg, s.c.). Se extirparon las rodillas 24 horas tras la inyección
de zimosan para medir la síntesis de proteoglicanos según
describieron van den Berg y col. (1982) supra. Brevemente, se
incubó cada rodilla y el ligamento asociado durante 3 horas a 37ºC,
CO_{2} al 5% en medio (RPMI con HEPES, HCO_{3}, glutamina y
penicilina/estreptomicina) que contenía
^{35}S-sulfato (NEN DuPont) 10 \muCi/ml. Tras la
incubación, se lavó el tejido y se fijó durante la noche en
formalina al 10% (VWR). A continuación se colocó el tejido en
Solución Descalcificadora (J.T. Baker) durante 4 horas antes de la
disección de la rodilla del tejido circundante. Posteriormente se
incubó cada rodilla en Solvable (Packard) a 50ºC. Se añadió líquido
de centelleo Ultima Gold (Packard) y se realizó el conteo de las
muestras en un contador de centelleo. Los valores se informaron
como la relación de cpm de rodilla con zimosan/cpm de rodilla con
vehículo para cada animal.
Resultados: La inyección articular de
zimosan reduce la síntesis de proteoglicanos en aproximadamente el
50% con relación a la inyección de vehículo (Fig. 3). La
administración de Trampa de IL-1h previo a la
inyección de zimosan bloqueó la acción local de
IL-1\beta y la síntesis de proteoglicanos volvió a
aproximadamente el 90% del control. Estos datos demuestran que la
Trampa de IL-1h 569 puede penetrar en las
articulaciones tras la inyección subcutánea y puede neutralizar
eficazmente el efecto biológico de IL-1 dentro de
estas articulaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Antecedentes. Se ha implicado a la
IL-1 en el desarrollo de la inflamación y
destrucción del cartílago en la artritis reumatoide (Dinarello
(1996) Blood 87(6): 2095-2147; Wooley y col.
(1993) Arthritis & Rheumatism 36(9):
1305-1314). La artritis inducida por colágeno (CIA)
es un modelo animal de poliartritis inflamatoria muy estudiado que
tiene similitudes con la artritis reumatoide; las características
histopatológicas comunes incluyen inflamación y erosión articular,
hiperplasia sinovial e infiltración de células inflamatorias (Joe y
col. (1999) Mol Med Today 5: 367-369). Como estudios
previos han mostrado que diversos tratamientos
anti-EL-1 tienen un efecto positivo
para reducir los síntomas de la artritis en animales CIA (van den
Berg y col. (1994) Clin Exp Immunol 95: 237-243;
Joosten y col. (1999) J Immunol 163: 5049-5055.; van
de Loo y col. (1992) J Rheumatol 19: 348-356.), los
solicitantes examinaron el efecto de una versión murina de la Trampa
de IL-1 (Trampa de IL-1m) en la
progresión de los síntomas de artritis en este modelo animal. La
versión humana de la Trampa de IL-1 tiene poca
reactividad cruzada con la IL-1 de roedor. La Trampa
de IL-1m está constituida por el dominio
extracelular de IL-1RacP murino, seguido por el
domino extracelular de IL-1 RI murino, seguido por
la bisagra, domino CH2 y CH3 de murino.
Materiales y procedimientos. Se
inmunizaron ratones DBA-1 macho (Jackson
Laboratories) por vía intradérmica en la base de la cola con 100
\mug/50\mul de colágeno tipo II bovino (CII; Chondrex)
emulsionado con adyuvante de Freund completo e incompleto (relación
2:1:1; Chondrex) y se estimularon por vía intradérmica con CII (100
\mug/50 \mul) emulsionado con adyuvante de Freund incompleto en
el día 21. Como la CIA se produce en los ratones
DBA-1 gradualmente durante un período de tiempo
prolongado con baja incidencia (Joosten y col. (1994) Clin Exp
Immunol 97:204-211.), los solicitantes sincronizaron
el inicio de los síntomas de artritis inyectando los animales por
vía intraperitoneal en el día 30 con 3 mg de zimosan (Sigma). Dos
horas antes de la inyección de zimosan, se distribuyeron los
ratones de manera aleatoria en grupos de tratamiento y se les
inyectó vehículo o Trampa de IL-1m (31 ó 10 mg/kg,
3X/semana, 8 inyecciones, s.c.). Se evaluaron los síntomas de
artritis (puntuaciones ASI, según describieron Wooley y col. (1993)
artritis & Rheumatism 36(9): 1305-1314)
en las patas 3X/semana por individuos cegados para los grupos de
tratamiento. Los animales se sacrificaron 24 horas después de la 8º
inyección, momento en que se midió el ancho de las patas junto con
las puntuaciones ASI.
Resultados. Dentro de los 5 días tras la
inyección i.p. de zimosan, los animales tratados con vehículo
tuvieron un aumento significativo de la puntuación ASI con relación
a los que recibieron Trampa de IL-1m (Fig. 4) con
los síntomas alcanzando un máximo 10 a 14 días tras la inyección de
zimosan. La Trampa de IL-1 murina actuó de manera
dependiente de la dosis de manera que los animales que recibieron 10
mg/kg de Trampa tuvieron más síntomas de artritis (mayor puntuación
ASI) que los que recibieron 31 mg/kg. Sin embargo, ambos grupos
tratados con Trampa de IL-1m tuvieron un grado de
síntomas de artritis significativamente más bajo que el grupo con
vehículo. La diferencia en la puntuación ASI también se refleja en
el ancho de pata en el momento del sacrificio (Fig. 5). Los
animales que recibieron Trampa de IL-1m tuvieron
anchos de para que eran similares a los de animales sin
tratamiento, no inmunizados con colágeno. Estos datos indican que
la Trampa de IL-1m puede neutralizar eficazmente
IL-1 y bloquear el desarrollo de las articulaciones
artríticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron diversas concentraciones de Trampa
de IL-1 1649 en presencia de IL-1b
humana 5 pM durante la noche a temperatura ambiente. A continuación
se añadieron las mezclas a pocillos de células
293-NFkB por duplicado (20.000 células/pocillo)
durante 5 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. Las células
293-NFkB contienen un plásmido informador integrado
de manera estable que tiene un gen de luciferasa dirigido por un
promotor que contiene 5 sitios de NFkB. La adición de
IL-1b da como resultado el aumento de la expresión
del gen de luciferasa. Se añadió reactivo
Steady-Glo (Promega) a las células durante 15
minutos a temperatura ambiente y se cuantificó la expresión del gen
de luciferasa como unidades relativas de luz (URL) por luminometría.
La Trampa de IL-1 1649 exhibe una CI_{50} de 32
pM que indica una Kd de aproximadamente 30 pM (Fig. 6). Estos datos
indican que la Trampa de EL-1 1649 bloquea de
manera potente la IL-1.
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTAGONISTAS BASADOS EN RECEPTORES
DE IL-1 Y PROCEDIMIENTOS DE FABRICACIÓN Y USO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> REG 203C-WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> a asignar
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
24-10-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10/282.162
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-10-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/787.835
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-03-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/22045
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-09-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PastSEQ para Versión 3.0 de
Windows
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2703
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 900
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 2709
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 902
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<400> 5
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<210> 6
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<211> 2709
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<212> ADN
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 902
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<211> 2709
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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<211> 902
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 13
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<211> 2748
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
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<210> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 2754
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<211> 917
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 22
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<211> 2754
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<212> ADN
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier Aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (13)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende la secuencia de SEC. ID Nº 7, en la que la molécula de
ácido nucleico aislada codifica un polipéptido de fusión que forma
un multímero capaz de unir la interleucina 1 (IL-1)
para formar un complejo no funcional.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1 que codifica la secuencia de SEC. ID Nº 8.
3. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó
2.
4. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 unida de manera operativa a una secuencia de
control de expresión.
5. Una célula huésped adecuada que comprende el
vector de la reivindicación 4 para uso en la producción de un
polipéptido de fusión.
6. La célula huésped de la reivindicación 5, en
la que la célula huésped es una célula bacteriana, una célula de
levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero.
7. La célula huésped de la reivindicación 6, en
la que la célula huésped es una célula CHO.
8. Un procedimiento para producir un polipéptido
de fusión que comprende cultivar las células de la reivindicación
6, bajo condiciones que permiten la producción de un polipéptido de
fusión y recuperar el polipéptido de fusión producido de esa
manera.
9. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 1, en el que el ácido nucleico de SEC. ID Nº 7
comprende uno o más de los siguientes cambios:
(a) el nucleótido 1043 de SEC. ID Nº 7, se
cambia de A a C; y
(b) los nucleótidos TCC GGA se insertan entre
los nucleótidos 1077 y 1078.
10. Un polipéptido de fusión codificado por las
moléculas de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1
ó 9.
11. Un polipéptido de fusión que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 8.
12. Un multímero capaz de unir
IL-1 para formar un complejo no funcional que
comprende un polipéptido de fusión de la reivindicación 11.
13. El multímero de la reivindicación 12 que es
un dímero.
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