TW202015723A - 治療ａ型血友病的方法 - Google Patents

Abstract

本公開提供一種治療有需要的人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)因子VIII(FVIII)蛋白，和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域之馮威里氏因子(von Willebrand factor，VWF)片段。

Description

治療A型血友病的方法 優先權申請的引用

本申請主張於2018年5月18日提交的美國臨時申請號62/673,670，於2018年7月31日提交的美國臨時申請號62/712,880，於2018年11月30日提交的美國臨時申請號62/773,785，和於2019年2月5日提交的美國臨時申請號62/801,576的優先權的權益，其中每個通過提述以其整體併入本文。

電子提交的序列表的引用

以ASCII文本文件電子提交的序列表(名稱：SA9-461PC_SeqListing；大小：922千字節；創建日期：2019年5月14日)的內容通過提述以其整體併入本文。

本申請案提供一種治療有需要的人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)因子VIII(FVIII)蛋白，和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域之馮威里氏因子(von Willebrand factor，VWF)片段。

背景技術

A型血友病是由編碼凝血因子VIII(coagulation factor VIII,FVIII)的基因的缺陷引起的出血障礙，且影響10,000個男性出生者中的1-2個。Graw等，Nat.Rev.Genet. 6(6)：488-501(2005)。受A型血友病影響的患者可經輸注純化的或重組產生的FVIII來治療。已知許多可商購的FVIII產品其半衰期為約8-12小時，這需要向患者頻繁靜脈內施用。參見Weiner M.A.和Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001；Lillicrap,D.Thromb.Res.122增刊4：S2-8(2008)。此外，已經嘗試了許多方法以便延長FVIII半衰期。例如，延長凝血因子(clotting factor)的半衰期 的開發中方法，包括聚乙二醇化、糖基聚乙二醇化(glycopegylation)和與白蛋白的綴合。參見Dumont等，Blood. 119(13)：3024-3030(2012)。已經在人類中證明了一致的結果，例如，據報導，相較於ADVATE^® ，rFVIIIFc在A型血友病患者中改善半衰期多達~1.7倍。參見Powell等，Blood. 119(13)：3031-3037(2012)。因此，儘管改善不多，但半衰期增加指示其它半衰期限制性因素的存在。參見Liu,T.等，2007 ISTH會議，摘要#P-M-035；Henrik,A.等，2011 ISTH會議，摘要#P=MO-181；Liu,T等，2011 ISTH會議摘要#P-WE-131。

目前推薦的護理標準涉及定期施用FVIII(常規預防)以使出血事件的數目最小化。常規預防與長期成果的改善有關，但其是一種高要求的方案，由於需要頻繁的靜脈內(IV)施用而受限制。參見Manco-Johnson等，N Engl J Med.357(6) ：535-44(2007)。延長半衰期的FVIII產品已經降低了用於預防的FVIII施用的頻率；然而，所有這些產品均與馮威里氏因子(von Willebrand factor，VWF)相互作用並具有相當的循環半衰期，與由於內源性VWF的半衰期引起的rFVIII變異體的半衰期上限一致。參見，例如，Pipe等，Blood. 128(16)：2007-16(2016)。這些FVIII產品的預防性給藥是每3至5天。

更長時間段預防並控制出血事件(導致更少頻率的施用)的下一代延長半衰期的FVIII產品，將可能會解決堅持高要求預防性方案的挑戰，從而可改善血友病患者的生活質量。

本公開的某些方面涉及一種治療有需要的人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)因子VIII(FVIII)蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的馮威里氏因子(von Willebrand factor，VWF)片段，其中該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg，且該給藥間隔為至少約每7天。

在一些實施例中，該多劑量包含至少兩個劑量、至少三個劑量、至少四個劑量、至少五個劑量、至少六個劑量、至少七個劑量、至少八個劑量、 至少九個劑量、至少十個劑量、至少十一個劑量、至少十二個劑量、至少十三個劑量、至少十四個劑量、至少十五個劑量、至少十六個劑量、至少十七個劑量、至少十八個劑量、至少十九個劑量、至少二十個劑量、或更多個。

在一些實施例中，A型血友病的治療包括控制或降低有需要的個體人類個體的出血事件的發生率或頻率。在一些實施例中，A型血友病的治療包括預防或治療有需要的個體人類個體的出血事件。

在一些實施例中，該多劑量的至少一個為約20IU/kg至約95IU/kg、約20IU/kg至約90IU/kg、約20IU/kg至約85IU/kg、約20IU/kg至約80IU/kg、約20IU/kg至約75IU/kg、約20IU/kg至約70IU/kg、約20IU/kg至約65IU/kg、約20IU/kg至約60IU/kg、約20IU/kg至約55IU/kg、約20IU/kg至約50IU/kg、約20IU/kg至約45IU/kg、約20IU/kg至約40IU/kg、約20IU/kg至約35IU/kg、約20IU/kg至約30IU/kg、或約20IU/kg至約25IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約100IU/kg、約25IU/kg至約100IU/kg、約30IU/kg至約100IU/kg、約35IU/kg至約100IU/kg、約40IU/kg至約100IU/kg、約45IU/kg至約100IU/kg、約50IU/kg至約100IU/kg、約55IU/kg至約100IU/kg、約60IU/kg至約100IU/kg、約65IU/kg至約100IU/kg、約70IU/kg至約100IU/kg、約75IU/kg至約100IU/kg、約80IU/kg至約100IU/kg、約85IU/kg至約100IU/kg、或約90IU/kg至約100IU/kg。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約80IU/kg，約25IU/kg至約75IU/kg、約30IU/kg至約70IU/kg、約35IU/kg至約65IU/kg、約40IU/kg至約60IU/kg、或約45IU/kg至約55IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約20IU/kg、約25IU/kg、約30IU/kg、約35IU/kg、約40IU/kg、約45IU/kg、約50IU/kg、約55IU/kg、約60IU/kg、約65IU/kg、約70IU/kg、約75IU/kg、約80IU/kg、約85IU/kg、約90IU/kg、約95IU/kg、或約100IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg。在一些 實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg。

在一些實施例中，該給藥間隔為至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天、至少約26天、至少約27天、至少約28天、至少約29天、至少約30天、或至少約31天。

在一些實施例中，該給藥頻率為至少每週一次、至少每2週一次、至少每3週一次、或至少每4週一次。在一些實施例中，該給藥間隔為至少每週一次。在一些實施例中，該給藥間隔為至少每兩週一次。

在一些實施例中，該嵌合多肽係施用於預防性治療。

在一些實施例中，該FVIII蛋白通過共價鍵與該VWF片段締合。在一些實施例中，該共價鍵是肽鍵或雙硫鍵。

在一些實施例中，該FVIII蛋白包含FVIII多肽和第一延長半衰期的部分。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分與該FVIII多肽的C端或N端融合。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽內。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽的B域。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽內，緊鄰對應於SEQ ID NO：65的胺基酸殘基745的下游。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分通過連接子與該FVIII多肽融合。

在一些實施例中，該VWF片段包含第二延長半衰期的部分。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分與該VWF片段的C端或N端融合。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分被插入在該VWF片段內。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分與該VWF片段的C端融合。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分通過連接子與該VWF片段融合。

在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分、該第二延長半衰期的 部分、或二者選自下列群組：白蛋白、免疫球蛋白Fc區、XTEN序列、人絨毛膜促性腺激素的β次單元的C端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、或其任何片段、衍生物、變異體、和其任何組合。

在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分包含第一XTEN。

在一些實施例中，該第一XTEN被插入在該FVIII多肽內，緊鄰對應於SEQ ID NO：65的胺基酸殘基745的胺基酸的下游。

在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分包含第二XTEN。在一些實施例中，該第二XTEN與該VWF片段的C端融合。

在一些實施例中，該FVIII蛋白包含第一免疫球蛋白(Ig)恆定區或其部分。在一些實施例中，該第一Ig恆定區或其部分與該FVIII多肽的C端或N端融合。在一些實施例中，該第一Ig恆定區或其部分被插入在該FVIII多肽內。在一些實施例中，該第一Ig恆定區或其部分與該FVIII多肽的C端融合。在一些實施例中，該第一Ig恆定區或其部分通過連接子與該FVIII多肽融合。在一些實施例中，該第一Ig恆定區或其部分包含第一Fc域或其部分。

在一些實施例中，該VWF片段包含第二Ig恆定區或其部分。在一些實施例中，該第二Ig恆定區或其部分與該VWF片段的C端或N端融合。在一些實施例中，該第二Ig恆定區或其部分被插入在該VWF片段內。在一些實施例中，該第二Ig恆定區或其部分與該VWF片段的C端融合。在一些實施例中，該第二Ig恆定區或其部分通過連接子與該VWF片段融合。在一些實施例中，該連接子是可切割的連接子。在一些實施例中，該第二Ig恆定區或其部分包含第二Fc域或其部分。

在一些實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段通過該第一Fc域和該第二Fc域之間的共價鍵彼此締合。在一些實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段通過該FVIII蛋白和該VWF片段之間的非共價相互作用進一步彼此締合。

在一個方面中，本文公開的是一種治療個體人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向有需要的該個體施用多劑量的嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含：(i)FVIII蛋白，其包含包含SEQ ID NO：215的胺基酸序列的第 一FVIII多肽片段；包含SEQ ID NO：8(AE288)的胺基酸序列的第一XTEN序列；包含SEQ ID NO：216的胺基酸序列的第二FVIII多肽片段；和包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列的第一Fc區；和(ii)VWF蛋白，其包含：VWF的D’域，該D’域包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列；VWF的D3域，該D3域包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列；包含SEQ ID NO：58(AE144_5A)的胺基酸序列的第二XTEN序列；包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列的a2連接子；和包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列的第二Fc區，且其中該第一Fc區通過雙硫鍵與該第二Fc區共價連接。

在一些實施例中，該嵌合多肽包含FVIII蛋白，該FVIII蛋白包含FVIII多肽、第一XTEN序列、第一Fc區、和VWF蛋白，該VWF蛋白包含VWF的D'域、VWF的D3域、第二XTEN序列、FVIII的a2連接子和第二Fc區，其中該FVIII多肽包含SEQ ID NO：215的胺基酸序列，該第一XTEN序列包含AE288(SEQ ID NO：8)的胺基酸序列，且與SEQ ID NO：215的C端融合，該FVIII多肽進一步包含SEQ ID NO：216的胺基酸序列，該第一Fc區包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列，且與SEQ ID NO：216的C端融合；VWF的D’域包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列；VWF的D3域包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列，該第二XTEN序列包含AE144_5A(SEQ ID NO：58)的胺基酸序列，且與VWF的D3域的C端融合；該a2連接子包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列，且與該第二XTEN序列的C端融合；該第二Fc區包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列，且與該a2連接子的C端融合；且其中該第一Fc區通過雙硫鍵與該第二Fc區連接。

在一些實施例中，該嵌合多肽包含包含FVIII信號肽的FVIII蛋白，該FVIII信號肽包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列。在一些實施例中，該嵌合多肽包含包含VWF信號肽的VWF蛋白，該VWF信號肽包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。在一些實施例中，該嵌合多肽包含包含VWF的D1D2域的VWF蛋白，該D1D2域包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列。

在一些實施例中，該嵌合多肽包含FVIII蛋白，該FVIII蛋白包含與SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：203、或SEQ ID NO：207至少約80%、90%、95%、或100%相同(identical)的胺基酸序列；且VWF蛋白包含與SEQ ID NO：202或SEQ ID NO：205至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列。

在一個實施例中，該嵌合多肽包含包含SEQ ID NO：203的胺基酸序列的FVIII蛋白和包含SEQ ID NO：205的胺基酸序列的VWF蛋白。在另一個實施例中，該嵌合多肽包含包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列的FVIII蛋白和包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列的VWF蛋白。在另一個實施例中，該嵌合多肽包含包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列的FVIII蛋白和包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列的VWF蛋白。

在一些實施例中，該嵌合多肽包含FVIII蛋白，該FVIII蛋白包含與選自以下的序列至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列：FVIII-161(SEQ ID NO：69)、FVIII-169(SEQ ID NO：70)、FVIII-170(SEQ ID NO：71)、FVIII-173(SEQ ID NO：72)；FVIII-195(SEQ ID NO：73)；FVIII-196(SEQ ID NO：74)、FVIII199(SEQ ID NO：75)、FVIII-201(SEQ ID NO：76)；FVIII-203(SEQ ID NO：77)、FVIII-204(SEQ ID NO：78)、FVIII-205(SEQ ID NO：79)、FVIII-266(SEQ ID NO：80)、FVIII-267(SEQ ID NO：81)、FVIII-268(SEQ ID NO：82)、FVIII-269(SEQ ID NO：83)、FVIII-271(SEQ ID NO：84)、FVIII-272(SEQ ID NO：85)、FVIII-312(SEQ ID NO：173)、或FVIII-312A(SEQ ID NO：203)；且VWF蛋白包含與選自以下的序列至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列：VWF031(SEQ ID NO：86)、VWF034(SEQ ID NO：87)、VWF059(SEQ ID NO：197)、VWF059A(SEQ ID NO：202)、或VWF036。

在一些實施例中，該嵌合多肽通過選自下列群組的途徑施用：靜脈內注射、靜脈內輸注、皮下施用、肌肉內施用、口服施用、鼻腔施用、和肺部施用。

在一些實施例中，在施用後，該嵌合多肽導致FVIII血漿活性水平為至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約3%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約5%。

在一些實施例中，在施用後，該嵌合多肽導致FVIII血漿活性水平為 至少約1IU/dL、至少約2IU/dL、至少約3IU/dL、至少約4IU/dL、至少約5IU/dL、至少約6IU/dL、至少約7IU/dL、至少約8IU/dL、至少約9IU/dL、或至少約10IU/dL。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約3IU/dL。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約5IU/dL。

在一些實施例中，在施用該嵌合多肽後至少約5天，該FVIII血漿活性水平為至少約10IU/dL。在一些實施例中，在施用該嵌合多肽後至少約7天，該FVIII血漿活性水平為至少約5IU/dL。在一些實施例中，在施用該嵌合多肽後至少約8天，該FVIII血漿活性水平為至少約3IU/dL。在一些實施例中，在施用該嵌合多肽後至少約10天，該FVIII血漿活性水平為至少約1IU/dL。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg。在一些實施例中，該多劑量為約50IU/kg，且該給藥間隔為約5天。在一些實施例中，該多劑量為約50IU/kg，且該給藥間隔為約7天。在一些實施例中，該多劑量為約50IU/kg，且該給藥間隔為約14天。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個为約50IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約1周。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約1周。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約1周。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約2周。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約2周。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個为約65IU/kg至約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約2周。

在一些實施例中，該給藥間隔為至少約5天。在一些實施例中，該給藥間隔為至少約7天。在一些實施例中，該給藥間隔為約5天至約14天。在一些實施例中，該給藥間隔為約7天至約14天。在一些實施例中，該給藥間隔為至少約10天。在一些實施例中，該給藥間隔為約10天至約21天。在一些實施例中，該給藥間隔為約14天至約21天。在一些實施例中，該給藥間隔為約14天。

在一些實施例中，該個體人類個體是女性。在一些實施例中，該個體人類個體是兒童。在一些實施例中，該個體人類個體是小於或等於約12歲、小於約11歲、小於約10歲、小於約9歲、小於約8歲、小於約7歲、小於約6歲、小於約5歲、小於約4歲、小於約3歲、小於約2歲、或小於約1歲的兒童。

在一些實施例中，該施用在該個體人類個體中誘發對FVIII的免疫耐 受。在一些實施例中，該施用在該個體人類個體中降低對FVIII抑制性免疫反應。在一些實施例中，該對FVIII抑制性免疫反應包含在該個體人類個體中高效價(titer)的抗FVIII抗體。

在一些實施例中，該嵌合多肽的施用在該施用的約7天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約20天、約24天、約25天、約28天、約30天、或約35天後不誘發FVIII抑制因子。在一些實施例中，該嵌合多肽的施用在該施用的約28天後不誘發FVIII抑制因子。

圖1是rFVIIIFc-VWF-XTEN的示意圖。FVIII：因子VIII；VWF：馮威里氏因子；A1、A2、A3、C1、C2：FVIII的域；D'D3：VWF的域；Fc：免疫球蛋白恆定區的Fc區。

圖2A和2B顯示在以低劑量隊列施用25IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN的人類患者中(圖2A)和在以高劑量隊列施用65IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN的人類患者中(圖2B)測試rFVIIIFc-VWF-XTEN的安全性和療效的流程。

圖3A-3B是校正基線的FVIII活性水平的圖示，該校正基線的FVIII活性水平係基於患有重度A型血友病的個體人類個體其活化部分凝血活酶時間(aPTT)測試結果，個體係施用了25IU/kg rFVIII，隨後進行洗脫期，然後施用25IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN(圖3A；低劑量隊列)，或者係施用65IU/kg rFVIII，隨後進行洗脫期，然後施用65IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN(圖3B；高劑量隊列)。水平虛線指示3%、5%、10%、和20% FVIII活性。

圖4是臨床研究設計的示意圖，其係用於在患有嚴重A型血友病、年齡為18-25歲的成人男性、先前經治療的患者(PTP)中評定rFVIIIFc-VWF-XTEN的安全性和耐受性，rFVIIIFc-VWF-XTEN每週一次劑量為50IU/kg或65IU/kg，總共四次給藥。EOS=研究結束；ET=提前終止；PK=藥物代謝動力學。

本公開涉及一種治療有需要的個體人類個體的出血性疾病或病況(例如，A型血友病)的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)因子VIII(FVIII)多肽和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的馮威里氏因子(VWF)片段。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg。在一些實施例中，該給藥間隔為至少約每5天。在一些實施例中，該給藥間隔為至少約每7天。

I．定義

值得注意的是術語「一個(a或an)」實體是指一個或多個該實體；例如，應理解「一個核苷酸序列」代表一個或多個核苷酸序列。同樣地，術語「一(a)」(或「an」)、「一個或多個」和「至少一個」在本文中可互換地使用。

此外，「和/或」當在本文中使用時，其被視為具有或不具有另一個特徵或組成的兩個指定特徵或組成中的每一個的具體公開。因此，在本文中以詞組的形式使用的術語「和/或」，諸如「A和/或B」，旨在包括「A和B」、「A或B」、「A」(單獨的)、和「B」(單獨的)。同樣地，如以詞組形式使用的術語「和/或」，諸如「A、B、和/或C」旨在包含下列方面中的每一個：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨的)；B(單獨的)；和C(單獨的)。

應理解的是，無論在本文中何處用語言「包含(comprising)」來描述方面，還提供了以術語「由......構成」和/或「基本上由......構成」描述的其他類似方面。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本公開涉及的領域中的普通技術人員所通常理解的相同含義。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press；and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，為本領域技術人員提供本公開中使用的許多術語的通用字典。

單位、前綴、和符號以其Système International de Unites(SI)可接受的形式表示。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有指示，否則胺基酸序列以胺基到羧基的方向從左向右書寫。本文提供的標題不是對本公開的各個方面的限制。因此，通過參考整個說明書，可以更全面地定義下面直接定義的術語。

術語「約」在本文中用於意指近似、大致、大約或在區域內。當術語「約」與數字範圍結合使用時，它通過延伸所示數值的上下邊界來修改該範圍。通常，術語「約」可通過，例如10%，向上或向下(更高或更低)的差異來修改高於和低於所述值的數值。

術語「多核苷酸」或「核苷酸」旨在包含單個的核酸以及複數的核酸，且是指經分離的核酸分子或構築體(construct)，例如，信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。在某些實施例中，多核苷酸包含常見的磷酸二酯鍵或非常見的鍵(例如，醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中發現的)。術語「核酸」是指存在於多核苷酸中的任何一個或多個核酸區段，例如，DNA或RNA片段。「經分離的」核酸或多核苷酸是指以從天然環境中去除的核酸分子、DNA或RNA。例如，出於本公開的目的，認為載體中含有的編碼因子VIII多肽的重組多核苷酸是經分離的。經分離的多核苷酸的其他實例，包括保持在異源宿主細胞中或從溶液中其他多核苷酸中所純化(部分地或基本上純化)的重組多核苷酸。經分離的RNA分子包括本公開的多核苷酸其體內或體外RNA轉錄本。根據本公開之經分開的多核苷酸或核酸，進一步包括合成所產生的此類分子。此外，多核苷酸或核酸可包括調控元件，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點、或轉錄終止信號。

由哺乳動物細胞分泌的某些蛋白係與分泌性信號肽締合，一旦開始穿過粗面內質網輸出生長的蛋白質鏈，該分泌信號肽就從成熟蛋白質上切割下來。本領域中普通技術人員知道信號肽通常與多肽的N端融合，且從完整或「全長」多肽中切割，以產生分泌形式或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，天然信號肽或保留有直接分泌多肽能力的序列之功能性衍生物可操作地與多肽締合。另外，可使用異源哺乳動物信號肽，例如，人類組織纖溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶信號肽，或其功能性衍生物。

如本文所用的，術語「多肽」旨在包含單一條的「多肽」以及複數條的「多肽」，且是指由通過醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)構成的分子。術語「多肽」是指任何一條或多條之兩個或多於兩個胺基酸的鏈，且並不是指具體長度的產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或多個胺基酸的一條鏈或多條鏈的任何其他術語，係包括在「多肽」的定義內，且術語「多肽」可代替這些術語中的任何術語使用，或與這些術語中的任何術語可互換地使用。術語「多肽」還意指多肽的表現後修飾產物，包括但不限於糖基化、乙醯化作用、磷酸化作用、醯胺化作用，通過已知的保護/阻斷基團的衍生化、溶蛋白性切割、或通過非天然存在的胺基酸的修飾。多肽可衍生自自然生物來源或通過重組技術所產生，但不一定從指定的核酸序列轉譯。其可以任何方式生成，包括通過化學合成的方式。

「經分離的」多肽或其片段、變異體、或衍生物是指未在其自然環境中的多肽。不需要特定程度的純化。例如，經分離的多肽係簡單地從其天然(native)或自然(natural)環境中移出。出於本公開的目的，認為在宿主細胞中表現的重組產生的多肽和蛋白是經分離的，如同通過任何適合的技術分開、分級或部分地或基本上純化的天然或重組多肽。

本公開還包括多肽的片段或變異體，和其任何組合。術語「片段」或「變異體」當是指本公開的多肽結合域或結合分子時，係包括保留參考多肽的至少一些性質(例如，FcRn結合域或Fc變異體的FcRn結合親和力，FVIII變異體的凝血活性，VWF片段的FVIII結合活性)的任何多肽。除了本文別處討論的具體抗體片段外，多肽的片段包括蛋白水解片段，以及刪除片段，但不包括自然存在地全長多肽(或成熟多肽)。本公開的多肽結合域或結合分子的變異體包括如上所述的片段，且還有具有由於胺基酸替代、缺失或插入而改變的胺基酸序列的多肽。變異體可天然或非天然地存在。非天然存在的變異體可使用本領域已知的誘變技術來產生。變異體多肽可包含保守性或非保守性胺基酸替代、缺失或添加。

本文中使用的術語「一個或多個VWF蛋白(VWF protein或VWF proteins)」意指與FVIII相互作用並保留通常由全長VWF所提供的至少一種或多種性質的任何VWF片段，該性質為例如，防止對FVIIIa的不成熟活化，防止不成熟蛋白水解，防止與磷脂膜締合(其可導致不成熟的清除)，防止結合FVIII清除受體(該受體可結合至裸FVIII但不結合與VWF結合的FVIII)，和/或穩定FVIII重鏈和輕鏈的相互作用。本文中提及的VWF片段是短於全長VWF蛋白的VWF多肽，其中該VWF片段保留與FVIII相互作用和/或結合的能力。

「保守性胺基酸替代」是胺基酸殘基係由具有相似側鏈的胺基酸殘基所取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族已經在本領域中定義，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如，天門冬胺酸、麩胺酸)，無電荷的極性側鏈(例如，甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)，非極性側鏈(例如，丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)，β-支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、擷胺酸、異白胺酸)和芳香族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，如果多肽中的胺基酸由來自相同側鏈家族的另一胺基酸所取代，則認為該替代是保守性的。在其它實施例中，一串胺基酸可以用結構相似但在側鏈家族成員的順序和/或組成上不同的胺基酸串來保守性地取代。

如本領域中已知的，兩個多肽之間的「序列同一性」係通過比較一個多肽的胺基酸序列和第二多肽的序列來確定。當在本文中討論時，可使用本領域中已知的方法和計算機程式/軟體來確定任何特定多肽是否與另一多肽至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或100%相同，所述方法和計算機程式/軟體諸如，但不限於，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法，以發現兩個序列之間同源性的最佳區段。當使用BESTFIT或任何其他序列比對程序來確定特定序列與根據本公開的參考序列是否例如有95%相同時，其參數係自然被設定，使得在全長參考多肽序列上計算同一性百分比且允許出現至多為在參考序 列胺基酸總數5%的同源性缺口。

如本文所用的，VWF序列或FVIII蛋白質序列中的「對應的胺基酸」或「等同胺基酸」係藉由進行最大化第一VWF或FVIII序列和第二VWF或FVIII序列之間的同一性或相似性之鑑定來找出。用於鑒定第二VWF或FVIII序列中的等同胺基酸的數目係基於用以鑒定該第一VWF或FVIII序列中的相應胺基酸的數目。

如本文所用的，術語「插入位點」是指在FVIII多肽，或其片段、變異體、或衍生物中的位置，其是緊鄰可插入延長半衰期的部分或異源部分的位置的下游。「插入位點」被指定為數字，該數字是成熟之天然FVIII(SEQ ID NO：65)中的插入位點(其緊鄰C端)對應於插入位置的胺基酸的號碼。例如，詞組「a3包含在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸1656的插入位點處的XTEN」，係指示該異源部分係位於對應於SEQ ID NO：65的胺基酸1656和胺基酸1657的兩個胺基酸之間。

如本文所用的詞組「緊鄰胺基酸下游」是指緊鄰胺基酸的末端羧基基團的位置。例如，緊鄰對應於成熟野生型FVIII蛋白的胺基酸745的下游的插入位點，意指對應於成熟野生型FVIII蛋白的胺基酸745和胺基酸746之間的插入位點。相似地，詞組「緊鄰胺基酸上游」是指緊鄰胺基酸的末端胺基基團的位置。

如本文所用的詞組「插入位點的兩個胺基酸之間」是指在兩個鄰近的胺基酸之間插入有XTEN或任何其他多肽的位置。因此，詞組「緊鄰胺基酸下游插入的」和「在插入位點的兩個胺基酸之間插入的」與「在插入位點處插入的」係同義地使用。

如本文所用的術語「插入的(inserted)」、「被插入(is inserted)」、「插入至...中(inserted into)」或語法上相關的術語，是指XTEN在嵌合多肽中相對於天然成熟的人類FVIII中的類似位置。如本文所用的術語是指重組FVIII多肽相對於天然成熟的人類FVIII的特性，且並不指示、暗示或推斷任何製造嵌合多肽的方法或過程。例如，關於本文所提供的嵌合多肽，詞組「XTEN係被插入至緊鄰FVIII多肽的殘基745的下游中」，意指嵌合多肽係包含緊鄰對應於天然成熟 的人類FVIII中的胺基酸745的下游的XTEN，例如，係以對應於天然成熟人FVIII的胺基酸745和746的胺基酸邊界。

「融合」或「嵌合」蛋白係包含第一胺基酸序列，其與第二胺基酸序列連接，其在自然界中不是天然連接的。正常情況下在分開的蛋白中所存在的胺基酸序列，可以一起放在融合多肽中，或正常情況下在同一蛋白中存在的胺基酸序列可以在融合多肽中以新的排列方式重新放置，例如本公開的因子VIII域與Ig Fc域之融合。舉例來說，融合蛋白係通過化學合成，或通過創建和轉譯一個多核苷酸來製成，在所述的多核苷酸中其胜肽區域係以期望的關係來編碼。嵌合多肽可進一步包含第二胺基酸序列，其係通過共價鍵、非肽鍵或非共價鍵與該第一胺基酸序列締合。

如本文所用的術語「連接的」是指共價地或非共價地與第二胺基酸序列或核苷酸序列對應接合的第一胺基酸序列或核苷酸序列。第一胺基酸或核苷酸序列可與第二胺基酸或核苷酸序列直接接合或並列，或者，可由介於中間的序列將該第一序列與該第二序列共價地接合。術語「連接的」不僅意指第一胺基酸序列與第二胺基酸序列在C端或N端處的融合，還包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入至第二胺基酸序列(或第一胺基酸序列，各自地)中的任何兩個胺基酸中。在一些實施例中，第一胺基酸序列可通過肽鍵或連接子與第二胺基酸序列連接。第一核苷酸序列可通過磷酸二酯鍵或連接子與第二核苷酸序列連接。該連接子可以是單肽或多肽(對於多肽鏈而言)、或核苷酸或核苷酸鏈(對於核苷酸鏈而言)、或任何化學部分(對多肽和多核苷酸鏈而言)。術語「連接的」也由連接符號(-)所表示。

如本文所用的術語「與...締合」是指在第一胺基酸鏈和第二胺基酸鏈之間所形成的共價或非共價鍵。在一些實施例中，術語「與...締合」意指共價鍵、非肽鍵或非共價鍵。此關聯可由冒號指示，例如(：)。在其他實施例中，其意指除肽鍵外的共價鍵。例如，胺基酸半胱胺酸包含巰基基團，該巰基基團可與第二個半胱胺酸殘基上的巰基基團形成雙硫鍵或橋。在大多數天然存在的IgG分子中，CH1和CL區可通過雙硫鍵締合，且其兩個重鏈通過位置239和242 (對應於Kabat編號系統，對應於EU編號系統則為位置226或229)的兩個雙硫鍵締合。共價鍵的實例包括，但不限於，肽鍵、金屬鍵、氫鍵、雙硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、不可知鍵(agnostic bond)、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、三鍵、四重鍵、五重鍵、六重鍵、共軛、超共軛、芳香、哈普托數(hapticity)或反鍵合。非共價鍵的非限制性實例包括離子鍵(例如，陽離子-π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如，二氫鍵、二氫絡合物、低勢壘氫鍵或對稱氫鍵)、范德華力、倫敦分散力、機械鍵、鹵素鍵、親金相互作用、嵌入、堆積、熵力、或化學極性。

如本文所用的，術語「切割位點」或「酶切割位點」是指由酶識別的位點。某些酶切割位點包含細胞內加工位點。在一些實施例中，多肽具有於凝血級聯作用期間活化的酶所切割的酶切割位點，使得此位點的切割發生在凝塊形成處。舉例來說，示例性的此位點包括，由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別的位點。示例性FXIa切割位點包括，例如，TQSFNDFTR(SEQ ID NO：1)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：3)。示例性的凝血酶切割位點包括，例如，DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：4)、TTKIKPR(SEQ ID NO：5)、LVPRG(SEQ ID NO：6)、ALRPR(SEQ ID NO：7)、ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：106)、DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：88)、和IEPRSFS(SEQ ID NO：194)。其他酶切割位點是本領域中已知的，且在本文的其他處中描述。

如本文所用的，術語「加工位點」或「細胞內加工位點」是指多肽中的一種類型的酶切割位點，其是在該多肽轉譯後才作為酶的靶標。在一些實施例中，此類酶在從高基氏體腔到反式高基氏體區室之間的轉運發揮作用。細胞內加工酶在從細胞中分泌蛋白之前切割多肽。此類加工位點的實例包括，例如，由內肽酶的PACE/弗林蛋白酶(其中PACE是成對鹼性胺基酸切割酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)的首字母縮寫)家族靶向的加工位點。這些酶位於高基氏體膜，並在序列基序Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基端位點上切割蛋白。如本文所用的，「弗林蛋白酶」家族的酶包括，例如，PCSK1(也稱為PC1/PC3)、PCSK2(也稱為PC2)、PCSK3(也稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也 稱為PC4)、PCSK5(也稱為PC5或PC6)、PCSK6(也稱為PACE4)、或PCSK7(也稱為PC7/LPC、PC8、或SPC7)。其他加工位點是本領域中已知的。

在包括一個以上加工或切割位點的構築體中，應該理解，此類位點可以是相同的或不同的。

如本文所用的「可加工的連接子」是指包含至少一種細胞內加工位點的連接子，其係於本文的其他處描述。

如本文所用的，術語「半衰期」是指特定多肽在體內的生物半衰期。半衰期可表示為一半的施用至個體體的量，從動物中的循環和/或其他組織中清除所需要的時間。當給定多肽的清除曲線構建為時間的函數時，該曲線通常是雙相的，具有快速的α相和更長的β相。α相一般係表示所施用的Fc多肽在血管內和血管外空間之間的平衡，且係(部分地)取決於多肽的大小。β相一般係表示多肽在血管內空間中的分解代謝。在一些實施例中，FVIII和包含有FVIII的嵌合多肽係為單相，且因此不具有α相，而僅是單一的β相。因此，在某些實施例中，如本文所用的術語半衰期，是指多肽在β相中的半衰期。人類抗體在人中的典型β相半衰期為21天。在某些實施例中，半衰期表示為末期的半衰期。

如本文所用的止血障礙意指基因遺傳性或後天性病症，其表徵為因形成纖維蛋白凝塊的能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊，而自發地或因創傷而出血的傾向。此類障礙的實例包括血友病。三種主要的形式是A型血友病(因子VIII缺乏)、B型血友病(因子IX缺乏或「克裡斯馬斯病(Christmas disease)」)和C型血友病(因子XI缺乏，輕度出血傾向)。其他止血障礙包括，例如，血管性血友病(Von Willebrand disease)、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或結構異常、伯-蘇綜合征(Bernard-Soulier syndrome)，其在GPIb有缺陷或缺乏GPIb。GPIb(VWF的受體)可以是有缺陷的且導致初期凝塊形成(初期止血)的缺少和增加的出血傾向)，和Glanzman和Naegeli的血小板機能不全(Glanzmann血小板機能不全)。在肝衰竭(急性和慢性形式)中，通過肝產生的凝血因子不足；這可增加出血風險。

如本文所用的「施用(Administer或administering)」是指向個體施用 本文所述的組合物，例如嵌合多肽。該組合物，例如嵌合多肽，可使用本領域中已知的方法向個體施用。特別地，該組合物，例如嵌合多肽，可由靜脈內、皮下、肌肉內、皮內、或經由任何粘膜表面，例如口服、舌下、經頰、經鼻、經直腸、經陰道或經由肺部途徑來施用。在一些實施例中，該施用是自我施用。在一些實施例中，係由父母向兒童施用該嵌合多肽。在一些實施例中，該嵌合多肽由醫療保健從業者諸如醫師、醫生或護士施用至個體。

如本文所用的，術語「劑量(dose)」是指向個體單次施用組合物。單劑量可以一次全部施用(例如作為單次推注劑量)，或在一段時間內施用，例如經由靜脈內輸注。術語「多劑量」意指多於一個劑量，例如多於一次施用。

當提及共同施用多於一種組合物時，一定劑量的組合物A可與一定劑量的組合物B同時施用。或者，一定劑量的組合物A可在一定劑量的組合物B之前或之後施用。在一些實施例中，將組合物A和組合物B組合成單一配製劑。

如本文所用的，術語「間隔」或「給藥間隔」是指施用至個體的第一劑量的組合物A和隨後劑量的相同組合物之間所經過的時間。給藥間隔可指第一劑量和第二劑量之間所經過的時間，或者給藥間隔可指多個劑量之間所經過的時間。

如本文所用的術語「給藥頻率」是指每個具體給藥間隔所施用的劑量數目。例如，給藥頻率可寫為一週一次、每兩週一次等。因此，7天的給藥間隔還可寫為7天一次或每週一次或一週一次的給藥間隔。

如本文所用的術語「預防性治療」是指施用於治療血友病的療法，其中此類治療旨在預防或降低血友病的一種或多種症狀(例如出血事件，例如一次或多次自發出血事件，和/或關節損傷)的嚴重性。參見Jimenez-Yuste等人，Blood Transfus.12(3)：314-19(2014)。為了預防或降低此類症狀(例如，出血事件和關節疾病的進展)的嚴重性，A型血友病患者可以接受定期輸注凝血因子作為預防性治療方案的一部分。此類預防性治療的基礎是觀察到，相較於具有重度血友病的患者，具有1%或更多量的凝血因子(例如FVIII)的血友病患者很少經歷自發出血事件，且具有較少與血友病相關的合併症。參見，例如，Coppola A.等，Semin. Thromb.Hemost.38(1)：79-94(2012)。治療這些血友病患者的醫療保健從業者推測在定期輸注情況下維持因子的量在大約1%，可潛在性地降低血友病症狀的風險，該症狀包括出血事件和關節損傷。參見同上。隨後的研究已經證實了接受凝血因子預防性治療的小兒血友病患者中有這些益處，這使得預防性治療成為具有重度血友病患者的目標。參見同上。

「預防性」治療還可指向個體優先施用本文所述的組合物(例如，嵌合多肽)，以便控制、管理、預防或降低A型血友病其一種或多種症狀的發生或嚴重性，例如出血事件。用凝血因子(例如FVIII)的預防性治療是針對具有重度A型血友病的個體的護理標準。參見，例如，Oldenburg，Blood 125：2038-44(2015)。在一些實施例中，預防性治療是指向有需要的個體施用本文公開的組合物以降低A型血友病的一種或多種症狀的發生。預防性治療可包括施用多個劑量。用於預防性治療的多劑量一般係以特定給藥間隔施用。在某些實施例中，年化出血率降低至少於10、少於9、少於8、少於7、少於6、少於5、少於4、少於3、少於2、或少於1。

術語「按需治療」或「發病期治療(episodic treatment)」是指針對A型血友病的症狀(例如，出血事件)作出反應，或在可引起出血的活動之前，「根據需要」施用嵌合分子。在一個方面中，當出血開始(諸如損傷後)時，或當預期出血(諸如手術前)時，可向個體給予按需治療。在另一方面中，可在使出血風險增加的活動(諸如接觸性運動)之前，給予按需治療。在一些實施例中，按需治療係以單一劑量給予。在其他實施例中，按需治療係作為第一劑量給予，隨後給予一個或多個另外的劑量。當嵌合多肽按需施用時，該一個或多個另外的劑量可在施用該第一劑量後至少約12小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時、至少約108小時、或至少約120小時施用。應該注意的是，然而，與按需治療相關聯的給藥間隔，並不與用於預防性治療的給藥間隔相同。

在一些實施例中，需要一般止血劑的個體係正在或即將經受手術。本公開的嵌合多肽可在手術之前或之後施用。本公開的嵌合多肽還可在手術期 間或之後施用以控制急性出血事件。當嵌合多肽在手術之前施用時，該施用可以在手術之前至少約1小時、至少約2小時、至少約4小時、至少約8小時、至少約12小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、或至少約72小時。當嵌合多肽在手術後施用時，該施用可以在手術後至少約1小時、至少約2小時、至少約4小時、至少約8小時、至少約12小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、或至少約72小時。該手術可包括，但不限於，肝移植、肝切除術、牙科手術、或幹細胞移植。

如本文所用的術語「急性出血」是指一出血事件，不論其根本原因為何。例如，個體可具有創傷、尿毒癥、遺傳性出血障礙(例如，因子VII缺乏)血小板障礙，或因凝血因子抗體的產生而產生的抗性。

如本文所用的「治療(treat)、(treatment)、(treating)」是指，例如，疾病或病況的嚴重性的降低；疾病過程的持續時間的降低；與疾病或病況相關聯的一種或多種症狀的改善；為具有疾病或病況的個體提供有益作用，而不必然治癒該疾病或病況，或預防與疾病或病況相關聯的一種或多種症狀。在一些實施例中，術語「治療(treating或treatment)」意指通過施用本公開的嵌合多肽或VWF片段來維持個體的FVIII波谷濃度(trough level)為至少約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL、或20IU/dL。如本文所用的，血友病患者中的「波谷濃度」是在施用下一劑量之前，以因子療法(例如，FVIII療法)所達到的最低濃度量。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII波谷濃度為至少約1IU/dL。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII波谷濃度為至少約3IU/dL。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII波谷濃度為至少約5IU/dL。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔期間維持FVIII波谷濃度在約1和約20IU/dL之間、約2和約20IU/dL之間、約3和約20IU/dL之間、約4和約20IU/dL之間、約5和約20IU/dL之間、約6和約20IU/dL之間、約7和約20IU/dL之間、約8和約20IU/dL之間、約9和約20IU/dL之間、或約10和約20IU/dL之間。

疾病或病況的治療還可包括在給藥間隔之間維持個體中FVIII的活性相當於非血友病個體中的FVIII活性的至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約1%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約2%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約3%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平維至少約4%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約5%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約6%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約7%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約8%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約9%。在其他實施例中，治療意指在給藥間隔之間維持FVIII活性水平為至少約10%。治療需要的最低波谷濃度可通過一種或多種已知方法量測(例如，本文所述的aPTT測定法或生色測定法)且可針對每個人進行調整(增加或降低)。

II．本公開的方法

本公開的某些方面涉及向有需要的個體治療其A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用嵌合多肽，該嵌合多肽包含FVIII蛋白和VWF片段。在一些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF D3域的VWF片段。在其他方面中，本公開涉及向有需要的個體治療出血疾病或病況(例如A型血友病)的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的FVIII蛋白和多劑量的VWF片段。

在一些實施例中，該多劑量包含至少兩個劑量、至少三個劑量、至少四個劑量、至少五個劑量、至少六個劑量、至少七個劑量、至少八個劑量、至少九個劑量、至少十個劑量、至少十一個劑量、至少十二個劑量、至少十三 個劑量、至少十四個劑量、至少十五個劑量、至少十六個劑量、至少十七個劑量、至少十八個劑量、至少十九個劑量、至少二十個劑量、或更多個。在一些實施例中，該多劑量施用至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約12個月、至少約18個月、至少約2年、至少約3年、至少約4年、至少約5年、至少約10年、至少約15年、至少約20年、或至少約25年。

在某些實施例中，本公開的方法涉及治療A型血友病。在一些實施例中，A型血友病的治療包括對有需要的個體人類個體預防其出血事件。在一些實施例中，A型血友病的治療包括向有需要的個體人類個體治療其出血事件。在一些實施例中，A型血友病的治療包括對有需要的個體人類個體控制其出血事件的發生率或頻率。在一些實施例中，A型血友病的治療包括降低有需要的個體人類個體其出血事件的發生率或頻率。

A．劑量

在一些實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)係以單劑量或以多劑量來施用。在一些實施例中，該多劑量中的每一個的量是相同的。在其他實施例中，該多劑量中的一個或多個與另一多劑量中的一個或多個不同。在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約5IU/kg至約200IU/kg，或約10IU/kg至約150IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約95IU/kg、約20IU/kg至約90IU/kg、約20IU/kg至約85IU/kg、約20IU/kg至約80IU/kg、約20IU/kg至約75IU/kg、約20IU/kg至約70IU/kg、約20IU/kg至約65IU/kg、約20IU/kg至約60IU/kg、約20IU/kg至約55IU/kg、約20IU/kg至約50IU/kg、約20IU/kg至約45IU/kg、約20IU/kg至約40IU/kg、約20IU/kg至約35IU/kg、約20IU/kg至約30IU/kg、或約20IU/kg至約25IU/kg。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約100IU/kg、約25IU/kg至約100IU/kg、約30IU/kg至約100IU/kg、約35IU/kg至約100IU/kg、約40IU/kg至約100IU/kg、約45IU/kg至約100IU/kg、約50IU/kg至約100IU/kg、 約55IU/kg至約100IU/kg、約60IU/kg至約100IU/kg、約65IU/kg至約100IU/kg、約70IU/kg至約100IU/kg、約75IU/kg至約100IU/kg、約80IU/kg至約100IU/kg、約85IU/kg至約100IU/kg、或約90IU/kg至約100IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg。

在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約150IU/kg、約50IU/kg至約140IU/kg、約50IU/kg至約130IU/kg、約50IU/kg至約120IU/kg、約50IU/kg至約110IU/kg、或約50IU/kg至約100IU/kg。在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約95IU/kg、約50IU/kg至約90IU/kg、約50IU/kg至約85IU/kg、約50IU/kg至約80IU/kg、約50IU/kg至約75IU/kg、約50IU/kg至約70IU/kg、約50IU/kg至約65IU/kg、約50IU/kg至約60IU/kg、約50IU/kg至約55IU/kg。在某些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg。在某些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg。

在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約60IU/kg至約150IU/kg、約60IU/kg至約140IU/kg、約60IU/kg至約130IU/kg、約60IU/kg至約120IU/kg、約60IU/kg至約110IU/kg、或約60IU/kg至約100IU/kg。在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約60IU/kg至約95IU/kg、約60IU/kg至約90IU/kg、約60IU/kg至約85IU/kg、約60IU/kg至約80IU/kg、約60IU/kg至約75IU/kg、約60IU/kg至約70IU/kg、或約60IU/kg至約65IU/kg。

在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約150IU/kg、約65IU/kg至約140IU/kg、約65IU/kg至約130IU/kg、約65IU/kg至約120IU/kg、約65IU/kg至約110IU/kg、或約65IU/kg至約100IU/kg。在一些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約95IU/kg、約65IU/kg至約90IU/kg、約65IU/kg至約85IU/kg、約65IU/kg至約80IU/kg、約65IU/kg至約75IU/kg、或約65IU/kg至約70IU/kg。在某些實施例中，該嵌合多肽的多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個為約5IU/kg、約10IU/kg、 約15IU/kg、約20IU/kg、約25IU/kg、約30IU/kg、約35IU/kg、約40IU/kg、約45IU/kg、約50IU/kg、約55IU/kg、約60IU/kg、約65IU/kg、約70IU/kg、約75IU/kg、約80IU/kg、約85IU/kg、約90IU/kg、約95IU/kg、約100IU/kg、約125IU/kg、約150IU/kg、約175IU/kg、或約200IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約30IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約35IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約40IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約45IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約55IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約60IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約70IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約75IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約85IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約90IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約95IU/kg。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約100IU/kg。

在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約25IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約30IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約35IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約40IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約45IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約50IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約55IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約60IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約65IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約70IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約75IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約80IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約85IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約90IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約95IU/kg。在一些實施例中，該多劑量中的每一劑量為約100IU/kg。

在一些實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)係預防性地施用。當預防性地施用時，該多劑量中的至少一個可以是約15IU/kg至約100IU/kg。在某些實施例中，預防性施用的該多劑量中的至少一個為約25IU/kg、約30IU/kg、約35IU/kg、約40IU/kg、約45IU/kg、約50IU/kg、約55IU/kg、約60IU/kg、約65IU/kg、約70IU/kg、約75IU/kg、約80IU/kg、約85IU/kg、約90IU/kg、約95IU/kg、或約100IU/kg。在一些實施例中，預防性施用的該多劑量中的至少一個為約25IU/kg。在其他實施例中，預防性施用的該多劑量中的至少一個為約50IU/kg。在其他實施例中，預防性施用的該多劑量中的至少一個為約65IU/kg。在其他實施例中，預防性施用的該多劑量中的至少一個為約80IU/kg。

在一些實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)係按需施用。當按需施用時，該嵌合多肽可以以單劑量或以多劑量施用。在一些實施例中，該嵌合多肽以約15IU/kg至約100IU/kg的一個或多個劑量施用。在某些實施例中，該嵌合多肽以約25IU/kg、約30IU/kg、約35IU/kg、約40IU/kg、約45IU/kg、約50IU/kg、約55IU/kg、約60IU/kg、約65IU/kg、約70IU/kg、約75IU/kg、約80IU/kg、約85IU/kg、約90IU/kg、約95IU/kg、或約100IU/kg的一個或多個劑量按需施用。在一些實施例中，該嵌合多肽以約25IU/kg的一個或多個劑量按需施用。在其他實施例中，該嵌合多肽以約50IU/kg的一個或多個劑量按需施用。在其他實施例中，該嵌合多肽以約65IU/kg的一個或多個劑量按需施用。在其他實施例中，該嵌合多肽以約80IU/kg的一個或多個劑量按需施用。

在一些實施例中，根據本方法的該嵌合多肽的施用係在該施用的約7天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約20天、約24天、約25天、約28天、約30天、或約35天後不誘發FVIII抑制因子。在一些實施例中，該嵌合多肽的施用係在施用的約28天後不誘導FVIII抑制因子。

B．給藥間隔

在某些實施例中，尤其是預防性治療，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)係以給藥間隔以多劑量施用。在一些實施例中，該給藥間隔為至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、 至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天、至少約26天、至少約27天、至少約28天、至少約29天、至少約30天、或至少約31天。

在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約5天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約6天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約8天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約9天。在某些實施例中，該給藥間隔為至少約10天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約11天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約12天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約13天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約14天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約21天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約27天。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約30天。

在一些實施例中，該給藥頻率(例如用於預防性治療A型血友病)為每週至少兩次、每週至少一次、每2周至少一次、每3周至少一次、每4周至少一次、每5周至少一次、或每6周至少一次。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為每週至少一次。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少2周。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少3周。在某些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少4周。

在一些實施例中，該給藥頻率(例如用於預防性治療A型血友病)為每三個月約2次、每月約1次、每月約2次、每月約3次、每個月約4次、每月約5次、每月約6次、每月約7次、或每月約8次。在某些實施例中，該給藥頻率為每月約 1次。在某些實施例中，該給藥頻率為每月約2次。在某些實施例中，該給藥頻率為每月約3次。在某些實施例中，該給藥頻率為每月約4次。在某些實施例中，該給藥頻率為每月約5次。在某些實施例中，該給藥頻率為每月約6次。

在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約3至5天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約4至6天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約4至7天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約4至8天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約4至9天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約4至10天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約5至7天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約5至8天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約5至9天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約5至10天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約6至8天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約6至9天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約6至10天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7至9天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7至10天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7至11天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7至12天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7至13天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約7至14天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約8至14天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約9至14天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約10至14天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約11至14天。在一些實 施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約10至21天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約12至14天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約12至15天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約13至15天。在一些實施例中，該給藥間隔(例如用於預防性治療A型血友病)為至少約14至21天。

在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係根據表1中所述的劑量和給藥頻率來施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以至少約5至14天的給藥間隔以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以至少約6至14天的給藥間隔以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中， 該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg至約65IU/kg 的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約25IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約25IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至 少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約25IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約50IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約50IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一 些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療的A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個 以約65IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約80IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約80IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約9至14天 的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約80IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80 IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑 量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約50IU/kg至約65IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至8天的給藥 間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約9至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約11至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約12至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約12至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4至9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4至10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4至11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4至12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4至13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約5至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約8至14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10至15天的給藥間隔 施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10至21天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約13至15天的給藥間隔施用。在一些實施例中，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約14至21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約5天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約7天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約6天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約5天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約4天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約3天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約2天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約8天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約9天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約10天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約11天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑 量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約12天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約13天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約14天的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約21天的給藥間隔施用。

在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以至少約1周的給藥間隔施用。在一些實施例中，諸如用於預防性治療小兒個體的A型血友病，該多劑量中的至少一個係以約65IU/kg至約80IU/kg的劑量以約每1周至少兩次的給藥頻率施用。

在某些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，例如rFVIIIFc-VWF-XTEN，其中該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。在某些實施例中，諸如用於預防性治療A型血友病，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，其中該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約8天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約9天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約11天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約12天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約13天。在某些實 施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約15天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約16天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約17天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約18天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約19天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約20天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約21天。

在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，例如rFVIIIFc-VWF-XTEN，其中該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，其中該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約6天。在一些實施例中，該方法是用於預防性治療A型血友病的。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約8天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約9天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約11天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約12天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約13天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約15天。在某些實施例 中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約16天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約17天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約18天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約19天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約20天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約25IU/kg，且該給藥間隔為至少約21天。

在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，例如rFVIIIFc-VWF-XTEN，其中該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，其中該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約6天。在一些實施例中，該方法是用於預防性治療A型血友病的。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約8天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約9天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約11天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約12天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約13天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約15天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約16天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約17天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約 18天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約19天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約20天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約50IU/kg，且該給藥間隔為至少約21天。

在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，例如rFVIIIFc-VWF-XTEN，其中該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，其中該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約6天。在一些實施例中，該方法是用於預防性治療A型血友病的。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約8天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約9天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約11天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約12天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約13天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約15天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約16天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約17天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約18天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約19天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約20天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約65IU/kg，且 該給藥間隔為至少約21天。

在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，例如rFVIIIFc-VWF-XTEN，其中該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天。在某些實施例中，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的VWF片段，其中該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約6天。在一些實施例中，該方法是用於預防性治療A型血友病的。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約8天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約9天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約10天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約11天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約12天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約13天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約14天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約15天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約16天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約17天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約18天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約19天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約20天。在某些實施例中，該多劑量中的至少一個為約80IU/kg，且該給藥間隔為至少約21天。

在一些實施例中，該嵌合多肽係施用於預防性治療A型血友病。A型血友病的預防性治療包括在連續或幾乎連續的基礎上減輕或降低A型血友病的 症狀的嚴重性。在一些實施例中，該預防性治療在A型血友病的症狀出現前(例如，出血事件之前)施用。在其他實施例中，該預防性治療在定期的基礎(例如以本文所述的給藥間隔)上施用，以預防該症狀的發病，或減輕該症狀發病之前的症狀的嚴重性。本文公開的任何給藥間隔可用在A型血友病的預防性治療中。

在其他實施例中，該嵌合多肽在可引起A型血友病的一種或多種症狀的活動前施用，例如作為按需治療。舉例來說，本公開的嵌合多肽可在該個體經受手術或參與以其他方式增加物理創傷和/或出血事件風險之活動前，向罹患A型血友病的個體施用。當以按需來施用時，該嵌合多肽可作為單劑量或作為多劑量施用。在一些實施例中，該按需治療包括以至少約12小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時、至少約108小時或至少約120小時的給藥間隔來施用多劑量的該嵌合多肽。在某些實施例中，該按需治療包括施用至少2個劑量，至少3個劑量，至少4個劑量或至少5個劑量的該嵌合多肽。

在一些實施例中，該個體先前已經經一種或多種FVIII取代療法的治療。在某些實施例中，該個體未能對先前的FVIII取代療法產生反應。在某些實施例中，該FVIII取代療法是ELOCTATE^® 或百因止(ADVATE^® )。在一些實施例中，該個體是成人。在一些實施例中，該個體是成人男性。在其他實施例中，該個體是成人女性。在其他實施例中，該個體是兒童，例如，小於或等於約12歲、小於或等於或等於約11歲、小於或等於約10歲、小於或等於約9歲、小於或等於約8歲、小於或等於約7歲、小於或等於約6歲、小於或等於約5歲、小於或等於約4歲、小於或等於約3歲、小於或等於約2歲、或小於或等於約1歲)。在一些實施例中，該個體是女性。在一些實施例中，該個體是男性。在一些實施例中，該個體是小於或等於約12歲的女性。在一些實施例中，該個體是小於或等於約11歲的女性。在一些實施例中，該個體是小於或等於約10歲的女性。

本文所述的嵌合多肽可通過本領域中已知的任何方式來施用。在一些實施例中，該嵌合多肽係通過選自下列群組的途徑來施用：靜脈內注射、靜脈內輸注、皮下施用、肌肉內施用、口服施用、皮下施用、鼻腔施用和肺部施 用。在一些實施例中，該嵌合多肽係以靜脈內施用。在其他實施例中，該嵌合多肽係以皮下施用。

在一些實施例中，該嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)在施用後係導致FVIII血漿活性水平為至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%。在某些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約3%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約4%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約5%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約4%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約5%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約5.6%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約7%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約10%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約12%。在一些實施例中，該FVIII血漿活性水平為至少約12.95%。如本文所用的，血漿活性水平表示為百分比(%)。或者，血漿活性可以以IU/dL單位表示，其中1%等於1IU/dL。

在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約5天，該FVIII血漿活性水平為至少約10%。在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約5天，該FVIII血漿活性水平為至少約12%。在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約5天，該FVIII血漿活性水平為至少約12.95%。在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約7天，該FVIII血漿活性水平為至少約5%。在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約7天，該FVIII血漿活性水平為至少約5.6%。在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約8天，該FVIII血漿活性水平為至少約3%。在一些實施例中，在(例如以25IU/kg的劑量)施用該嵌合多肽後至少約10天，該FVIII血漿活性水平為至少約1%。

本公開還包括治療A型血友病的方法，該方法包括向個體施用組合物，該組合物包含(i)FVIII蛋白和(ii)VWF片段。在一些實施例中，該FVIII蛋白存在 於第一配製劑中，且該VWF片段存在於第二配製劑中。在其他實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段存在於同一配製劑中。在特定的實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段是單一配製劑中分開的組分。在某些實施例中，該FVIII蛋白(例如，單鏈FVIII、FVIII-Fc、聚乙二醇化的FVIII、全長成熟FVIII、或B域缺失的FVIII)係以本文公開的劑量，例如，25IU/kg、30IU/kg、35IU/kg、40IU/kg、45IU/kg、50IU/kg、55IU/kg、60IU/kg、或65IU/kg，且以至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、或至少14天的給藥間隔來施用，且該VWF片段係以VWF片段對比施用的FVIII分子為至少約0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1、50：1、100：1、200：1、300：1、400：1、500：1、1000：1、2000：1、3000：1、4000：1、5000：1、10,000：1、50,000：1、100,000：1、或500,000：1的劑量來施用。在其他實施例中，該VWF片段與該FVIII蛋白同時、在該FVIII蛋白後立即、剛好在該FVIII蛋白之前來施用。在某些實施例中，該VWF片段係在該FVIII蛋白之前約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約3.5小時、約4小時、約4.5小時、約5小時、約5.5小時、或約6小時施用。在其他實施例中，該FVIII蛋白在該VWF片段之前約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約3.5小時、約4小時、約4.5小時、約5小時、約5.5小時、或約6小時施用。

C．免疫耐受誘發

本公開的某些方面涉及向有需要的個體治療其A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用嵌合多肽，該嵌合多肽包含FVIII蛋白和VWF片段，其中該嵌合多肽在該個體中誘發對FVIII的免疫耐受。本公開的某些方面涉及向有需要的個體治療其A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用嵌合多肽，該嵌合多肽包含FVIII蛋白和VWF片段，其中該嵌合多肽在該個體中降低對FVIII的抑制性反應。本公開的某些方面涉及向有需要的個體治療其A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用嵌合多肽，該嵌合多肽包含FVIII蛋白和VWF片段，其中該嵌合多肽在施用後不誘發對該嵌合多肽的免 疫反應。本公開的另一方面涉及在具有血友病的人中誘發免疫耐受的方法，該方法包括(1)向該人施用有效量的本文所述的嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)，其中該有效量的該嵌合多肽在該人中誘發免疫耐受。使用包含FVIII和Fc的嵌合多肽的免疫耐受誘發的多種方法，公開在國際專利號WO 2018/102760 A1中，其透過提述以其整體併入本文。

在某些實施例中，該方法進一步包括(2)在誘發免疫耐受後，向該人施用該組合物或該嵌合多肽的逐漸減少的用藥法(tapering regimen)。在某些實施例中，當在人中抑制性抗體的效價(titer)少於約0.6BU時，出現免疫耐受的誘發。在某些實施例中，當在人中抑制性抗體的效價少於約0.6BU且若血漿中監測到凝血因子活性的恢復率為60%時，出現免疫耐受的誘發。在本公開的一些實施例中，該方法進一步包括(3)在該逐漸減少的用藥法後，向該人施用預防性劑量的凝血因子，例如本文所述的嵌合多肽，如rFVIIIFc-VWF-XTEN。

在某些方面中，該人尚未用針對凝血因子(例如，針對FVIII)的先前免疫耐受療法治療。該嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)可在已經確定該人已經產生了抑制因子免疫反應的任何時間(例如在量測該人中的抑制性免疫反應的水平後)施用至該人。在其他實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)可施用至尚未產生一種或多種抑制因子免疫反應的人，以預防抑制因子免疫反應的發生。在一些實施例中，該嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)施用至有高度可能性會發生抑制因子免疫反應(例如，家族史、遺傳易感性或顯示有生物標誌物)的人。在一些實施例中，該方法進一步包括在施用前量測抑制性免疫反應水平或發展抑制因子免疫反應的可能性。

在一些實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)在已經(例如，在量測過該人之抑制性免疫反應的水平或發展出抑制因子免疫反應的可能性後)確定了該人已經產生了抑制因子免疫反應或該人具有發生抑制因子免疫反應的可能性後，少於約1天、少於約2天、少於約3天、少於約4天、少於約5天、少於約6天、少於約7天、少於約2周、少於約3周、少於約4周、少於約2個月、 少於約3個月、少於約4個月、少於約5個月、少於約6個月、少於約1年、少於約2年、少於約3年、少於約4年、或少於約5年被施用至該人。在某些實施例中，該嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)在已經(例如，在量測過該人之抑制性免疫反應的水平或發展出抑制因子免疫反應的可能性後)確定了該人已經產生了抑制因子免疫反應或該人具有發生抑制因子免疫反應的可能性後立即被施用至該人。在特定的實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)在已經(例如，在量測過該人之抑制性免疫反應的水平或發展出抑制因子免疫反應的可能性後)確定了該人已經產生了抑制因子免疫反應或該人具有發生抑制因子免疫反應的可能性後少於約5分鐘、少於約10分鐘、少於約15分鐘、少於約20分鐘、少於約30分鐘、少於約45分鐘、少於約1小時、少於約2小時、少於約3小時、少於約4小時、少於約5小時、少於約6小時、少於約7小時、少於約8小時、少於約9小時、少於約10小時、少於約11小時、少於約12小時、約18小時、或少於約24小時被施用至該人。在特定的實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)在已經(例如，在量測過人之抑制性免疫反應的水平或發展出抑制因子免疫反應的可能性後)確定了該人已經產生了抑制因子免疫反應或該人具有發生抑制因子免疫反應的可能性後約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約18小時、或約24小時被施用至該人。在某些實施例中，該嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)在已經(例如，在量測過該人之抑制性免疫反應的水平或發展出抑制因子免疫反應的可能性後)確定了該人已經產生了抑制因子免疫反應或該人具有發生抑制因子免疫反應的可能性後少於約1天被施用至該人。

免疫反應的誘導可持續直至抑制因子的水平低於某些水平或直至抑制因子無法被偵測到。在某些實施例中，誘導期可持續至少約24周、至少約26周、至少約28周、至少約30周、至少約32周、至少約34周、至少約36周、至少約38周、至少約40周、至少約42周、至少約44周、至少約46周、至少約48周、至少約50周、至少約52周、至少約54周、至少約56周、至少約58周、至少約60 周、至少約62周、至少約64周、至少約66周、至少約68周、至少約70周。在特定的實施例中，誘導期少於60周。

通過本發明的方法來治療的抑制性免疫反應包括人體內對凝血因子治療的一種或多種作用產生消極影響的任何反應。在一些實施例中，該抑制性免疫反應包含產生針對凝血因子的抑制性抗體，例如抑制性抗FVIII抗體。在某些實施例中，本公開的方法進一步包括在施用有效量的本文所述的嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)或編碼該嵌合多肽的多核苷酸之前(例如，在基線處)或之後，係量測人體中一種或多種抑制性抗體的效價。在一些實施例中，在施用之前(例如，在基線處)的抑制性抗體的效價為至少約0.6Bethesda單位(BU)。在某些實施例中，在施用之前(例如，在基線處)的抑制性抗體的效價為至少約1BU、至少約2BU、至少約3BU、至少約4BU、至少約5BU、至少約6BU、至少約7BU、至少約10BU、至少約20BU、至少約30BU、至少約40BU、至少約50BU、至少約100BU、至少約150BU、或至少約200BU。在一個特定的實施例中，在施用之前(例如，在基線處)的抑制性抗體的效價為至少約5BU。

在一些實施例中，本發明的方法降低個體人類個體中相對於施用之前其抑制性抗體的效價。在某些實施例中，在施用之後的抑制性抗體的效價少於約0.6BU。在一些實施例中，在施用之後的抑制性抗體的效價為少於約0.5BU、少於約0.4BU、少於約0.3BU、少於約0.2BU、或少於約0.1BU。在一個特定的實施例中，在施用之後的抑制性抗體的效價為0BU。在其他實施例中，在施用之後的抑制性抗體的效價為少於5BU、少於4BU、少於3BU、少於2BU、少於1BU、少於0.9BU、少於0.8BU、少於0.7BU、或少於0.6BU。

在一些實施例中，相較於在未經處理的對照組和僅用凝血因子處理的人之巨噬細胞分化情況，施用本文所述的嵌合多肽(例如rFVIIIFc-VWF-XTEN)係增加人體中巨噬細胞向M2樣表型的分化。在一些實施例中，M2樣表型包括上調NRF2路徑、PPARγ路徑、或NRF2路徑和PPARγ路徑二者。在一些實施例中，M2樣表型包括上調CD206(MRC1)。在一些實施例中，M2樣表型包括上調ARG1。在一些實施例中，M2樣表型包括上調CD206(MRC1)和ARG1。

在一些實施例中，相對於未經治療的個體中或僅用凝血因子處理的個體中一種或多種基因的表現，施用本文所述的嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)係導致人中一種或多種基因有更高的表現。在一些實施例中，該施用係導致選自下列群組的一種或多種基因有更高表現：Hmox1、PPARγ、LPL、EGR2、SLCO4A1、血紅素加氧酶1(HO-1)、氧化應激誘導的生長抑制因子1(OSGIN1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、谷胱甘肽-二硫化物還原酶(GSR)、麩胺酸-半胱胺酸連接酶催化亞基(GCLC)、麩胺酸-半胱胺酸連接酶修飾亞基(GCLM)、NAD(P)H醌脫氫酶1(NQO1)、脂肪酸結合蛋白5(FABP5)、B7-H3(CD276)、SLAM家族成員3(SLAMF3；淋巴細胞抗原9；LY9)、SLAM家族成員7(SLAMF7)、甘露糖受體C型1(MRC1)、溶質運載蛋白家族12成員4(SLC12A)、神經氈蛋白1(NRP1)、和其任何組合。在一些實施例中，該施用係導致NRF2路徑的一種或多種基因有更高表現。在某些實施例中，NRF2路徑的一種或多種基因係選自下列群組：HO-1、OSGIN1、SOD1、GSR、GCLC、GCLM、NQO1、和其任何組合。在一些實施例中，該施用係導致PPARγ路徑的一種或多種基因有更高表現。在一些實施例中，PPARγ路徑的一種或多種基因係選自下列群組：PPARγ、LPL、FABP5、EGR2、和其任何組合。在一些實施例中，該施用係導致選自下列群組的一種或多種基因有更高表現：B7-H3(CD276)、SLAMF3、SLAMF7、MRC1、SLC12A、NRP1、和其任何組合。在特定的實施例中，相對於在未經治療的人中或僅施用了凝血因子的人之一種或多種基因的表現，該施用係導致一種或多種基因有更高表現，其中該表現高至少約1.5倍、高至少約2倍、高至少約2.5倍、高至少約3倍、高至少約3.5倍、高至少約4倍、高至少約4.5倍、或高至少約5倍。

在一些實施例中，該一種或多種基因的差異表現係在施用本文所述的嵌合多肽(例如，rFVIIIFc-VWF-XTEN)後少於6小時觀察到。在一些實施例中，該差異表現係在施用後少於12小時觀察到。在一些實施例中，該差異表現係在施用後少於18小時觀察到。在一些實施例中，該差異表現在施用後少於24小時觀察到。

在一些實施例中，抑制性免疫反應包含細胞介導的免疫反應。在某些實施例中，該細胞介導的免疫反應包含細胞因子的釋放。在一些實施例中，該細胞因子是與增加的免疫反應相關聯的任何細胞因子。在一些實施例中，該細胞因子係選自下列群組：IL-1、IL-6、IL-16、IL-12、IL-4、IL-17、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素α、干擾素γ及其任何組合。在一個實施例中，該細胞介導的免疫反應包含血清量有所增加的IL-12。在另一個實施例中，該細胞介導的免疫反應包含血清量有所增加的IL-4。在另一個實施例中，該細胞介導的免疫反應包含血清量有所增加的IL-17。在另一個實施例中，該細胞介導的免疫反應包含血清量有所增加的TNF-α。

多種基因突變係已與發展出抑制性免疫反應的風險增加聯繫起來。例如，Hap2內的TNF-α-308G>A多態性(其與TNF的組成型和誘導型轉錄水平增加有關)係已與發展抑制性免疫反應的風險增加聯繫起來。參見Astermark等，Blood 108：3739-3745(2006)，其通過提述以其整體併入本文。因此，在一些實施例中，該人具有與TNF-α增加相關聯的遺傳多態性。在一些實施例中，該多態性是TNF-α-308G>A多態性。在一些實施例中，該人具有IL10基因中的多態性，例如與IL10的分泌增加相關聯的多態性。在一些實施例中，FVIII-Fc係被施用至在IL10基因啟動子區中具有IL10G微衛星的等位基因134的個體。參見Astermark等Hemostatis,Thrombosis,and Vascular Biology 108：3739-3745(2006)，其通過提述以其整體併入。

在一些實施例中，該人具有與CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞抗原4)表現降低相關聯的遺傳多態性。在一些實施例中，該人具有DR15(HLA-DR15)或DQB0602 MHC(主要組織相容性複合物)II類分子中的突變。與具有血友病的個體中的抑制性免疫反應相關聯的其他MHC II類分子為A3、B7、C7、DQA0102、C2、DQA0103、DQB0603、和DR13(參見Inhibitors in Patients with Hemophilia,E.C.Rodriguez-Merchan & C.A.Lee,Eds.,Blackwell Science,Ltd,,2002)。

在一些實施例中，相較於在經過具有以FVIII蛋白所構成的多肽之在先治療後的個體中的一種或多種細胞因子的量，本公開的方法係降低個體該一 種或多種細胞因子的量個體。在另一個實施例中，相較於施用前的個體體內的一種或多種細胞因子的量，本公開的方法係降低該個體中該一種或多種細胞因子的量個體。在其他實施例中，相對於施用之前一種或多種耐受原分子的表現，在施用本公開的方法後，該一種或多種耐受原分子的表現係增加。在某些實施例中，該一種或多種耐受原分子係選自IL-10、TGF-β、IL-35、IDO-1及其任何組合。

在其他實施例中，該免疫反應包含選自下列群組的臨床症狀：出血傾向增加、高凝血因子消耗、缺乏對凝血因子療法的反應、凝血因子療法的功效降低、凝血因子的半衰期縮短，及其任何組合。在某些實施例中，該免疫反應包含選自下列群組的臨床症狀：出血傾向增加、凝血因子消耗增加、缺乏對凝血因子療法的反應、凝血因子療法的功效降低、血漿中監測的凝血因子活性的恢復降低、凝血因子的半衰期縮短，及其任何組合。

在某些實施例中，該人先前經診斷具有抑制性免疫反應。此類診斷可使用本領域中已知的任何方法進行。例如，如果該人具有一種或多種下列情況：(a)凝血因子的抑制性抗體的效價大於或等於0.6BU；(b)一種或多種選自於IL-12、IL-4、IL-17、和TNF-α的細胞因子的血清水平增加；(c)出血傾向增加；(d)高凝血因子消耗；(e)缺乏對凝血因子療法的反應；(f)凝血因子療法的功效降低；(g)凝血因子的半衰期縮短，及其任何組合，則該人可表徵為對凝血因子(例如FVIII)具有免疫反應。在一個特定的實施例中，如果該人的凝血因子的抑制性抗體的效價大於或等於0.6BU，則該人表徵為對凝血因子具有免疫反應。

在一些實施例中，該人先前經診斷為在施用前至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約13個月、至少約14個月、至少約15個月、至少約16個月、至少約17個月、至少約18個月、至少約19個月、至少約20個月、至少約21個月、至少約22個月、至少約23個月、至少約24個月、至少約27個月、至少約30個月、至少約33個月、至少約36個月、至少約39個月、至少約42個月、至少約45個月、至少約48 年、至少約51個月、至少約54個月、至少約57個月、至少約60個月、至少約6年、至少約7年、至少約8年、至少約10年、至少約15年、或至少約20年已經發展出對凝血因子的抑制性免疫反應。在一個實施例中，該人先前經診斷為在施用前至少5年已經發展出對凝血因子的抑制性免疫反應。

在一些實施例中，相較於誘發免疫耐受的標準護理方法，本公開的方法係提供經改善的耐受時間。如本文所用的術語「耐受時間」是指以第一劑量施用包含有凝血因子和Fc區的組合物或嵌合蛋白與在人體中產生免疫耐受之間的時間。減少耐受時間對於人體具有顯著的益處，包括但不限於降低實現耐受所需要的總經濟負擔。在一些實施例中，該耐受時間為約1至約24周、約1至約23周、約1至約22周、約1至約21周、約2至約20周、約2至約19周、約2至約18周、約2至約17周、約3至約16周、約3至約15周、約3至約14周、約3至約13周、約4至約12周、約4至約11周、約4至約10周、約4至約9周、約5至約8周、約5至約7周、約5至約6周、約1至約12周、約1至約11周、約1至約10周、約1至約9周、約1至約8周、約1至約7周、約1至約6周、約1至約5周、或約1至約4周。在一些實施例中，該耐受時間為少於約70周、少於約65周、少於約60周、少於約58周、少於約56周、少於約54周、少於約52周、少於約50周、少於約48周、少於約46周、少於約44周、少於約42周、少於約40周、少於約38周、少於約36周、少於約34周、少於約32周、少於約30周、少於約28周、少於約26周、少於約24周、少於約23周、少於約22周、少於約21周、少於約20周、少於約19周、少於約18周、少於約17周、少於約16周、少於約15周、少於約14周、少於約13周、少於約12周、少於約11周、少於約10周、少於約9周、少於約8周、少於約7周、少於約6周、少於約5周、少於約4周、少於約3周、少於約2周、或少於約1周。在某些實施例中，該耐受時間為約4至約12周。在一個實施例中，該耐受時間為約4周。在另一個實施例中，該耐受時間為約12周。在一些實施例中，該耐受時間為少於約10個月。在一些實施例中，該耐受時間為少於約9個月。在一些實施例中，該耐受時間為少於約8個月。在一些實施例中，該耐受時間為少於約7個月。在一些實施例中，該耐受時間為少於約6個月。在一些實施例中，該耐受時間為 少於約5個月。在一些實施例中，該耐受時間為少於約4個月。在一些實施例中，相較於僅用凝血因子治療後的耐受時間，本公開的方法導致在使用包含有凝血因子和Fc區的組合物和嵌合蛋白的治療後的人體中有更短的耐受時間。

在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價少於約0.6BU。在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價少於約0.5BU。在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價少於約0.4BU。在一些實施例中，發生免疫耐受的發展的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價少於約0.3BU。在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價少於約0.2BU。在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價少於約0.1BU。在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於凝血因子的抑制性抗體效價為0.0BU。在某些實施例中，抑制性免疫抗體的效價在兩個連續量測(例如在四周的週期內的兩個連續周中)中觀察到。

在一些實施例中，發生免疫耐受的表徵在於增量恢復>66%(例如，增量的恢復為約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或約100%)。如本文所用的，「增量恢復」是指輸注後15-30分鐘的FVIII峰值量。

在誘導期和逐漸減少期結束之後，接著可對個體進行嵌合蛋白的預防性治療。預防性給藥方案可以是本文公開的任何給藥方案。

在一些實施例中，使用本公開的方法治療的人係正在接受或最近已經接受了免疫刺激療法。舉例來說，在經受干擾素治療的HCV陽性A型血友病患者中或在具有與抗逆轉錄病毒療法相關聯的免疫重建發炎癥候群的HIV陽性A型血友病患者中已報導有抑制因子。參見Report of Expert Meeting on FVIII Products and Inhibitor Development,European Medicines Agency(2006年2月28日至3月2日)。因此，在一些實施例中，該人正在接受干擾素療法。在一些實施例中， 該人正在接受抗病毒療法。在一些實施例中，該人正在接受抗逆轉錄病毒療法且具有免疫重建發炎癥候群。

在某些實施例中，該人對凝血因子(例如FVIII)的暴露天數(ED)少於150。在一個實施例中，該人的ED少於50。在另一個實施例中，該人的ED少於20。

本公開的某些方面涉及在有需要的個體中降低對凝血因子的過敏或過敏反應的嚴重性或發生的方法，該方法包括向該個體施用包含凝血因子和Fc區的組合物或嵌合蛋白。在一些實施例中，該組合物或該嵌合蛋白的施用係降低對凝血因子的過敏樣反應的嚴重性。在一些實施例中，該組合物或該嵌合蛋白的施用係降低對凝血因子的過敏反應的嚴重性。

III．嵌合多肽

可用於本公開的嵌合多肽包含FVIII蛋白，該FVIII蛋白包含FVIII多肽和包含VWF的D'域和D3域的VWF片段。該VWF片段用於防止或阻斷該FVIII蛋白與內源性VWF相互作用，從而防止FVIII蛋白通過VWF清除路徑而被清除。為了防止該FVIII蛋白與該VWF片段的解離，在一些實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段係藉由比FVIII和VWF間的自然相互作用更強的締合來彼此直接地或間接地締合。

在某些實施例中，該FVIII蛋白係通過共價鍵與VWF片段締合。該共價鍵可以是本領域中已知的任何共價鍵。在一些實施例中，該共價鍵是雙硫鍵。在一些實施例中，該共價鍵是肽鍵。在其他實施例中，該FVIII蛋白經修飾以增加該FVIII蛋白和該VWF片段之間的相互作用的強度。在其他實施例中，該VWF片段係經修飾以增加該FVIII蛋白和該VWF片段之間的相互作用強度。在另一些其他的實施例中，該FVIII蛋白和該VWF蛋白二者係經修飾以增加該FVIII蛋白和該VWF片段之間的相互作用強度。

在特定的實施例中，該FVIII蛋白包含FVIII多肽和包含VWF的D'域和D3域的VWF片段，其係通過FVIII多肽序列中的至少一個胺基酸與VWF的D'和 D3域中的至少一個胺基酸之間的至少一個共價鍵直接締合。在其他實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段係通過FVIII多肽序列中的至少一個胺基酸與VWF的D'和D3域所直接或間接融合的異源序列中的至少一個胺基酸之間的至少一個共價鍵來間接締合。在其他實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段係通過VWF片段序列中的至少一個胺基酸與FVIII多肽所直接或間接融合的異源序列中的至少一個胺基酸之間的至少一個共價鍵來間接締合。在另一些其他的實施例中，該FVIII蛋白和該VWF片段係通過與VWF的D'和D3域所直接或間接融合的異源序列中的至少一個胺基酸與FVIII多肽所直接或間接融合的異源序列中的至少一個胺基酸之間的至少一個共價鍵來間接締合。

本公開的FVIII蛋白可包含FVIII多肽和一個或多個異源部分，例如延長半衰期的部分，該異源部分係與該FVIII多肽直接或間接地融合。本公開的VWF片段還可包含VWF的D'域和D3域和一個或多個異源部分，例如，延長半衰期的部分，該異源部分係與VWF的D'域和D3域直接或間接地融合。在一些實施例中，可用於本公開的FVIII蛋白實質上由FVIII多肽構成或係由FVIII多肽構成，且可用於本公開的VWF片段包含VWF的D'域和D3域和一個或多個異源部分，例如，延長半衰期的部分，該異源部分與VWF的D'域和D3域直接或間接地融合。在一些實施例中，該FVIII蛋白包含FVIII多肽和一個或多個異源部分，例如，延長半衰期的部分，該異源部分與該FVIII多肽係直接或間接地融合，且可用於本公開的VWF片段實質上由VWF的D'域和D3域構成或係由VWF的D'域和D3域構成。在一些實施例中，該嵌合多肽包含FVIII蛋白和VWF片段，該FVIII蛋白實質上由FVIII多肽構成或係由FVIII多肽構成，且該VWF片段實質上由VWF的D'域和D3域構成或係由VWF的D'域和D3域構成。

在一些實施例中，本文公開的嵌合多肽或蛋白是FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異源二聚體。在一個實施例中，該FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異源二聚體嵌合多肽包含：(i)FVIII蛋白，其包含FVIII多肽、插入在FVIII多肽的B域內的XTEN、和第一Fc區；和(ii)VWF蛋白， 其包含VWF片段、第二XTEN序列、a2連接子、和第二Fc區。示例性的FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異源二聚體、rFVIIIFc-VWF-XTEN係呈現在圖1中。

在一具體的實施例中，該嵌合多肽是rFVIIIFc-VWF-XTEN。在另一具體的實施例中，rFVIIIFc-VWF-XTEN包含(i)含有SEQ ID NO：203的胺基酸序列的FVIII蛋白和(ii)含有SEQ ID NO：205胺基酸序列的VWF蛋白。在再另一實施例中，rFVIIIFc-VWF-XTEN包含經由雙硫鍵共價連接的(i)FVIII蛋白和(ii)VWF蛋白。

III.A．因子VIII多肽

如本文所用的「因子VIII」，其在本申請中縮寫為「FVIII」，除非另有規定，否則意指在凝血過程中正常作用的有功能的FVIII多肽。因此，術語FVIII包括變異體多肽，其是有功能的(functional)。「FVIII蛋白」用於指單獨的FVIII多肽(或蛋白)、與另外的多肽融合的FVIII多肽、和與一個或多個多肽締合的FVIII多肽，只要該FVIII蛋白表現出FVIII的功能/活性。術語「FVIII多肽」、「FVIII部分」或「FVIII」是指單獨的FVIII多肽序列。FVIII的功能/活性實例包括但不限於，激活凝血的能力、作為因子IX的輔因子的能力、或在Ca²⁺ 和磷脂的存在下與因子IX形成十因子(tenase)酶複合物，然後該複合物將因子X轉化為激活形式的Xa。該FVIII多肽可以是人、豬、犬、大鼠、或鼠的FVIII多肽。此外，來自人類和其他物種的FVIII之間的比較已經證實了功能可能所必須的保守殘基(Cameron等，Thromb.Haemost.79：317-22(1998)；US 6,251,632)。其全長多肽和多核苷酸序列是已知的，而許多功能性片段、突變體和經修飾的版本者亦同。多種FVIII胺基酸和核苷酸序列例如公開於，美國公開號2015/0158929 A1、2014/0308280 A1、和2014/0370035 A1和國際公開號WO 2015/106052 A1。FVIII多肽例如包括，全長FVIII、減去N端處的Met的全長FVIII、成熟FVIII多肽(減去信號序列)、在N端處具有另外的Met的成熟FVIII多肽，和/或B域全部或部分缺失的 FVIII多肽。FVIII變異體包括B域缺失，不論是部分或全部缺失。

本文所用的嵌合多肽的FVIII多肽在血漿中具有FVIII活性。FVIII活性可通過本領域中任何已知的方法量測。許多測試可用於評定凝血系統的功能：活化部分凝血活酶時間(aPTT)測試、生色測定、ROTEM測定、凝血酶原時間(PT)測試(也用於測定INR)、纖維蛋白原測試(通常通過克勞斯(Clauss)方法)、血小板計數、血小板功能測試(通常通過PFA-100)、TCT、出血時間、混合測試(如果患者的血漿與正常血漿混合，是否異常校正)、凝血因子測定、抗磷脂抗體、D-二聚體、基因測試(例如，因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾氏毒蛇(Russell's viper)毒液時間(dRVVT)、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記法(TEG或Sonoclot)、血栓彈力圖(TEM®，例如，ROTEM®)、或優球蛋白裂解時間(ELT)。

aPTT測試是量測「內生性的」(也指接觸激活路徑)和共通的凝血路徑功效的優良指標。此測試常用於量測可商購的重組凝血因子(例如FVIII)的凝血活性。其一般係與凝血酶原時間(PT)結合使用，凝血酶原時間(PT)係測定外生性路徑。(參見，例如，Kamal等，Mayo Clin Proc.,82(7)：864-873(2007))。在一個實施例中，使用其中使用Dade® Actin® FSL激活的PTT試劑(Siemens Health Care Diagnostics)在BCS® XP分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics)上量測FVIII活性的測定法來測試aPTT。在某些實施例中，如通過aPTT測試量測的，該嵌合多肽具有的血漿FVIII活性為至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、或至少約20%。

aPTT測法定還可用於評定在向患者或個體施用之前的嵌合多肽的力價(potency)。(Hubbard AR，等J Thromb Haemost 11：988-9(2013))。aPTT測定法可進一步與本文所述的任何測定法結合使用，其在向患者或個體施用之前或施用之後進行。

ROTEM分析係提供關於止血的整個動力學信息：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性和裂解。血栓彈力圖的不同參數取決於血漿凝固系統的活性、血小板功能、血纖蛋白分解、或影響這些相互作用的許多因素。此測定法可提供繼發性止血的全面瞭解。

生色測定法機制是基於血液凝固級聯反應的原理，其中激活的FVIII係在激活的因子IX、磷脂和鈣離子的存在下，加速因子X至因子Xa的轉化。因子Xa的活性係藉由對因子Xa具有專一性的對硝基苯胺(pNA)受質之水解來評定的。對硝基苯胺在405nM處所量測到的初始釋放速率係與因子Xa活性成正比，且因此與樣品中的FVIII活性成正比。在一個實施例中，生色測定法是BIOPHEN FVIII：C測定法(Hyphen Biomed，Neurville sur Oise，France)。

生色測定法由國際血栓形成與止血學會(ISTH)科學和標準化委員會(SSC)的FVIII和因子IX下屬委員會推薦。自1994年以來，生色測定法也是歐洲藥典中用於指定FVIII濃縮物力價的參考方法。因此，在一些實施例中，包含FVIII多肽的嵌合多肽，係具有與包含成熟FVIII多肽或BDD FVIII多肽(例如，RECOMBINATE^® 、KOGENATE FS^® 、HELIXATE FS^® 、XYNTHA/REFACTO AB^® 、HEMOFIL-M^® 、MONARC-M^® 、MONOCLATE-P^® 、HUMATE-P^® 、ALPHANATE^® 、KOATE-DVI^® 、AFSTYLA^® 、AND HYATE：C^® )的嵌合多肽所相當的FVIII活性。

生色測定法還可用於評定在向患者或個體施用之前的嵌合多肽的力價。(Hubbard AR，等J Thromb Haemost 11：988-9(2013))。生色測定法可進一步與本文所述的任何測定法結合使用，其在向患者或個體施用之前或施用之後進行。

在其他實施例中，包含本公開的FVIII多肽的嵌合多肽，係具有與包含成熟FVIII多肽或BDD FVIII多肽(例如，ADVATE^® 、REFACTO^® 、或ELOCTATE^® )的嵌合多肽相當的因子Xa生成率。

為了使因子X活化成為因子Xa，被活化的因子IX(因子IXa)係在Ca²⁺ 、膜磷脂、和FVIII輔因子的存在下，水解因子X中的一個精胺酸-異白胺酸鍵，以形成因子Xa。因此，FVIII與因子IX的相互作用在凝血路徑中至關重要。在某些 實施例中，包含FVIII多肽的嵌合多肽可以與含有成熟FVIII多肽序列或BDD FVIII多肽(例如，ADVATE^® 、REFACTO^® 、或ELOCTATE^® )的嵌合多肽相當的速率與因子IXa相互作用。

此外，FVIII係與馮威里氏因子結合，而在循環中無活性。FVIII在未與VWF結合時快速降解，並通過凝血酶的作用從VWF中釋放。在一些實施例中，包含FVIII多肽的嵌合多肽係以與包含成熟FVIII多肽序列或BDD FVIII多肽(例如，ADVATE^® 、REFACTO^® 、或ELOCTATE^® )的嵌合多肽相當的程度來結合假性血友病因子(例如本文公開的VWF片段)。

FVIII可在鈣和磷脂的存在下藉由激活的蛋白C使其失活。激活的蛋白C係在A1域中精胺酸336後切割FVIII重鏈，其係破壞因子X受質的作用位點，且在A2域中的精胺酸562後切割，這增強了A2域的解離並破壞與因子IXa的相互作用位點。此切割還將A2域(43kDa)對切，並產生A2-N(18kDa)和A2-C(25kDa)域。因此，激活的蛋白C可催化重鏈中的多個切割位點。在一些實施例中，激活的蛋白C係以與包含成熟FVIII多肽序列或BDD FVIII多肽(例如，ADVATE^® 、REFACTO^® 、或ELOCTATE^® )的嵌合多肽相當的程度來使含有FVIII多肽的嵌合多肽失活。

在其他實施例中，包含FVIII多肽的嵌合多肽在體內具有與含有成熟FVIII多肽序列或BDD FVIII多肽(例如，ADVATE^® 、REFACTO^® 、或ELOCTATE^® )的嵌合多肽相當的FVIII活性。在特定的實施例中，包含FVIII多肽的嵌合多肽能夠在HemA小鼠尾靜脈橫斷模型中，以與包含成熟FVIII多肽序列或BDD FVIII多肽(例如，ADVATE^® 、REFACTO^® 、或ELOCTATE^® )的嵌合多肽相當的程度來保護HemA小鼠。

人FVIII序列(全長)的實例如下所示。

FVIII多肽包括全長FVIII、減去N端處的Met的全長FVIII、成熟FVIII(減去信號序列)、在N端處具有另外的Met的成熟FVIII、和/或全部或部分缺失B域的FVIII。在某些實施例中，FVIII變異體包括B域缺失，不論是部分或全部缺失。

天然成熟的人類FVIII多肽的序列如SEQ ID NO：65所示。天然的FVIII多肽具有下式：A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2，其中A1、A2、和A3是結構上相關的「A域」，B是「B域」，C1和C2是結構上相關的「C域」，且a1、a2和a3是酸性間隔子區域。關於SEQ ID NO：65中的一級胺基酸序列位置，人類FVIII的A1域係從Ala1延伸至約Arg336，a1間隔子區域係從約Met337延伸至約Val374，A2域係從約Ala375延伸至約Tyr719，a2間隔子區域係從約Glu720延伸至約Arg740，B域係從約Ser741延伸至約Arg 1648，a3間隔子區域係從約Glu1649延伸至約Arg1689，A3域係從約Ser1690延伸至約Leu2025，C1域係從約Gly2026延伸至約Asn2072，且C2域係從約Ser2073延伸至Tyr2332。除了特定的蛋白水解切割位點，FVIII的域和區域之間邊界位置的指定可以在不同的參考文獻中有變化。因此，本文中所指稱的邊界係通過使用術語「約」被指定為近似。

人類FVIII基因是經分離的且在哺乳動物細胞中表現(Toole,J.J.，等，Nature 312：342-347(1984)；Gitschier,J.，等，Nature 312：326-330(1984)；Wood,W.I.，等，Nature 312：330-337(1984)；Vehar,G.A.，等，Nature 312：337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；和美國專利號4,757,006)。FVIII胺基酸序列從如美國專利號4,965,199中所示的cDNA中推導出來。此外，部分或全部B域缺失的FVIII，係示於美國專利號4,994,371和4,868,112中。在一些實施例中，人FVIII的B域係由如美國專利號5,004,803中所示的人類因子V之B域所取代。編碼有人類因子VIII的cDNA序列和胺基酸序列係分別如美國申請公開號2005/0100990的SEQ ID NO：1和2所示。

豬的FVIII序列係發表於Toole,J.J.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5939-5942(1986)。進一步地，從來自豬脾臟cDNA庫中的FVIII序列之PCR擴增物中所獲得的完整豬cDNA序列，係已經報導於Healey,J.F.，等，Blood 88：4209-4214(1996)中。具有替代的所有之域、所有次單元、和具體胺基酸序列的雜合性人/豬FVIII，係公開於Lollar和Runge的美國專利號5,364,771、和WO 93/20093中。更近來，WO 94/11503中係報導了豬FVIII的A1和A2域的核苷酸和相應的胺基酸序列，以及具有由相應之人類域所取代的豬A1和/或A2域的嵌合FVIII。美國專利號5,859,204,Lollar,J.S.還公開了豬cDNA和推導出的胺基酸序列。美國專利號6,458,563公開了B域缺失的豬FVIII。

Lollar,J.S.的美國專利號5,859,204報導了FVIII的有功能之突變體，該突變體具有較低的抗原性和較低的免疫反應性。Lollar,J.S.的美國專利號6,376,463還報導了FVIII的突變體，該突變體具有較低的免疫反應性。Saenko等的美國申請公開號2005/0100990報導了FVIII的A2域中有功能的突變。

在一些實施例中，FVIII多肽(或嵌合多肽的FVIII部分)可以與以下的FVIII胺基酸序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同：SEQ ID NO：67的胺基酸1至1438或SEQ ID NO：65(不具有信號序列)的胺基酸1至2332，或SEQ ID NO：64的胺基酸1至19和SEQ ID NO：67的胺基酸1至1438，或SEQ ID NO：64的胺基酸1至19和SEQ ID NO：65(具有信號 序列)的胺基酸1至2332，其中該FVIII具有凝血活性，例如，激活作為輔因子的因子IX，以將因子X轉化為激活的因子X。該FVIII多肽(或嵌合多肽的FVIII部分)可與SEQ ID NO：67的胺基酸1至1438或SEQ ID NO：65(不具有信號序列)的胺基酸1至2332的FVIII胺基酸序列相同。該FVIII多肽可進一步包含信號序列。

如本文所用的FVIII「B域」與由內在胺基酸序列同一性和蛋白水解切割的位點(例如全長人FVIII的殘基Ser741-Arg1648)定義之本領域中已知的B域者相同。其他人類FVIII域係由下列胺基酸殘基所定義：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Asn2019；C1，殘基Lys2020-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。其餘的序列，殘基Glu1649-Arg1689，通常被稱為a3酸性區域。豬、小鼠和犬FVIII的全數結構域(包括B域)之邊界位置也是本領域已知的。在一些實施例中，FVIII的B域是缺失的(「B域缺失的因子VIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII的實例是REFACTO^® (重組BDD FVIII)，其具有與表4中的序列的因子VIII部分相同的序列。(BDD FVIII重鏈以雙底劃線表示；B域以斜體表示；且BDD FVIII輕鏈以正常文字表示)。在一些實施例中，B域FVIII缺失除5個胺基酸外的全部B域，如表5中所示(SEQ ID NO：68)(B域以斜體表示)。

「B域缺失的FVIII」可具有下列專利所公開的全部或部分缺失：美國專利號6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112、和6,458,563，美國公開號US 2017/0073393 A1和US 2012/308641 A1，和國際公開號WO 2011/041770 A1、WO 2015/106052 A1(PCT/US2015/010738)、和WO 2016/025764。在一些實施例中，在本公開的方法中使用的B域缺失的FVIII序列包含美國專利號6,316,226的第4欄第4行至第5欄第28行和實例1-5所公開的任何一個缺失(也在US 6,346,513中公開)。在其他實施例中，B域缺失的因子VIII是S743/Q1638 B域缺失的因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如具有從胺基酸744至胺基酸1637缺失的因子VIII，例如具有成熟FVIII的胺基酸1-743和胺基酸1638-2332的因子VIII)。在一些實施例中，在本公開的方法中所使用的B域缺失的FVIII具有美國專利號5,789,203的第2欄第26-51行和實例5-8處公開的缺失(也在US 6,060,447、US 5,595,886、和US 6,228,620中公開)。在一些實施例中，B域缺失的因子VIII具有下列者所描述的缺失：美國專利號5,972,885的第1欄第25行至第2 欄第40行；美國專利號6,048,720的第6欄第1-22行和實例1；美國專利號5,543,502的第2欄第17-46行；美國專利號5,171,844的第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利號5,112,950的第2頁第2欄第55-68行和實例1；美國專利號4,868,112的第2欄第2行至第19欄第21行和表2；美國專利號7,041,635的第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行、和第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利號6,458,563的第4欄第25-53行。在一些實施例中，B域缺失的FVIII多肽具有大部分B域的缺失，但仍含有使初級轉譯產物在體內蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需的B域的胺基末端序列，如WO 91/09122中公開的。在一些實施例中，B域缺失的FVIII多肽係構建成缺失胺基酸747-1638，即B域幾乎完全缺失。Hoeben R.C.，等J.Biol.Chem.265(13)：7318-7323(1990)。B域缺失的因子VIII多肽還可含有FVIII的胺基酸771-1666或胺基酸868-1562的缺失。Meulien P.，等Protein Eng.2(4)：301-6(1988)。作為本公開的一部分的另外B域缺失包括：缺失胺基酸982至1562或760至1639(Toole等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton，等Biochemistry(1986)25：8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開的申請號WO 87/04187))、747-1560(Sarver，等，DNA(1987)6：553-564))、741至1648(Pasek(PCT application No。88/00831))、或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No 82：16-25,EP 295597))。在特定的實施例中，該B域缺失的FVIII多肽包含成熟FVIII的胺基酸殘基746至1648的缺失(對應於全長FVIII的765至1665的缺失)。在其他實施例中，該B域缺失的FVIII多肽包含成熟FVIII的胺基酸殘基745至1648的缺失(對應於全長FVIII的764至1665的缺失)。

在其他實施例中，BDD FVIII係包括含有B域片段的FVIII多肽，該B域片段係保留一個或多個N連接的糖基化位點(例如，殘基757、784、828、900、963，或任選為943)，該B域片段對應於全長FVIII序列的胺基酸序列。B域片段的實例包括Miao,H.Z.，等，Blood 103(a)：3412-3419(2004),Kasuda,A，等，J.Thromb.Haemost.6：1352-1359(2008)，和Pipe,S.W.，等，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)中所公開的B域的226個胺基酸或163個胺基酸(即，保留B域前面 的226個胺基酸或163個胺基酸)。在又一些其他的實施例中，BDD FVIII進一步包含殘基309處的點突變(由Phe突變為Ser)以改善BDD FVIII多肽的表現。參見Miao,H.Z.，等，Blood 103(a)：3412-3419(2004)。在又一些其他的實施例中，該BDD FVIII包括含有部分B域，但不含有一個或多個弗林蛋白酶切割位點(例如，Arg1313和Arg 1648)的FVIII多肽。參見Pipe,S.W.，等，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)。在一些實施例中，該BDD FVIII包含含有對應於成熟全長FVIII的胺基酸765至1652有缺失的單鏈FVIII(也稱為rFVIII-單鏈和AFSTYLA®)。參見美國專利號7,041,635。前述缺失中的每一種可以在任何FVIII序列中進行。

在一些實施例中，該FVIII具有部分B域。在一些實施例中，具有部分B域的FVIII多肽為FVIII198。FVIII198是含有單鏈FVIIIFc分子-226N6的部分B域。數字226表示FVIII之B域的N端226號胺基酸，且N6表示B域中的六個N-糖基化位點。

在某些實施例中，該FVIII多肽選自公開號WO 2017/117630 A1、WO 2018/087271 A1、US 9,878,017 B2、US 8,575,104 B2、US 8,754,194 B2、US 7,939,632 B2、US 2018/0161402 A1、US 9,956,269 B2、US 9,107,902 B2、US 2017/209546 A1中所公開的FVIII多肽。

在一些實施例中，FVIII剛好在胺基酸1648(在全長因子VIII或SEQ ID NO：65中)、胺基酸754(在S743/Q1638 B域缺失的因子VIII或SEQ ID NO：67中)處的精胺酸、或對應的精胺酸殘基(在其他變異體中)後被切割，因此產生重鏈和輕鏈。在其他實施例中，FVIII多肽包含重鏈和輕鏈，該重鏈和輕鏈通過金屬離子介導的非共價鍵來連接或締合。

在其他實施例中，FVIII是單鏈FVIII，其未剛好在胺基酸1648(在全長因子VIII或SEQ ID NO：65中)、胺基酸754(在S743/Q1638 B域缺失的VIII或SEQ ID NO：67中)處的精胺酸、或對應的精胺酸殘基(在其他變異體中)後被切割。單鏈FVIII可包含一個或多個胺基酸替代。在一些實施例中，該胺基酸替代在對應於全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO：65)的殘基1648、殘基1645、或二者，或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO：67)的殘基754、殘基751、或二者的殘基處。該胺基 酸替代可以是除精胺酸外的任何胺基酸，例如，異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸、擷胺酸、丙胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、脯胺酸、硒代半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥胺酸、吡咯離胺酸、或牛磺酸。

FVIII可進一步由凝血酶切割，然後經活化為FVIIIa，用作激活的因子IX(FIXa)的輔因子。且激活的FIX連同激活的FVIII係形成X酶複合物，並使因子X轉化為激活的因子X(FXa)。為了激活，FVIII在胺基酸372、740、和1689(對應於B域缺失的FVIII序列中的胺基酸372、740、和795)處的三個精胺酸殘基後由凝血酶切割，切割後生成具有50kDa的A1、43kDa的A2、和73kDa的A3-C1-C2鏈的FVIIIa。在一些實施例中，可用於本公開的FVIII多肽是非活化的FVIII。在其他實施例中，該FVIII多肽是激活的FVIII。

具有與VWF蛋白連接或締合的FVIII多肽的蛋白，可包含與SEQ ID NO：65或67至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的序列，其中該序列具有FVIII凝血活性，例如，激活因子IX作為輔因子以使因子X轉化為激活的因子X(FXa)。

如本文所用的，「雜合」或「嵌合」多肽和蛋白係包括第一多肽和第二多肽的組合。在一些實施例中，該雜合或嵌合多肽係包含單一多肽鏈，例如包含FVIII多肽和XTEN的嵌合多肽。參見，例如，US 2015/0158929 A1，其通過提述以其整體併入本文。在一些實施例中，該雜合或嵌合多肽係包含第一多肽鏈(例如，與XTEN序列和第一Ig恆定區或其部分融合的VWF片段)與第二多肽鏈(例如，與第二Ig恆定區或其部分融合的FVIII多肽)的組合，因此形成異二聚體。參見，例如，US 2015/0266943 A1，US 2016/0251408 A1，US 2017/0073393 A1，其中各文本係通過提述以其整體併入本文。在一些實施例中，在雜合體中的第一多肽和第二多肽係經由蛋白-蛋白相互作用(諸如電荷-電荷或疏水性相互作用)彼此締合。在其他實施例中，第一多肽包含VWF蛋白-XTEN-Fc融合蛋白，且第二多肽包含FVIII-Fc融合蛋白，這使雜合體形成異二聚體，其中該XTEN含有少於288個胺基酸。在其他實施例中，該第一多肽包含VWF蛋白-XTEN-Fc融合蛋 白，且該第二多肽包含FVIII(X)-Fc融合蛋白，這使雜合體形成異二聚體，其中該XTEN含有少於288個胺基酸。該第一多肽和該第二多肽可通過第一Fc區和第二Fc區之間的共價鍵(例如雙硫鍵)來締合。該第一多肽和該第二多肽可進一步通過VWF片段和FVIII多肽之間的結合彼此締合。

在某些實施例中，本文公開的嵌合多肽包含FVIII蛋白，該FVIII蛋白包含第一FVIII多肽片段、XTEN序列、第二FVIII多肽片段、和Fc區。在一些實施例中，該FVIII蛋白包含，從N端至C端的方向排列，第一FVIII多肽片，融合至XTEN序列，融合至第二FVIII多肽片段，融合至Fc區。在具體的實施例中，該FVIII蛋白包含含有SEQ ID NO：215之胺基酸序列的第一FVIII多肽片段、含有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的XTEN序列、含有SEQ ID NO：216的胺基酸序列的第二FVIII多肽，和/或含有SEQ ID NO：217的胺基酸序列的第一Fc區。

在一個具體的實施例中，該嵌合多肽是rFVIIIFc-VWF-XTEN，且包含含有SEQ ID NO：201之胺基酸序列的FVIII蛋白。在另一個具體的實施例中，rFVIIIFc-VWF-XTEN包含SEQ ID NO：207的胺基酸序列。

在一些實施例中，該FVIII蛋白進一步包含FVIII信號肽序列。在一個具體的實施例中，該FVIII蛋白包含含有SEQ ID NO：64之胺基酸序列的FVIII信號肽、含有SEQ ID NO：215之胺基酸序列的第一FVIII多肽片段、含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的XTEN序列、含有SEQ ID NO：216之胺基酸序列的第二FVIII多肽，和/或含有SEQ ID NO：217的胺基酸序列的第一Fc區。

在一個具體的實施例中，該嵌合多肽是rFVIIIFc-VWF-XTEN，且包含含有SEQ ID NO：203之胺基酸序列的FVIII蛋白。在另一個具體的實施例中，rFVIIIFc-VWF-XTEN包含由SEQ ID NO：204的核酸序列或其片段所編碼的FVIII蛋白。與本文公開之嵌合多肽的FVIII蛋白有關的其他示例性多肽序列係在表18至19中提供。

許多有功能的FVIII變異體是已知的，如前後文所討論的。此外，FVIII中的數百個非功能性突變已經在血友病患者中被找出來，且已經確定了，這些突變對FVIII功能的作用更多係是由於它們位於FVIII的3維結構內而非取代的性 質(Cutler等，Hum.Mutat.19：274-8(2002))，其通過提述一起整體併入本文。此外，來自人類和其他物種的FVIII之間的比較已經鑒別出了功能可能所必須的保守殘基(Cameron等，Thromb.Haemost.79：317-22(1998)；US 6,251,632)，其通過提述以其整體併入本文。

III.B．馮威里氏因子(VWF)片段

VWF(也稱為F8VWF)是存在於血漿中的大的多聚體糖蛋白，且在內皮(在懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade bodies)中)、巨核細胞(血小板α-顆粒)、和內皮下結締組織中係組成性地產生。基本的VWF單體是2813個胺基酸的蛋白。每個單體含有多個具有特定功能的特定域，D'/D3域(其結合因子VIII)，A1域(其結合血小板GPIb受體、肝素、和/或可能的膠原)，A3域(其結合膠原)，C1域(當激活時，在該C1域中的RGD域結合血小板整聯蛋白αIIbβ3)，和該蛋白的C末端處的「半胱胺酸結(cysteine knot)」域(其中VWF與血小板衍生的生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGFβ)和β-人絨毛膜促性腺激素(βHCG)共有該域)。

如本文所用的術語「VWF片段」包括，但不限於，包含D'域和D3域的功能性VWF片段，其能夠抑制內源性VWF與FVIII的結合。在一些實施例中，該VWF片段結合FVIII蛋白。在其他實施例中，該VWF片段阻斷FVIII蛋白上的VWF結合位點，因此抑制FVIII蛋白與內源性VWF的相互作用。在其他實施例中，該VWF片段阻斷FVIII與內源性VWF的結合，因此防止FVIII蛋白通過VWF清除路徑的清除。該VWF片段包括保留VWF的這些活性的衍生物、變異體、突變體、或類似物。

人類VWF的2813個單體胺基酸序列在Genbank中報導為登錄號NP000543.2。編碼人類VWF的核苷酸序列在Genbank中報導為登錄號NM000552.3。人類VWF的核苷酸序列命名為SEQ ID NO：20。SEQ ID NO：21為全長VWF的胺基酸序列。VWF的每個域在表6中列出。

表6.VWF序列(人)

如本文所用的VWF蛋白可以是包含VWF的D'域和D3域的VWF片段，其中該VWF片段結合因子VIII(FVIII)並抑制內源性VWF(全長VWF)與FVIII的結合。包含D'域和D3域的VWF片段可進一步包含VWF域，該VWF域係選自下列群組：A1域、A2域、A3域、D1域、D2域、D4域、B1域、B2域、B3域、C1域、C2域、CK域，其一種或多種片段，和其任何組合。在一些實施例中，VWF片段包含有、實質上由下列片段所構成，或係由下列片段所構成：(1)VWF的D'和D3域或其片段；(2)VWF的D1、D'、和D3域或其片段；(3)VWF的D2、D'、和D3域或其片段；(4)VWF的D1、D2、D'、和D3域或其片段；或(5)VWF的D1、D2、D'、D3、和A1域或其片段。本文所述的VWF片段不含有與VWF清除受體結合的位點。在其他實施例中，本文所述的VWF片段不是SEQ ID NO：21的胺基酸764至1274。本公開的VWF片段可包含與該VWF片段連接或融合的任何其他序列。例如，本文所述的VWF片段可進一步包含信號肽。

在一些實施例中，包含D’域和D3域的VWF片段係與FVIII蛋白結合或 締合。參見，例如，US 2015/0023959 A1、US 2015/0266943 A1、US 2016/0251408 A1、US 2017/0073393 A1、US 2018/185455 A1、US 2018/0051067 A1、US 2017/0152300 A1、US 9,878,017 B2、US 9,458,223 B2、US 8,575,104 B2、WO 2017/117630 A1、US 2018/0161402 A1、WO 2017/117631 A1、WO 2018/087271 A1、US 9,107,902 B2、WO 2017/222337 A1、WO 2015/185758 A1，其中各文本係通過提述以其整體併入本文。通過與FVIII蛋白的結合或締合，本公開的VWF片段保護FVIII免於蛋白酶切割和FVIII激活，穩定FVIII的重鏈和輕鏈，且防止FVIII通過清道夫受體的清除。在其他實施例中，該VWF片段係與FVIII蛋白結合或締合，並阻斷或防止FVIII蛋白與磷脂或激活的蛋白C的結合。通過防止或抑制FVIII蛋白與內源性、全長VWF的結合，本公開的VWF片段降低FVIII通過VWF清除受體的清除，且因此延長該嵌合多肽的半衰期。因此，該嵌合多肽的半衰期延長是由於與缺乏針對FVIII蛋白的VWF清除受體結合位點的VWF片段的結合或締合，且通過來自含有VWF清除受體結合位點的內源性VWF的VWF片段來屏蔽或保護FVIII蛋白。結合VWF片段的或受VWF片段保護的FVIII蛋白，還可讓FVIII蛋白再循環。通過消除全長VWF分子中所包含的VWF清除路徑受體結合位點，本公開的FVIII/VWF異二聚體從VWF清除路徑中被屏蔽掉，進一步延長了FVIII半衰期。

在一些實施例中，可用於本公開的VWF蛋白包含VWF的D'域和D3域，其中該D'域與SEQ ID NO：21的胺基酸764至866為至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同，其中該VWF蛋白防止或抑制內源性VWF與FVIII的結合。在其他實施例中，VWF蛋白包含VWF的D'域和D3域，其中該D3域與SEQ ID NO：21的胺基酸867至1240至少為60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同，其中該VWF蛋白防止或抑制內源性VWF與FVIII的結合。在一些實施例中，本文所述的VWF蛋白包含VWF的D'域和D3域，基本上由VWF的D'域和D3域構成，或由VWF的D'域和D3域構成，該VWF的D'域和D3域與SEQ ID NO：21的胺基酸764至1240至少為60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同，其中該 VWF蛋白防止或抑制內源性VWF與FVIII的結合。在其他實施例中，VWF蛋白包含D1、D2、D'、和D3域、實質上由D1、D2、D'、和D3域構成，或係由D1、D2、D'、和D3域構成，該D1、D2、D'、和D3域與SEQ ID NO：21的胺基酸23至1240至少為60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同，其中該VWF蛋白防止或抑制內源性VWF與FVIII的結合。在又一些其他的實施例中，該VWF蛋白進一步包含與其可操作性連接的信號肽。

在一些實施例中，可用於本公開的VWF蛋白實質上由以下或係由以下所構成：(1)D'D3域、D1D'D3域、D2D'D3域、或D1D2D'D3域，和(2)另外的VWF序列，其多達約10個胺基酸(例如，從SEQ ID NO：21的胺基酸764至1240到SEQ ID NO：21的胺基酸764至1250的任何序列)，多達約15個胺基酸(例如，從SEQ ID NO：21的胺基酸764至1240到SEQ ID NO：21的胺基酸764至1255的任何序列)，多達約20個胺基酸(例如，從SEQ ID NO：21的胺基酸764至1240到SEQ ID NO：21的胺基酸764至1260的任何序列)，多達約25個胺基酸(例如，從SEQ ID NO：21的胺基酸764至1240到SEQ ID NO：21的胺基酸764至1265的任何序列)，或多達約30個胺基酸(例如，從SEQ ID NO：21的胺基酸764至1240到SEQ ID NO：21的胺基酸764至1260的任何序列)。在一些實施例中，包含D'域和D3域或基本上由D'域和D3域構成的VWF蛋白既不是SEQ ID NO：21的胺基酸764至1274，也不是全長成熟VWF。在一些實施例中，該D1D2域係對D'D3域反式表現。在一些實施例中，該D1D2域係對D'D3域順式表現。

在其他實施例中，包含與D1D2域連接的D'D3域的VWF蛋白進一步包含細胞內切割位點，例如，(PACE(弗林蛋白酶)或PC5的切割位點)，其允許在表現時從D'D3域中切割D1D2域。細胞內切割位點的非限制性實例在本文的其他地方公開。

在又一些其他實施例中，VWF蛋白包含D'域和D3域，但不包含選自下列群組的胺基酸序列：(1)對應於SEQ ID NO：21的胺基酸1241至2813，(2)對應於SEQ ID NO：21的胺基酸1270至胺基酸2813，(3)對應於SEQ ID NO：21的胺基酸1271至胺基酸2813，(4)對應於SEQ ID NO：21的胺基酸1272至胺基酸2813， (5)對應於SEQ ID NO：21的胺基酸1273至胺基酸2813，(6)對應於SEQ ID NO：21的胺基酸1274至胺基酸2813，和其任何組合。

在又一些其他實施例中，本公開的VWF蛋白包含有對應於D'域、D3域、和A1域的胺基酸序列、實質上由對應於D'域、D3域、和A1域的胺基酸序列構成，或係由對應於D'域、D3域、和A1域的胺基酸序列構成，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO：21的胺基酸764至1479至少為60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同，其中該VWF蛋白防止內源性VWF與FVIII的結合。在特定的實施例中，該VWF蛋白不是SEQ ID NO：21的胺基酸764至1274。

在一些實施例中，本公開的VWF蛋白包含D'域和D3域，但不包含至少一種選自下列群組的VWF域(1)A1域，(2)A2域，(3)A3域，(4)D4域，(5)B1域，(6)B2域，(7)B3域，(8)C1域，(9)C2域，(10)CK域，(11)CK域和C2域，(12)CK域、C2域、和C1域，(13)CK域、C2域、C1域、B3域，(14)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域，(15)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、和B1域，(16)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、和D4域，(17)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、D4域、和A3域，(18)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、D4域、A3域、和A2域，(19)CK域、C2域、C1域、B3域、B2域、B1域、D4域、A3域、A2域、和A1域，和(20)其任何組合。

在又一些其他實施例中，該VWF蛋白包含D'D3域和一種或多種域或模組。此類域或模組的實例包括，但不限於，Zhour等，Blood published online April 6,2012：DOI 10.1182/blood-2012-01-405134中公開的域和模組，其通過提述以其整體併入本文。例如，該VWF蛋白可包含D'D3域和一種或多種域或模組，其選自下列群組：A1域、A2域、A3域、D4N模組、VWD4模組、C8-4模組、TIL-4模組、C1模組、C2模組、C3模組、C4模組、C5模組、C5模組、C6模組、和其任何組合。

在又一些其他實施例中，該VWF蛋白係與異源部分連接，其中該異源部分係與VWF蛋白的N端或C端連接，或插入緊鄰該VWF蛋白中的一個或多個 胺基酸的下游(例如，一個或多個XTEN插入位點)。例如，異源部分在該VWF蛋白中的插入位點可以在D'域、D3域、或二者之中。該異源部分可以是半衰期延長物。

在某些實施例中，可用於本公開的VWF蛋白係形成多聚體，例如，二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、或更高級的聚體。在其他實施例中，該VWF蛋白是僅具有一個VWF蛋白的單體。在一些實施例中，本公開的VWF蛋白可具有一個或多個胺基酸替代、缺失、添加、或修飾。在一些實施例中，該VWF蛋白可包括胺基酸替代、缺失、添加、或修飾，使得該VWF蛋白不能形成雙硫鍵或形成二聚體或多聚體。在其他實施例中，該胺基酸替代係在D'域和D3域內。在特定的實施例中，可用於本公開的VWF蛋白含有在對應於SEQ ID NO：21殘基1099、殘基1142，或兩個殘基1099和1142處的殘基有至少一個胺基酸替代。該至少一個胺基酸替代可以是非天然存在於野生型VWF中的任何胺基酸。例如，該胺基酸替代可以是除了半胱胺酸外的任何胺基酸，例如，異白胺酸、丙胺酸、白胺酸、天門冬醯胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、擷胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、精胺酸、或組胺酸。在另一實例中，該胺基酸替代具有一種或多種防止或抑制VWF蛋白形成多聚體的胺基酸。

在某些實施例中，可用於本文的VWF蛋白可進一步經修飾以改善其與FVIII的相互作用，例如，以改善對FVIII的結合親和力。作為非限制性實例，該VWF蛋白包含對應於SEQ ID NO：21的胺基酸764的殘基處的絲胺酸殘基和對應於SEQ ID NO：21的胺基酸773的殘基處的離胺酸殘基。殘基764和/或773可有助於該VWF蛋白與FVIII的結合親和力。在其他實施例中，可用於本公開的VWF蛋白可具有其他修飾，例如，該蛋白可以經聚乙二醇化、糖基化、羥乙基澱粉化(hesylated)、或聚唾液酸化。

在某些實施例中，本文公開的嵌合多肽包含VWF蛋白，該VWF蛋白包含VWF片段、XTEN序列、FVIII的a2連接子、和Fc區。在一些實施例中，該VWF蛋白包含，以從N端到C端的方向排列，VWF片段，融合至XTEN序列，融合至a2 連接子，融合至Fc區。在某些實施例中，該VWF蛋白包含VWF的D’域(該D’域包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列)，VWF的D3域(該D3域包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列)，包含SEQ ID NO：58(AE144_5A)的胺基酸序列的XTEN序列，包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列的a2連接子，和/或包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列的Fc區。

在一個具體的實施例中，該嵌合多肽是rFVIIIFc-VWF-XTEN，並包含包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列的VWF蛋白。

在一些實施例中，該VWF蛋白包含VWF片段，該VWF片段包含VWF的D1、D2、D'、和/或D3域。在一個實施例中，該VWF片段包含VWF的D1D2域，該D1D2域包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列。在一些實施例中，該VWF蛋白進一步包含VWF信號肽序列。在一個實施例中，該VWF信號肽包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。在一個具體的實施例中，該VWF蛋白包含：包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列的VWF信號肽，包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列的D1D2區域，VWF的D’域(該D’域包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列)，VWF的D3域(該D3域包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列)，包含SEQ ID NO：58(AE144_5A)的胺基酸序列的XTEN序列，包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列的a2連接子，和/或包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列的Fc區。

在一個具體的實施例中，該嵌合多肽是rFVIIIFc-VWF-XTEN，並包含含有SEQ ID NO：205的胺基酸序列之VWF蛋白。在另一具體的實施例中，rFVIIIFc-VWF-XTEN包含由SEQ ID NO：206的核酸序列所編碼的VWF蛋白或其片段。涉及本文公開的嵌合多肽的VWF蛋白的其他示例性多肽序列係在表18至19中提供。

III.C．延長半衰期的部分(Half-Life Extending Moieties)

在一些實施例中，本公開的嵌合多肽包含一個或多個延長半衰期的部分。在一些實施例中，該嵌合多肽的FVIII多肽(即，FVIII蛋白)係與一個或多個延長半衰期的部分融合或締合。在其他實施例中，該嵌合多肽包含至少兩個 延長半衰期的部分，與FVIII多肽融合的第一延長半衰期的部分和與VWF的D'D3域融合的第二延長半衰期的部分。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分與該FVIII多肽的C端或N端融合。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽中。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽的B域中。在一些實施例中，該第一延長半衰期的部分被插入在緊鄰對應於SEQ ID NO：65的胺基酸殘基745的胺基酸的下游的FVIII多肽中。在一些實施例中，該第一異源部分通過連接子與該FVIII多肽融合。

在某些實施例中，該VWF片段中的VWF的D'D3域可與第二延長半衰期的部分融合或締合。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分可與該VWF片段的C端或N端融合。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分被插入在該VWF片段中。在一些實施例中，該第二延長半衰期的部分與該VWF片段的C端融合。在某些實施例中，其中該第二延長半衰期的部分通過連接子與該VWF片段融合。

在其他實施例中，該嵌合多肽包含FVIII多肽和包含VWF的D'域和D3域的VWF片段，其中VWF的D'D3域與一個或多個延長半衰期的部分融合，且其中VWF的D'D3域和FVIII多肽係與比FVIII和VWF之間天然存在的鍵更強的鍵來締合。

在一些實施例中，該嵌合多肽包含FVIII多肽和包含VWF的D'域和D3域的VWF片段，其中VWF的D'D3域通過連接子與FVIII多肽融合。在一些實施例中，該連接子是可切割的連接子。在一些實施例中，VWF的D'域和D3域通過至少一個非共價鍵與FVIII多肽締合。在某些實施例中，VWF的D'域和D3域進一步與Fc融合。在一些實施例中，VWF的D'域和D3域通過連接子與Fc融合。在一些實施例中，該Fc通過另外的連接子與第二Fc融合。在某些實施例中，該Fc和該第二Fc通過共價鍵(例如雙硫鍵)彼此締合。在特定的實施例中，該嵌合多肽包含FVIII多肽和包含VWF的D'域和D3域的VWF片段，如國際公開號WO 2017/222337 A1中公開的，其通過提述以其整體併入本文。

該第一延長半衰期的部分、該第二延長半衰期的部分，或二者可選 自下列群組：FcRn結合配偶體(例如，白蛋白或免疫球蛋白Fc區)、XTEN序列、人絨毛膜促性腺激素的β次單元的C端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分，或其任何片段、衍生物、變異體，及其任何組合。

III.C.1.Ig恆定區或其部分

在一些實施例中，本公開的嵌合多肽還包括通過任何的連接子與FVIII多肽融合的第一Ig恆定區或其部分。該第一Ig恆定區或其部分可被插入在該FVIII多肽中或與該FVIII多肽的C端或N端融合。在一些實施例中，該嵌合多肽進一步包括與VWF蛋白融合的第二Ig恆定區或其部分。該第一Ig恆定區或其部分可被插入在該VWF片段中，或與該VWF片段的C端或N端融合。在特定的實施例中，該第一Ig恆定區係通過共價鍵(例如雙硫鍵)與該第二Ig恆定連接或締合。

Ig恆定區或其部分可與另外的異源部分(例如XTEN序列)和VWF蛋白來共同改善嵌合多肽的藥物代謝動力學或藥效動力學。在某些實施例中，Ig恆定區或其部分係延長與恆定區或其部分所融合的分子的半衰期。

Ig恆定區由表示CH(恆定重)域(CH1、CH2等)的域構成。取決於其同型的類別(即IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE)，恆定區可由三個或四個CH域構成。一些同型(例如IgG)恆定區還含有鉸鏈區。參見Janeway等2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y.。

用於產生本公開的嵌合多肽的Ig恆定區或其部分可以獲自許多不同的來源。在一些實施例中，Ig恆定區或其部分係衍生自人類Ig。應理解的是，然而，該Ig恆定區或其部分可衍生自另一哺乳動物物種的Ig，包括例如，齧齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、或豚鼠)或非人靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。而且，該Ig恆定區或其部分可衍生自任何Ig類別，其包括IgM、IgG、IgD、IgA、和IgE，和任何Ig同型，其包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在一些實施例中，使用人類同型IgG1。

多種Ig恆定區基因序列(例如，人恆定區基因序列)可以以可公開獲得的保藏物的形式來獲得。恆定區域序列可經選擇以具有特定的效用功能(或缺乏特定的效用功能)或經特定修飾以降低免疫原性。許多編碼有一個或多個抗體的 基因序列已經被公開，且適合的Ig恆定區序列(例如，鉸鏈、CH2、和/或CH3序列，或其部分)可以使用本領域公認的技術從這些序列來衍生。然後，可以改變或合成由任何前述方法所獲得的遺傳物質以獲得本公開的多肽。還應理解，本公開的範圍包含恆定區DNA序列的等位基因、變異體和突變。

Ig恆定區或其部分的序列可被選殖(cloned)，例如，使用聚合酶鏈式反應和選擇用於擴增感興趣的域的引子。為了選殖來自抗體的Ig恆定區或其部分的序列，mRNA可從雜交瘤細胞、脾細胞或淋巴細胞中分離，反轉錄成DNA，且通過PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法具體描述於美國專利號4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；以及，例如，「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」Innis等eds.,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等1989.Gene 77：51；Horton等1993.Methods Enzymol.217：270)中。PCR可通過共有恆定區引子或通過多個基於公開的重和輕鏈DNA和胺基酸序列的具體引子來開始。如上述所討論的，PCR還可用於分離編碼抗體輕和重鏈的DNA選殖。在此情況中，可通過共有引子或較大的同源探針(諸如小鼠恆定區探針)來篩選文庫。適於擴增抗體基因的許多引子對是本領域中已知的(例如，基於純化的抗體的N端序列的5'基因(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7：1509)；快速擴增cDNA末端(Ruberti,F.等1994.J.Immunol.Methods 173：33)；抗體先導序列(Larrick等1989 Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250))。選殖抗體序列進一步描述於Newman等，1995年1月25日提交的美國專利號5,658,570中，其通過提述併入本文。

本文中使用的Ig恆定區可包括其所有域和鉸鏈區或其部分。在一些實施例中，該Ig恆定區或其部分係包含CH2域、CH3域、和鉸鏈區，即Fc區或FcRn結合配偶體。

如本文所用的，術語「Fc區」定義為多肽的一部分，其對應於天然Ig的Fc區，即，如通過其兩條重鏈的各自Fc域的二聚締合形成的。天然Fc區與另一Fc區形成同源二聚體。與此相反，如本文所用的，術語「基因融合的Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)是指由在單個多肽鏈內(即，在單個連續基因序列中編 碼的)基因連接的Fc域所構成的合成二聚Fc區。

在一些實施例中，「Fc區」是指開始於木瓜蛋白酶切割位點(即IgG中的殘基216，將重鏈恆定區的第一殘基定為114)正上游的鉸鏈區且結束於抗體C端的單個Ig重鏈的部分。因此，完整的Fc域包含至少鉸鏈域、CH2域、和CH3域。

Ig恆定區的Fc區(其取決於Ig同型)可包括CH2、CH3、和CH4域，以及鉸鏈區。包含Ig的Fc區之嵌合多肽係賦予嵌合多肽數個期望的性質，包括穩定性的增加、血清半衰期的增加(參見Capon等，1989,Nature 337：525)以及結合Fc受體諸如新生Fc受體(FcRn)(美國專利號6,086,875、6,485,726、6,030,613；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，其通過提述以其整體併入本文。

Ig恆定區或其部分可以是FcRn結合配偶體。FcRn在成人上皮組織中有活性，並在腸、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結腸和直腸表面的管腔中表現(美國專利號6,485,726)。FcRn結合配偶體是Ig的一部分，其結合FcRn。FcRn結合配偶體的另一實例是白蛋白，以下進一步描述。

FcRn受體已經從若干哺乳動物物種(包括人)中分離。人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn、和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等1994,J.Exp.Med.180：2377)。FcRn受體在相對低的pH下結合IgG(但不結合其他Ig類別，諸如IgA、IgM、IgD、和IgE)，主動地將腔內的IgG跨細胞地向漿膜方向(serosal)轉運，然後在相對較高的pH處(存在於間質液中)釋放IgG。其表現在成人上皮組織中(美國專利號6,485,726、6,030,613、6,086,875；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺和腸上皮(Israel等1997,Immunology 92：69)、腎近端小管上皮(Kobayashi等2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282：F358)以及鼻上皮、陰道表面、和膽道系統表面。

可用於本公開的FcRn結合配偶體包含可由FcRn受體特異性結合的分子，該分子包括整個IgG、IgG的Fc片段，和包括FcRn受體的完整結合區的其他片段。IgG結合至FcRn受體的Fc部分的區域已經根據X射線晶體術被描述(Burmeister等1994,Nature 372：379)。Fc與FcRn的主要接觸面係接近CH2和CH3 域的連接部分。Fc-FcRn接觸全部在單個Ig重鏈內。FcRn結合配偶體包括整個IgG、IgG的Fc片段、和IgG的其他片段，包括FcRn的完整結合區。主要接觸位點包括CH2域的胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311、和314，以及CH3域的胺基酸殘基385-387、428、和433-436。對Ig或Ig片段或區的胺基酸編號的參考均基於Kabat等1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。

結合至FcRn的Fc區或FcRn結合配偶體可以通過FcRn有效地穿梭於上皮障壁，從而提供非侵入性手段以全身性地施用所期望的治療分子。此外，包含Fc區或FcRn結合配偶體的融合蛋白通過表現FcRn的細胞被內吞。但是這些融合蛋白不是經標記用於降解，而是再次回收到循環中，從而增加了這些蛋白質的體內半衰期。在某些實施例中，Ig恆定區的部分是Fc區域或FcRn結合配偶體，其一般係經由雙硫鍵和其他非特異性相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合配偶體來締合，以形成二聚體和更高階的多聚體。

兩個FcRn受體可結合單個Fc分子。結晶學資料表明每個FcRn分子係結合至Fc同源二聚體的單個多肽。在一些實施例中，將FcRn結合配偶體(例如IgG的Fc片段)連接至生物活性分子，提供了以口服、經頰、舌下、經直腸、經陰道，經鼻或經由肺途徑施用的氣霧劑，或經由眼睛途徑來遞送該生物活性分子的手段。在其他實施例中，該嵌合多肽可侵入性地施用，例如以皮下、靜脈內方式。

FcRn結合配偶體區域是可由FcRn受體特異性結合的分子或其部分，隨後通過Fc區的FcRn受體進行主動轉運。特異性結合是指形成複合物的兩個分子，該複合物在生理條件下相對穩定。特異性結合的表徵在於高親和力及低至中等載量(capacity)，這通常與具有低親和力及中等至高載量的非特異性結合有所區別。典型地，當親和力常數KA高於10⁶ M^-1 ，或高於10⁸ M^-1 時，認為結合是特異性的。如果必要的話，可在實質上不影響特異性結合的情況下通過改變結合條件來減少非特異性結合。適當的結合條件諸如分子的濃度、溶液的離子強度、可結合的時間、溫度、阻斷劑的濃度(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)等，可由本領域技術人員使用常規技術來最佳化。

在某些實施例中，本公開的嵌合多肽包含一個或多個經截切的Fc區，但該經截切的Fc區足以賦予Fc區對Fc受體(FcR)結合特性。例如，Fc區結合至FcRn的部分(即，FcRn結合部分)係包含IgG1的約胺基酸282-438，EU編號(一級接觸位點為CH2域的胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311、和314，和CH3域的胺基酸殘基385-387、428、和433-436)。因此，本公開的Fc區可包含FcRn結合部分或係由FcRn結合部分構成。FcRn結合部分可衍生自任何同型類別(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的重鏈。在一些實施例中，使用來自人類同型IgG1的抗體其FcRn結合部分。在其他實施例中，使用來自人類同型IgG4的抗體其FcRn結合部分。

在其他實施例中，「Fc區」包括Fc域的或衍生自Fc域的胺基酸序列。在某些實施例中，Fc區包含下列者的至少一種：鉸鏈(例如，上、中、和/或下鉸鏈區)域(根據EU編號，抗體Fc區的約胺基酸216-230)、CH2域(根據EU編號，抗體Fc區的約胺基酸231-340)、CH3域(根據EU編號，抗體Fc區的約胺基酸341-438)、CH4域，或其變異體、部分，或其片段。在其他實施例中，Fc區包含完整Fc域(即，鉸鏈域、CH2域、和CH3域)。在一些實施例中，Fc區包含下列者，實質上由下列者所構成，或係由下列者所構成：與CH3域(或其部分)融合的鉸鏈域(或其部分)，與CH2域(或其部分)融合的鉸鏈域(或其部分)，與CH3域(或其部分)融合的CH2域(或其部分)，與鉸鏈域(或其部分)和CH3域(或其部分)二者融合的CH2域(或其部分)。在又一些其他的實施例中，Fc區缺乏至少部分的CH2域(例如，全部或部分的CH2域)。在特定的實施例中，Fc區包含對應於EU編號221至447的胺基酸，或由對應於EU編號221至447的胺基酸構成。

本文中表示為F、F1、或F2的Fc區可從許多不同的來源獲得。在一些實施例中，該多肽的Fc區衍生自人類Ig。應理解，然而，Fc區可衍生自另一哺乳動物物種的Ig，包括例如，齧齒動物(例如例如小鼠、大鼠、兔、或豚鼠)或非人靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。而且，該Fc域或其部分的多肽可衍生自任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何Ig同型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在其他實施例中，使用人類同型IgG1。

在某些實施例中，該Fc變異體賦予至少一種由Fc區(包含所述野生型Fc域)給予的效用功能的變化(例如，Fc區結合Fc受體(例如FcγRI、FcγRII、或FcγRIII)或補體蛋白(例如C1q)，或引發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，吞噬作用，或補體依賴性細胞毒性(CDCC)的能力的改善或降低)。在其他實施例中，該Fc變異體提供工程化的半胱胺酸殘基。

本公開的Fc區可採用本領域公認的Fc變異體，已知該Fc變異體給予效用功能和/或FcR或FcRn結合的變化(例如，增強或降低)。具體地，本公開的結合分子可包括，例如，以下中公開的一處或多處胺基酸位置的變化(例如，替代)：國際PCT公開WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、和WO06/085967A2；美國專利公開號US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056；或美國專利號5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956、和7,317,091，其中每個通過提述併入本文。在一些實施例中，具體的變化(例如，一種或多種本領域中公開的胺基酸的特定替代)可在一處或多處公開的胺基酸位置進行。在其他實施例中，可在一處或多處公開的胺基酸位置進行不同變化(例如，本領域中公開的一處或多處胺基酸位置的不同替代)。

IgG的Fc區或FcRn結合配偶體可根據公認的方法(諸如定點誘變等)來修飾，以產生由FcRn所結合的經修飾的IgG或Fc片段或其部分。此類修飾包括遠離FcRn接觸位點的修飾以及接觸位點內的修飾，所述修飾保留或甚至增強與 FcRn的結合。例如，人IgG1Fc(Fc γ1)中的下列單個胺基酸殘基可被取代而沒有顯著丟失FcRn的Fc結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A、和K447A，其中例如P238A表示位置編號238處的野生型脯胺酸由丙胺酸替代。作為一個實例，一些實施例併入N297A突變，去除高度保守的N-糖基化位點。除了丙胺酸，其他胺基酸可在上面指定的位置處取代野生型胺基酸。突變可被單獨引入至Fc中，導致多於100種與天然Fc不同的Fc區域。此外，可以將這些個別突變中的兩個、三個或更多個的組合一起引入，產生數百種Fc區。而且，本公開的構築體的Fc區之一可以突變，且構築體的其他Fc區完全不突變，或者它們都可以突變但具有不同的突變。

某些上述突變可賦予Fc區或FcRn結合配偶體新的功能。例如，一些實施例併入N297A，去除高度保守的N-糖基化位點。此突變的作用在於降低免疫原性，從而增強Fc區的循環半衰期，以及使得Fc區無法結合至FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、和FcγRIIIA，而不損害對FcRn的親和力(Routledge等1995,Transplantation 60：847；Friend等1999,Transplantation 68：1632；Shields等1995,J.Biol.Chem.276：6591)。作為由上述突變引起的新功能的又一實例，在某些情況中，對FcRn的親和力可以增加到超過野生型的親和力。此增加的親和力可以反映增加的「開啟」速率，減少的「關閉」速率或者增加的「開啟」速率和減少 的「關閉」速率二者。被認為給予對FcRn的親和力所增加的突變其實例包括但不限於，T256A、T307A、E380A、和N434A(Shields等2001,J.Biol.Chem.276：6591)。

此外，至少三種人Fcγ受體似乎識別下鉸鏈區內IgG上的結合位點，通常是胺基酸234-237。因此，新功能和潛在降低的免疫原性的另一個實例可以由此區的突變引起，例如通過將人IgG1「ELLG」的胺基酸233-236替換為來自IgG2「PVA」的相應序列(具有一個胺基酸缺失)。已經顯示了當已經引入此類突變時，介導多種效用功能的Fcγ72RI、Fcγ72RII、和FcγRIII將不結合IgG1。Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2：77和Armour等1999,Eur.J.Immunol.29：2613。

在一些實施例中，Ig恆定區或其部分(例如Fc區)是多肽，其包括序列PKNSSMISNTP(美國專利號5,739,277的SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：3)，且任選地進一步包括選自以下的序列：HQSLGTQ(SEQ ID NO：90)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：91)、HQNISDGK(SEQ ID NO：92)、或VISSHLGQ(SEQ ID NO：93)(或分別為美國專利號5,739,277的SEQ ID NO：11、1、2、和31)。

在其他實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分係包含鉸鏈區或其部分中的胺基酸序列，該鉸鏈區或其部分係與另一免疫球蛋白恆定區或其部分形成一個或多個雙硫鍵。免疫球蛋白恆定區或其部分的雙硫鍵使包含FVIII多肽的第一多肽和包含VWF片段的第二多肽置於一起，使得內源性VWF不會代替VWF片段且不結合至FVIII多肽。因此，第一免疫球蛋白恆定區或其部分與第二免疫球蛋白恆定區或其部分之間的雙硫鍵係防止內源性VWF和FVIII多肽之間的相互作用。此種VWF和FVIII多肽之間的相互作用的抑制係使嵌合多肽的半衰期超過了兩倍的限度。鉸鏈區或其部分可進一步與CH1、CH2、CH3中的一個或多個域、其片段，和其任何組合連接。在特定的實施例中，該免疫球蛋白恆定區或其部分是鉸鏈區和CH2。

在某些實施例中，該Ig恆定區或其部分是半糖基化的。例如，包含兩個Fc區或FcRn結合配偶體的嵌合多肽，可含有第一糖基化的Fc區(例如，糖基 化的CH2區)或FcRn結合配偶體，和第二非糖基化的Fc區域(例如，非糖基化的CH2區)或FcRn結合配偶體。在一些實施例中，連接子可插入在糖基化和非糖基化的Fc區域之間。在其他實施例中，該Fc區語或FcRn結合配偶體經充分糖基化，即所有Fc區域皆經糖基化。在其他實施例中，該Fc區與可以是非糖基化的，即Fc部分均未經糖基化。

在某些實施例中，本公開的嵌合多肽包含Ig恆定區或其部分的胺基酸替代(例如，Fc變異體)，其改變Ig恆定區的抗原依賴性效用功能，特別是蛋白的循環半衰期。

當相較於缺乏這些替代物的蛋白時，此類蛋白係表現出與FcRn結合的增加或降低，因此，分別具有增加或降低的血清中半衰期。具有對FcRn有改善親和力的Fc變異體被預期係具有較長的血清半衰期，且此類分子在治療哺乳動物的方法中具有有益的應用，其中所施用的多肽係希望會有長半衰期，例如用於治療慢性疾病或病症(參見，例如，美國專利7,348,004、7,404,956、和7,862,820)。與此相反，具有降低的FcRn結合親和力的Fc變異體被預期會具有較短的半衰期，且此類分子也是有益的，例如有益於施用至哺乳動物，在該哺乳動物中，縮短的循環時間可能是有利的，例如有利於體內診斷成像，或當起始多肽在循環中長時間存在時具有毒性副作用的情況下。具有降低的FcRn結合親和力的Fc變異體也不太可能穿過胎盤，因此也可用於治療孕婦的疾病或病症。此外，預期會有降低的FcRn結合親和力的其他應用，係包括希望定位腦、腎、和/或肝的那些應用。一個示例性實施例中，本公開的嵌合多肽表現出從脈管系統穿過腎絲球上皮細胞有降低的轉運情況。在其他實施例中，本公開的嵌合多肽表現出從腦穿過血腦障壁(BBB)至血管空間有降低的轉運情況。在一些實施例中，具有經改變的FcRn結合情況的蛋白係包含至少一個Fc區或FcRn結合配偶體(例如，一個或多個Fc區或FcRn結合配偶體)，該Fc區或FcRn結合配偶體在Ig恆定區的「FcRn結合環」內具有一處或多處胺基酸替代。該FcRn結合環由野生型全長Fc區的胺基酸殘基280-299(根據EU編號)構成。在其他實施例中，本公開的嵌合多肽中具有被改變的FcRn結合親和力的Ig恆定區或其部分，係包含至少一個 Fc區或FcRn結合配偶體，該Fc區或FcRn結合配偶體在15

FcRn「接觸區」內具有一處或多處胺基酸替代。如本文所用的，術語15

FcRn「接觸區」包括野生型全長Fc部分下列位置處的殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU編號)。在其他實施例中，本公開的具有經改變的FcRn結合親和力的Ig恆定區或其部分，係包含至少一個Fc區或FcRn結合配偶體，該Fc區或FcRn結合配偶體具有一處或多處在對應於下列EU位置中任一個的胺基酸位置處的胺基酸替代：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A或N434K)、和438。改變FcRn結合活性的示例性胺基酸替代係公開在國際PCT公開號WO05/047327中，其通過提述併入本文。

在本公開中使用的Fc區或FcRn結合配偶體還可包含本領域公認的改變嵌合多肽其糖基化的胺基酸替代。例如，連接至VWF的D'D3域或FVIII多肽的嵌合多肽之Fc區或FcRn結合配偶體，可包含具有導致糖基化(例如，N或O連接的糖基化)減少突變的Fc區，或可包含野生型Fc部分的經改變糖型(例如，低海藻糖或無海藻糖聚糖)。

在一些實施例中，本公開的未經加工的嵌合多肽可包含基因融合的Fc區(即，scFc區)，其具有兩個或多個獨立選自本文所述的Ig恆定區或其部分的其構成性Ig恆定區或其部分。在一些實施例中，二聚Fc區的Fc區是相同的。在其他實施例中，至少兩個Fc區是不同的。例如，本公開的蛋白其Fc區或FcRn結合配偶體，係包含相同數目的胺基酸殘基，或它們可在長度上相差一個或多個胺基酸殘基(例如，相差約5個胺基酸殘基(例如，1、2、3、4、或5個胺基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基、或約50個殘基)。在又一些其他實施例中，本公開的蛋白其Fc區或FcRn結合配偶體的序列，可在一個或多個胺基酸位置處不同。例如，至少兩個Fc區或FcRn結合配偶體可在約5個胺基酸位置(例如，1、2、3、4、或5個胺基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置、或約50個位置處不同。

III.C.2.XTEN序列

如本文所用的「XTEN序列」是指以非天然存在且基本上非重複性序列所延長長度的多肽，其主要由小型親水性胺基酸構成，其中該序列在生理條件下具有低度的二級或三級結構，或無二級或三級結構。作為嵌合多肽配偶體，XTEN可用作載體，該載體當與本公開的VWF蛋白或FVIII序列連接以產生嵌合多肽時，係賦予某些期望的藥物代謝動力學、物理化學和藥學性質。此類期望的性質包括但不限於增強的藥物代謝動力學參數和溶解度特性。如本文所用的，「XTEN」係明確排除抗體或抗體片段，諸如單鏈抗體，或輕鏈或重鏈的Fc片段。

在一些實施例中，當XTEN序列與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合時，相較於較長的XTEN序列，較短的XTEN序列係提供經改善的半衰期延長性質。因此，在一些實施例中，與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，在長度上含有少於288個胺基酸，即比288個胺基酸短。在一些實施例中，與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，係由其長度介於12個胺基酸至287胺基酸之間的胺基酸序列所構成。在其他實施例中，與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，包含至少約36個胺基酸、至少約42個胺基酸、至少約72個胺基酸、或至少約144個胺基酸，但少於288個胺基酸。在其他實施例中，與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，係選自AE36、AG36、AE42、AG42、AE72、AG72、AE144、或AG144。在一些實施例中，與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，是與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：14為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的胺基酸序列，其中相較於不具有XTEN序列的嵌合多肽，該嵌合多肽表現出經改善的半衰期。

本公開的嵌合多肽可進一步包含另外的(第二、第三、或更多)XTEN序列。該另外的XTEN序列可進一步與FVIII多肽或第一Ig恆定區或其部分融合。該另外的XTEN序列可以是任何長度的。例如，與FVIII多肽或第一Ig恆定區或其 部分融合的另外的XTEN序列，是具有大於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、或2000個胺基酸殘基的肽或多肽。在某些實施例中，該另外的XTEN序列是具有大於約20至約3000個胺基酸殘基、大於約30至約2500個殘基、大於約40至約2000個殘基、大於約50至約1500個殘基、大於約60至約1000個殘基、大於約70至約900個殘基、大於約80至約800個殘基、大於約90至約700殘基、大於約100至約600個殘基、大於約110至約500個殘基、或大於約120至約400個殘基的肽或多肽。在某些實施例中，與FVIII多肽融合的另外的XTEN包含至少約288個胺基酸。在特定的實施例中，與FVIII多肽融合的另外的XTEN包含約288個胺基酸。在特定的實施例中，與FVIII多肽融合的另外的XTEN包含與AE288(SEQ ID NO：8)的胺基酸序列為至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同的胺基酸序列。

XTEN序列(即與VWF蛋白和/或第二Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，或與FVIII多肽和/或第一Ig恆定區或其部分融合的XTEN序列，或在FVIII多肽內的一個或多個插入位點處插入的XTEN序列)可包含一個或多個為9至14個胺基酸殘基的序列基序，或與該序列基序為至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列，其中該基序包含選自下列群組中的4至6種類型的胺基酸、實質上由選自下列群組中的4至6種類型的胺基酸所構成，或係由選自下列群組中的4至6種類型的胺基酸所構成：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)和脯胺酸(P)。參見US 2010-0239554 A1。

在一些實施例中，XTEN序列包含非重疊性序列基序，在XTEN序列中至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%，或約100%的該序列，係由選自於表7的單個基序家族的非重疊性序列的多個單元構成，以產生家族序列。如本文所用的，「家 族」意指XTEN具有僅自表7的單個基序分類中所選出的基序；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、或BD XTEN，且XTEN中任何其他不是來自家族基序的胺基酸，係經選擇以獲得所需的性質，諸如為了要藉由編碼讓核苷酸併入限制性位點，併入切割序列，或為了達成FVIII或VWF有更好的連接。在XTEN家族的一些實施例中，XTEN序列包含AD基序家族的，或AE基序家族的，或AF基序家族的，或AG基序家族的，或AM基序家族的，或AQ基序家族的，或BC家族的，或BD家族的多個單元之非重疊性序列基序，所得的XTEN係表現出上述同源性的範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表7的兩個或更多個基序家族的多個單元的基序序列。這些序列可經選擇以實現期望的物理/化學特性，包括諸如由基序的胺基酸組成所賦予的淨電荷、親水性、缺乏二級結構，或缺乏重複性的性質，下文將更充分地描述。在此段上述的實施例中，併入XTEN中的基序可使用本文所述的方法經選擇和裝配以取得約36至約3000個胺基酸殘基的XTEN。

在一些實施例中，在本公開中使用的XTEN序列與選自下列群組的序列為至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AE576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、和AG2004。參見US 2010-0239554 A1。

在一些實施例中，該XTEN序列係與選自下列群組的胺基酸序列為至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：AE42(SEQ ID NO：9)、AE72(SEQ ID NO：10)、AE144_2A(SEQ IDNO：55)、AE144_3B(SEQ ID NO：56)、AE144_4A(SEQ ID NO：57)、AE144_5A(SEQ IDNO：58)、AE144_6B(SEQ IDNO：59)、AG144_A(SEQ ID NO：60)、AG144_B(SEQ IDNO：61)、AG144_C(SEQ ID NO：62)、AG144_F(SEQ IDNO：63)、AE864(SEQ ID NO：15)、AE576(SEQ ID NO：16)、AE288(SEQ IDNO：8)、AE288_2(SEQ ID NO：54)、AE144(SEQ ID NO：11)、AG864(SEQ ID NO：17)，AG576(SEQ ID NO：18)，AG288(SEQ ID NO：19)，AG144(SEQ ID NO：14)、及其任何組合。在其他實施 例中，該XTEN序列選自下列群組：AE42(SEQ ID NO：9)、AE72(SEQ ID NO：10)、AE144_2A(SEQ IDNO：55)、AE144_3B(SEQ ID NO：56)、AE144_4A(SEQ ID NO：57)、AE144_5A(SEQ IDNO：58)、AE144_6B(SEQ IDNO：59)、AG144_A(SEQ ID NO：60)、AG144_B(SEQ IDNO：61)、AG144_C(SEQ ID NO：62)、AG144_F(SEQ IDNO：63)、AE864(SEQ ID NO：15)、AE576(SEQ ID NO：16)、AE288(SEQ IDNO：8)、AE288_2(SEQ ID NO：54)、AE144(SEQ ID NO：11)、AG864(SEQ ID NO：17)、AG576(SEQ ID NO：18)、AG288(SEQ ID NO：19)、AG144(SEQ ID NO：14)、及其任何組合。在一些實施例中，該XTEN序列是AE288。本公開的某些XTEN序列的胺基酸序列係示於8中。

在這些實施例中，其中一個或多個XTEN組分由其胺基酸中有少於100%係為4、5、或6種類型的選自於下列胺基酸所構成：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)和脯胺酸(P)，或具有由少於100%的來自表7的序列基序或表8的XTEN序列所構成的序列，XTEN的其他胺基酸殘基係選自其他14種天然L-胺基酸中的任一種，但較佳係選自於親水性胺基酸，使得該XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%親水性胺基酸。非甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)和脯胺酸(P)的XTEN胺基酸係散佈在整個XTEN序列，位於序列基序內或序列基序之間，或集中在XTEN序列的一個或多個短的序列段(stretch)中，例如，以產生在XTEN和FVIII或VWF組分之間的連接子。在XTEN組分包含除了甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)和脯胺酸(P)以外的胺基酸之情況下，較佳是少於約2%或少於約1%的胺基酸是疏水性殘基，使得所得序列通常缺乏二級結構，例如不具有多於2% α螺旋或2% β折疊，如通過本文公開的方法測定的。不太會用來構建XTEN的疏水性殘基，包括色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、異白胺酸、擷胺酸、和甲硫胺酸。此外，可設計XTEN序列以含有少於5%、或少於4%、或少於3%、或少於2%、或少於1%，或無下列的胺基酸：半胱胺酸(以避免雙硫鍵形成和氧化)、甲硫胺酸(以避免氧化)、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸(以避免脫醯胺作用)。因此，在一些實施例中，包含除甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)和脯胺酸(P)外等其他胺基酸的XTEN組分，其序列含有少於5%會導致α螺旋和β折疊(藉由Chou-Fasman算法所衡量 者)的殘基，且具有至少90%、或至少約95%、或更高的無規則捲曲形成(藉由GOR算法所衡量者)。

在又一些實施例中，在本公開的中使用的XTEN序列係影響本公開的嵌合多肽的物理或化學性質，例如藥物代謝動力學。在本公開的中使用的XTEN序列可表現出一種或多種下列有利的性質：構形彈性、增強的水溶解度、高蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體的低度結合、或增加的流體動力學(或斯托克斯(Stokes))半徑。在一些實施例中，與本公開中的FVIII蛋白連接的XTEN序列係增加藥物代謝動力學性質，諸如較長的終末半衰期，或增加的曲線下面積(AUC)，使得相較於野生型FVIII，本文所述的嵌合多肽在體內的保持時間增加。在又一些實施例中，在本公開中使用的XTEN序列係增加藥物代謝動力學性質，諸如較長的終末半衰期，或增加的曲線下面積(AUC)，使得相較於野生型FVIII，FVIII蛋白在體內的保持時間增加。

多種方法和測定法可用來測定包含XTEN序列的蛋白其物理/化學性質。此類方法包括但不限於，分析離心分離、EPR、離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、反相HPLC、光散射、毛細管電泳、圓二色譜、差示掃描量熱法、熒光、離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、IR、NMR、拉曼光譜、折光測定法、和UV/可見光譜。另外的方法公開於Amau等，Prot Expr and Purif48,1-13(2006)中。

其他可根據本公開所使用的XTEN序列實例係公開於美國專利公開號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1、或2011/0172146 A1，或國際專利公開號WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、WO 2011028344 A2、或WO 20130122617 A1中。

III.C.2.白蛋白

白蛋白或其部分可以是FcRn結合配偶體。在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽包含至少一個白蛋白多肽或其片段、變異體、或衍生物。人類血清白蛋白(HSA或HA)，全長形式為609個胺基酸的蛋白，負責血清的顯著比例的滲透壓，且還作為內源性和外源性配體的載體。如本文所用的術語 「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體的實例係公開於美國專利公開號2008/0194481A1、2008/0004206 A1、2008/0161243 A1、2008/0261877 A1、或2008/0153751 A1或PCT申請公開號2008/033413 A2、2009/058322 A1、或2007/021494 A2，其通過提述以其整體併入本文。

白蛋白結合多肽(ABP)可包含但不限於，可結合至白蛋白的細菌性白蛋白結合域、白蛋白結合肽、或白蛋白結合抗體片段。來自鏈狀球菌的蛋白G其域3，如Kraulis等，FEBS Lett.378：190-194(1996)和Linhult等，Protein Sci.11：206-213(2002)所公開的，是細菌性白蛋白結合域的實例。白蛋白結合肽的實例公開於Dennis等，J.Biol.Chem.2002,277：35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段的實例係公開於Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9：319-326(2007)；Roovers等，Cancer Immunol.Immunother.56：303-317(2007)，和Holt等，Prot.Eng.Design Sci.,21：283-288(2008)中，其通過提述以其整體併入本文。

在某些方面中，在本公開的方法中所使用的嵌合多肽，係包含至少一個供非多肽小分子、其變異體、或衍生物可結合至白蛋白的附著位點。例如，該嵌合多肽可包括一個或多個有機白蛋白結合部分。此類白蛋白結合部分的實例為，如Trussel等，Bioconjugate Chem.20：2286-2292(2009)中公開的2-(3-馬來亞醯胺丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標簽)。

在某些實施例中，本文所述的VWF片段係與白蛋白融合。在一些實施例中，VWF片段-白蛋白構築體係形成二聚體。在一些實施例中，VWF的與白蛋白融合的D'D3域與FVIII多肽締合。在某些實施例中，融合至白蛋白的VWF之D'D3域係通過比野生型FVIII和VWF之間的天然非共價相互作用更強的相互作用來與FVIII多肽締合。在特定的實施例中，VWF的D'D3域和/或FVIII多肽係包含一個或多個增加VWF的D'D3域和FVIII多肽之間的親和力的突變。在某些實施例中，VWF的D'D3域和/或FVIII多肽係包含一個或多個允許在VWF的D'D3域和/或FVIII多肽之間形成雙硫鍵的突變。

III.C.3.CTP

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽係包含至少一個人類絨毛膜促性腺激素的β次單元的C端肽(C-terminal peptide，CTP)或其片段、變異體、或衍生物。已知CTP肽用於增加此蛋白的半衰期。參見，例如，美國專利號5,712,122，其通過提述以其整體併入本文。非限制性的示例性CTP肽公開在美國專利申請公開號US 2009/0087411 A1中，其通過提述併入。

III.C.4.PAS

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽包含至少一個PAS肽或其片段、變異體、或衍生物。如本文所用的，PAS肽或PAS序列意指主要包含丙胺酸和絲胺酸殘基，或主要包含丙胺酸、絲胺酸、和脯胺酸殘基的胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下係形成無規則捲曲構形。因此，該PAS序列是構成模組、胺基酸聚合物，或為含有丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸的序列盒、實質上由丙胺酸、絲胺酸、和脯胺酸構成的序列盒，或係由丙胺酸、絲胺酸、和脯胺酸構成的序列盒，其在嵌合多肽中可作為一部分之異源部分。當PAS序列中添加有除了丙胺酸、絲胺酸、和脯胺酸以外的殘基作為少量成分時，胺基酸聚合物還是可形成無規則捲曲構形。「少量成分」意指除了丙胺酸、絲胺酸、和脯胺酸以外的胺基酸，可在PAS序列中添加到一定程度，例如，多達約12%(即，PAS序列的100個胺基酸中的12個)、多達約10%、多達約9%、多達約8%、約6%、約5%、約4%、約3%、即約2%、或約1%的該胺基酸。不同於丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸的胺基酸可選自下列群組：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、和Val。在生理條件下，PAS肽係形成無規則捲曲構形，從而可介導本公開的重組蛋白在體內和/或體外的穩定性增加，且具有促凝血活性。

PAS肽的非限制性實例公開在，例如，美國專利公開號2010/0292130 A1；PCT申請公開號WO 2008/155134 A1；和歐洲授權的專利EP2173890。

III.C.5.HAP

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽包含至少一個均胺基酸聚合物(HAP)肽或其片段、變異體、或衍生物。HAP肽可包含甘胺酸的重複序列，其長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸、或500個胺基酸。HAP序列能夠延長與HAP序列融合或連接的部分的半衰期。HAP序列的非限制性實例包括，但不限於(Gly)n、(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。在一些實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40。在其他實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200。參見，例如，Schlapschy M等，Protein Eng.Design Selection,20：273-284(2007)。

III.C.6.轉鐵蛋白

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽包含至少一個轉鐵蛋白肽或其片段、變異體、或衍生物。任何轉鐵蛋白可與在本公開的方法中使用的嵌合多肽融合。例如，野生型人類Tf(Tf)是679個胺基酸的蛋白，約75kDa(不考慮糖基化)，具有兩個主要域，N(約330個胺基酸)和C(約340個胺基酸)，其似乎起源於基因重複。參見GenBank登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，其中全部通過提述以其整體併入本文。

轉鐵蛋白通過轉鐵蛋白受體(TfR)介導的內吞作用來運輸鐵。在鐵被釋放到內體區室中，且Tf-TfR複合體被循環到細胞表面後，Tf係被釋放回細胞外空間，以用於下一輪的鐵運輸。Tf擁有超過14至17天的長半衰期(Li等，Trends Pharmacol.Sci.23：206-209(2002))。已經研究了轉鐵蛋白融合蛋白的半衰期延長、靶向遞送用於癌症治療、口服遞送和持續激活胰島素原(Brandsma等，Biotechnol. Adv.,29：230-238(2011)；Bai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：7292-7296(2005)；Kim等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,334：682-692(2010)；Wang等，J.Controlled Release 155：386-392(2011))。

III.C.7.PEG

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽包含非多肽異源部分或其片段、變異體、或衍生物的至少一個附著位點。例如，在本公開的方法中使用的嵌合多肽可包括與凝血因子和/或Fc區中的一個或多個胺基酸殘基附著的一個或多個聚乙二醇(PEG)部分。

蛋白的聚乙二醇化可是指該蛋白和至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成的綴合物。多種分子量和平均分子量範圍的PEG係可商購獲得。PEG平均分子量範圍的一般實例包括，但不限於，約200、約300、約400、約600、約1000、約1300-1600、約1450、約2000、約3000、約3000-3750、約3350、約3000-7000、約3500-4500、約5000-7000、約7000-9000、約8000、約10000、約8500-11500、約16000-24000、約35000、約40000、約60000、和約80000道爾頓(Dalton)。這些平均分子量僅作為實例提供，並不意味著以任何方式進行限制。

在本公開的方法中所使用的嵌合多肽可經聚乙二醇化以包括單一或聚(例如，2至4個)PEG部分。聚乙二醇化可通過本領域中已知的任何聚乙二醇化反應來進行。用於製備聚乙二醇化蛋白產物的方法將通常包括(i)在本公開的肽與一個或多個PEG基團附著的條件下，使多肽與聚乙二醇(諸如PEG的反應性酯或醛衍生物)反應；和(ii)獲得一個或多個反應產物。通常，反應的最佳反應條件將根據已知參數和期望的結果以個案確定。

本領域技術人員可使用許多PEG附著方法，例如Malik F等，Exp.Hematol.20：1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)；歐洲專利公開號EP0401384、EP0154316、和EP0401384；和國際專利申請公開號WO92/16221和WO95/34326。作為非限制性實例，FVIII變異體可含有半胱胺酸替代，且半胱胺酸可進一步與PEG聚合物綴合。參見Mei等，Blood 116：270-279(2010)和美國專利號7,632,921，其通過提述以其整體併入本文。

在某些實施例中，該嵌合多肽係包含與VWF片段共價連接的單鏈FVIII多肽，該VWF片段包含VWF的D'域和D3域，其中該FVIII多肽包含全部或部分B域的缺失，其中該FVIII多肽是聚乙二醇化的，且其中該VWF片段與FVIII多肽(例如，PEG-scFVIII-D'D3、「MG1121」或LAFATE)的N端直接或間接融合。在其他實施例中，該嵌合多肽係包含與VWF片段共價連接的單鏈FVIII多肽，該VWF片段包含VWF的D'域和D3域，其中該FVIII多肽包含全部或部分B域的缺失，其中該VWF片段是聚乙二醇化的，且其中該VWF片段與FVIII多肽(例如，scFVIII-D'D3-PEG)的N端直接或間接融合。在其他實施例中，該嵌合多肽係包含與VWF片段共價連接的單鏈FVIII多肽，該VWF片段包含VWF的D'域和D3域，其中該FVIII多肽包含全部或部分B域的缺失，其中FVIII多肽和該VWF片段是聚乙二醇化的，且其中該VWF片段與FVIII多肽(例如，scFVIII-D'D3-PEG)的N端直接或間接融合。

III.C.8.HES

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽係包含至少一個羥乙基澱粉(HES)聚合物。HES是天然存在的支鏈澱粉的衍生物，且通過體內的α澱粉酶降解。HES表現出有益的生物學性質，且用作血容積代替劑，且在臨床上用於血液稀釋療法。參見，例如，Sommermeyer等，Krankenhauspharmazie 8：271-278(1987)；和Weidler等，Arzneim.-Forschung/Drug Res.41：494-498(1991)。

HES主要係以分子量分佈和替代程度所表徵。HES的平均分子量(重均分子量)為1至300kD、2至200kD、3至100kD、4至70kD。羥乙基澱粉可進一步表現出0.1至3、0.1至2、0.1至0.9、或0.1至0.8的莫耳替代率(molar degree of substutution)，以及相對於羥乙基基團C2：C6替代的比例在2至20的範圍中。平均分子量為約130kD的HES為來自Fresenius的VOLUVEN^® 。VOLUVEN^® 是人工膠體，其例如係用於在低血容量症中之治療和預防的治療性指示所使用的容量代替物。本領域技術人員可使用許多HES附著方法，例如，上述相同的PEG附著方法。

III.C.9.PSA

在某些方面中，在本公開的方法中使用的嵌合多肽包含至少一個聚唾液酸(PSA)聚合物。PSA是天然存在且無支鏈的唾液酸聚合物，其係通過某些細菌菌株和哺乳動物中的某些細胞中所產生。參見，例如，Roth J.等(1993)in Polysialic Acid：From Microbes to Man,eds.Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.(BirkhäuserVerlag,Basel,Switzerland),pp.335-348。PSA可生成為多種的聚合程度，從n=約80或以上的唾液酸殘基直至n=2，其係對天然的、細菌性衍生的聚合物形式進行有限的酸水解，或進行神經胺酸酶消化、或進行分餾來產生。本領域技術人員可使用許多PSA附著方法，例如，上述相同的PEG附著方法。在某些方面中，激活的PSA還可與凝血因子內的半胱胺酸胺基酸殘基附著，例如，在FVIII上，或Fc區內的半胱胺酸胺基酸殘基。參見，例如，美國專利號5846951。

III.C.10.清除受體

在某些方面中，若該嵌合多肽的凝血因子包含FVIII多肽和FVIII清除受體或其FVIII結合片段、變異體、或衍生物的至少一個片段，在本公開的方法中所使用的嵌合多肽其半衰期可以被延長。插入可溶形式的清除受體，諸如低密度脂蛋白相關的蛋白受體LRP1或其片段，可阻斷FVIII與清除受體的結合，且從而延長其半衰期，例如是體內半衰期。LRP1是600kDa的整合膜蛋白，其涉及多種蛋白質(包括FVIII)的受體介導清除。參見，例如，Lenting等，Haemophilia 16：6-16(2010)。其它適合的FVIII清除受體例如是，LDLR(低密度脂蛋白受體)、VLDLR(極低密度脂蛋白受體)、和巨蛋白(LRP-2)、或其片段。參見，例如，Bovenschen等，Blood 106：906-912(2005)；Bovenschen,Blood 116：5439-5440(2010)；Martinelli等，Blood 116：5688-5697(2010)。

III.D.插入位點

在某些方面中，FVIII多肽中的插入位點係位於FVIII多肽的一個或多個域中，該域是N端、A1域、A2域、A3域、B域、C1域、C2域、C端、或其兩個或多於兩個的組合，或位於FVIII多肽的兩個域之間，該兩個域是A1域和a1 酸性區、和a1酸性區和A2域、A2域和a2酸性區、a2酸性區和B域、B域和A3域、和A3域和C1域、C1域和C2域、或其任何組合。例如，可插入XTEN序列的插入位點選自下列群組：N端和A1域、N端和A2域、N端和A3域、N端和B域、N端和C1域、N端和C2域、N端和C端、A1和A2域、A1和A3域、A1和B域、A1和C1域、A1和C2域、A1域和C端、A2和A3域、A2和B域、A2和C1域、A2和C2域、A2域和C端、A3和B域、A3和C1域、A3和C2域、A3域和C端、B和C1域、B和C2域、B域和C端、C1和C2域、C1和C端、C2域和C端，及其兩種或多種組合。

在連接XTEN序列或插入XTEN序列後，FVIII多肽(其中XTEN序列在係插入於緊鄰FVIII多肽中的一個或多個胺基酸(例如，一個或多個XTEN插入位點)的下游或在C端或N端處連接)係保留有FVIII活性。XTEN序列可以在FVIII多肽中插入一次或多於一次、兩次、三次、四次、五次、或六次，使得插入不影響FVIII活性(即，FVIII蛋白仍保留凝血性質)。

可用於本公開的FVIII多肽可通過任選的連接子在FVIII多肽的N端或C端處，與一個或多個XTEN多肽連接，或通過一個或多個任選的連接子插入在緊鄰FVIII多肽中的一個或多個胺基酸(例如，一個或多個XTEN插入位點)的下游。

在又一些其他的實施例中，一個或多個XTEN係被插入在FVIII的B域中。在一個實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸740和1640之間，其中在胺基酸740和1640之間的FVIII序列可視情況不存在。在另一實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸741和1690之間，其中在胺基酸740和1690之間的FVIII序列可視情況不存在。在其他實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸741和1648之間，其中在胺基酸741和1648之間的FVIII序列可視情況不存在。在又一些其他的實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸743和1638之間，其中胺基酸743和1638之間的FVIII序列可視情況不存在。在又一些其他的實施例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸745和1656之間，其中在胺基酸745和1656之間的FVIII序列可視情況不存在。在一些實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸745和1657 之間，其中在胺基酸745和1657之間的FVIII序列可視情況不存在。在某些實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸745和1667之間，其中在胺基酸745和1667之間FVIII序列可視情況不存在。在又一些其他的實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸745和1686之間，其中在胺基酸745和1686之間的FVIII序列可視情況不存在。在一些其他實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸747和1642之間，其中在胺基酸747和1642之間的FVIII序列可視情況不存在。在又一些其他實例中，XTEN被插入在對應於SEQ ID NO：65的胺基酸751和1667之間，其中在胺基酸751和1667之間的FVIII序列可視情況不存在。在一些實施例中，XTEN序列被插入在成熟FVIII多肽的胺基酸745和746之間，或B域缺失的FVIII多肽的對應插入位點。在特定的實施例中，包含具有與AE288(SEQ ID NO：8)的胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列同一性的胺基酸序列的XTEN序列被插入在成熟FVIII的胺基酸745和746之間，其中該成熟FVIII具有胺基酸殘基746至1648的缺失。在特定的實施例中，XTEN被插入在緊鄰表5的B域缺失的FVIII(SEQ ID NO：68)的胺基酸745的下游。

III.E.連接子

在某些實施例中，本公開的嵌合多肽在FVIII蛋白係中和/或在VWF片段中進一步包含一個或多個連接子。一種類型的連接子是可切割的連接子，當其在體內施用至個體(例如在凝血位點處)時，可由蛋白酶來切割。在一些實施例中，該可切割的連接子允許從XTEN序列切割例如VWF蛋白的基團，從而自嵌合多肽在凝血級聯位點處切割出來，因此讓激活的FVIII(FVIIIa)具有其FVIIIa活性。另一種類型的連接子是可加工的連接子，其含有細胞內切割位點，且因此可在宿主細胞中由細胞內加工酶進行切割，以方便地表現多肽和形成嵌合多肽。

一個或多個連接子可存在於嵌合多肽中的任何兩個蛋白之間。在一 些實施例中，嵌合多肽包含第一多肽和第二多肽，該第一多肽包含(i)FVIII多肽和(ii)第一Ig恆定區或其部分，該第二多肽包含(iii)VWF蛋白，(iv)連接子(例如，可切割的連接子)，(v)XTEN序列，和(vi)第二Ig恆定區或其部分。在其他實施例中，嵌合多肽包含第一多肽和第二多肽，該第一多肽包含(i)FVIII多肽和(ii)第一Ig恆定區或其部分，該第二多肽包含(iii)VWF蛋白，(iv)XTEN序列，(v)連接子(例如可切割的連接子)，和(vi)第二Ig恆定區或其部分。在其他實施例中，嵌合多肽包含第一多肽和第二多肽，該第一多肽包含(i)FVIII多肽和(ii)第一Ig恆定區或其部分，該第二多肽包含(iii)VWF蛋白，(iv)第一連接子(例如可切割的連接子)，(v)XTEN序列，(vi)第二連接子(例如可切割的連接子)，和(vii)第二Ig恆定區或其部分。在一些實施例中，該第一多肽在FVIII多肽和第一Ig恆定區之間進一步包含連接子(例如可切割的連接子)。

在某些實施例中，嵌合多肽包含單鏈，該單鏈包含(i)FVIII多肽，(ii)第一Ig恆定區或其部分，(iii)連接子(例如可加工的連接子)，(iv)VWF蛋白，(v)XTEN序列，和(vi)第二Ig恆定區或其部分。在其他實施例中，嵌合多肽包含單鏈，該單鏈包含(i)FVIII多肽，(ii)第一Ig恆定區或其部分，(iii)第一連接子(例如可加工的連接子)，(iv)VWF蛋白，(v)第二連接子(例如可切割的連接子)，(vi)XTEN序列，和(vii)第二Ig恆定區或其部分。在該嵌合多肽在宿主細胞中表現後，該可加工的連接子可經加工；因此在宿主細胞中所產生的嵌合多肽可以是包含兩條或三條多肽鏈的最終形式。

可用於本公開的連接子可包含任何有機分子。可在本公開的嵌合多肽中使用的連接子的實例公開於，例如，US 2011/0183907 A1、US 2016/0229903 A1、和US 2016/0251408 A1中，其中各文本係通過提述以其整體併入本文。在一些實施例中，該連接子包含聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)或羥乙基澱粉(HES)。在其他實施例中，該連接子包含胺基酸序列。該連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000個胺基酸。該連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50 個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸、或900-1000個胺基酸。在一些實施例中，該連接子包含XTEN序列。XTEN的另外的實例可根據本公開來使用，且公開於美國專利公開號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1、或2011/0172146 A1，或國際專利公開號WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、或WO 2011028344 A2中。在其他實施例中，該連接子是PAS序列。

在某些實施例中，該連接子是聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)或羥乙基澱粉(HES)。在其他實施例中，該連接子是胺基酸序列。該連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000個胺基酸。該連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸、或900-1000個胺基酸。

連接子的實例是本領域中熟知的。在某些實施例中，該連接子包含序列G_n 。該連接子可包含序列(GA)_n 。該連接子可包含序列(GGS)_n 。在其他實施例中，該連接子包含(GGGS)_n (SEQ ID NO：101)。在又一些其他的實施例中，該連接子包含序列(GGS)_n (GGGGS)_n (SEQ ID NO：95)。在這些情況中，n可以是從1-100的整數。在其他情況中，n可以是從1-20的整數，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。連接子的實例包括但不限於，GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO：96)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：97)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：98)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：99)、或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：100)。該連接子不消除或減少VWF蛋白活性或因子VIII的凝血活性。任選地，該連接子係增強VWF蛋白活性或因子VIII蛋白的凝血活性，例如藉由進 一步減少立體障礙作用，並使VWF蛋白或因子VIII部分更易接近其靶結合位點。

在某些實施例中，可用於嵌合多肽的連接子為15-25個胺基酸長。在其他實施例中，可用於嵌合多肽的連接子為15-20個胺基酸長。在一些實施例中，可用於嵌合多肽的連接子為10-25個胺基酸長。在其他實施例中，可用於嵌合多肽的連接子為15個胺基酸長。在又一些其他的實施例中，可用於嵌合多肽的連接子為(GGGGS)_n (SEQ ID NO：94)，其中G表示甘胺酸，S表示絲胺酸，且n為從1-20的整數。

III.F.切割位點

可切割連接子可以併入能夠通過化學方法(例如，酯鍵的水解)、酶促(即，併入蛋白酶切割序列)、或光解(例如，生色團諸如3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP))來切割的部分，以便從另一分子釋放一個分子。適於本公開的嵌合多肽的可切割連接子其實例可見於，例如，US 2016/0229903 A1和US 2016/0251408 A1中，其中個文本通過提述以其整體併入本文。

在某些實施例中，可切割連接子在N端或C端或二者處包含一個或多個切割位點。在其他實施例中，該可切割連接子實質上由或係由一個或多個可切割位點所構成。在其他實施例中，該可切割連接子包含本文所述的異源胺基酸連接子序列或聚合物和一個或多個可切割位點。

在某些實施例中，可切割連接子包含一個或多個可在宿主細胞中切割的切割位點(即，細胞內加工位點)。切割位點的非限制性實例包括RRRR(SEQ ID NO：102)、RKRRKR(SEQ ID NO：103)、和RRRRS(SEQ ID NO：104)。

在一些實施例中，可切割連接子包含來自FVIII的a1區、來自FVIII的a2區、來自FVIII的a3區、凝血酶可切割位點，該凝血酶可切割位點包含X-V-P-R(SEQ ID NO：105)和PAR1外位點(exosite)相互作用基序，其中X是脂肪族胺基酸，或其任何組合。在其他實施例中，可用於本公開 的可切割連接子包含a2區，該a2區包含與對應於全長FVIII的Glu720至Arg740至少為約80%、約85%、約90%、約95%或100%相同的胺基酸序列，其中a2區能够由凝血酶切割。在特定的實施方案中，可用於本公開的可切割連接子包含a2區，該a2區包含ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：106)或DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：88)。在其他實施方案中，可用於本公開的可切割連接子包含a1區，該a1區包含與對應於全長FVIII的Met337至Arg372至少為約80%、約85%、約90%、約95%、或100%相同的胺基酸序列，其中a1區能够由凝血酶切割。在特定的實施方案中，該a1區包含ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(SEQ ID NO：107)。在一些實施例中，本公开的可切割連接子包含a3區，該a3區包含與對應於全長FVIII的Glu1649至Arg1689至少為約80%、約85%、約90%、約95%、或100%相同的胺基酸序列，其中該a3區能够由凝血酶切割。在某些實施方案中，用於本公開的可切割連接子包含a3區，該a3區包含ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(SEQ ID NO：108)。

在其他實施方案中，可切割連接子包含凝血酶切割位點，該凝血酶切割位點包含X-V-P-R(SEQ ID NO：105)和PAR1外位點相互作用基序，且其中PAR1外位點相互作用基序包含S-F-L-L-R-N(SEQ ID NO：109)。PAR1外位點相互作用基序可進一步包含選自以下的胺基酸序列：P、P-N、P-N-D、P-N-D-K(SEQ ID NO：110)、P-N-D-K-Y(SEQ ID NO：111)、P-N-D-K-Y-E(SEQ ID NO：112)、P-N-D-K-Y-E-P(SEQ ID NO：113)、P-N-D-K-Y-E-P-F(SEQ ID NO：114)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(SEQ ID NO：115)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(SEQ ID NO：116)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(SEQ ID NO：117)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(SEQ ID NO：118)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(SEQ ID NO：119)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(SEQ ID NO：120)，或其任何组合。在一些實施例中，脂肪族胺基酸選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、或異白胺酸。

在其他實施方案中，可切割連接子包含一個或多個切割位點，在包含該可切割連接子的嵌合多肽施用至個體後，該切割位點可由蛋白酶切割。在一些實施例中，該切割位點可由選自下列群組的蛋白酶切割：因子XIa、因子XIIa、激肽釋放素(kallikrein)、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP-13、MMP-17、和MMP-20。在其他實施方案中，該切割位點選自下列群組：FXIa切割位點(例如，KLTR↓AET(SEQ ID NO：121))、FXIa切割位點(例如，DFTR↓VVG(SEQ ID NO：122))、FXIIa切割位點(例如，TMTR↓IVGG(SEQ ID NO：123))、激肽釋放素切割位點(例如，SPFR↓STGG(SEQ ID NO：124))、FVIIa切割位點(例如，LQVR↓IVGG(SEQ ID NO：125))、FIXa切割位點(例如，PLGR↓IVGG(SEQ ID NO：126))、FXa切割位點(例如，IEGR↓TVGG(SEQ ID NO：127))、FIIa(凝血酶)切割位點(例如，LTPR↓SLLV(SEQ ID NO：128))、彈性蛋白酶-2切割位點(例如，LGPV↓SGVP(SEQ ID NO：129))、顆粒酶-B切割位點(例如，VAGD↓SLEE(SEQ ID NO：130))、MMP-12切割位點(例如，GPAG↓LGGA(SEQ ID NO：131))、MMP-13切割位點(例如，GPAG↓LRGA(SEQ ID NO：132))、MMP-17切割位點(例如，APLG↓LRLR(SEQ ID NO：133))、MMP-20切割位點(例如，PALP↓LVAQ(SEQ ID NO：134))、TEV切割位點(例如，ENLYFQ↓G(SEQ ID NO：135))、腸激酶(Enterokinase)切割位點(例如，DDDK↓IVGG(SEQ ID NO：136))、蛋白酶3C(PRESCISSION^TM )切割位點(例如，LEVLFQ↓GP(SEQ ID NO：137))、和分選酶A(Sortase A)切割位點(例如，LPKT↓GSES)(SEQ ID NO：138)。在某些實施方案中，FXIa切割位點包括，但不限於，例如，TQSFNDFTR(SEQ ID NO：1)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：3)。非限制性示例性凝血酶切割位點包括，例如，DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：4)、TTKIKPR(SEQ ID NO：5)、LVPRG(SEQ ID NO： 6)、DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：88)、或IEPRSFS(SEQ ID NO：194)，和包含ALRPR(SEQ ID NO：7)(例如，ALRPRVVGGA(SEQ ID NO：145))的序列，實質上由由ALRPR(SEQ ID NO：7)(例如，ALRPRVVGGA(SEQ ID NO：145))構成的序列，或係由ALRPR(SEQ ID NO：7)(例如，ALRPRVVGGA(SEQ ID NO：145))構成的序列。

在一些實施例中，該切割位點為TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO：146)。在其他實施例中，該切割位點包含DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：88)或其片段。在特定的實施例中，該切割位點包含IEPRSFS(SEQ ID NO：194)。在其他實施例中，該切割位點包含EPRSFS(SEQ ID NO：195)，其中該切割位點不是FVIII的全長a2區。在又一些其他的實施例中，該切割位點包含IEPR(SEQ ID NO：200)。在又一些其他的實施例中，該切割位點包含IEPR(SEQ ID NO：200)，其中該切割位點不是FVIII的全長a2區，或者不包含FVIII的全長a2區。在其他實施例中，該切割位點包含DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：88)、KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：139)、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：140)、TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：141)、GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：142)、DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：143)、YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：144)、YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：176)、EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：177)、DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：178)、SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：179)、YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：180)、EDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：181)、DISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：182)、ISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：183)、SAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：184)、AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO：185)、YLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：186)、LLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：187)、LSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：188)、SKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：189)、KNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：190)、NNAIEPRSFS(SEQ ID NO：191)、NAIEPRSFS(SEQ ID NO：192)、AIEPRSFS(SEQ ID NO：193)、或IEPRSFS(SEQ ID NO：194)。在其他實施例中，該切割位點包含DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：88)、KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：139)、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：140)、TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：141)、GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：142)、DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：143)、YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：144)、YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：176)、EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：177)、DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：178)、SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：179)、YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：180)、EDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：181)、DISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：182)、ISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：183)、SAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：184)、AYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：185)、YLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：186)、LLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：187)、LSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：188)、SKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：189)、KNNAIEPRSFS(SEQ ID NO：190)、NNAIEPRSFS(SEQ ID NO：191)、NAIEPRSFS(SEQ ID NO：192)、AIEPRSFS(SEQ ID NO：193)、或IEPRSFS(SEQ ID NO：194)，其中該切割位點不是全長FVIII a2區。在某些實施例中，該可切割連接子在凝血酶切割測定中是可切割的，如本文所提供的或如本領域已知的。

在特定的實施例中，本公開的嵌合多肽包含：(i)FVIII蛋白，其包含FVIII多肽、第一XTEN序列、和第一Fc區；和(ii)VWF片段，其包含VWF的D' 域和VWF的D3域、第二XTEN序列、FVIII的a2連接子、和第二Fc區；其中：

(a)該FVIII蛋白具有對應於成熟FVIII的胺基酸746至1648的缺失；

(b)該第一XTEN序列被插入在的FVIII多肽內，其緊鄰對應於成熟FVIII的胺基酸745的下游；

(c)該第一XTEN序列包含與AE288(SEQ ID NO：8)的胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列同一性的胺基酸序列；

(d)該第一Fc區融合至該FVIII多肽的C端；

(e)該第二XTEN序列融合至該VWF片段的C端；

(f)該第二XTEN序列包含與AE144_5A(SEQ ID NO：58)的胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列同一性的胺基酸序列；

(g)該a2連接子融合至與該XTEN的C端；

(h)該a2連接子包含與SEQ ID NO：88的胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列同一性的胺基酸序列；

(i)該第二Fc區融合至該a2連接子的C端；且

(j)該第一Fc區通過雙硫鍵與該第二Fc區共價連接。

在特定的實施例中，本公開的嵌合多肽包含兩條多肽序列，第一多肽序列和第二多肽序列，該第一多肽序列包含與選自下列群組的序列至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列：FVIII-161(SEQ ID NO：69)、FVIII-169(SEQ ID NO：70)、FVIII-170(SEQ ID NO：71)、FVIII-173(SEQ ID NO：72)；FVIII-195(SEQ ID NO：73)；FVIII-196(SEQ ID NO：74)、FVIII199(SEQ ID NO：75)、FVIII-201(SEQ ID NO：76)；FVIII-203(SEQ ID NO：77)、FVIII-204(SEQ ID NO：78)、FVIII-205(SEQ ID NO：79)、FVIII-266(SEQ ID NO：80)、FVIII-267(SEQ ID NO：81)、FVIII-268(SEQ ID NO：82)、FVIII-269(SEQ ID NO：83)、FVIII-271(SEQ ID NO：84)或FVIII-272(SEQ ID NO：85)，該第二多肽序列包含與選自下列群組的序列至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列VWF031(SEQ ID NO：86)、VWF034(SEQ ID NO：87)、或VWF-036。

在一些實施例中，本公開的嵌合多肽包含兩條多肽序列，第一多肽序列和第二多肽序列，該第一多肽序列包含與SEQ ID NO：201所示的胺基酸序列至少為約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列；該第二多肽序列包含VWF片段以及Fc區，該VWF片段包含VWF的D'域和VWF的D3域。在一些實施例中，本公開的嵌合多肽包含兩條多肽序列，第一多肽序列和第二多肽序列，該第一多肽序列包含FVIII多肽和Fc區；該第二多肽序列包含與SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列至少為約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列。在某些實施例中，本公開的嵌合多肽包含兩條多肽序列，第一多肽序列和第二多肽序列，該第一多肽序列包含與SEQ ID NO：201所示的胺基酸序列至少為約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列，該第二多肽序列包含與SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列至少為約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列。在特定的實施例中，本公開的嵌合多肽包含兩條多肽序列，第一多肽序列和第二多肽序列，該第一多肽序列包含SEQ ID NO：201所示的胺基酸序列，該第二多肽序列包含SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列。在其他特定的實施例中，本公開的嵌合多肽包含兩條多肽序列，第一多肽和第二多肽序列，該第一多肽序列包含SEQ ID NO：201所示的胺基酸序列，該第二多肽序列包含SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列，其中該第一多肽序列和該第二多肽序列通過雙硫鍵彼此連接。

IV.醫藥組合物

含有本公開的嵌合多肽的組合物可含有適合的醫藥上可接受的載劑。例如，它們可含有賦形劑和/或輔料，其有助於有助於將活性化合物加工成經設計用於遞送至作用部位的製劑。

該醫藥組合物可經配製用於通過推注注射的非經胃腸型之施用(即靜脈內、皮下、或肌肉內)。用於注射的配製劑，例如在含有添加的防腐劑的安 瓿或多劑量容器中，可以單位劑量形式呈現。該組合物可以採取諸如懸浮液、溶液、或油性或水性媒劑中的乳液的形式，並含有配方劑諸如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以是粉末形式，用於與適合的媒劑(例如無熱原的水)組成。

用於非經胃腸型式施用的適當配製劑，還包括水溶性形式的活性化合物水溶液，例如水溶性鹽。此外，可以施用活性化合物的懸浮液作為適合的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(例如，芝麻油)、或合成性脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質，其例如包括羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。視情況地，懸浮液還可含有穩定劑。脂質體也可用於包封本發明的分子以遞送到細胞或間質空間中。示例性的醫藥上可接受載劑是生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲透和延遲吸收劑、水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些實施例中，該組合物包含等滲劑，例如，糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。在其他實施例中，該組合物包含醫藥上可接受的物質諸如潤濕劑或微量輔助物質諸如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其可增強活性成分的貯存期限或有效性。

本公開的組合物可以是多種形式的，例如包括液體(例如，可注射和可輸注的溶液)、分散體、懸浮液、半固體和固體劑型。優選的形式係取決於施用的模式和治療應用。

該組合物可配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或其他適用於高藥物濃度的有序結構。無菌可注射溶液可通過將所需量的活性成分併入具有一種以上所列舉的成分或以上列舉成分的組合之適當溶劑中來製備，根據需要，隨後係進行無菌過濾。通常，分散體可通過將活性成分併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有基礎分散介質和來自以上列舉成分中的其他所需成分。至於用來製備無菌可注射溶液的無菌粉末，較佳的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，其係從先前已經無菌過濾的溶液中產生活性成分的粉末和任何另外所期望的成分。維持溶液的適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂等包衣形式(coating)、藉 由保持所需的粒子大小(在分散的情況下)，和藉由使用表面活性劑。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中納入延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現。

活性成分可用控釋型的配製劑或裝置來配製。此類配製劑和裝置的實例包括植入物、經皮貼劑、和微囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。用於製備此類配製劑和裝置的方法是本領域中已知的。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

可注射貯庫配製劑(injectable depot formulations)可通過在生物可降解的聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成藥物的微膠囊化基質來製造。根據藥物與聚合物的比率，以及所採用的聚合物性質，可控制藥物釋放的速率。其他示例性的可生物降解的聚合物為聚原酸酯和聚酸酐。貯庫可注射的配製劑還可通過在脂質體或微乳液中捕獲藥物來製備。

補充性活性化合物可被併至組合物中。在一些實施例中，本公開的嵌合多肽係與另一凝血因子或其變異體、片段、類似物或衍生物一起配製。例如，凝血因子包括，但不限於，因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、馮威里氏因子或重組可溶性組織因子(rsTF)或任何前述因子的激活形式。止血劑的凝血因子也可包括抗纖維蛋白溶解藥物，例如，ε-胺基-己酸、胺甲環酸。

劑量方案可經調節以提供最佳的期望反應。例如，可施用單次推注，可隨時間施用若干分劑量，或可按比例減少或增加劑量，如通過治療情況的緊急狀態所指示的。以劑量單位形式所配製的非經胃腸組合物，係對於易施用性和劑量均勻性而言是有利的。參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.1980)。

除了活性化合物外，液體劑型可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、 油類、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯。

適合的藥物載劑的非限制性實例還描述於E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑的一些實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。組合物還可含有pH緩衝劑和潤濕劑或乳化劑。

在一些實施例中，醫藥組合物係包含嵌合多肽和醫藥上可接受的載劑。相較於野生型FVIII蛋白或對應的無VWF片段的FVIII蛋白，嵌合多肽中的FVIII蛋白係具有延長的半衰期。在一些實施例中，其中嵌合多肽的半衰期比野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、或至少約12倍。在其他實施例中，因子VIII的半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時、或至少約108小時。在一些實施例中，相較於野生型FVIII，嵌合多肽的半衰期係延長約3倍。

在一些實施例中，該組合物通過非經胃腸的施用來施用，非經胃腸的施用可以是靜脈內或皮下施用。

在其他實施例中，該組合物可用於治療有需要的個體其出血疾病或病況。該出血疾病或病況係選自下列群組：出血凝固障礙、關節出血、肌肉出血、口腔出血、溢血(hemorrhage)、溢血至肌肉中、口腔溢血、創傷、頭部創傷(trauma capitis)、胃腸出血、顱內溢血、腹腔內溢血、胸腔內溢血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後間隙中出血、髂腰肌鞘中出血及其任何組合。在又一些其他的實施例中，個體被安排進行手術。在又一些其他的實施例中，治療是預防性的或按需的。

現已詳細描述了本公開，通過參考下列實例將會更清楚地理解本發明，包括在此的這些實例僅出於說明的目的，而不旨在限制本公開。本文提及的所有專利、出版物和文章係明確且具體地通過提述併入本文。

實例 實例1：FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體的第一個人體研究

基於因子的替代性療法是血友病護理的基石。傳統的重組FVIII(rFVIII)產品具有短的半衰期，需要頻繁施用。藉由rFVIIIFc(Eloctate^® )已帶給患者護理的顯著進步，包括針對A型血友病的最長給藥間隔；在急性、手術期間(perioperative)和緊急情況中充分的出血控制(包括預防性控制)；防止出血無法控制，包括關節保護和改善生活質量；和長期一致和良好表徵的安全性概況。然而，每週或更長的因子VIII預防性給藥仍然未滿足大多數具有A型血友病的人們的需求。

本研究探究了rFVIIIFc-VWF-XTEN的安全性和藥物代謝動力學(PK)，該rFVIIIFc-VWF-XTEN是一種嵌合多肽，其包含(i)FVIII多肽，在FVIII多肽的B域內所插入的XTEN，和第一Fc區；和(ii)VWF片段、第二XTEN序列、a2連接子、和第二Fc區(圖1)。

研究設計

本研究的目標是評定單劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN相較於rFVIII的安全性、耐受性和FVIII活性(PK)。患者群包括具有重度A型血友病(<1IU/dL[<1%]內源性FVIII活性水平)且先前經治療的成人男性，其至少150天暴露於FVIII產品，且沒有陽性抑制因子測試史，或對FVIII施用的反應降低的臨床徵兆。主要終點是實驗室測試中的不良事件和臨床異常，包括抑制因子的發展。關鍵的次要終點包括藥物代謝動力學參數，包括但不限於消除半衰期(t1/2)、清除(CL)、從0至無窮大的曲線下面積(AUC_0-∞ )、平均停留時間(MRT)、和增量恢復(IR)。

患者分為低劑量隊列(7名患者；圖2A)或高劑量隊列(9名患者；圖2B)。 每名患者給藥rFVIII(ADVATE^® )，隨後為PK取樣期。簡短的洗脫期(對於低劑量隊列(圖2A)為

3天，對於高劑量隊列為

4天(圖2B))後，每位個體接著被施用rFVIIIFc-VWF-XTEN，隨後為PK取樣期。個體在注射rFVIIIFc-VWF-XTEN後，係進行28天的安全性觀察，包括在注射rFVIIIFc-VWF-XTEN後14天和28天時，收集用於抑制因子評定的樣品。在低劑量隊列中的患者，係接受25IU/kg的rFVIII和25IU/kg的rFVIIIFc-VWF-XTEN。在高劑量隊列中的患者係接受65IU/kg的rFVIII和65IU/kg的rFVIIIFc-VWF-XTEN。

方法

藥物代謝動力學參數係藉由經修改的活化部分凝血活酶時間(aPTT)凝血測定(「一站」測定)來量測。簡單來說，FVIII活性在經修改的aPTT測定中，使用Dade® Actin® FSL激活的PTT試劑(Siemens Health Care Diagnostics)，在BCS® XP分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics)上來量測。使用rFVIIIFc-VWF-XTEN特異性校準物來製備7點校準曲線(高：1.500-0.050IU/mL；低：0.150-0.0025IU/mL)。對於高校準曲線，係將rFVIIIFc-VWF-XTEN校準物[1.000IU/mL]稀釋到Tris/BSA緩衝液(50mM，150mM氯化鈉，pH 7.4+/-0.2，含有1% BSA)中。此稀釋係通過BCS® XP分析儀進行，以生成預先選擇的校準FVIII活性水平。然後以1：2、在Tris/BSA緩衝液中製備的工作稀釋液測試這些樣品。對於低校準曲線，rFVIIIFc-VWF-XTEN校準物[1.000IU/mL]在免疫缺失的FVIII缺陷血漿(Siemens Healthcare Diagnostics)中通過BCS® XP分析儀來進行稀釋，並進行純淨背景測試(在缺少工作稀釋液的情況下)。校準係進行二重複。通過以IU/mL表示的FVIII活性(x軸)和以秒表示的凝血時間(y軸)來繪製曲線。高和低校準曲線二者均使用線性對數-線性(log-lin)回歸曲線來擬合。

使用高校準曲線metatest(在Tris/BSA中1：2、1：4、和1：8的工作稀釋液)或低校準曲線metatest(在免疫缺失的FVIII缺陷血漿中零稀釋、1：2、和1：4的工作稀釋液)以二重複來測試樣品。在適當的工作稀釋後，所有校準物、患者樣品和質量控制樣品係與免疫缺失的FVIII缺陷血漿1：1混合，該血漿含有少於或等於0.010IU/mL FVIII活性和至少0.400IU/mL的其他凝血因子。在樣品與此血漿混 合後，添加APTT試劑，且孵育混合物。孵育後，添加氯化鈣，並以光學方式來量測凝塊形成的時間。然後，以一演算法來檢查單個工作稀釋結果是否落在平均值的+/-15.0%之內，以決定所報告的FVIII活性。除接近定量下限(LLOQ)外，兩個metatest的工作稀釋結果的最小值對於決定所報告的FVIII活性來說是必需的。

結果：低劑量隊列

個體低劑量隊列係收集7名個體；1名個體在接受rFVIIIFc-VWF-XTEN之前，因與研究不相關的原因退出。6名個體接受單次、低劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN(25IU/kg)。在低劑量隊列中經治療的前4名個體的特徵包括：具有重度A型血友病(<1IU/dL[<1%]的內源性FVIII活性水平)且先前經治療的成人男性個體；所有個體均是高加索人種；個體的年齡範圍為19-60歲，平均年齡為33；且平均體重為85kg(其範圍為67.2-100.6kg)。

在所有患者中，rFVIIIFc-VWF-XTEN普遍是耐受良好，且在給藥後第14天或第28天未觀察到抑制因子。

接受單次低劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN(25IU/kg)的前6名個體，在5天時其輸注後平均FVIII活性為約12.0%，且在7天時為約5.3%(圖3A)。平均FVIII活性在10天內係保持在1%以上(圖3A)。藉由活化部分凝血活酶時間(aPTT)量測法所量測的，rFVIIIFc-VWF-XTEN(25IU/kg)和rFVIII(25IU/kg)的藥物代謝動力學參數係示於表9 中。觀察到rFVIIIFc-VWF-XTEN在個體人類個體中係具有約37.6小時的平均半衰期，其相較於在相同劑量下所施用的rFVIII平均半衰期(約9.12小時)係高4倍以上。

結果：高劑量隊列

個體高劑量隊列係收集9名個體。該等個體被施用單次、高劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN(65IU/kg)。1名個體因與研究不相關的原因不能測試PK參數。在高劑量隊列中經治療的個體的特徵包括：具有重度A型血友病(<1IU/dL[<1%]的內源性FVIII活性水平)且先前經治療的成人男性個體；9名個體中的7名為高加索人種；個體的年齡範圍為32-63歲，平均年齡為44；且平均體重為81.1kg(其範圍為61.5-100.7kg)。

8名經評估之接受單次高劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN(65IU/kg)的個體，在5天時的輸注後平均FVIII活性為約38.0%，且在7天時為約17%(圖3B)。平均FVIII活性在14天內保持在1%以上(圖3B)。藉由活化部分凝血活酶時間(aPTT)量測法所量測的，rFVIIIFc-VWF-XTEN(65IU/kg)和rFVIII(65IU/kg)的藥物代謝動力學參數係示於表10 中。觀察到rFVIIIFc-VWF-XTEN在個體人類個體中具有約42.5小時的平均半衰期，其相較於以相同劑量來施用的rFVIII其平均半衰期(約13小時)係高3倍以上。

結論：

rFVIIIFc-VWF-XTEN在所有患有重度A型血友病且經單次低劑量(25IU/kg)或單次高劑量(65IU/kg)治療的患者中耐受良好。無患者發展出針對FVIII的抑制因子。rFVIIIFc-VWF-XTEN顯示了其半衰期比rFVIII高3倍至4倍，這表明VWF施加的半衰期上限係有所突破。持續的高FVIII活性具有針對所有出血類型提供延長保護的潛力。

實例2：FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體的重複劑量研究

在接受單次劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN的個體中，rFVIIIFc-VWF-XTEN的耐受良好，並提供持續的FVIII水平。(實例1)。本研究將評估重複劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN其安全性和耐受性，並表徵重複劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN其藥物代謝動力學(圖1)。

研究設計

將總共4劑每週一次劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN施用至具有重度A型血友病的成人男性患者，該患者先前已經用FVIII治療進行治療，並接受至少150個暴露天數的此類FVIII治療。將其分為兩個隊列，每個隊列由約10名、年齡為18至65歲的成人男性所構成。隊列1中的每名個體將在第1天、第8天、第15天和第22天，接受總共4次、每週一次、劑量為50IU/kg的rFVIIIFc-VWF-XTEN。

臨床研究的設計示意圖如圖4所示。在第1天將取得給藥前的藥物代 謝動力學樣品。此外，在第1天和第22天給藥後，取得多個PK樣品，而在第8、15和22天給藥之前係出現低谷(168h)樣品。在最後一劑的rFVIIIFc-VWF-XTEN後，個體將經歷28天的安全性觀察期，包括在最後一劑rFVIIIFc-VWF-XTEN之後14和28天時評定其抑制因子。對於完成施打總共四個每週一劑的rFVIIIFc-VWF-XTEN之個體，安全性觀察期係結束於第50天(+3天)的研究結束(end-of-study，EOS)訪視。對於提早停止治療的個體，安全性觀察期將結束在最後一劑的rFVIIIFc-VWF-XTEN後28天的提前終止(early termination，ET)訪視。

該研究的首要目標是評定總共4劑每週一劑的靜脈內(IV)方式施加的rFVIIIFc-VWF-XTEN其安全性和耐受性。主要終點是實驗室測試中發生不良事件(AE)和臨床上的顯著異常，包括經由Nijmegen-modified Bethesda測試法所測定的抑制因子(針對FVIII的中和抗體)的產生。(Verbruggen等，Thrombosis and Haemostasis,73：247-251(1995))。

該研究的次要目標是在總共4劑每週一劑IV方式施加後，表徵rFVIIIFc-VWF-XTEN的藥物代謝動力學，其中FVIII活性係藉由一站式(one-stage)活化部分凝血活酶時間(aPTT)凝血測定來測定，如實例1所述的。次要終點是經由參數估計來評定的藥物代謝動力學，包括但不限於最大活性(Cmax)、半衰期(t½)、穩態時的總清除(CLss)、累積指數(AI)、從0至給藥間隔之活性時間曲線下面積(AUC0-tau)、穩態時的分佈容積(Vss)、平均停留時間(MRT)、IR、藥物在下一次施用前達到的最低(低谷)濃度(C_低谷 )、和FVIII活性高於基線1%的時間。

此研究的探究性目標是在總共4劑每週一劑IV方式施加後，表徵rFVIIIFc-VWF-XTEN的藥物代謝動力學，其中FVIII活性係藉由兩站式(two-stage)生色凝血測定法來測定。探究性終點為經由參數估計評定的PK，該參數包括但不限於Cmax、t½、CLss、AI、AUC0-tau、Vss、MRT、IR、C_低谷 、和FVIII活性高於基線1%的時間。

方法

FVIII活性係經修改的活化部分凝血活酶時間(aPTT)凝血測定法(「一 站式」測定法)來測定，如上文實例1中詳述的。

兩站式生色凝血測定法係使用BIOPHEN FVIII：C測定法(Hyphen Biomed 221402-RUO)，在BCS® XP分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics)上量測FVIII活性。簡單來說，在恆定數量的因子IXa的存在下，磷脂、鈣和凝血酶激活的FVIII：C係形成酶複合物。此酶複合物反過來激活因子X(FX)，其係以恆定濃度來供應，且超過因子Xa(FXa)。將FX活化為FXa係直接與FVIII：C的數量相關，FVIII：C在恆定且過量的因子IXa的存在下，係為測定中的限制因素。然後，使用特異性的生色性FXa受質(SXa-11(Hyphen Biomed))來量測所生成的FXa的活性。因子Xa係切割SXa-11，並釋放對硝基苯胺(pNA)。釋放出的pNA的數量係與生成的FXa量成正比。樣品中FVIII：C的量、所生成的FXa的量，和釋放出的pNA的量之間係存在直接關係。pNA的釋放係藉由在405nm波長處的顯色來測定。

使用rFVIIIFc-VWF-XTEN特異性校準物來做出8點校準曲線(高：1.500-0.150IU/mL；低：0.200-0.008IU/mL)。對於高校準曲線，1IU/mL的rFVIIIFc-VWF-XTEN係稀釋於Tris/BSA緩衝液中，以生成預先選擇的FVIII活性校準水平。此稀釋係通過BCS® XP分析儀來實施。預先選擇的FVIII活性校準水平係以在Tris/BSA緩衝液中為1：4的工作稀釋液來進行測試。對於低校準曲線，1IU/mL的rFVIIIFc-VWF-XTEN係在先天性FVIII缺陷的血漿(Helena Laboratories)中以1：4預先稀釋，然後通過BCS® XP分析儀在Tris/BSA緩衝液中進一步稀釋，以生成預先選擇的FVIII活性校準水平，其在反應裝置中係在沒有進一步稀釋的情況下進行測試。

校準係進行二重複。以FVIII活性(以IU/mL為單位，x軸)和以吸收度/分鐘(y軸)所表示的變化來繪製曲線。對於高校準曲線，係使用線性對數-對數(log-log)回歸曲線來擬合。對於低校準曲線，使用線性的線性-線性(lin-lin)回歸曲線來擬合。樣品之測試均係進行二重複，不論係於1：4工作稀釋下的高校準曲線中，抑或是在使用先天性FVIII缺陷血漿以1：4稀釋或零稀釋中(不具有工作稀釋)。

結果

人口統計和基線特徵

10名年齡為18至65歲的成人男性個體係分入隊列1(50IU/kg)，而5名年齡為18-65歲(俱連本數)的成人男性個體係分入隊列2(65IU/kg)。在50IU/kg給藥的隊列中，10名個體全數係接受4次劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN。分入65IU/kg給藥的隊列中之5名個體中，有3名係接受至少1個劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN。入選的所有15名個體均來自保加利亞索非亞(Sofia，Bulgaria)的單一地點。入選的15名個體中，有13名個體係接受至少1個劑量的BIVV001，且包括在人口統計和基線特徵的綜述(summary)中。所有個體均為男性。平均年齡為35歲(範圍：25至55歲)，且所有個體均為白種人。平均體重為86.7kg(範圍：51.0至130.9kg)，且平均身體質量指數為25.9kg/m² (範圍：16.4至40.9kg/m² )。

安全性分析

對於中期分析，總共有13名個體係被包括在安全性分析集(50IU/kg組中n=10，而65IU/kg組中n=3)中。所有安全性分析均係基於安全性分析集(Safety Analysis Set)來進行，並包括所有接受至少一個劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN的個體。

治療後出現的緊急不良反應事件(treatment-emergent AE，TEAE)係定義為在第一次rFVIIIFc-VWF-XTEN施用開始或之後以及在最後rFVIIIFc-VWF-XTEN施用後28天內的任何不良事件。缺少開始日期的AE被假定為治療後出現的緊急事件，除非停止日期在給藥日期之前。一般性的，係藉由隊列和整體的個體發病率來綜整AE，以及藉由隊列和個體在資料列表中來呈現AE。還可針對每名個體評估治療後出現的緊急重大不良反應事件(Treatment-emergent serious adverse events，TESAE)，但在經治療的個體中未觀察到任何TESAE(表11) 。

入選的15名個體中，13名個體係接受至少1個劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN，且被納入在安全性分析中。該13名個體中的8名被報導有19個TEAE(61.5%)(表11) 。無重大或相關TEAE被報導，且無個體由於TEAE而停止試驗。最常見的TEAE為關節痛、上呼吸道感染、頭痛和鼻炎(每個TEAE為 2/13名個體；15.4%)。未偵測到產生有針對FVIII的抑制因子，且無嚴重超敏反應(serious hypersensitivity)或過敏反應(anaphylaxis)的報導。在個體總結的每個水平，如果個體被報導有一個或多個事件，則對該個體計數一次。表11中所報導的百分比係基於在每個隊列和總體中接受至少1個劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN的個體人數。

免疫原性分析

在篩選時、第1天、第8天、第15天、第22天、第36天、和第50天(EOS或ET訪問)來評定所有個體其抑制因子的發生和抗rFVIIIFc-VWF-XTEN抗體。抑制因子的測試係使用Nijmegen改進的Bethesda測定法，藉由中央實驗室來進行。如果返回的Nijmegen修改Bethesda測定法其結果為

0.6BU/mL，則在2至4周內收集並測試另一獨立樣品，以確認抑制因子的發生。對於潛在性抗體形成的測試， 係在中央實驗室使用經驗證的rFVIIIFc-VWF-XTEN特異性抗藥物抗體(ADA)測定法來進行。經確認的陽性樣品係進一步表徵為對FVIII、D'D3或XTEN具有特異性的抗體。經測試為抑制因子發生陽性的個體其數目和百分比，以及經測試為抗rFVIIIFc-VWF-XTEN抗體陽性的個體其數目和百分比，係藉由使用安全性分析集的隊列來加以綜述。

無個體在rFVIIIFc-VWF-XTEN施用之後發生抗藥物抗體的陽性測定結果。

藥物代謝動力學分析和結果

一般來說，安全性和PK資料係使用對連續和分類資料的標準綜述統計法(standard summary statistics)來加以綜述。資料係通過隊列來加以綜述。連續變量係使用描述性統計來綜述，描述性統計包括非缺失值(n)、平均值、標准偏差(SD)、中位數、最小值和最大值的數字。藥物代謝動力學參數還使用幾何平均值和百分比變異係數(%CV)來加以綜述。分類變量係藉由計數和百分比來加以綜述。

所有PK分析係基於PK分析集(PK analysis set，PKAS)來進行，且包括9名來自50IU/kg給藥隊列的個體，該個體在rFVIIIFc-VWF-XTEN施用後，收集有足夠的血液樣品。

FVIII活性

為了表徵在總共4劑每週一劑以IV方式施加後的rFVIIIFc-VWF-XTEN其藥物代謝動力學，係在預定的時間點於每個個體中來測定FVIII活性。FVIII活性係藉由隊列、所排定的PK訪視和一站式(活化部分凝血活酶時間[aPTT])凝血測定和生色凝血測定的時間點來加以綜述。以兩種FVIII活性測試之FVIII活性對時間的圖，係以原始和對數尺度來繪製。以隊列、所排定的PK訪視和兩個FVIII活性測定的時間點，來列出每名個體個別之FVIII活性。根據一站式[aPTT]測定法的FVIII活性結果係描述於表12中。根據生色測定法的FVIII活性結果係描述於表13中。

簡言之，在第1天給藥後，在72小時處基於一站式和生色測定法的平 均FVIII活性，係分別為45.53%和29.37%，在120小時處分別為21.56%和13.49%，在168小時處分別為7.91%和5.97%。在第22天給藥後，在72小時處基於一站式和生色測定法的平均FVIII活性，係分別為46.28%和30.46%，在120小時處分別為22.30%和14.48%，在168小時處分別為9.83%和6.74%。通常對於所有患者、所有時間點和兩種測定法，在此中期分析中，50IU/kg QW的rFVIIIFc-VWF-XTEN的C_低谷 其範圍係介於7-10%之間。

PK參數

每個個體的個別PK參數估計值係被列出，並藉由隊列、所排定的PK訪視和兩種FVIII活性測定的時間點來進行描述性地綜述。

所有接受50IU/kg QW的rFVIIIFc-VWF-XTEN的個體，在此中期分析中的幾何平均消除半衰期(t_1/2 )，根據一站式測定法係為41.24小時(表16B) ，而根據生色測定法係為43.87小時(表17B) 。

在第1天給藥後，幾何平均最大FVIII活性(C_max )在一站式測定法中為113IU/dL(表14) ，且在生色測定法中為108IU/dL(表15) 。在第22天給藥後，穩態時的幾何平均FVIII活性(C_maxss )，根據一站式測定法為127IU/dL(表16A) ，且根據生色測定法為115IU/dL(表17A) 。

在第1天給藥後，幾何平均累積FVIII活性(AUC_0-tau )，根據一站式測定法為7650hr*IU/dL(表14) ，且根據生色測定法為5630hr*IU/dL(表15) 。在第22天給藥後，幾何平均AUC0_-tau ，根據一站式測定法為8270hr*IU/dL(表16A) ，且根據生色測定法為5880hr*IU/dL(表17A) 。

在第1天和第22天給藥的C_max 和AUC_0-tau 資料，係指出由累積指數(accumulation index，AI)所支持的最小累積為1.07(一站式測定法，表16B) 和1.08(生色測定法，表17B) 。對於表12至17中所呈現的所有PK參數資料，出於分析的目的，低於定量下限(BLQ)的值被處理為0。當需要計算PK參數時，由於未捕獲輸注結束時間，根據研究的操作和管理指南文件中的施用指導，將每名個體的輸注持續時間估算為8分鐘。

表15：第1天，基於生色測定法的基線校正之FVIII活性其藥物代謝動力學參數的綜述：PK分析集

結論

與在單劑量研究(實例1)中所觀察到的結果一致，每週給藥rFVIIIFc-VWF-XTEN一般來說是耐受良好的，且在最後一次施用rFVIIIFc-VWF-XTEN後的28天內，未偵測到抑制因子。劑量為50IU/kg的rFVIIIFc-VWF-XTEN在一站式和生色測定法的情況下，分別表現出平均消除半衰期(t_1/2 )為41.24和43.87小時。這些中期結果表明，在單劑量給藥rFVIIIFc-VWF-XTEN中所觀察到的增強的半衰期，在重複給藥QW的情況中得以維持，這強烈表明rFVIIIFc-VWF-XTEN的優點可以藉由讓A型血友病患者根據預防性FVIII給藥時間表接受治療來實現。

實例3：在具有重度A型血友病且先前經治療之患者中的rFVIIIFc-VWF-XTEN第3期試驗

本研究將評估50IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN(圖1)的安全性和耐受性，並表徵每週一次施用的50IU/kg rFVIIIFc-VWF-XTEN(圖1)其藥物代謝動力學。該研究的首要目標是，相較於rFVIIIFc-VWF-XTEN按需治療，評估rFVIIIFc-VWF-XTEN的預防性治療功效。該研究的次要目標是評估 rFVIIIFc-VWF-XTEN作為預防性治療，其對出血事件與rFVIIIFc-VWF-XTEN的消耗、關節健康、及以由患者報導結果(Patient-Reported Outcomes PRO)所量測的生活品質的作用，且評估按需治療的rFVIIIFc-VWF-XTEN。

此外，藥物代謝動力學(PK)目標是基於aPTT FVIII活性測定法來表徵所有個體其rFVIIIFc-VWF-XTEN預防情況在基線處的PK，並在三個月時對預定義的個體子集進行重複。另外的目標是評估rFVIIIFc-VWF-XTEN在接受手術的個體中的功效，並評估rFVIIIFc-VWF-XTEN的安全性和耐受性。進一步地，關節健康結構性結果將經由超音波法來評定，並評定治療對其它生活質量度量和對醫療保健資源利用的影響。

試驗設計

此試驗是樞紐型(pivotal)、第3期、非盲性(open-label)的多中心試驗，係針對年齡

12歲且具有重度A型血友病(定義為<1IU/dL[<1%]的內源性FVIII)的患者中研究靜脈內方式施加之rFVIIIFc-VWF-XTEN其安全性、功效和PK。目前接受按需用藥法的大約25名個體，將根據按需基礎以50IU/kgIV的劑量接受rFVIIIFc-VWF-XTEN，持續26周，然後根據預防性治療用藥法，以50IU/kg IV的劑量每週一次地接受rFVIIIFc-VWF-XTEN，持續26周。目前採用預防性治療用藥法的個體，將根據預防性治療用藥法以50IU/kg IV的劑量接受rFVIIIFc-VWF-XTEN，持續26周。

大約140名年齡

12歲的個體將會入選；在12周時，將對大約16名個體的子集重複PK的評定。

將篩選個體，並且在滿足入選標準後，以50IU/kg IV劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN進行兩種治療用藥法之一(即按需或預防)。所有個體將在洗脫期後(至少4至5天，取決於現在的療法)係經歷基線PK評定。個體將在整個研究期間經歷療效和安全性評定。這些安全性評定將包括測試潛在的抑制因子形成。除非個體入選非盲性延伸研究，否則將在最後一個劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN後的28天，進行後續(follow-up)安全性訪視或電話呼叫。

試驗結束(EOS)可能發生在滿足兩個標準時：(i)至少104名個體已經 達到50個暴露天數(ED)，且已經在第50個ED後完成確效的抑制因子測試；且(ii)至少25名個體完成了按需組(on-demand arm)試驗，包括26周的預防性治療期，或提早退出研究。此外，在試驗期間有接受手術之來自任何組(arm)的個體，將包括在手術子集中。至少5名個體中有最少十個主要手術係被針對以在手術環境中評定出血的控制和預防。

個體將在大約28天的篩選期內去到診所以確定適格性。除篩選訪視之外，個體將返回診所進行基線、第4周、第12周、第26周、第36周、第52周和EOS/ET的訪視。給藥期間將超過52周。進入預防性治療組的個體將接受52個每週一次劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN和治療出血事件所需的另外劑量。進入按需治療組的個體，將在26周之按需治療期間按需接受rFVIIIFc-VWF-XTEN，且在隨後的26周之預防性治療期間接受26個每週一次劑量的rFVIIIFc-VWF-XTEN和治療出血事件所需的另外劑量。整個試驗將評定安全性。除非個體入選非盲性延伸研究，否則將在最後一次給予rFVIIIFc-VWF-XTEN後的28天進行後續安全性訪視或電話呼叫。

該試驗的主要終點是個體進行rFVIIIFc-VWF-XTEN按需治療(26周)對比每週一次的預防性治療(26周)，個體內的年出血率(ABR)比較。

該研究的次要終點將包括(i)rFVIIIFc-VWF-XTEN所預防的ABR與歷史ABR(對於參與先前觀察研究的預防組個體)的個體內比較；(ii)出血事件的出現和消耗(總體ABR、按類型和位置計算的ABR，以及每個個體的年度rFVIIIFc-VWF-XTEN總消耗)；(iii)對治療的反應；(iv)療效指數(在第7天維持L3%低谷水平的個體百分比；(v)關節健康；和(vi)生活質量度量的變化(至少18歲的個體其haem-A-QoL和PROMIS-SF的生理功能；和小於18歲的個體其HAEMO-QoL和PROMISPediatric-SF的生理活動)。

對治療的反應將包括(i)解決出血事件所需的rFVIIIFc-VWF-XTEN的輸注數目和劑量；(ii)需要單次輸注才能解決的出血事件的百分比；(iii)基於4點反應量表所評定之個體對rFVIIIFc-VWF-XTEN治療個體出血事件的反應；(iv)研究者基於4點反應量表所全面評定個體對rFVIIIFc-VWF-XTEN治療的反應。

關節健康評估將包括(i)關節出血事件的ABR；(ii)根據國際血栓形成與止血學會(ISTH)標準，在52周時的目標關節變形(target joint resolution)；(iii)根據基於經由經修改的血友病關節健康評分(mHJHS)或HJHS)所評定的從基線到52周的絕對變化之功能性結果；(iv)由mHJHS或HJHS所評定的在52周時無關節惡化的個體的百分比。

另外的終點包括(i)最大(峰值)血漿藥物濃度(Cmax)、消除半衰期(t½)、累積指數(AI)、血漿濃度-時間曲線下面積(AUC)、穩態時的表觀分佈容積(Vss)、平均停留時間(MRT)、增量恢復(incremental recovery，IR)、低谷血漿濃度(C_低谷 )、和高於預定義的FVIII活性水平的時間；(ii)研究人員或外科醫生基於4點反應量表對個體對rFVIIIFc-VWF-XTEN治療的止血反應的評定，在手術期間維持止血所需的輸注數目和劑量，手術期間的總rFVIIIFc-VWF-XTEN消耗，手術期間的估計失血量，手術期間所需的血液成分的輸注數目和類型，以及手術期間的手術後出血事件；(iii)不良反應事件(AE)和重大不良事件(SAE)的出現，身體檢查、生命體徵和實驗室測試中的臨床顯著異常，以及抑制因子的發生(經由Nijmegen-經修改的Bethesda偵測法所測定之針對FVIII的中和抗體)；和(iv)藉由分組人群中的超音波成像的結構關節健康解剖學結果，其他QoL量測(EQ-5D-5L、PGIC)的變化(僅第52周)，PROMIS疼痛強度，PROMIS-SF疼痛干擾(個體

18歲)，PROMIS小兒-SF疼痛干擾(個體<18歲))，和HRU。

納入/排除標準

符合條件的候選人必須滿足下列合格標準：(1)知情同意時，年齡

12歲；(2)重度A型血友病，定義為<1IU/dL(<1%)內源性的FVIII，如藉由經過認證的臨床實驗室所記載者；(3)先前經任何重組和/或血漿衍生的FVIII治療(預防性或按需)，或至少150個ED的冷沉澱物之A型血友病；(4)目前採用市售FVIII產品的預防性治療用藥法，且在試驗入組前的12個月內有至少4次出血事件，或目前採用市售FVIII產品的按需治療用藥法，且在入組前12個月內有至少12次出血事件；和(5)篩選時血小板計數

100,000個細胞/μL(由中央實驗室進行測試，並在第1天給藥之前進行複查)。個體將出於以下原因被排除在外：(1)除A型血友病外的 其它任何凝血障礙；(2)與任何FVIII產品相關的超敏反應或過敏反應的病史；(3)陽性抑制因子測試史或對FVIII施用反應降低的臨床徵兆(抑制因子的家族史不會排除個體)；(4)篩選時所獲取的陽性抑制因子結果，定義為

0.6BU/mL；(5)腎功能異常，定義為篩選時所獲取的血清肌酸酐>2.0mg/dL；(6)篩選時所獲取的血清丙胺酸轉胺酶(ALT)或天門冬胺酸轉胺酶(AST)>5×正常值上限(ULN)；(7)篩選時所獲取的血清總膽紅素>3×ULN；(8)在篩選前12周內使用Fitusiran或艾美賽珠單抗(emicizumab)；(9)在篩選前12周內用單株抗體治療劑、除rFVIIIFc以外的Fc融合蛋白或IV免疫球蛋白進行治療；(10)在篩選前2周內用乙醯水楊酸(ASA)治療或用非固醇類消炎藥(NSAID)治療，其劑量等於或高於每種產品的區域處方信息中所規定的最大劑量；(11)在篩選前12周內用化療和/或其他免疫抑制藥物進行全身治療(除了C型肝炎病毒[HCV]或HIV的治療；允許使用皮質類固醇，但以20mg/天的潑尼松或其等效物每天或隔日給予全身性皮質類固醇治療持續>14天除外；允許使用局部、外用和/或吸入類固醇)；和(12)在篩選前8周內進行大手術(大手術定義為任何外科手術(選擇性或緊急手術)，其通常但不總是涉及全身麻醉和/或呼吸輔助，在大手術中主要體腔被穿透和暴露出來，或產生嚴重的身體或生理功能損害(例如，剖腹手術、胸廓切開術、開顱手術、關節置換術、或肢體截肢術))。

序列

VWF031核苷酸序列(SEQ ID NO：147)

VWF031蛋白質序列(SEQ ID NO：86)

VWF034核苷酸序列(SEQ ID NO：148)

VWF034蛋白質序列(SEQ ID NO：87)

VWF050核苷酸序列(IHH三突變體)(SEQ ID NO：149)

VWF050蛋白質序列(IHH三突變體)(SEQ ID NO：150)

VWF057核苷酸序列(SEQ ID NO：151)

VWF057蛋白質序列(SEQ ID NO：152)

VWF058核苷酸序列(具有IHH突變的VWF034)(SEQ ID NO：153)

VWF058蛋白質序列(具有IHH突變的VWF034)(SEQ ID NO：154)

FVIII 169核苷酸序列(SEQ ID NO：155)

FVIII 169蛋白質序列(SEQ ID NO：70)

FVIII 263核苷酸序列(IHH三突變體)(SEQ ID NO：156)

FVIII 263蛋白質序列(IHH三突變體)(SEQ ID NO：157)

FVIII 282核苷酸序列(SEQ ID NO：158)

FVIII 282蛋白質序列(SEQ ID NO：159)

FVIII 283核苷酸序列(具有IHH三突變體的FVIII 169)(SEQ ID NO：160)

FVIII 283蛋白質序列(具有IHH三突變的FVIII 169)(SEQ ID NO：161)

pSYNFVIII 010核苷酸序列-(雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：162)

pSYNFVIII 010蛋白質序列-(雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：163)

FVIII 195蛋白質序列(在胺基酸1656和1900處具有兩個144 AE XTEN的雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：73)

pSYN-FVIII-173成熟蛋白質序列(SEQ ID NO：72)：

FVIII 196蛋白質序列(在胺基酸26、1656和1900處具有三個144 AE XTEN的雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：74)

FVIII 199蛋白質序列(在胺基酸1656和1900處具有三個144 AE XTEN的單鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：75)

FVIII 201蛋白質序列(在胺基酸26、1656和1900處具有三個144 AE XTEN的單鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：76)

FVIII 203蛋白質序列(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個為B域中的288AE XTEN，一個為在胺基酸1900處的144 AE XTEN)(SEQ ID NO：77)

FVIII 204蛋白質序列(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個為B域中的288AE XTEN，且一個為在胺基酸403處的144 AE XTEN)(SEQ ID NO：78)

FVIII 205蛋白質序列(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個為B域中的288AE XTEN，且一個為在胺基酸18處的144 AE XTEN)(SEQ ID NO：79)

pSYN FVIII 266蛋白質序列(在胺基酸18處具有42 AE-XTEN且在B域中具有288 AE XTEN的FVIII Fc)SEQ ID NO：80)

pSYN FVIII 267蛋白質序列(在胺基酸18處具有72 AE-XTEN且在B域中具有288AE XTEN的FVIII Fc)SEQ ID NO：81)

pSYN FVIII 268蛋白質序列(在胺基酸18處具有144 AE-XTEN的FVIII Fc)SEQ ID NO：82)

pSYN FVIII 269蛋白質序列(在胺基酸18處具有72 AE-XTEN的FVIII Fc)SEQ ID NO：83)

pSYNFVIII271蛋白質序列(在胺基酸18處具有42 AE-XTEN的FVIII Fc)SEQ ID NO：84)

pSYN FVIII蛋白質序列272(在胺基酸18處具有144 AE XTEN且在B域中具有244 AE XTEN的FVIII-無Fc)SEQ ID NO：85)

pSYN-FVIII-161蛋白質序列(SEQ ID NO：69)(FVIII序列胺基酸位置1-1457：底線區表示Fc區域；彎曲底線表示第一Fc和VWF片段之間的可切割連接子；加雙底線區表示VWF片段；粗體區表示VWF片段和Fc之間的可切割連接子)。

pSYN-FVIII-170蛋白質序列(SEQ ID NO：71)

pSYN FVIII 310核苷酸序列(編碼FVIII，其具有除2個胺基酸殘基以外的完整B域缺失和在aa 742後插入有288 AE-XTEN)(SEQ ID NO：170)

pSYN FVIII 310蛋白質序列(FVIII，其具有除2個胺基酸以外的完整B域缺失和在aa 742後插入有288 AE-XTEN)(SEQ ID NO：171)

pSYN FVIII 312核苷酸序列(編碼FVIII，其具有除5個胺基酸殘基以外的完整B域缺失和在aa 745至B5版本後插入有288 AE-XTEN)(SEQ ID NO：172)

pSYN FVIII 312蛋白質序列(FVIII，其具有除5個胺基酸殘基以外的完整B域缺失和在aa 745至B5版本後插入有288 AE-XTEN)(SEQ ID NO：173)

pSYN VWF059核苷酸序列(編碼VWF D’D3-Fc，其在連接子中具有酸性區2(a2)凝血酶位點)(SEQ ID NO：196)

pSYN VWF059蛋白質序列(VWF D’D3-Fc，其在連接子中具有FVIII凝血酶位點的a2區)-粗體加底線區表示a2區(SEQ ID NO：197)

pSYN VWF062核苷酸序列(編碼VWF D’D3-Fc，其在連接子中不具有凝血酶位點)(SEQ ID NO：198)

pSYN VWF062蛋白質序列(VWF D’D3-Fc，其在連接子中不具有凝血酶位點)(SEQ ID NO：199)

pSYN VWF073核苷酸序列-(其編碼VWFD1D2D’D3-144 AE XTEN-FVIII經截切的a2凝血酶位點-Fc)(SEQ ID NO：174)

pSYN VWF073蛋白質序列-(VWFD1D2D’D3-144 AE XTEN-經截切的a2凝血酶位點-Fc)(SEQ ID NO：175)

表19. 另外的嵌合多肽之序列

具體的實施例的前述描述將充分地揭示本公開的一般性質，使得其他人可通過應用本領域技術範圍內的知識，在不脫離本公開的一般概念的情況下，針對各種應用容易地修改和/或改編此類具體實施例，而無需過度實驗。因此，基於本文呈現的教導和指導，此類改編和修改旨在落入所公開實施例的等同物的含義和範圍內。應理解，本文中的詞組或術語是出於描述而非限制性目的，使得本說明書的術語或詞組將由本領域技術人員根據教導和指導來解釋。

考慮到本文公開的說明書和實踐，本公開的其他實施例對於本領域技術人員而言是顯而易見的。說明書和實例旨在僅被視為示例性的，本公開的真實範圍和精神由所附申請專利範圍指示。

本文引用的所有專利和出版物均通過提述以其整體併入本文。

<110> 美商百歐維拉提夫治療公司(Bioverativ Therapeutics Inc.)

<120> 治療A型血友病的方法

<130> 609832：SA9-461-4

<160> 218

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 1

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 312A

<400> 2

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 7

<210> 8

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE288

<400> 8

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE42

<400> 9

<210> 10

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE72

<400> 10

<210> 11

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE144

<400> 11

<210> 12

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF057

<400> 12

<210> 13

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF059

<400> 13

<210> 14

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG144

<400> 14

<210> 15

<211> 864

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE864

<400> 15

<210> 16

<211> 576

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE576

<400> 16

<210> 17

<211> 864

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG864

<400> 17

<210> 18

<211> 576

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG576

<400> 18

<210> 19

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG288

<400> 19

<210> 20

<211> 8442

<212> DNA

<213> 智人

<400> 20

<210> 21

<211> 2813

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (2016)..(2016)

<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸

<400> 21

<210> 22

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF059A

<400> 22

<210> 23

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF073

<400> 23

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AD

<400> 24

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AD

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AD

<400> 26

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AD

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AE,AM

<400> 28

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AE,AM,AQ

<400> 29

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AE,AM,AQ

<400> 30

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AE,AM,AQ

<400> 31

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AF,AM

<400> 32

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AF,AM

<400> 33

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AF,AM

<400> 34

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AF,AM

<400> 35

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AG,AM

<400> 36

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AG,AM

<400> 37

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AG,AM

<400> 38

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AG,AM

<400> 39

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AQ

<400> 40

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AQ

<400> 41

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AQ

<400> 42

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AQ

<400> 43

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AQ

<400> 44

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族AQ

<400> 45

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BC

<400> 46

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BC

<400> 47

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BC

<400> 48

<210> 49

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN家族基序BC

<400> 49

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BD

<400> 50

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BD

<400> 51

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BD

<400> 52

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN基序家族BD

<400> 53

<210> 54

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE288_2

<400> 54

<210> 55

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE144_2A

<400> 55

<210> 56

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE144_3B

<400> 56

<210> 57

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE144_4A

<400> 57

<210> 58

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE144_5A

<400> 58

<210> 59

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE144_6B

<400> 59

<210> 60

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG144_A

<400> 60

<210> 61

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG144_B

<400> 61

<210> 62

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AG144_C

<400> 62

<210> 63

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AG144_F

<400> 63

<210> 64

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII信號肽

<400> 64

<210> 65

<211> 2332

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 成熟因子VIII

<400> 65

<210> 66

<211> 7053

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全長FVIII

<400> 66

<210> 67

<211> 1438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BDD FVIII

<400> 67

<210> 68

<211> 1429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B域缺失的因子VIII的胺基酸序列(除5個胺基酸殘基外的B域缺失)

<400> 68

<210> 69

<211> 2754

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN-FVIII-161

<400> 69

<210> 70

<211> 1978

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 169

<400> 70

<210> 71

<211> 2242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN-FVIII-170

<400> 71

<210> 72

<211> 1959

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN-FVIII-173

<400> 72

<210> 73

<211> 1984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 195(在胺基酸1656和1900處具有兩個144 AE XTEN的雙鏈FVIIIFc)

<400> 73

<210> 74

<211> 2134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 196(在胺基酸26、1656和1900處具有三個144 AE XTEN的雙鏈FVIIIFc)

<400> 74

<210> 75

<211> 1984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 199(在胺基酸1656和1900處具有三個144 AE XTEN的單鏈FVIIIFc)

<400> 75

<210> 76

<211> 2134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 201(在胺基酸26,1656和1900處具有三個144 AE XTEN的單鏈FVIIIFc)

<400> 76

<210> 77

<211> 2128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 203(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個為B域中的288AE XTEN，一個為在胺基酸1900處的144 AE XTEN)

<400> 77

<210> 78

<211> 2128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 204(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個為B域中的288AE XTEN，且一個為在胺基酸403處的144 AE XTEN)

<400> 78

<210> 79

<211> 2128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 205(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個為B域中的288AE XTEN，且一個為在胺基酸18處的144 AE XTEN)

<400> 79

<210> 80

<211> 2020

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 266(FVIII Fc，其在胺基酸18處具有42 AE-XTEN且在B域中具有288 AE XTEN)

<400> 80

<210> 81

<211> 2056

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 267(FVIII Fc，其在胺基酸18處具有72 AE-XTEN且在B域中具有288 AE XTEN)

<400> 81

<210> 82

<211> 1834

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 268(FVIII Fc，其在胺基酸18處具有144 AE-XTEN)

<400> 82

<210> 83

<211> 1762

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 269(FVIII Fc，其在胺基酸18處具有72 AE-XTEN)

<400> 83

<210> 84

<211> 1726

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYNFVIII 271(FVIII Fc，其在胺基酸18處具有42 AE-XTEN)

<400> 84

<210> 85

<211> 1901

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 272(FVIII，其在胺基酸18處具有144 AE XTEN且在B域中具有244 AE XTEN-無Fc)

<400> 85

<210> 86

<211> 1515

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF031

<400> 86

<210> 87

<211> 1778

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF034

<400> 87

<210> 88

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 88

<210> 89

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ig恆定區部分

<400> 89

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ig恆定區部分

<400> 90

<210> 91

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ig恆定區部分

<400> 91

<210> 92

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ig恆定區部分

<400> 92

<210> 93

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ig恆定區部分

<400> 93

<210> 94

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子，其中該序列可重複1至20次

<400> 94

<210> 95

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子，其中該序列可重複1至100次或1至20次

<400> 95

<210> 96

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 96

<210> 97

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 97

<210> 98

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 98

<210> 99

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 99

<210> 100

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 100

<210> 101

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子，其中該序列可重複1至00次或1至20次

<400> 101

<210> 102

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位點

<400> 102

<210> 103

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位點

<400> 103

<210> 104

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位點

<400> 104

<210> 105

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 凝血酶可切割位點

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為脂肪族胺基酸

<400> 105

<210> 106

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 106

<210> 107

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 107

<210> 108

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 108

<210> 109

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 109

<210> 110

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 110

<210> 111

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 111

<210> 112

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 112

<210> 113

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 113

<210> 114

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 114

<210> 115

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 115

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 116

<210> 117

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 117

<210> 118

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 118

<210> 119

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 119

<210> 120

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAR1位點外相互作用基序

<400> 120

<210> 121

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXIa切割位點

<400> 121

<210> 122

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXIa切割位點

<400> 122

<210> 123

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXIIa切割位點

<400> 123

<210> 124

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 激肽釋放酶切割位點

<400> 124

<210> 125

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIIa切割位點

<400> 125

<210> 126

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FIXa切割位點

<400> 126

<210> 127

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXa切割位點

<400> 127

<210> 128

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FIIa(凝血酶)切割位點

<400> 128

<210> 129

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 彈性蛋白酶-2切割位點

<400> 129

<210> 130

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 顆粒酶-B切割

<400> 130

<210> 131

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-12切割位點

<400> 131

<210> 132

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-13切割位點

<400> 132

<210> 133

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-17切割位點

<400> 133

<210> 134

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP-20切割位點

<400> 134

<210> 135

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TEV切割位點

<400> 135

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 腸激酶切割位點

<400> 136

<210> 137

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶3C(PRESCISSION)切割位點

<400> 137

<210> 138

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 分選酶A切割位點

<400> 138

<210> 139

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 139

<210> 140

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 140

<210> 141

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 141

<210> 142

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 142

<210> 143

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 143

<210> 144

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 144

<210> 145

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 凝血酶切割位點

<400> 145

<210> 146

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 146

<210> 147

<211> 4548

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF031

<400> 147

<210> 148

<211> 5379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF034

<400> 148

<210> 149

<211> 4548

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF050(IHH三突變體)

<400> 149

<210> 150

<211> 1515

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF050(IHH三突變體)

<400> 150

<210> 151

<211> 4959

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF057

<400> 151

<210> 152

<211> 1652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF057

<400> 152

<210> 153

<211> 5379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF058(具有IHH突變的VWF034)

<400> 153

<210> 154

<211> 1792

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF058(具有IHH突變的VWF034)

<400> 154

<210> 155

<211> 5937

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 169

<400> 155

<210> 156

<211> 6387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 263(IHH三突變體)

<400> 156

<210> 157

<211> 2128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 263(IHH三突變體)

<400> 157

<210> 158

<211> 5505

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 282

<400> 158

<210> 159

<211> 1834

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 282

<400> 159

<210> 160

<211> 5937

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 283(具有IHH三突變的FVIII 169)

<400> 160

<210> 161

<211> 1978

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 283(具有IHH三突變的FVIII 169)

<400> 161

<210> 162

<211> 5055

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYNFVIII 010(雙鏈FVIIIFc)

<400> 162

<210> 163

<211> 1684

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYNFVIII 010(雙鏈FVIIIFc)

<400> 163

<210> 164

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子，其中該序列可重複1至10次

<400> 164

<210> 165

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 165

<210> 166

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 166

<210> 167

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 169

<400> 167

<210> 168

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 310

<400> 168

<210> 169

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 312

<400> 169

<210> 170

<211> 5892

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 310(編碼FVIII，其具有除2個胺基酸殘基之外的完整B域缺失和在aa 742後插入有288 AE-XTEN)

<400> 170

<210> 171

<211> 1944

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 310(FVIII，其具有除2個胺基酸以外的完整B域缺失和在aa 742後插入有288 AE-XTEN)

<400> 171

<210> 172

<211> 5900

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 312(編碼FVIII，其具有除5個胺基酸殘基之外的完全B域缺失和在aa 745-B5版本後插入有288 AE-XTEN)

<400> 172

<210> 173

<211> 1947

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN FVIII 312(FVIII，其具有除5個胺基酸殘基之外的完全B域缺失和在aa 745至FVIII B5版本後插入有288 AE-XTEN)

<400> 173

<210> 174

<211> 4977

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF073(VWFD1D2D'D3-144 AE XTEN-FVIII經截切的a2凝血酶位點-Fc)

<400> 174

<210> 175

<211> 1658

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF073(VWFD1D2D'D3-144 AE XTEN-經截切的a2凝血酶位點-Fc)

<400> 175

<210> 176

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 176

<210> 177

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 177

<210> 178

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 178

<210> 179

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 179

<210> 180

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 180

<210> 181

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 181

<210> 182

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 182

<210> 183

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 183

<210> 184

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 184

<210> 185

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 185

<210> 186

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 186

<210> 187

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 187

<210> 188

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 188

<210> 189

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 189

<210> 190

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 190

<210> 191

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 191

<210> 192

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 192

<210> 193

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 193

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 194

<210> 195

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 195

<210> 196

<211> 4959

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF059(在連接子中具有酸性區2(a2)凝血酶位點的VWF D'D3-Fc)

<400> 196

<210> 197

<211> 1652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF059(在連接子中具有LVPR凝血酶位點的VWF D'D3-Fc)

<400> 197

<210> 198

<211> 4860

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF062(在連接子中不具有凝血酶位點的VWF D'D3-Fc)

<400> 198

<210> 199

<211> 1619

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pSYN VWF062(在連接子中不具有凝血酶位點的VWF D'D3-Fc)

<400> 199

<210> 200

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可切割連接子

<400> 200

<210> 201

<211> 1945

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII(XTEN)-Fc

<400> 201

<210> 202

<211> 883

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF(D'D3)-XTEN-a2連接子-Fc

<400> 202

<210> 203

<211> 1965

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 312A的最終胺基酸序列

<400> 203

<210> 204

<211> 5898

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 312A的最終胺基酸序列(SEQ ID NO：204)

<400> 204

<210> 205

<211> 1646

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF059A多肽的最終胺基酸序列

<400> 205

<210> 206

<211> 4941

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF059A的最終胺基酸序列

<400> 206

<210> 207

<211> 1946

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII(XTEN)-Fc w先導A

<400> 207

<210> 208

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人

<400> 208

<210> 209

<211> 741

<212> PRT

<213> 智人

<400> 209

<210> 210

<211> 103

<212> PRT

<213> 智人

<400> 210

<210> 211

<211> 374

<212> PRT

<213> 智人

<400> 211

<210> 212

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 212

<210> 213

<211> 1334

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (537)..(537)

<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸

<400> 213

<210> 214

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VWF D3區EAE

<400> 214

<210> 215

<211> 745

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII的1至745

<400> 215

<210> 216

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FVIII 1649-2332

<400> 216

<210> 217

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc區

<400> 217

<210> 218

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> XTEN AE288-3

<400> 218

Claims (89)

1. 一種治療有需要的人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向該個體施用多劑量的嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i)因子VIII(FVIII)多肽和(ii)包含VWF的D'域和VWF的D3域的馮威里氏因子(von Willebrand factor，VWF)片段，

   其中該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。
2. 如請求項1的方法，其中該FVIII多肽通過共價鍵與該VWF片段締合。
3. 如請求項1或2的方法，其中該共價鍵是肽鍵或雙硫鍵。
4. 如請求項1至3中任一項的方法，其中該FVIII多肽包含第一延長半衰期的部分。
5. 如請求項4的方法，其中該第一延長半衰期的部分與該FVIII多肽的C端或N端融合。
6. 如請求項4的方法，其中該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽內。
7. 如請求項5或6的方法，其中該第一延長半衰期的部分被插入在該FVIII多肽的B域內。
8. 如請求項7的方法，其中該第一延長半衰期的部分被插入在FVIII多肽內，緊鄰對應於SEQ ID NO：65的胺基酸殘基745的胺基酸的下游。
9. 如請求項4至8中任一項的方法，其中該第一延長半衰期的部分通過連接子與該FVIII多肽融合。
10. 如請求項4至9中任一項的方法，其中該VWF片段包含第二延長半衰期的部分。
11. 如請求項10的方法，其中該第二延長半衰期的部分與該VWF片段的C端或N端融合。
12. 如請求項10的方法，其中該第二延長半衰期的部分被插入在該VWF片段內。
13. 如請求項10或11的方法，其中該第二延長半衰期的部分與該VWF片段的C端融合。
14. 如請求項10至13中任一項的方法，其中該第二延長半衰期的部分通過連接子與該VWF片段融合。
15. 如請求項4至14中任一項的方法，其中該第一延長半衰期的部分、該第二延長半衰期的部分、或二者，係選自下列群組：白蛋白、免疫球蛋白Fc區、XTEN序列、人絨毛膜促性腺激素的β次單元的C端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、或其任何片段、衍生物、變異體、和任何組合。
16. 如請求項4至15中任一項的方法，其中該第一延長半衰期的部分包含第一XTEN。
17. 如請求項16的方法，其中該第一XTEN被插入在該FVIII多肽內，緊鄰對應於SEQ ID NO：65的胺基酸殘基745的胺基酸的下游。
18. 如請求項10至17中任一項的方法，其中該第二延長半衰期的部分包含第二XTEN。
19. 如請求項18的方法，其中該第二XTEN與該VWF片段的C端融合。
20. 如請求項1至19中任一項的方法，其中該FVIII多肽包含第一免疫球蛋白(Ig)恆定區或其部分。
21. 如請求項20的方法，其中該第一Ig恆定區或其部分與該FVIII多肽的C端或N端融合。
22. 如請求項20的方法，其中該第一Ig恆定區或其部分被插入至該FVIII多肽內。
23. 如請求項20或21的方法，其中該第一Ig恆定區或其部分與該FVIII多肽的C端融合。
24. 如請求項20至23中任一項的方法，其中該第一Ig恆定區或其部分通過連接子與該FVIII多肽融合。
25. 如請求項20至24中任一項的方法，其中該第一Ig恆定區或其部分包含第一Fc域或其部分。
26. 如請求項1至25中任一項的方法，其中該VWF片段包含第二Ig恆定區或其部分。
27. 如請求項26的方法，其中該第二Ig恆定區或其部分與該VWF片段的C端或N端融合。
28. 如請求項26的方法，其中該第二Ig恆定區或其部分被插入在該VWF片段內。
29. 如請求項26或27的方法，其中該第二Ig恆定區或其部分與該VWF片段的C端融合。
30. 如請求項26至29中任一項的方法，其中該第二Ig恆定區或其部分通過連接子與該VWF片段融合。
31. 如請求項30的方法，其中該連接子是可切割的連接子。
32. 如請求項26至31中任一項的方法，其中該第二Ig恆定區或其部分包含第二Fc域或其部分。
33. 如請求項32的方法，其中該FVIII蛋白和該VWF片段通過該第一Fc域和該第二Fc域之間的共價鍵彼此締合。
34. 如請求項33的方法，其中該FVIII蛋白和該VWF片段進一步通過該FVIII蛋白和該VWF片段之間的非共價相互作用彼此締合。
35. 一種治療人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向有需要的該個體施用多劑量的嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含：

    (i)FVIII蛋白，其包含：

    (a)第一FVIII多肽片段，其包含SEQ ID NO：215的胺基酸序列；

    (b)第一XTEN序列，其包含SEQ ID NO：8(AE288)的胺基酸序列；

    (c)第二FVIII多肽片段，其包含SEQ ID NO：216的胺基酸序列；和

    (d)第一Fc區，其包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列；

    (ii)VWF蛋白，其包含：

    (a)VWF的D’域，其包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列；

    (b)VWF的D3域，其包含SEQ ID NO：214的胺基酸序列；

    (c)第二XTEN序列，其包含SEQ ID NO：58(AE144_5A)的胺基酸序列；

    (d)a2連接子，其包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列；和

    (e)第二Fc區，其包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列；

    其中該第一Fc區通過雙硫鍵與該第二Fc區共價連接。
36. 如請求項35的方法，其中該FVIII蛋白進一步包含FVIII信號肽，該FVIII信號肽包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列。
37. 如請求項35的方法，其中該VWF蛋白進一步包含VWF信號肽，該VWF信號肽包含SEQ ID NO：208的胺基酸序列。
38. 如請求項35的方法，其中該VWF蛋白進一步包含VWF的D1D2域，該D1D2域包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列。
39. 一種治療人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向有需要的該個體施用多劑量的嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含：

    (i)FVIII蛋白，其包含與SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：203、或SEQ ID NO：207至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列；和

    (ii)VWF蛋白，其包含與SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：202、或SEQ ID NO：205至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列。
40. 一種治療人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向有需要的該個體施用多劑量的嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含：

    (i)FVIII蛋白，其包含SEQ ID NO：203的胺基酸序列；和

    (ii)VWF蛋白，其包含SEQ ID NO：205的胺基酸序列。
41. 一種治療人類個體的A型血友病的方法，該方法包括以給藥間隔向有需要的該個體施用多劑量的嵌合多肽，其中該嵌合多肽包含：

    (i)FVIII蛋白，其包含與選自以下的序列至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列：FVIII-161(SEQ ID NO：69)、FVIII-169(SEQ ID NO：70)、FVIII-170(SEQ ID NO：71)、FVIII-173(SEQ ID NO：72)；FVIII-195(SEQ ID NO：73)；FVIII-196(SEQ ID NO：74)、FVIII199(SEQ ID NO：75)、FVIII-201(SEQ ID NO：76)；FVIII-203(SEQ ID NO：77)、FVIII-204(SEQ ID NO：78)、FVIII-205(SEQ ID NO：79)、FVIII-266(SEQ ID NO：80)、FVIII-267(SEQ ID NO：81)、FVIII-268(SEQ ID NO：82)、FVIII-269(SEQ ID NO：83)、FVIII-271(SEQ ID NO：84)、FVIII-272(SEQ ID NO：85)、FVIII-312(SEQ ID NO：173)、或FVIII-312A(SEQ ID NO：203)；和

    (ii)VWF蛋白，其包含與選自以下的序列至少約80%、90%、95%、或100%相同的胺基酸序列：VWF031(SEQ ID NO：86)、VWF034(SEQ ID NO：87)、VWF059(SEQ ID NO：197)、VWF059A(SEQ ID NO：202)、或VWF036。
42. 如請求項39-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約15IU/kg至約100IU/kg，且該給藥間隔為至少約7天。
43. 如請求項39-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約50IU/kg或約65IU/kg，且該給藥間隔為至少約5天或約7天。
44. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量包含至少兩個劑量、至少三個劑量、至少四個劑量、至少五個劑量、至少六個劑量、至少七個劑量、至少八個劑量、至少九個劑量、至少十個劑量、至少十一個劑量、至少十二個劑量、至少十三個劑量、至少十四個劑量、至少十五個劑量、至少十六個劑量、至少十七個劑量、至少十八個劑量、至少十九個劑量、至少二十個劑量、或更多個。
45. 如請求項1-41中任一項的方法，其中A型血友病的治療包括控制或降低有需要的人類個體的出血事件的發生率或頻率。
46. 如請求項1-41中任一項的方法，其中A型血友病的治療包括預防或治療有需要的人類個體的出血事件。
47. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約95IU/kg、約20IU/kg至約90IU/kg、約20IU/kg至約85IU/kg、約20IU/kg至約80IU/kg、約20IU/kg至約75IU/kg、約20IU/kg至約70IU/kg、約20IU/kg至約65IU/kg、約20IU/kg至約60IU/kg，、約20IU/kg至約55IU/kg、約20IU/kg至約50IU/kg、約20IU/kg至約45IU/kg、約20IU/kg至約40IU/kg、約20IU/kg至約35IU/kg、約20IU/kg至約30IU/kg、或約20IU/kg至約25IU/kg。
48. 如請求項1-415中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約100IU/kg、約25IU/kg至約100IU/kg、約30IU/kg至約100IU/kg、約35IU/kg至約100IU/kg、約40IU/kg至約100IU/kg、約45IU/kg至約100IU/kg、約50IU/kg至約100IU/kg、約55IU/kg至約100IU/kg、約60IU/kg至約100IU/kg、約65IU/kg至約100IU/kg、約70IU/kg至約100IU/kg、約75IU/kg至約100IU/kg、約80IU/kg至約100IU/kg、約85IU/kg至約100IU/kg、或約90IU/kg至至約100IU/kg。
49. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約20IU/kg至約80IU/kg、約25IU/kg至約75IU/kg、約30IU/kg至約70IU/kg、約35IU/kg至約65IU/kg、約40IU/kg至約60IU/kg、或約45IU/kg至約55IU/kg。
50. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約25IU/kg至約65IU/kg。
51. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約20IU/kg、約25IU/kg、約30IU/kg、約35IU/kg、約40IU/kg、約45IU/kg、約50IU/kg、約55IU/kg、約60IU/kg、約65IU/kg、約70IU/kg、約75IU/kg、約80IU/kg、約85IU/kg、約90IU/kg、約95IU/kg、或約100IU/kg。
52. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約25IU/kg。
53. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約65IU/kg。
54. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約80IU/kg。
55. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天、至少約26天、至少約27天、至少約28天、至少約29天、至少約30天、或至少約31天。
56. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該劑量的頻率為至少每週一次、至少每2週一次、至少每3週一次、或至少每4週一次。
57. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該劑量的頻率為至少每週一次。
58. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該劑量的頻率為至少每兩週一次。
59. 如請求項1-41中任一項的方法，其中施用該嵌合多肽用於預防性治療。
60. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該嵌合多肽通過選自下列群組的途徑施用：靜脈內注射、靜脈內輸注、皮下施用、肌肉內施用、口服施用、鼻腔施用、和肺部施用。
61. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該嵌合多肽在該施用後導致FVIII血漿活性水平為至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%。
62. 如請求項61的方法，其中該FVIII血漿活性水平為至少約3%。
63. 如請求項61的方法，其中該FVIII血漿活性水平為至少約5%。
64. 如請求項1至41中任一項的方法，其中該嵌合多肽在該施用後導致FVIII血漿活性水平為至少約1IU/dL、至少約2IU/dL、至少約3IU/dL、 至少約4IU/dL、至少約5IU/dL、至少約6IU/dL、至少約7IU/dL、至少約8IU/dL、至少約9IU/dL、或至少約10IU/dL。
65. 如請求項64的方法，其中該FVIII血漿活性水平為至少約3IU/dL。
66. 如請求項64的方法，其中該FVIII血漿活性水平為至少約5IU/dL。
67. 如請求項1至41中任一項的方法，其中在施用該嵌合多肽後至少約5天，該FVIII血漿活性水平為至少約10IU/dL。
68. 如請求項1至41中任一項的方法，其中在施用該嵌合多肽後至少約7天，該FVIII血漿活性水平為至少約5IU/dL。
69. 如請求項1至41中任一項的方法，其中在施用嵌合多肽後至少約8天，該FVIII血漿活性水平為至少約3IU/dL。
70. 如請求項1至41中任一項的方法，其中在施用嵌合多肽後至少約10天，該FVIII血漿活性水平為至少約1IU/dL。
71. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約50IU/kg。
72. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量為約50IU/kg，且該給藥間隔為約7天。
73. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該嵌合多肽的施用在該施用的約7天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約20天、約24天、約25天、約28天、約30天、或約35天後不誘發FVIII抑制因子。
74. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該嵌合多肽的施用在該施用的約28天後不誘發FVIII抑制因子。
75. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約80IU/kg。
76. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約50IU/kg至約65IU/kg。
77. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該多劑量中的至少一個為約65IU/kg至約80IU/kg。
78. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為至少約7天。
79. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為約7天至約14天。
80. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為至少約10天。
81. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為約10天至約21天。
82. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為約14天至約21天。
83. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該給藥間隔為約14天。
84. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該人受試者是女性。
85. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該人受試者是兒童。
86. 如請求項85的方法，其中該人受試者是小於或等於約12歲、小於約11歲、小於約10歲、小於約9歲、小於約8歲、小於約7歲、小於約6歲、小於約5歲、小於約4歲、小於約3歲、小於約2歲、或小於約1歲的兒童。
87. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該施用在該人受試者中誘發對FVIII的免疫耐受。
88. 如請求項1-41中任一項的方法，其中該施用在該人受試者中誘發對FVIII的抑制性免疫反應。
89. 如請求項88的方法，其中該對FVIII的抑制性免疫反應包含在該個體人類個體中高效價(titer)的抗FVIII抗體。

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