CN110862457A

CN110862457A - 能与碳酸酐酶ix特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN110862457A
Application number: CN201911233913.7A
Authority: CN
Inventors: 王洛夫; 胡明
Original assignee: Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Current assignee: Chinese Peoples Liberation Army Army Specialized Medical Center
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN110862457B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及能与碳酸酐酶IX(CA IX)特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用。本发明通过真核表达CA IX抗原胞外区，以其免疫骆驼，制备抗CA IX胞外区的纳米抗体并鉴定，为下一步的靶向显像和治疗奠定基础。

Description

能与碳酸酐酶IX特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及能与碳酸酐酶IX(CA IX)特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用。

背景技术

肾癌相关抗原CA IX于1986年被发现并对其进行了系统、深入的研究，CA IX抗原具有良好的肾癌特异性。免疫组化研究表明:85％以上的原发性肾癌和转移性肾癌表达CAIX抗原，而占肾癌90％的肾透明细胞癌几乎全部表达此抗原，正常的肾组织则不表达CA IX抗原。CA IX属于单次跨膜蛋白，位于VHL肿瘤抑制基因的下游，由缺氧诱导因子-1途径激活。CA IX本身是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，作为CO₂水化可逆反应的催化剂，能催化CO₂水化生成H⁺和HCO₃ ^－，HCO₃ ^－与细胞内C1^－交换，维持细胞内碱性环境而有利于细胞的生长；细胞内H⁺则通过离子泵、H⁺-Na⁺交换等方式运输到细胞外，使细胞外为酸性微环境，可以激活细胞表面蛋白，有利于肿瘤生长和转移，目前普遍认为CA IX参与肿瘤形成和进展的过程。肾癌相关抗原CA IX的基因序列和cDNA序列已被克隆，其碳酸酐酶活性催化区位于胞外部分，由外显子2～8编码。

CA IX被视为肿瘤特异的蛋白，特别是对于肾癌的诊断、靶向治疗具有重要价值。Bleumer等采用CA IX单克隆抗体对患者进行了免疫治疗(Ⅱ期临床试验)，发现肾癌进展期患者病情可得到缓解，进一步的研究还在进行中。我们前期的研究将CA IX单克隆抗体与纳米微泡相连，证实其可很好地实现对肾癌的靶向黏附，在超声辐照下可增强裸鼠移植瘤的组织显影。该针对肾癌的靶向纳米微泡，CA IX抗原作为靶标，特异性非常好。

单克隆抗体修饰的靶向超声微泡存在一些不够理想的地方，如单克隆抗体免疫原性强、稳定性差、单克隆抗体-微粒复合物相对分子质量大、组织穿透力弱、实际到达靶组织的浓度低等，这些都制约了超声分子成像的临床应用。因此，寻找一种特异性高、穿透力强的小型化抗体对于肿瘤的靶向诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种能与碳酸酐酶IX特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用。本发明提供的纳米抗体体积小，特异性强，与纳米微泡相连，有助于实现靶向微泡的小型化和靶向性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了能与碳酸酐酶IX(CA IX)特异性结合的骆驼源单域重链抗体(即纳米抗体)，

(I)、所述骆驼源纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

或

(II)、如(I)所述氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。

或

(III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2个或3个。

在上述研究的基础上，本发明还提供了编码所述的骆驼源纳米抗体的核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的核苷酸具有

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示(

caggtgcagctgcaggagtctggaggagacttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggattcgccttcagtagctactggatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggcatgagtgggtctcagctatcgatagtggtggtgccacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcaaactgaggacacggccgtgtattactgtgcggcagccctaccccttgtggtagctggtgccccacgtgttaagtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca)的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列。

在上述研究的基础上，本发明还提供了一种表达载体，包括所述的核苷酸。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主为细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞或无细胞表达系统。

本发明还提供了所述的骆驼源纳米抗体的制备方法，包括：培养如权利要求7所述的宿主、诱导骆驼源纳米抗体的表达。

在上述研究的基础上，本发明还提供了结合物或偶联物，所述结合物包含经化学标记或生物标记的所述的骆驼源纳米抗体；

所述偶联物由所述的骆驼源纳米抗体或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

本发明还提供了所述的骆驼源纳米抗体、所述的结合物或偶联物在制备碳酸酐酶IX检测试剂或预防和/或治疗癌症的靶向药物中的应用。

此外，本发明还提供了试剂盒，包括所述的骆驼源纳米抗体、所述的结合物或偶联物。

本发明还提供了碳酸酐酶IX(CA IX)的检测方法，以所述的试剂盒检测碳酸酐酶IX(CA IX)表达。

更重要的是，本发明还提供了所述的骆驼源纳米抗体、所述的结合物和/或所述的偶联物在制备预防和/或治疗癌症的靶向药物中的应用。

本发明还提供了药物，包括所述的骆驼源纳米抗体、所述的结合物或偶联物。

本发明还提供了癌症的预防和/或治疗方法，给予所述的药物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述癌症为肾癌。

本发明提供了能与肾癌相关抗原CA IX胞外区特异性结合的纳米抗体。通过瞬时转染方式将包含CA IX蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞HEK 293F中表达CA IX胞外区，以该重组蛋白免疫新疆双峰驼，构建噬菌体展示纳米抗体库。通过体外定向筛选，得到能与CA IX蛋白胞外区特异性结合的噬菌体，以Monoclonal phage ELISA方法筛选出具有结合活性的噬菌体克隆。通过细胞ELISA和流式细胞仪再次验证淘选到的纳米抗体的细胞结合活性。测序证明编码CA IX的重组DNA片段序列正确，Western blot检测结果证实CA IX重组蛋白成功表达。通过免疫新疆双峰驼，成功构建了库容为2.87×10⁹的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选，使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集，阳性率高达54.3％。经过抗原ELISA、细胞ELISA鉴定，筛选出3个具有细胞结合活性的纳米抗体噬菌体克隆，取其中结合活性最高的Nb-G5进行表达、纯化，产量为1.5mg/L培养物，流式细胞仪检测结果证实Nb-G5与CA IX表达阳性的细胞具有很强的特异性结合能力。从纳米抗体库中淘选得到了在分子和细胞水平均能与CA IX蛋白胞外区特异性结合的纳米抗体。

本发明成功制备了针对CA IX抗原蛋白胞外区的纳米抗体，在后续的工作中，我们准备将其与纳米微泡相连，制备靶向于CA IX的纳米抗体靶向的纳米微泡，用于包括肾癌在内的表达CA IX抗原肿瘤的早期诊断和靶向治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示CA IX真核表达质粒的细菌克隆PCR电泳结果；其中M：DNA标准；1-2：随机挑取的细菌克隆的PCR产物，其PCR条带与1266bp的目标条带长度一致；

图2示CA IX蛋白表达纯化及鉴定结果；其中A：CA IX蛋白纯化中各组分的SDS-PAGE电泳结果(在还原条件下，CA IX蛋白的分子量约为50kDa)；1：表达上清；2：流穿样品；3：洗杂样品；4：50mmol/L咪唑洗脱样品；5：250mmol/L咪唑洗脱样品使用anti-CA IX抗体进行检测，目的条带分子量约为50kDa，M：蛋白Marker；B：CA IX蛋白western blot检测结果；

图3示VHH DNA片段扩增的琼脂糖凝胶电泳结果；其中M：DNA标准；以免疫后的骆驼外周血淋巴细胞cDNA为模板进行了两次扩增得到VHH基因片段；其中A为第一次PCR产物电泳结果，1为第一次PCR产物，得到约700bp的目的片段和约1000bp的传统骆驼抗体基因片段；B为第二次PCR产物电泳结果，2为第二次PCR产物，得到含PstⅠ和NotⅠ酶切位点约400bp的VHH DNA片段；

图4示各轮筛选中Input phage pool ELISA结果；

图5示9个VHH抗体克隆对CA IX蛋白的monoclonal phage ELISA结果；

图6示细胞ELISA检测纳米抗体克隆与HeLa细胞和ACHN细胞的结合情况；

图7示纯化后的纳米抗体Nb-G5的SDS-PAGE电泳结果；其中1：未诱导的菌液；2：诱导表达的菌液；3：50mmol/L咪唑洗脱样品；4：250mmol/L咪唑洗脱样品；M：蛋白质分子量标准；

图8示FACS检测纳米抗体Nb-G5对HeLa细胞和ACHN细胞的结合情况；图A显示纳米抗体Nb-G5和阴性对照PBS对CA IX表达阳性的HeLa细胞的流式实验结果，图B显示Nb-G5和PBS对CA IX表达阴性的ACHN细胞的流式实验结果；纳米抗体Nb-G5显示了良好的细胞结合活性。

具体实施方式

本发明公开了一种能与碳酸酐酶IX特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

既往的研究中，我们将CA IX单克隆抗体与超声纳米微泡相连，制备出了靶向纳米微泡，发现其对肾癌细胞具有特异性靶向结合作用。由于单克隆抗体相对分子质量大、体积大，不利于超声微泡的小型化和组织穿透性，而纳米抗体作为最小的功能性抗原结合片段，其独特的生物学结构特征赋予了它们许多优势，如体积非常小、稳定性强、可溶性好、免疫原性低、容易表达等，因此，我们拟采用纳米抗体取代单克隆抗体。本发明通过真核表达CAIX抗原胞外区，以其免疫骆驼，制备抗CA IX胞外区的纳米抗体并鉴定，为下一步的靶向显像和治疗奠定基础。

本发明公开了一种能与碳酸酐酶IX(CA IX)特异性结合的骆驼源纳米抗体及其编码序列和用途。

本发明的目的是提供针对碳酸酐酶IX(CA IX)的单域重链抗体(即纳米抗体)，可以被用于制备检测CA IX的试剂和工具。

本发明提供的纳米抗体通过免疫骆驼(新疆双峰驼)而制备，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其氨基酸序列可通过标准化的抗体氨基酸序列编号方法(ImMunoGeneTics，IMGT)进行编号和结构域的划分。

本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含框架区中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有90％同源性。

本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含互补决定区中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有80％同源性。

本发明提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID No.1，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。该核酸分子的序列如SEQ ID No.2。

本发明还提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID No.1部分结构域，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。

本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。

本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。

本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。

本发明还提供一种检测细胞上碳酸酐酶IX(CA IX)的方法。基于本发明提供的蛋白质或多肽与前列腺特异性膜抗原特异性结合的能力，建立前列腺特异性膜抗原的检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，荧光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法。

本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

本发明还公布了抗碳酸酐酶IX(CA IX)的纳米抗体的用途。该纳米抗体与癌细胞膜上的抗原碳酸酐酶IX结合，可用于阻断碳酸酐酶IX的活性。该纳米抗体经过生物素化处理后，可以连接到基因或药物载体(如超市微泡、纳米金颗粒等)上，使载体具有靶向性，可使载体靶向结合于细胞表面的碳酸酐酶IX，可用于肿瘤的增强显影、靶向治疗。

本发明制备出了能特异性结合CA IX抗原的纳米抗体。通过对2头新疆双峰骆驼8次的免疫，提取免疫后的骆驼外周血淋巴细胞总RNA，经mRNA分离和反转录后得到的cDNA为模板，使用巢式PCR经2次扩增得到VHH抗体DNA片段，多次电转化后构建了骆驼VHH免疫文库。由于其体内产生的抗体在抗原的刺激下经过了体细胞突变且对抗原有针对性，相较于天然纳米抗体库，骆驼VHH免疫文库能产生高亲和力和高特异性的纳米抗体。在免疫纳米抗体库中通过噬菌体展示技术，我们淘选出与CA IX抗原结合活性高的纳米抗体。Monoclonalphage ELISA实验证实淘选出的VHH克隆显示出对CA IX蛋白的特异性结合能力，细胞ELISA及流式细胞实验数据显示该纳米抗体与HeLa细胞具有特异性结合活性。由于我们制备的纳米抗体针对的是CA IX蛋白的胞外区，保证了其在穿出血管进入组织间隙后能与表达CA IX抗原的细胞结合。

本发明提供的能与碳酸酐酶IX特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

材料：

质粒与细胞株包含人源CA IX基因cDNA序列的质粒pMD-CAIX购自北京义翘神州生物技术有限公司，真核表达载体pR AG2a(含Sig-BM40信号肽和C端6His-tag标签)购自上海锐劲生物技术有限公司。HEK 293F细胞购自Invitrogen，HeLa细胞和肾细胞腺癌细胞株ACHN购自中科院上海细胞库。噬菌体载体pMECS、大肠杆菌Top 10、ER 2738、HB2151为本实验室保存。

主要试剂：

限制性内切酶和其他工具酶主要购自美国NEB和Thermo Scientific公司，PCR反应均使用日本TaKaRa公司的KOD plus酶，质粒抽提及DNA回收试剂盒购自美国Axygen公司，mRNA纯化试剂盒购自美国Promega公司，cDNA合成试剂盒购自Thermo Scientific公司。转染所用的阳离子脂质体293fectin购自美国Invitrogen公司。鼠抗人CA IX抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，Anti-M13-HRP鼠单抗购自GE Healthcare公司，羊抗鼠-FITC和羊抗鼠-HRP购自上海康成生物工程有限公司。所有引物由苏州金维智生物科技有限公司合成，细胞培养中用到的培养基和胎牛血清购均自美国Gibco公司，其他化学试剂购自国药集团和美国Sigma公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 CA IX胞外区的真核表达

利用引物对CA IXECD-VF(5'-gatcagctagcacagaggttgccccggatgca-3'，如SEQ IDNo.3所示)和CA IXECD-VR(5'-catgactcgaggtcaccagcagccaggcag-3'，如SEQ ID No.4所示)从模板质粒pMDCAIX中扩增出包含CA IX胞外区Gln38至Asp414区间(以下简称CA IX蛋白)的DNA片段，使用NheⅠ和XhoⅠ限制性内切酶将其插入到真核表达载体pRAG2a中。构建的重组质粒转化到感受态细胞E.coli Top 10，通过菌落PCR鉴定出阳性克隆，并最终经测序验证得到正确的质粒pRAG2a-huCA IXECD。大量抽提所得质粒后，使用293fectin将质粒DNA转染到HEK 293F细胞进行悬浮培养和目的蛋白的瞬时表达。细胞培养5d后，离心收集培养上清，使用Ni-6FF(TED)镍柱纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE凝胶电泳分析各组分和纯化的CAIX蛋白。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE后，电转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶封闭后，加入鼠抗人CA IX抗体(1∶1 000稀释)，于4℃孵育过夜，漂洗后加入羊抗鼠-HRP并于室温下孵育1h，漂洗后加氟显色液进行显影。

质粒pRAG2a-huCA IXECD构建和转化后，采用菌落PCR对随机挑取的菌落进行鉴定，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。目标条带长度为1 266bp(图1)，挑取的2个克隆均为阳性克隆，经DNA测序和比对，克隆序列与CA IX蛋白的对照序列完全一致。对纯化后的CA IX蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，在预期位置出现明确条带，纯度大于90％(图2A)。使用鼠抗人CA IX单抗对纯化的CA IX蛋白进行Western blot检测(图2B)，结果表明该重组蛋白成功在真核细胞HEK293F中高效表达。

实施例2免疫纳米抗体库的构建

2头约两岁的雄性新疆双峰骆驼被用于免疫，免疫注射共进行了8次，持续时间为105d。前2次的免疫时间点分别为第0天和第17天，每只骆驼每次注射的抗原用量分别为50μg和100μg。随后的免疫时间点分别在第40、59、74天和第87天，注射的抗原用量为每次300μg。最后2次的加强免疫在1周内完成，时间点分别是第102天和第105天。1周后，分别从每只骆驼采集200mL外周血，用于免疫文库构建。

经T R Izol试剂提取骆驼外周血淋巴细胞的总RNA，提取mRNA，并mRNA反转录为cDNA。然后使用两步法PCR扩增出骆驼重链抗体的重链可变区(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody，VHH)基因片段。第1步PCR使用引物对为CALL001(5'-gtcctggctgctcttctacaagg-3'，如SEQ ID No.5所示)和CALL002(5'-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3'，如SEQ ID No.6所示)。通过凝胶电泳切胶回收700bp的DNA片段，然后以其为模板，使用引物对VHH-Back(5'-gatgtgcagctgcaggagtctggrggagg-3'，如SEQ ID No.7所示)和PMCF(5'-ctagtgcggccgctgaggagacggtgacctgggt-3'，如SEQ ID No.8所示)进行第2次PCR扩增，得到条带大小约为400bp的VHH基因片段。通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，纯化后使用PstⅠ和NotⅠ进行双酶切，使用T4 DNA连接酶连接到同样经PstⅠ/NotⅠ双酶切的pMECS载体。连接产物与3mL新鲜制备的感受态大肠杆菌TG1细胞混合，分装到60只转化杯进行电转化。转化后的细胞重悬于50mL SOC培养基，在37℃保温1h后，涂布在包含100μg/mL氨苄青霉素和质量浓度为2％的葡萄糖的2×TY平板，37℃培养过夜。最后，从平板上刮下来的菌落重悬于100mL LB培养基，加入15％终浓度的甘油后，分装冻存于－80℃。

以免疫后的骆驼外周血淋巴细胞总RNA为源头，经mRNA分离和反转录后得到的cDNA为模板，使用巢式PCR经2次扩增得到VHH抗体DNA片段。第1次扩增得到了缺少CH1结构域的VHH抗体基因片段(长度约700bp的主带)以及传统的骆驼抗体基因片段(长度约1000bp)(图3A)。通过切胶回收700bp的条带，并以此为模板，进行第2次PCR得到长度约400bp的VHH基因片段(图3B)。经过PstⅠ和NotⅠ双酶切的VHH片段与经同样双酶切的pMECS载体连接后，电转化到TG1感受态细胞。pMECS噬菌体载体在VHH的C端融合了HA-tag和6His-tag，便于阳性克隆的鉴定和VHH抗体纯化。多次电转化后的梯度计数结果显示:最终成功得到了库容为2.87×10⁹的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。

实施例3针对CA IX胞外区的纳米抗体的淘选

使用上述构建的噬菌体展示VHH免疫文库。针对CA IX蛋白进行了3轮体外定向筛选，以分离出能与CA IX特异性结合的纳米抗体。简而言之，从文库中取出约4×10¹⁰转化后的TG1细胞，接种到包含100μg/mL氨苄青霉素和质量浓度为1％的葡萄糖的2×TY培养基进行培养。2h后，加入4×1010辅助噬菌体M13KO7，在室温下孵育30min进行感染。离心收集感染后的细胞，重悬于包含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2×TY培养基，于37℃和220r/min条件下培养过夜。离心分离培养上清，加入PEG 6 000/NaCl(20％PEG 6 000和2.5mol/L NaCl)溶液沉淀和浓缩噬菌体颗粒，并最终重悬于无菌和预冷的PBS缓冲液。

定向筛选实验采用固相淘选方法，在MaxisorpELISA 96孔板上进行了3轮筛选。每轮具体的操作方法如下:用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)将CA IX蛋白稀释成100μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜；用PBS洗1次，加入2％BSA-PBS溶液在室温下封闭2h；用PBST(含0.1％Tween-20)洗3次后，加入含1％BSA和0.1％Tween-20的噬菌体抗体库，于37℃孵育2h，用PBST洗涤20次(逐轮增加10次)以去除不能结合或弱结合的噬菌体颗粒。最后以100μL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH＝2.2)洗脱吸附的噬菌体颗粒，重复洗脱1次，随后用中和液(Tris-HCl，pH＝9.1)中和酸性的洗脱液，加入到对数生长中期的大肠杆菌ER2738进行感染、计数和扩增，然后用于下一轮筛选。

为了从免疫库中筛选到与CA IX蛋白结合能力强的纳米抗体，采用了逐轮增加筛选压力的策略，主要包括降低抗原用量、增加表面活性剂浓度和洗涤次数的方法。各轮筛选的数据，包括投入噬菌体数量(Input)、洗脱后得到的噬菌体数量(Output)、回收率(Output/Input)以及富集度如表1所示。结果表明:在每轮的Input略微减少的情况下，尽管筛选压力逐轮增大，Output中噬菌体数量仍然有明显提升，其中第2轮的富集度最高，第3轮富集度降低为6.2倍，推测阳性噬菌体颗粒在第3轮筛选后已经得到足够富集。

表1各轮筛选中的噬菌体滴度和富集度

筛选轮数	Input	Output	回收率	富集度
					第1轮	2.1×10<sup>12</sup>	2.6×10<sup>6</sup>	1.2×10<sup>－6</sup>	－
第2轮	1.2×10<sup>12</sup>	6.3×10<sup>7</sup>	5.3×10<sup>－5</sup>	44.2
					第3轮	8.0×10<sup>11</sup>	2.6×10<sup>8</sup>	3.3×10<sup>－4</sup>	6.2

将各轮的Input噬菌体分别对CA IX蛋白和阴性对照蛋白BSA进行phage poolELISA检测(图4)，结果表明:随着筛选次数的增加，用于筛选的混合噬菌体颗粒对CA IX蛋白的识别信号明显增强，而对BSA的结合信号基本不变。

采用各轮筛选的Input噬菌体样品分别对CA IX蛋白和对照蛋白BSA进行phageELISA检测。结果显示:Input phage样品与CA IX蛋白的结合信号逐轮增强。

实施例4 Monoclonal phage-ELISA鉴定阳性克隆

从第2轮和第3轮筛选后的克隆中，随机挑选单克隆进行培养和噬菌体援救，随后进行monoclonal phage-ELISA实验，以鉴定出能特异性结合CA IX蛋白的阳性纳米抗体克隆。为此目的，分别将2μg/mL的CA IX蛋白以及阴性对照蛋白牛血清白蛋白(BSA)包被到96孔ELISA平板，用PBS洗1次，加入2％BSA在室温下封闭2h。用PBST洗板3次后，每孔加入100μL含1％BSA和0.1％Tween-20的噬菌体样品，同时以不展示VHH的野生型M13KO7噬菌体为阴性对照样品，在37℃孵育2h。用PBST洗板3次后，每孔加入100μL含1％BSA的anti-M13-HRP抗体(1∶5 000稀释)，在37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，每孔加入TMB显色液100μL，在室温下反应15min，随后加入50μL硫酸(浓度为2mol/L)终止显色，并在酶标仪上使用双波长法测定光密度值[D(450～630)]。

从第2轮和第3轮筛选后的Output中，分别随机挑取188个单克隆菌落，通过Monoclonal phage ELISA方法鉴定与CA IX蛋白特异性结合的纳米抗体。结果表明:以对CAIX的结合值大于BSA对照组结合值[D(450～630)]大于3倍为标准，从第2轮鉴定出35个阳性克隆，阳性率为18.6％；从第3轮鉴定出102个阳性克隆，阳性率为54.3％。分别挑取不同结合强度的克隆，对其中60个克隆进行测序分析后，最终得到9个不同序列的VHH抗体克隆，其phage ELISA结果如图5所示。

实施例5阳性克隆的细胞ELISA鉴定

分别以2×10⁴/孔的量接种CA IX表达阳性的HeLa细胞和表达阴性的ACHN细胞于96孔细胞培养板，100μL/孔，过夜培养。用含1％BSA的PBS溶液洗涤1次后，以4％多聚甲醛固定，并滴加3％过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶活性，于室温下孵育30min。PBS洗板3次，加入含2％BSA的PBS溶液于37℃孵育2h进行封闭。按照实施例4的方法，同样加入待分析样品和阴性对照样品M13KO7，进行后续实验。

从第2轮和第3轮筛选后的阳性克隆中共鉴定出9个不同的VHH抗体克隆，这些克隆在monoclonal phage ELISA实验中显示出对CA IX蛋白的特异性结合能力。

为了验证筛选到的纳米抗体的细胞结合活性，通过细胞ELISA检测了9个具有抗原结合活性的纳米抗体噬菌体颗粒。其中克隆Nb-G3、Nb-G5和Nb-G8能特异性结合CA IX表达阳性的HeLa细胞，不与CA IX表达阴性的ACHN细胞结合。其余克隆不具有细胞结合活性，推测是由于CA IX蛋白分子与细胞表面的CA IX构象上的差异造成。

纳米抗体Nb-G3、Nb-G5和Nb-G8能特异性结合CA IX表达阳性的HeLa细胞，不与CAIX表达阴性的ACHN细胞结合(图6)。M13KO7为野生型噬菌体作为阴性对照样品。

实施例6针对CA IX胞外区的纳米抗体的原核表达及纯化

将包含噬菌体质粒的大肠杆菌ER2738接种到400mL 2×TY培养基，培养至D(600)约为0.6时，加入1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，于28℃培养过夜。收集菌体，使用TES缓冲液进行周质腔蛋白抽提。CA IX特异的纳米抗体C端融合了6His-tag，可以通过Ni-6FF(TED)镍柱纯化，使用250mmol/L咪唑缓冲液洗脱。使用超滤管将洗脱样品的缓冲液置换为PBS(pH＝7.4)，使用BCA法测定蛋白浓度，并用SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，最后加入5％甘油，分装保存。

为了表达和纯化筛选得到的纳米抗体，包含Nb-G5纳米抗体序列质粒的大肠杆菌ER2738被直接用于培养和诱导表达。ER2738是琥珀终止子抑制型大肠杆菌，约20％的琥珀终止子能被翻译为谷氨酸(Glu)，因此，目的蛋白中约20％为纳米抗体与g3蛋白形成的融合，其余为不含g3蛋白的纳米抗体。使用TES缓冲液将周质腔中的可溶性纳米抗体抽提出来后，通过镍柱进行纯化。SDS-PAGE电泳结果显示，纯化后的纳米抗体具有很好的纯度(图7)，其纯度约为90％。CA IX特异的纳米抗体Nb-G5的产量为1.5mg/L培养物。

实施例7流式细胞仪鉴定纳米抗体的特异性细胞结合活性

分别将HeLa细胞和ACHN细胞用含1％胎牛血清(FBS)的PBS溶液(简称为FBS-PBS溶液)洗涤1次，分装为5×105/管用于实验。每种细胞分别加入100nmol/L浓度的纳米抗体，冰浴1h；同样条件下分别加入PBS作为阴性对照。用FBS-PBS溶液洗涤2次后，加入1∶100稀释的二抗anti-HA鼠单抗，冰浴1h。用FBS-PBS溶液洗涤2次后，加入FITC标记的羊抗鼠(1∶100稀释)，冰浴1h。用FBS-PBS溶液洗涤2次后，加入200μL FBS-PBS溶液，使用BeckmanCoulter的MoFlo XDP进行检测。

为了检验得到的纳米抗体的特异性细胞结合能力，使用流式细胞仪分别检测了纳米抗体Nb-G5与CA IX表达阳性的HeLa细胞和表达阴性的ACHN细胞的结合情况(图8)。检测所用的纳米抗体的浓度为100nmol/L，Nb-G5和PBS对照与HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)分别为9 723.2和749.8，与ACHN细胞的MFI分别为4 343.5和3 183.5。在与HeLa细胞的直方图上，纳米抗体Nb-G5显示出强烈的荧光信号偏移。由此可见，Nb-G5具有很好的细胞结合能力和结合特异性。

使用流式细胞仪检测纳米抗体Nb-G5和PBS(阴性对照)与CA IX表达阳性的HeLa细胞和表达阴性的ACHN细胞的结合情况。二抗和三抗分别为anti-HA鼠单抗(1：100稀释)和羊抗鼠-FITC(1：100稀释)。纳米抗体Nb-G5显示出与CA IX表达阳性的HeLa细胞良好的特异性结合能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军特色医学中心

<120> 能与碳酸酐酶IX特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用

<130> MP1922923

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly His Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Ala Leu Pro Leu Val Val Ala Gly Ala Pro Arg Val Lys Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggagac ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgccttcagt agctactgga tgtactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcatgagtg ggtctcagct atcgatagtg gtggtgccac atactatgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgcaaac tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcggc agccctaccc 300

cttgtggtag ctggtgcccc acgtgttaag tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcagctag cacagaggtt gccccggatg ca 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgactcga ggtcaccagc agccaggcag 30

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n(24)=A/G

<400> 7

gatgtgcagc tgcaggagtc tggnggagg 29

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34

Claims

1.能与碳酸酐酶IX特异性结合的骆驼源纳米抗体，其特征在于，

(I)、所述骆驼源纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

或

(II)、如(I)所述氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；

或

2.编码如权利要求1所述的骆驼源纳米抗体的核苷酸。

3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，具有

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

4.一种表达载体，包括如权利要求3所述的核苷酸。

5.转化或转染如权利要求4所述表达载体的宿主。

6.如权利要求5所述的宿主，其特征在于，其为细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞或无细胞表达系统。

7.结合物或偶联物，其特征在于，所述结合物包含经化学标记或生物标记的如权利要求1所述的骆驼源纳米抗体；

所述偶联物由如权利要求1所述的骆驼源纳米抗体或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

8.如权利要求1所述的骆驼源纳米抗体、权利要求9所述的结合物或偶联物在制备碳酸酐酶IX检测试剂或预防和/或治疗癌症的靶向药物中的应用。

9.试剂盒，包括如权利要求1所述的骆驼源纳米抗体、如权利要求9所述的结合物或偶联物。

10.药物，其特征在于，包括如权利要求1所述的骆驼源纳米抗体、如权利要求9所述的结合物或偶联物。