CN101641450A - Mn/ca9剪接变体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了MN/CA9 mRNA的旁路剪接[AS]变体及相关蛋白－ASMN/CA IX。不同于在大多数组织中意味着肿瘤形成和/或低氧的与癌症相关的全长[FL]MN/CA9 mRNA和FL MN/CA IX，AS MN/CA9 mRNA在正常含氧量下组成型表达，不受低氧刺激，AS MN/CA IX不限于细胞膜上。本文提供了区分AS和FL MN/CA9的表达从而用于肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断/预后的方法，以及用于这些方法的探针、引物和抗体。还公开了涉及MN基因和蛋白的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的治疗方法，这些方法基于ASMN蛋白(AS MN/CA IX)干扰FL MN蛋白(FL MN/CA IX)催化活性的能力；此类方法还可使用具有所述干扰能力的AS MN蛋白片段。所述方法可包括相对于FL MN/CA IX水平增加AS MN/CA IX水平。示例性治疗方法可包括给予物质，例如，AS MN/CA IX本身、表达AS MN/CA9 mRNA的载体、阻断FL MN/CA IX表达但不阻断AS MN/CA IX表达的反义寡核苷酸、表达此类反义寡核苷酸的载体、FL MN/CA9－同工型特异性siRNA、或表达此类FL MN/CA9－同工型特异性siRNA的载体。还公开了鉴定能够调节AS MN/CA IX水平的物质的方法。

Description

MN/CA9剪接变体
发明领域
本发明属于医学遗传学、生物化学工程、免疫化学和肿瘤学领域。更具体地说，本发明涉及MN基因-被认为是癌基因的细胞基因，也称为MN/CA9、CA9或碳酸酐酶9，该基因编码现在也称为MN蛋白的癌蛋白、MN/CA IX同功酶，MN/CA IX、碳酸酐酶IX、CA IX或MN/G250蛋白。
更具体地说，本发明涉及一种以其他方式剪接的[AS]形式的MN/CA9mRNA和用于检测该mRNA的探针/引物。该AS MN/CA9mRNA主要在正常的细胞中于正常的血氧下表达，能够干扰检测全长[FL]MN/CA9mRNA表达的试验，尤其是RT-PCR试验。本发明还涉及该AS形式的MN/CA IX以及利用对其(单独或与FL形式的MN CA IX蛋白组合)进行检测或检测并定量的试验来进行诊断/预后的方法。此外，本发明涉及利用MN/CA9旁路剪接(alternative splicing)作为手段来靶向FL MN/CA IX蛋白的治疗方法。作为本发明焦点的AS形式的MN/CA9/CA IX可以来自脊椎动物，但优选来自哺乳动物，更优选来自人。
发明背景
如上所述，该MN基因和蛋白有很多可选名称，这些名称在本文中可互换使用。发现MN蛋白可结合锌并具有碳酸酐酶(CA)活性，现在被认为是第九种碳酸酐酶同工酶-MN/CA IX或CA IX[Opavsky等(1996)见下文]。按照碳酸酐酶命名法，人CA同工酶用大写罗马字母和数字表示，而它们的基因用斜体字母和阿拉伯数字表示。或者本文中使用的“MN”指碳酸酐酶同工酶IX(CA IX)蛋白/多肽或碳酸酐酶同工酶9(CA9)基因、核酸、cDNA、mRNA等，如上下文所示。
MN蛋白还已被鉴定为G250抗原。Uemura等“肿瘤相关抗原MN/G250在尿道癌中的表达：潜在治疗性靶标(Expression of Tumor-AssociatedAntigen MN/G250 in Urologic Carcinoma：Potential Therapeutic Target)”，“J.Urol.，154(4增刊)：377(摘要1475；1997)描述：“序列分析和数据库搜索显示，G250抗原与MN(在宫颈癌中鉴定到的人肿瘤相关性抗原)相同(Pastorek等，1994)。
CA IX是由Zavada J.，Pastorekova，S.和Pastorek，J.利用首先由Pastorekova等[Virology 187：620-626(1992)]描述的M75单克隆抗体鉴定到的癌相关性碳酸酐酶[“zavada等”，参见，例如，美国专利5,387,676]。该抗体用于克隆编码CA IX的cDNA[Pastorek等，Oncogene，9：2788-2888(1994)]，用于评价CA IX在肿瘤内和正常组织中的表达[Zavada等，Int J Cancer，54：268-274，(1993)，以及很多其他的参考文献]，用于研究细胞密度对CA IX的调控[Lieskovska等，Neoplasma，46：17-24，(1999)，Kaluz等，Cancer Research，62：4469-4477，(2002)]，还用于证明低氧对CA IX的诱导[Wykoff等，Cancer Research，60：7075-7083 2000)，以及很多其他的参考文献]。所有此类研究均支持Zavada等最初的观点和工作[例如，Zavada等，美国专利5,387,676]，即MN/CA IX/CA9可作为肿瘤发生前/肿瘤标记物用于诊断和/或预防性用途，以及可作为靶标用于治疗性用途，Zavada等还表明M75单克隆抗体是一种有价值的CA IX特异性试剂，可用于不同的免疫检测方法和免疫靶向方法。
Zavada等，国际公开No.WO 93/18152(1993年9月16日公开)和美国专利No.5,387,676(1995年2月7日授权)描述了MN基因和蛋白的发现及其生物学和分子特征。发现MN基因存在于所有测试的脊椎动物染色体DNA中，它的表达与肿瘤的发生强烈相关。
最初在来源于人子宫颈癌的HeLa细胞中鉴定到MN蛋白。在多种人肿瘤中均发现了这种蛋白(其中特别是子宫颈、卵巢、子宫内膜、肾、膀胱、乳房、结肠直肠、肺、食管和前列腺的肿瘤)。在正常组织中几乎没有发现MN蛋白的任何显著性表达。那些表达MN的正常组织包括人的胃粘膜和胆囊上皮，以及消化道的一些其它正常组织。自相矛盾的是，在一些正常地表达MN基因的组织(例如胃粘膜)中，发生癌及其他肿瘤发生前(preneoplastic)/肿瘤性疾病(neoplastic disease)时MN基因的表达缺失或减少。
通常，MN蛋白的异常表达可能预示肿瘤生成。例如，以下现象可能预示肿瘤生成：(1)在正常情况下不表达MN蛋白的组织中存在显著水平的MN蛋白；(2)在正常情况下表达MN蛋白的组织中不存在MN蛋白；(3)组织中MN基因表达相对于正常表达水平显著增加，或显著减少；或(4)在细胞内的异常位点中表达MN蛋白。
Zavada等，WO 93/18152以及Zavada等，WO 95/34650(1995年12月21日公开)公开了如何利用MN基因和蛋白以及MN基因表达与肿瘤发生学的强烈相关性的发现发明了诊断/预后以及治疗癌症和癌症前期病症的方法。这些专利申请中提供了通过检测或检测并定量脊椎动物中MN基因的异常表达从而鉴定肿瘤性疾病的发病和存在的方法和组合物。可通过多种常规试验在脊椎动物样品中检测或检测并定量MN基因的异常表达，例如通过使用MN特异性抗体检测或检测并定量MN抗原的免疫测定方法，通过使用MN核酸(例如MN cDNA)检测或检测并定量MN核酸(例如MN mRNA)的杂交试验或PCR试验，例如RT-PCR。
MN/CA IX首先在HeLa细胞中鉴定到，其既是一种质膜蛋白又是一种核蛋白，通过蛋白质印迹法评估的表观分子量分别为58和54千道尔顿(kDa)。MN/CA IX单个3kDa碳水化合物链N-糖基化，在非还原状态下形成S-S连接的寡聚物[Pastorekova等，Virology，187：620-626(1992)；Pastorek等，Oncogene 9：2788-2888(1994)]。MN/CA IX是一种位于细胞表面的跨膜蛋白，但有时候也在细胞核中检测到该蛋白[Zavada等，Int.J. Cancer，54：268-274(1993)；Pastorekova等，见上文]。
MN以孪生蛋白p54/58N的形式存在于HeLa细胞中。使用与p54/58N反应的单克隆抗体(MAb M75)的免疫印迹显示，在54kd和58kd处有两个条带。这两个条带可能对应于一种类型的蛋白，它们很可能由于翻译后加工而不同。
Zavada等，WO 9318152和/或WO 95/34650公开了MN cDNA序列(SEQ ID NO：1)(示于本文的图8A-8C中)，MN氨基酸顺序(SEQ ID NO：2)(也示于图8A-8C中)，以及MN基因组序列(SEQ ID NO：3)(示于本文的图9A-9F中)。MN基因包括11个外显子和10个内含子。SEQ ID NO：1的人MN cDNA序列含有1522个碱基对(bp)。SEQ ID NO：70的MN cDNA序列含有1552bp[EMBL登录号X66839；Pastorek等(1994)]。
示于图8A-8C中的MN蛋白(SEQ ID NO：2)的头37个氨基酸构成了推定的MN信号肽[SEQ ID NO：4]。跨膜MN蛋白有胞外(EC)结构域[图8A-8C(SEQ ID NO：5)的氨基酸(aa)38-414)、跨膜(TM)结构域[aa 415-434(SEQ ID NO：6)]和胞内(IC)结构域[aa 435-459(SEQ ID NO：7)]。该胞外结构域在约氨基酸(aa)53-111(SEQ ID NO.8)或优选在约aa 52-125(SEQ ID NO：81)处含有蛋白聚糖样(PG)结构域，在约aa 135-391(SEQID NO：9)或优选在约aa 121-397(SEQ ID NO：82)处含有碳酸酐酶(CA)结构域。
Zavada等WO 93/18152和WO 95/34650描述了MN-特异性抗体的制备。一种代表性且优选的MN特异性抗体，即单克隆抗体M75(Mab M75)，其对应的杂交瘤(VU-M75)保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)(Manassas，VA，USA)，ATCC编号HB 11128。M75抗体用来例如在新鲜、冷冻或经福尔马林、酒精、丙酮或其他试剂固定的和/或经石蜡包埋和脱蜡的组织样品中通过蛋白质印迹试验、放射免疫测定和免疫组化学来发现和鉴定MN蛋白，也可用于容易地鉴定MN抗原。另一种代表性并优选的MN特异性抗体Mab MN12由保藏在ATCC名为HB 11647的杂交瘤MN12.2.2分泌。Zavada等的WO 95/34650的实施例1提供了用MAb M75进行组织的免疫组织化学染色获得的代表性结果，这些结果证明了MN基因的致癌性。
免疫显性表位被认为基本上是位于MN/CA IX的PG结构域内的那些表位，包括针对M75mab的重复性表位，特别是氨基酸序列PGEEDLP(SEQID NO：11)，该序列是N末端PG区域的4X完全重复序列[Zavada等(2000)，见下文]。针对MN12mab的表位也是免疫显性的。
Pastorekova等，Virology，187：620-626(1992)首先报道了M75mab，并在很多美国和外国专利(包括例如Zavada等美国专利No.5,981,711和EP 0 637 336 B1)中具体要求保护，以及与MN/CA IX特异性抗体(多克隆和单克隆抗体及其片段)等一起要求保护。[也参见，Zavada等，美国专利No.5,387,676；5,955,075；5,972,353；5,989,838；6,004,535；6,051,226；6,069,242；6,093,548；6,204,370；6,204,887；6,297,041；和6,297,051；Zavada等，AU 669694；CA 2,131,826；DE 69325577.3；和KR 282284]。Zavada等的那些美国专利和外国专利通过参考纳入本文。
CA IX是锌金属酶的α碳酸酐酶家族中的一种高度活性成员，该酶家族催化二氧化碳和碳酸氢盐之间的可逆转化[Pastorek等(1994)；Opavsky等(1996)；Chegwidden等，(2000)，见下文；Wingo等，(2001)，见下文；Pastorekova等(2004)，见下文]。CA IX是14种同工型之一，这些同工型存在于哺乳动物中，位于不同的亚细胞位置，包括细胞质(CA I，II，III，VII)、线粒体(CA VA，VB)、分泌小泡(CA VI)和质膜(CA IV，IX，XII，XIV)。一些同功酶分布在多种组织中(CA I，II，CA IV)，其它的同工酶则更局限于特定的器官中(唾液腺中的CAVI)，已发现两种同工型与癌组织有关系(CA IX，XII)[综述于Chegwidden2000；Pastorekova和Pastorek，第9章，Carbonic Anhydrase：Its Inhibitors andActivators(Supuran等主编；CRC Press(London等)2004中]。酶活性和动力学性质以及对氨磺酰抑制剂的灵敏度从高(CA II，CA IX，CA XII，CA IV)到低(CA III)变化[Supuran和Scozzafava(2000)，见下文]。由于不完全保守性活性位点，几种称为CA-相关性蛋白的同工型(CA-RP VIII，X，XI)是非催化性的(acatalytic)。属于相同蛋白家族的遗传相关性成员的这种特别的变异性为它们在多种生理学和病理过程中的应用创造了基础。这种催化活性与维持代谢活性组织中的离子和水交换以及酸碱平衡有重要关系。通过该活性，CA酶类显著影响呼吸、体液(玻璃体液(vitreous humor)、胃液、脑脊髓液)的产生、骨吸收、肾酸化等(Chegwidden等2000)。
CA IX同功酶综合了几种性质，使其成为基础研究和临床研究的重要课题。首先，CA IX的表达与各种人肿瘤十分密切相关，而它通常不存在于相应的正常组织[Zavada等，(1993)；Liao等，(1994)，infra；Turner等，1997，见下文；Liao等，1997，见下文；Saarnio等，1998，见下文；Vermylen等，1999，见下文；Ivanov等(2001)，见下文；Bartosova等，(2002)，等]。这主要与肿瘤低氧有关系，肿瘤低氧通过低氧诱导因子(HIF)强烈激活CA9基因的转录，该低氧可诱导因子结合于定位在靠近转录起始位点的最小CA9启动子(位置在-10/-3)中的低氧效应元件(HRE)[Wykoff等(2000)，见下文]。HIF转录因子通过活化支持弱氧化肿瘤细胞的生存和对低氧应激的适应或导致这些细胞死亡的基因而显著改变弱氧化肿瘤细胞的表达谱。因此，低氧选择了侵袭和转移能力增加、从而固有地与预后不良及对抗癌治疗响应较差相关的、更具侵略性的肿瘤细胞[Harris(2002)，见下文]。
因为肿瘤低氧是一种重要现象，其很大程度上暗示着癌症的发展及治疗(结果)[Hockel和Vaupel(2001)，见下文]，MN非常有可能作为具有预后/前兆价值的一种内在低氧标记物和作为一种有前景的治疗靶标[Wykoff等(2000)；Wykoff等，(2001)，见下文；Beasley等，(2001)，见下文；Giatromanolaki等，(2001)，见下文；Koukourakis等，(2001)，见下文；Potter和Harris(2003)，见下文]。CA IX是一种整体的质膜蛋白，其大的胞外部分暴露在癌细胞的表面上，因而能够被靶向工具(包括特异性单克隆抗体)接近，这对其临床应用是有利的。而且，CA IX与其他CA同功酶的不同在于CA IX中存在独特的蛋白聚糖相关性区域(PG)，该区域形成胞外CA结构域的N末端延伸，从而消除了与其他同功酶的交叉识别[Opavsky等(1996)]。通过调节细胞粘着和控制pH值，CA IX似乎在肿瘤生物学中发挥着活跃的作用(Svastova等，2003，见下文，Svastova等，2004，见下文，Swietach等，2007，见下文)。CA IX参与碳酸氢盐运输蜕变中间物质并响应于低氧条件而影响胞外小环境的酸化(Morgan等，2007，见下文，Svastova等，2004，见 下文).另外，CA IX的胞内结构域(IC)具有潜在性第三致瘤作用，至少在肾细胞肿瘤中：酪氨酸-磷酸化CA IX(通过EGFR介导)与PI-3K(p85)的调节亚基相互作用，导致Akt活化[Dorai等，(2005)，见下文]。由于它的很多潜在活性促使肿瘤生成，靶向CA IX蛋白从而消除其功能预期具有治疗效果。然而，关于CA IX的很多基本的分子和功能方面是未知的；其中一个方面是CA IX可能的旁路剪接。
旁路剪接是一种非常重要的分子机制，其有助于蛋白的结构多样化和功能多样化。旁路剪接常常是差异性外显子包涵体(differential exon inclusion)导致的，其造成结构域组成、亚细胞定位、相互作用可能性、信号容量的及其他蛋白水平的改变。通过最近的基因组技术获得的数据显示，超过60％的人基因是旁路剪接形成的。还有越来越明显的一点是旁路剪接变体表达的不平衡可显著影响细胞表型，并在多种病理学中起作用(Matlin等，2005，见下文)。
本发明基于以下发现：CA9基因的表达涉及旁路剪接。本文描述了小鼠和人的MN mRNA旁路剪接(AS)变体。发明人证明，肿瘤中人AS变体的丰度小于全长(FL)CA9mRNA，但是可以在正常组织和正常含氧量情况下检测到。人AS CA9mRNA不含有外显子8和9，该mRNA编码截短的CA IX蛋白。因此，AS CA IX不限于质膜并显示降低的催化活性。在HeLa细胞中过度表达时，AS CA IX降低了低氧诱导的胞外酸化，阻碍HeLa球状体的生长。由于AS变体可存在于具有正常表型、含氧量正常的细胞中，在用来评定低氧-和肿瘤-相关的CA9基因表达的诊断和/或预后研究中有可能出现假阳性结果。而且，CA IX蛋白的AS形式可能在功能上干扰FL CAIX形式，在中度低氧的情况下，当FL水平相对较低时尤其如此。
发明概述
本发明基于以下发现：除编码低氧诱导的、膜-结合和肿瘤相关的MN蛋白的全长(FL)CA9mRNA转录物之外，还有编码AS MN蛋白(AS MN/CAIX或AS CA IX)的组成型产生的旁路剪接(AS)CA9mRNA转录物，所述AS MN蛋白不限于质膜。作为本发明治疗方面的基础的另一个发现是，ASCA IX干扰FL CA IX的功能。独立于低氧-和肿瘤-的CA IX AS变体产生对CA IX的诊断、预后和治疗方面有很多意义。
一方面中，本发明涉及与脊椎动物、优选哺乳动物、更优选人中MN/CAIX的异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，其包括区分全长[FL]和旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA或AS和FL MN/CA IX的表达。
所述方法可包括使用一个或多个探针和/或引物检测或检测并定量FL和/或AS MN/CA9mRNA的表达；优选地，所述方法包括使用：(a)探针和/或引物，以检测全长[FL]MN/CA9mRNA，但不检测旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA；(b)探针和/或引物，以检测AS MN/CA9mRNA，但不检测FL MN/CA9mRNA；和/或(c)探针和/或引物，以检测FL和AS MN/CA9mRNA。一方面中，本发明的诊断预后方法利用旁路剪接MN/CA9核酸和全长MN/CA9核酸之间的差异，例如，通过将探针靶向存在于AS MN/CA9但不存在于FL MN/CA9mRNA中的剪接点，或靶向不存在于AS MN/CA9mRNA中，但存在于FL MN/CA9mRNA中的核酸序列。类似地，可设计引物对用于例如扩增仅在AS MN/CA9mRNA中发现但未在FL MN/CA9中发现(或反之亦然)的区域。鉴于本公开内容，本领域技术人员将能设计任意数目的有用于本发明的诊断/预后方法的探针和/或引物/引物对。
在人肿瘤发生前/肿瘤性疾病的优选诊断/预后方法中，本发明的一个或多个特别优选的探针和/或引物选自SEQ ID NOS：97-101及与SEQ IDNOS：97-101至少80％同源(更优选与SEQ ID NOS：97-101至少90％)的核酸序列。所述方法包括使用一个或多个探针和/或引物来检测或检测并定量FL和/或AS MN/CA9mRNA表达，还可包括测定FL∶AS MN/CA9mRNA的比率或FL∶AS MN/CA9mRNA比率随时间的变化。
此外，所述AS MN/CA9mRNA表达可用于指示MN/CA9基因正常表达，所述FL MN/CA9mRNA表达可用于指示MN/CA9基因异常表达，特别是所述AS和/或FL MN/CA9mRNA表达的水平，或者或另外地，所述AS MN/CA9mRNA表达可用于指示含氧量正常情况下MN/CA9基因表达，所述FL MN/CA9mRNA表达可用于指示低氧的情况下MN/CA9基因表达。此外，所述MN AS和/或FL mRNA表达的水平将具有特定的指示值。
所述包括使用一个或多个探针和/或引物来检测或检测并定量FL和/或AS MN/CA9mRNA表达的方法还可包括使用核酸扩增方法，优选选自以下的扩增方法：PCR、RT-PCR、实时PCR或实时定量RT-PCR以及本领域技术人员已知的同等核酸扩增方法。或者，所述用于检测或检测并定量FL和/或AS MN/CA9mRNA表达的方法可包括使用微阵列芯片。例如，所述微阵列芯片可包含结合于全长[FL]MN/CA9mRNA但不结合旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA的探针，和/或结合于AS MN/CA9mRNA但不结合FLMN/CA9mRNA的探针，其中策略地使所述探针定位在此类芯片上在本领域技术人员的能力范围内。
另一个方面，本发明涉及与哺乳动物中MN/CA IX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，包括区分FL和AS MN/CA IX的表达。优选地，所述方法包括使用一种或多种抗体区分肿瘤发生前/赘生性组织(neoplastic tissue)中FL和AS MN/CA IX的表达。所述方法可包括检测或检测并定量所述组织中的AS MN/CA IX；还可包括测定所述组织中FL MN/CA IX水平与AS MN/CA IX水平的比率。此外，所述FL∶ASMN/CA IX比率可用来指示所述组织中低氧的存在或程度。
本发明一种优选实施方案中，该诊断和/或预后方法包括检测或检测并定量脊椎动物组织中的FL MN/CA IX和AS MN/CA IX，其包括以下步骤：
(a)使所述样品同时或按序地与至少两种抗体、至少两种抗原结合抗体片段、或抗体和抗原-结合抗体片段的混合物接触，其中至少一种抗体/抗体片段特异性结合于FL MN/CA IX蛋白但不结合AS MN/CA IX蛋白，其中至少一种其他抗体/抗体片段特异性结合于FL和AS MN/CA IX两者；
(b)检测并定量所述样品中的抗体/抗体片段；和
(c)比较所述差异结合性(differentially binding)抗体/抗体片段的结合，以测定FL MN/CA IX和AS MN/CA IX的相对水平。
优选地，所述特异性结合于FL MN/CA IX但不结合AS MN/CA IX的抗体/抗体片段对MN/CA IX的碳酸酐酶(CA)结构域具有特异性；所述特异性结合FL MN/CA IX和AS MN/CA IX两者的抗体/抗体片段对MN/CA IX的蛋白聚糖样(PG)结构域具有特异性。更优选，所述对MN/CA IX的CA结构域具有特异性的抗体是是保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生的V/10单克隆抗体；所述对MN/CA IX的PG结构域具有特异性的抗体是保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)、ATCC名称编号为HB 11128的杂交瘤VU-M75产生的M75单克隆抗体。
此外，本发明涉及与脊椎动物中MN/CA IX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，包括检测或检测并定量合适的脊椎动物组织样品中的全长[FL]MN/CA IX蛋白但非旁路剪接[AS]MN/CA IX蛋白，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述样品与抗体或抗体片段接触，其中所述抗体或抗体片段特异性结合于FL MN/CA IX但不结合AS MN/CA IX；和
(b)检测并定量所述样品中所述抗体/抗体片段的结合。
所述脊椎动物优选哺乳动物，所述哺乳动物更优选人。
特异性结合于FL MN/CA IX但不结合AS MN/CA IX的示例性且优选的抗体或抗体片段是对MN/CA IX的碳酸酐酶(CA)结构域具有特异性的抗体或抗体片段。更优选，所述对MN/CA IX的CA结构域具有特异性的抗体是是保藏在比利时根特、登录号(accession No.)为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生的V/10单克隆抗体。
本发明特别优选的实施方案涉及与脊椎动物(优选哺乳动物)中MN/CAIX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，其包括检测或检测并定量脊椎动物(优选哺乳动物)的肿瘤发生前/赘生性样品(neoplastic sample)中的全长[FL]MN/CA9mRNA但非旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA，包括使所述样品中的mRNA与特异性结合FL MN/CA9mRNA但不结合AS MN/CA9mRNA的引物或探针接触。
本发明还涉及用来区分哺乳动物中旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA和全长[FL]MN/CA9mRNA表达的核酸探针和/或引物。如上所述，此类基于本发明公开内容的探针/引物的设计在本领域技术人员的能力范围之内。优选地，其中所述哺乳动物是人，所述探针和/或引物用来检测AS MN/CA9mRNA但不检测FL MN/CA9mRNA，所述探针或引物包含结合于MN/CA9基因的外显子7和10的剪接点的核酸。更优选，所述探针或引物具有SEQ ID NO：101的序列或与SEQ ID NO：101至少80％同源(更优选与SEQ ID NO：101至少90％同源)的序列。或者，其中所述哺乳动物是人，所述探针或引物用来检测FL MN/CA9mRNA但不检测AS MN/CA9mRNA，所述探针或引物包含结合于人MN/CA9基因的外显子8或外显子9的核酸，或结合于人MN/CA9基因外显子7和8的剪接点的核酸、或结合于人MN/CA9基因外显子8和9的剪接点的核酸、或结合于人MN/CA9基因外显子9和10的剪接点的核酸。更优选，所述用于检测人FL MN/CA9mRNA但不检测ASMN/CA9mRNA的探针或引物具有SEQ ID NO：100的序列或与SEQ IDNO：100至少80％同源(更优选与SEQ ID NO：100至少90％同源)的序列。本发明还涉及表达此类探针或引物的载体、和/或包含此类载体的宿主细胞、包含一个或多个此类探针的微阵列芯片。
本发明还涉及用来区分哺乳动物中旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA和全长[FL]MN/CA9mRNA表达的探针对和/或引物对。所述探针对和/或引物对可用于检测旁路剪接[AS]人MN/CA9mRNA但不检测全长[FL]人MN/CA9mRNA。用于检测旁路剪接[AS]人MN/CA9mRNA但不检测全长[FL]人MN/CA9mRNA的示例性且优选的探针对或引物对由SEQ ID NOS：99和101、或与SEQ ID NOS：99和101至少80％同源(更优选与SEQ ID NOS：99和101至少90％同源)的核酸序列组成。
或者所述探针对和/或引物用于检测全长[FL]人MN/CA9mRNA但不检测旁路剪接[AS]人MN/CA9mRNA。用于检测FL mRNA的示例性且优选的探针对或引物对仅由SEQ ID NOS：99和100、或与SEQ ID NOS：99和100至少80％同源(更优选与SEQ ID NOS：99和100至少90％同源)的核酸序列组成。在本发明另一种实施方式中，探针对和/或引物对用来检测AS人MN/CA9mRNA和FL人MN/CA9mRNA两者，所述AS mRNA和所述FL mRNA的长度不同。优选地，所述用于检测AS和FL人MN/CA9mRNA两者的探针对和/或引物对仅由SEQ ID NOS：97和98、或与SEQ ID NOS：97和98至少80％同源(更优选与SEQ ID NOS：97和98至少90％同源)的核酸序列组成。
本发明还涉及编码哺乳动物中的旁路剪接[AS]MN/CA IX的分离核酸。优选地，所述AS MN/CA IX的分子量为约43-约48千道尔顿。本发明还涉及表达此类核酸或其片段的载体、包含此类载体的宿主细胞和/或涉及通过重组、合成或其他生物学方法产生AS MN/CA IX蛋白和多肽。
所述分离核酸编码的示例性且优选的AS形式的MN/CA IX的特征还在于，它与对MN/CA IX的PG结构域具有特异性的抗体特异性结合，但不与对MN/CA IX的CA结构域具有特异性的抗体结合。本发明更优选的实施方案中，所述AS形式的MN/CA IX与M75单克隆抗体特异性结合，但不与V/10单克隆抗体结合，所述M75单克隆抗体由保藏在美国模式培养物保藏所、名为ATCC No.HB 11128的杂交瘤VU-M75分泌，所述V/10单克隆抗体由保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生。
更优选，所述哺乳动物是人，所述分离核酸特征在于删除了对应于外显子8和外显子9的核苷酸。更优选，所述分离的人核酸具有SEQ ID NO：108的核酸序列、或与SEQ ID NO：108至少80％同源(更优选与SEQ ID NO：108至少90％同源)的分离核酸。优选地，由SEQ ID NO：108或非常相关的序列编码的示例性AS形式的人MN/CA IX与M75单克隆抗体特异性结合，但不与V/10单克隆抗体结合，所述M75单克隆抗体由保藏在美国模式培养物保藏所、名为ATCC No.HB 11128的杂交瘤VU-M75分泌，所述V/10单克隆抗体由保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生。
此外，本发明涉及特异性结合AS MN/CA IX但不结合其他形式的MN/CA IX的抗体或抗原结合抗体片段。例如，此类AS-特异性抗体可以是特异性结合AS形式的MN/CA IX但不特异性结合FL形式的MN/CA IX的抗体或抗原-结合抗体片段；或特异性结合AS MN/CA IX但不特异性结合可溶性MN/CA IX(s-CA IX)的抗体或抗原结合抗体片段。
本文还公开了用于治疗哺乳动物肿瘤发生前/肿瘤性疾病的治疗方法，其中所述疾病与MN/CA IX的异常表达有关，这些方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的组合物，该组合物包含相对于全长[FL]MN/CA IX水平提高旁路剪接[AS]MN/CA IX水平的物质。所述AS MN/CA IX还包括干扰FL MN/CA IX活性的AS MN/CA IX的任何蛋白或多肽片段。优选地，所述增加的AS MN/CA IX相对水平干扰所述FL MN/CA IX的碳酸酐酶活性。所述物质可以优选处于生理学上可接受的载体中的AS MN/CA IX本身、表达AS MN/CA9mRNA的载体、阻断FL MN/CA IX但非AS MN/CA IX表达的反义寡核苷酸、表达所述反义寡核苷酸的载体、FL MN/CA9同工型特异性siRNA、或表达所述FL MN/CA9同工型特异性siRNA的载体。
例如，所述物质可以是靶向MN/CA9mRNA的外显子7和8、外显子8和9或外显子9和10的剪接点的FL MN/CA9同工型特异性siRNA。或者，所述物质是调节AS和/或FL MN/CA9前mRNA(pre-mRNA)剪接的反义寡核苷酸。
另一方面，本发明涉及相对于全长[FL]MN/CA IX水平提高旁路剪接[AS]MN/CA IX水平的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸用于治疗与MN/CA IX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病。例如，所述寡核苷酸可以是与FLMN/CA9前mRNA互补但不与AS MN/CA9前mRNA互补的寡核苷酸；优选地，所述寡核苷酸与MN/CA9mRNA的外显子7和8、外显子8和9或外显子9和10的剪接点互补。或者，所述相对于FL MN/CA IX水平提高AS MN/CA IX水平的寡核苷酸可以是与FL MN/CA9mRNA互补但不与AS MN/CA9mRNA互补的siRNA。
本发明还涉及一种体外方法，其用于鉴定能够调节旁路剪接[AS]MN/CA IX水平的物质，所述方法包括使表达AS MN/CA IX的细胞与怀疑调节细胞中所述AS MN/CA IX水平的物质接触，检测并定量所述ASMN/CA IX水平的变化。
参考文献
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缩写
本文使用了以下缩写：
Aa-氨基酸
AS-旁路剪接
ATCC-美国典型培养物保藏中心
bp-碱基对
BSA-牛血清白蛋白
CA-碳酸酐酶
CAM-细胞粘着分子
CARP-碳酸酐酶相关蛋白
cm-厘米
C-末端-羧基末端
CTL-细胞毒性T淋巴细胞
℃-摄氏度
DEAE-二乙氨基乙基
DMEM-Dulbecco改进的Eagle培养基
ds-双链
EDTA-乙二胺四乙酸盐
EGFR-表皮生长因子受体
EIA-酶免疫测定
ELISA-酶联免疫吸附测定
ER-雌激素受体蛋白
FCS-胎牛血清
FITC-异硫氰酸荧光素
FITC-CAI-荧光CA抑制剂(与FITC缀合(conjugated)的高磺胺)
FL-全长
FTP-脱氧核糖核酸酶1足迹法分析
GST-谷胱甘肽S-转移酶
GST-MN-融合蛋白MN谷胱甘肽-S转移酶
h-小时
H-低氧
HBS-HIF结合位点
HIF-低氧诱导因子
HRE-低氧响应元件
IC-胞质内的或胞内
IF-免疫荧光
IHC-免疫组织化学
IL-2-白介素-2
IP-使用A蛋白琼脂糖凝胶的免疫沉淀反应
kb-千碱基对
kd或kDa-千道尔顿
KS-角质素硫酸盐
M-摩尔
Mab或mab-单克隆抗体
min.-分钟
mg-毫克
ml-毫升
mM-毫摩尔
M-MuLV-鼠白血病病毒
N-标准浓度；正常含氧量(normoxia)
ND-未做
ng-纳克
nt-核苷酸
N-末端-氨基末端
ODN-寡脱氧核糖核苷酸
ORF-开放读框
PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS-磷酸盐缓冲盐水
PCR-聚合酶链式反应
PG-蛋白聚糖样区域
pI-等电点
RACE-cDNA末端快速扩增
RCC-肾细胞癌
RIA放射免疫测定
RIPA-放射免疫沉淀测定法
RNP-核糖核酸酶保护试验
RT-PCR-逆转录酶聚合酶链式反应
SDS-十二烷基硫酸钠
SDS-PAGE-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SP-信号肽
TC-组织培养
tk-胸苷激酶
TM-跨膜
Tris-三(羟基甲基)氨基甲烷
μg-微克
μl-微升
μM-微摩尔
VEGF-血管内皮细胞生长因子
细胞系
ACHN-人肾癌
C33a-人宫颈癌细胞[ATCC HTB-31；J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)32：135(1964)]
CAKI-1-人肾癌
Caski-人宫颈癌
CGL1-H/F-N杂交细胞HeLa D98/AH.2衍生物)
CGL2-H/F-N杂交细胞(HeLa D98/AH.2衍生物)
CGL3-H/F-T杂交细胞(HeLa D98/AH.2衍生物)
CGL4-H/F-T杂交细胞(HeLa D98/AH.2衍生物)
HeLa-人宫颈癌；来自美国模式培养物保藏所(ATCC)
MDCK-犬上皮细胞系，来源于表观(apparently)正常的成年雌性英国小猎犬(cocker spaniel)(ATCC CCL-34)(S.H.Madin和N.B.Barby，1958)
NIH3T3-Aaronson，Science，237：178(1987)中报道的鼠成纤维细胞系
SiHa-人子宫颈鳞状细胞癌细胞系[ATCC HTB-35；Friedl等，Proc.Soc. Exp.Biol.Med.，135：543(1990)]
核苷酸和氨基酸符号
本文用以下符号来代表核苷酸：
碱基
符号   含义
A      腺嘌呤
C      胞嘧啶
G      鸟嘌呤
T    胸腺嘧啶
U    尿嘧啶
I    肌苷
M    A或C
R    A或G
W    A或T/U
S    C或G
Y    C或T/U
K    G或T/U
V    A或C或G
H    A或C或T/U
D    A或G或T/U
B    C或G或T/U
N/X  A或C或G或T/U
有二十种主要氨基酸，各自用三个相邻的核苷酸的不同排列(三联体密码或密码子)表示，这些氨基酸以特定的顺序连在一起形成特征性蛋白。本文用如下3字母或1字母表示所述氨基酸，例如见下图1：
               3字母        1字母
氨基酸名称     缩写         缩写
丙氨酸         Ala          A
精氨酸         Arg          R
天门冬酰胺     Asn          N
天冬氨酸       Asp          D
半胱氨酸       Cys          C
谷氨酸         Glu          E
谷氨酰胺       Gln          Q
甘氨酸         Gly          G
组氨酸         His          H
异亮氨酸       Ile          I
亮氨酸         Leu          L
赖氨酸         Lys          K
甲硫氨酸      Met      M
苯丙氨酸      Phe      F
脯氨酸        Pro      P
丝氨酸        Ser      S
苏氨酸        Thr      T
色氨酸        Trp      W
酪氨酸        Tyr      Y
缬氨酸        Val      V
未知的或其他的         X
附图简述
图1提供小鼠CA IX剪接变体的鉴定和预测的结构。(A)小鼠Car9基因(GenBank# AY049077)的基因结构。(B)小鼠胃肠组织中Car9剪接变体的RT-PCR。[参见表2，见下文，实施例中所用的引物序列。](C)分离FL和AS转录物的扩增产物。(D)FL和AS氨基酸序列的比较。(E)小鼠AS CAIX蛋白的预测结构。
图2示出了小鼠AS CA IX的免疫印迹分析和定位。将含有小鼠AS cDNA的pSG5C-AS质粒分别转染到NIH3T3和MDCK细胞中。(A)使用抗小鼠CAIX的多克隆血清进行的AS-转染细胞的免疫印迹分析显示单一的AS相关性条带。(B)转染子的免疫荧光分析证明了小鼠AS蛋白的胞内定位。
图3提供人CA IX剪接变体的鉴定和预测的结构。(A)示意性说明人CA9基因(GenBank# Z54349)的基因结构。箭头显示引物的位置。[参见表2，实施例所用的引物序列。]旁路剪接排除的外显子为黑灰色。(B)人胃和小肠的CA9的RT-PCR分析，使用不区分各剪接变体的h1S-h6A引物[SEQ ID NOS：95和96]。(C)人组织中FL和AS转录物两者的扩增，使用h6S-h11A引物[SEQID NOS：97和98]。(D)从人FL和AS CA9 cDNAs推断的氨基酸序列的比较。信号肽(SP)用斜体字表示，蛋白聚糖样结构域(PG)用粗体表示，碳酸酐酶结构域(CA)加实线框表示，起始于氨基酸(aa)415的跨膜区域(TM)加虚线框表示。虚线代表在AS中删除的氨基酸残基。结合催化性锌的组氨酸和涉及S-S键形成的半胱氨酸单独地加虚线框表示。人FL和AS CA IX蛋白的预测结构。
图4示出了人肿瘤细胞系和人组织中AS CA IX变体的表达，人AS CA9的RT-PCR分析使用设计用于剪接变体的独立扩增的引物，用于FL的引物称为h7S-h8A[SEQ ID NOS：99和100]，A用于S的引物称为h7S-h10/7A[SEQID NOS：99和101](参见图3)。β-肌动蛋白用作标样。从以下来源分离cDNAs：(A)暴露于正常含氧量(N)和低氧(H)48小时的细胞，(B)以低和高密度培养72小时的细胞，和(C)人的正常组织和赘生性组织。结果显示，AS的表达是稳定的，不依赖于低氧、密度和肿瘤表型。
图5示出了人AS CA IX的定位和寡聚。用pSG5C质粒中的AS CA9cDNA永久性转染CA IX阴性MDCK细胞和天然低氧-诱导表达FL CA IX的HeLa细胞。(A)使用既识别AS蛋白又识别FL蛋白的M75MAb进行AS转染细胞(AS)、FL转染细胞(FL)和对照细胞(模拟的)的免疫荧光分析。(B)HeLa-AS和对照HeLa细胞的蛋白提取物和培养基的免疫印迹分析。用M75MAb检测AS-转染的细胞的提取物以及培养基中的AS CA IX变体。
图6示出了FL和AS剪接变体形成寡聚物的能力。(A)非还原SDS-PAGE和用M75进行的免疫印迹分析表明，AS不能形成寡聚物。(B)通过用MAbV/10(识别FL但不识别AS)或M75(识别这两种变体)进行HeLa-AS提取物的免疫沉淀反应，检测寡聚物形式的剪接变体。使用过氧化物酶-标记的M75使沉淀的寡聚物的组分显现。
图7示出了过度表达的AS变体对酸化、抑制剂结合和球状体形成的影响。(A)分别在正常含氧量和低氧下培养AS转染的HeLa细胞和相关模拟转染的对照细胞48h，试验结束时立即检测培养基的胞外pH值。数据表示为含氧量正常细胞vs低氧细胞中检测到的pH值之间的差异(ΔpH)，包括标准偏差。结果表明AS的表达降低低氧下FL CA IX蛋白介导的酸化。(B)在MDCK-AS转染子的条件培养基中不存在(对照)或存在分泌的AS变体的情况下，用荧光CA抑制剂(FITC-CAI)处理组成型表达人FL CA IX蛋白的经MDCK-CA IX转染的细胞48小时。条件培养基与新鲜的培养基混合。FITC-CAI仅结合低氧细胞，并在AS蛋白的存在下显著被降低。(C)用一半(1/2AS)或者三分之一(1/3AS)的来自MDCK-AS细胞的条件培养基重复进行同样的实验。用Scion影像软件利用获得的影像评价FITC-CAI的结合和相应的荧光。数据表示为无AS的情况下阳性对照的百分比，其中与FITC-CAI一起培养的低氧MDCK-CA IX细胞代表阳性对照。结果证实，AS降低FITC-CAI对CA IX的结合。(D)分别显示生长自对照模拟转染的HeLa细胞和AS转染的HeLa细胞的球状体的显微影像。对照HeLa细胞表达低氧诱导的、功能性FL CA IX蛋白并产生形成紧凑核心的球状体。含有低氧诱导的FL CA IX和组成型表达AS两者的HeLa-AS细胞含有松散的核心，这可能是由于AS相对于FL的功能减弱，从而导致低氧核心细胞的存活量减少。
图8A-C提供如本文所述分离的MN cDNA克隆的核苷酸序列[SEQID NO：1]。Figure 8A-C还显示该cDNA编码的预测的氨基酸序列[SEQID NO：2]。
图9A-F提供MN的完全10,898bp基因组序列[SEQ ID NO：3]。碱基计算如下：2654A；2739C；2645G；和2859T。11个外显子一般以大写字母表示，但通过核糖核酸酶保护试验测定认为外显子1从位置3507开始。
图10是人MN基因的推定启动子的核苷酸序列[SEQ ID NO：24]。核苷酸从根据核糖核酸酶保护试验测得的转录起始位点开始编号。列出了可能的调控元件。转录起始位点用相应核苷酸上面的星号(核糖核酸酶保护)和点(RACE)表示。第一个外显子序列在星号下开始。MN4启动子片段的FTP分析显示，5个区域(I-V)在编码和非编码链上均受保护，两个区域(VI和VII)在编码链受保护但在非编码链不受保护。
发明详述
MN/CA IX蛋白作为控制pH值和细胞粘着的调节机制的一部分而在功能上与肿瘤发生有关。MN/CA IX主要在低氧下通过HIF-1途径被诱导；HIF-1也可能通过不同的胞外信号和致癌变化而在正常含氧量情况下表达，所述胞外信号和致癌变化例如高细胞密度、通过PI3K途径传导，这些能够导致MN/CA IX表达增加。HIF 1和PI3K途径均增加HIF-1蛋白水平，而这种增加能够被转换为增加的MN/CA IX水平。
如以下实施例所示，发明人发现，除编码低氧诱导的、具有高度酶活性和调节pH能力的CA IX蛋白的全长(FL)CA9转录物之外，还有丰度较小的、组成型-产生的、旁路剪接(AS)CA9转录物。如以下实施例2证明的，人CA9mRNA的旁路剪接变体不含有外显子8和9，不依赖于低氧而在肿瘤细胞中表达。在没有全长转录本时也可在正常组织中检测到所述剪接变体，因此，基于对低氧-和癌症-相关性CA9表达而进行的预后研究中会产生假阳性数据。该剪接变体编码截短的、缺少催化结构域的C-末端部分的CAIX蛋白，其显示减少的催化活性，定位在胞内或被分泌。过度表达时，其降低全长CA IX蛋白酸化低氧细胞的胞外pH和结合碳酸酐酶抑制剂的能力。实施例4和5描述的实验表明，人AS CA IX变体不限于质膜上，当过度表达时干扰FL蛋白的功能。实施例5中，用剪接变体cDNA转染的HeLa细胞产生不形成紧凑核心的球状体，这暗示它们不能适应低氧应激。这种AS能力可能在轻微低氧的条件下尤其相关，此时细胞不遭受严重的酸中毒，也不需要过多的pH控制。
不依赖于低氧-和肿瘤-的CA IX AS变体产生对CA IX的诊断、预后和治疗方面有很多意义。未来对全长CA9mRNA(编码功能性的CA IX蛋白)进行的诊断/预后研究可设计用来避免同时检测到旁路剪接变体的探针/引物，癌症治疗可基于CA9旁路剪接，例如通过设计用于反义和RNA干涉治疗以及其他治疗的寡核苷酸。
肿瘤发生前/肿瘤性疾病
作为本发明的诊断/预后和治疗方法的对象的肿瘤发生前/肿瘤性疾病(以及受影响的组织)是与MN/CA IX异常表达相关的那些疾病。本文所用的“肿瘤发生前/赘生性组织”也可包括体液内的肿瘤发生前/肿瘤细胞。优选地，所述肿瘤发生前/肿瘤性疾病选自乳腺、尿路、膀胱、肾、卵巢、子宫、子宫颈、子宫内膜、鳞状上皮细胞、腺鳞细胞、阴道(vaginal)、阴门、前列腺、肝脏、肺、皮肤、甲状腺、胰腺、睾丸、脑、头颈、中胚层、肉瘤性(sarcomal)、胃、脾、胃肠、食管、以及结肠的肿瘤发生前/肿瘤性疾病。
正常含氧量和低氧
本文所用的“正常含氧量″定义为具体哺乳动物组织中的氧张力(oxygentension)水平，其位于该组织的正常生理氧张力水平范围内。本文所用的“低氧”定义为稳定具体组织或细胞中的HIF-1α所需的氧张力水平。实验诱导的低氧通常为2％pO2或更低，但高于缺氧(0％pO2，因为缺氧会导致死亡)。涉及低氧的本文所述实施例是在2％pO2下进行的，这是一种示例性的低氧条件。然而，本领域技术人员可以预期可理解为“低氧”并产生类似的试验结果的其他的氧张力水平。例如，Wykoff等[Cancer Research，60：7075-7083(2000)]使用了0.1％pO2作为代表性低氧条件来诱导CA9的HIF-1α-依赖性表达。Tomes等描述了在示例性体外低氧条件，即0.3％、0.5％、和2.5％pO2条件下HeLa细胞或初级人乳腺成纤维细胞中不同程度的HIF-1α稳定和CA9表达[Tomes等，Br.Cancer Res.Treat.81(1)：61-69(2003)]。或者，Kaluz等使用了示例性低氧条件0.5％pO2用于试验诱导CA9[Kaluz等.，Cancer Res.，63：917-922(2003)]，指出低氧的“实验诱导范围”是0.1-1％pO2[Cancer Res.，62：4469-4477(2002)]。
高于2％pO2的氧张力水平也可能是低氧，如Tomes等所示，见上文。基于对HIF-1α稳定性的测定，本领域技术人员将能确定某一条件是否为本文所定义的低氧。具体组织或细胞中的示例性低氧范围可以是例如，约3％-约0.05％pO2，约2％-约0.1％pO2，约1％-约0.1％pO2，约0.5％-约0.1％pO2。
MN基因和蛋白
术语“CA IX“和“MN/CA9“在本文认为与MN同义。另外，认为G250抗原指MN蛋白/多肽。
Zavada等，WO 93/18152和/或WO 95/34650公开了MN cDNA序列[SEQ ID NO：1](示于本文图8中)，MN氨基酸顺序[SEQ ID NO：2](也示于图8中)，以及MN基因组序列[SEQ ID NO：3](示于本文图9中)。MN基因包括11个外显子和10个内含子。
示于图8中的MN cDNA的ORF能编码459个氨基酸的蛋白，计算分子量为49.7kd。MN蛋白的总体氨基酸组成偏酸性(rather acidic)，预测pI为4.3。通过双向电泳和而后的免疫印迹对CGL3细胞自身产生的MN蛋白进行分析显示，与计算机预测一致，MN是一种酸性蛋白质，存在几种等电位形式，pI范围是4.7-6.3。
示于图8中的MN蛋白的头37个氨基酸是推定的MN信号肽[SEQ IDNO：4]。MN蛋白具有胞外结构域[图8的氨基酸(aa)38-414][SEQ ID NO：5]、跨膜结构域[aa 415 434；SEQ ID NO：6]和胞内结构域[aa 435-459；SEQID NO：7]。胞外结构域含有蛋白聚糖样结构域[aa 53-111：SEQ ID NO：8]和碳酸酐酶(CA)结构域[aa 135-391；SEQ ID NO：9]。
CA结构域对锚定独立性(anchorage independence)非常重要，而TM锚和IC尾对该生物效应不是必要的。MN蛋白在转染的细胞中还能够造成质膜皱褶，似乎参与细胞对固相支持体的附着。数据证明MN参与调控细胞增殖、粘着和细胞间通讯。
MN基因-克隆和测序
图8A-C提供全长MN cDNA克隆的核苷酸序列[SEQ ID NO：1]。图9A-F提供MN完全基因组序列[SEQ ID NO：3]。建议的MN启动子的核苷酸序列[SEQ ID NO：24]示于图9A-F(nt 3001-3540)和图10中。
应理解，由于遗传密码简并，即，多于一种密码子编码一个氨基酸[例如，密码子TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG各编码氨基酸亮氨酸(leu)]，核苷酸序列例如SEQ ID NOS：1和3的变化(其中一种密码子被另一种密码子代替)可以产生与本发明蛋白或多肽基本上等同的蛋白或多肽。所有这些MN cDNA核苷酸序列和互补核酸序列的变化均包括在本发明范围内。
还应理解，本文描述并示于图8、9和10中的核苷酸序列仅代表本文分离和描述的cDNA、基因组和启动子核苷酸序列的精确结构。预期将发现经稍微修饰的核苷酸序列或可通过本领域已知技术来对其修饰，以编码基本上相似或同源的MN蛋白和多肽(例如具有相似的表位的那些MN蛋白和多肽)，就本发明目的而言，认为此类核苷酸序列和蛋白/多肽是等同的。
认为具有等同密码子的DNA或RNA在本发明范围内，这些DNA或RNA是编码与MN蛋白/多肽同源或基本同源的蛋白/多肽的合成核酸序列，以及能够在严格条件下与所述示例性序列[SEQ.ID.NOS.1、3和24]杂交的那些核酸序列，或如果不是由于遗传密码的简并性将能够在严格杂交条件下与所述cDNA核酸序列杂交的那些核酸序列。认为本文指出的核酸序列的修饰和变化产生了与示例性MN序列及其片段基本上相同的序列。
只有具有至少80-90％(优选至少90％)的同源性的非常密切相关的核苷酸序列才能够在严格条件下彼此杂交。示于图8中的MN cDNA序列和对应的人碳酸酐酶II(CA II)cDNA的序列比较表明，这两种序列间的同一性不足以使具有25个或更多核苷酸的CA II cDNA序列片段在严格杂交条件下与MN cDNA杂交，反之亦然。
本文考虑的严格杂交条件与本领域理解的标准杂交条件一致。例如，通常理解严格条件包括相对低盐和/或高温条件，例如0.02M-0.15M NaCl，温度50℃-70℃。可通过加入递增量的甲酰胺(其作用是像提高温度一样使杂交双链不稳定)使较不严格的杂交条件(例如0.15-0.9M盐、温度20℃-55℃)变得更加严格。
示例性严格杂交条件描述在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1.91和9.47-9.51页(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press；Cold Spring Harbor，N.Y.；1989)；Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第387-389页(Cold SpringHarbor Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.；1982)；Tsuchiya等，Oral Surgery，Oral Medicine，Oral Pathology，71(6)：721-725(1991年6约)；美国专利No.5,989,838、美国专利No.5,972,353、美国专利No.5,981,711和美国专利No.6,051,226。
含有MN基因组序列(SEQ ID NO：3)的质粒-A4a克隆及XE1和XE3亚克隆于1995年6月6日保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)，ATCC保藏号分别为97199、97200和97198。
完整的MN基因组区域的外显子-内含子结构
重叠克隆的全序列含有10,898bp(SEQ ID NO：3)。人MN基因含有11个外显子以及2个上游的、6个内含子中的(intronic)Alu重复元件。除了第一个外显子为445bp外，所有的外显子都较小，为27-191bp。内含子大小为89-1400bp。CA结构域由外显子2-8编码，而外显子1、10和11分别对应MN/CA IX蛋白的蛋白聚糖样结构域、跨膜锚和胞质尾。下表1列出了与包括AG-GT基序的共有剪接序列[Mount Nucleic Acids Res.10：459-472(1982)]一致的剪接供体和受体序列。
表1
人MN基因的外显子-内含子结构
Figure A20078004527100331
＊＊位置涉及包括5′侧翼区的整体基因组序列[图9A-F]的核苷酸计数。
＊数字对应于下文通过核糖核酸酶保护试验测定的转录起始位点。
MN基因转录起始和终止位点的定位
Zavada等，WO 95/34650描述了定位MN基因转录起始和终止位点的方法步骤。核糖核酸酶保护试验用于MN基因5′末端的精细定位。探针是均匀标记的470个核苷酸的RNA(核苷酸-205至+265)[SEQ ID NO：66]，将其杂交于表达MN的HeLa和CGL3细胞中的总RNA，在测序凝胶上分析。分析显示，MN基因转录在多位点起始，最长的MN转录物的5′末端比之前用种族鉴定的长30核苷酸。
小鼠Car9cDNA
先前已经描述了编码小鼠CA IX的cDNA和基因的克隆和表征[Ortova-Gut等，Gastroenterology，123：1889-1903(2002)]。用衍生自人cDNA的引物和从C57BL/6J小鼠胃中分离到的模板RNA进行RT-PCR从而分离小鼠Car9cDNA片段。在5’/3’两个方向进行cDNA末端的快速扩增以获得全长cDNA。它包括1982bp，由以下区域组成：49bp的5’非翻译区，1311bp的开放读框和622bp的3’非翻译序列(保存在EMBL数据库中，登录号为AJ245857；SEQ ID NO：71)。
Car9cDNA能编码437个氨基酸的蛋白(保存在EMBL数据库中，登录号为CAC80975(Q8VDE4)；SEQ ID NO：73)，理论分子量为47.3kDa。该小鼠蛋白与它的人同源物显示69.5％的序列同一性，并且具有相似的预测结构域排列[Opavsky等(1996)]。氨基酸(aa)1-31(SEQ ID NO：74)对应于信号肽。成熟蛋白质的N-末端胞外区(aa 32-389)(SEQ ID NO：75)由以下区域组成：蛋白聚糖样区域(aa 48-107)(SEQ ID NO：76)、碳酸酐酶结构域(aa112-369)(SEQ ID NO：77)。C-末端区域(aa 390-437)(SEQ ID NO：78)由以下区域组成：跨膜锚(aa 390-411)(SEQ ID NO：79)和短的胞质尾区(aa 412-437)(SEQ ID NO：80)。小鼠和人CA IX之间的大多数序列差异发现于蛋白聚糖样(PG)区域内，而CA结构域显示保守性最高。然而，涉及酶活性位点的5个关键氨基酸(His94，His96，Glu106，His119，Thr199)[Christianson和Cox，Annu.Rev.Biochem.，68：33-57(1999)]中，在人CA IX中都是保守的，但在小鼠同工酶中有一个发生了变化(Thr199→Ser)。尽管存在该取代，但小鼠CA IX仍然结合于氨磺酰琼脂糖，暗示它可能具有酶活性。
Car9cDNA的可用性允许分析小鼠组织中Car9mRNA的表达模式。利用设计用来检测编码CA结构域的区域的3’部分的170bp核糖探针(riboprobe)进行核糖核酸酶保护试验(RNP)。正如基于在人和大鼠组织中的分布所预期的，在小鼠胃中检测到最高水平的Car9mRNA。在小肠和结肠中发现了中等水平的Car9mRNA，而肾和脑显示非常弱的表达。肝脏和脾显示阴性结果。值得注意的是，RNP信号也存在于E18.5胚胎日龄的小鼠胚胎中，但不存在于胚胎干细胞和E10.5胚胎中。这可显示CA IX在小鼠胃肠道发育过程中的作用。
小鼠Car9基因的结构
为了分离Car9基因并测定其结构，使用全长Car9cDNA筛选小鼠胚胎干细胞129/Ola基因组文库(载体为pBAC108L)。通过对小鼠野生型基因组DNA的限制性内切酶图析和DNA印迹分析，证实获得一个BACM-355(G13)克隆，它含有完整的Car9基因组序列。将来源于该克隆的三个重叠基因组片段亚克隆入pBluescript II KS。
基因组序列(GenBank登录号AY049077；SEQ ID NO：72)分析显示，Car9基因覆盖了6.7kb的小鼠基因组，由11个外显子和10个内含子组成。内含子的分布和外显子与蛋白结构域的关系与人中对应的基因类似[Opavsky等(1996)]。Southern杂交模式指出Car9是单拷贝基因。覆盖5.9kb并跨越启动子区域和外显子1-6的EcoRI-HindIII片段用于构建目标载体。
MN蛋白和/或多肽
短语“MN蛋白和/或多肽“(MN蛋白/多肽)在本文定义为指MN基因或其片段编码的蛋白和/或多肽。根据本发明的示例性且优选的MN蛋白的推定的氨基酸序列示于图8中。优选的MN蛋白/多肽是与图8中所示的MN蛋白具有显著同源性的那些蛋白和/或多肽。例如，此类显著同源的MN蛋白/多肽是与本发明的MN-特异性抗体(优选Mabs M75、V/10、MN12、MN9和MN7或它们的等同物)反应的那些。分泌M75Mab的VU-M75杂交瘤于1992年9月17日保藏在ATCC，保藏号为HB 11128。
“多肽”或“肽”是通过肽键共价连接的一串氨基酸，本文认为由50个或更少的氨基酸组成。“蛋白”在本文定义为由超过50个氨基酸组成的多肽。术语多肽涵盖术语肽和寡肽。本文所用的“AS MN/CA IX”、“AS CAIX”或“AS MN”指由MN/CA9mRNA的AS形式编码的蛋白和/或多肽。
MN蛋白显示几种有趣的特点：细胞膜定位、HeLa细胞中的细胞密度依赖性表达、与HeLa x成纤维体细胞杂种的致瘤表型相关、以及在很多人赘生性组织以及其他组织中表达。MN蛋白可直接在赘生性组织切片中找到，但通常在相应的正常组织中找不到(如上所述在正常胃粘膜和胆囊组织中例外)。MN有时也在显示发育不良和/或恶性的组织样本的形态上看上去正常的区域中表达。综合起来，这些特点表明，MN参与调控细胞增殖、分化和/或转化。
可以理解，体内赘生性细胞产生的蛋白或多肽可能与细胞培养中的肿瘤细胞或转化的细胞所产生的蛋白或多肽序列不同。因此，具有改变的氨基酸序列(包括但不限于氨基酸取代、延伸、缺失、截短及它们的组合)的MN蛋白和/或多肽均落在本发明范围内。也可以理解，存在于体液内的蛋白可经历降解过程，例如蛋白水解过程；因此，可在体液(例如血清)中发现显著截短的MN蛋白和MN多肽。短语“MN抗原”在本文用于涵盖MN蛋白和/或多肽。
还可以理解，可通过遗传技术来修饰MN蛋白和多肽的氨基酸序列。可删除或取代一个或多个氨基酸。此类氨基酸改变可不引起该蛋白或多肽的生物活性的任何可测量的变化，并产生本发明范围内的蛋白或多肽以及MN突变蛋白。
根据本发明，可通过多种方式制备本发明的MN蛋白和多肽，例如，可通过重组、合成或生物学方法(即酶法和/或化学方法裂解较长的蛋白和多肽)来制备。优选的MN蛋白制备方法是重组方法。
MN蛋白和多肽重组体的产生
制备MN蛋白(例如示于图8中的MN蛋白或其片段)的一种代表性方法是将全长MN cDNA或其合适的片段插入合适的表达载体。Zavada等WO 93/18152(见上文)中描述了使用部分cDNA在载体pGEX-3X(Pharmacia)中生产融合蛋白GEX-3X-MN(现在称为GST-MN)。非糖基化GST-MN(MN融合蛋白MN谷胱甘肽S-转移酶)来自XL1-Blue细胞。
Zavada等WO 95/34650描述了使用表达质粒pEt-22b[Novagen Inc.；Madison，WI(USA)]从昆虫细胞表达糖基化的MN蛋白和从大肠杆菌表达非糖基化MN蛋白而进行的重组体生产。用重组杆状病毒表达载体感染昆虫细胞。在杆状病毒-感染的sf9细胞中重组产生糖基化的MN 20-19蛋白[Clontech；Palo Alto，CA(USA)]。
MN-特异性抗体的制备
本文定义的术语“抗体”不仅包括完整抗体，而且包括抗体的生物学活性片段，优选含有抗原结合区域的片段。对MN蛋白和另一种组织特异性抗原均具有特异性的双特异性抗体也包括在抗体的定义中。
可用有用于本发明方法中的抗体可通过常规方法制备和/或通过遗传工程制备。抗体片段可以是经过遗传工程化的，优选来自轻链和/或重链(VH和VL)的可变区，包括高变区，更优选来自VH和VL两种区域。例如，本文所用术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体及其生物学活性片段，包括“一价”抗体及其它可能性；Fab蛋白，包括Fab’和共价或非共价聚集的F(ab)2片段；单独的轻链或重链，优选重链和轻链的可变区(VH和VL区域)，更优选包括高变区[或者称为VH和VL区的互补决定域(CDRs)]；Fc蛋白；能结合多于一种抗原的“杂合”抗体；恒变区嵌合体(constant-variable regionchimeras)；带有不同来源的重链和轻链的“复合”免疫球蛋白；用标准重组技术和寡核苷酸定向诱变技术[Dalbadie-MacFarland等，“Oligonucleotide-directed mutagenesis as a general and powerful methodfor studies of protein function，”PNAS USA 79：6409(1982)]制备的特异性及其他特征改进的“改变型”抗体。
对于很多用途，特别是药物用途或体内示踪而言，部分或更优选地，特别合适的是部分或更优选完全人源化的抗体和/或生物学活性抗体片段。可用本领域公知方法制备此类人源化抗体/抗体片段。
可用任何常规方式将本发明的用于鉴定MN蛋白/多肽的抗体标记，例如用酶，例如辣根过氧化酶(HRP)、荧光化合物或用放射性同位素，例如125I以及很多其他标记。根据本发明的一种优选的标记是125I，优选的抗体标记方法是用氯胺-T。[Hunter，W.M.，″Radioimmunoassay，″：Handbook of Experimental Immunology 14.1-14.40页(D.W.Weir编；Blackwell，Oxford/London/Edinburgh/Melbourne；1978)]。其他的示例性标记可包括例如别藻蓝蛋白及藻红蛋白等。
Zavada等WO 93/18152和WO 95/34650详细描述了产生MN-特异性抗体的方法以及制备代表性MN-特异性抗体，如M75、MN7、MN9和MN12单克隆抗体的详细步骤。
表位
MAb对含有表位的肽的亲合力取决于具体情况，例如，所述肽是否是短序列(4-6aa)，或是否这种短肽的一侧或两侧侧接了较长的aa序列，或在测试表位时，肽是否在溶液中或固定在表面上。因此，本领域技术人员能够预期，本文描述的MN特异性MAbs的代表性表位将根据所用的MAb的具体情况而不同。
术语“对应于MN蛋白多肽的表位”应理解为包括这种实际的可能性，即，在有些情况下，天然存在的蛋白或多肽的氨基酸序列变化可能是抗原性的，并带来抗肿瘤性疾病的保护性免疫和/或抗致瘤性作用。可能的序列变化包括但不限于氨基酸取代、延伸、缺失、截短、插入及它们的组合。假设含有这些氨基酸序列变化的蛋白或多肽是免疫性的，并且这些多肽或蛋白引发的抗体在作为疫苗给药时，与天然存在的MN蛋白和多肽交叉反应的程度足够提供保护性免疫和/或抗致瘤性活性，则此类氨基酸序列变化均落在本发明范围内。
PG结构域和邻近区域的免疫显性表位
如上所述，全长CA IX的胞外结构域含有PG和CA结构域以及一些间隔区或也许有一些绞链区。CA IX免疫显性表位主要在PG区域中，在大约aa 53-111(SEQ ID NO：8)或在大约aa 52-125(SEQ ID NO：81)，现在认为优选在大约aa 52-125(SEQ ID NO：81)。CA IX的免疫显性表位可位于邻近PG区域的区域内。例如，aa 36-51(SEQ ID NO：21)的表位认为是免疫显性表位。
主要的CA IX免疫显性表位是针对M75mab的表位。M75单克隆抗体被认为是针对CA IX的蛋白聚糖样(PG)区域的N-末端中的免疫显性表位。氨基酸序列的比对说明MN/CA IX蛋白的PG区域(aa 53-111)[SEQ ID NO：8]和人聚集蛋白聚糖(aa 781-839)[SEQ ID NO：10]之间有显著同源性。M75的表位已鉴定为氨基酸序列PGEEDLP(SEQ ID NO：11)，其是CA IX的氨基末端PG区域中的4x相同的重复[Zavada等(2000)]。也可与M75mab结合的非常相关的表位(这些也是示例性的免疫显性表位)包括例如，可在图8A-8C(显示预测的CA IX氨基酸序列)的氨基酸(aa)61-96(SEQ ID NO.12)中发现的免疫显性6X串联重复。PG结构域中的免疫显性串联重复表位的变化包括GEEDLP(SEQ ID NO：13)(aa 61-66、aa 79-84、aa 85-90和aa91-96)、EEDL(SEQ ID NO：14)(aa 62-65、aa 80-83、aa 86-89、aa 92-95)、EEDLP(SEQ ID NO：15)(aa 62-66、aa 80-84、aa 86-90、aa 92-96)、EDLPSE(SEQ ID NO：16)(aa 63-68)、EEDLPSE(SEQ ID NO：17)(aa 62-68)、DLPGEE(SEQ ID NO：18)(aa 82-87、aa 88-98)、EEDLPS(SEQ ID NO：19)(aa 62-67)和GEDDPL(SEQ ID NO：20)(aa 55-60)。其他的免疫显性表位可包括例如，aa 68-91(SEQ ID NO：22)。
单克隆抗体MN9和MN12被认为是分别针对氨基末端PG区域SEQ IDNOS：19-20内的免疫显性表位。MN7单克隆抗体可针对邻近PG区域位于图8A-8C的aa 127-147(SEQ ID NO：23)的免疫显性表位。
CA结构域(SEQ ID NO：9)内优选的表位来自约aa 279-291(SEQ IDNO：67)。胞内结构域(IC结构域(SEQ ID NO：7)内优选的表位来自于约aa435-450(SEQ ID NO：68)。
SEQ ID NO：69(图8A-8C的aa 166-397)被认为是CA结构域的一种重要的抗原成分。CA结构域内有几个抗原位点。在CA IX-缺失小鼠中已制备了四组CA IX特异性单克隆抗体，以使它们针对CA结构域；其中三组在SEQ IDNO：69内。抗原位点还可部分地位于氨基酸135-166(SEQ ID NO：84)上。特异性结合MN蛋白的碳酸酐酶结构域的示例性优选MN特异性抗体是保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生的V/10单克隆抗体。
试验
筛选组织中的AS和FL MN/CA IX表达的试验
这些方法可包括在取自诊断患有肿瘤发生前/肿瘤性疾病的病人的样品中筛选AS和/或FL MN/CA9基因表达产物(如果有的话)；MN/CA9基因表达产物可以是AS或FL形式的MN蛋白、MN多肽、编码MN蛋白或多肽的mRNA、对应于编码MN蛋白或多肽的mRNA的cDNA等。
可使多种形式适合用于本发明的方法。例如可通过核酸扩增方法例如使用PCR、RT-PCR、实时PCR、或实时定量RT-PCR或通过利用微阵列芯片进行AS和/或FL MN mRNA的检测和定量。AS和/或FL MN蛋白或MN多肽的检测和定量可通过以下试验进行：蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫测定、竞争免疫测定、双抗体夹心试验、免疫组织化学染色试验、凝集试验、荧光免疫测定、使用免疫金的免疫电子和扫描显微镜法以及本领域通常所知的其他试验。这些试验中MN AS和/或FL基因表达产物的检测可通过本领域已知的常规方法来进行。
核酸探针和/或引物
本发明的核酸探针和/或是含有与图8所示MN cDNA序列[SEQ ID NO：1]或其他的MN基因序列(例如图9A-F所示的完整基因组序列[SEQ ID NO：3])互补或基本上互补的序列的那些。短语“基本上互补”在本文定义为本领域充分理解的含义，因此用在标准杂交条件的背景(context)中。可调节杂交条件的严格性以控制互补的精确性。如果两个核酸在严格杂交条件下彼此杂交，则这两个核酸是例如基本上彼此互补的。如上所述，只有具有至少为80-90％(优选至少90％)的同源性的非常相关的核苷酸序列才会在严格条件下彼此杂交。
可用于本发明的尤其优选的探针和/或引物是区分全长[FL]和旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA表达的探针和/或引物。很多最近的文章提供了有关癌症中的旁路剪接的一般信息和有关用于检测癌症相关基因表达的mRNA变体的特异性探针和/或引物设计的具体信息，根据这些信息，可设计用于检测AS和/或FL CA9mRNA变体的探针和/或引物[参见，例如Matlin等，Nat Rev Mol Cell Biol，6：386-398(2005)；Venables JP，BioEssays，28：378-386(2006)；Skotheim和Nees，Int J Biochem Cell Biol.，39(7-8)：1432-1449(2007)；Srebrow和Kornblihtt，J Cell Sci.，119(Pt 13)：2635-2641(2006)；Gothie等.，J Biol Chem，275：6922-6927(2000)；Robinson等.，JCell Sci.，114：853-865(2001)；He等.，Oncogene，25：2192-2202(2006)；Roy等.，Nucleic Acids Res.，33(16)：5026-5033(2005)；Taconelli等.，Cancer Cell，6：347-360(2004)]。一种方法中，仅用于检测FL CA9mRNA的至少一种探针或引物全部或部分来源于在AS CA9mRNA中被删除的区域内，而仅用于检测AS CA9mRNA的至少一种探针或引物来源于旁路剪接产生的结点。例如，人FL MN/CA9-特异性探针/引物可包含以充分的特异性结合(优选特异性结合)于人MN/CA9基因的外显子8或外显子9的核酸，或以充分的特异性结合(优选特异性结合)于人MN/CA9基因的外显子7和8的剪接点、外显子8和9的的剪接点或外显子9和10的剪接点的核酸；或可包含与那些序列充分同源从而其以足够的特异性进行结合(或优选特异性结合)的任何核酸。类似地，人AS MN/CA9特异性探针/引物可包含以足够的特异性与人MN/CA9基因的外显子7和外显子10的剪接点的结合(优选特异性结合)的核酸；或可包含充分同源从而以足够的特异性与该剪接点的结合(或优选特异性结合)的任何核酸。或者，探针和/或引物可用于检测FL和AS CA9mRNA两者，且FL和AS mRNA产物的长度有别，例如可在凝胶上区分。
基于MN旁路剪接变体的癌症治疗方法
很多文章讨论了基于癌症相关基因的旁路剪接变体的癌症治疗方法，并提供了用于反义和RNA干扰治疗以及其他治疗方法的寡核苷酸的设计策略[例如，Garcia-Blanco，Curr Opin Mol Ther.，7(5)：476-482(2005)；Wilton和Fletcher，Curr Gene Ther.，5(5)：467-483(2005)；Pajares等，Lancet Oncol.，8(4)：349-357(2007)；Xing Y.，Front Biosci.，12：4034-4041(2007)]。例如，本领域一般技术人员可分别从SEQ ID NOS：1和108的核酸序列确定对人FL CA9mRNA有特异性但对人AS CA9mRNA没有特异性的合适的反义核酸序列，优选反义寡核苷酸。
除了由AS形式的CA9mRNA表达的完整AS MN/CA IX之外，本领域技术人员可以预期，分离的AS MN/CA IX蛋白或多肽片段将能够干扰FLMN/CA IX活性。因此，干扰FL MN/CA IX活性的衍生自AS MN/CA IX的任何蛋白或多肽都考虑在本发明的治疗方法的范围内。
MN RNA干扰(MN RNAi)
可例如利用对MN基因表达的RNA干扰作用来抑制MN基因的表达。RNA干扰是一种使用RNA来抑制基因表达的方法，如近年已报道[Elbashir等.，Nature，411：494-498(2001)]。更具体地说，可使用对MN基因的具体mRNA剪接变体(例如FL剪接变体)的表达显示RNA干扰作用的一种或多种寡核苷酸来抑制MN基因的表达。
可通过用含有cDNA片段的载体或其互补RNA转染细胞来抑制MN基因的mRNA剪接变体的表达。因此，含有所述寡核苷酸的用于抑制MN剪接变体的物质也包括在本发明范围内。用于抑制MN mRNA剪接变体的物质可含有一种寡核苷酸，或可含有两种或更多种寡核苷酸。可通过使用MN基因表达体系来选择特异性沉默FL mRNA变体表达的寡核苷酸，从而从基于MN基因的AS和/或FL mRNA变体核苷酸序列而设计的寡核苷酸中获得显示RNA干扰作用的所述寡核苷酸。
MN基因治疗载体
就使用寡核苷酸抑制FL MN/CA IX表达而言，有可能通过使用基因疗法将寡核苷酸引入靶细胞中。可使用已知的方法进行基因治疗。例如，可使用非病毒性转染(包括通过注射直接给予寡核苷酸)或使用病毒载体转染。非病毒性转染的优选方法包括给予含有寡核苷酸的磷脂载体(例如脂质体)，以及包括通过注射直接给予寡核苷酸的方法。用于转染的优选载体是病毒载体，更优选DNA病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和牛痘病毒载体或RNA病毒载体。
材料和方法
细胞培养、组织和抗体
于湿润气氛、5％CO2、37℃下，在补充有10％ FCS(BioWhittaker，Verviers，比利时)和40μg/ml庆大霉素(Lek Slovenia)的DMEM中培养小鼠NIH 3T3成纤维细胞、犬MDCK上皮细胞、衍生自肾癌的人肿瘤细胞系CAKI-1和ACHN以及来自宫颈癌的Caski、SiHa、HeLa和C33a细胞系。低氧处理在厌氧性工作站(Ruskin Technologies，Bridgend，英国)、2％O2、5％CO2、10％H2和83％N2、37℃进行。
37℃下从悬挂在组织培养皿盖上的每20μl滴状培养基中的400个细胞预先形成(pre-form)HeLa球状体，持续3天。将所得的细胞聚集体转移到具有非粘性(non-adherent)表面的皮式培养皿中，悬浮培养另外11天，每三天更换培养基。用Nikon E400显微镜检查球状体，用Nikon Coolpix 990照相机拍照。
人组织选自先前描述的集合(collection)(Kivela等，2005)。小鼠组织取自颈脱位致死的BALB/c小鼠。这些组织存储在-80℃直到用于RNA分离和/或蛋白抽提。
早先已表征了特异性针对人MN/CA IX蛋白的M75和V/10小鼠MAb(Pastorekova等，1993，Zatovicova等，2003)。二级抗小鼠过氧化物酶缀合抗体和与辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体来自于Sevapharma(Prague，CzechRepublic)。抗小鼠FITC缀合抗体来自于Vector Laboratories。(Burlingame，CA)。Alexa 488缀合的抗兔二级抗体获自Advanced Targeting Systems(SanDiego，CA)。
免疫荧光
如先前所述进行免疫荧光(Svastova等，2004)。生长在玻璃盖玻片上的细胞用冰冷的PBS清洗两次，在20℃用冷甲醇固定5分钟。盖玻片与含有1％BSA的PBS于37℃孵育30分钟，然后与含有M75MAb的未稀释的杂交瘤培养基或1∶1000稀释的兔抗mCA IX多克隆血清一起孵育。其他文献描述了抗小鼠CA IX蛋白的抗体(Gut等，2002)。在湿润的小室中于37℃用初级抗体进行孵育1小时。盖玻片用含有0.02％吐温-20的PBS洗涤三次(10分钟)，然后在PBS中用1∶300稀释在0.5％BSA中的荧光素缀合的抗小鼠二级抗体于37℃处理1小时，或在PBS中用1∶1000稀释在0.5％BSA中的抗兔Alexa 488缀合的二级抗体处理。用PBS清洗三次(10分钟)之后，将盖玻片用固定剂(mounting medium)(Calbiochem，Cambridge，MA)固定在显微镜载玻片上，然后用Nikon E400显微镜检查并用Nikon Coolpix990照相机拍照。
表达质粒
用反向PCR从含有小鼠CA9cDNA的pSG5C-Car9质粒产生编码小鼠剪接变体的真核生物表达质粒pSG5C-mAS。正向引物自外显子9的起始位点设计(m9S，5’-TCCATGTGAATTCCTGCTTCACTG-3’)[SEQ ID NO：102]反向引物特异性针对外显子6的末端(m6A，5’-CTTCCTCCGAGATTTCTTCCAAAT-3’)[SEQ ID NO：103]。类似地，用针对外显子10和7的引物进行反向PCR从含有全长人CA9cDNA(GenBank # X66839)的pSG5C-MN/CA9表达质粒(Pastorek等，1994)产生编码人剪接变体的真核生物表达质粒pSG5C-AS。正向引物(h10S，5’-GTGACATCCTAGCCCTGGTTTTT-3’)[SEQ ID NO：104]特异性针对外显子10的起始位点，反向引物(h7A，5’-CTGCTTAGCACTCAGCATCACTG-3’)[SEQ ID NO：105]特异性针对外显子7的末端。同样的h7A和h10S引物用于由编码无信号肽的全长CA IX蛋白的初级质粒构建物pGEX-3XCA9来制备编码人CA IX蛋白的GST-融合剪接变体的细菌表达载体pGEX-3X-AS。使用Phusion聚合酶进行PCR扩增(Finnzymes，Espoo，Finland)。PCR反应由以下反应组成：开始在98℃变性30秒，98℃变性10秒(32个循环)，64℃退火30秒，72℃延伸1分40秒，最后72℃延伸5分钟。将PCR产物凝胶纯化，用T4多核苷酸激酶处理，用T4DNA连接酶(Invitrogen Carlsbad，美国)连接。通过测序验证所有的构建物。编码含有人CA IX胞外部分的GST-PGCA融合蛋白的构建物先前已有描述(Zatovicova等，2003)。下表2提供实施例中所用的引物序列。
表2
  引物名称   位置   序列(5’-3’)   SEQID NO
  mβ-肌动蛋白S   768-787   GTTGGCATAGAGGTCTTTACG   85
  mβ-肌动蛋白A   968-948   GCCGCATCCTCTTCCTCCCT   86
  M6S   794-814   GGAGGCCTGGCAGTTTTGGCT   87
  M11A   1358-1336   CTCCAGTTTCTGTCATCTCTGCC   88
  M8S   1156-1175   CCCTGCTGCAGAGGATAGCA   89
  M10A   1312-1293   GGTCCCACTTCTGTGCCTGT   90
  M6/9S   883-893/1188-1194   CTCGGAGGAAG/TCCATGTGAA   91
  M10A   1312-1293   GGTCCCACTTCTGTGCCTGT   92
  hβ-肌动蛋白S   414-433   CCAACCGCGGGAAGATGACC   93
  hβ-肌动蛋白A   649-629   GATCTTCATGAGGTAGTCAGT   94
  h1S   412-433   GAACCCCAGAATAATGCCCACA   95
  h6A   924-945   TCGCTTGGAAGAAATCGCTGAG   96
  h6S   915-937   GTTGCTGTCTCGCTTGGAAGAAA   97
  h11A   1392-1372   GCGGTAGCTCACACCCCCTTT   98
  h7S   980-1001   TATCTGCACTCCTGCCCTCTG   99
  h8A   1133-1155   CACAGGGTGTCAGAGAGGGTGT   100
  h10/7A   1291-1279/1106-1095   CTAGGATGTCAC/CTGCTTAGCACTC   101
转染
将细胞接种在60mm的皮式培养皿中，第二天达到大约70％的密度。分别用2μg编码人和小鼠CA IX剪接变体的pSG5C-hAS和pSG5C mAS质粒连同200ng pSV2neo质粒进行转染。使用Gene Porter II转染试剂(Genlantis，San Diego，CA)，分别将2μg编码人和小鼠CA IX剪接变体的pSG5C-hAS和pSG5C-mAS质粒连同200ng pSV2neo质粒进行转染。用G418(Invitrogen)对转染的细胞进行选择，对HeLa细胞的浓度为900μg/ml，对MDCK细胞的浓度为500μg/ml。克隆抗性集落，通过免疫印迹测试剪接变体的表达并扩增。
荧光CA抑制剂的结合
通过高磺胺和异硫氰酸荧光素反应获得荧光CA抑制剂(FITC-CAI)，对CA IX的KI值为24nM(Svastova等，2004，Cecchi等，2005)。将该抑制剂以100mM浓度和20％的DMSO溶于PBS中，临加入细胞中前在培养基中稀释至终浓度为1mM。将MDCK-CA IX细胞(Svastova等，2004)以4×105细胞/3.5cm培养皿的密度接种在含有分泌人AS变体的MDCK-AS转染子产生的条件培养基的培养基中。对照细胞在没有分泌的AS的培养基中培养。培育24小时之后，补充同等的新鲜培养基，添加FITC-CAI至细胞，将细胞转入低氧工作站，允许进行结合另外48小时。平行样品在正常含氧量中培养。最后，这些细胞用PBS洗涤5次，用Nikon E400落射荧光显微镜观察。使用Scion ImageBeta 4.02软件(Scion Corporation，Frederick，MD)评价所获得的影像的荧光强度，相关的FITC-CAI结合以百分比表示。
蛋白抽提
如先前所述(Svastova等，2004)用RIPA缓冲液从细胞单层或组织匀浆中抽提蛋白。在冰上用含有蛋白酶类Complete mini抑制剂(Roche AppliedScience，Mannhein，德国)的RIPA缓冲液(PBS中的1％Triton X-100、0.1％脱氧胆酸钠，1mM苯甲基磺酰氟)从细胞单层或组织匀浆中抽提蛋白30分钟。抽提物以13000rpm离心15分钟，按照制造商的说明书用BCA试验(Pierce，Rockford，IL)测定总蛋白浓度。在10％和8％SDS PAGE(在有2-巯基乙醇(还原条件)或没有2-巯基乙醇(非还原条件)的Laemmli样品缓冲液中)中分离总蛋白抽提物(含有30-50μg的等分试样)。
免疫沉淀和免疫印迹
从无FCS条件下在低氧和正常含氧量下培养24小时的AS转染细胞的培养基中制备样品用于检测人胞外AS。将四分之一的培养基(500μl)10倍浓缩，在SDS-PAGE中分离。对于免疫沉淀，室温下使1ml杂交瘤培养基中的CA IX特异性MAb与25μl 50％的蛋白A琼脂糖凝胶悬浮液(Pharmacia，Uppsala，瑞典)结合1小时。细胞抽提物(200μl)用20μl的50％蛋白A琼脂糖凝胶悬浮液预清洁，然后添加到结合的MAb中。如先前所述(Zatovicova等，2003)，洗涤蛋白A琼脂糖凝胶上收集的免疫复合物，煮沸并进行SDS-PAGE和免疫印迹。在SDS-PAGE中分离蛋白并印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ImmobilonTM-P，Millipore，Billerica，MA)上。用含有PBS配制的5％无脂奶、0.2％Nonidet P-40的封闭缓冲液处理所述膜1小时，然后和稀释在封闭缓冲液中的初级抗体(在杂交瘤培养基中1∶2稀释的M75单克隆抗体，或者1∶1000稀释的兔抗小鼠CA IX多克隆抗体)一起孵育1小时。处理后，膜用含有0.2％Nonidet P-40的PBS彻底清洗45分钟，和在封闭缓冲液中1∶7500和1∶5000稀释的辣根过氧化酶缀合的猪抗小鼠或抗兔二级抗体(Sevapharma)一起孵育1小时。膜在含有0.2％Nonidet P-40(Sigma，St Louis，MO)的PBS中清洗，用ECL检测系统显影。
为了分离膜和亚膜蛋白并分析寡聚物，用PBS洗涤细胞，在冰上与RIPA抽提缓冲液孵育30秒。抽出含有蛋白的RIPA缓冲液并在细胞中添加新鲜的RIPA缓冲液。剩余的蛋白在冰上抽提15分钟。首先使用CA IX特异性MAbsV/10(识别FL但不识别AS)或M75(识别这两种变体)从HeLa-AS提取物中免疫沉淀寡聚物。在还原性SDS-PAGE解析沉淀寡聚物的组分，印迹(blotted)并用过氧化物酶标记的M75抗体显象。
反转录PCR
使用InstaPure试剂(Eurogentec，Seraing，比利时)从细胞或者组织中分离总RNA。使用随机七聚体引物(400ng/μl)，用M-MuLV反转录酶(Finnzymes，Oy，芬兰)进行反转录。5μg总RNA和随机引物(400ng/μl)的混合物于70℃加热10分钟，在冰上迅速冷却，补充有0.5mM dNTPs(Finnzymes)，含有6mMMgCl2、40mM KCl、1mM DTT、0.1mg/ml BSA和50mM Tris-HCl，pH8.3的反转录酶缓冲液。终容积24μl的混合物进一步补充200U的反转录酶M-MuLV，于42℃培养1小时，70℃加热15分钟，-80℃下存储直至使用。
用Dynazyme EXT聚合酶(Finnzymes)和表2(见上文)中列出的引物进行PCR。所得的PCR片段在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。PCR程序由以下组成：94℃3分钟，然后30个循环：94℃变性30秒，退火40秒(温度取决于引物组)，72℃延伸40秒，然后于72℃最后延伸5分钟。纯化PCR产物，并使用Applied Biosystems ABI 3100(Foster City，USA)的自动测序仪进行测序。
以下实施例仅用于阐释本发明，不以任何方式限制本发明。
实施例1
小鼠CA IX剪接变体的鉴定、结构和表达
早先与小鼠组织中Car9mRNA表达相关的反转录(RT)PCR数据基于外显子1-6的扩增。然而，使用引物m6S和m11A扩增跨越外显子6-11的区域进行的Car9mRNA的RT PCR分析显示，存在两种扩增产物-一种预期大小的PCR产物和一种较小产物(图1A、B)。该较小PCR产物的测序证明其对Car9有特异性，表明它代表缺少外显子7和8的小鼠Car9mRNA的旁路剪接(AS)变体。在所有三种被分析的组织，即，胃、小肠和结肠中均发现小鼠AS变体(图1B)。使用相应的引物对(wt的引物是m8S-m10A，AS的引物是m6/9S-m10A)对Car9的野生型和AS变体进行的独立的RT PCR扩增证实，在所分析的组织中同时存在两种产物(图1C)。
AS变体序列的计算机分析表明，推定的蛋白小于全长小鼠CA IX约6kDa，其预测的分子量是48kDa。该剪接变体能编码缺少氨基酸335-379的蛋白，该蛋白缺少催化(CA)结构域的羧基末端部分和跨膜锚上游的区域，而跨膜和胞质内结构域是完整的(图1D、E)。
为了研究小鼠AS CA IX变体的亚细胞定位，发明人将AS Car9cDNA克隆入pSG5C表达质粒中，并用它产生永久转染的细胞系。AS变体已在不含有内源性CA IX蛋白的小鼠NIH3T3成纤维细胞和犬MDCK上皮细胞中过度表达。使用多克隆抗小鼠CA IX抗体(Gut等，2002)进行免疫印迹和免疫荧光来检测两种转染的细胞系。在转染子的细胞抽提物中检测到约48kDa的单个条带，与计算机预测的小鼠AS CA IX蛋白分子量很好地吻合(图2A)。转染的细胞显示出清晰的细胞质着色，表示小鼠AS变体定位在细胞溶质中(图2B)。
实施例2
人CA IX剪接变体的鉴定和结构
为了搜索人组织和细胞系中的AS CA9mRNA，发明人设计了一组引物，其覆盖了完整的人CA9mRNA(图3A)。这些引物用于对分离自人胃和小肠的mRNAs反转录得到的cDNA模板进行RT-PCR。使用针对外显子1和6设计的引物，发明人仅检测到预计的PCR产物(图3B)。然而，针对外显子6和11的引物产生了两种PCR扩增子-一种丰度较大的较长产物和一种丰度较小的较短产物(图3C)。较短产物的序列分析证实，它对应于人CA9mRNA AS变体。剪接导致缺失外显子8和9。
计算机预测的人AS CA IX蛋白缺少氨基酸356-412，其推定的分子量约为43kDa，而全长(FL)CA IX的预测大小为49kDa。所述氨基酸缺失包括催化CA结构域的C-末端部分缺失的35个氨基酸和CA结构域与跨膜区域之间缺失的21个氨基酸，其中包括Cys409，该氨基酸似乎参与形成分子间S-S键(图3D)。由于移码在AS mRNA 1119bp处产生的终止密码子(FLCA9mRNA中，终止密码子在1142bp位置)，AS蛋白被截短，既不含有跨膜结构域也不含有胞质内结构域(图3E)。
实施例3
人AS CA IX在肿瘤细胞系和组织中的表达
为了有利于CA9mRNA的FL和AS变体的单独检测，发明人使用了允许独立扩增这两种mRNA的引物。引物的设计是基于：使一条FL特异性引物位于所述删除的区域内，一条AS特异性引物位于旁路剪接产生的结点上(图3A)。
首先，发明人分析了暴露于低氧(2％)和正常含氧量(21％)的人癌细胞系中AS变体的存在。在所有检查的细胞系中均检测到AS变体，并在正常含氧量和低氧两种情况下水平相似(图4A)。这与FL CA9mRNA相反，后者明显地可被低氧诱导而水平显著增加(即在衍生自肾癌的ACHN细胞中和衍生自宫颈癌的Caski和SiHa细胞中)，而CAKI-1细胞仅表达极低水平的FL CA9(图4A)。缺乏CA9基因的C33a宫颈癌细胞中没有观察到FL CA9特异性信号(Lieskovska等，1999)。
早先的研究显示了与细胞外周低氧相关的FL CA IX的密度诱导性表达(Kaluz等，2002)。为了确定AS变体的表达是否依赖于密度，发明人使用了分别在稀薄培养物(以1×104细胞/cm2接种)和稠密培养物(8×104细胞/cm2)中培养24小时的HeLa和SiHa细胞。稠密的细胞清楚显示FL CA9mRNA正常含氧量的表达，但其水平比低氧细胞中低。在稀薄和稠密的细胞单层之间没有观察到AS变体水平的显著差异图4B)。
最后，发明人分析了正常与恶性的人组织(包括胃、结肠、直肠和肝脏)中AS的表达。RT-PCR显示所有检查的组织中都存在AS变体(图4C)。根据先前的研究，FL转录物仅存在于正常的胃和源自结肠和直肠的肿瘤内(Saarnio等，1998，Kivela等，2005)。
实施例4
人CA IX AS变体的定位和基本特点
为了对CA IX的AS变体进行基本表征，发明人用人AS蛋白的异位表达产生了稳定的转染子。将人AS cDNA转染入CA IX阴性的MDCK细胞以及响应于密度和低氧自然地表达FL CA IX的人HeLa宫颈癌细胞中。与计算机分析(即预测的剪接-和移码-介导删除了TM和IC区)一致，AS CA IX蛋白不限于质膜上，而是在MDCK细胞和含氧量正常的HeLa细胞两者中显示胞内定位(图5A)。这与暴露于低氧(2％O2)的转染的MDCK细胞和模拟转染的HeLa细胞中FL CA IX的细胞表面定位明显地不同。
在免疫印迹中，转染的HeLa AS细胞显示约43/47kDa的两条带，这对应于AS CA IX，另外的54/58K两条带对应于低氧诱导的FL CA IX(图5B)。由于AS蛋白完全缺少跨膜和胞内结构域，发明人还假定AS CA IX分子的至少一部分应释放入培养基中。为了研究这种可能性，在无血清培养基中于正常含氧量和低氧情况下培养细胞。培养24小时后，浓缩四分之一的培养基，并通过SDS-PAGE分析。免疫印迹显示在正常含氧量和低氧两种情况下培养基中都存在AS CA IX(图5B)。综合在一起，这些数据表明，AS存在于胞内以及细胞间隙中，这与大都限于质膜上的FL CA IX相反。
然而，还可能的是，一些AS分子可与FL CA IX掺入异源寡聚体(heterooligomers)中。使用正常结合于完整的CA IX结构域但不能识别AS变体的单克隆抗体V/10测试这种假设(数据未显示)。该V/10Mab经由其与FL分子的相互作用用于CA IX寡聚物的免疫沉淀。然后用还原性PAGE解析寡聚物组分(包括可能掺入的AS分子)，使用与FL和AS形式均反应的过氧化物酶标记的M75抗体进行免疫印迹显象。在非还原条件下，FL蛋白形成约153K的寡聚物，而AS CA IX变体不能这样做，并且不能进入FL CA IX蛋白形成的寡聚物(图6；细节参见材料和方法部分)。
实施例5
人AS CA IX的功能性质
低氧诱导的肿瘤细胞中FL CA IX的表达。低氧还激活CA IX的催化性能，导致胞外pH的加强酸化(Svastova等，2004)。缺少CA IX的催化CA结构域的显性-阴性突变体的过度表达可消除这种酸化能力(Svastova等，2004)。由于AS蛋白仅含有不完整的CA结构域，它对分析其是否具有催化活性和是否能够干扰FL CA IX蛋白介导的酸化来说尤其重要。使用含有截短的CA结构域的重组细菌GST AS融合蛋白的停流光谱法(stopped flow spectrometry)检测酶活性，与融合有GST的含有完整的CA结构域的胞外部分[例如SEQ IDNO：9](从而形成含有PG和CA结构域两者[aa 52-397(SEQ ID NO：83)]的GST-PGCA)进行比较。结果显示，野生型CA IX的催化活性Kcat(WT)＝3.8×105s-1在剪接变体中减少了一半，Kcat(AS)＝1.9×105s-1。另外，GST AS蛋白对乙酰唑胺(一种碳酸酐酶的磺胺抑制剂)的亲合力显著降低：Ki WT＝14nM对Ki AS＝110nM。这些数据说明，剪接削弱了CA IX的酶活性和其对抑制剂的亲合力。
发明人还想要研究AS CA IX是否可调节FL CA IX在低氧条件下酸化胞外pH的能力。出于该目的，发明人分析了转染的HeLa-AS细胞和模拟转染的对照细胞，这些细胞在2％O2(低氧)和21％O2(正常含氧量)中培养48小时。与含氧量正常的相应细胞比较，低氧培养导致对照和AS转染的HeLa细胞中预期的胞外酸化(图7A)。然而，培养基比在AS-过度表达的细胞中少酸化约0.2pH单位，说明AS干扰野生型CA IX蛋白的活性。
由于CA IX的催化部位暴露于细胞间隙，发明人测试了AS胞外级分(fraction)的可能的作用。如先前所述，可使用仅结合低氧激活的CA IX(其催化部位可被抑制剂接近)的荧光素-标记的CA抑制剂(FITC-CAI)来间接地证明CA IX的活性(Svastova等2004)。因此，发明人使用已建立的CA IX转染的MDCK细胞模型，该模型显示用低氧处理时CA IX介导的胞外酸化以及低氧(但并非正常含氧量)中FITC-CAI的聚集。发明人分析了存在或不存在来自分泌AS的MDCK-AS转染子的培养基时MDCK-CA IX细胞中FITC-CAI的积聚。如图7B所示，在混合有含AS的条件培养基的新鲜培养基中培养MDCK CA IX细胞，结果可观察到FITC-CA IX积聚下降，这支持了胞外AS减少抑制剂的结合的观点。用一半和三分之一的含有AS的条件培养基重复该试验。分析获得的影像以确定荧光强度的差异。结果清楚地证明，AS的胞外级分将FITC-CAI的积聚减少约一半(图7C)。
为确定AS变体对FL CA IX功能的这种作用是否具有生物学影响，发明人分析了HeLa-AS转染子的生长参数并与模拟转染的对照细胞进行比较。在不依赖于正常含氧量或低氧条件的贴壁培养的短期生长(72小时)中未观察到两种类型细胞之间的显著差别(数据未显示)。因此，发明人还使HeLa细胞球状体生长了14天，并将HeLa AS细胞产生的球状体的质量和形状分别与对照HeLa细胞进行比较。HeLa-AS球状体紧凑程度较小，缺少中心区域，在该区域中通常含有承受低氧和酸性pH的细胞(图7D)。这些HeLa-AS球状体的表观显示了AS的作用(导致FL CA IX调节pH的能力降低)可影响细胞在这些微环镜应激下的生存能力。
总而言之，我们的结果表明，与FL CA IX相比，AS CA IX受到不同的调控、定位异常、功能减弱(functionally disabled)。
讨论
旁路剪接的失调尤其在癌症中是一种普遍认可的现象(Venables等，2006)。有很多旁路剪接基因的实例，所述基因的产物通常涉及肿瘤的发展，例如CD44、HIF-α、VEGF、骨桥蛋白和很多其它产物(Wong等，2003，Gothie等，2000，Robinson等，2001，He等，2006)。某些情况下，在正常组织中罕见的剪接形式会在肿瘤中变得常见，而存在于正常组织中的旁路剪接形式可保持不变(Roy等，2005)。
本研究中鉴定的人CA IX旁路剪接变体可归为此类，尽管由于全长CA IX的表达模式非常特别，难以给出明确的结论。FL CA IX在极少的正常组织(包括胃和小肠)中有丰度，同时表达低水平的旁路剪接变体。在胃癌中，FL CA IX的表达降低，但AS的水平和正常胃中相似。另一方面，全长CA IX在正常的结肠和直肠(以及本研究中另外的未分析的正常组织)中不存在表达或表达极低，但在相应的在肿瘤中的表达显著提高(Saarnio等，1998)。然而，AS变体在正常组织和结肠癌两者中均显示稳定的表达水平。这些数据强烈表明其表达与肿瘤表型无关。而且，与拥挤的培养物中生长和暴露于低氧的细胞中FL CAIX的水平被诱导相反，AS变体不主要依赖于低氧和细胞密度。
相对低但组成型的AS表达对利用CA9转录作为低氧肿瘤标记物用于潜在的预后或预测目的的临床研究相当重要。由于在缺少FL CA9转录物的正常和/或非低氧组织中存在AS，设计用于检测未受剪接影响的区域的引物或探针不能区分CA9mRNA的两种形式，因此可能会给出假阳性结果，从而可能影响低氧诱导的FL CA9的真实临床价值。
值得注意的是，与FL转录物对比进行的AS mRNA和5’RACE分析产生了相同长度的产物，这支持了两种变体均产生同样的启动子的结论(数据未显示)。该事实可能显示了，依赖于生理学环境，在CA9转录物加工过程中转录设备和剪接机器构件之间进行了差异性合作。实际上，有几个被低氧调控的剪接事件的实例，例如与hTERT、TrkA和XBP1有关的那些(Anderson等，2006，Taconelli等，2004，Romero-Ramirez等，2004)。对于hTERT，已证明，低氧下含有RNA聚合酶II、TFIIB、HIF和共活化剂的转录复合物募集在启动子处，并在转录过程中始终保持与基因相连。这种方式诱导了剪接模式的转换，有利于酶的活性形式(Anderson等2006)。非常容易想到，在CA9基因转录期间可能存在一种类似的机制。
由于外显子8和9的缺失产生了人CA9mRNA的AS变体，该变体被翻译成不含跨膜区、胞内尾和催化性结构域的羧基末端部分的截短的蛋白。显然，TM和IC区域的缺失导致该AS变体的定位改变，其主要占据细胞间隙并释放到胞外培养基中。这与FL CA IX蛋白形成对比，FL CA IX蛋白是一种整合的质膜蛋白。可以预期，这种与催化性结构域的部分缺失相关的不当定位将削弱蛋白的功能。实际上，GST-AS的酶活性只有含完整的催化性结构域的相应GST-PG+CA蛋白的一半。然而，很难将这种发现直接应用到具体的细胞环境中，因为在低氧条件下的细胞环境中CA IX与碳酸氢盐转运蛋白(transporter)相互作用并影响质膜内外的pH调节(Morgan等，2007，Svastova等，2004，Swietach等，2007)。首先，在没有任何亚细胞结构、蛋白质-蛋白质相互作用、离子流动和微环镜影响(这些因素当然在调控CA IX的催化性能起作用)的装置中用细菌产生的蛋白检测活性。其次，不同碳酸酐酶同工酶的催化活性大致在两个数量级中变化，活性高的同工型比活性中等的同工酶的活性高20-3倍不等(Pastorekova等，2004)。因此，不可能预测(preclude)所述减少一半的活性是否足以(维持)CA IX的生理功能。不过，这个问题可能不是关键，因为AS变体不能恰当定位在质膜上，不能形成寡聚物，这些是对CA IX蛋白功能的重要限制。
然而，组成型过度表达AS形式的CA IX的低氧HeLa-AS细胞培养物中观察到的胞外酸化减少清楚地表明，AS CA IX干扰内源性、低氧诱导的FL蛋白的功能。虽然目前还不清楚其机制，但基于用AS变体处理的低氧MDCK-CA IX细胞中CA抑制剂的积聚减少，可认为AS在与碳酸氢盐运输代谢区室(metabolon)的细胞表面组分的相互作用方面与FL CA IX竞争。此外，AS的过度表达显著影响HeLa细胞形成紧凑球状体的能力，HeLa细胞球状体通常用作模仿具有相应的瘤内微环境的肿瘤块的三维模型。很多研究很好地记载了穿越球状体的氧分压、pH值、营养物和代谢物梯度，球状体的核心区与以较酸性的微环镜为特征的实体瘤低氧区非常相似(Alvarez-Perez等，2005)。其他文献已证明，在SiHa和HeLa宫颈癌细胞产生的多细胞球状体最内部的细胞中，FL CA IX的质膜染色显著增加(Olive等，2001，Chrastina等，2003)。这些数据表明，FL CA IX刚好存在于那些细胞为了生存需要增加保护和适应对低氧压力及酸性微环境的有害影响的区域。FL CA IX通过碳酸氢盐-介导的胞内pH的缓冲来发挥作用(Swietach等，2007)。明显地，部分扰乱pH调节的AS变体不允许对酸性球状体内pH的适应，导致球状体核心中最受胁迫的中心细胞的消失。这种想法与CA IX的催化活性受低氧调控是一致的，其建议CA IX调节pH的能力对低氧肿瘤细胞的存活非常重要。这种建议已经得到Robertson等(2004)中RNAi实验的间接支持。
虽然天然产生的AS变体以低水平表达，但存在仅微弱地诱导FL CA IX的生理学情况和细胞类型。例如，位置离功能性供血脉管较近的肿瘤细胞暴露于轻微低氧中，FL和AS的表达水平可能相当，从而导致CA IX活性的显性-阴性下调。这些弱低氧的细胞假设没有暴露于严重的酸中毒，因此可能不受益于这种pH控制机理的完全实施(full performance)。类似的解释可适用于遭受轻微缺血的正常组织。这种想法得到了最近及先前一些数据的支持，这些数据表明，一些肿瘤细胞系、含氧量正常的稠密细胞(受微弱的细胞外周低氧的影响)和一些早期低氧程度较轻的肿瘤仅表达较低水平的CA IX。
总之，发明人认为，在这两种蛋白共同表达的情况中，AS变体起调节FL CA IX的作用。旁路剪接变体较低但组成型的表达对基于利用CA9转录作为低氧肿瘤标记物用于潜在的预后或预测目的的临床研究相当重要。由于在不存在FL CA9转录物的正常和/或非低氧组织中存在AS，设计用于检测不受剪接影响的区域的引物或探针不能区分CA9mRNA的两种形式，因此可能会给出假阳性结果，这会影响低氧诱导的FL CA9的真实临床价值。事实上，在迄今为止发表的几个研究中已经发生了这种现象[例如McKiernan等.，Cancer，86(3)：492-497(1999)；Span等.，Br J Cancer，89(2)：271-276(2003)；Simi等.，Lung Cancer，52(1)：59-66(2006)；Greiner等.，Blood，108(13)：4109-4117(2006)]。为此原因，用于微阵列芯片和RT-PCR的正确的引物及探针的设计应避免上述现象的出现，应考虑MN/CA IX的AS形式。
根据布达佩斯条约进行的保藏
下列材料保藏在现位于10810 University Blvd.，Manassas，Virginia20110-2209(USA)的美国模式培养物保藏所(ATCC)。保藏是根据国际承认用于专利程序和控制的微生物保藏布达佩斯条约进行的。从保藏日开始计算，保证维持活培养物30年。根据布达佩斯条约可从ATCC获得本发明的杂交瘤和质粒，根据申请人与ATCC之间的协议，保证一旦本申请授予专利权则公众可无限制地获得这些保藏的杂交瘤和质粒。这些保藏菌株的可获得性并不意味着违背任何政府当局根据其专利法授予的专利权而许可实施本发明。
杂交瘤        保藏             ATCC#
VU-M75        1992年9月17日    HB 11128
MN 12.2.2     1994年6月9日     HB 11647
质粒          保藏日           ATCC#
A4a           1995年6月6日     97199
XE1           1995年6月6日     97200
XE3           1995年6月6日     97198
类似地，产生V/10单克隆抗体的杂交瘤细胞系V/10-VU根据布达佩斯条约于2003年2月19日保藏在比利时根特，B-9000，根特大学，K.L.Ledeganckstraat 35的Laboratorium voor MoleculaireBiologie-Plasmidencollectie(LMBP)(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms(BCCM)的国际保藏机构(IDA))[BCCM/LMBP]，登录号为6009CB。
本发明上述实施方式的描述仅出于阐释和说明的目的。这些实施方式不是穷尽性的，也并非将本发明限于所公开的具体形式，很明显，根据上文教导可进行很多修饰和变化。选择和描述这些实施方式是为了说明本发明的原则和其具体应用，以使本领域技术人员以多种实施方式和根据特定目的进行各种变化来利用本发明。
本文引用的所有参考文献均通过引用纳入本文。
序列表
<110>拜尔药物公司(Baver Pharmaceuticals Corporation)
     病毒学研究所(Institute of Virology of the Slovak Academy of Sciences
     J.帕斯托雷克(Pastorek，Jaromir)
     M.巴拉索瓦(Barathova，Monika)
<120>MN/CA9剪接变体
<130>MST-3579 PCT
<150>60/851,398
<151>2006-10-12
<160>109
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1522
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(1389)
<220>
<221>成熟肽
<222>(124)..(1389)
<400>1
acagtcagcc gc atg gct ccc ctg tgc ccc agc ccc tgg ctc cct ctg ttg    51
              Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu
                      -35                 -30                 -25
atc ccg gcc cct gct cca ggc ctc act gtg caa ctg ctg ctg tca ctg      99
Ile Pro Ala Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu
                -20                 -15                 -10
ctg ctt ctg atg cct gtc cat ccc cag agg ttg ccc cgg atg cag gag     147
Leu Leu Leu Met Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu
            -5              -1  1               5
gat tcc ccc ttg gga gga ggc tct tct ggg gaa gat gac cca ctg ggc     195
Asp Ser Pro Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly
    10                  15                  20
gag gag gat ctg ccc agt gaa gag gat tca ccc aga gag gag gat cca     243
Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro
25                  30                  35                  40
ccc gga gag gag gat cta cct gga gag gag gat cta cct gga gag gag    291
Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu
                45                  50                  55
gat cta cct gaa gtt aag cct aaa tca gaa gaa gag ggc tcc ctg aag    339
Asp Leu Pro Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys
            60                  65                  70
tta gag gat cta cct act gtt gag gct cct gga gat cct caa gaa ccc    387
Leu Glu Asp Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro
        75                  80                  85
cag aat aat gcc cac agg gac aaa gaa ggg gat gac cag agt cat tgg    435
Gln Asn Asn Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp
    90                  95                  100
cgc tat gga ggc gac ccg ccc tgg ccc cgg gtg tcc cca gcc tgc gcg    483
Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala
105                 110                 115                 120
ggc cgc ttc cag tcc ccg gtg gat atc cgc ccc cag ctc gcc gcc ttc    531
Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe
                125                 130                 135
tgc ccg gcc ctg cgc ccc ctg gaa ctc ctg ggc ttc cag ctc ccg ccg    579
Cys Pro Ala Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro
            140                 145                 150
ctc cca gaa ctg cgc ctg cgc aac aat ggc cac agt gtg caa ctg acc    627
Leu Pro Glu Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr
        155                 160                 165
ctg cct cct ggg cta gag atg gct ctg ggt ccc ggg cgg gag tac cgg    675
Leu Pro Pro Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg
    170                 175                 180
gct ctg cag ctg cat ctg cac tgg ggg gct gca ggt cgt ccg ggc tcg    723
Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser
185                 190                 195                 200
gag cac act gtg gaa ggc cac cgt ttc cct gcc gag atc cac gtg gtt    771
Glu His Thr Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val
                205                 210                 215
cac ctc agc acc gcc ttt gcc aga gtt gac gag gcc ttg ggg cgc ccg    819
His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro
            220                 225                 230
gga ggc ctg gcc gtg ttg gcc gcc ttt ctg gag gag ggc ccg gaa gaa    867
Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu
        235                 240                 245
aac agt gcc tat gag cag ttg ctg tct cgc ttg gaa gaa atc gct gag     915
Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu
    250                 255                 260
gaa ggc tca gag act cag gtc cca gga ctg gac ata tct gca ctc ctg     963
Glu Gly Ser Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu
265                 270                 275                 280
ccc tct gac ttc agc cgc tac ttc caa tat gag ggg tct ctg act aca    1011
Pro Ser Asp Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr
                285                 290                 295
ccg ccc tgt gcc cag ggt gtc atc tgg act gtg ttt aac cag aca gtg    1059
Pro Pro Cys Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val
            300                 305                 310
atg ctg agt gct aag cag ctc cac acc ctc tct gac acc ctg tgg gga    1107
Met Leu Ser Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly
        315                 320                 325
cct ggt gac tct cgg cta cag ctg aac ttc cga gcg acg cag cct ttg    1155
Pro Gly Asp Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu
    330                 335                 340
aat ggg cga gtg att gag gcc tcc ttc cct gct gga gtg gac agc agt    1203
Asn Gly Arg Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser
345                 350                 355                 360
cct cgg gct gct gag cca gtc cag ctg aat tcc tgc ctg gct gct ggt    1251
Pro Arg Ala Ala Glu Pro Val Gln Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly
                365                 370                 375
gac atc cta gcc ctg gtt ttt ggc ctc ctt ttt gct gtc acc agc gtc    1299
Asp Ile Leu Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val
            380                 385                 390
gcg ttc ctt gtg cag atg aga agg cag cac aga agg gga acc aaa ggg    1347
Ala Phe Leu Val Gln Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly
        395                 400                 405
ggt gtg agc tac cgc cca gca gag gta gcc gag act gga gcc            1389
Gly Val Ser Tyr Arg Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala
    410                 415                 420
tagaggctgg atcttggaga atgtgagaag ccagccagag gcatctgagg gggagccggt  1449
aactgtcctg tcctgctcat tatgccactt ccttttaact gccaagaaat tttttaaaat  1509
aaatatttat aat                                                     1522
<210>2
<211>459
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala
        -35                 -30                 -25
Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu
    -20                 -15                 -10
Met Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro
-5              -1  1               5                   10
Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp
            15                  20                  25
Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu
        30                  35                  40
Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
    45                  50                  55
Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp
60                  65                  70                  75
Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn
                80                  85                  90
Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly
            95                  100                 105
Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe
        110                 115                 120
Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala
    125                 130                 135
Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu
140                 145                 150                 155
Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro
                160                 165                 170
Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln
            175                 180                 185
Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr
        190                 195                 200
Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser
    205                 210                 215
Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu
220                 225                 230                 235
Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala
                240                 245                 250
Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser
            255                 260                 265
Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp
        270                 275                 280
Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys
    285                 290                 295
Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser
300                 305                 310                 315
Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp
                320                 325                 330
Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg
            335                 340                 345
Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser Pro Arg Ala
        350                 355                 360
Ala Glu Pro Val Gln Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly Asp Ile Leu
    365                 370                 375
Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val Ala Phe Leu
380                 385                 390                 395
Val Gln Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser
                400                 405                 410
Tyr Arg Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala
            415                 420
<210>3
<211>10898
<212>DNA
<213>智人
<220>
     基因
<221>
<222>(1)..(10898)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1974)..(1974)
<223>n is a，c，g，or t
<400>3
ggatcctgtt gactcgtgac cttaccccca accctgtgct ctctgaaaca tgagctgtgt     60
ccactcaggg ttaaatggat taagggcggt gcaagatgtg ctttgttaaa cagatgcttg    120
aaggcagcat gctcgttaag agtcatcacc aatccctaat ctcaagtaat cagggacaca    180
aacactgcgg aaggccgcag ggtcctctgc ctaggaaaac cagagacctt tgttcacttg    240
tttatctgac cttccctcca ctattgtcca tgaccctgcc aaatccccct ctgtgagaaa    300
cacccaagaa ttatcaataa aaaaataaat ttaaaaaaaa aatacaaaaa aaaaaaaaaa    360
aaaaaaaaaa gacttacgaa tagttattga taaatgaata gctattggta aagccaagta    420
aatgatcata ttcaaaacca gacggccatc atcacagctc aagtctacct gatttgatct    480
ctttatcatt gtcattcttt ggattcacta gattagtcat catcctcaaa attctccccc    540
aagttctaat tacgttccaa acatttaggg gttacatgaa gcttgaacct actaccttct     600
ttgcttttga gccatgagtt gtaggaatga tgagtttaca ccttacatgc tggggattaa     660
tttaaacttt acctctaagt cagttgggta gcctttggct tatttttgta gctaattttg     720
tagttaatgg atgcactgtg aatcttgcta tgatagtttt cctccacact ttgccactag     780
gggtaggtag gtactcagtt ttcagtaatt gcttacctaa gaccctaagc cctatttctc     840
ttgtactggc ctttatctgt aatatgggca tatttaatac aatataattt ttggagtttt     900
tttgtttgtt tgtttgtttg tttttttgag acggagtctt gcatctgtca tgcccaggct     960
ggagtagcag tggtgccatc tcggctcact gcaagctcca cctcccgagt tcacgccatt    1020
ttcctgcctc agcctcccga gtagctggga ctacaggcgc ccgccaccat gcccggctaa    1080
ttttttgtat ttttggtaga gacggggttt caccgtgtta gccagaatgg tctcgatctc    1140
ctgacttcgt gatccacccg cctcggcctc ccaaagttct gggattacag gtgtgagcca    1200
ccgcacctgg ccaatttttt gagtctttta aagtaaaaat atgtcttgta agctggtaac    1260
tatggtacat ttccttttat taatgtggtg ctgacggtca tataggttct tttgagtttg    1320
gcatgcatat gctacttttt gcagtccttt cattacattt ttctctcttc atttgaagag    1380
catgttatat cttttagctt cacttggctt aaaaggttct ctcattagcc taacacagtg    1440
tcattgttgg taccacttgg atcataagtg gaaaaacagt caagaaattg cacagtaata    1500
cttgtttgta agagggatga ttcaggtgaa tctgacacta agaaactccc ctacctgagg    1560
tctgagattc ctctgacatt gctgtatata ggcttttcct ttgacagcct gtgactgcgg    1620
actatttttc ttaagcaaga tatgctaaag ttttgtgagc ctttttccag agagaggtct    1680
catatctgca tcaagtgaga acatataatg tctgcatgtt tccatatttc aggaatgttt    1740
gcttgtgttt tatgctttta tatagacagg gaaacttgtt cctcagtgac ccaaaagagg    1800
tgggaattgt tattggatat catcattggc ccacgctttc tgaccttgga aacaattaag    1860
ggttcataat ctcaattctg tcagaattgg tacaagaaat agctgctatg tttcttgaca    1920
ttccacttgg taggaaataa gaatgtgaaa ctcttcagtt ggtgtgtgtc cctngttttt    1980
ttgcaatttc cttcttactg tgttaaaaaa aagtatgatc ttgctctgag aggtgaggca    2040
ttcttaatca tgatctttaa agatcaataa tataatcctt tcaaggatta tgtctttatt    2100
ataataaaga taatttgtct ttaacagaat caataatata atcccttaaa ggattatatc    2160
tttgctgggc gcagtggctc acacctgtaa tcccagcact ttgggtggcc aaggtggaag    2220
gatcaaattt gcctacttct atattatctt ctaaagcaga attcatctct cttccctcaa    2280
tatgatgata ttgacagggt ttgccctcac tcactagatt gtgagctcct gctcagggca    2340
ggtagcgttt tttgtttttg tttttgtttt tcttttttga gacagggtct tgctctgtca    2400
cccaggccag agtgcaatgg tacagtctca gctcactgca gcctcaaccg cctcggctca    2460
aaccatcatc ccatttcagc ctcctgagta gctgggacta caggcacatg ccattacacc    2520
tggctaattt ttttgtattt ctagtagaga cagggtttgg ccatgttgcc cgggctggtc    2580
tcgaactcct ggactcaagc aatccaccca cctcagcctc ccaaaatgag ggaccgtgtc    2640
ttattcattt ccatgtccct agtccatagc ccagtgctgg acctatggta gtactaaata    2700
aatatttgtt gaatgcaata gtaaatagca tttcagggag caagaactag attaacaaag    2760
gtggtaaaag gtttggagaa aaaaataata gtttaatttg gctagagtat gagggagagt    2820
agtaggagac aagatggaaa ggtctcttgg gcaaggtttt gaaggaagtt ggaagtcaga    2880
agtacacaat gtgcatatcg tggcaggcag tggggagcca atgaaggctt ttgagcagga    2940
gagtaatgtg ttgaaaaata aatataggtt aaacctatca gagcccctct gacacataca    3000
cttgcttttc attcaagctc aagtttgtct cccacatacc cattacttaa ctcaccctcg    3060
ggctccccta gcagcctgcc ctacctcttt acctgcttcc tggtggagtc agggatgtat    3120
acatgagctg ctttccctct cagccagagg acatgggggg ccccagctcc cctgcctttc    3180
cccttctgtg cctggagctg ggaagcaggc cagggttagc tgaggctggc tggcaagcag    3240
ctgggtggtg ccagggagag cctgcatagt gccaggtggt gccttgggtt ccaagctagt    3300
ccatggcccc gataaccttc tgcctgtgca cacacctgcc cctcactcca cccccatcct    3360
agctttggta tgggggagag ggcacagggc cagacaaacc tgtgagactt tggctccatc    3420
tctgcaaaag ggcgctctgt gagtcagcct gctcccctcc aggcttgctc ctcccccacc    3480
cagctctcgt ttccaatgca cgtacagccc gtacacaccg tgtgctggga caccccacag    3540
tcagccgcat ggctcccctg tgccccagcc cctggctccc tctgttgatc ccggcccctg    3600
ctccaggcct cactgtgcaa ctgctgctgt cactgctgct tctggtgcct gtccatcccc    3660
agaggttgcc ccggatgcag gaggattccc ccttgggagg aggctcttct ggggaagatg    3720
acccactggg cgaggaggat ctgcccagtg aagaggattc acccagagag gaggatccac    3780
ccggagagga ggatctacct ggagaggagg atctacctgg agaggaggat ctacctgaag    3840
ttaagcctaa atcagaagaa gagggctccc tgaagttaga ggatctacct actgttgagg    3900
ctcctggaga tcctcaagaa ccccagaata atgcccacag ggacaaagaa ggtaagtggt    3960
catcaatctc caaatccagg ttccaggagg ttcatgactc ccctcccata ccccagccta    4020
ggctctgttc actcagggaa ggaggggaga ctgtactccc cacagaagcc cttccagagg    4080
tcccatacca atatccccat ccccactctc ggaggtagaa agggacagat gtggagagaa    4140
aataaaaagg gtgcaaaagg agagaggtga gctggatgag atgggagaga agggggaggc    4200
tggagaagag aaagggatga gaactgcaga tgagagaaaa aatgtgcaga cagaggaaaa    4260
aaataggtgg agaaggagag tcagagagtt tgaggggaag agaaaaggaa agcttgggag    4320
gtgaagtggg taccagagac aagcaagaag agctggtaga agtcatctca tcttaggcta    4380
caatgaggaa ttgagaccta ggaagaaggg acacagcagg tagagaaacg tggcttcttg    4440
actcccaagc caggaatttg gggaaagggg ttggagacca tacaaggcag agggatgagt    4500
ggggagaaga aagaagggag aaaggaaaga tggtgtactc actcatttgg gactcaggac    4560
tgaagtgccc actcactttt tttttttttt tttttgagac aaactttcac ttttgttgcc    4620
caggctggag tgcaatggcg cgatctcggc tcactgcaac ctccacctcc cgggttcaag    4680
tgattctcct gcctcagcct ctagccaagt agctgcgatt acaggcatgc gccaccacgc    4740
ccggctaatt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcgc catgttggtc aggctggtct    4800
cgaactcctg atctcaggtg atccaaccac cctggcctcc caaagtgctg ggattatagg    4860
cgtgagccac agcgcctggc ctgaagcagc cactcacttt tacagaccct aagacaatga    4920
ttgcaagctg gtaggattgc tgtttggccc acccagctgc ggtgttgagt ttgggtgcgg    4980
tctcctgtgc tttgcacctg gcccgcttaa ggcatttgtt acccgtaatg ctcctgtaag    5040
gcatctgcgt ttgtgacatc gttttggtcg ccaggaaggg attggggctc taagcttgag    5100
cggttcatcc ttttcattta tacaggggat gaccagagtc attggcgcta tggaggtgag    5160
acacccaccc gctgcacaga cccaatctgg gaacccagct ctgtggatct cccctacagc    5220
cgtccctgaa cactggtccc gggcgtccca cccgccgccc accgtcccac cccctcacct    5280
tttctacccg ggttccctaa gttcctgacc taggcgtcag acttcctcac tatactctcc    5340
caccccaggc gacccgccct ggccccgggt gtccccagcc tgcgcgggcc gcttccagtc    5400
cccggtggat atccgccccc agctcgccgc cttctgcccg gccctgcgcc ccctggaact    5460
cctgggcttc cagctcccgc cgctcccaga actgcgcctg cgcaacaatg gccacagtgg    5520
tgagggggtc tccccgccga gacttgggga tggggcgggg cgcagggaag ggaaccgtcg    5580
cgcagtgcct gcccgggggt tgggctggcc ctaccgggcg gggccggctc acttgcctct    5640
ccctacgcag tgcaactgac cctgcctcct gggctagaga tggctctggg tcccgggcgg    5700
gagtaccggg ctctgcagct gcatctgcac tggggggctg caggtcgtcc gggctcggag    5760
cacactgtgg aaggccaccg tttccctgcc gaggtgagcg cggactggcc gagaaggggc    5820
aaaggagcgg ggcggacggg ggccagagac gtggccctct cctaccctcg tgtccttttc    5880
agatccacgt ggttcacctc agcaccgcct ttgccagagt tgacgaggcc ttggggcgcc    5940
cgggaggcct ggccgtgttg gccgcctttc tggaggtacc agatcctgga caccccctac    6000
tccccgcttt cccatcccat gctcctcccg gactctatcg tggagccaga gaccccatcc    6060
cagcaagctc actcaggccc ctggctgaca aactcattca cgcactgttt gttcatttaa    6120
cacccactgt gaaccaggca ccagccccca acaaggattc tgaagctgta ggtccttgcc    6180
tctaaggagc ccacagccag tgggggaggc tgacatgaca gacacatagg aaggacatag    6240
taaagatggt ggtcacagag gaggtgacac ttaaagcctt cactggtaga aaagaaaagg    6300
aggtgttcat tgcagaggaa acagaatgtg caaagactca gaatatggcc tatttaggga    6360
atggctacat acaccatgat tagaggaggc ccagtaaagg gaagggatgg tgagatgcct    6420
gctaggttca ctcactcact tttatttatt tatttatttt tttgacagtc tctctgtcgc    6480
ccaggctgga gtgcagtggt gtgatcttgg gtcactgcaa cttccgcctc ccgggttcaa    6540
gggattctcc tgcctcagct tcctgagtag ctggggttac aggtgtgtgc caccatgccc    6600
agctaatttt tttttgtatt tttagtagac agggtttcac catgttggtc aggctggtct    6660
caaactcctg gcctcaagtg atccgcctga ctcagcctac caaagtgctg attacaagtg    6720
tgagccaccg tgcccagcca cactcactga ttctttaatg ccagccacac agcacaaagt    6780
tcagagaaat gcctccatca tagcatgtca atatgttcat actcttaggt tcatgatgtt    6840
cttaacatta ggttcataag caaaataaga aaaaagaata ataaataaaa gaagtggcat    6900
gtcaggacct cacctgaaaa gccaaacaca gaatcatgaa ggtgaatgca gaggtgacac    6960
caacacaaag gtgtatatat ggtttcctgt ggggagtatg tacggaggca gcagtgagtg    7020
agactgcaaa cgtcagaagg gcacgggtca ctgagagcct agtatcctag taaagtgggc    7080
tctctccctc tctctccagc ttgtcattga aaaccagtcc accaagcttg ttggttcgca    7140
cagcaagagt acatagagtt tgaaataata cataggattt taagagggag acactgtctc    7200
taaaaaaaaa aacaacagca acaacaaaaa gcaacaacca ttacaatttt atgttccctc    7260
agcattctca gagctgagga atgggagagg actatgggaa cccccttcat gttccggcct    7320
tcagccatgg ccctggatac atgcactcat ctgtcttaca atgtcattcc cccaggaggg    7380
cccggaagaa aacagtgcct atgagcagtt gctgtctcgc ttggaagaaa tcgctgagga    7440
aggtcagttt gttggtctgg ccactaatct ctgtggccta gttcataaag aatcaccctt    7500
tggagcttca ggtctgaggc tggagatggg ctccctccag tgcaggaggg attgaagcat    7560
gagccagcgc tcatcttgat aataaccatg aagctgacag acacagttac ccgcaaacgg    7620
ctgcctacag attgaaaacc aagcaaaaac cgccgggcac ggtggctcac gcctgtaatc    7680
ccagcacttt gggaggccaa ggcaggtgga tcacgaggtc aagagatcaa gaccatcctg    7740
gccaacatgg tgaaacccca tctctactaa aaatacgaaa aaatagccag gcgtggtggc    7800
gggtgcctgt aatcccagct actcgggagg ctgaggcagg agaatggcat gaacccggga    7860
ggcagaagtt gcagtgagcc gagatcgtgc cactgcactc cagcctgggc aacagagcga    7920
gactcttgtc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaaaaccaag caaaaaccaa aatgagacaa    7980
aaaaaacaag accaaaaaat ggtgtttgga aattgtcaag gtcaagtctg gagagctaaa    8040
ctttttctga gaactgttta tctttaataa gcatcaaata ttttaacttt gtaaatactt    8100
ttgttggaaa tcgttctctt cttagtcact cttgggtcat tttaaatctc acttactcta    8160
ctagaccttt taggtttctg ctagactagg tagaactctg cctttgcatt tcttgtgtct    8220
gttttgtata gttatcaata ttcatattta tttacaagtt attcagatca ttttttcttt    8280
tctttttttt tttttttttt ttttttacat ctttagtaga gacagggttt caccatattg    8340
gccaggctgc tctcaaactc ctgaccttgt gatccaccag cctcggcctc ccaaagtgct    8400
gggattcatt ttttcttttt aatttgctct gggcttaaac ttgtggccca gcactttatg    8460
atggtacaca gagttaagag tgtagactca gacggtcttt cttctttcct tctcttcctt    8520
cctcccttcc ctcccacctt cccttctctc cttcctttct ttcttcctct cttgcttcct    8580
caggcctctt ccagttgctc caaagccctg tacttttttt tgagttaacg tcttatggga    8640
agggcctgca cttagtgaag aagtggtctc agagttgagt taccttggct tctgggaggt    8700
gaaactgtat ccctataccc tgaagcttta agggggtgca atgtagatga gaccccaaca    8760
tagatcctct tcacaggctc agagactcag gtcccaggac tggacatatc tgcactcctg    8820
ccctctgact tcagccgcta cttccaatat gaggggtctc tgactacacc gccctgtgcc    8880
cagggtgtca tctggactgt gtttaaccag acagtgatgc tgagtgctaa gcaggtgggc    8940
ctggggtgtg tgtggacaca gtgggtgcgg gggaaagagg atgtaagatg agatgagaaa    9000
caggagaaga aagaaatcaa ggctgggctc tgtggcttac gcctataatc ccaccacgtt    9060
gggaggctga ggtgggagaa tggtttgagc ccaggagttc aagacaaggc ggggcaacat    9120
agtgtgaccc catctctacc aaaaaaaccc caacaaaacc aaaaatagcc gggcatggtg    9180
gtatgcggcc tagtcccagc tactcaagga ggctgaggtg ggaagatcgc ttgattccag    9240
gagtttgaga ctgcagtgag ctatgatccc accactgcct accatcttta ggatacattt    9300
atttatttat aaaagaaatc aagaggctgg atggggaata caggagctgg agggtggagc    9360
cctgaggtgc tggttgtgag ctggcctggg acccttgttt cctgtcatgc catgaaccca    9420
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ccattcagcc ccagggctgc tcaggaccgc ctctgctccc tctccttttc tgcagaacag    9840
accccaaccc caatattaga gaggcagatc atggtgggga ttcccccatt gtccccagag    9900
gctaattgat tagaatgaag cttgagaaat ctcccagcat ccctctcgca aaagaatccc     9960
cccccctttt tttaaagata gggtctcact ctgtttgccc caggctgggg tgttgtggca    10020
cgatcatagc tcactgcagc ctcgaactcc taggctcagg caatcctttc accttagctt    10080
ctcaaagcac tgggactgta ggcatgagcc actgtgcctg gccccaaacg gcccttttac    10140
ttggctttta ggaagcaaaa acggtgctta tcttacccct tctcgtgtat ccaccctcat    10200
cccttggctg gcctcttctg gagactgagg cactatgggg ctgcctgaga actcggggca    10260
ggggtggtgg agtgcactga ggcaggtgtt gaggaactct gcagacccct cttccttccc    10320
aaagcagccc tctctgctct ccatcgcagg tgacatccta gccctggttt ttggcctcct    10380
ttttgctgtc accagcgtcg cgttccttgt gcagatgaga aggcagcaca ggtattacac    10440
tgaccctttc ttcaggcaca agcttccccc acccttgtgg agtcacttca tgcaaagcgc    10500
atgcaaatga gctgctcctg ggccagtttt ctgattagcc tttcctgttg tgtacacaca    10560
gaaggggaac caaagggggt gtgagctacc gcccagcaga ggtagccgag actggagcct    10620
agaggctgga tcttggagaa tgtgagaagc cagccagagg catctgaggg ggagccggta    10680
actgtcctgt cctgctcatt atgccacttc cttttaactg ccaagaaatt ttttaaaata    10740
aatatttata ataaaatatg tgttagtcac ctttgttccc caaatcagaa ggaggtattt    10800
gaatttccta ttactgttat tagcaccaat ttagtggtaa tgcatttatt ctattacagt    10860
tcggcctcct tccacacatc actccaatgt gttgctcc                            10898
<210>4
<211>37
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu
            20                  25                  30
Met Pro Val His Pro
        35
<210>5
<211>377
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro Leu Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu Glu
            20                  25                  30
Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly
        35                  40                  45
Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Glu Val Lys Pro Lys
    50                  55                  60
Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Pro Thr Val Glu
65                  70                  75                  80
Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn Ala His Arg Asp Lys
                85                  90                  95
Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Pro Trp
            100                 105                 110
Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp
        115                 120                 125
Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala Leu Arg Pro Leu Glu
    130                 135                 140
Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Leu Arg Leu Arg Asn
145                 150                 155                 160
Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Glu Met Ala
                165                 170                 175
Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp
            180                 185                 190
Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr Val Glu Gly His Arg
        195                 200                 205
Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg
    210                 215                 220
Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala
225                 230                 235                 240
Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu
                245                 250                 255
Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser Glu Thr Gln Val Pro
            260                 265                 270
Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Phe Ser Arg Tyr Phe
        275                 280                 285
Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ala Gln Gly Val Ile
    290                 295                 300
Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser Ala Lys Gln Leu His
305                 310                 315                 320
Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp Ser Arg Leu Gln Leu
                325                 330                 335
Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Val Ile Glu Ala Ser
            340                 345                 350
Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser Pro Arg Ala Ala Glu Pro Val Gln
        355                 360                 365
Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly Asp
    370                 375
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Ile Leu Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val Ala
1               5                   10                  15
Phe Leu Val Gln
            20
<210>7
<211>25
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser Tyr Arg
1               5                   10                  15
Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala
            20                  25
<210>8
<211>59
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
            20                  25                  30
Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Glu Val Lys Pro
        35                  40                  45
Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu
    50                  55
<210>9
<211>257
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Pro Trp Pro
1               5                   10                  15
Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp Ile
            20                  25                  30
Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala Leu Arg Pro Leu Glu Leu
        35                  40                  45
Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Leu Arg Leu Arg Asn Asn
    50                  55                  60
Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Glu Met Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp Gly
                85                  90                  95
Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr Val Glu Gly His Arg Phe
            100                 105                 110
Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Val
        115                 120                 125
Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe
    130                 135                 140
Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu Ser
145                 150                 155                 160
Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser Glu Thr Gln Val Pro Gly
                165                 170                 175
Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Phe Ser Arg Tyr Phe Gln
            180                 185                 190
Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ala Gln Gly Val Ile Trp
        195                 200                 205
Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser Ala Lys Gln Leu His Thr
    210                 215                 220
Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp Ser Arg Leu Gln Leu Asn
225                 230                 235                 240
Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Val Ile Glu Ala Ser Phe
                245                 250                 255
Pro
<210>10
<211>59
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Ser Ala Ser Glu Glu Pro Ser Pro Ser Glu Val Pro Phe Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Pro Ser Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Arg Pro Phe Pro
            20                  25                  30
Ser Val Val Leu Phe Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Lys Glu Pro
        35                  40                  45
Ser Pro Ser Glu Glu Pro Ser Ala Ser Glu Glu
    50                  55
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
1               5
<210>12
<211>36
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp
1               5                   10                  15
Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu
            20                  25                  30
Glu Asp Leu Pro
        35
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Gly Glu Glu Asp Leu Pro
1               5
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Glu Glu Asp Leu
1
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Glu Glu Asp Leu Pro
1               5
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Glu Asp Leu Pro Ser Glu
1               5
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>17
Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu
1               5
<210>18
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Asp Leu Pro Gly Glu Glu
1               5
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Glu Glu Asp Leu Pro Ser
1               5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Gly Glu Asp Asp Pro Leu
1               5
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>21
His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro Leu Gly Gly
1               5                   10                  15
<210>22
<211>24
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly
            20
<210>23
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Asn Asn Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg
1               5                   10                  15
Tyr Gly Gly Asp Pro
            20
<210>24
<211>540
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(540)
<400>24
cttgcttttc attcaagctc aagtttgtct cccacatacc cattacttaa ctcaccctcg     60
ggctccccta gcagcctgcc ctacctcttt acctgcttcc tggtggagtc agggatgtat    120
acatgagctg ctttccctct cagccagagg acatgggggg ccccagctcc cctgcctttc    180
cccttctgtg cctggagctg ggaagcaggc cagggttagc tgaggctggc tggcaagcag    240
ctgggtggtg ccagggagag cctgcatagt gccaggtggt gccttgggtt ccaagctagt    300
ccatggcccc gataaccttc tgcctgtgca cacacctgcc cctcactcca cccccatcct    360
agctttggta tgggggagag ggcacagggc cagacaaacc tgtgagactt tggctccatc    420
tctgcaaaag ggcgctctgt gagtcagcct gctcccctcc aggcttgctc ctcccccacc    480
cagctctcgt ttccaatgca cgtacagccc gtacacaccg tgtgctggga caccccacag    540
<210>25
<211>445
<212>DNA
<213>智人
<400>25
gcccgtacac accgtgtgct gggacacccc acagtcagcc gcatggctcc cctgtgcccc     60
agcccctggc tccctctgtt gatcccggcc cctgctccag gcctcactgt gcaactgctg    120
ctgtcactgc tgcttctggt gcctgtccat ccccagaggt tgccccggat gcaggaggat    180
tcccccttgg gaggaggctc ttctggggaa gatgacccac tgggcgagga ggatctgccc    240
agtgaagagg attcacccag agaggaggat ccacccggag aggaggatct acctggagag    300
gaggatctac ctggagagga ggatctacct gaagttaagc ctaaatcaga agaagagggc    360
tccctgaagt tagaggatct acctactgtt gaggctcctg gagatcctca agaaccccag    420
aataatgccc acagggacaa agaag                                          445
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>智人
<400>26
gggatgacca gagtcattgg cgctatggag                                      30
<210>27
<211>171
<212>DNA
<213>智人
<400>27
gcgacccgcc ctggccccgg gtgtccccag cctgcgcggg ccgcttccag tccccggtgg     60
atatccgccc ccagctcgcc gccttctgcc cggccctgcg ccccctggaa ctcctgggct    120
tccagctccc gccgctccca gaactgcgcc tgcgcaacaa tggccacagt g             171
<210>28
<211>143
<212>DNA
<213>智人
<400>28
tgcaactgac cctgcctcct gggctagaga tggctctggg tcccgggcgg gagtaccggg     60
ctctgcagct gcatctgcac tggggggctg caggtcgtcc gggctcggag cacactgtgg    120
aaggccaccg tttccctgcc gag                                            143
<210>29
<211>93
<212>DNA
<213>智人
<400>29
atccacgtgg ttcacctcag caccgccttt gccagagttg acgaggcctt ggggcgcccg     60
ggaggcctgg ccgtgttggc cgcctttctg gag                                  93
<210>30
<211>67
<212>DNA
<213>智人
<400>30
gagggcccgg aagaaaacag tgcctatgag cagttgctgt ctcgcttgga agaaatcgct     60
gaggaag                                                               67
<210>31
<211>158
<212>DNA
<213>智人
<400>31
gctcagagac tcaggtccca ggactggaca tatctgcact cctgccctct gacttcagcc     60
gctacttcca atatgagggg tctctgacta caccgccctg tgcccagggt gtcatctgga    120
ctgtgtttaa ccagacagtg atgctgagtg ctaagcag                            158
<210>32
<211>145
<212>DNA
<213>智人
<400>32
ctccacaccc tctctgacac cctgtgggga cctggtgact ctcggctaca gctgaacttc     60
cgagcgacgc agcctttgaa tgggcgagtg attgaggcct ccttccctgc tggagtggac    120
agcagtcctc gggctgctga gccag                                          145
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>智人
<400>33
tccagctgaa ttcctgcctg gctgctg                                         27
<210>34
<211>82
<212>DNA
<213>智人
<400>34
gtgacatcct agccctggtt tttggcctcc tttttgctgt caccagcgtc gcgttccttg     60
tgcagatgag aaggcagcac ag                                              82
<210>35
<211>191
<212>DNA
<213>智人
<400>35
aaggggaacc aaagggggtg tgagctaccg cccagcagag gtagccgaga ctggagccta     60
gaggctggat cttggagaat gtgagaagcc agccagaggc atctgagggg gagccggtaa    120
ctgtcctgtc ctgctcatta tgccacttcc ttttaactgc caagaaattt tttaaaataa    180
atatttataa t                                                         191
<210>36
<211>1174
<212>DNA
<213>智人
<400>36
gtaagtggtc atcaatctcc aaatccaggt tccaggaggt tcatgactcc cctcccatac     60
cccagcctag gctctgttca ctcagggaag gaggggagac tgtactcccc acagaagccc    120
ttccagaggt cccataccaa tatccccatc cccactctcg gaggtagaaa gggacagatg    180
tggagagaaa ataaaaaggg tgcaaaagga gagaggtgag ctggatgaga tgggagagaa    240
gggggaggct ggagaagaga aagggatgag aactgcagat gagagaaaaa atgtgcagac    300
agaggaaaaa aataggtgga gaaggagagt cagagagttt gaggggaaga gaaaaggaaa    360
gcttgggagg tgaagtgggt accagagaca agcaagaaga gctggtagaa gtcatctcat    420
cttaggctac aatgaggaat tgagacctag gaagaaggga cacagcaggt agagaaacgt    480
ggcttcttga ctcccaagcc aggaatttgg ggaaaggggt tggagaccat acaaggcaga    540
gggatgagtg gggagaagaa agaagggaga aaggaaagat ggtgtactca ctcatttggg    600
actcaggact gaagtgccca ctcacttttt tttttttttt ttttgagaca aactttcact    660
tttgttgccc aggctggagt gcaatggcgc gatctcggct cactgcaacc tccacctccc    720
gggttcaagt gattctcctg cctcagcctc tagccaagta gctgcgatta caggcatgcg    780
ccaccacgcc cggctaattt ttgtattttt agtagagacg gggtttcgcc atgttggtca    840
ggctggtctc gaactcctga tctcaggtga tccaaccacc ctggcctccc aaagtgctgg    900
gattataggc gtgagccaca gcgcctggcc tgaagcagcc actcactttt acagacccta    960
agacaatgat tgcaagctgg taggattgct gtttggccca cccagctgcg gtgttgagtt    1020
tgggtgcggt ctcctgtgct ttgcacctgg cccgcttaag gcatttgtta cccgtaatgc    1080
tcctgtaagg catctgcgtt tgtgacatcg ttttggtcgc caggaaggga ttggggctct    1140
aagcttgagc ggttcatcct tttcatttat acag                                1174
<210>37
<211>193
<212>DNA
<213>智人
<400>37
gtgagacacc cacccgctgc acagacccaa tctgggaacc cagctctgtg gatctcccct      60
acagccgtcc ctgaacactg gtcccgggcg tcccacccgc cgcccaccgt cccaccccct     120
caccttttct acccgggttc cctaagttcc tgacctaggc gtcagacttc ctcactatac     180
tctcccaccc cag                                                        193
<210>38
<211>131
<212>DNA
<213>智人
<400>38
gtgagggggt ctccccgccg agacttgggg atggggcggg gcgcagggaa gggaaccgtc      60
gcgcagtgcc tgcccggggg ttgggctggc cctaccgggc ggggccggct cacttgcctc     120
tccctacgca g                                                          131
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<211>89
<212>DNA
<213>智人
<400>39
gtgagcgcgg actggccgag aaggggcaaa ggagcggggc ggacgggggc cagagacgtg      60
gccctctcct accctcgtgt ccttttcag                                        89
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<211>1400
<212>DNA
<213>智人
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gtaccagatc ctggacaccc cctactcccc gctttcccat cccatgctcc tcccggactc     60
tatcgtggag ccagagaccc catcccagca agctcactca ggcccctggc tgacaaactc    120
attcacgcac tgtttgttca tttaacaccc actgtgaacc aggcaccagc ccccaacaag    180
gattctgaag ctgtaggtcc ttgcctctaa ggagcccaca gccagtgggg gaggctgaca    240
tgacagacac ataggaagga catagtaaag atggtggtca cagaggaggt gacacttaaa    300
gccttcactg gtagaaaaga aaaggaggtg ttcattgcag aggaaacaga atgtgcaaag    360
actcagaata tggcctattt agggaatggc tacatacacc atgattagag gaggcccagt    420
aaagggaagg gatggtgaga tgcctgctag gttcactcac tcacttttat ttatttattt    480
atttttttga cagtctctct gtcgcccagg ctggagtgca gtggtgtgat cttgggtcac    540
tgcaacttcc gcctcccggg ttcaagggat tctcctgcct cagcttcctg agtagctggg    600
gttacaggtg tgtgccacca tgcccagcta attttttttt gtatttttag tagacagggt    660
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cctaccaaag tgctgattac aagtgtgagc caccgtgccc agccacactc actgattctt    780
taatgccagc cacacagcac aaagttcaga gaaatgcctc catcatagca tgtcaatatg    840
ttcatactct taggttcatg atgttcttaa cattaggttc ataagcaaaa taagaaaaaa    900
gaataataaa taaaagaagt ggcatgtcag gacctcacct gaaaagccaa acacagaatc    960
atgaaggtga atgcagaggt gacaccaaca caaaggtgta tatatggttt cctgtgggga   1020
gtatgtacgg aggcagcagt gagtgagact gcaaacgtca gaagggcacg ggtcactgag   1080
agcctagtat cctagtaaag tgggctctct ccctctctct ccagcttgtc attgaaaacc   1140
agtccaccaa gcttgttggt tcgcacagca agagtacata gagtttgaaa taatacatag   1200
gattttaaga gggagacact gtctctaaaa aaaaaaacaa cagcaacaac aaaaagcaac   1260
aaccattaca attttatgtt ccctcagcat tctcagagct gaggaatggg agaggactat   1320
gggaaccccc ttcatgttcc ggccttcagc catggccctg gatacatgca ctcatctgtc   1380
ttacaatgtc attcccccag                                               1400
<210>41
<211>1334
<212>DNA
<213>智人
<400>41
gtcagtttgt tggtctggcc actaatctct gtggcctagt tcataaagaa tcaccctttg     60
gagcttcagg tctgaggctg gagatgggct ccctccagtg caggagggat tgaagcatga    120
gccagcgctc atcttgataa taaccatgaa gctgacagac acagttaccc gcaaacggct    180
gcctacagat tgaaaaccaa gcaaaaaccg ccgggcacgg tggctcacgc ctgtaatccc    240
agcactttgg gaggccaagg caggtggatc acgaggtcaa gagatcaaga ccatcctggc    300
caacatggtg aaaccccatc tctactaaaa atacgaaaaa atagccaggc gtggtggcgg    360
gtgcctgtaa tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aatggcatga acccgggagg    420
cagaagttgc agtgagccga gatcgtgcca ctgcactcca gcctgggcaa cagagcgaga    480
ctcttgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaga aaaccaagca aaaaccaaaa tgagacaaaa    540
aaaacaagac caaaaaatgg tgtttggaaa ttgtcaaggt caagtctgga gagctaaact    600
ttttctgaga actgtttatc tttaataagc atcaaatatt ttaactttgt aaatactttt    660
gttggaaatc gttctcttct tagtcactct tgggtcattt taaatctcac ttactctact    720
agacctttta ggtttctgct agactaggta gaactctgcc tttgcatttc ttgtgtctgt    780
tttgtatagt tatcaatatt catatttatt tacaagttat tcagatcatt ttttcttttc    840
tttttttttt tttttttttt ttttacatct ttagtagaga cagggtttca ccatattggc    900
caggctgctc tcaaactcct gaccttgtga tccaccagcc tcggcctccc aaagtgctgg    960
gattcatttt ttctttttaa tttgctctgg gcttaaactt gtggcccagc actttatgat   1020
ggtacacaga gttaagagtg tagactcaga cggtctttct tctttccttc tcttccttcc   1080
tcccttccct cccaccttcc cttctctcct tcctttcttt cttcctctct tgcttcctca   1140
ggcctcttcc agttgctcca aagccctgta cttttttttg agttaacgtc ttatgggaag   1200
ggcctgcact tagtgaagaa gtggtctcag agttgagtta ccttggcttc tgggaggtga   1260
aactgtatcc ctataccctg aagctttaag ggggtgcaat gtagatgaga ccccaacata   1320
gatcctcttc acag                                                     1334
<210>42
<211>512
<212>DNA
<213>智人
<400>42
gtgggcctgg ggtgtgtgtg gacacagtgg gtgcggggga aagaggatgt aagatgagat     60
gagaaacagg agaagaaaga aatcaaggct gggctctgtg gcttacgcct ataatcccac    120
cacgttggga ggctgaggtg ggagaatggt ttgagcccag gagttcaaga caaggcgggg    180
caacatagtg tgaccccatc tctaccaaaa aaaccccaac aaaaccaaaa atagccgggc    240
atggtggtat gcggcctagt cccagctact caaggaggct gaggtgggaa gatcgcttga    300
ttccaggagt ttgagactgc agtgagctat gatcccacca ctgcctacca tctttaggat    360
acatttattt atttataaaa gaaatcaaga ggctggatgg ggaatacagg agctggaggg    420
tggagccctg aggtgctggt tgtgagctgg cctgggaccc ttgtttcctg tcatgccatg    480
aacccaccca cactgtccac tgacctccct ag                                  512
<210>43
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<212>DNA
<213>智人
<400>43
gtacagcttt gtctggtttc cccccagcca gtagtccctt atcctcccat gtgtgtgcca     60
gtgtctgtca ttggtggtca cagcccgcct ctcacatctc ctttttctct ccag          114
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<212>DNA
<213>智人
<400>44
gtgagtctgc ccctcctctt ggtcctgatg ccaggagact cctcagcacc attcagcccc     60
agggctgctc aggaccgcct ctgctccctc tccttttctg cagaacagac cccaacccca    120
atattagaga ggcagatcat ggtggggatt cccccattgt ccccagaggc taattgatta    180
gaatgaagct tgagaaatct cccagcatcc ctctcgcaaa agaatccccc cccctttttt    240
taaagatagg gtctcactct gtttgcccca ggctggggtg ttgtggcacg atcatagctc    300
actgcagcct cgaactccta ggctcaggca atcctttcac cttagcttct caaagcactg    360
ggactgtagg catgagccac tgtgcctggc cccaaacggc ccttttactt ggcttttagg    420
aagcaaaaac ggtgcttatc ttaccccttc tcgtgtatcc accctcatcc cttggctggc    480
ctcttctgga gactgaggca ctatggggct gcctgagaac tcggggcagg ggtggtggag    540
tgcactgagg caggtgttga ggaactctgc agacccctct tccttcccaa agcagccctc    600
tctgctctcc atcgcag                                                   617
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<212>DNA
<213>智人
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gtattacact gaccctttct tcaggcacaa gcttccccca cccttgtgga gtcacttcat     60
gcaaagcgca tgcaaatgag ctgctcctgg gccagttttc tgattagcct ttcctgttgt    120
gtacacacag                                                           130
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<212>DNA
<213>智人
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<213>智人
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<213>智人
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<212>DNA
<213>智人
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<212>RNA
<213>智人
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gcuuugguau gggggagagg gcacagggcc agacaaaccu gugagacuuu ggcuccaucu    120
cugcaaaagg gcgcucugug agucagccug cuccccucca ggcuugcucc ucccccaccc    180
agcucucguu uccaaugcac guacagcccg uacacaccgu gugcugggac accccacagu    240
cagccgcaug gcuccccugu gccccagccc cuggcucccu cuguugaucc cggccccugc    300
uccaggccuc acugugcaac ugcugcuguc acugcugcuu cuggugccug uccaucccca    360
gagguugccc cggaugcagg aggauucccc cuugggagga ggcucuucug gggaagauga    420
cccacugggc gaggaggauc ugcccaguga agaggauuca cccagagagg               470
<210>67
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln
1               5                   10
<210>68
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>68
Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser Tyr Arg
1               5                   10                  15
<210>69
<211>232
<212>PRT
<213>智人
<400>69
Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala Leu Arg Pro Leu Glu
1               5                   10                  15
Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Leu Arg Leu Arg Asn
            20                  25                  30
Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Glu Met Ala
        35                  40                  45
Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp
    50                  55                  60
Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr Val Glu Gly His Arg
65                  70                  75                  80
Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg
                85                  90                  95
Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala
            100                 105                 110
Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser Glu Thr Gln Val Pro
    130                 135                 140
Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Phe Ser Arg Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ala Gln Gly Val Ile
                165                 170                 175
Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser Ala Lyg Gln Leu His
            180                 185                 190
Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp Ser Arg Leu Gln Leu
        195                 200                 205
Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Val Ile Glu Ala Ser
    210                 215                 220
Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser
225                 230
<210>70
<211>1552
<212>DNA
<213>智人
<300>
<308>EMBL登录号    X66839
<309>1995-10-10
<313>(1)..(1552)
<400>70
gcccgtacac accgtgtgct gggacacccc acagtcagcc gcatggctcc cctgtgcccc     60
agcccctggc tccctctgtt gatcccggcc cctgctccag gcctcactgt gcaactgctg    120
ctgtcactgc tgcttctgat gcctgtccat ccccagaggt tgccccggat gcaggaggat    180
tcccccttgg gaggaggctc ttctggggaa gatgacccac tgggcgagga ggatctgccc    240
agtgaagagg attcacccag agaggaggat ccacccggag aggaggatct acctggagag    300
gaggatctac ctggagagga ggatctacct gaagttaagc ctaaatcaga agaagagggc    360
tccctgaagt tagaggatct acctactgtt gaggctcctg gagatcctca agaaccccag    420
aataatgccc acagggacaa agaaggggat gaccagagtc attggcgcta tggaggcgac    480
ccgccctggc cccgggtgtc cccagcctgc gcgggccgct tccagtcccc ggtggatatc    540
cgcccccagc tcgccgcctt ctgcccggcc ctgcgccccc tggaactcct gggcttccag    600
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cctgccgaga tccacgtggt tcacctcagc accgcctttg ccagagttga cgaggccttg    840
gggcgcccgg gaggcctggc cgtgttggcc gcctttctgg aggagggccc ggaagaaaac    900
agtgcctatg agcagttgct gtctcgcttg gaagaaatcg ctgaggaagg ctcagagact    960
caggtcccag gactggacat atctgcactc ctgccctctg acttcagccg ctacttccaa   1020
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cagacagtga tgctgagtgc taagcagctc cacaccctct ctgacaccct gtggggacct    1140
ggtgactctc ggctacagct gaacttccga gcgacgcagc ctttgaatgg gcgagtgatt    1200
gaggcctcct tccctgctgg agtggacagc agtcctcggg ctgctgagcc agtccagctg    1260
aattcctgcc tggctgctgg tgacatccta gccctggttt ttggcctcct ttttgctgtc    1320
accagcgtcg cgttccttgt gcagatgaga aggcagcaca gaaggggaac caaagggggt    1380
gtgagctacc gcccagcaga ggtagccgag actggagcct agaggctgga tcttggagaa    1440
tgtgagaagc cagccagagg catctgaggg ggagccggta actgtcctgt cctgctcatt    1500
atgccacttc cttttaactg ccaagaaatt ttttaaaata aatatttata at            1552
<210>71
<211>1965
<212>DNA
<213>小鼠
<400>71
acagtgtgtc ctgggacacc ccagtcagct gcatggcctc cctgggcccc agcccctggg     60
cccctttgtc gaccccagcc cctactgcac agctgctgct gttcctgctg ctccaagtgt    120
ctgctcagcc ccagggcctg tccgggatgc agggggagcc ctccttggga gacagttcat    180
ctggggagga tgagctgggc gtggatgttc tgcccagtga agaggatgca cctgaagagg    240
cggatccacc cgatggggag gatccacctg aagttaattc tgaagacagg atggaggagt    300
cccttgggtt agaggatcta tcgactcccg aggctcctga gcacagtcaa ggttcccacg    360
gggatgaaaa agggggtggc cacagtcatt ggagctatgg aggcacccta ctctggcccc    420
aggtgtcccc agcctgtgct ggccgctttc agtccccggt agacatccgc ctggagcgca    480
ccgcattctg ccgcactctg caacccctgg aacttctggg ttatgagctc cagcctctcc    540
cggaactgag cctatccaac aatggccaca cggtacagct gactctgccg ccggggctga    600
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acgtggtgca cctcagtact gctttctccg aacttcatga agccttgggc cgcccaggag    780
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agctgaggag gcagcacagg cacagaagtg ggaccaaaga tagagttagc tacagtccgg    1320
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tgtcctgtcc tgcctgttat acagcctcct ttttaaccac tacgaaatca tttccatctt    1440
tttaactttc ttctttcctt aaagtactgt gataggagct aaccgtgaaa aaacaagatt    1500
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gctgtcctgg gactcactct gtagcctagg ctggccttga actcagagat ccgattgcct    1620
ctgccttctt agtgccagga ctgagggtat gtaccactac caccgccacc ccgcaattct    1680
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1               5                   10                  15
Pro Thr Ala Gln Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gln Val  Ser Ala Gln
            20                  25                  30
Pro Gln Gly Leu Ser Gly Met Gln Gly Glu Pro Ser Leu Gly Asp Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Gly Glu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Leu Pro Ser Glu Glu
    50                  55                  60
Asp Ala Pro Glu Glu Ala Asp Pro Pro Asp Gly Glu Asp Pro Pro Glu
65                  70                  75                  80
Val Asn Ser Glu Asp Arg Met Glu Glu Ser Leu Gly Leu Glu Asp Leu
                85                  90                  95
Ser Thr Pro Glu Ala Pro Glu His Ser Gln Gly Ser His Gly Asp Glu
            100                 105                 110
Lys Gly Gly Gly His Ser His Trp Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Leu Trp
        115                 120                 125
Pro Gln Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp
    130                 135                 140
Ile Arg Leu Glu Arg Thr Ala Phe Cys Arg Thr Leu Gln Pro Leu Glu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Gly Tyr Glu Leu Gln Pro Leu Pro Glu Leu Ser Leu Ser Asn
                165                 170                 175
Asn Gly His Thr Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Lys Met Ala
            180                 185                 190
Leu Gly Pro Gly Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp
        195                 200                 205
Gly Thr Ser Asp His Pro Gly Ser Glu His Thr Val Asn Gly His Arg
    210                 215                 220
Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ser Glu
225                 230                 235                 240
Leu His Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala
                245                 250                 255
Phe Leu Gln Glu Ser Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu
            260                 265                 270
Ser His Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Gly Ser Lys Ile Glu Ile Pro
        275                 280                 285
Gly Leu Asp Val Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Tyr Tyr
    290                 295                 300
Arg Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ser Gln Gly Val Ile
305                 310                 315                 320
Trp Thr Val Phe Asn Glu Thr Val Lys Leu Ser Ala Lys Gln Leu His
                325                 330                 335
Thr Leu Ser Val Ser Leu Trp Gly Pro Arg Asp Ser Arg Leu Gln Leu
            340                 345                 350
Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Thr Ile Glu Ala Ser
        355                 360                 365
Phe Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Pro Glu Pro Val His Val Asn Ser
    370                 375                 380
Cys Phe Thr Ala Gly Asp Ile Leu Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe
385                 390                 395                 400
Ala Val Thr Ser Ile Ala Phe Leu Leu Gln Leu Arg Arg Gln His Arg
                405                 410                 415
His Arg Ser Gly Thr Lys Asp Arg Val Ser Tyr Ser Pro Ala Glu Met
            420                 425                 430
Thr Glu Thr Gly Ala
        435
<210>74
<211>31
<212>PRT
<213>小鼠
<400>74
Met Ala Ser Leu Gly Pro Ser Pro Trp Ala Pro Leu Ser Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Thr Ala Gln Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gln Val Ser Ala
            20                  25                  30
<210>75
<211>358
<212>PRT
<213>小鼠
<400>75
Gln Pro Gln Gly Leu Ser Gly Met Gln Gly Glu Pro Ser Leu Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Ser Gly Glu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Leu Pro Ser Glu
            20                  25                  30
Glu Asp Ala Pro Glu Glu Ala Asp Pro Pro Asp Gly Glu Asp Pro Pro
        35                  40                  45
Glu Val Asn Ser Glu Asp Arg Met Glu Glu Ser Leu Gly Leu Glu Asp
    50                  55                  60
Leu Ser Thr Pro Glu Ala Pro Glu His Ser Gln Gly Ser His Gly Asp
65                  70                  75                  80
Glu Lys Gly Gly Gly His Ser His Trp Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Leu
                85                  90                  95
Trp Pro Gln Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val
            100                 105                 110
Asp Ile Arg Leu Glu Arg Thr Ala Phe Cys Arg Thr Leu Gln Pro Leu
        115                 120                 125
Glu Leu Leu Gly Tyr Glu Leu Gln Pro Leu Pro Glu Leu Ser Leu Ser
    130                 135                 140
Asn Asn Gly His Thr Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Lys Met
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Pro Gly Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His
                165                 170                 175
Trp Gly Thr Ser Asp His Pro Gly Ser Glu His Thr Val Asn Gly His
            180                 185                 190
Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ser
        195                 200                 205
Glu Leu His Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala
    210                 215                 220
Ala Phe Leu Gln Glu Ser Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu
225                 230                 235                 240
Leu Ser His Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Gly Ser Lys Ile Glu Ile
                245                 250                 255
Pro Gly Leu Asp Val Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Tyr
            260                 265                 270
Tyr Arg Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ser Gln Gly Val
        275                 280                 285
Ile Trp Thr Val Phe Asn Glu Thr Val Lys Leu Ser Ala Lys Gln Leu
    290                 295                 300
His Thr Leu Ser Val Ser Leu Trp Gly Pro Arg Asp Ser Arg Leu Gln
305                 310                 315                 320
Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Thr Ile Glu Ala
                325                 330                 335
Ser Phe Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Pro Glu Pro Val His Val Asn
            340                 345                 350
Ser Cys Phe Thr Ala Gly
        355
<210>76
<211>60
<212>PRT
<213>小鼠
<400>76
Ser Ser Ser Gly Glu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Leu Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Asp Ala Pro Glu Glu Ala Asp Pro Pro Asp Gly Glu Asp Pro Pro
            20                  25                  30
Glu Val Asn Ser Glu Asp Arg Met Glu Glu Ser Leu Gly Leu Glu Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Thr Pro Glu Ala Pro Glu His Ser Gln Gly
    50                  55                  60
<210>77
<211>258
<212>PRT
<213>小鼠
<400>77
Glu Lys Gly Gly Gly His Ser His Trp Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Trp Pro Gln Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val
            20                  25                  30
Asp Ile Arg Leu Glu Arg Thr Ala Phe Cys Arg Thr Leu Gln Pro Leu
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Gly Tyr Glu Leu Gln Pro Leu Pro Glu Leu Ser Leu Ser
    50                  55                  60
Asn Asn Gly His Thr Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Lys Met
65                  70                  75                  80
Ala Leu Gly Pro Gly Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His
                85                  90                  95
Trp Gly Thr Ser Asp His Pro Gly Ser Glu His Thr Val Asn Gly His
            100                 105                 110
Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ser
        115                 120                 125
Glu Leu His Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala
    130                 135                 140
Ala Phe Leu Gln Glu Ser Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu
145                 150                 155                 160
Leu Ser His Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Gly Ser Lys Ile Glu Ile
                165                 170                 175
Pro Gly Leu Asp Val Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Tyr
            180                 185                 190
Tyr Arg Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ser Gln Gly Val
        195                 200                 205
Ile Trp Thr Val Phe Asn Glu Thr Val Lys Leu Ser Ala Lys Gln Leu
    210                 215                 220
His Thr Leu Ser Val Ser Leu Trp Gly Pro Arg Asp Ser Arg Leu Gln
225                 230                 235                 240
Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Thr Ile Glu Ala
                245                 250                 255
Ser Phe
<210>78
<211>48
<212>PRT
<213>小鼠
<400>78
Asp Ile Leu Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Ile
1               5                   10                  15
Ala Phe Leu Leu Gln Leu Arg Arg Gln His Arg His Arg Ser Gly Thr
            20                  25                  30
Lys Asp Arg Val  Ser Tyr Ser Pro Ala Glu Met Thr Glu Thr Gly Ala
        35                   40                  45
<210>79
<211>22
<212>PRT
<213>小鼠
<400>79
Asp Ile Leu Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Ile
1               5                   10                  15
Ala Phe Leu Leu Gln Leu
            20
<210>80
<211>26
<212>PRT
<213>小鼠
<400>80
Arg Arg Gln His Arg His Arg Ser Gly Thr Lys Asp Arg Val Ser Tyr
1               5                   10                  15
Ser Pro Ala Glu Met Thr Glu Thr Gly Ala
            20                  25
<210>81
<211>74
<212>PRT
<213>小鼠
<400>81
Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Glu Val Lys
        35                  40                  45
Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Pro Thr
    50                  55                  60
Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro
65                  70
<210>82
<211>277
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp
1               5                   10                  15
Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val
            20                  25                  30
Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro
        35                  40                  45
Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly
    50                  55                  60
Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His
65                  70                  75                  80
Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro
                85                  90                  95
Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala
            100                 105                 110
Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala
        115                 120                 125
Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu
145                 150                 155                 160
Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu
                165                 170                 175
Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp
            180                 185                 190
Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu
        195                 200                 205
Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val
    210                 215                 220
Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser
225                 230                 235                 240
Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg
                245                 250                 255
Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala
            260                 265                 270
Gly Val Asp Ser Ser
        275
<210>83
<211>346
<212>PRT
<213>智人
<400>83
Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Glu Val Lys
        35                  40                  45
Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Pro Thr
    50                  55                  60
Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn Ala His Arg
65                  70                  75                  80
Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly Gly Asp Pro
                85                  90                  95
Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro
            100                 105                 110
Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala Leu Arg Pro
        115                 120                 125
Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Leu Arg Leu
    130                 135                 140
Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Glu
145                 150                 155                 160
Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu
                165                 170                 175
His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr Val Glu Gly
            180                 185                 190
His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe
        195                 200                 205
Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu
    210                 215                 220
Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser Glu Thr Gln
                245                 250                 255
Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Phe Ser Arg
            260                 265                 270
Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ala Gln Gly
        275                 280                 285
Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser Ala Lys Gln
    290                 295                 300
Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp Ser Arg Leu
305                 310                 315                 320
Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg Val Ile Glu
                325                 330                 335
Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser
            340                 345
<210>84
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>84
Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Pro Trp Pro
1               5                   10                  15
Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp Ile
            20                  25                  30
<210>85
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>85
gttggcatag aggtctttac g                                        21
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<400>86
gccgcatcct cttcctccct                                          20
<210>87
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>87
ggaggcctgg cagttttggc t                                          21
<210>88
<211>23
<212>DNA
<213>小鼠
<400>88
ctccagtttc tgtcatctct gcc                                        23
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<400>89
ccctgctgca gaggatagca                                            20
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<400>90
ggtcccactt ctgtgcctgt                                            20
<210>91
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>91
ctcggaggaa gtccatgtga a                                          21
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<400>92
ggtcccactt ctgtgcctgt                                            20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>93
ccaaccgcgg gaagatgacc                                          20
<210>94
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>94
gatcttcatg aggtagtcag t                                        21
<210>95
<211>22
<212>DNA
<213>智人
<400>95
gaaccccaga ataatgccca ca                                       22
<210>96
<211>22
<212>DNA
<213>智人
<400>96
tcgcttggaa gaaatcgctg ag                                       22
<210>97
<211>23
<212>DNA
<213>智人
<400>97
gttgctgtct cgcttggaag aaa                                      23
<210>98
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>98
gcggtagctc acaccccctt t                         21
<210>99
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>99
tatctgcact cctgccctct g                         21
<210>100
<211>22
<212>DNA
<213>智人
<400>100
cacagggtgt cagagagggt gt                        22
<210>101
<211>25
<212>DNA
<213>智人
<400>101
ctaggatgtc acctgcttag cactc                     25
<210>102
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>102
tccatgtgaa ttcctgcttc actg                      24
<210>103
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>103
cttcctccga gatttcttcc aaat                      24
<210>104
<211>23
<212>DNA
<213>智人
<400>104
gtgacatcct agccctggtt ttt                                          23
<210>105
<211>23
<212>DNA
<213>智人
<400>105
ctgcttagca ctcagcatca ctg                                          23
<210>106
<211>1671
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(33)..(1052)
<400>106
acagtgtgtc ctgggacacc ccagtcagct gc atg gcc tcc ctg ggc ccc agc    53
                                    Met Ala Ser Leu Gly Pro Ser
                                    1               5
ccc tgg gcc cct ttg tcg acc cca gcc cct act gca cag ctg ctg ctg   101
Pro Trp Ala Pro Leu Ser Thr Pro Ala Pro Thr Ala Gln Leu Leu Leu
        10                  15                  20
ttc ctg ctg ctc caa gtg tct gct cag ccc cag ggc ctg tcc ggg atg   149
Phe Leu Leu Leu Gln Val Ser Ala Gln Pro Gln Gly Leu Ser Gly Met
    25                  30                  35
cag ggg gag ccc tcc ttg gga gac agt tca tct ggg gag gat gag ctg   197
Gln Gly Glu Pro Ser Leu Gly Asp Ser Ser Ser Gly Glu Asp Glu Leu
40                  45                  50                  55
ggc gtg gat gtt ctg ccc agt gaa gag gat gca cct gaa gag gcg gat   245
Gly Val Asp Val Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ala Pro Glu Glu Ala Asp
                60                  65                  70
cca ccc gat ggg gag gat cca cct gaa gtt aat tct gaa gac agg atg   293
Pro Pro Asp Gly Glu Asp Pro Pro Glu Val Asn Ser Glu Asp Arg Met
            75                  80                  85
gag gag tcc ctt ggg tta gag gat cta tcg act ccc gag gct cct gag   341
Glu Glu Ser Leu Gly Leu Glu Asp Leu Ser Thr Pro Glu Ala Pro Glu
        90                  95                  100
cac agt caa ggt tcc cac ggg gat gaa aaa ggg ggt ggc cac agt cat    389
His Ser Gln Gly Ser His Gly Asp Glu Lys Gly Gly Gly His Ser His
    105                 110                 115
tgg agc tat gga ggc acc cta ctc tgg ccc cag gtg tcc cca gcc tgt    437
Trp Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Leu Trp Pro Gln Val Ser Pro Ala Cys
120                 125                 130                 135
gct ggc cgc ttt cag tcc ccg gta gac atc cgc ctg gag cgc acc gca    485
Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Leu Glu Arg Thr Ala
                140                 145                 150
ttc tgc cgc act ctg caa ccc ctg gaa ctt ctg ggt tat gag ctc cag    533
Phe Cys Arg Thr Leu Gln Pro Leu Glu Leu Leu Gly Tyr Glu Leu Gln
            155                 160                 165
cct ctc ccg gaa ctg agc cta tcc aac aat ggc cac acg gta cag ctg    581
Pro Leu Pro Glu Leu Ser Leu Ser Asn Asn Gly His Thr Val Gln Leu
        170                 175                 180
act ctg ccg ccg ggg ctg aag atg gct ctg gga cct ggg cag gaa tac    629
Thr Leu Pro Pro Gly Leu Lys Met Ala Leu Gly Pro Gly Gln Glu Tyr
    185                 190                 195
cgg gcc ttg cag ttg cat cta cac tgg gga act tca gat cac cca ggc    677
Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp Gly Thr Ser Asp His Pro Gly
200                 205                 210                 215
tca gaa cac aca gtc aat ggt cac cgt ttc cct gct gag atc cac gtg    725
Ser Glu His Thr Val Asn Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val
                220                 225                 230
gtg cac ctc agt act gct ttc tcc gaa ctt cat gaa gcc ttg ggc cgc    773
Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ser Glu Leu His Glu Ala Leu Gly Arg
            235                 240                 245
cca gga ggc ctg gca gtt ttg gct gcc ttt ctg cag gag agc cca gaa    821
Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Gln Glu Ser Pro Glu
        250                 255                 260
gaa aac agt gct tac gaa cag ttg ctg tcc cat ttg gaa gaa atc tcg    869
Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu Ser His Leu Glu Glu Ile Ser
    265                 270                 275
gag gaa gtc cat gtg aat tcc tgc ttc act gct ggt gac atc cta gcc    917
Glu Glu Val His Val Asn Ser Cys Phe Thr Ala Gly Asp Ile Leu Ala
280                 285                 290                 295
ttg gtg ttt ggc ctt ctc ttt gct gtc acc agc atc gcc ttc ctc cta    965
Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Ile Ala Phe Leu Leu
                300                 305                 310
cag ctg agg agg cag cac agg cac aga agt ggg acc aaa gat aga gtt      1013
Gln Leu Arg Arg Gln His Arg His Arg Ser Gly Thr Lys Asp Arg Val
            315                 320                 325
agc tac agt ccg gca gag atg aca gaa act gga gcc taa taaggagaaa       1062
Ser Tyr Ser Pro Ala Glu Met Thr Glu Thr Gly Ala
        330                 335
ccagctaaag gaatctggaa accttgtcct gtcctgcctg ttatacagcc tcctttttaa    1122
ccactacgaa atcatttcca tctttttaac tttcttcttt ccttaaagta ctgtgatagg    1182
agctaaccgt gaaaaaacaa gattgggctc aattcttgct gggttttgat ggttttgaag    1242
acagggtttc tctgtgtagc cctggctgtc ctgggactca ctctgtagcc taggctggcc    1302
ttgaactcag agatccgatt gcctctgcct tcttagtgcc aggactgagg gtatgtacca    1362
ctaccaccgc caccccgcaa ttcttgcttt tattctgcag tcaaatgctc caccactgag    1422
ctacacaccc ctccatctta ctatgcaggc agactggcct tgcattgtgt atgtatggtg    1482
atggagtttg aagccagggt cttacctact aggcaagcgt tctatcactg acctaagcct    1542
ctctagtccc ttctcttgaa ccctctattc tcctgtccca gcctcttgaa tgctgggatt    1602
acaggaatgc accatcatgc ttggtcatcc caattattta aaaaaaatat ataaatcttc    1662
ctagtaaaa                                                            1671
<210>107
<211>339
<212>PRT
<213>小鼠
<400>107
Met Ala Ser Leu Gly Pro Ser Pro Trp Ala Pro Leu Ser Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Thr Ala Gln Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gln Val Ser Ala Gln
            20                  25                  30
Pro Gln Gly Leu Ser Gly Met Gln Gly Glu Pro Ser Leu Gly Asp Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Gly Glu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Leu Pro Ser Glu Glu
    50                  55                  60
Asp Ala Pro Glu Glu Ala Asp Pro Pro Asp Gly Glu Asp Pro Pro Glu
65                  70                  75                  80
Val Asn Ser Glu Asp Arg Met Glu Glu Ser Leu Gly Leu Glu Asp Leu
                85                  90                  95
Ser Thr Pro Glu Ala Pro Glu His Ser Gln Gly Ser His Gly Asp Glu
            100                 105                 110
Lys Gly Gly Gly His Ser His Trp Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Leu Trp
        115                 120                 125
Pro Gln Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val Asp
    130                 135                 140
Ile Arg Leu Glu Arg Thr Ala Phe Cys Arg Thr Leu Gln Pro Leu Glu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Gly Tyr Glu Leu Gln Pro Leu Pro Glu Leu Ser Leu Ser Asn
                165                 170                 175
Asn Gly His Thr Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Lys Met Ala
            180                 185                 190
Leu Gly Pro Gly Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His Trp
        195                 200                 205
Gly Thr Ser Asp His Pro Gly Ser Glu His Thr Val Asn Gly His Arg
    210                 215                 220
Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ser Glu
225                 230                 235                 240
Leu His Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala Ala
                245                 250                 255
Phe Leu Gln Glu Ser Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu Leu
            260                 265                 270
Ser His Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Val His Val Asn Ser Cys Phe
        275                 280                 285
Thr Ala Gly Asp Ile Leu Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val
    290                 295                 300
Thr Ser Ile Ala Phe Leu Leu Gln Leu Arg Arg Gln His Arg His Arg
305                 310                 315                 320
Ser Gly Thr Lys Asp Arg Val Ser Tyr Ser Pro Ala Glu Met Thr Glu
                325                 330                 335
Thr Gly Ala
<210>108
<211>1380
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(43)..(1119)
<400>108
gcccgtacac accgtgtgct gggacacccc acagtcagcc gc atg gct ccc ctg      54
                                               Met Ala Pro Leu
                                               1
tgc ccc agc ccc tgg ctc cct ctg ttg atc ccg gcc cct gct cca ggc    102
Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala Pro Ala Pro Gly
5                   10                  15                  20
ctc act gtg caa ctg ctg ctg tca ctg ctg ctt ctg atg cct gtc cat    150
Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Met Pro Val His
                25                  30                  35
ccc cag agg ttg ccc cgg atg cag gag gat tcc ccc ttg gga gga ggc    198
Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro Leu Gly Gly Gly
            40                  45                  50
tct tct ggg gaa gat gac cca ctg ggc gag gag gat ctg ccc agt gaa    246
Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp Leu Pro Ser Glu
        55                  60                  65
gag gat tca ccc aga gag gag gat cca ccc gga gag gag gat cta cct    294
Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
    70                  75                  80
gga gag gag gat cta cct gga gag gag gat cta cct gaa gtt aag cct    342
Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Glu Val Lys Pro
85                  90                  95                  100
aaa tca gaa gaa gag ggc tcc ctg aag tta gag gat cta cct act gtt    390
Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Pro Thr Val
                105                 110                 115
gag gct cct gga gat cct caa gaa ccc cag aat aat gcc cac agg gac    438
Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn Ala His Arg Asp
            120                 125                 130
aaa gaa ggg gat gac cag agt cat tgg cgc tat gga ggc gac ccg ccc    486
Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Pro
        135                 140                 145
tgg ccc cgg gtg tcc cca gcc tgc gcg ggc cgc ttc cag tcc ccg gtg    534
Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe Gln Ser Pro Val
    150                 155                 160
gat atc cgc ccc cag ctc gcc gcc ttc tgc ccg gcc ctg cgc ccc ctg    582
Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala Leu Arg Pro Leu
165                 170                 175                 180
gaa ctc ctg ggc ttc cag ctc ccg ccg ctc cca gaa ctg cgc ctg cgc    630
Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Leu Arg Leu Arg
                185                 190                 195
aac aat ggc cac agt gtg caa ctg acc ctg cct cct ggg cta gag atg    678
Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Glu Met
            200                 205                 210
gct ctg ggt ccc ggg cgg gag tac cgg gct ctg cag ctg cat ctg cac    726
Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln Leu His Leu His
        215                 220                 225
tgg ggg gct gca ggt cgt ccg ggc tcg gag cac act gtg gaa ggc cac    774
Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr Val Glu Gly His
    230                 235                 240
cgt ttc cct gcc gag atc cac gtg gtt cac ctc agc acc gcc ttt gcc    822
Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser Thr Ala Phe Ala
245                 250                 255                 260
aga gtt gac gag gcc ttg ggg cgc ccg gga ggc ctg gcc gtg ttg gcc    870
Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu Ala Val Leu Ala
                265                 270                 275
gcc ttt ctg gag gag ggc ccg gaa gaa aac agt gcc tat gag cag ttg     918
Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala Tyr Glu Gln Leu
            280                 285                 290
ctg tct cgc ttg gaa gaa atc gct gag gaa ggc tca gag act cag gtc     966
Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser Glu Thr Gln Val
        295                 300                 305
cca gga ctg gac ata tct gca ctc ctg ccc tct gac ttc agc cgc tac    1014
Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp Phe Ser Arg Tyr
    310                 315                 320
ttc caa tat gag ggg tct ctg act aca ccg ccc tgt gcc cag ggt gtc    1062
Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ala Gln Gly Val
325                 330                 335                 340
atc tgg act gtg ttt aac cag aca gtg atg ctg agt gct aag cag gtg    1110
Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser Ala Lys Gln Val
                345                 350                 355
aca tcc tag ccctggtttt tggcctcctt tttgctgtca ccagcgtcgc            1159
Thr Ser
gttccttgtg cagatgagaa ggcagcacag aaggggaacc aaagggggtg tgagctaccg  1219
cccagcagag gtagccgaga ctggagccta gaggctggat cttggagaat gtgagaagcc  1279
agccagaggc atctgagggg gagccggtaa ctgtcctgtc ctgctcatta tgccacttcc  1339
ttttaactgc caagaaattt tttaaaataa atatttataa t                      1380
<210>109
<211>358
<212>PRT
<213>智人
<400>109
Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu
            20                  25                  30
Met Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro
        35                  40                  45
Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp
    50                  55                  60
Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
                85                  90                  95
Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn
        115                 120                 125
Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly
    130                 135                 140
Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe
145                 150                 155                 160
Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala
                165                 170                 175
Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu
            180                 185                 190
Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro
        195                 200                 205
Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln
    210                 215                 220
Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr
225                 230                 235                 240
Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser
                245                 250                 255
Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu
            260                 265                 270
Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala
        275                 280                 285
Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser
    290                 295                 300
Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp
305                 310                 315                 320
Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys
                325                 330                 335
Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser
            340                 345                 350
Ala Lys Gln Val Thr Ser
        355

Claims (55)

1.与哺乳动物中MN/CA IX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，包括区分全长[FL]和旁路剪接的[AS]MN/CA9mRNA或MN/CA IX表达。
2.如权利要求1所述的方法，包括使用一种或多种探针和/或引物来检测或检测并定量FL和/或AS MN/CA9mRNA表达。
3.如权利要求2所述的方法，包括使用：
(a)探针和/或引物，以检测全长[FL]MN/CA9mRNA但不检测旁路剪接的[AS]MN/CA9mRNA；
(b)探针和/或引物，以检测AS MN/CA9mRNA但不检测FL MN/CA9mRNA；和/或
(c)探针和/或引物，以检测FL和AS MN/CA9mRNA。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物是人，且其中所述一种或多种探针和/或引物选自SEQ ID NOS：97-101和与SEQ ID NOS：97-101至少80％同源的核酸序列。
5.如权利要求2所述的方法，包括使用核酸扩增方法。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸扩增方法包括使用PCR、RT-PCR、实时PCR或定量实时RT-PCR。
7.如权利要求2所述的方法，包括使用微阵列芯片，所述芯片含有结合全长[FL]MN/CA9mRNA但不结合旁路剪接的[AS]MN/CA9mRNA的探针，和/或结合AS MN/CA9mRNA但不结合FL MN/CA9mRNA的探针。
8.如权利要求2所述的方法，还包括测定FL:AS MN/CA9mRNA的比率。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述AS MN/CA9mRNA表达指示正常MN/CA9基因表达，所述FL MN/CA9mRNA表达指示异常MN/CA9基因表达。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述AS MN/CA9mRNA表达指示正常含氧量情况下MN/CA9基因的表达，所述FL MN/CA9mRNA表达指示低氧情况下MN/CA9基因的表达。
11.如权利要求1所述的方法，包括使用一种或多种抗体来区分肿瘤发生前/赘生性组织中的FL和AS MN/CA IX表达。
12.如权利要求11所述的方法，包括检测或检测并定量所述组织中的AS MN/CA IX。
13.如权利要求12所述的方法，还包括测定所述组织中FL MN/CA IX水平与AS MN/CA IX水平的比率。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述比率指示所述组织中低氧的存在或程度。
15.如权利要求11所述的方法，包括检测或检测并定量脊椎动物组织中的FL MN/CA IX和AS MN/CA IX，其包括以下步骤：
(a)使所述脊椎动物组织的样品同时或按序与至少两种抗体、至少两种抗原结合抗体片段、或抗体和抗原-结合抗体片段的混合物接触，其中至少一种抗体/抗体片段特异性结合于FL MN/CA IX蛋白但不结合AS MN/CAIX蛋白，其中至少一种其他抗体/抗体片段特异性结合于FL和AS MN/CAIX两者；
(b)检测并定量所述样品中的所述抗体/抗体片段；和
(c)比较所述差异结合性抗体/抗体片段的结合以测定FL MN/CA IX和AS MN/CA IX的相对水平。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述特异性结合于FL MN/CA IX但不结合AS MN/CA IX的抗体/抗体片段对MN/CA IX的碳酸酐酶(CA)结构域有特异性；其中所述特异性结合于FL MN/CA IX和AS MN/CA IX两者的抗体/抗体片段对MN/CA IX的蛋白聚糖样(PG)结构域有特异性。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述对MN/CA IX的CA结构域有特异性的抗体是保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生的V/10单克隆抗体；其中所述对MN/CA IX的PG结构域有特异性的抗体是保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)、ATCC名称编号为HB 11128的杂交瘤VU-M75产生的M75单克隆抗体。
18.与脊椎动物中异常MN/CA IX表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，包括检测或检测并定量脊椎动物组织中的全长[FL]MN/CA IX蛋白但非旁路剪接[AS]MN/CA IX蛋白，其包括以下步骤：
(a)使所述脊椎动物组织的样品与抗体或抗体片段接触，其中所述抗体或抗体片段特异性结合于FL MN/CA IX但不结合AS MN/CA IX；和
(b)检测并定量所述样品中所述抗体/抗体片段的结合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗体或抗体片段对MN/CA IX的碳酸酐酶(CA)结构域有特异性。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述对MN/CA IX的CA结构域有特异性的抗体是保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生的V/10单克隆抗体。
21.与哺乳动物中MN/CA IX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病的诊断和/或预后方法，包括检测或检测并定量哺乳动物肿瘤发生前/赘生性样品中的全长[FL]MN/CA9mRNA但非旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA，所述方法包括使所述样品中的mRNA与特异性结合FL MN/CA9mRNA但不结合AS MN/CA9mRNA的引物或探针接触。
22.用于区分哺乳动物中旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA和全长[FL]MN/CA9mRNA表达的探针或引物。
23.如权利要求22所述的探针或引物，其中所述哺乳动物是人，所述探针或引物用来检测AS MN/CA9mRNA但不检测FL MN/CA9mRNA，所述探针或引物包含结合于MN/CA9基因的外显子7和10的剪接点的核酸。
24.如权利要求23所述的探针或引物，其中所述探针或引物具有SEQ IDNO：101的序列或与SEQ ID NO：101至少80％同源的序列。
25.表达权利要求22所述的探针或引物的载体。
26.包含权利要求25所述载体的宿主细胞。
27.如权利要求22所述的探针或引物，其中所述哺乳动物是人，所述探针或引物用来检测FL MN/CA9mRNA但不检测AS MN/CA9mRNA，所述探针或引物包含结合于人MN/CA9基因的外显子8或外显子9的核酸，或结合于人MN/CA9基因外显子7和8的剪接点的核酸、或结合于人MN/CA9基因外显子8和9的剪接点的核酸、或结合于人MN/CA9基因外显子9和10的剪接点的核酸。
28.如权利要求27所述的探针或引物，其中所述探针或引物具有SEQ IDNO：100的序列或与SEQ ID NO：100至少80％同源的序列。
29.包含一种或多种权利要求22所述的探针的微阵列芯片。
30.用于区分哺乳动物中旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA和全长[FL]MN/CA9mRNA表达的探针对和/或引物对。
31.如权利要求30所述的探针对和/或引物对，其用于检测旁路剪接[AS]人MN/CA9mRNA但不检测全长[FL]人MN/CA9mRNA。
32.如权利要求31所述的探针对或引物对，其由SEQ ID NOS：99和101或与SEQ ID NOS：99和101至少80％同源的核酸序列组成。
33.如权利要求30所述的探针对和/或引物对，用于检测全长[FL]人MN/CA9mRNA但不检测旁路剪接[AS]人MN/CA9mRNA。
34.如权利要求33所述的探针对或引物对，其由SEQ ID NOS：99和100或与SEQ ID NOS：99和100至少80％同源的核酸序列组成。
35.如权利要求30所述的探针对和/或引物对，其用于检测AS人MN/CA9mRNA和FL人MN/CA9mRNA两者，所述探针对和/或引物对由SEQ ID NOS：97和98、或与SEQ ID NOS：97和98至少80％同源的核酸序列组成；其中所述AS mRNA和所述FL mRNA的长度不同。
36.编码哺乳动物的旁路剪接[AS]MN/CA IX的分离核酸，其中所述ASMN/CA IX的分子量为约43-约48千道尔顿。
37.表达权利要求36所述的分离核酸序列的载体。
38.包含权利要求37所述载体的宿主细胞。
39.如权利要求36所述的分离核酸，其特征在于，对应于MN/CA9的外显子8和外显子9的核苷酸缺失，其中所述哺乳动物是人。
40.如权利要求36所述的分离核酸，其具有SEQ ID NO：108的序列或与SEQ ID NO：108至少80％同源的分离核酸序列，其中所述哺乳动物是人。
41.由SEQ ID NO：108或权利要求40所述的分离核酸编码的AS形式的MN/CA IX，其特征在于，所述AS形式的MN/CA IX与M75单克隆抗体特异性结合，但不与V/10单克隆抗体结合，所述M75单克隆抗体由保藏在美国模式培养物保藏所、名为ATCC No.HB 11128的杂交瘤VU-M75分泌，所述V/10单克隆抗体由保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生。
42.由权利要求36所述的分离核酸编码的AS形式的MN/CA IX，其特征还在于，所述AS形式的MN/CA IX与对MN/CA IX的PG结构域有特异性的抗体特异性结合，但不与对MN/CA IX的CA结构域有特异性的抗体结合。
43.如权利要求42所述的AS形式的MN/CA IX，其特征还在于，所述AS形式的MN/CA IX与M75单克隆抗体特异性结合，但不与V/10单克隆抗体结合，所述M75单克隆抗体由保藏在美国模式培养物保藏所、名为ATCC No.HB 11128的杂交瘤VU-M75分泌，所述V/10单克隆抗体由保藏在比利时根特、登录号为LMBP 6009CB的BCCMTMTM/LMBP杂交瘤VU-V/10产生。
44.特异性结合于权利要求36所述的AS MN/CA IX但不特异性结合FLMN/CA IX的抗体或抗原结合抗体片段。
45.特异性结合于权利要求36所述的AS MN/CA IX但不特异性结合可溶性MN/CA IX(s-CA IX)的抗体或抗原结合抗体片段。
46.治疗哺乳动物中肿瘤发生前/肿瘤性疾病的方法，其中所述疾病与MN/CA IX异常表达有关，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的组合物，该组合物包含相对于全长[FL]MN/CA IX水平提高旁路剪接[AS]MN/CA IX水平的物质。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述增加的AS MN/CA IX的相对水平干扰所述FL MN/CA IX的碳酸酐酶活性。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述物质是处于生理学上可接受的载体中的AS MN/CA IX本身，表达AS MN/CA9mRNA的载体，阻断FLMN/CA IX但不阻断AS MN/CA IX表达的反义寡核苷酸，表达所述反义寡核苷酸的载体，FL MN/CA9同工型特异性siRNA，或表达所述FL MN/CA9同工型特异性siRNA的载体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述FL MN/CA9同工型特异性siRNA靶向MN/CA9mRNA的外显子7和8、外显子8和9或外显子9和10的剪接点。
50.如权利要求46所述的方法，其中所述物质是调节AS和/或FLMN/CA9前mRNA剪接的反义寡核苷酸。
51.相对于全长[FL]MN/CA IX水平提高旁路剪接[AS]MN/CA IX水平的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸用于治疗与MN/CA IX异常表达相关的肿瘤发生前/肿瘤性疾病。
52.如权利要求51所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是与FL MN/CA9前mRNA互补但不与AS MN/CA9前体mRNA互补的反义寡核苷酸。
53.如权利要求51所述的寡核苷酸，其是与FL MN/CA9mRNA互补但不与AS MN/CA9mRNA互补的SiRNA。
54.如权利要求53所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与FL MN/CA9mRNA的外显子7和8、外显子8和9或外显子9和10的剪接点互补。
55.用于鉴定能够调节旁路剪接[AS]MN/CA IX水平的物质的体外方法，其包括使表达AS MN/CA IX的细胞与怀疑调节细胞中所述AS MN/CAIX水平的物质接触，检测并定量所述AS MN/CA IX水平的变化。
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