JP5866328B2 - Mn/ca9スプライス変異体 - Google Patents
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Description
(a)前記サンプルを、少なくとも2種の抗体、少なくとも2種の抗原結合性抗体断片、または抗体と抗原結合性抗体断片の混合物とを同時にまたは連続的に接触させて、少なくとも1種の抗体/抗体断片をASのMN/CA IXタンパク質には結合しないが、FLのMN/CA IXタンパク質に特異的に結合させ、少なくとも他の1種の抗体/抗体断片をFLのMN/CA IXとASのMN/CA IXの双方に特異的に結合させる工程と;
(b)前記サンプルにおいて前記抗体/抗体断片の結合を検出および定量化する工程と;
(c)前記差異的に結合する抗体/抗体断片の結合を比較してFLのMN/CA IXとASのMN/CA IXの相対的レベルを特定する工程と、
を有してなる。
(a)前記サンプルを抗体または抗体断片に接触させるステップであって、前記抗体または抗体断片が、ASのMN/CA IXには結合しないが、FLのMN/CA IXに特異的に結合する工程と;
(b)前記サンプルにおける前記抗体/抗体断片の結合を検出および定量化する工程と、
を有してなる。前記脊椎動物は、哺乳動物であることが好ましく、前記哺乳動物はヒトであることがさらに好ましい。
以下の引用文献は、MN/CA9遺伝子およびMN/CA IXタンパク質、または選択的にスプライスされたmRNAに関する最新情報を本明細書に引用するか、または提供する。本明細書に引用されるリストに挙げられた引用文献ならびに他の引用文献の全ては、参照することにより具体的に援用される。
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略語
以下の略語が本明細書中に使用される:
細胞株
ヌクレオチドおよびアミノ酸の記号
以下の記号は、本明細書においてヌクレオチドを表すために使用される:
20の主要アミノ酸があり、それらの各々は、3つの隣接ヌクレオチド(トリプレットコードまたはコドン)の異なる配列により特定され、特定の順序で一緒に結合して特徴的なタンパク質を形成する。例えば、以下の図1に示される前記アミノ酸を同定するために、3文字または1文字の通則が、本明細書に使用される:
本発明の診断方法/予後診断方法および治療方法の対象である前新生物疾患/新生物疾患(および患部組織)は、MN/CA IXの異常発現に関連するものである。本明細書に用いられる「前新生物組織/新生物組織」はまた、体液中の前新生物細胞/新生物細胞を含むことができる。前記前新生物疾患/新生物疾患は、乳房、尿路、膀胱、腎臓、卵巣、子宮、子宮頚部、子宮内膜、扁平上皮細胞、腺扁平上皮細胞、膣、外陰部、前立腺、肝臓、肺、皮膚、甲状腺、膵臓、精巣、脳、頭頚部、中胚葉、肉腫、胃、脾臓、胃腸管、食道、および大腸の前新生物疾患/新生物疾患からなる群から選択されるのが好ましい。
本明細書に用いられる「酸素正常状態」とは、哺乳動物の特定組織に関して生理的酸素張力レベルの正常範囲内にある特定の哺乳動物組織中の酸素張力レベルとして定義される。本明細書に用いられる「低酸素状態」とは、特定の組織または細胞中のHIF−1αを安定化させるために必要な酸素張力レベルとして定義される。実験的に誘導された低酸素状態は、一般的に2%以下であって、酸欠状態(酸欠状態は致死的となり得る0%のpO2)以上のpO2の範囲内にある。低酸素状態に関係する本明細書に記載された実施例では、代表的な低酸素状態である2%pO2で実施された。しかしながら、当業者は、「低酸素状態」として理解され、同様の実験結果を生じる他の酸素張力レベルを考えることもあろう。例えば、ウィコッフ(Wykoff)ら[Cancer Research、60:7075−7083頁(2000年)]は、代表的な低酸素状態として0.1%pO2の条件を用いてCA9のHIF−1α−従属発現を誘導した。トームズ(Tomes)らは、0.3%、0.5%および2.5%pO2の代表的なインビトロ低酸素状態下、HeLa細胞またはヒト乳房線維芽細胞におけるHIF−1αの安定化およびCA9発現の程度が変わることを立証している[トームズ(Tomes)ら、Br.Cancer Res.Treat.81(1):61−69頁(2003年)]。あるいは、カルツ(Kaluz)らは、CA9の実験的誘導に関して0.5%pO2の代表的な低酸素状態を用いており[カルツ(Kaluz)ら、Cancer Res.、63:917−922頁(2003年)]、0.1〜1%pO2を低酸素状態の「実験的に誘導された範囲」として言及している[Cancer Research、62:4469−4477頁(2002年)]。
本明細書における用語「CA IX」および「MN/CA9」は、MNに関する同義語と考えられている。G250抗原は、MNタンパク質/ポリペプチドを称するものと考える。
図8A〜Cに、完全長MN cDNAクローンに関するヌクレオチド配列[配列番号1]を提供する。図9A〜Fに、完全MNゲノム配列[配列番号3]を提供する。提案されたMNプロモーターに関するヌクレオチド配列[配列番号24]は、図9A〜Fのnts3001から3540、および図10に示される。
オーバーラップクローンの完全配列は、10,898bp(配列番号3)を含む。ヒトMN遺伝子は、11のエクソンならびに2つの上流反復要素および6つのイントロンAlu反復要素を含んでなる。エクソンは全て、445bpである第1エクソンを除いて27bpから191bpの範囲と小型である。イントロンのサイズは、89bpから1400bpの範囲である。CAドメインは、エクソン2〜8によりコードされ、一方、エクソン1、10および11は、それぞれMN/CA IXタンパク質のプロテオグリカン様ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞質テールに相当する。下表1は、AG−GTモチーフを含むコンセンサススプライス配列に合致するスプライスドナーおよびアクセプター配列を掲げている[マウント(Mount)、Nucleic Acids Res.10:459−472頁(1982年)]。
ザバダ(Zavada)らの国際公開第95/34650号パンフレットには、MN遺伝子転写開始部位および終結部位をマッピングする方法が記載されている。RNアーゼ保護アッセイを、MN遺伝子の5'末端の精密マッピングに使用した。プローブは、均一に標識された470ヌクレオチドコピーRNA(nt−205から+265)[配列番号66]であり、そのプローブをMNを発現するHeLa細胞およびCGL3細胞からの全RNAにハイブリダイズさせ、配列決定ゲル上で分析した。その分析は、MN遺伝子転写が複数部位で開始し、最も長いMN転写物の5'末端は、RACEにより以前特徴づけられたものよりも30nt長いことを示した。
マウスCA IXをコードするcDNAおよび遺伝子のクローニングおよび特徴づけは、以前に記載されている[オルトバ−ガット(Ortova−Gut)ら、Gastroenterology、123:1889−1903頁(2002年)]。マウスCar9cDNA断片を、ヒトcDNA由来のプライマーおよびC57 BL/6Jマウスの胃から単離されたテンプレートRNAを用いてRT PCRにより単離した。完全長cDNAは、5'/3'双方の方向においてcDNA末端の高速増幅により得られた。完全長cDNAは、49bpの5'非翻訳領域、1311bpのオープンリーディングフレームおよび622pの3'非翻訳配列からなる1982bpを包含する(登録番号AJ245857;配列番号71のもとでEMBLデータベースに寄託された)。
Car9遺伝子を単離し、その編成を特定するために、完全長Car9 cDNAを、pBAC108Lにおけるマウス胎仔幹細胞129/Olaゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。マウス野生型ゲノムDNAの制限マッピングおよびサザンブロット解析により確認されたように、完全Car9ゲノム配列を含む1つのBACM−355(G13)クローンが得られた。このクローンから誘導された3つのオーバーラップゲノム断片を、pブルースクリプトII KSにサブクローン化した。
語句「MNタンパク質および/またはポリペプチド」(MNタンパク質/ポリペプチド)とは、MN遺伝子またはその断片によりコードされるタンパク質および/またはポリペプチドを意味するとして本明細書に定義される。本発明による代表的な好ましいMNタンパク質は、図8に示される推定アミノ酸配列を有する。好ましいMNタンパク質/ポリペプチドは、図8に示されたMNタンパク質と実質的に相同性を有するタンパク質および/またはポリペプチドである。例えば、そのような実質的に相同なMNタンパク質/ポリペプチドは、本発明のMN特異的抗体、好ましくはMAb M75、V/10、MN12、MN9およびMN7またはそれらの等価体と反応性であるものである。M75 mabを分泌するVU−M75ハイブリドーマは、1992年9月17日、HB11128としてATCCに寄託された。
MNタンパク質、例えば、図8に示されたようなMNタンパク質またはその断片を調製するための代表的な方法は、MN cDNAの完全長または適切な断片を、適切な発現ベクター内に挿入することであると考えられる。ザバダ(Zavada)らの国際公開第93/18152号パンフレットには、ベクターpGEX−3X(ファルマシア(Pharmacia)社)の部分的cDNAを用いて融合タンパク質GEX−3X−MN(現在はGST−MNと称される)の製造について記載されている。XL1−ブルー細胞に由来する非グリコシル化GST−MN(MN融合タンパク質MNグルタチオンS−トランスフェラーゼ)。
用語の「抗体」は、抗体全体のみならず抗体の生物学的活性断片、好ましくは抗原結合性領域を含む断片を含むように本明細書に定義されている。MNタンパク質および別の組織特異抗原に特異的である二重特異性抗体が、抗体の定義にさらに含まれる。
エピトープを含むペプチドに対するMAbの親和性は、文脈において、例えば、そのペプチドが、短い配列(4〜6のaa)であるかどうか、またはこのような短ペプチドが、片側または両側に、より長いaa配列によってフランクされているかどうか、またはエピトープに関する試験において、そのペプチドが溶液中にあるか、または表面に固定されているかどうかによって決まる。したがって、MN特異的MAbに関して本明細書に記載された代表的なエピトープは、これらMAbの使用の文脈において変わり得ることが当業者によって予想されるであろう。
上記のとおり、完全長CA IXの細胞外ドメインは、PGおよびCAドメインならびに幾つかのスペーサーあるいはヒンジ領域を含んでなる。CA IXの免疫優性エピトープは、主として約aa53〜111(配列番号8)または約aa52〜125(配列番号81)におけるPG領域にあり、好ましくはここでは約aa52〜125(配列番号81)にあると考えられる。CA IXの免疫優性エピトープは、PG領域に隣接する領域に位置し得る。例えば、aa36〜51(配列番号21)に関するエピトープは、免疫優性エピトープであると考えられるであろう。
組織中のASおよびFLのMN/CA IX発現に関するスクリーンのためのアッセイ
この方法は、もしあれば、前新生物疾患/新生物疾患と診断された患者から採取したサンプルに存在するASおよび/またはFLのMN/CA9遺伝子発現産物に関するスクリーニングを含むことができ;MN/CA9遺伝子発現産物は、MNタンパク質、MNポリペプチド、MNタンパク質またはMNポリペプチドをコードするmRNA、MNタンパク質またはMNポリペプチドをコードするmRNAに相当するASまたはFL型のcDNAであり得る。
本発明の核酸プローブおよび/またはプライマーは、図8に示されたMN cDNA配列[配列番号1]または図9A〜Fの完全ゲノム配列[配列番号3]等の他のMN遺伝子配列に、相補的または実質的に相補的である配列を含むものである。語句の「実質的に相補的」は、当該技術分野で十分に理解され、したがって標準的なハイブリダイゼーション条件の文脈において用いられる意味を有するように本明細書に定義される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、相補性の精度を制御するために調整することができる。2つの核酸は、例えば、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする場合、互いに実質的に相補的である。上記に示したように、少なくとも80〜90%、好ましくは少なくとも90%の相同性を有する極めて密接に関連するnt配列だけが、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすると考えられる。
多くの論文において、癌関連遺伝子の選択的スプライシング変異体に基づく癌治療が検討されており、他にも治療法があるが、中でもアンチセンスおよびRNA干渉療法に使用されるオリゴヌクレオチドの設計に関する戦略が提供されている[例えば、ガルシア−ブランコ(Garcia−Blanco)、Curr Opin Mol Ther.、7(5):476−482頁(2005年);ウィルトン(Wilton)およびフレッチャー(Fletcher)、Curr Gene Ther.、5(5):467−483頁(2005年);パジャレス(Pajares)ら、Lancel Oncol.、8(4):349−357頁(2007年);シンY.(Xing Y.)、Front Biosci.、12:4034−4041頁(2007年)]。例えば、当業者は、それぞれ配列番号1および108の核酸配列からヒトAS CA9 mRNAには特異的ではないが、ヒトFL CA9 mRNAに特異的な適切なアンチセンス核酸配列、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを特定することができるであろう。
MN遺伝子の発現阻害は、例えば、MN遺伝子の発現に対するRNA干渉効果を適用することによって実施することができる。RNA干渉は、近年報告されたようにRNAを用いることによって遺伝子発現を阻害するための方法である[エルバシア(Elbashir)ら、Nature、411:494−498頁(2001年)]。さらに詳細には、MN遺伝子の発現は、MN遺伝子の特定のmRNAスプライス変異体(FLスプライス変異体など)の発現に対してRNA干渉効果を示す1種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることによって阻害することができる。
オリゴヌクレオチドを用いてFL MN/CA IXの発現を阻害するために、遺伝子治療の使用により標的細胞にオリゴヌクレオチドを導入することが可能である。遺伝子治療は、既知の方法を用いることによって実施することができる。例えば、注入により直接オリゴヌクレオチドを投与する工程を有してなる非ウィルス性形質移入、またはウィルスベクターを用いる形質移入のいずれかを用いることができる。非ウィルス性形質移入に関する好ましい方法は、オリゴヌクレオチドを含むリポソームなどのリン脂質小胞を投与することを含む方法、ならびに注入により直接オリゴヌクレオチドを投与することを含む方法がある。形質移入に使用される好ましいベクターは、ウィルスベクター、より好ましくは、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクターおよびワクシニアウィルスベクターなどのDNAウィルスベクター、またはRNAウィルスベクターである。
細胞培養、組織および抗体
マウスNIH 3T3線維芽細胞、イヌMDCK上皮細胞、腎癌由来のヒト腫瘍細胞株CAKI−1およびACHN、ならびに子宮頚部癌由来のCaski、SiHa、HeLa、およびC33a系を、37℃、5%CO2で加湿下、10%FCS(バイオウィタカー(BioWhittaker)社(ベルギー国ベルビエ所在))および40μg/mlのゲンタマイシン(レック社(スロベニア国所在)で補足されたDMEM中で培養した。低酸素処理は、37℃、2%O2、5%CO2、10%H2および83%N2中、嫌気性ワークステーション(ラスキンテクノロジーズ(Ruskin Technologies)社(英国ブリジェンド所在))内で実施した。
免疫蛍光法を、以前に記載されたとおりに実施した(スバストバ(Svastova)ら、2004年)。カバーガラス上で増殖させた細胞を氷冷PBSで2回すすぎ、冷メタノールにより−20℃で5分間固定した。このカバーグラスを、1%BSAを含むPBSにより37℃で30分間インキュベートし、次いで1:1000に希釈されたmCA IXに対しM75 mabまたはウサギポリクローナル血清を含む非希釈ハイブリドーマ培地と共にインキュベートした。マウスCA IXタンパク質に対する抗体は、他でも記載されている(ガット(Gut)ら、2002年)。一次抗体とのインキュベーションを、37℃での加湿チャンバ内で1時間実施した。このカバーグラスを、0.02%のツイーン20を含むPBSで10分間3回洗浄し、次にPBS中0.5%BSA中、1:300に希釈されたフルオレセイン複合化抗マウス二次抗体で処理するか、またはPBS中0.5%BSA中、1:1000に希釈された抗ウサギAlexa488複合化二次抗体で処理した。PBSで10分間、3回すすいだ後、このカバーグラスを装着媒体(カルビオケム(Calbiochem)社(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在))と共に顕微鏡スライド上に乗せ、次にニコン社のE400顕微鏡で調べてニコンクールピクス990カメラで撮影した。
マウススプライシング変異体をコードする真核生物発現プラスミドpSG5C−mASを、マウスCA9 cDNAを含むpSG5C−Car9プラスミドから逆PCRにより作出した。順方向プライマーは、エクソン9(m9S、5'−TCCATGTGAATTCCTGCTTCACTG−3')[配列番号102]の開始点に対して設計され、逆方向プライマーは、エクソン6(m6A、5'−CTTCCTCCGAGATTTCTTCCAAAT−3')[配列番号103]の終止点に特異的であった。同様に、ヒトスプライシング変異体をコードする真核生物発現プラスミドpSG5C−ASを、エクソン10および7に対するプライマーを用いて完全長ヒトCA9 cDNA(GenBank番号X66839)を含むpSG5C−MN/CA9発現プラスミド(パストレク(Pastorek)ら、1994年)から逆PCRにより作出した。順方向プライマー(h10S、5'−GTGACATCCTAGCCCTGGTTTTT−3')[配列番号104]は、エクソン10の開始点に特異的であり、逆方向プライマー(h7A、5'−CTGCTTAGCACTCAGCATCACTG−3')[配列番号105]は、エクソン7の終止点に特異的であった。同じh7Aおよびh10Sプライマーを、シグナルペプチドなしの完全長CA IXタンパク質をコードする一次プラスミド構成物pGEX−3X−CA9から、ヒトCA IXタンパク質のGST融合スプライス変異体をコードする細菌発現ベクターpGEX−3X−ASの調製に使用した。PCR増幅は、Phusionポリメラーゼ(フィンザイムス(Finnzymes)社(フィンランド国エスポー所在))を用いて実施した。PCR反応は、98℃で30秒間の最初の変性、98℃で10秒間32サイクルの変性、64℃で30秒間のアニーリング、72℃で1分40秒間の伸長、最後に72℃で5分間の伸長で構成された。PCR産物をゲル精製し、T4ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、T4 DNAリガーゼ(インビトロジェン社(米国カリフォルニア州カールスバッド所在))とライゲーションさせた。全ての構成物を塩基配列決定法により検証した。ヒトCA IXの細胞外部分を含むGST−PGCA融合タンパク質をコードする構成物は、以前に記載されている(ザトビコバ(Zatovicova)ら、2003年)。下表2に、実施例に使用されたプライマーの配列を提供する。
細胞を60mmのペトリ皿にプレーティングし、翌日およそ70%の密度に達した。形質移入は、ヒトおよびマウスのCA IXのスプライシング変異体をコードするそれぞれ2μgのpSG5C−hASプラスミドおよびpSG5C−mASプラスミド、200ngのpSV2neoプラスミドと共に実施した。形質移入は、ヒトおよびマウスのCA IXのスプライシング変異体をコードするそれぞれ2μgのpSG5C−hASプラスミドおよびpSG5C−mASプラスミド、200ngのpSV2neoプラスミドと共に、Gene Porter II形質移入剤(ゲンランティス(Genlantis)社(米国カリフォルニア州サンディエゴ所在))を用いて実施した。HeLa細胞に関しては900μg/mlの濃度で、MDCK細胞に関しては500μg/mlの濃度でG418(インビトロジェン社製)を用いて、形質移入細胞を選別に供した。耐性コロニーをクローン化し、免疫ブロット法によりスプライシング変異体の発現を試験し、増殖させた。
蛍光CA阻害剤(FITC−CA I)は、ホモスルファニルアミドとフルオレセインイソチオシアネートとの反応により得られ、CA IXに対して24nMのKi値を示した(スバストバ(Svastova)ら、2004年、セッチ(Cecchi)ら、2005年)。この阻害剤を100mMの濃度で20%のDMSOを有するPBS中に溶解し、細胞への添加直前に培地中で最終的に1mM濃度に希釈した。MDCK−CA IX細胞(スバストバ(Svastova)ら、2004年)を、ヒトAS変異体を分泌するMDCK−AS形質移入体から馴化培地を含めた培地に、3.5cmの皿当り4×105細胞の密度でプレーティングした。対照細胞を、分泌ASの不在下でインキュベートした。24時間のインキュベーション後、同じ新鮮な培地を補充し、FITC−CA Iを細胞に添加し、細胞を低酸素ワークステーションに移し、さらに48時間結合させた。平行して酸素正常状態中でサンプルをインキュベートした。最後に細胞をPBSで5回洗浄し、ニコンE400エピ蛍光顕微鏡により検視した。蛍光強度は、Scion Image Beta4.02ソフトウェア(シオン社(Scion Corporation)(米国メリーランド州フレデリック所在))を用いて獲得した画像から評価し、相対的FITC−CA I結合をパーセントで表した。
タンパク質は、以前記載されたとおり(スバストバ(Svastova)ら、2004年)、RIPA緩衝液により、細胞単層または組織ホモジネートから抽出した。タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤のComplete mini(ロッシュ・アプライドサイエンス(Roche Applied Science)社(ドイツ国マンハイム所在))を含むRIPA緩衝液(PBS中、1%トリトンX−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド)により、細胞単層または組織ホモジネートから、氷上で30分間、抽出した。抽出物は、13000rpmで15分間、遠心分離し、総タンパク質濃度を、製造元の指示に従って、BCAアッセイ(ピアス(Pierce)社(米国イリノイ州ロックフォード所在))によって特定した。総タンパク質の抽出物(30〜50μgを含むアリコート)を、2−メルカプトエタノール有り(還元条件)、または2−メルカプトエタノールなし(非還元条件)で、ラムリ(Laemmli)のサンプル緩衝液中、10%および8%のSDS−PAGEにおいて分離した。
低酸素状態下および正常酸素状態下で24時間、FCSなしでインキュベートしたAS−形質移入細胞の培地から、細胞外ヒトASの検出用サンプルを調製した。培地の1/4(500μl)を10倍に濃縮し、SDS−PAGEで分離した。免疫沈降用に、1mlのハイブリドーマ培地中のCA IX特異的MAbsを、タンパク質−Aセファロースの50%懸濁液(ファルマシア(Pharmacia)社(スウェーデン国ウプサラ所在))25μlに、室温で2時間結合させた。細胞抽出物(200μl)を、タンパク質−Aセファロースの50%懸濁液20μlで予備クリアしてから、結合したMAbに加えた。タンパク質−Aセファロース上に採取した免疫複合体を洗浄し、沸騰させ、以前記載されたとおり(ザトビコバ(Zatovicova)ら、2003年)、SDS−PAGEおよび免疫ブロット法に供した。タンパク質を、SDS−PAGEにおいて分離し、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)膜(Immobilon(商標)−P、ミリポア(Millipore)社(米国マサチューセッツ州ビレリカ所在))上にブロットした。この膜を、0.2%Nonidet P−40を含むPBS中、5%無脂肪乳を含むブロック緩衝液で1時間処理し、次いで、ブロック緩衝液(1:2に希釈したハイブリドーマ培地中のM75モノクローナル抗体または1:1000に希釈したウサギ抗マウスCA IXポリクローナル抗体)中に希釈した一次抗体と共に1時間インキュベートした。処理後、膜を、0.2%のNonidet P−40を有するPBS中、45分間完全に洗浄し、ブロック緩衝液中で1:7500および1:5000に希釈した、西洋わさびペルオキシダーゼに結合させたブタ抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体(セバファーマ(Sevapharma)社製)と共に1時間インキュベートした。膜を、0.2%のNonidet P−40(シグマ(Sigma)社(米国ミズーリ州セントルイス所在))を含むPBS中で洗浄し、ECL検出系により展開した。
InstaPure試薬(ユーロジェンテック(Eurogentec)社(ベルギー国セライング所在)を用いて、総RNAを、細胞または組織から単離した。ランダムヘプタマープライマー(400ng/μl)を用い、M−MuLV逆転写酵素(フィンザイムス(Finnzymes)社(フィンランド国オイ所在))により、逆転写を実施した。5μgの総RNAとランダムプライマー(400ng/μl)の混合物を70℃で10分間加熱し、氷上で速やかに冷却し、6mMのMgCl2、40mMのKCl、1mMのDTT、0.1mg/mlのBSAおよび50mMのトリス−HCl、pH8.3を含む逆転写酵素緩衝液を添加した。最終容量24μlの混合物に、さらに200UのM−MuLV逆転写酵素を添加し、42℃で1時間インキュベートし、70℃で15分間加熱し、使用するまで−80℃で保存した。
CA IXのマウススプライス変異体の同定、構造および発現
マウス組織におけるCar9 mRNAの発現に関する以前の逆転写(RT)PCRデータは、エクソン1〜6の増幅に基づいていた。しかし、エクソン6〜11にわたる領域を増幅するために、プライマーm6Sおよびm11Aを用いたCar9 mRNAのRT PCR分析により、2つの増幅産物、すなわち、1つは予想された大きさのPCR産物、もう1つはそれよりも小さい産物の存在が判明した(図1A、1B)。この小さいPCR産物の配列決定により、そのCar9特異性が証明され、それが、エクソン7および8を欠く、マウスCar9 mRNAの選択的スプライシング(AS)変異体(配列番号106)であることが示された。このマウスAS変異体は、分析した3つの組織、胃、小腸および結腸全てに見られた(図1B)。対応する一対のプライマー(野性型に対してはm8S〜m10AおよびASに対してはm6/9S〜m10A)を用いたCar9の野生型およびAS変異体の個々のRT PCR増幅により、分析した組織において、双方の産物が同時に存在することが確認された(図1C)。
CA IXのヒトスプライス変異体の同定および構造
ヒトの組織および細胞株におけるAS CA9 mRNAを探索するために、本発明者らは、ヒトCA9 mRNAの全体をカバーするプライマーセットを設計した(図3A)。これらを、ヒトの胃および小腸から単離したmRNAから逆転写したcDNAテンプレート上でRT−PCRにおいて用いた。エクソン1および6に対して設計されたプライマーを用いて、本発明者らは、予想されたPCR産物のみを検出した(図3B)。しかしながら、エクソン6および11に対するプライマーにより、2つのPCRアンプリコン、すなわち、大量の長い産物と、非常に少量の短い産物が生じた(図3C)。この短い方の産物の配列解析によって、これが、ヒトCA9 mRNAのAS変異体に相当することが確認された。スプライシングにより、エクソン8および9の検出に至った。
腫瘍細胞株および腫瘍組織におけるヒトAS CA IXの発現
CA9 mRNAのFL変異体およびAS変異体の別々の検出を促進するために、本発明者らは、それら個々の増幅を可能にするプライマーを利用した。その設計は、1つのFL特異的プライマーを欠失領域内に配置し、もう1つのAS特異的プライマーを選択的スプライシングで生じたジャンクションに配置することに基づいていた(図3A)。
CA IXのヒトAS変異体の局在性および基本的な特徴
CA IXのAS変異体の基本的な特徴付けを実施するために、本発明者らは、ヒトASタンパク質の異所性発現を有する形質移入体を作出した。CA IX陰性のMDCK細胞、ならびに高密度および低酸素状態に応じてFL CA IXを天然に発現するヒトHeLa子宮頚部癌細胞に、ヒトAS cDNAを形質移入した。TM領域およびIC領域のスプライシングおよびフレームシフト媒介の除去を推定したコンピュータ解析と一致して、AS CA IXタンパク質は、細胞膜にとどめられず、MDCK細胞と酸素正常状態のHeLa細胞の双方において、細胞内局在を示した(図5A)。これは、形質移入MDCK細胞および低酸素状態(2%のO2)に曝露した偽形質移入HeLa細胞におけるFL CA IXの細胞表面局在とは明らかに対照的であった。
ヒトAS CA IXの機能的特性
腫瘍細胞におけるFL CA IXの発現は、低酸素状態によって誘導される。低酸素状態はまた、CA IXの触媒性能も活性化し、その結果、細胞外pHの酸性化が増強される(スバストバ(Svastova)ら、2004年)。この酸性化能力は、CA IXの触媒CAドメインを欠くドミナントネガティブな変異体の過剰発現によって消滅する(スバストバ(Svastova)ら、2004年)。ASタンパク質は、不完全なCAドメインしか含んでいないので、それが触媒的に活性であるかどうか、およびFL CA IXタンパク質によって媒介される酸性化を阻害する能力があるかどうかを分析することは特に重要であった。酵素活性の測定は、完全CAドメイン[例えば、配列番号9]を含み、それによってPGドメインとCAドメインの双方[aa52〜397(配列番号83)]を含むGST−PGCAを形成するFL CA IXのGST融合細胞外部分と比較して、切断CAドメインを含む組換え細菌GST−AS融合タンパク質を用いて、ストップドフロー分光法により達成した。その結果、野生型CA IXの触媒活性、Kcat(WT)=3.8×105/秒は、スプライシング変異体において半分、Kcat(AS)=1.9×105/秒に低下することが判明した。また、GST−ASタンパク質は、炭酸脱水酵素のスルホンアミド阻害剤であるアセタゾールアミンに対して、かなり低い親和性:Ki WT=14nM対KiAS=110nMを示した。それらのデータにより、このスプライシングは、CA IXの酵素活性と阻害剤に対するその親和性との双方を損なったことが示唆される。
選択的スプライシングの脱制御は、特に癌においてよく認識された現象である(ベナブルス(Venables)ら、2006年)。CD44、HIF−α、VEGF、オステオポンチンなど、また他にも多くの、その産物が腫瘍の進行に因果的に関与している、選択的にスプライスされた遺伝子の例は多数ある(ワン(Wong)ら、2003年、ゴチー(Gothie)ら、2000年、ロビンソン(Robinson)ら、2001年、フー(He)ら、2006年)。ある場合、正常な組織では稀であるスプライス型が腫瘍においては一般的になり得、一方で、正常組織に存在する選択的スプライス型は、不変のままであり得る(ロイ(Roy)ら、2005年)。
下記に掲げた物質は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(米国20110−2209バージニア州マナッサスUniversity Blvd.,10810所在)に寄託された。この寄託は、the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposited Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations(ブダペスト条約)にしたがって行なわれた。生存可能な培養物の維持は、寄託日から30年間保証される。ハイブリドーマおよびプラスミドは、ブダペスト条約の下、ATCCにより入手でき、当該出願から特許が付与された際に、寄託されたハイブリドーマおよびプラスミドの公的に非制限的利用を保証する出願者とATCC間の同意に従う。寄託された株が利用可能であることは、任意の政府当局のもとでその特許法に従って付与された権利に違反して、本発明を実施することの許可として解釈すべきではない。
1.完全長[FL]および選択的にスプライスされた[AS]MN/CA9 mRNAの発現、あるいは、ASおよびFLのMN/CA IXの発現の差異を識別する工程を有してなる、哺乳動物における異常なMN/CA IXの発現に関連する前新生物疾患/新生物疾患の診断および/または予後診断方法。
(b)FLのMN/CA9 mRNAは検出せず、ASのMN/CA9 mRNAを検出するためのプローブおよび/またはプライマー;および/または
(c)FLおよびASのMN/CA9 mRNAの双方を検出するためのプローブおよび/またはプライマー
の使用を含んでなる実施態様2に記載の方法。
(a)前記脊椎動物の組織サンプルを、少なくとも2種の抗体、少なくとも2種の抗原結合性抗体断片、または抗体および抗原結合性抗体断片の混合物に同時にまたは連続的に接触させる工程であって、
ここで、少なくとも1種の抗体/抗体断片は、FLのMN/CA IXタンパク質には特異的に結合するが、ASのMN/CA IXタンパク質には結合せず、
少なくとも1種の他の抗体/抗体断片は、FLのMN/CA IXとASのMN/CA IXの双方に特異的に結合する、
ことを特徴とする工程と、
(b)前記サンプルにおいて前記抗体/抗体断片の結合を検出および定量化する工程と、
(c)前記特異的に結合する抗体/抗体断片の結合を比較して、FLのMN/CA IXとASのMN/CA IXの相対的レベルを決定する工程と、
を有してなる実施態様11に記載の方法。
前記抗体/抗体断片、または、FLのMN/CA IXとASのMN/CA IXの双方に特異的に結合する抗体/抗体断片が、MN/CA IXのプロテオグリカン様(PG)ドメインに特異的である、
実施態様15に記載の方法。
前記MN/CA IXのPGドメインに特異的な前記抗体が、ATCC指定番号HB11128として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託されたハイブリドーマVU−M75により産生されるM75モノクローナル抗体である、
実施態様16に記載の方法。
脊椎動物の組織において選択的にスプライスされた[AS]MN/CA IXタンパク質は検出せず、完全長[FL]MN/CA IXタンパク質を検出、または検出および定量化する工程であって、
(a)前記脊椎動物の組織サンプルを、抗体または抗体断片と接触させる工程であって、前記抗体または抗体断片が、ASのMN/CA IXには結合しないが、FLのMN/CA IXには特異的に結合することを特徴とする工程と、
(b)前記サンプルにおける前記抗体/抗体断片の結合を検出および定量化する工程と、
を有してなる方法。
哺乳動物の前新生物/新生物サンプルにおける選択的にスプライスされた[AS]MN/CA9 mRNAは検出せず、完全長[FL]MN/CA9 mRNAを検出、または検出および定量化する工程を有してなり、前記サンプルからのmRNAを、ASのMN/CA9 mRNAには結合しないが、FLのMN/CA9 mRNAに特異的に結合するプライマーまたはプローブに接触させる工程を有してなることを特徴とする方法。
前記プローブまたはプライマーが、FLのMN/CA9 mRNAは検出せず、ASのMN/CA9 mRNAを検出するために使用され、
前記プローブまたはプライマーが、MN/CA9遺伝子のエクソン7および10のスプライスジャンクションに結合する核酸を含む、
実施態様22に記載のプローブまたはプライマー。
前記プローブまたはプライマーが、ASのMN/CA9 mRNAは検出せず、FLのMN/CA9 mRNAを検出するために使用され、
前記プローブまたはプライマーが、ヒトMN/CA9遺伝子のエクソン8またはエクソン9に結合するか、またはヒトMN/CA9遺伝子のエクソン7および8のスプライスジャンクション、エクソン8および9のスプライスジャンクション、またはエクソン9および10のスプライスジャンクションに結合する核酸を含む、
実施態様22に記載のプローブまたはプライマー。
前記ASのmRNAおよび前記FLのmRNAが、その長さにより識別される、
実施態様30に記載の一対のプローブおよび/またはプライマー。
前記ASのMN/CA IXのレベルの変化を検出および定量化する工程と、
を有してなる、選択的にスプライスされた[AS]MN/CA IXのレベルを調節する能力のある薬剤をインビトロにおいて同定する方法。
Claims (10)
- ヒト患者における選択的にスプライスされた切断[AS]MN/CA9 mRNAの発現と完全長[FL]MN/CA9 mRNAの発現とを識別するために使用される少なくとも21塩基長を有するプローブまたはプライマーであって、FL MN/CA9 mRNAを検出しないでAS MN/CA9 mRNAを検出するのに使用され、ヒトMN/CA9遺伝子のエクソン7および10のスプライスジャンクションに結合する核酸を含み、
前記AS MN/CA9 mRNAは、配列番号108の核酸配列に相補的な配列または配列番号108の配列と少なくとも90%同一である核酸配列に相補的な配列を有し、かつヒトMN/CA9遺伝子のエクソン8および9を含まないことを特徴とするプローブまたはプライマー。 - ヒト患者における選択的にスプライスされた切断[AS]MN/CA9 mRNAの発現と完全長[FL]MN/CA9 mRNAの発現とを識別するために使用される少なくとも21塩基長を有するプローブまたはプライマーであって、AS MN/CA9 mRNAは検出しないでFL MN/CA9 mRNAを検出するのに使用され、ヒトMN/CA9遺伝子のエクソン8またはエクソン9に結合するか、またはヒトMN/CA9遺伝子のエクソン7および8のスプライスジャンクション、エクソン8および9のスプライスジャンクション、またはエクソン9および10のスプライスジャンクションに結合する核酸を含み、
前記AS MN/CA9 mRNAは、配列番号108の核酸配列に相補的な配列または配列番号108の配列と少なくとも90%同一である核酸配列に相補的な配列を有し、かつヒトMN/CA9遺伝子のエクソン8および9を含まないことを特徴とするプローブまたはプライマー。 - 請求項1記載のプローブを1以上含むマイクロアレイチップ。
- ヒト患者における選択的にスプライスされた切断[AS]MN/CA9 mRNAの発現と完全長[FL]MN/CA9 mRNAの発現とを識別するために使用される一対の少なくとも21塩基長を有するプローブおよび/またはプライマーであって、FL MN/CA9 mRNAを検出しないでAS MN/CA9 mRNAを検出するのに使用され、ヒトMN/CA9遺伝子のエクソン7および10のスプライスジャンクションに結合する核酸を含み、
前記AS MN/CA9 mRNAは、配列番号108の核酸配列に相補的な配列または配列番号108の配列と少なくとも90%同一である核酸配列に相補的な配列を有し、かつヒトMN/CA9遺伝子のエクソン8および9を含まないことを特徴とする一対のプローブおよび/またはプライマー。 - ヒトにおける選択的にスプライスされた切断[AS]MN/CA IXをコードする単離核酸であって、前記AS MN/CA IXが、43〜48kDaの分子量を有し、該核酸は、配列番号108の核酸配列または配列番号108の配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有し、かつヒトMN/CA9遺伝子のエクソン8および9に相当するヌクレオチドを含まず、前記AS MN/CA IXが、2%以下のpO2の低酸素状態下におけるFL MN/CA IX発現細胞による細胞外酸性化を阻害し得ることを特徴とする単離核酸。
- 配列番号108の配列を有することを特徴とする、請求項5記載の単離核酸。
- 請求項5記載の単離核酸を発現するベクター。
- 請求項7記載のベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号108の配列または請求項5記載の単離核酸によりコードされ、ATCC番号HB11128としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマVU−M75から分泌されるM75モノクローナル抗体により特異的に結合されるが、登録番号LMBP6009CBとしてベルギー国ヘント所在の「BCCM」/LMBPに寄託されたハイブリドーマVU−V/10により産生されるV/10モノクローナル抗体によっては結合されないことを特徴とする、AS型のMN/CA IX。
- 配列番号108の配列によりコードされることを特徴とする、請求項9記載のAS型のMN/CA IX。
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