WO2018139386A1 - 癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法 - Google Patents

癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法 Download PDF

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present application relates to a screening method and screening kit for a compound that specifically suppresses a survival signal of cancer cells, a transformant, a recombinant vector, and a method for selecting a patient to which a molecular target drug is indicated.
  • Lung cancer is the leading cause of cancer deaths in economically well developed countries, of which lung adenocarcinoma is the most common histological subtype.
  • Lung adenocarcinoma is closely associated with the persistent expression of TTF-1, a lineage-specific transcription factor required for branching morphogenesis and physiological function in the lung. It is known (see Non-Patent Document 1). It is also known that TTF-1 is a lineage-survival oncogene (see Non-Patent Documents 2 to 4). Identification of downstream molecules involved in lineage-specific survival signals of TTF-1 is a novel therapeutic approach because TTF-1 is essential for surfactant protein production and physiological function in normal adult lungs Is necessary.
  • ROR1 receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1
  • ROR1 when ROR1 is targeted, not only induction of apoptosis of cancer cells but also receptor tyrosine kinases such as EGFR and MET (Receptor Tyrosine Kinase, hereinafter, receptor tyrosine kinases may be referred to as “RTK”). It is also known that ROR1 can be an important target for the development of cancer cell growth inhibitors (see Patent Document 2). Non-patent document 5).
  • the inhibitor of kinase activity is a compound that suppresses activation of RTK related to the growth and survival of human cancer including lung cancer.
  • a mutation that confers resistance to the kinase gene occurs during treatment, or a bypass pathway that depends on other receptors for the survival signal of the cancer cell occurs, causing the cancer cell to There is a problem of acquiring resistance to an inhibitor of the kinase activity.
  • Patent Document 3 is very effective in searching for compounds that can completely suppress the activity of various RTKs by specifically suppressing the formation of caveolae.
  • an effective anticancer agent it is desirable to elucidate the detailed molecular mechanism by which various receptors accumulated in caveola transmit survival signals to cancer cells.
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned conventional problems, and as a result of extensive research, (1) focusing on ROR1, which is a protein unique to cancer cells, and the binding of ROR1 and Cavin-3. Inhibition can suppress the survival signal by serine / threonine kinase (AKT), and (2) screening for compounds that target the binding of ROR1 and Cavin-3 can be expected to develop new anticancer agents. I found it.
  • the binding of ROR1 and Cavin-3 means the binding of “ROR1 protein” and “Cavin-3 protein”, and the description of the protein may be omitted.
  • an object of the present invention is to provide a screening method and screening kit for a compound that specifically suppresses a survival signal of cancer cells, a transformant, a recombinant vector, and a method for selecting a patient to which a molecular target drug is indicated. is there.
  • the present invention relates to a screening method and a screening kit for a compound that specifically suppresses a survival signal for cancer cells, a transformant, a recombinant vector, and a method for selecting a patient to which a molecular target drug is indicated, as described below.
  • a method for screening a compound that specifically suppresses a survival signal of cancer cells comprises: Contacting the test compound with a system capable of detecting inhibition of binding of ROR1 protein and Cavin-3 protein; Selecting a compound that inhibits the binding of ROR1 protein and Cavin-3 protein; A screening method comprising: (2) The screening method according to (1) above, wherein the survival signal of the cancer cell is a survival signal by AKT.
  • ROR1 protein A carrier that binds to at least one of the Cavin-3 protein, the ROR1 protein, and the Cavin-3 protein, A screening kit for a compound that inhibits the binding of ROR1 protein and Cavin-3 protein, comprising at least (4) The screening kit for a compound that suppresses the binding of ROR1 protein and Cavin-3 protein according to (3), wherein the carrier is at least one selected from a metal film, metal nanoparticles, and beads.
  • the carrier is A donor bead comprising a photosensitizer that is excited by light irradiation and converts surrounding oxygen molecules into a singlet state; and An acceptor bead including a chemiluminescence transmitter that reacts with the singlet oxygen to emit light; And
  • the ROR1 protein binds to one of the donor bead or the acceptor bead;
  • the Cavin-3 protein is bound to the other of the donor bead or the acceptor bead;
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a survival signal of a cancer cell.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of survival signals of cancer cells, as in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an embodiment of a screening kit that targets the binding of Cavin-3 and ROR1.
  • 4A to 4D are photographs substituted for drawings, and show that ROR1 and Cavin-3 bind to each other in a lung adenocarcinoma cell line.
  • FIG. 4A is a photograph showing the result of Western blotting analysis of binding of endogenous ROR1 and endogenous Cavin-3 in lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975.
  • FIG. 4B is a photograph showing the result of analysis by Western blotting that endogenous ROR1 and endogenous Cavin-3 bind to SK-LU-1, a lung adenocarcinoma cell line.
  • FIG. 4C shows that endogenous cavin-3 binds to GST-ROR1 using a cell extract of a lung adenocarcinoma cell line, NCI-H1975, and recombinant purified proteins GST and GST-ROR1. It is a photograph which shows the result analyzed by the pull down method and the Western blotting method.
  • FIG. 4C shows that endogenous cavin-3 binds to GST-ROR1 using a cell extract of a lung adenocarcinoma cell line, NCI-H1975, and recombinant purified proteins GST and GST-ROR1. It is a photograph which shows the result analyzed by the pull down method and the Western blotting method.
  • FIGS. 5A to 5D are photographs substituted for drawings, and are photographs showing the results of analyzing the colocalization of ROR1 and Cavin-3 by a cell staining method in a confocal laser microscope.
  • 5A is a photograph of ROR1
  • FIG. 5B is a photograph of Cavin-3
  • FIG. 5C is a photograph in which ROR1 and Cavin-3 are merged
  • FIG. 5A is a photograph of ROR1
  • FIG. 5B is a photograph of Cavin-3
  • FIG. 5C is a photograph in which ROR1 and Cavin-3 are merged
  • FIG. 5D is a photograph in which a portion surrounded by a rectangle in FIG. 5C is enlarged.
  • FIG. 6 shows that the ROR1 binding site of Cavin-3 has been identified.
  • FIG. 6A shows a schematic diagram of deletion mutants of ROR1 kinase domain, two serine / threonine-rich domains, and proline-rich domain.
  • FIG. 6B is a drawing-substituting photograph showing the result of analysis by the immunoprecipitation method and Western blotting method that Cavin-3 is bound in the kinase domain of ROR1.
  • Cavin-3 has been shown to bind in a region within the kinase domain of 473 to 564 amino acids within the kinase domain of the ROR1 protein.
  • FIG. 6 shows that the ROR1 binding site of Cavin-3 has been identified.
  • FIG. 6A shows a schematic diagram of deletion mutants of ROR1 kinase domain, two serine / threonine
  • FIG. 7 shows that, in the lung adenocarcinoma cell line, the binding region of ROR1 by Cavin-3 is indispensable for proper intracellular localization of Cavin-3, but caveola formation itself is not affected. Is shown.
  • FIG. 7A is a drawing-substituting photograph showing ROR1 wild type (WTm) having resistance to siROR1 and ROR1 (TK ⁇ 1m) lacking the binding site of Cavin-3 in NCI-H1975 lung adenocarcinoma cell line.
  • WTm wild type
  • TK ⁇ 1m ROR1
  • FIG. 7B is a drawing-substituting photograph showing the result of analysis by cell staining that the intracellular localization of Cavin-3 changes in lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975 in which TK ⁇ 1m of ROR1 is expressed under the same conditions. It is a photograph shown.
  • FIG. 7C is a drawing-substituting photograph. In the lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975 in which ROR1 WTm or TK ⁇ 1m was expressed, the change in the number of caveolae formation was analyzed by ultrathin section analysis by electron microscopic analysis. It is a photograph which shows the result.
  • FIG. 7D is a graph showing the results of analysis.
  • FIG. 7B is a drawing-substituting photograph showing the result of analysis by cell staining that the intracellular localization of Cavin-3 changes in lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975 in which TK ⁇ 1m of ROR1 is
  • FIG. 8 shows that in the lung adenocarcinoma cell line, the binding region of ROR1 by Cavin-3 is essential for activation of the survival signal by ligand stimulation.
  • FIG. 8A is a drawing-substituting photograph in which the binding site of ROR1 that is not resistant to siROR1 (WT), the wild type of ROR1 that is resistant to siROR1 (WTm), and Cavin-3 is deleted.
  • ROR1 (TK ⁇ 1m) was expressed in NCI-H1975 lung adenocarcinoma cell line, and treated with siROR1 to replace intracellular ROR1 with WTm and TK ⁇ 1m, and phosphorylation (activity of AKT by IGF-I stimulation) It is a photograph which shows the result of having analyzed by Western blotting.
  • FIG. 8B is a photograph showing the result of analyzing the phosphorylation (activation) of AKT by EGF stimulation by Western blotting instead of IGF-I stimulation.
  • FIG. 9 shows that, in the lung adenocarcinoma cell line, suppression of the expression of Cavin-3 shows a decrease in cell proliferation similarly to the suppression of the expression of ROR1.
  • FIG. 9A is a drawing-substituting photograph showing the result of analyzing the expression suppression efficiency of each of the lung adenocarcinoma cell line PC-9 treated with siROR1 or siCavin-3 by Western blotting.
  • the lower part of FIG. 9A is a graph showing the effect of MTT assay on cell proliferation.
  • the upper part of FIG. 9B is a photograph showing the result of analysis by Western blotting when the lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975 is used instead of the lung adenocarcinoma cell line PC-9, and the lower part of FIG. 9B is by MTT assay. It is the graph which showed the influence on cell proliferation.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting photograph and shows the result of analysis by GST-pull down method and Western blotting method that recombinant purified proteins of GST-ROR1 and His-Cavin-3 bind to each other.
  • FIG. 1 and FIG. 2 are diagrams showing examples of cancer cell survival signals (see Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6).
  • ROR1 regulates the balance between survival signal (AKT signal) and apoptosis signal (p38 signal)
  • ROR1 activates c-Src, via PTEN, or directly
  • ROR1 binds to EGFR to induce heterodimer formation between EGFR and ERBB3, and phosphorylates ERBB3 and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • ROR1 functions as a scaffold protein that interacts with CAV1 and CAVIN-1, which are caveola constituent molecules, thereby promoting the binding of CAV1 and CAVIN-1 at the cell membrane, and forming caveolae.
  • CAV1 and CAVIN-1 which are caveola constituent molecules
  • RTKs receptor tyrosine kinases
  • the “survival signal” means a signal that induces an intracellular environment such as gene expression and metabolism in cancer cells to a state in which apoptosis is suppressed and survival is promoted.
  • receptor-type tyrosine kinases and series caused by binding of various growth factors (EGF, PDGF, FGF, HGF, insulin-like growth factor, etc.) to a receptor having tyrosine kinase activity (receptor-type tyrosine kinase).
  • numerator is mentioned.
  • a compound that specifically suppresses a survival signal of cancer cells means a compound that does not affect normal cells and can specifically suppress only the survival signal of cancer cells.
  • the present inventors have newly found that the binding of ROR1 and Cavin-3 among the various signals shown in FIGS. 1 and 2 suppresses the survival signal by AKT. Since ROR1 is a protein specific to cancer cells, the inhibition of the binding of ROR1 and Cavin-3 does not affect normal cells and can specifically suppress only the survival signal of cancer cells.
  • the target compound of the screening method of the present application is, for example, a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a single compound such as a protein, an antibody, or a peptide, as well as a compound library, an expression product of a gene library, a cell extract, Examples include cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts and the like.
  • “suppression” includes not only complete suppression (ie, inhibition) but also partial suppression.
  • “specifically suppressing survival signal” includes both inhibiting the generation of survival signal and suppressing survival signal activity.
  • “suppression of ROR1 and Cavin-3 binding” includes both complete inhibition of ROR1 and Cavin-3 binding and partial inhibition of binding.
  • the gene information, cDNA sequence and amino acid sequence of human ROR1 are known.
  • the gene information of GenBank Gene ID: 4919, the cDNA described in GenBank accession number NM_005012, and the amino acid sequence information described in GenBank accession number NP_005003 are obtained. can do.
  • Cavin-3 also known as PRKCDBP
  • PRKCDBP is known as a Cavin family protein together with Cavin-1, 2, 4 and is known to be localized in caveolae.
  • the caveola means a structure having a depression on the surface of an epithelial cell and an endothelial cell membrane of cancer cells.
  • the caveolae contain RTKs that transmit signals into cells by binding various growth factors such as EGF, PDGF, FGF, HGF, and insulin-like growth factor (IGF-IR). It functions as a transmission, lipid uptake and elimination of bacteria that have invaded the body.
  • the gene information, cDNA sequence and amino acid sequence of human Cavin-3 are known.
  • gene information of GenBank Gene ID: 112464, cDNA described in GenBank accession number NM_145040, and amino acid sequence information described in GenBank accession number NP_659477 can be obtained.
  • any cancer cells may be used as long as they form caveolae and intracellular structures caused by caveolae.
  • cancer cells include lung cancer (including lung adenocarcinoma, lung small cell carcinoma, lung squamous cell carcinoma, lung large cell carcinoma), pancreatic cancer, malignant mesothelioma, breast cancer, stomach cancer, colon cancer, oral cancer.
  • Cancer cells such as esophageal cancer, uterine cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, testis cancer, but are not limited thereto.
  • biological species from which cancer cells are derived include, but are not limited to, humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, pigs, cows, sheep, goats, and the like.
  • the screening method is not particularly limited as long as the test compound is brought into contact with a system that can directly or indirectly detect whether or not cancer cell survival signals can be specifically suppressed, and changes in function before and after contact can be detected. No.
  • test compound may be brought into contact with a system in which ROR1 and Cavin-3 are expressed, and then the presence or absence of inhibition of the binding of ROR1 and Cavin-3 may be examined.
  • detection methods include ELISA (enzyme immunoassay), immunoprecipitation-western blot (IP-WB), pull-down assay, cross-linked protein interaction analysis (cross-link method), Two-hybrid method, fluorescence It can be carried out by a quenching method, labeled transcription protein interaction analysis method, far western blot analysis method or the like. If a decrease in the binding amount of ROR1 and Cavin-3 is detected as compared to the detection in the absence of the test compound, the test compound is evaluated to specifically suppress cancer cell survival signals.
  • compounds that specifically suppress cancer cell survival signals can also be screened for the fluorescence intensity of proteins and the refractive index of photomolecules.
  • a system that includes at least the ROR1 protein and the Cavin-3 protein and has a difference in fluorescence brightness, a refractive index of a photomolecule, and the like when both are bound to each other may be constructed.
  • one of ROR1 protein or Cavin-3 protein is immobilized on the surface of a metal film such as gold or silver or the surface of a metal nanoparticle, the other protein is mixed with a test compound, and the protein is irradiated by laser irradiation.
  • a method using a surface plasmon resonance method for detecting a refractive index of a laser when a protein is bound to a protein that is, when a complex is formed.
  • the fluorescence spectrum generated when one of the fluorescent molecules whose excitation spectrum is on the short wavelength side is irradiated with excitation light overlaps the excitation spectrum of the other fluorescent molecule (proteins Fluorescence resonance energy transfer (FRET) method detected by photomolecules.
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an embodiment of a screening kit that targets the binding of Cavin-3 and ROR1, and is an alpha screen (AlphaScreen) technology using recombinant purified proteins of GST-ROR1 and His-Cavin-3.
  • Alphascreen technology includes donor beads and acceptor beads, and energy is transferred from one bead to the other by the binding of molecules captured on both beads (singlet oxygen generation), and fluorescence. The principle of signal generation is used.
  • the ROR1 protein is bound to one of the donor bead or the acceptor bead
  • the Cavin-3 protein is bound to the other of the donor bead or the acceptor bead.
  • the donor bead contains a photosensitive substance and is excited by light irradiation such as laser light to convert surrounding oxygen molecules into a singlet state.
  • the photosensitive substance include porphyrins, phthalocyanines, chlorines, tetraphenylporphyrins, benzolporphyrin derivatives, purpurines, pheophorbides, and metal complexes thereof.
  • Other substances may be used as long as can be converted into a singlet state.
  • the acceptor bead contains a chemiluminescence transmitter that reacts with singlet oxygen to emit light.
  • chemiluminescence transmitter examples include thioxan, but other substances may be used as long as they can react with singlet oxygen to emit light.
  • the material for forming the bead is not particularly limited as long as it can disperse the photosensitive substance and the chemiluminescent transmission substance, and a polymer or the like generally used in the bio field may be used.
  • donor beads and acceptor beads refer to “Alpha Protein-Protein Interaction User Guide” by PerkinElmer Japan Co., Ltd.
  • a recombinant protein with glutathione S-transferase is used as ROR1 to facilitate binding to glutathione-coated donor beads.
  • GST glutathione S-transferase
  • it may be directly fixed without using GST, or another protein tag may be used.
  • Other protein tags include HA, c-myc, FLAG, DIG, FITC, V5, GFP, MBP, and the like, in addition to histidine (His) that easily binds to metal ions such as nickel. Further, it may be immobilized in a system using a biotin-streptavidin reaction.
  • Cavin-3 may be directly fixed without using histidine, or another protein tag may be used.
  • a method of capturing (capturing) the protein itself with an antibody without using a tagging method for the protein For example, using anti-ROR1 antibody and anti-Cavin-3 antibody that react with ROR1 and Cavin-3, and using protein A, protein G, or protein L as beads containing a photosensitizer and a chemiluminescence transmitter, By using antibodies (human, mouse, rabbit, sheep, cow, chicken, etc.), it is possible to construct an alpha screen system. By using the above screening kit, it is possible to easily screen for a compound that suppresses the binding between ROR1 and Cavin-3.
  • a carrier such as a metal film, a metal nanoparticle, and a bead for immobilizing at least one of the ROR1 protein and the Cavin-3 protein and both proteins.
  • a recombinant protein or antibody may be used as appropriate, or a carrier may be selected.
  • the binding site of ROR1 that binds to Cavin-3 is an intracellular region of ROR1 (ROR1-ICD: amino acid sequence Nos. 428 to 937) within the kinase domain. It was newly specified to be the amino acid region from 473 to 564. Since Cavin-3 binds to the intracellular region of ROR1, a cell in which at least the amino acid sequence of amino acid sequence 473 to 564 and Cavin-3 are expressed in the amino acid sequence of the intracellular region of ROR1 is produced, By constructing a system that can detect the binding between the expressed proteins as fluorescence intensity in the cell, another embodiment of the screening kit can be obtained.
  • a cell in which both the amino acid region of 473 to 564 of ROR1 and Cavin-3 are expressed can be prepared by the following procedure.
  • a recombinant vector into which a nucleic acid encoding an amino acid sequence containing at least amino acids 473 to 564 of amino acid sequences 428 to 937 in the intracellular region of ROR1 is prepared.
  • a recombinant vector into which a nucleic acid encoding the amino acid sequence of human Cavin-3 is inserted is prepared.
  • Transformants are prepared by introducing the vectors (1) and (2) into cells. The production of the recombinant vector and the introduction of the recombinant vector into the cell may be performed by a known method.
  • HeLa cells As the cells, HeLa cells, HEK293 cells, COS-7 cells, CHO cells and the like can be used. (4) Using these cells, a cell line that can be constitutively expressed as a transformant introduced with the recombinant vectors (1) and (2) is prepared.
  • a screening kit can be prepared.
  • Cavin-3 binds to the binding site of expressed ROR1 to Cavin-3, it can be detected as fluorescence intensity (foci: dot-like structure), and the test compound is bound to ROR1 binding site and Cavin-3.
  • fluorescence intensity fluorescence intensity (foci: dot-like structure)
  • the test compound can be easily selected by not detecting the fluorescence intensity.
  • a membrane protein eg, ROR1 protein, etc.
  • a protein that is usually localized or scattered in a cell eg, Cavin-3 protein
  • Image-based Protein-Protein Interaction analysis it is said that the detection system is not stable if the full length of the nucleic acid encoding the protein is incorporated into a vector. Since the region where ROR1 binds to Cavin-3 was found to be part of the intracellular region, the above procedure did not incorporate the amino acid sequence Nos. 1 to 427 that are the extracellular region part of ROR1.
  • the nucleic acid portion encoding the amino acid sequence of the extracellular region portion may be incorporated into the vector.
  • detection methods immunoprecipitation, yeast two-hybrid system, FRET (fluorescence resonance energy transfer), a method using surface plasmon resonance, and the like can also be used.
  • embodiment of said screening method has shown embodiment which actually contacts a test compound, you may implement the process made to contact a test compound in silico. As in Examples described later, the binding site of ROR1 protein that binds to Cavin-3 protein was found.
  • a test compound that suppresses the binding between the ROR1 protein and the Cavin-3 protein is contacted (calculated) in silico, and the compound that suppresses the binding is selected. It is good also as an embodiment.
  • a method for selecting a patient to which a molecular target drug is indicated is that a cancer cell sample is obtained from a subject, and the expression of ROR1 and Cavin-3 in the sample is measured to specifically determine the survival signal of the cancer cell. It is possible to select an indication patient of the compound screened by the screening method of the inhibitory compound. Expression may be any of protein, RNA, and DNA expression.
  • ELISA method For the expression of ROR1 and Cavin-3 in a sample, ELISA method, real-time PCR method, RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) method, in situ hydridization method, immunohistochemistry method, etc. may be used.
  • RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
  • Cell lines and reagents Human lung adenocarcinoma cell lines are stored in an American cultured cell line. Purchased from the institution (American Type Culture Collection). The PC-9 cell line (RCB4455) was obtained from RIKEN's Cell Bank. The SK-LU-1 cell line is the Lloyd J. et al. Provided by Old (Memorial Sloan Kettering Cancer Center). These cell lines were maintained with RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (manufactured by Invitrogen).
  • FBS fetal bovine serum
  • Recombinant IGF-I was obtained from PeproTech.
  • Recombinant EGF was obtained from Sigma.
  • the following antibodies were purchased from the following companies.
  • anti-ROR1 for Western blotting was purchased from Cell Signaling Technology.
  • anti-ROR1 for immunoprecipitation was purchased from R & D system.
  • Anti-ROR1 for cell staining was purchased from abcam.
  • -Anti-Cavin-1 and anti-Cavin-2 were purchased from abcam.
  • anti-Cavin-3 was purchased from Protein Technologies.
  • Anti- ⁇ -tubulin was purchased from Sigma.
  • • anti-CAV1 was purchased from BD Bioscience.
  • ⁇ Anti-GST was purchased from MBL.
  • Anti-AKT and anti-phospho-AKT (S473) were purchased from Cell Signaling Technology.
  • -Anti-mouse IgG and anti-rabbit IgG were purchased from Cell Signaling Technology.
  • -Anti-goat IgG was purchased from R & D system.
  • pCMVpuro-ROR1-TK ⁇ 473-564 (TK ⁇ 1)
  • pCMVpuro-ROR1-TK ⁇ 564-655 (TK ⁇ 2)
  • pCMVpuro-ROR1-TK ⁇ 655-746 (TK ⁇ 3)
  • pCMVpuro-ROR1- ⁇ 748-782 ( ⁇ S / Tp)
  • ROR1- ⁇ 784-851 ( ⁇ P)
  • pCMVpuro-ROR1- ⁇ 853-876 ⁇ S / T2 were prepared by performing in vitro mutation using KOD-plus-DNA polymerase (TOYOBO).
  • ROR1-TK ⁇ 1-F 5′-CGGTCCTGGGAGGGACTCTCAAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
  • ROR1-TK ⁇ 1-R 5′-AGCAGAAAGAGGGTAGCTCTTTAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
  • ROR1-TK ⁇ 2-F 5′-ATCATGAGATCCCCCACTACTGATG-3 ′
  • ROR1-TK ⁇ 2-R 5′-GAGGAACTCATGAGAGCCCCCCTGA-3 ′
  • ROR1-TK ⁇ 3-F 5′-ATTCGCTGGATGCCCCCCTGAAGCCA-3 ′
  • ROR1-TK ⁇ 3-R 5′-GGGCAGCAAGGAACTTACCTCTGGACC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • ROR1- ⁇ S / T1-F 5′-AACCCCAGATATCCCATATACATGT-3 ′
  • pulmonary adenocarcinoma cell lines NCI-H1975 and SK-LU-1 cell lines were used, and lysis buffer containing octylglucoside (0.15M) was used. After suspending the cells with NaCl, 50 mM EDTA, 60 mM Octylglucoside), immunoprecipitation-Western blotting analysis was performed.
  • RNA interference (RNAi) against human ROR1 and human Cavin-3 The following RNA oligomers were obtained from QIAGEN and Sigma-Aldrich for RNAi. 5′-CAGCAAUGGAUGGAAUUCCA-3 ′: siROR1 # 1 (SEQ ID NO: 13), 5'-CCCAGUGAGUAAUCUCAGU-3 ': siROR1 # 2 (SEQ ID NO: 14), -5'-CUCUGAGUCGGCAGCCACGA-3 ': siCavin-3 # 1 (SEQ ID NO: 15). As a control, AllStars Negative Control siRNA (siControl # 1) was obtained from QIAGEN.
  • siRNA each 20 nM was performed using Lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Cells were harvested 3 days after transfection for Western blotting analysis. The influence on cell proliferation was measured using Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo) 5 days after transfection.
  • siROR1-resistant ROR1 mutants lacking the Cavin-3 binding site was prepared by performing in vitro maturation using KOD-plus-DNA polymerase (TOYOBO). No amino acid substitution is involved in the production, 5′-CCCGGGTAAGCAACCTAAGC-3 ′ (siROR1 # 2) (SEQ ID NO: 16), The primers were used.
  • Wild-type ROR1 (ROR1-WT), wild-type ROR1 (ROR1-WTm) resistant to siROR1, or ROR1 (ROR1-WTm) lacking the binding site of cavin-3 resistant to siROR1 TK ⁇ 1m) was transfected into NCI-H1975 cells, 24 hours later, puromycin was selected (1.0 ⁇ g / ml), a single clone was collected, and a stable clone (constantly expressing each ROR1) ROR1-expressing cell line) was prepared. These stable clones were then treated with siControl or siROR1, followed by sucrose concentration gradient centrifugation, cell staining, electron microscopic analysis, and Western blotting analysis with ligand stimulation.
  • a secondary antibody (Invitrogen) conjugated with Alexa dyes was reacted for 1 hour, washed with PBS, mounted on a slide glass with Fluoromount (Diagnostic BioSystems), and a confocal laser microscope (Carl Zeiss) was attached. Using this, the localization of intracellular ROR1 and Cavin-3 was observed. Further, NCI in which ROR1 (ROR1-TK ⁇ 1m) lacking the binding site of wild-type ROR1 (ROR1-WTm) having resistance to siROR1 or Cavin-3 having resistance to siROR1 was constantly expressed. -For H1975 cells, siROR1 treatment was performed the day after seeding the cells. 24 hours after transfection, the cells were fixed at room temperature, and prepared in the same manner. The intracellular localization of CAV1, cavin-1, and cavin-3 was observed using a confocal laser microscope (Carl Zeiss).
  • This solubilized solution was allowed to stand on ice for 30 minutes, mixed with 80% sucrose dissolved in 1 ml of TN Buffer, and transferred to a centrifuge tube (Ultra Clear, manufactured by Beckman). On top of that, 5.5 ml of 30% sucrose and 3.5 ml of 5% sucrose solution were overlaid, and ultracentrifugation was performed at 200,000 g at 4 ° C. for 22 hours using a SW41Ti rotor (manufactured by Beckman). . Thereafter, each sample was fractionated every 11 samples, and after acetone precipitation, treated with SDS sample buffer and subjected to Western blotting analysis.
  • Example 1 ⁇ Verification of binding of ROR1 and Cavin-3 in lung adenocarcinoma cell line> Examination was performed by the method described in (3) above by immunoprecipitation using the lung adenocarcinoma cell lines NCI-H1975 and SK-LU-1 cell lines. As shown in FIGS. 4A and 4B, it was found that endogenous ROR1 and endogenous Cavin-3 were bound. There has been no report on the interaction between ROR1 and Cavin-3, and this is a new finding. Further, in this verification, it was also possible to confirm the binding between ROR1 and Cavin-1 verified in Patent Document 3 and Non-Patent Document 6.
  • FIGS. 5A to 5D are photographs showing the results of analysis by immunocytostaining that ROR1 and Cavin-3 co-localize in a confocal laser microscope.
  • FIG. 5A shows the intracellular localization of endogenous ROR1
  • FIG. 5B shows the intracellular localization of endogenous Cavin-3.
  • FIG. 5C is a photograph in which ROR1 and Cavin-3 are merged
  • FIG. 5D is a photograph in which a portion surrounded by a rectangle in FIG. 5C is enlarged.
  • FIGS. 5C and 5D it was revealed that endogenous ROR1 and endogenous Cavin-3 partially colocalize in the cell and in the cell membrane.
  • Cavin-3 is involved in the physiological function of caveolae, it is known that it is concentrated and localized with CAV1 in the cell membrane, but also in the part where caveola is concentrated (enlarged region). It was found to be very significantly co-localized with ROR1.
  • FIG. 6A shows a schematic diagram of deletion mutants of ROR1 kinase domain, two serine / threonine-rich domains, and proline-rich domain.
  • FIG. 6B is a drawing-substituting photograph showing the result of analysis by the immunoprecipitation method and Western blotting method that Cavin-3 is bound in the kinase domain of ROR1.
  • FIG. 6A and FIG. 6B it was found that Cavin-3 binds to the N-terminal third region (473 to 564 amino acids) in the kinase domain of ROR1.
  • Patent Document 3 and Non-Patent Document 6 it is known that ROR1 binds to caveolae-related molecules Cavin-1 and CAV1, but the region to which they bind is the C-terminal in the kinase domain of ROR1.
  • Patent Document 3 discloses specific examples of transformants, recombinant vectors, and compound screening kits containing the binding region portion of Cavin-1.
  • a screening kit for a compound that specifically inhibits the binding between Cavin-3 and ROR1 may be prepared in the same manner as in Patent Document 3.
  • Example 4 ⁇ Examination of the effect of binding of ROR1 and Cavin-3 in lung adenocarcinoma cell line on proper localization and caveolae formation of Cavin-3>
  • the lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975 was used to suppress the expression of endogenous ROR1 and newly An experimental system for reconstructing cells in the cell in which ROR1 lacking 3 binding regions was expressed was constructed.
  • ROR1-WTm wild-type ROR1 having resistance to siROR1
  • ROR1-TK ⁇ 1m cavin-3 having resistance to siROR1
  • a lung adenocarcinoma cell line NCI-H1975 in which the deficient ROR1) was constantly expressed was established.
  • These established cell lines are treated with siROR1 to eliminate endogenous ROR1 originally present in NCI-H1975 and newly express ROR1 that lacks the binding region of wild-type ROR1 or Cavin-3. be able to. Therefore, by comparing the two, it is possible to clarify the important physiological functions provided by the binding of ROR1 and Cavin-3 in lung adenocarcinoma cell lines.
  • the sucrose concentration gradient centrifugation method described in (9) above and the immune cells described in (6) above regarding the localization change of Cavin-3 to caveolae The examination was performed using a staining method.
  • FIG. 7A is a photograph showing the result of analyzing the localization change of Cavin-3 by sucrose concentration gradient centrifugation method by Western blotting method.
  • the cell line expressing ROR1-TK ⁇ 1m compared to the cell line expressing ROR1-WTm, the disappearance of cavin-3 in the insoluble fraction containing caveolae (Detergent-resistant membrane: DRM, 6 and 7 fractions) was recognized.
  • no influence was observed on the expression of CAV1, which is a caveola constituent molecule.
  • FIG. 7B is a photograph showing the result of analysis by immunocytostaining.
  • the cell line expressing ROR1-TK ⁇ 1m a large change was observed in the intracellular localization of Cavin-3 as compared to the cell line expressing ROR1-WTm.
  • the cell line expressing ROR1-WTm it is localized in the cytoplasm and cell membrane in the form of dots, whereas in the cell line expressing ROR1-TK ⁇ 1m, it is accumulated in the center of the cytoplasm. Appearance was apparent, showing clearly different localization.
  • no changes were observed in the intracellular localization of CAV1 and Cavin-1, which are caveolae-related molecules. From the above, it was found that the binding of ROR1 and Cavin-3 in lung adenocarcinoma cells is necessary for the proper localization and arrangement of Cavin-3 to caveolae containing CAV1.
  • FIG. 7C is a photograph taken with an electron microscope by an ultrathin section method. Analysis of how much caveolae are formed in a region on a random cell membrane of 100 micrometers of the cell membrane revealed that caveolae were expressed in both the ROR1-WTm-expressing cell line and the ROR1-TK ⁇ 1m-expressing cell line. The formation of was observed.
  • FIG. 7C is a photograph taken with an electron microscope by an ultrathin section method. Analysis of how much caveolae are formed in a region on a random cell membrane of 100 micrometers of the cell membrane revealed that caveolae were expressed in both the ROR1-WTm-expressing cell line and the ROR1-TK ⁇ 1m-expressing cell line. The formation of was observed.
  • Example 5 ⁇ Examination of the effect of ROR1 and Cavin-3 binding on survival signals in lung adenocarcinoma cell lines due to ligand stimulation> From the examination of Examples 1 to 4, ROR1 and Cavin-3 bind and colocalize in lung adenocarcinoma cell lines and are important for proper localization of Cavin-3, but do not participate in caveolae formation. I found. In Patent Document 3 and Non-Patent Document 6, it is clear that ROR1 is important for activation of various receptors accumulated in caveolae by interacting with CAV1 and Cavin-1 and contributing to caveolae formation. I have done it. However, there is no understanding of the detailed molecular mechanism of how survival signals are transmitted with the activation of these receptors.
  • FIG. 8A shows ROR1 wild-type (WT) having no resistance to siROR1, ROR1 wild-type (WTm) having resistance to siROR1, and ROR1 (TK ⁇ 1m) lacking the binding site of Cavin-3 Is expressed in the NCI-H1975 lung adenocarcinoma cell line, and by performing siROR1 treatment, intracellular ROR1 is replaced with WTm or TK ⁇ 1m, and phosphorylation (activation) of AKT by IGF-I stimulation is a Western blotting method. It is a photograph which shows the result analyzed by. As is clear from FIG.
  • FIG. 8B is a photograph showing the result of analyzing the phosphorylation (activation) of AKT by EGF stimulation by Western blotting instead of IGF-I stimulation.
  • phosphorylation of AKT by EGF stimulation is also decreased in the cell line expressing ROR1-WT, and the decrease in AKT phosphorylation is restored in the cell line expressing ROR1-WTm. confirmed.
  • ROR1-TK ⁇ 1m as in the cell line expressing ROR1-WT, a marked decrease in phosphorylation of AKT was observed.
  • siControl treatment as a control an increase in phosphorylation of AKT by EGF stimulation was observed in all the expression cell lines.
  • Example 6 ⁇ Examination of the effect on cell proliferation by suppressing Cavin-3 expression in lung adenocarcinoma cell lines>
  • the binding between ROR1 and Cavin-3 is an indispensable binding for controlling the survival signal by AKT by stimulating ligands such as IGF-I and EGF.
  • Cavin-3 also known as PRKCDBP, is an intracellular protein identified as a PKC ⁇ binding protein. In recent years, it has been found that it is a molecule involved in physiological functions of caveolae. Therefore, whether or not Cavin-3 is actually involved in survival in lung adenocarcinoma cell lines was examined by the method described in (4) above.
  • FIG. 9A The upper part of FIG. 9A is a photograph showing the results of analysis by Western blotting using PC-9, a lung adenocarcinoma cell line, and the lower part of FIG. 9A is a graph showing the effect of MTT assay on cell proliferation. It is.
  • FIG. 9A when the expression of ROR1 and Cavin-3 in the cells was suppressed by RNA interference method, a significant decrease in cell proliferation was observed as in the case of suppressing the expression of ROR1.
  • FIG. 9B shows the results when NCI-H1975, a lung adenocarcinoma cell line, was used instead of PC-9.
  • Example 7 ⁇ Inhibitor screening method for targeting and inhibiting the binding of ROR1 and Cavin-3> From the examination of [Example 1] to [Example 6], since the binding of ROR1 and Cavin-3 in lung adenocarcinoma cells is a very important interaction controlling the survival signal by AKT, If the binding between proteins can be inhibited, the cell growth of ROR1-positive and Cavin-3 positive lung adenocarcinoma cells can be specifically suppressed and can be killed. Therefore, a screening system targeting the binding of ROR1 and Cavin-3 using the AlphaScreen technology (manufactured by PerkinElmer) showing high-sensitivity and low background based on beads for detecting intermolecular interactions in a microplate format.
  • AlphaScreen technology manufactured by PerkinElmer
  • FIG. 2 The outline of the screening system is shown in FIG. 2. Specifically, GST-ROR1 protein is bound to donor beads coated with glutathione, and His-Cavin-3 protein is bound to acceptor beads of nickel chelate. I let you. It is possible to find an inhibitor that inhibits the binding of ROR1 and Cavin-3 by mixing each protein-adsorbed bead in one well and adding various low molecular weight compounds in each well. Become. By using this screening system, many low molecular weight compounds can be reacted at once at a low cost and simply, so that comprehensive high-throughput screening can be realized.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of analysis by Western blotting. As shown in FIG. 10, it was confirmed that His-Cavin-3 did not bind to GST but to GST-ROR1.

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Abstract

癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。　ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の結合を抑制する化合物を選択する工程、を含む、スクリーニング方法により、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物をスクリーニングできる。

Description

癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法
　本願は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法に関する。
　肺癌は、経済的に良く発展した国々における癌による死亡の主たる原因であり、その中でも肺腺癌は最も頻度の高い組織学的サブタイプである。
　肺腺癌は、肺における分岐形態形成及び生理学的機能に必要な系譜特異的転写因子（ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）であるＴＴＦ－１（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ－１）の持続的な発現と密接に結びついていることが知られている(非特許文献１参照)。また、ＴＴＦ－１は系譜生存的癌遺伝子（ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるということも知られている（非特許文献２～４参照）。ＴＴＦ－１がサーファクタントタンパク質の産生、並びに正常な成人の肺における生理学的機能に欠かせないことから、ＴＴＦ－１の系譜特異的生存シグナルに関与する下流分子の同定は、新たな治療方法の開発に必要である。
　ＴＴＦ－１により発現が誘導される下流分子としては、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｏｒｐｈａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）遺伝子が知られている。そして、このＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制することにより、特定の癌細胞の増殖が阻害できることも知られている（特許文献１参照）。
　更に、ＲＯＲ１を標的とすると、癌細胞のアポトーシスの誘導のみならず、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ、以下、受容体型チロシンキナーゼのことを「ＲＴＫ」と記載することがある。）が伝達する癌細胞の生存促進性シグナルの抑制が可能であること、そのため、ＲＯＲ１が、癌細胞の増殖抑制剤の開発の重要な標的となりうることも知られている（特許文献２参照、非特許文献５参照）。
　ところで、上記特許文献２等に記載されているように、これまでの開発されてきた多くの分子標的薬は、キナーゼ活性の阻害剤である。前記キナーゼ活性の阻害剤とは、肺癌を始めとするヒトがんの増殖・生存に関わるＲＴＫの活性化を抑制する化合物のことである。しかしながら、キナーゼ活性の阻害剤を患者に投与すると、治療中にキナーゼ遺伝子に耐性を付与する変異が生じたり、癌細胞の生存シグナルを他のレセプターに依存するバイパス経路が生じることで、癌細胞が当該キナーゼ活性の阻害剤に対して耐性を獲得するという問題がある。
　また、上記特許文献２に記載されているＥＧＦＲ、ＭＥＴ等、癌細胞の一つのレセプターを分子標的とした場合、他のレセプターからのシグナルが遮断できず十分な効果が得られないことがあり、各々のレセプターを標的とする阻害剤の併用が試みられている。しかしながら、複数の阻害剤を併用したとしても、更にバイパス経路が生じたり、複数の阻害剤投与による副作用が拡大する恐れがあるという問題がある。
　以上のことから、正常細胞や癌細胞は様々な生存シグナルを駆使し自身が生き延びることを可能としているが、これらの生存シグナルは細胞膜に存在する多くのＲＴＫを介して伝わる。これまでの研究から、癌細胞では個々のＲＴＫをターゲットとした分子標的薬（ＥＧＦＲを対象としたイレッサなど）が開発され、上記のように複数のＲＴＫに対する阻害剤の併用が試みられているが、更に異なるＲＴＫを介したバイパス経路の出現やこれらのＲＴＫは正常細胞でも生存シグナルを伝える重要な役割を担っているため、副作用が非常に大きな問題となっている。そのため、癌細胞の個々のＲＴＫをターゲットとするのではなく、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－１又はＲＯＲ１とＣａｖｅｏｌｉｎ１（以下、「ＣＡＶ１」と記載することがある。）の結合を抑制することで、各種増殖因子が結合し細胞内にシグナルを伝達するＲＴＫが集積しているカベオラの形成自体を抑制できること、そして、カベオラの形成を特異的に抑制することで、各種ＲＴＫの活性を一網打尽にできることも知られている（特許文献３、非特許文献６参照）。
国際公開第２０１０／００８０６９号 国際公開第２０１２／０９０９３９号 国際公開第２０１６／０６３６３７号
Ｔａｎａｋａ．Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，　ｐ６００７～６０１１ Ｋｅｎｄａｌｌ．Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００７，　Ｖｏｌ．１０４，　ｐ１６６６３～１６６６８ Ｗｅｉｒ，ＢＡ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２００７，　Ｖｏｌ．４５０，　ｐ８９３～８９８ Ｋｗｅｉ，ＫＡ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，　Ｖｏｌ．２７，　ｐ３６３５～３６４０ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ，２０１２，　Ｖｏｌ．２１，　ｐ３４８～３６１ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，Ｖｏｌ．７，１００６０（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１００６０）
　上記のとおり、特許文献３に記載されている発明は、カベオラの形成を特異的に抑制することで、各種ＲＴＫの活性を一網打尽にできる化合物の探索に非常に有効である。一方、有効な抗癌剤の開発には、カベオラに集積する様々な受容体が癌細胞に生存シグナルを伝達する詳細な分子機序についても併せて解明することが望ましい。具体的には、カベオラの生理的機能に鑑み、その形成は抑制せずに、カベオラに集積する様々な受容体が伝える生存シグナルをより特異的に阻害できるような分子機序を解明することが望ましい。
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）癌細胞に特有のタンパク質であるＲＯＲ１に着目し、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合の阻害が、セリン・スレオニンキナーゼ（ＡＫＴ）による生存シグナルを抑制すること、（２）ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合を標的とする化合物をスクリーニングすることで、新たな抗癌剤の開発が期待できること、を新たに見出した。なお、以下において、「ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合」とは、「ＲＯＲ１タンパク質」と「Ｃａｖｉｎ－３タンパク質」の結合を意味し、タンパク質の記載を省略する場合もある。
　すなわち、本発明の目的は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法を提供することである。
　本発明は、以下に示す、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法に関する。
（１）癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
　前記スクリーニング方法が、
　ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
　ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物を選択する工程、
を含む、スクリーニング方法。
（２）前記癌細胞の生存シグナルが、ＡＫＴによる生存シグナルである、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）ＲＯＲ１タンパク質、
　Ｃａｖｉｎ－３タンパク質、及び
　前記ＲＯＲ１タンパク質、並びに、前記Ｃａｖｉｎ－３タンパク質の少なくとも一方と結合する担体、
を少なくとも含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（４）前記担体が、金属膜、金属ナノ粒子、及びビーズから選択される少なくとも１つである、上記（３）に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（５）前記担体が、
　　光照射によって励起され、周囲の酸素分子を一重項状態に変換する光感受性物質を含むドナービーズ、及び、
　　前記一重項酸素と反応し発光する化学発光伝達物質を含むアクセプタービーズ、
であり、
　前記ＲＯＲ１タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの一方に結合し、
　前記Ｃａｖｉｎ－３タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの他方に結合している、
上記（３）に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（６）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８～９３７番の内、少なくとも４７３～５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
　ヒトＣａｖｉｎ－３のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
（７）上記（６）に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（８）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８～９３７番の内、少なくとも４７３～５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター。
（９）被検体から癌細胞を取得する工程、
　前記癌細胞中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の発現を測定する工程、
を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
　本願で開示する癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法により、通常の細胞には影響を与えず、癌細胞を特異的に抑制する化合物を発見できる可能性が有る。
図１は、癌細胞の生存シグナルの一例を表す図である。 図２は、図１と同様、癌細胞の生存シグナルの一例を表す図である。 図３は、Ｃａｖｉｎ－３とＲＯＲ１との結合を標的としたスクリーニングキットの実施形態の一例を示す図である。 図４Ａ乃至Ｄは、図面代用写真で、肺腺癌細胞株において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３が結合することを示している。図４Ａは、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５において、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ－３が結合することを、ウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図４Ｂは、肺腺癌細胞株であるＳＫ－ＬＵ－１において、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ－３が結合することを、ウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図４Ｃは、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５の細胞抽出液およびリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ－ＲＯＲ１を用いて、内因性のＣａｖｉｎ－３がＧＳＴ－ＲＯＲ１と結合することをＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図４Ｄは、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５の細胞抽出液およびリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ－Ｃａｖｉｎ－３を用いて、内因性のＲＯＲ１がＧＳＴ－Ｃａｖｉｎ－３と結合することをＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。 図５Ａ乃至Ｄは、図面代用写真で、共焦点レーザー顕微鏡において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３が共局在することを細胞染色法によって分析した結果を示す写真である。図５ＡはＲＯＲ１の写真、図５ＢはＣａｖｉｎ－３の写真、図５ＣはＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３をマージした写真、図５Ｄは図５Ｃの長方形で囲った部分を拡大した写真である。 図６は、Ｃａｖｉｎ－３のＲＯＲ１結合部位を同定したことを示す図である。図６Ａは、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン、２箇所のセリン・スレオニンリッチドメイン、プロリンリッチドメインのそれぞれの欠損変異体の模式図を示している。また、図６Ｂは、図面代用写真で、Ｃａｖｉｎ－３がＲＯＲ１のキナーゼドメイン内で結合していることを免疫沈降法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。Ｃａｖｉｎ－３はＲＯＲ１タンパク質のキナーゼドメイン内の４７３アミノ酸から５６４アミノ酸のキナーゼドメイン内の領域で結合していることを示している。 図７は、肺腺癌細胞株においてＣａｖｉｎ－３によるＲＯＲ１の結合領域はＣａｖｉｎ－３の適切な細胞内での局在化に必要不可欠であるが、カベオラ形成そのものには影響が認められないことを示している。図７Ａは、図面代用写真で、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＲＯＲ１の野生型（ＷＴｍ）、及び、Ｃａｖｉｎ－３の結合部位を欠損させたＲＯＲ１（ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ－Ｈ１９７５肺腺癌細胞株に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行うことで細胞内のＲＯＲ１をＷＴｍ、及び、ＴＫΔ１ｍに置換させた際のショ糖濃度勾配遠心法によるＣａｖｉｎ－３の局在変化をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図７Ｂは、図面代用写真で、同様の条件においてＲＯＲ１のＴＫΔ１ｍを発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５においてＣａｖｉｎ－３の細胞内局在が変化することを細胞染色法によって分析した結果を示す写真である。図７Ｃは、図面代用写真で、ＲＯＲ１のＷＴｍあるいはＴＫΔ１ｍを発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５では、カベオラの形成数に変化が見られないことを超薄切片法により電子顕微鏡解析によって分析した結果を示す写真である。図７Ｄは、分析した結果を示すグラフである。 図８は、肺腺癌細胞株において、Ｃａｖｉｎ－３によるＲＯＲ１の結合領域はリガンド刺激による生存シグナルの活性化に必要不可欠であることを示している。図８Ａは、図面代用写真で、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持たないＲＯＲ１の野生型（ＷＴ）、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＲＯＲ１の野生型（ＷＴｍ）、及び、Ｃａｖｉｎ－３の結合部位を欠損させたＲＯＲ１（ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ－Ｈ１９７５肺腺癌細胞株に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行うことで細胞内のＲＯＲ１をＷＴｍ、及びＴＫΔ１ｍに置換させ、そして、ＩＧＦ－Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図８Ｂは、ＩＧＦ－Ｉ刺激に換え、ＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。 図９は、肺腺癌細胞株において、Ｃａｖｉｎ－３の発現抑制はＲＯＲ１の発現抑制と同様に、細胞増殖の低下が認められることを示している。図９Ａの上段は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株ＰＣ－９においてｓｉＲＯＲ１あるいはｓｉＣａｖｉｎ－３を処理した際の各々の発現抑制の効率をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図９Ａの下段は、ＭＴＴ　ａｓｓａｙによる細胞増殖への影響を示したグラフである。図９Ｂの上段は、肺腺癌細胞株ＰＣ－９に換え、肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５を用いた時のウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真で、図９Ｂの下段はＭＴＴ　ａｓｓａｙによる細胞増殖への影響を示したグラフである。 図１０は、図面代用写真で、ＧＳＴ－ＲＯＲ１およびＨｉｓ－Ｃａｖｉｎ－３のリコンビナント精製タンパク質同士が結合することをＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示している。
　以下に、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、形質転換体、組み換えベクター、並びに、分子標的薬の適応患者の選択方法について詳しく説明する。
　図１および図２は、癌細胞の生存シグナルの一例を表す図である（非特許文献５および非特許文献６参照）。図１に示すように、（１）ＲＯＲ１は生存シグナル（ＡＫＴシグナル）とアポトーシスシグナル（ｐ３８シグナル）のバランスを制御、（２）ＲＯＲ１はｃ－Ｓｒｃを活性化し、ＰＴＥＮを介して、あるいは直接的に、ＡＫＴによる生存シグナルを制御、（３）ＲＯＲ１はＥＧＦＲと結合することで、ＥＧＦＲとＥＲＢＢ３とのヘテロダイマー形成を惹起させ、ＥＲＢＢ３のリン酸化やホスファチジルイノシトール　３－キナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　３－ｋｉｎａｓｅ；ＰＩ３Ｋ）のサブユニットであるｐ８５によるＥＲＢＢ３への結合、さらにはＰＩ３Ｋ（ｐ８５とｐ１１０の複合体）の活性化を通じてＡＫＴによる生存シグナルの維持にも関与、することが知られている。また図２に示すように、ＲＯＲ１は、カベオラ構成分子であるＣＡＶ１やＣａｖｉｎ－１と相互作用するスキャフォールドタンパク質として機能することで、細胞膜でのＣＡＶ１とＣａｖｉｎ－１の結合を促進させ、カベオラ形成を安定化させることで、そこに集積する様々なタイプの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のリガンド刺激等による活性化を維持させ、ＲＴＫからの生存シグナルの維持に関与、することが知られている。
　なお、本願において、「生存シグナル」とは、癌細胞における遺伝子発現や代謝などの細胞内環境を、アポトーシスを抑制し生存を促進する状況に誘導するシグナルを意味する。例えば、種々の増殖因子（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子など）がチロシンキナーゼ活性をもつ受容体（受容体型チロシンキナーゼ）に結合することによって惹起される、受容体型チロシンキナーゼ及び一連の下流分子のリン酸化反応によって伝達されるシグナルが挙げられる。また、「癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物」とは、通常細胞には影響を与えず、癌細胞の生存シグナルのみを特異的に抑制できる化合物を意味する。本発明者らは、図１および図２に示す各種シグナルの中で、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合が、ＡＫＴによる生存シグナルを抑制すること新たに見出した。ＲＯＲ１は癌細胞に特異的なタンパク質であることから、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合の抑制は、通常細胞には影響を与えず、癌細胞の生存シグナルのみを特異的に抑制することができる。
　本願のスクリーニング方法のターゲットとなる化合物は、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。また、「抑制」とは、完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することも含む。例えば、「生存シグナルを特異的に抑制」には、生存シグナルの生成を阻害および生存シグナル活性の抑制の双方が含まれる。また、「ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の結合の抑制」には、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合の完全な阻害、及び結合の部分的な阻害の双方が含まれる。
　ヒトＲＯＲ１の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：４９１９の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０１２に記載のｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
　Ｃａｖｉｎ－３は別名ＰＲＫＣＤＢＰとも呼ばれ、Ｃａｖｉｎ－１、２、４とともに、Ｃａｖｉｎファミリータンパク質として知られ、カベオラに局在することが知られている。なお、カベオラとは、癌細胞の上皮細胞と内皮細胞膜表面にある窪みを持った構造を意味している。カベオラには、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ－ＩＲ）など各種の増殖因子が結合することで細胞内にシグナルを伝達するＲＴＫが集積しており、癌細胞へのシグナル伝達、脂質の取り込みや体内に侵入した細菌などの排除として機能している。
　ヒトＣａｖｉｎ－３の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１１２４６４の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５０４０に記載のｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５９４７７に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
　ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３は、カベオラおよびカベオラに起因する細胞内構造物に局在することから、癌細胞としては、カベオラおよびカベオラに起因する細胞内構造物を形成するものであればよい。そのような癌細胞としては、例えば、肺癌（肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、肺大細胞癌を含む）、膵癌、悪性中皮腫、乳癌、胃癌、大腸癌、口腔癌、食道癌、子宮癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌などの癌の細胞が挙げられるが、これらに制限されない。癌細胞の由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。
　スクリーニング方法は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制することができるか否かを直接又は間接的に検出し得る系に試験化合物を接触させ、接触前後の機能の変化を検出できれば特に制限は無い。
　例えば、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３が発現している系等に、試験化合物を接触させ、次いで、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の結合の抑制の有無について調べればよい。
　検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、免疫沈降－ウェスタンブロット（ＩＰ－ＷＢ）法、プルダウンアッセイ法、架橋タンパク質相互作用解析法（クロスリンク法）、Ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法、蛍光消光法、標識転写タンパク質相互作用解析法、ファーウエスタンブロット解析法などによって実施することができる。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の結合量の低下が検出されれば、試験化合物は、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制すると評価される。
　上記の検出方法の他、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物は、タンパク質の蛍光輝度や光分子の屈折率としてスクリーニングすることもできる。具体的には、少なくともＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質を含み、両者が結合する場合と結合しない場合に、蛍光輝度や光分子の屈折率などに差がでる系を構築すればよい。例えば、金、銀等の金属膜表面又は金属ナノ粒子表面に、ＲＯＲ１タンパク質又はＣａｖｉｎ－３タンパク質の一方を固定し、他方のタンパク質と試験化合物を混合し、ここにレーザーを照射することで、タンパク質とタンパク質との結合、すなわち複合体が形成された際の、レーザーの屈折率を検出する、表面プラズモン共鳴法を使った方法が挙げられる。また、２種類の蛍光分子を使用することで、励起スペクトルが短波長側にある一方の蛍光分子に励起光を照射すると生じる蛍光スペクトルが、もう一方の蛍光分子の励起スペクトルト重なる場合（タンパク質同士が近距離で相互作用する場合）、光分子が検出する蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）法などが挙げられる。
　図３は、Ｃａｖｉｎ－３とＲＯＲ１との結合を標的としたスクリーニングキットの実施形態の一例を示す図で、ＧＳＴ－ＲＯＲ１およびＨｉｓ－Ｃａｖｉｎ－３のリコンビナント精製タンパク質を用いたアルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）技術を用いた例を示している。アルファスクリーン技術とは、ドナービーズ及びアクセプタービーズを含み、両ビーズの上に捕捉された分子同士の結合により、ビーズの一方からもう一方にエネルギーの伝達が起き（一重項酸素の発生）、蛍光シグナルが発生する原理を用いている。ＲＯＲ１タンパク質をドナービーズ又はアクセプタービーズの一方に結合し、Ｃａｖｉｎ－３タンパク質をドナービーズ又はアクセプタービーズの他方に結合しておく。そして、両ビーズを試験化合物と混合することで、試験化合物がＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の結合を抑制する場合は、蛍光輝度の変化として測定することができる。
　ドナービーズおよびアクセプタービーズについて、より具体的に説明する。ドナービーズには、光感受性物質が含まれ、レーザー光等の光照射によって励起され、周囲の酸素分子を一重項状態に変換する。光感受性物質としては、例えば、ポルフィリン類、フタロシアニン類、塩素類、テトラフェニルポルフィリン類、ベンゾルポルフィリン誘導体類、プルプリン類、フェオフォルバイド類及びその金属錯体類等が挙げられるが、周囲の酸素分子を一重項状態に変換できれば、他の物質でもよい。アクセプタービーズには、一重項酸素と反応し発光する化学発光伝達物質が含まれている。化学発光伝達物質としては、例えば、チオキサン、等が挙げられるが、一重項酸素と反応し発光できるものであれば、他の物質でもよい。ビーズを形成する材料は、光感受性物質、化学発光伝達物質を分散することができれば特に制限はなく、バイオ分野で一般的に用いられているポリマー等を用いればよい。ドナービーズおよびアクセプタービーズの具体例は、株式会社パーキンエルマージャパン社の「Ａｌｐｈａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ユーザーガイド」を参照すればよい。
　なお、図３に示す例では、グルタチオンコートドナービーズに結合しやすくするために、ＲＯＲ１としてグルタチオン　Ｓ－トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）とのリコンビナントタンパク質が用いられているが、ビーズの種類（ビーズ表面のコート材料の種類）に応じてＧＳＴを用いずに直接固定、又は、他のタンパク質タグを用いてもよい。他のタンパク質タグとしては、ニッケルなどの金属イオンと結合し易いヒスチジン（Ｈｉｓ）の他、ＨＡ、ｃ－ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＤＩＧ、ＦＩＴＣ、Ｖ５、ＧＦＰ、ＭＢＰ等が挙げられる。さらに、ビオチン－ストレプトアビジンの反応を用いた系で固定してもよい。Ｃａｖｉｎ－３についてもＲＯＲ１と同様、ヒスチジンを用いずに直接固定、又は、他のタンパク質タグを用いてもよい。
　また、タンパク質へのタグ付加法を用いない、タンパク質そのものを抗体で捕獲（キャプチャー）する方法もある。例えば、ＲＯＲ１およびＣａｖｉｎ－３と反応する抗ＲＯＲ１抗体および抗Ｃａｖｉｎ－３抗体を用い、光感受性物質と化学発光伝達物質を含むビーズとしてプロテインＡやプロテインＧ、あるいはプロテインＬを用いて、各種二次抗体（ヒト、マウス、ラビット、羊、ウシ、チキンなど）を使用することで、アルファスクリーン系を構築することが可能である。上記スクリーニングキットを用いることで、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合を抑制する化合物のスクリーニングを簡単に行うことができる。
　上記のとおり、スクリーニングキットの実施形態の一例としては、ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質、並びに、両タンパク質の少なくとも一方を固定するための、金属膜、金属ナノ粒子、ビーズ等の担体を少なくとも含めば良い。そして、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合の抑制の検出方法に応じて、適宜、リコンビナントタンパク質や抗体を用いたり、担体の選択をすればよい。
　また、後述する実施例で示すとおり、本発明では、Ｃａｖｉｎ－３と結合するＲＯＲ１の結合部位が、ＲＯＲ１の細胞内領域（ＲＯＲ１－ＩＣＤ：アミノ酸配列４２８～９３７番）の内、キナーゼドメイン内の４７３～５６４番のアミノ酸領域であることを新たに特定した。Ｃａｖｉｎ－３はＲＯＲ１の細胞内領域に結合することから、ＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列の内、少なくともアミノ酸配列４７３～５６４番のアミノ酸領域及びＣａｖｉｎ－３が発現している細胞を作製し、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる系を構築することで、スクリーニングキットの他の実施形態とすることもできる。
　ＲＯＲ１の４７３～５６４番のアミノ酸領域及びＣａｖｉｎ－３の両方が発現している細胞は、次の手順で作製することができる。
（１）ＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８～９３７番の内、少なくとも４７３～５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
（２）ヒトＣａｖｉｎ－３のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
（３）細胞に、（１）及び（２）のベクターを導入して形質転換体を作製する。組み換えベクターの作製及び細胞への組み換えベクターの導入は、公知の方法で行えばよい。また、細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＣＨＯ細胞等を用いることができる。
（４）これらの細胞を用いて（１）および（２）の組み換えベクターを導入した形質転換体として恒常的に発現することができる細胞株を作製する。
　次いで、例えば、Ｉｍａｇｅ－ｂａｓｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｆｌｕｏｐｐｉ）、Ｆｌｕｏ－ｃｈａｓｅ等、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる公知のキットに上記の形質転換体を用いることで、スクリーニングキットを作製することができる。発現しているＲＯＲ１のＣａｖｉｎ－３への結合部位とＣａｖｉｎ－３が結合する時には蛍光輝度（ｆｏｃｉ：ドット状の構造物）として検出することができ、試験化合物がＲＯＲ１の結合部位とＣａｖｉｎ－３が結合することを抑制できるときには蛍光輝度として検出しないことで、試験化合物の選択を簡単に行うことができる。
　なお、一般的に、Ｉｍａｇｅ－ｂａｓｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓに膜タンパク質（例えばＲＯＲ１タンパク質など）や細胞内で通常ドット状に局在、或いは、散在するするタンパク質（例えばＣａｖｉｎ－３タンパク質など）等を組み込む場合、当該タンパク質をコードする核酸の全長をベクターに組み込むと検出系が安定しないと言われている。ＲＯＲ１がＣａｖｉｎ－３と結合する領域が細胞内領域の部分であることが判明したため、上記手順では、ＲＯＲ１の細胞外領域部分であるアミノ酸配列１～４２７番部分を組み込んでいない。しかしながら、検出系が安定する範囲内であれば、細胞外領域部分のアミノ酸配列をコードする核酸部分についてもベクターに組み込んでもよい。その他の検出方法としては、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法を利用した方法などを用いることもできる。なお、上記のスクリーニング方法の実施形態は、試験化合物を実際に接触させる実施形態を示しているが、試験化合物を接触させる工程は、インシリコで実施してもよい。後述する実施例のとおり、Ｃａｖｉｎ－３タンパク質と結合するＲＯＲ１タンパク質の結合部位が判明した。そのため、スクリーニング方法は、ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質の立体構造に基づき、ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する試験化合物をインシリコで接触（計算）し、結合を抑制する化合物を選択する実施形態としてもよい。
　また、分子標的薬の適応患者の選択方法は、被検体から癌細胞サンプルを取得し、サンプル中の、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の発現を測定することで、上記癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物の適応患者の選択をすることができる。発現は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡの発現の何れであってもよい。
　サンプル中の、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ－３の発現は、ＥＬＩＳＡ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法、ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ法等、公知の方法を用いればよい。
　以下に実施例を掲げ、実施形態を具体的に説明するが、本願で開示する発明の範囲を限定、あるいは制限することを表すものではない。
＜材料と方法＞
（１）細胞株と試薬
　ヒト肺腺癌細胞株、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ－５９０８）、および、ＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ－１６５１）細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。ＰＣ－９細胞株（ＲＣＢ４４５５）は、ＲＩＫＥＮのＣｅｌｌ　Ｂａｎｋより入手した。ＳＫ－ＬＵ－１細胞株は、Ｌｌｏｙｄ　Ｊ．Ｏｌｄ（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター）から提供を受けた。そして、これらの細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ　１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により維持した。
　組換えＩＧＦ－Ｉは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から入手した。組み換えＥＧＦは、Ｓｉｇｍａ社から入手した。
　下記抗体は、各々下記会社から購入した。
・ａｎｔｉ－ＲＯＲ１（ウェスタンブロッティング用）は、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ＲＯＲ１（免疫沈降用）は、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ＲＯＲ１（細胞染色用）は、ａｂｃａｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ－Ｃａｖｉｎ－１、ａｎｔｉ－Ｃａｖｉｎ－２はａｂｃａｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ－Ｃａｖｉｎ－３は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。
・ａｎｔｉ－α－ｔｕｂｕｌｉｎは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ＣＡＶ１は、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ＧＳＴは、ＭＢＬ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ＡＫＴ、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ（Ｓ４７３）は、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、及びａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧは、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧは、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。
（２）コンストラクト
　ヒトＲＯＲ１全長ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）はｐＣＭＶ－ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。ヒトＣａｖｉｎ－３全長ｃＤＮＡ（かずさＤＮＡ研究所）はｐＣＭＶ－ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ－Ｃａｖｉｎ－３）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。また、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－ＴＫΔ４７３－５６４（ＴＫΔ１）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－ＴＫΔ５６４－６５５（ＴＫΔ２）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－ＴＫΔ６５５－７４６（ＴＫΔ３）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－Δ７４８－７８２（ΔＳ／Ｔ１）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－Δ７８４－８５１（ΔＰ）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－Δ８５３－８７６（ΔＳ／Ｔ２）については、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。
　以下に、各々の作製に用いたプライマーを示す。
・ＲＯＲ１－ＴＫΔ１－Ｆ：５’－ＣＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＣ－３’（配列番号：１）、
・ＲＯＲ１－ＴＫΔ１－Ｒ：５’－ＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣ－３’（配列番号：２）、
・ＲＯＲ１－ＴＫΔ２－Ｆ：５’－ＡＴＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号：３）、
・ＲＯＲ１－ＴＫΔ２－Ｒ：５’－ＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡ－３’（配列番号：４）、
・ＲＯＲ１－ＴＫΔ３－Ｆ：５’－ＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡ－３’（配列番号：５）、
・ＲＯＲ１－ＴＫΔ３－Ｒ：５’－ＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣ－３’（配列番号：６）、
・ＲＯＲ１－ΔＳ／Ｔ１－Ｆ：５’－ＡＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴ－３’（配列番号：７）、
・ＲＯＲ１－ΔＳ／Ｔ１－Ｒ：５’－ＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡ－３’（配列番号：８）、
・ＲＯＲ１－ΔＰ－Ｆ：５’－ＡＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡ－３’（配列番号：９）、
・ＲＯＲ１－ΔＰ－Ｒ：５’－ＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧ－３’（配列番号：１０）、
・ＲＯＲ１－ΔＳ／Ｔ２－Ｆ：５’－ＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣ－３’（配列番号：１１）、
・ＲＯＲ１－ΔＳ／Ｔ２－Ｒ：５’－ＣＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）。
（３）ウェスタンブロッティング分析、及び免疫沈降－ウェスタンブロッティング分析（ＩＰ－ＷＢ分析）
　ウェスタンブロッティング分析、及び免疫沈降－ウェスタンブロッティング分析は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ　フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及び化学発光増強システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、標準的な方法により施行した。ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合部位を特定するために、ｐＣＭＶｐｕｒｏ－Ｃａｖｉｎ－３－ＷＴ、とともに、ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（ＷＴ）、ＴＫΔ４７３－５６４（ＴＫΔ１）、ＴＫΔ５６４－６５５（ＴＫΔ２）、ＴＫΔ６５５－７４６（ＴＫΔ３）、Δ７４８－７８２（ΔＳ／Ｔ１）、Δ７８４－８５１（ΔＰ）、Δ８５３－８７６（ΔＳ／Ｔ２）、といった様々なＲＯＲ１発現コンストラクトと一緒に共発現を行った。これらはＣＯＳ－７細胞を用いて、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によるトランスフェクション後２４時間で細胞を回収し、免疫沈降－ウェスタンブロッティング分析を行った。
　またＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－１、２、３との結合を確認するため、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５及びＳＫ－ＬＵ－１細胞株を用いて、オクチルグルコシド含有のｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、６０ｍＭ　Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）で細胞を懸濁した後、免疫沈降－ウェスタンブロッティング分析を行った。
（４）ヒトＲＯＲ１およびヒトＣａｖｉｎ－３に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
　ＲＮＡｉを行うため、下記ＲＮＡオリゴマーをＱＩＡＧＥＮ社及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
・５’－ＣＡＧＣＡＡＵＧＧＡＵＧＧＡＡＵＵＵＣＡＡ－３’：ｓｉＲＯＲ１＃１（配列番号：１３）、
・５’－ＣＣＣＡＧＵＧＡＧＵＡＡＵＣＵＣＡＧＵ－３’：ｓｉＲＯＲ１＃２（配列番号：１４）、
・５’－ＣＵＣＵＧＡＧＵＣＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡ－３’：ｓｉＣａｖｉｎ－３＃１（配列番号：１５）。
　また、コントロールとして、ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ＃１）はＱＩＡＧＥＮ社から入手した。
　ｓｉＲＮＡ（各々２０ｎＭ）のトランスフェクションは、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、そのメーカーの使用説明書に従って行った。そして、細胞は、ウェスタンブロッティング分析のため、トランスフェクションをしてから３日後に回収した。細胞増殖への影響については、トランスフェクションをしてから５日後にＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学社製）を用いて測定を行った。
（５）Ｃａｖｉｎ－３結合部位を欠損したｓｉＲＯＲ１抵抗性のＲＯＲ１変異体の作成
　ｓｉＲＯＲ１＃２に抵抗性を持ったｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１＃２）やｐＣＭＶｐｕｒｏ－ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍ（ｓｉＲＯＲ１＃２）については、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・５’－ＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣ－３’（ｓｉＲＯＲ１＃２）（配列番号：１６）、
のプライマーを用いた。
　野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１－ＷＴ）、あるいはｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持った野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１－ＷＴｍ）、またはｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＣａｖｉｎ－３の結合部位を欠失したＲＯＲ１（ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞にトランスフェクションを行い、２４時間後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎでセレクション（１．０μｇ／ｍｌ）を行った上で、シングルクローンを採取し、それぞれのＲＯＲ１を発現したｓｔａｂｌｅ　ｃｌｏｎｅ（恒常的ＲＯＲ１発現細胞株）を作製した。これらのｓｔａｂｌｅ　ｃｌｏｎｅは、その後、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１で処理の後、ショ糖濃度勾配遠心法や細胞染色法、電子顕微鏡解析、リガンド刺激によるウェスタンブロッティング分析を行った。
（６）免疫細胞染色法
　肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株を、カバーガラスを敷いた６－ｗｅｌｌプレートで培養し、培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、３．７％ホルムアルデヒドを含んだＰＢＳで室温固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含んだＰＢＳで透過処理を行った。非特異結合を防ぐために１．０％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＰＢＳで３０分間静置させた後、１．０％ＢＳＡを含んだＰＢＳで希釈した１次抗体で１時間、特異的なＡｌｅｘａ　ｄｙｅｓが共役された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製）でスライドガラス上にマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて細胞内のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の局在を観察した。また、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持った野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１－ＷＴｍ）あるいはｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＣａｖｉｎ－３の結合部位を欠失したＲＯＲ１（ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍ）を恒常的に発現させたＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞については、細胞を播種した次の日に、ｓｉＲＯＲ１処理を行った。トランスフェクション後２４時間で室温固定し、同様にプレパラートを作製し、ＣＡＶ１やｃａｖｉｎ－１、ｃａｖｉｎ－３の細胞内局在について共焦点レーザー顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて観察した。
（７）超薄切片法を用いた電子顕微鏡解析によるＲＯＲ１－ＷＴｍおよびＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍの発現細胞でのカベオラ形成への影響ついての検討
　培養ディッシュ内に細かく刻んだガラスを敷き、その上でＲＯＲ１－ＷＴｍおよびＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍの恒常的発現細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を培養し、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後７２時間で各々の細胞は、２％ホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ　ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で２時間以上固定し、その後、１％のｏｓｍｉｕｍ　ｔｅｔｒｏｘｉｄｅと０．１％ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅで処理を行った。超薄切片はＪＥＯＬ　ＪＥＭ１０１１電子顕微鏡を用いて観察した。また、細胞膜におけるカベオラ分布密度計測については、電子顕微鏡下でランダムに選択した領域（ＷＴｍ；ｎ＝２１、ＴＫΔ１ｍ；ｎ＝２１、ただし、ｎとは細胞膜の１００マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域）を測定し、それぞれの電子顕微鏡写真の細胞膜の領域は、ＩｍａｇｅＪを用いて測定した。
（８）ＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ法
　肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５を用いて、オクチルグルコシド含有のｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、６０ｍＭ　Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）で懸濁し、その細胞抽出液に対して、昆虫細胞Ｓｆ９で精製したリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ－ＲＯＲ１、ＧＳＴ－Ｃａｖｉｎ－３を各々添加しインキュベーションさせた後、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスヘア・ジャパン社製）を加えてプルダウンさせ、沈降物に対してＳＤＳサンプルバッファーで処理し、ウェスタンブロッティング分析を行った。また、アルファスクリーン（ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）のための、ＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙでは、昆虫細胞Ｓｆ９で精製したリコンビナント精製タンパク質であるＧＳＴ、ＧＳＴ－ＲＯＲ１、ＧＳＴ－Ｃａｖｉｎ－３をそれぞれの組み合わせで混合し、同様にインキュベーションさせた後、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスヘア・ジャパン社製）を加えてプルダウンさせ、沈降物に対してＳＤＳサンプルバッファーで処理し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
（９）ショ糖濃度勾配遠心法
　ＲＯＲ１－ＷＴｍ及びＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍの発現細胞株を１０ｃｍ　ｄｉｓｈに１×１０６個播種し、次の日にｓｉＲＯＲ１処理を行い、２４時間後にＴＮ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭ　ＮａＨＳＯ３、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加えたｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒにそれぞれ懸濁させた。この可溶化液を氷上で３０分静置させた後、１ｍｌのＴＮ　Ｂｕｆｆｅｒで溶解した８０％スクロースと混和させ、遠心用チューブ（Ｕｌｔｒａ　Ｃｌｅａｒ，　Ｂｅｃｋｍａｎ社製）に移した。その上に、５．５ｍｌの３０％スクロースと３．５ｍｌの５％スクロース溶液を重層し、ＳＷ４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて、２００，０００ｇで４℃、２２時間、超遠心を行った。その後、それぞれの試料を１１サンプルごとに分画し、アセトン沈殿の後、ＳＤＳサンプルバッファーで処理し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
（１０）ＲＯＲ１－ＷＴｍおよびＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍの発現細胞でのリガンド刺激による生存シグナルへの影響の検討
　ＲＯＲ１－ＷＴｍおよびＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍの発現細胞でのリガンド刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）への影響を検討するために、ＲＯＲ１－ＷＴ、ＲＯＲ１－ＷＴｍおよびＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍの発現細胞は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクション後２４時間で培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ：ウシ胎児血清）を含まない培養液に置換し、さらに２４時間培養し、その後、２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－Ｉ、ＥＧＦで３０分処理したのち、細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
［実施例１］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合に関する検証＞
　上記（３）に記載の方法で、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５、及びＳＫ－ＬＵ－１細胞株を用いた免疫沈降法による検討を行った。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ－３が結合することが分かった。ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の相互作用についてはこれまで報告はなく、新しい知見といえる。また今回の検証において、特許文献３及び非特許文献６において検証された、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－１の結合に関しても確認できた。さらに本検証によって、カベオラの生理的機能に深く関わるとされるＣａｖｉｎ　ｆａｍｉｌｙ（Ｃａｖｉｎ－１、Ｃａｖｉｎ－２、Ｃａｖｉｎ－３）のうち、ＲＯＲ１はＣａｖｉｎ－１およびＣａｖｉｎ－３とは結合するが、Ｃａｖｉｎ－２とは結合しないという、相互作用の特異性があることが判明した。
　次に、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合について詳細に検討を行うために、上記（８）に記載の方法で、各々の精製タンパク質を用いたＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙによる検討を行った。図４Ｃ及び図４Ｄに示すように、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３は、タンパク質同士の相互作用が認められることが明らかとなった。以上のことから、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－１の結合に関しては、特許文献３及び非特許文献６においてカベオラの形成に関わることが示されたが、今回の検証から、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合が肺腺癌細胞において何らかの生理機能を担っている可能性を示唆する結果が得られた。
［実施例２］
＜肺腺癌細胞でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の細胞内局在に関する検討＞
　［実施例１］の検討から、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３が結合することが判明したため、上記（６）に記載の方法で、細胞内での両者の局在について免疫細胞染色法を用いて検討を行った。図５Ａ乃至Ｄは、共焦点レーザー顕微鏡において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３が共局在することを免疫細胞染色法によって分析した結果を示す写真である。図５Ａは内因性のＲＯＲ１の細胞内局在を示しており、図５Ｂは内因性のＣａｖｉｎ－３の細胞内局在を示している。また、図５ＣはＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３をマージした写真で、図５Ｄは図５Ｃの長方形で囲った部分を拡大した写真である。図５Ｃ及び図５Ｄに示すように、内因性のＲＯＲ１と内因性のＣａｖｉｎ－３は、細胞内および細胞膜で一部共局在していることが明らかとなった。さらに、Ｃａｖｉｎ－３はカベオラの生理機能に関わっていることから、細胞膜においてＣＡＶ１とともに濃縮して局在していることも分かっているが、そのカベオラが濃縮している部分（拡大領域）においてもＲＯＲ１と非常に顕著に共局在していることが判明した。
［実施例３］
＜Ｃａｖｉｎ－３によるＲＯＲ１の結合領域の同定に関する検討＞
　［実施例１］および［実施例２］の検討から、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３は結合し、細胞内で共局在していることが分かった。そこで、次にＣａｖｉｎ－３によるＲＯＲ１の結合領域の同定を、上記（２）に記載の方法で、様々なＲＯＲ１の機能ドメイン領域を欠損させた欠損変異体を作製し、上記（３）に記載の方法で、免疫沈降法によってＣａｖｉｎ－３の結合領域の特定を行った。図６Ａは、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン、２箇所のセリン・スレオニンリッチドメイン、プロリンリッチドメインのそれぞれの欠損変異体の模式図を示している。また、図６Ｂは、図面代用写真で、Ｃａｖｉｎ－３がＲＯＲ１のキナーゼドメイン内で結合していることを免疫沈降法およびウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図６Ａ及び図６Ｂに示すとおり、Ｃａｖｉｎ－３はＲＯＲ１のキナーゼドメイン内のＮ末側の３分の１の領域（４７３アミノ酸から５６４アミノ酸）と結合することが判明した。特許文献３及び非特許文献６に記載のとおり、ＲＯＲ１はカベオラ関連分子であるＣａｖｉｎ－１やＣＡＶ１と結合することが分かっているが、それらが結合する領域は、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン内のＣ末側の３分の２の領域やＲＯＲ１のＣ末側に存在するセリン・スレオニンリッチ領域であり、Ｃａｖｉｎ－３が結合する部位とは全く別の領域であることも今回の検証から明らかとなった。さらに、Ｃａｖｉｎ－３によるＲＯＲ１の結合領域が特定できたことから、この結合領域をターゲットとした、タンパク質－タンパク質間の相互作用を標的とした低分子化合物等のハイスループットスクリーニングができる可能性が示唆される。なお、上記特許文献３では、Ｃａｖｉｎ－１の結合領域部分を含む形質転換体、組み換えベクター、化合物のスクリーニングキットの具体的な実施例を開示している。Ｃａｖｉｎ－３とＲＯＲ１の結合を特異的に抑制する化合物のスクリーニングキットも、特許文献３と同様に作製すればよい。
［実施例４］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合がＣａｖｉｎ－３の細胞内での適切な局在化及びカベオラ形成に与える影響の検討＞
　肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合が与える影響について詳細に検討を行うために、肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５を用いて、内因性のＲＯＲ１の発現を抑制させ、新たにＣａｖｉｎ－３の結合領域を欠損させたＲＯＲ１を発現させるという、細胞内での再構築系の実験系を構築した。具体的には、上記（５）に記載の方法で、ＲＯＲ１－ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持った野生型のＲＯＲ１）、ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍ（ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＣａｖｉｎ－３の結合領域を欠損したＲＯＲ１）を恒常的に発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５を樹立した。これらの樹立した細胞株はｓｉＲＯＲ１処理を行うことで、もともとＮＣＩ－Ｈ１９７５に存在する内因性のＲＯＲ１を消失させ、新たに野生型のＲＯＲ１、あるいはＣａｖｉｎ－３の結合領域を欠損したＲＯＲ１を発現させることができる。そのため、両者を比較することで、肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合が与える重要な生理的機能を明らかにすることが可能となる。そこで、まずこれらの樹立した細胞株を用いて、Ｃａｖｉｎ－３のカベオラへの局在変化について、上記（９）に記載のショ糖濃度勾配遠心法、及び、上記（６）に記載の免疫細胞染色法を用いて検討を行った。
　図７Ａは、ショ糖濃度勾配遠心法によるＣａｖｉｎ－３の局在変化をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１－ＷＴｍを発現した細胞株と比較して、カベオラを含む不溶性画分（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ：ＤＲＭ、６および７画分）でのＣａｖｉｎ－３の消失が認められた。また、カベオラ構成分子であるＣＡＶ１の発現には影響が認められなかった。
　図７Ｂは、免疫細胞染色法による分析した結果を示す写真である。ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１－ＷＴｍを発現した細胞株と比べて、Ｃａｖｉｎ－３の細胞内の局在に大きな変化が認められた。具体的には、ＲＯＲ１－ＷＴｍを発現した細胞株では、ドット状に細胞質および細胞膜に局在しているのに対して、ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、細胞質の中央に集積している様相を呈し、明らかに異なる局在を示していた。しかしながら、カベオラ関連分子であるＣＡＶ１やＣａｖｉｎ－１の細胞内局在には変化が見られなかった。以上のことから、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合は、Ｃａｖｉｎ－３のＣＡＶ１を含むカベオラへの適切な局在化、配置化に必要であることが判明した。
　次に、上記（７）に記載の方法により、電子顕微鏡を用いて実際に、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合がカベオラ形成に影響を与えるかどうかについて検討を行った。図７Ｃは、超薄切片法により電子顕微鏡によって撮像した写真である。細胞膜の１００マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域にどれだけのカベオラが形成されているか解析を行ったところ、ＲＯＲ１－ＷＴｍを発現した細胞株とＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株、どちらにおいてもカベオラの形成は認められた。図７Ｄは、解析した結果を示すグラフである（平均値±標準偏差（ＷＴｍ；ｎ＝２１、ＴＫΔ１ｍ；ｎ＝２１、ただし、ｎとは細胞膜の１００マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域である。））。図７Ｃ及びＤに示すとおり、カベオラ形成数についても有意な差は認められなかった。以上の結果から、ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、肺腺癌細胞におけるＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合はカベオラ形成には影響を及ぼさないことが判明した。
［実施例５］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合が与えるリガンド刺激による生存シグナルへの影響の検討＞
　実施例１～４の検討から、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３は結合・共局在し、Ｃａｖｉｎ－３の適切な局在化に重要であるが、カベオラ形成には関与しないことを見出した。特許文献３及び非特許文献６においては、ＲＯＲ１がＣＡＶ１やＣａｖｉｎ－１と相互作用し、カベオラ形成に寄与することで、カベオラに集積する様々な受容体の活性化に重要であることを明らかにしてきた。しかしながら、これらの受容体の活性化に伴って、どのように生存シグナルが伝達されているのかについての詳細な分子機序については全く理解されていない。そこで、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合が肺腺癌細胞の生存に関与するのかどうかについて、上記（１０）に記載の方法により、検討を行った。同様にＲＯＲ１－ＷＴやＲＯＲ１－ＷＴｍあるいは、ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株を用いて、ＩＧＦ－ＩやＥＧＦなどのリガンド刺激を行った際のＡＫＴのリン酸化（活性化）を解析した。
　図８Ａは、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持たないＲＯＲ１の野生型（ＷＴ）、ｓｉＲＯＲ１に抵抗性を持ったＲＯＲ１の野生型（ＷＴｍ）、及び、Ｃａｖｉｎ－３の結合部位を欠損させたＲＯＲ１（ＴＫΔ１ｍ）をＮＣＩ－Ｈ１９７５肺腺癌細胞株に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行うことで細胞内のＲＯＲ１をＷＴｍ又はＴＫΔ１ｍに置換させ、そして、ＩＧＦ－Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図８Ａから明らかなように、ＩＧＦ－Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化は、ＲＯＲ１－ＷＴを発現した細胞株では低下し、ＲＯＲ１－ＷＴｍを発現した細胞株ではＡＫＴのリン酸化の低下が回復することを確認した。しかしながら、ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１－ＷＴを発現した細胞株と同様に、顕著にＡＫＴのリン酸化の低下が認められた。またコントロールとしてのｓｉＣｏｎｔｒｏｌ処理では、すべての発現細胞株においてＩＧＦ－Ｉ刺激によるＡＫＴのリン酸化の上昇が認められた。
　図８Ｂは、ＩＧＦ－Ｉ刺激に換え、ＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化（活性化）をウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図８Ｂから明らかなように、ＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化についても、ＲＯＲ１－ＷＴを発現した細胞株では低下し、ＲＯＲ１－ＷＴｍを発現した細胞株ではＡＫＴのリン酸化の低下が回復することを確認した。しかしながら、ＲＯＲ１－ＴＫΔ１ｍを発現した細胞株では、ＲＯＲ１－ＷＴを発現した細胞株と同様に、顕著にＡＫＴのリン酸化の低下が認められた。またコントロールとしてのｓｉＣｏｎｔｒｏｌ処理では、すべての発現細胞株においてＥＧＦ刺激によるＡＫＴのリン酸化の上昇が認められた。
　以上の結果から、肺腺癌細胞株におけるＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合は、リガンド刺激によるＡＫＴによる生存シグナルを制御する非常に重要な相互作用であることが判明した。
［実施例６］
＜肺腺癌細胞株におけるＣａｖｉｎ－３発現抑制による細胞増殖への影響の検討＞
　［実施例５］において、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合は、ＩＧＦ－ＩやＥＧＦなどのリガンド刺激によるＡＫＴによる生存シグナルを制御する必要不可欠な結合であることが分かった。Ｃａｖｉｎ－３は別名ＰＲＫＣＤＢＰとも言われ、ＰＫＣδ結合タンパク質として同定された細胞内タンパク質である。近年になりカベオラの生理機能に関与する分子であることが分かってきた。そこで、実際に肺腺癌細胞株においてＣａｖｉｎ－３が生存に関わっているかどうかを、上記（４）に記載の方法により検討した。
　図９Ａの上段は、肺腺癌細胞株であるＰＣ－９を用いた際のウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真、図９Ａの下段は、ＭＴＴ　ａｓｓａｙによる細胞増殖への影響を示したグラフである。図９Ａから明らかなように、ＲＮＡ干渉法によって細胞内のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の発現を抑制させたところ、ＲＯＲ１の発現を抑制させた時と同様に有意な細胞増殖の低下が認められた。図９Ｂは、ＰＣ－９に換え、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５を用いた時の結果を示している。ＮＣＩ－Ｈ１９７５において、ＲＮＡ干渉法によって細胞内のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の発現を抑制させたところ、ＲＯＲ１の発現を抑制させた時と同様に有意な細胞増殖の低下が認められた。なお、肺腺癌細胞株であるＰＣ－９及びＮＣＩ－Ｈ１９７５におけるＲＯＲ１抑制による細胞増殖の低下については、既に特許文献３及び非特許文献６において示している。
　以上のことから、肺腺癌細胞においてＣａｖｉｎ－３はＲＯＲ１と同様に生存に関与していることが判明した。このことは、［実施例５］において証明した、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合の生存シグナルへの重要性の結果を支持するものである。
［実施例７］
＜ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合を標的とし、その結合を阻害するための阻害剤スクリーニング法＞
　［実施例１］乃至［実施例６］の検討から、肺腺癌細胞においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合は、ＡＫＴによる生存シグナルを制御する非常に重要な相互作用であることから、この両者のタンパク質同士の結合を阻害することが出来れば、ＲＯＲ１陽性およびＣａｖｉｎ－３陽性の肺腺癌細胞の細胞増殖を特異的に抑えることができ、死滅させることが可能となる。そこで、分子間相互作用をマイクロプレートフォーマットで検出するビーズベースの高感度かつ低バックグラウンドを示すＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を利用して、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合を標的としたスクリーニング系を構築した。スクリーニング系の概略は図２に示すとおりで、具体的には、グルタチオンコートされたドナービーズには、ＧＳＴ－ＲＯＲ１タンパク質を結合させ、ニッケルキレートのアクセプタービーズにはＨｉｓ－Ｃａｖｉｎ－３タンパク質を結合させた。これらタンパク質を吸着させた各々のビーズは１つのウェルで混合し、それぞれの中に様々な低分子化合物を添加させることで、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の結合を阻害する阻害剤を見つけ出すことが可能となる。このスクリーニング系を用いることで、低コストかつ簡便に一度に多くの低分子化合物を反応させることができるため、網羅的なハイスループットスクリーニングが実現できる。実際にアルファスクリーンで使用するＧＳＴ－ＲＯＲ１とＨｉｓ－Ｃａｖｉｎ－３の結合について、上記（８）に記載したＧＳＴ－ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ法を用いて、両者の結合を調べた。図１０は、ウェスタンブロッティング法によって分析した結果を示す写真である。図１０に示すように、Ｈｉｓ－Ｃａｖｉｎ－３はＧＳＴとは結合せず、ＧＳＴ－ＲＯＲ１と結合することを確認した。
　癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法により、癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制できる化合物を探索できる可能性が有る。したがって、副作用等の少ない画期的な医薬品開発が可能である。したがって、分子標的薬に効果がある患者のみに医薬品を処方できるので、医療機関における副作用の少ない癌治療に有用である。

Claims (9)

  1. 　癌細胞の生存シグナルを特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
    　前記スクリーニング方法が、
    　ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
    　ＲＯＲ１タンパク質及びＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物を選択する工程、
    を含む、スクリーニング方法。
  2. 　前記癌細胞の生存シグナルが、ＡＫＴによる生存シグナルである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. 　ＲＯＲ１タンパク質、
    　Ｃａｖｉｎ－３タンパク質、及び
    　前記ＲＯＲ１タンパク質、並びに、前記Ｃａｖｉｎ－３タンパク質の少なくとも一方と結合する担体、
    を少なくとも含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
  4. 　前記担体が、金属膜、金属ナノ粒子、及びビーズから選択される少なくとも１つである、請求項３に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
  5. 　前記担体が、
    　　光照射によって励起され、周囲の酸素分子を一重項状態に変換する光感受性物質を含むドナービーズ、及び、
    　　前記一重項酸素と反応し発光する化学発光伝達物質を含むアクセプタービーズ、
    であり、
    　前記ＲＯＲ１タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの一方に結合し、
    　前記Ｃａｖｉｎ－３タンパク質が、前記ドナービーズ又は前記アクセプタービーズの他方に結合している、
    請求項３に記載のＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
  6. 　ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８～９３７番の内、少なくとも４７３～５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
    　ヒトＣａｖｉｎ－３のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
    を導入した形質転換体。
  7. 　請求項６に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１タンパク質とＣａｖｉｎ－３タンパク質の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
  8. 　ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８～９３７番の内、少なくとも４７３～５６４番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター。
  9. 　被検体から癌細胞を取得する工程、
    　前記癌細胞中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ－３の発現を測定する工程、
    を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
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