KR101741826B1 - 암 치료를 위한 ａｎｏ１ 단백질의 세포막 이동을 억제하는 물질 및 그를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

암 치료를 위한 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제하는 물질 및 그를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 ＡＮＯ１ 단백질의 세포막 이동을 억제하는 물질 및 그를 스크리닝하는 방법{Agents for inhibiting movement of ANO1 to plasma membrane for cancer therapy and method for screening the same}

암 치료를 위한 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제하는 물질 및 그를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

ANO1 단백질은 2007년 칼슘에 의한 활성화되는 클로라이드 이온채널로서 그 역할이 규명되며 활발하게 전기생리학적인 기능 연구가 진행되어 왔다. 최근에는 암세포에서 그 발현이 현저히 증가된 예가 보고되고 있고, ANO1 유전자 자체의 발현을 억제하였을 경우 암세포의 성장이 억제되는 결과가 밝혀지면서, 새로운 항암 치료의 타겟으로 주목받고 있다.

특히 조기 진단의 어려움 때문에 생존율이 낮은 췌장암의 경우에도 ANO1 발현 증가가 보고되고 있으며, 세포주를 이용한 실험에서 ANO1의 발현 억제가 암세포의 증식을 현저하게 감소시키는 결과들이 알려지면서 ANO1 억제와 항암 효과의 상관관계에 대한 궁금증이 증폭되고 있다. 현재까지 알려진 ANO1 선택적인 억제제의 종류가 매우 제한적이고, 억제 효과를 보이는 농도 또한 세포주 실험에서 10 uM 이상의 농도를 요구된다는 단점이 있다.

따라서, ANO1의 세포막 이동경로에 관여하는 단백질들의 발현 및 활성을 조절함으로써 종양세포의 증식을 억제하는 새로운 기술의 개발이 요구된다.

일 양상은 약물 후보물질, ANO1(Anoctamin-1) 단백질의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 잔기(이하 'segment a'라 함)까지를 포함하는 단백질 및 βCaMKII를 접촉시키는 단계로서, 상기 segment a는 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하고, N-말단으로부터 9번째 잔기인 트레오닌(이하 'T9'라 함)은 인산화되지 않은 것인 단계; segment a의 T9의 인산화의 수준을 측정하는 단계; 측정된 T9의 인산화의 수준을 대조군의 인산화 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 T9의 인산화의 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계;를 포함하는, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물을 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 약물 후보물질, segment a를 포함하는 단백질 및 14-3-3ν 단백질을 접촉시키는 단계로서, 상기 segment a는 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하고, T9는 인산화되어 있는 것인 단계; 접촉물로부터 segment a 및 14-3-3ν 단백질의 복합체의 결합 수준을 측정하는 단계; 측정된 복합체의 결합 수준 또는 T9의 인산화의 수준을 대조군의 인산화 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 상기 복합체의 결합 수준 또는 T9의 인산화 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계;를 포함하는, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물을 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제시키는 물질을 활성 성분으로 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 약물 후보물질, ANO1(Anoctamin-1) 단백질의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 잔기(이하 'segment a'라 함)까지를 포함하는 단백질 및 βCaMKII를 접촉시키는 단계로서, 상기 segment a는 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하고, N-말단으로부터 9번째 잔기인 트레오닌(이하 'T9'라 함)은 인산화되지 않은 것인 단계; segment a의 T9의 인산화의 수준을 측정하는 단계; 측정된 T9의 인산화의 수준을 대조군의 인산화 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 T9의 인산화의 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계;를 포함하는, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물을 선발하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 약물 후보물질, segment a를 포함하는 단백질 및 14-3-3ν 단백질을 접촉시키는 단계로서, 상기 segment a는 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하고, T9는 인산화되어 있는 것인 단계; 접촉물로부터 segment a 및 14-3-3ν 단백질의 복합체의 결합 수준을 측정하는 단계; 측정된 복합체의 결합 수준 또는 T9의 인산화의 수준을 대조군의 인산화 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 상기 복합체의 결합 수준 또는 T9의 인산화 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계;를 포함하는, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물을 선발하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "ANO1(Anoctamin-1)" 또는 "TMEM16A(Transmembrane member 16A)"는 호환적으로 사용되고, 칼슘-활성 클로라이드 채널(calcium-activated chloride channel:CACC)을 의미할 수 있다. ANO1은 다수의 아이소폼 또는 다수의 동물 유래의 ANO1을 포함할 수 있으며, 예를 들면, ANO1(abc), ANO1(ac), 또는 ANO1(a)를 포함할 수 있고, 인간, 마우스, 랫드, 소 등의 유래의 ANO1을 포함할 수 있다. 상기 ANO1 단백질은 예를 들면 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 또한, 상기 ANO1 단백질은 예를 들면 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 상기 ANO1의 세포막으로의 이동을 결정하는 부위를 포함할 수 있다. 상기 부위는 ANO1 단백질의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 잔기까지를 포함하는 부위일 수 있으며, 그를 "segment a"라 한다. 따라서, 상기 segment a를 포함하는 단백질은 ANO1 단백질일 수 있다.

상기 14-3-3γ 단백질은 진핵 세포에서 발현되는 조절 분자, 즉 신호전달 단백질을 의미할 수 있으며, 상기 ANO1 단백질, 예를 들면, segment a와 상호작용, 즉, segment a 내의 인산화된 T9와 결합할 수 있다. 상기 14-3-3γ 단백질은 예를 들면 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 또한, 상기 14-3-3γ 단백질은 예를 들면 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 βCaMKII(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II beta chain)은 세린/트레오닌 단백질 키나아제 패밀리에 속하고, Ca(2+)/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제의 서브패밀리에 속하는 단백질을 의미할 수 있으며, 예를 들면, 상기 segment a 내의 T9를 인산화시키는 작용을 할 수 있다. 상기 βCaMKII 단백질은 예를 들면 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 또한, 상기 βCaMKII 단백질은 예를 들면 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물은 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동의 증가와 연관된 질병을 치료하기 위한 것일 수 있으며, 상기 질병은 예를 들면, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 또는 췌장암일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 스크리닝 방법에 있어서, 상기 약물은 항암제 일 수 있다.

상기 후보 물질, 예를 들면, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다.

상기 접촉시키는 단계는 상기 접촉시키는 단계는 βCaMKII의 키나아제 활성이 작용할 수 있는 조건에서 접촉시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질들을 발현하는 벡터를 세포에 형질전환 하는 단계; 상기 형질전환된 세포에 약물 후보물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 상기 segment a, 그를 포함하는 ANO1 단백질, 14-3-3ν, βCaMKII, 또는 그들의 조합을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 바이러스 발현 벡터, 포유류 발현 벡터, 또는 박테리아 발현 벡터를 이용할 수 있다.

상기 T9의 인산화를 수준을 측정하는 단계 또는 segment a 및 14-3-3ν 단백질의 복합체의 결합 수준을 측정하는 단계는 상기 T9의 탈인산화 여부를 측정하는 단계; 상기 14-3-3ν의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; βCaMKII의 활성을 측정하는 단계; 또는 segment a(ANO1) 및 14-3-3ν의 상호 작용 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법에 있어서, 활성 또는 발현 수준을 측정하는 단계는 14-3-3ν 또는 βCaMKII 유전자의 전사 활성 수준을 측정하거나 발현된 단백질량을 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 면역침강(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또한 상기 segment a(ANO1) 및 14-3-3ν의 상호 작용 수준을 측정하는 단계는 면역침강 방법, 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system), 또는 표면 플라즈몬 공명형상을 이용한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 면역침강은 예를 들면, 문헌에 있는 방법에 의해 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988). SDS-PAGE는 면역침강된 단백질들의 분석에 일반적으로 사용되고, 결합된 단백질은 적합한 농도의 겔(gel)을 이용하여 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다. 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)은 공지된 방법에 의해 수행("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참고문헌 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992; Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994)될 수 있으며, 표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 이용한 바이오센서(biosensor)는 본 명세서에서 결합된 상기 물질들을 탐지 또는 정량하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 상기 바이오센서가 사용될 때, 상기 결합에 의한 상호작용은 표면 플라즈몬 공명 시그날(signal)로서 실시간 관찰될 수 있다.

일 구체예에 있어서, ANO1 단백질의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 잔기에 해당하는 부위(segment a)가 ANO1의 세포막 이동에 작용하고, 이 부위에서의 인산화 과정이 세포막으로의 이동을 결정지을 수 있으며, 그 부위는 N-말단으로부터 9번째 트레오닌에 해당할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 인산화된 9번째 트레오닌에 14-3-3γ 단백질이 결합하여 ANO1의 세포막으로의 이동을 촉진될 수 있으며, 따라서, 14-3-3γ의 발현 또는 활성을 억제함으로써 ANO1의 세포막 이동을 억제하여 종양세포의 증식작용을 억제할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 인산화된 9번째 트레오닌 부위를 인산화시키는 키나아제는 βCaMKII일 수 있으며, βCaMKII의 발현 또는 활성을 억제함으로써 ANO1의 세포막 이동을 억제하여 종양세포의 증식작용을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 일 구체예에 따른 선발 방법에 있어서, 상기 T9의 탈인산화 여부의 측정, 상기 14-3-3ν의 발현 또는 활성 수준의 측정, βCaMKII의 발현 또는 수준의 측정 또는 segment a(ANO1) 및 14-3-3ν의 상호 작용 수준의 측정을 통해, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물을 선발할 수 있다. 예를 들면, 무처리 대조군에 비해 T9의 탈인산화를 촉진하거나, 상기 14-3-3ν의 발현 또는 활성 수준을 감소시키거나, βCaMKII의 발현 또는 수준을 감소시키거나, 또는 segment a(ANO1) 및 14-3-3ν의 상호 작용을 억제하는 후보 물질을 선발함으로써 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물(예를 들면, 항암제)로 선발할 수 있다.

다른 양상은 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제시키는 물질을 활성 성분으로 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제시키는 물질을 활성 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 억제시키는 약물은 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동의 증가와 연관된 질병을 치료하기 위한 것일 수 있으며, 상기 질병은 예를 들면, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 또는 췌장암일 수 있다.

상기 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제시키는 물질은 βCaMKII 또는 14-3-3ν의 발현 또는 활성을 억제시키는 물질, 또는 ANO1 단백질 및 14-3-3ν 단백질의 상호작용을 억제하는 물질일 수 있다.

상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν의 발현 또는 활성을 억제시키는 물질은 βCaMKII 또는 14-3-3ν 유전자의 전사를 억제하는 물질, 전사된 βCaMKII 또는 14-3-3ν mRNA의 번역을 억제하는 물질, 또는 βCaMKII 또는 14-3-3ν 단백질의 기능을 억제하는 물질을 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 상호작용을 억제하는 물질은 ANO1 단백질의 인산화된 T9에 결합하는 항체 또는 그의 결합활성을 갖는 단편, 또는 ANO1 단백질의 segment a 중 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하는 연속 아미노산 서열을 포함하는 단편으로서 T9은 인산화되어 있지 않은 것일 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν의 활성을 억제시키는 물질은 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν 단백질에 결합하는 항체, 또는 그의 결합 활성을 갖는 단편인 것일 수 있다. 또한 상기 물질은 βCaMKII 또는 14-3-3ν 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 화합물, 펩티드, 또는 펩티드 미메틱스를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν의 발현을 억제시키는 물질은 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 14-3-3ν 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 작은 간섭 RNA는 서열번호 15를 타겟 영역으로 하는 것일 수 있다.

상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν의 발현을 억제시키는 물질은 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서(enhancer), 프로모터에 결합되는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로는 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것일 수 있다. RNA 간섭(RNAi)은 βCaMKII 또는 14-3-3ν 유전자에 대응하는 두 가닥 사슬 RNA(dsRNA)를 세포 또는 유기체에 도입함으로써 대응하는 mRNA의 분해가 일어나는 전사 후 유전자 사일런싱 메카니즘(post-transcriptional gene silencing mechanism)일 수 있다. 상기 RNAi 효과에 의해 유전자 발현이 복귀되기 전에 다중 세포 분열이 지속되므로 RNAi는 RNA 레벨에서 목표로 하는 녹아웃(knockout) 또는 '녹다운(knockdown)'을 만드는 방법이다. 또한, βCaMKII 또는 14-3-3ν를 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 핵산 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 βCaMKII 또는 14-3-3ν를 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 βCaMKII 또는 14-3-3ν 코딩 가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 βCaMKII 또는 14-3-3ν mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, βCaMKII 또는 14-3-3ν mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 단지 일부(예: 번역 개시부)에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 약 5 내지 50 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 공지의 방법을 이용한 화합 합성 및 효소 결합 반응을 이용하여 구성할 수 있다.

상기 항체는 항 βCaMKII 또는 14-3-3ν의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 사용 가능할 수 있다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다. 다클론 항체는 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함될 수 있다(Kohler G etal., Nature256:495-497, 1975; Kozbor D etal., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). 또한, 상기 βCaMKII 또는 14-3-3ν에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD etal., Science254: 1275-1281, 1989).

일 구체예에 따른 약학적 조성물은, 상기 기재한 활성성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피내 또는 경구를 통해 투여될 수 있다. 달리, 상기 약제는 경구 투여 또는 표적 기관에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 건강상태 및 체중, 병행치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질 등에 비추어 결정될 수 있다. 또한, 치료되는 질환, 부위-특이적 치료의 필요성, 투여되는 약물의 양과 같은 조건들을 고려하여 전신적 또는 국소적으로 투여할 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물을 제공하거나 치료하는 방법을 수행함에 있어서, 상기 약제는 단독으로 또는 조합하여, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합하여 사용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 약제는 일반적으로 허용되는 의학적 관행에 따라 의도된 질환에 대해 전형적으로 처방되는 다른 약제와 동시 투여될 수 있다. 또한, 상기 약제는 일반적으로 포유동물, 예를 들면, 인간의 생체내(in vivo)에서 이용될 수 있다.

일 양상에 따른 약학적 조성물에 의하면, ANO1의 단백질의 세포막으로의 이동을 억제 또는 감소시켜 암을 치료할 수 있는 효과가 있다.

다른 양상에 따른 선발하는 방법에 의하면, ANO1의 단백질의 세포막으로의 이동을 억제 또는 감소시키는 약물을 선발할 수 있을 암 치료제를 선발하는데 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 ANO1 단백질의 세포막 이동에 Segment a가 역할을 함을 나타내는 도면이다.
도 2는 14-3-3γ이 ANO1의 세포막 이동에 관여하는 segment a와 직접적 및 선택적으로 결합함을 나타내는 도면이다.
도 3은 segment a를 포함하는 ANO1 단백질과 14-3-3γ 단백질 간의 결합이 ANO1의 세포막 이동에 중요하여 두 단백질 사이의 결합을 R18 펩타이드를 이용하여 저해하였을 때 세포막에 존재하는 ANO1 단백질의 양과 활성이 현저하게 감소함을 나타내는 도면이다.
도 4는 segment a 내의 Thr9가 14-3-3γ의 결합 부위임을 나타내는 도면이다.
도 5는 14-3-3γ 매개 ANO1의 표면 발현을 조절하는 키나아제 스크리닝한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 CaMKII 억제제인 KN-93을 처리하고 ANO1의 활성을 측정한 결과 및, CaMKII의 ANO1에 대한 선택성에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 CaMKII 베타 단백질의 인산화가 ANO1의 9번째 트레오닌 잔기에 선택적으로 작용하고 있음을 나타내는 도면이다.
도 8은 ANO1 및 14-3-3γ의 발현을 shRNA로 억제하였을 때 나타나는 효과를 HEK293T 및 CFPAC-1 세포에서 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 ANO1, 및 14-3-3γ의 발현 및 활성의 억제가 암세포주에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 : ANO1 단백질의 세포막 이동 억제를 통한 종양 세포의 성장 억제

1. ANO1 의 세포막 이동에 관여하는 부위의 결정

ANO1의 세포막 이동에 관여하는 부위를 결정하기 위해, ANO1의 아이소폼 중 하나인 ANO1(abc)의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 부위 (이하 'segment a'라 함)이 제거된 ANO1(abc)-△a를 구축하였다.

우선, 인간 ANO1(abc)(서열번호 1)의 전체 서열을 암호화하는 cDNA는 RT-PCT 기반 게이트웨이 클로닝 방법을 사용하여 수득하였다(인비트로젠). ANO1(abc), ANO1(abc)-△a를 포함하는 여러 ANO1의 변이체는 전체 길이 인간 ANO1 cDNA를 주형으로 하여 위치 특이적 돌연변이 키트(Enzyunomics)를 사용하여 구축하였다. 이후, 도 1A와 같이, GFP(Green fluorescent protein)이 N-말단에 태그된 인간 ANO1(abc) 및 segment a 제거된 ANO1(abc)-△a을 구축하였다. 도 1A에서 검은색 박스는 막관통도메인, 점 박스는 segmet a, 줄무늬 박스는 segment b, 회색 박스는 segment c를 나타낸다. 다음으로, 상기 태그된 인간 ANO1 및 세포막 마커인 DsRed-MEM을 HEK293 세포에 형질전환하였다. HEK293T 세포는 DMEM 배지에서 유지하였고, 발현 벡터의 형질전환은 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 수행하였다. 이후 이미지 분석을 위해 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드로 20분 동안 상온에서 고정하였다. 세포를 세척하고, 장착하여 Nikon A1 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였고 그 결과를 도 1B에 나타내었다.

또한, 표면 비오티닐레이션을 위해, 상기 형질전환 HEK293T 세포를 설포-NHS-SS-비오틴(Pierce) 함유 PBS에 4 ℃에서 30분 동안 비오티닐레이션하였다. 이후 초과의 비오틴을 제거하기 위해 세포를 퀸칭(quenching) 버퍼(PBS 중 100 mM 글리신)으로 세척하였고, PBS로 3번 세척하였다. 다음으로 세포를 용해하였고, 고성능 NeutrAvidin-아가로스 레진(Thermo Scientific^TM)으로 인큐베이션하였다. 이후 라이시스 버퍼로 3번 세척하였고, 결합 단백질을 SDS 시료 버퍼로 용출하고 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 면역블롯팅을 위해서, 단백질 샘플을 10% 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 포리피닐린덴 플루오리드(polyvinylidene fluoride)(PVDF) 막(BioRad)으로 트랜스퍼하였다. 이후 상기 단백질을 항-GFP 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4 ℃에서 하루밤 동안 인큐베이션하였다. 관심 단백질은 홀스래디시 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 고트 항-마우스, 고트 항-랫드, 또는 항-래빗 IgG를 사용하여 검출하였고, 그 결과를 도 1C에 나타내었다.

다음으로, 상기 형질전환 세포의 전기생리학적 레코딩을 수행하였다. 그를 위해 전류-전압 (I-V) 곡선은 ANO1 또는 ANO1 변이체를 발현하는 HEK293T 세포, 및 CFPAC-1 세포로부터 기록되었다. I-V 곡선은 1000 ms 동안 + 100 내지 -100 mV의 전압을 적용함으로써 측정되었다. 클로라이드 전류를 측정하기 위해 기록 전극(4 내지 7 MΩ)을 146 mM CsCl, 5 mM Ca-EGTA-NMDG, 8 mM HEPES, 2 mM MgCl₂ 및 10 mM 수크로오스(CsOH로 pH는 7.3으로 조정)로 채웠다. 표준 배스 용액은 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 3 mM KCL, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ 및 5.5 mM 글루코오스(NaOH로 pH는 7.3으로 조정)를 함유하였다. 전체 세포막 전류는 Axopatch 200A 패치 클램프 시스템을 사용하여 증폭하였다. 데이터 획든은 pCLAMP 10.2 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 조절하였다. Digidata 1322A 인터페이스는 증폭기와 컴퓨터 사이에 디지털-아날로그 신호를 전환하기 위해 사용하였다. 데이터를 5 kHZ에서 샘플링하였고, 2 kHZ에서 필터링하였다. 세포막 커패시턴스(capacitance)는 pCLampex의 'membrane test' 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 전기생리학적 레코딩 실험은 20 내지 22 ℃의 상온에서 수행하였고, 그 결과를 도 1D 및 1E에 나타내었다.

도 1은 ANO1 단백질의 세포막 이동에 Segment a가 역할을 함을 나타내는 도면이다.

도 1B에 나타낸 바와 같이, 야생형 ANO1(abc)는 세포막에서 고도로 국소화된 반면, segment a가 제거된 ANO1(abc)-△a는 세포막에서 거의 국소화되지 않았음을 알 수 있다. 또한, 도 1C에 나타낸 바와 같이, ANO1의 표면 발현이 segment a가 없으면 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있다. 또한 도 1D에 나타낸 바와 같이, ANO1(abc)의 전류-전압(I-V)은 안팎의 전류를 나타내는 반면, ANO1(abc)-△a의 전류-전압은 유의적이지 않은 전류를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한, 도 1E에 나타낸 바와 같이, + 80 mV에서 측정된 ANO1(abc) 및 ANO1(abc)-△a의 전류 밀도는 ANO1에서 현저하게 높으며, ANO1(abc)-△a는 대조군가 차이가 없음을 확인할 수 있다.

상기의 결과로, segment a가 ANO1의 표면 발현 및 채널 활성에 중요한 역할을 하며, ANO1 단백질 세포막 이동에 관여하는 부위는 segment a임을 확인할 수 있다.

2. segment a와 14-3-3γ의 상호작용 분석

ANO1 단백질 세포막 이동에 관여하는 segment a와 상호작용하는 분자를 찾기 위해, 효모단백질교잡법(Yeast two-hybrid system: Y2H), MBP 풀 다운 어세이 및, 면역침강법을 수행하였다.

우선, 총 RNA는 Hybrid R^TM 키트(Geneall)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. 역전사는 Superscript III RT(인비트로젠)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응에 사용된 ANO1 segment a에 대한 프라이머는 서열번호 7 및 8을 사용하였고, PCR 조건은 다음과 같다; 94 ℃에서 30초 동안 변성, 57 ℃에서 30초 동안 결합, 72 ℃에서 30초 동안 연장.

또한, 인간 14-3-3γ(서열번호 3)의 전체 서열을 암호화하는 cDNA는 상기 1. 과 동일한 방법으로 RT-PCT 기반 게이트웨이 클로닝 방법을 사용하여 수득하였다(인비트로젠).

이후, 공지된 문헌("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참고문헌 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992; Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994)의 방법으로 Y2H 법을 수행하였고, 그 결과를 도 2A에 나타내었다.

또한, 말토오즈 결합 단백질(MBP) 풀 다운 어세이(pull-down assay)를 수행하기 위해, MBP-14-3-3γ 발현 벡터를 E.coli BL21균주에 형질전환하였다. MBP-14-3-3γ 단백질을 수용성 형태로 발현하였고, MBP-SpinClean(Mbiotech)을 사용하여 정제하였다. GFP-seg(a)를 HE293T 세포에 상기 1. 과 동일한 방법으로 형질전환하였고, 24시간 동안 추출하였다. 세포 용해물을 3 ㎍의 정제된 MBP-14-3-3γ와 함께, MBP 결합 아가로즈 레진(Elpis Biotech)에 4 ℃에서 1시간 동안 고정화하고, 인큐베이션 하였다. 이후 이를 라이시스 버퍼로 세 번 세척하고, 결합 단백질을 SDS 시료 버퍼로 용출하여 상기 1. 과 동일하게 웨스턴 블랏 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 2B에 나타내었다.

또한, GFP-seg(a) 및 7개의 HA-14-3-3 아이소폼의 발현 벡터를 구축하였고, 그를 HEK293T 세포에 형질전환하였다. 이후, 상기 세포에 대한 면역 침강법을 수행하였다. 또한, 14-3-3γ와 ANO1(abc)의 상호작용을 인 비보 시스템에서 검증하기 위해, 플래그-태그된 ANO1(FLAG-ANO1) 및 헴아글루티닌-태그된 14-3-3γ(HA-14-3-3γ) 발현 벡터를 구축하였고, 그를 HEK293T 세포에 형질전환하였다. 이후, 상기 세포에 대한 면역 침감법을 수행하였다. 면역침강법은 다음과 같이 수행하였다. HEK293T 세포를 프로테아제-인히비터 칵테일(protease-inhibitor cocktail)(로슈)을 함유하는 라이시스 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1mM PMSF, 및 0.1% 트리톤X-100) 중에 1 ㎍/ml 항-HA(F-7; Santa Cruz Biotechnology), 또는 항-ANO1(ab3212; Abcam) 항체와 함께 4 ℃에서 하루밤 동안 인큐베이션하였다. 면역 복합체는 단백질 A/G 비드(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 이후 라이시스 버퍼로 4회 세척하였다. 이후 상기 1. 과 동일하게 항-HA 항체(1:1000; 로슈), 항-FLAG 항체(1:1000; 시그마), 항-GFP 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였고, 그 결과를 각각 도 2C 및 2D에 나타내었다.

도 2는 14-3-3γ이 ANO1의 세포막 이동에 관여하는 segment a와 직접적 및 선택적으로 결합함을 나타내는 도면이다.

도 2A에 나타낸 바와 같이, 양성 콜로니가 트레오닌, 루신 및 히스티딘이 없는(TLH-) 배지에서 나타나고, 공 벡터에서는 나타나지 않는 것을 확인함으로써, 14-3-3γ 및 segment a의 전체 서열 cDNA가 상호작용함을 알 수 있다.

또한, 도 2B에 나타낸 바와 같이, MBP 풀 다운 어세이를 통해서 14-3-3γ 및 segment a가 상호작용을 함을 알 수 있다.

또한, 도 2C에 나타낸 바와 같이, 7개의 14-3-3 아이소폼 중에서 14-3-3γ만 특이적으로 segment a와 결합함을 알 수 있다.

또한, 도 2D에 나타낸 바와 같이, 상기 결과와 동일하게 HA-14-3-3γ이 FALG-ANO1과 강하게 상호작용을 함을 확인할 수 있었다.

3. segment a와 14-3-3γ의 상호작용 억제의 분석

상기 14-3-3γ이 segmet a와 상호작용한다는 상기의 결과에 기초하여, 14-3-3γ이 ANO1의 세포 표면 발현이 미치는 영향을 분석하였고, segment a와 14-3-3γ의 상호작용 억제하였을 때, 세포막에 존재하는 ANO1 단백질의 양과 활성에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 상기 두 단백질의 상호작용을 억제하는 R18 펩티드(14-3-3 단백질 억제제) 컨스트럭트(서열번호 9)는 위치 특이적 돌연변이 키트(Enzyunomics)를 사용하여 구축하였다. 이후, GFP-ANO1, FLAG-14-3-3γ, 및/또는 HA-R18 형질전환된 HEK293T 세포에 대해 상기 1. 과 동일한 방법으로 비오티닐레이션을 수행하였고, 그 결과를 도 3A 및 3B에 나타내었다. 또한, GFP-ANO1, GFP-ANO1+mCh-14-3-3γ, GFP-ANO1+mCh-14-3-3γ+HA-R18이 형질전환된 HEK293T 세포에 대해 상기 1. 과 동일한 방법으로 전기생리학적 레코딩을 수행하였고, 그 결과를 도 3C 및 3D에 나타내었다.

도 3은 segment a를 포함하는 ANO1 단백질과 14-3-3γ 단백질 간의 결합이 ANO1의 세포막 이동에 중요하여 두 단백질 사이의 결합을 R18 펩타이드를 이용하여 저해하였을 때 세포막에 존재하는 ANO1 단백질의 양과 활성이 현저하게 감소함을 나타내는 도면이다.

도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, HEK293T 세포에서 ANO1의 표면 발현은 14-3-3γ에 의해 현저하게 증가함을 확인할 수 있다. 또한, R18 펩티드가 형질전환된 세포에서는 ANO1의 표면 발현에 대한 14-3-3γ의 효과가 현저하게 완화되었음을 확인할 수 있다.

또한, 도 3C 및 3D에 나타낸 바와 같이, 14-3-3γ의 존재는 ANO1-매개 전류를 증가시켰음을 확인할 수 있고, 이러한 ANO1에 대한 14-3-3γ의 효과는 R18 펩티드에 의해 현저하게 억제되었음을 확인할 수 있다.

상기의 결과로 14-3-3γ는 ANO1 채널의 세포 표면 발현 및 활성을 증가시키는 역할을 함을 확인할 수 있고, 상기 14-3-3γ와 segmet a의 상호작용을 억제함으로써 ANO1의 세포막 이동을 저해할 수 있음을 알 수 있다.

4. segment a 내의 14-3-3γ 결합 부위 분석

이후에, segment a 내의 14-3-3γ 결합 부위를 분석하는 실험을 수행하였다.

도 4A에서와 같이 ANO1의 4개의 포유류의 동소체의 서열 배열을 통해 14-3-3γ에 대한 가능성 있는 결합 부위인 hANO1의 N-말단으로부터 9번째 트레오닌이 고도로 보존되어 있는 것을 확인하였다. 상기 잔기가 14-3-3γ 및 segment a의 상호작용에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해, 상기 1. 과 동일한 방법으로 ANO1의 트레오닌을 알라닌으로 치환한 seg(a)-T9A를 구축하였고, 14-3-3γ와의 상호작용을 분석하였다. 상기 seg(a)-T9A를 HEK293T 세포에 상기 1. 과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이후, 상기 2. 와 동일한 방법으로 Y2H를 수행하였고, 그 결과를 도 4B에 나타내었다. 또한, 상기 1. 과 동일한 방법으로 이미지 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 4C 및 4D에 나타내었다.

도 4는 segment a 내의 Thr9가 14-3-3γ의 결합 부위임을 나타내는 도면이다.

도 4B에 나타낸 바와 같이, ANO1의 N-말단으로부터 9번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환된 세포에서 14-3-3γ가 결합하지 않음을 확인할 수 있다. 또한, 도 4C 및 4D에 나타낸 바와 같이, ANO1의 N-말단으로부터 9번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환된 세포에서 ANO1의 표면 발현이 거의 없음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 ANO1의 segment a 내의 Thr9에서의 인산화가 14-3-3γ의 결합, ANO1의 표면 발현 및 활성에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.

5. 14-3-3γ 매개 ANO1 의 표면 발현 조절 키나아제의 분석

(5.1) ANO1 의 표면 발현을 조절하는 키나아제 CaMKII 의 동정

14-3-3γ 매개 ANO1의 표면 발현을 조절 키나아제를 스크리닝 하기 위해, 다양한 키나아제 억제제의 존재하에서 ANO1의 표면 발현을 분석하였다.

구체적으로, ANO1을 발현하는 CFPAC-1 세포에 다양한 키나아제 억제제 H89 (PKA 억제제), KT5823 (PKG 억제제), TBB(카세인 키나아제 억제제), 및 KN-93(CaMKII 억제제)를 처리하고, 상기 1. 과 동일한 방법으로 비오티닐레이션을 수행하였다. 이후, 항-ANO1 항체(Abcam)를 사용하여 면역 블랏팅을 수행하였고, 그 결과를 도 5A 및 5B에 나타내었다.

도 5는 14-3-3γ 매개 ANO1의 표면 발현을 조절하는 키나아제 스크리닝한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, CaMKII 억제제인 KN-93을 처리한 세포에서 ANO1의 표면 발현이 감소함을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 14-3-3γ 매개 ANO1의 표면 발현을 조절하는 키나아제는 CaMKII임을 알 수 있다.

(5.2) CaMKII 억제제 처리에 따른 ANO1 의 활성 분석

상기의 결과에 기초하여 췌장암 세포주에서 KN-93을 처리하여 ANO1의 활성이 감소되는지 확인하였다.

우선, CFPAC-1 세포에 실험군으로서 KN-93 및 대조군으로서 DMSO를 처리하였다. 이후, 상기 1. 과 동일한 방법으로 전기생리학적 레코딩을 수행하였고, 그 결과를 도 6A 및 도 6B에 나타내었다. 또한, CaMKII의 ANO1에 대한 선택성을 분석을 하기 위해, CaMKII 알파에 대한 서열번호 10 및 11의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 상기 2. 과 동일한 방법으로 수행하였다. 이후, pDEST- mCherry-N에 클로닝한 컨스트럭트를 구축하였고, 그를 GFP-ANO1과 함께, CFPAC-1 세포에 상기 1. 과 동일한 방법으로 형질전환시켰다. 다음으로 상기 1. 과 동일한 방법으로 전기생리학적 레코딩을 수행하였고, 그 결과를 도 6C 및 6D에 나타내었다.

도 6은 CaMKII 억제제인 KN-93을 처리하고 ANO1의 활성을 측정한 결과 및, CaMKII의 ANO1에 대한 선택성에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6A에 나타낸 바와 같이, CaMKII 억제제인 KN-93을 처리하였을 때, 전체 세포 I-V 곡선이 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있다. 또한, 도 6B에 나타낸 바와 같이, KN-93이 작용할 수 있는 또 다른 키나아제인 CaMKII 알파를 형질전환한 세포에서 ANO1의 세포막 이동에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 KN-93을 처리하였을 때, ANO1의 활성이 감소하며, CaMKII 알파가 아닌 CaMKII 베타가 14-3-3γ 매개 ANO1의 표면 발현 조절 키나아제임을 알 수 있다.

(5.3) CaMKII 베타 단백질의 인산화 작용의 선택성 분석

또한, CaMKII 베타 단백질이 ANO1 단백질의 9번째 트레오닌 잔기를 인산화시키는지 여부를 분석하였다.

구체적으로, GFP-ANO1, GFP-ANO1+mCh-βCaMKII, GFP-ANO1 T9A, 및 GFP-ANO1 T9A+mCh-βCaMKII를 CAPFC-1 세포에 상기 1. 과 동일한 방법으로 형질전환하였다. CaMKII 베타는 서열번호 12 및 13의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 상기 2. 와 동일한 방법으로 수행하여 수득하였다. 또한, 상기 1. 과 동일한 방법으로 전기생리학적 레코딩을 수행하였고, 그 결과를 도 7A 및 7B에 나타내었다. 또한, 상기 세포에 대해 상기 1. 과 동일한 방법으로 비오티닐레이션을 수행하였고, 그 결과를 도 7C 및 7D에 나타내었다.

도 7은 CaMKII 베타 단백질의 인산화가 ANO1의 9번째 트레오닌 잔기에 선택적으로 작용하고 있음을 나타내는 도면이다.

도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, CaMKII 베타는 ANO1-매개 전류를 유의적으로 증가시킴을 확인할 수 있다. 그에 반해, ANO1의 9번째 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환된 세포에서는 CaMKII 베타가 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다. 또한, 도 7C 및 7D에 나타낸 바와 같이, 상기 도 7A 및 7B의 결과와 유사하게 CaMKII 베타의 존재에 의해 ANO1의 표면 발현이 유의적으로 증가한 반면, ANO1의 9번째 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환된 세포에서는 CaMKII 베타가 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 CaMKII 베타 단백질의 인산화가 ANO1의 9번째 트레오닌 잔기에 선택적으로 작용하고 있음을 알 수 있다.

6. 14-3-3γ 또는 CaMKII 의 억제가 종양 세포의 증식에 미치는 효과 분석

(6.1) ANO1 및 14-3-3γ의 발현 억제를 위한 shRNA 의 제조 및 효과 분석

상기 14-3-3γ이 segmet a와 상호작용한다는 상기의 결과에 기초하여, ANO1 및 14-3-3γ의 발현을 억제하는 shRNA를 제조하였고, 그를 검증하였다.

구체적으로 ANO1 및 14-3-3γ의 발현을 억제하기 위한 ANO1 shRNA 및 14-3-3γ shRNA를 각각 서열번호 14 및 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드를 타겟 영역으로 하여 제조하였다. 이후, HEK293T 세포에 HA-14-3-3γ, 및 14-3-3γ shRNA를 상기 1. 과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 웨스턴 블롯팅은 항-HA 항체를 사용하여 상기 1. 과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 도 8A에 나타내었다. 또한, HEK293T 세포에 GFP-ANO1, 및 GFP-ANO1 shRNA를 상기 1. 과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 웨스턴 블롯팅은 항-GFP 항체를 사용하여 상기 1. 과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 도 8B에 나타내었다. 또한, 췌장암 세포주인 CFPAC-1 세포에 ANO1 shRNA를 형질전환하였다. CFPAC-1 세포는 IMDM 세포 배지에서 유지하였고, 상기 1. 과 동일한 방법으로 전기생리학적 레코딩을 수행하였고, 그 결과를 도 8C 및 8D에 나타내었다.

도 8은 ANO1 및 14-3-3γ의 발현을 shRNA로 억제하였을 때 나타나는 효과를 HEK293T 및 CFPAC-1 세포에서 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8A 및 8B에 나타낸 바와 같이, ANO1 및 14-3-3γ의 발현을 shRNA을 억제하였을 때, 블롯팅 분석에서 ANO1 및 14-3-3γ의 발현이 감소되었음을 검증할 수 있다. 또한, 도 8C 및 8D에 나타낸 바와 같이, ANO1 shRNA를 통해 췌장암 세포주에서도 ANO1의 발현이 감소될 수 있음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 ANO1 및 14-3-3γ에 대한 shRNA를 통해 ANO1의 세포막 이동을 저해할 수 있음을 알 수 있다.

(6.2) 14-3-3γ 또는 CaMKII 의 억제가 종양 세포의 증식에 미치는 효과 분석

상기의 결과에 기초하여 췌장암 세포주인 CFPAC-1 세포에서 14-3-3γ의 억제 또는 CaMKII의 억제가 종양 세포의 증식에 미치는 효과를 분석하였다.

구체적으로, 상기에서 제작한 ANO1 shRNA, 14-3-3γ shRNA를 CFPAC-1 세포에 형질전환하였고, 또한 KN-93을 CFPAC-1 세포에 처리하였다. 이후, 세포의 증식율을 MTT 어세이를 사용하여 측정하였다. MTT 어세이는 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸림이 살아있는 세포 내에 존재하는 탈수소효소에 의하여 청자색을 띠는 비수용성의 MTT 포마잔(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원되는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 방법이다. MTT 포마잔의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 상기 MTT 어세이의 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9는 ANO1, 및 14-3-3γ의 발현 및 활성의 억제가 암세포주에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 동일한 숫자의 세포에서 배양이 시작된 CFPAC-1 세포는 4일 동안 계속해서 증식을 거듭하게 되지만, shRNA와 KN-93 약물이 함께 처리된 실험군에서는 처리되지 않은 군에 비하여 현저하게 세포의 증식이 억제된 것을 확인할 수 있고, 따라서, ANO1, 14-3-3γ, CaMKII 베타의 발현 또는 활성을 억제함으로써, 암세포주의 증식이 억제됨을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 14-3-3γ, CaMKII 베타의 발현 또는 활성 억제, 또는 segment a 내의 9번째 잔기의 인산화 억제, 또는 탈인산화를 통해 암 세포의 증식을 유의적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 결과로, ANO1 단백질의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 잔기에 해당하는 부위(segment a)가 ANO1의 세포막 이동에 중요하게 작용함을 할 수 있고, 이 부위에서의 인산화 과정이 세포막으로의 이동을 결정지을 수 있으며, 그 부위는 N-말단으로부터 9번째 트레오닌에 해당함을 알 수 있다.

또한, 상기 인산화된 9번째 트레오닌에 14-3-3γ 단백질이 결합하여 ANO1의 세포막으로의 이동을 촉진되고, 14-3-3 단백질의 여러 아이소폼 중 14-3-3γ에 대한 선택성이 높으며, 이를 이용하여 14-3-3γ 선택적인 shRNA를 이용하였을 때 ANO1 단백질의 세포막 이동이 현저하게 저해되었고, 종양세포의 증식도 억제되었음을 알 수 있다. 또한 14-3-3의 결합부위를 모방한 R18 펩타이드를 이용하여 경쟁적으로 결합을 방해하였을 경우에도 ANO1 단백질의 세포막이동이 저해되었으므로, 14-3-3γ의 발현 또는 활성을 억제함으로써 종양세포의 증식작용을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 상기 인산화된 9번째 트레오닌 부위를 인산화시키는 키나아제는 CamKII 베타 단백질이며, 그와 유사성이 높은 CamKII 알파 단백질에서는 동일한 효과가 나타나지 않는다는 것을 알 수 있다. ANO1의 세포막 이동은 CaMKII 베타의 활성을 억제하는 약물인 KN-93에 의해서도 억제되었으며, 종양세포의 증식작용도 억제하였으므로, CaMKII 베타의 발현 또는 활성을 억제함으로써 종양세포의 증식작용을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Agents for inhibiting movement of ANO1 to plasma membrane for cancer therapy and method for screening the same <130> PN110420 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 982 <212> PRT <213> Homo sapeins <400> 1 Met Arg Val Asn Glu Lys Tyr Ser Thr Leu Pro Ala Glu Asp Arg Ser 1 5 10 15 Val His Ile Ile Asn Ile Cys Ala Ile Glu Asp Ile Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Ser Glu Gly Thr Leu Leu Asn Ser Leu Ser Val Asp Pro Asp Ala Glu 35 40 45 Cys Lys Tyr Gly Leu Tyr Phe Arg Asp Gly Arg Arg Lys Val Asp Tyr 50 55 60 Ile Leu Val Tyr His His Lys Arg Pro Ser Gly Asn Arg Thr Leu Val 65 70 75 80 Arg Arg Val Gln His Ser Asp Thr Pro Ser Gly Ala Arg Ser Val Lys 85 90 95 Gln Asp His Pro Leu Pro Gly Lys Gly Ala Ser Leu Asp Ala Gly Ser 100 105 110 Gly Glu Pro Pro Met Asp Tyr His Glu Asp Asp Lys Arg Phe Arg Arg 115 120 125 Glu Glu Tyr Glu Gly Asn Leu Leu Glu Ala Gly Leu Glu Leu Glu Arg 130 135 140 Asp Glu Asp Thr Lys Ile His Gly Val Gly Phe Val Lys Ile His Ala 145 150 155 160 Pro Trp Asn Val Leu Cys Arg Glu Ala Glu Phe Leu Lys Leu Lys Met 165 170 175 Pro Thr Lys Lys Met Tyr His Ile Asn Glu Thr Arg Gly Leu Leu Lys 180 185 190 Lys Ile Asn Ser Val Leu Gln Lys Ile Thr Asp Pro Ile Gln Pro Lys 195 200 205 Val Ala Glu His Arg Pro Gln Thr Met Lys Arg Leu Ser Tyr Pro Phe 210 215 220 Ser Arg Glu Lys Gln His Leu Phe Asp Leu Ser Asp Lys Asp Ser Phe 225 230 235 240 Phe Asp Ser Lys Thr Arg Ser Thr Ile Val Tyr Glu Ile Leu Lys Arg 245 250 255 Thr Thr Cys Thr Lys Ala Lys Tyr Ser Met Gly Gln Gly Glu Gly Arg 260 265 270 Lys Lys Asp Ser Ala Leu Leu Ser Lys Arg Arg Lys Cys Gly Lys Tyr 275 280 285 Gly Ile Thr Ser Leu Leu Ala Asn Gly Val Tyr Ala Ala Ala Tyr Pro 290 295 300 Leu His Asp Gly Asp Tyr Asn Gly Glu Asn Val Glu Phe Asn Asp Arg 305 310 315 320 Lys Leu Leu Tyr Glu Glu Trp Ala Arg Tyr Gly Val Phe Tyr Lys Tyr 325 330 335 Gln Pro Ile Asp Leu Val Arg Lys Tyr Phe Gly Glu Lys Ile Gly Leu 340 345 350 Tyr Phe Ala Trp Leu Gly Val Tyr Thr Gln Met Leu Ile Pro Ala Ser 355 360 365 Ile Val Gly Ile Ile Val Phe Leu Tyr Gly Cys Ala Thr Met Asp Glu 370 375 380 Asn Ile Pro Ser Met Glu Met Cys Asp Gln Arg His Asn Ile Thr Met 385 390 395 400 Cys Pro Leu Cys Asp Lys Thr Cys Ser Tyr Trp Lys Met Ser Ser Ala 405 410 415 Cys Ala Thr Ala Arg Ala Ser His Leu Phe Asp Asn Pro Ala Thr Val 420 425 430 Phe Phe Ser Val Phe Met Ala Leu Trp Ala Ala Thr Phe Met Glu His 435 440 445 Trp Lys Arg Lys Gln Met Arg Leu Asn Tyr Arg Trp Asp Leu Thr Gly 450 455 460 Phe Glu Glu Glu Glu Glu Ala Val Lys Asp His Pro Arg Ala Glu Tyr 465 470 475 480 Glu Ala Arg Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Glu Ser Arg Asn Lys 485 490 495 Glu Thr Asp Lys Val Lys Leu Thr Trp Arg Asp Arg Phe Pro Ala Tyr 500 505 510 Leu Thr Asn Leu Val Ser Ile Ile Phe Met Ile Ala Val Thr Phe Ala 515 520 525 Ile Val Leu Gly Val Ile Ile Tyr Arg Ile Ser Met Ala Ala Ala Leu 530 535 540 Ala Met Asn Ser Ser Pro Ser Val Arg Ser Asn Ile Arg Val Thr Val 545 550 555 560 Thr Ala Thr Ala Val Ile Ile Asn Leu Val Val Ile Ile Leu Leu Asp 565 570 575 Glu Val Tyr Gly Cys Ile Ala Arg Trp Leu Thr Lys Ile Glu Val Pro 580 585 590 Lys Thr Glu Lys Ser Phe Glu Glu Arg Leu Ile Phe Lys Ala Phe Leu 595 600 605 Leu Lys Phe Val Asn Ser Tyr Thr Pro Ile Phe Tyr Val Ala Phe Phe 610 615 620 Lys Gly Arg Phe Val Gly Arg Pro Gly Asp Tyr Val Tyr Ile Phe Arg 625 630 635 640 Ser Phe Arg Met Glu Glu Cys Ala Pro Gly Gly Cys Leu Met Glu Leu 645 650 655 Cys Ile Gln Leu Ser Ile Ile Met Leu Gly Lys Gln Leu Ile Gln Asn 660 665 670 Asn Leu Phe Glu Ile Gly Ile Pro Lys Met Lys Lys Leu Ile Arg Tyr 675 680 685 Leu Lys Leu Lys Gln Gln Ser Pro Pro Asp His Glu Glu Cys Val Lys 690 695 700 Arg Lys Gln Arg Tyr Glu Val Asp Tyr Asn Leu Glu Pro Phe Ala Gly 705 710 715 720 Leu Thr Pro Glu Tyr Met Glu Met Ile Ile Gln Phe Gly Phe Val Thr 725 730 735 Leu Phe Val Ala Ser Phe Pro Leu Ala Pro Leu Phe Ala Leu Leu Asn 740 745 750 Asn Ile Ile Glu Ile Arg Leu Asp Ala Lys Lys Phe Val Thr Glu Leu 755 760 765 Arg Arg Pro Val Ala Val Arg Ala Lys Asp Ile Gly Ile Trp Tyr Asn 770 775 780 Ile Leu Arg Gly Ile Gly Lys Leu Ala Val Ile Ile Asn Ala Phe Val 785 790 795 800 Ile Ser Phe Thr Ser Asp Phe Ile Pro Arg Leu Val Tyr Leu Tyr Met 805 810 815 Tyr Ser Lys Asn Gly Thr Met His Gly Phe Val Asn His Thr Leu Ser 820 825 830 Ser Phe Asn Val Ser Asp Phe Gln Asn Gly Thr Ala Pro Asn Asp Pro 835 840 845 Leu Asp Leu Gly Tyr Glu Val Gln Ile Cys Arg Tyr Lys Asp Tyr Arg 850 855 860 Glu Pro Pro Trp Ser Glu Asn Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Asp Phe Trp 865 870 875 880 Ala Val Leu Ala Ala Arg Leu Ala Phe Val Ile Val Phe Gln Asn Leu 885 890 895 Val Met Phe Met Ser Asp Phe Val Asp Trp Val Ile Pro Asp Ile Pro 900 905 910 Lys Asp Ile Ser Gln Gln Ile His Lys Glu Lys Val Leu Met Val Glu 915 920 925 Leu Phe Met Arg Glu Glu Gln Asp Lys Gln Gln Leu Leu Glu Thr Trp 930 935 940 Met Glu Lys Glu Arg Gln Lys Asp Glu Pro Pro Cys Asn His His Asn 945 950 955 960 Thr Lys Ala Cys Pro Asp Ser Leu Gly Ser Pro Ala Pro Ser His Ala 965 970 975 Tyr His Gly Gly Val Leu 980 <210> 2 <211> 2946 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagggtca acgagaagta ctcgacgctc ccggccgagg accgcagcgt ccacatcatc 60 aacatctgcg ccatcgagga catcggctac ctgccgtccg agggcacgct gctgaactcc 120 ttatctgtgg accctgatgc cgagtgcaag tatggcctgt acttcaggga cggccggcgc 180 aaggtggact acatcctggt gtaccatcac aagaggccct cgggcaaccg gaccctggtc 240 aggagggtgc agcacagcga caccccctct ggggctcgca gcgtcaagca ggaccacccc 300 ctgccgggca agggggcgtc gctggatgca ggctcggggg agcccccgat ggactaccac 360 gaggatgaca agcgcttccg cagggaggag tacgagggca acctcctgga ggcgggcctg 420 gagctggagc gggacgagga cactaaaatc cacggagtcg ggtttgtgaa aatccatgcc 480 ccctggaacg tgctgtgcag agaggccgag tttctgaaac tgaagatgcc gacgaagaag 540 atgtaccaca ttaatgagac ccgtggcctc ctgaaaaaaa tcaactctgt gctccagaaa 600 atcacagatc ccatccagcc caaagtggct gagcacaggc cccagaccat gaagagactc 660 tcctatccct tctcccggga gaagcagcat ctatttgact tgtctgataa ggattccttt 720 ttcgacagca aaacccggag cacgattgtc tatgagatct tgaagagaac gacgtgtaca 780 aaggccaagt acagcatggg gcaaggcgag ggaagaaaga aggactccgc ccttctaagt 840 aaaaggcgga aatgtgggaa gtatggcatc acgagcctgc tggccaatgg tgtgtacgcg 900 gctgcatacc cactgcacga tggagactac aacggtgaaa acgtcgagtt caacgacaga 960 aaactcctgt acgaagagtg ggcacgctat ggagttttct ataagtacca gcccatcgac 1020 ctggtcagga agtattttgg ggagaagatc ggcctgtact tcgcctggct gggcgtgtac 1080 acccagatgc tcatccctgc ctccatcgtg ggaatcattg tcttcctgta cggatgcgcc 1140 accatggatg aaaacatccc cagcatggag atgtgtgacc agagacacaa tatcaccatg 1200 tgcccgcttt gcgacaagac ctgcagctac tggaagatga gctcagcctg cgccacggcc 1260 cgcgccagcc acctcttcga caaccccgcc acggtcttct tctctgtctt catggccctc 1320 tgggctgcca ccttcatgga gcactggaag cggaaacaga tgcgactcaa ctaccgctgg 1380 gacctcacgg gctttgaaga ggaagaggag gctgtcaagg atcatcctag agctgaatac 1440 gaagccagag tcttggagaa gtctctgaag aaagagtcca gaaacaaaga gactgacaaa 1500 gtgaagctga catggagaga tcggttccca gcctacctca ctaacttggt ctccatcatc 1560 ttcatgattg cagtgacgtt tgccatcgtc ctcggcgtca tcatctacag aatctccatg 1620 gccgccgcct tggccatgaa ctcctccccc tccgtgcggt ccaacatccg ggtcacagtc 1680 acagccaccg cagtcatcat caacctagtg gtcatcatcc tcctggacga ggtgtatggc 1740 tgcatagccc gatggctcac caagatcgag gtcccaaaga cggagaaaag ctttgaggag 1800 aggctgatct tcaaggcttt cctgctgaag tttgtgaatt cctacacccc catcttttac 1860 gtggcgttct tcaaaggccg gtttgttgga cgcccgggcg actacgtgta cattttccgt 1920 tccttccgaa tggaagagtg tgcgccaggg ggctgcctga tggagctatg catccagctc 1980 agcatcatca tgctggggaa acagctgatc cagaacaacc tgttcgagat cggcatcccg 2040 aagatgaaga agctcatccg ctacctgaag ctgaagcagc agagcccccc tgaccacgag 2100 gagtgtgtga agaggaaaca gcggtacgag gtggattaca acctggagcc cttcgcgggc 2160 ctcaccccag agtacatgga aatgatcatc cagtttggct tcgtcaccct gtttgtcgcc 2220 tccttccccc tggccccact gtttgcgctg ctgaacaaca tcatcgagat ccgcctggac 2280 gccaaaaagt ttgtcactga gctccgaagg ccggtagctg tcagagccaa agacatcgga 2340 atctggtaca atatcctcag aggcattggg aagcttgctg tcatcatcaa tgccttcgtg 2400 atctccttca cgtctgactt catcccgcgc ctggtgtacc tctacatgta cagtaagaac 2460 gggaccatgc acggcttcgt caaccacacc ctctcctcct tcaacgtcag tgacttccag 2520 aacggcacgg cccccaatga ccccctggac ctgggctacg aggtgcagat ctgcaggtat 2580 aaagactacc gagagccgcc gtggtcggaa aacaagtacg acatctccaa ggacttctgg 2640 gccgtcctgg cagcccggct ggcgtttgtc atcgtcttcc agaacctggt catgttcatg 2700 agcgactttg tggactgggt catcccggac atccccaagg acatcagcca gcagatccac 2760 aaggagaagg tgctcatggt ggagctgttc atgcgggagg agcaagacaa gcagcagctg 2820 ctggaaacct ggatggagaa ggagcggcag aaggacgagc cgccgtgcaa ccaccacaac 2880 accaaagcct gcccagacag cctcggcagc ccagccccca gccatgccta ccacgggggc 2940 gtcctg 2946 <210> 3 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Val Asp Arg Glu Gln Leu Val Gln Lys Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Asn Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Ile Glu 65 70 75 80 Met Val Arg Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Ala Val 85 90 95 Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Ser Glu Thr Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Glu Lys Arg Ala 130 135 140 Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser Glu Ala His Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu His Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys His Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Asp 225 230 235 240 Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asn 245 <210> 4 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggtggacc gcgagcaact ggtgcagaaa gcccggctgg ccgagcaggc ggagcgctac 60 gacgacatgg ccgcggccat gaagaacgtg acagagctga atgagccact gtcgaatgag 120 gaacgaaacc ttctgtctgt ggcctacaag aacgttgtgg gggcacgccg ctcttcctgg 180 agggtcatca gtagcattga gcagaagaca tctgcagacg gcaatgagaa gaagattgag 240 atggtccgtg cgtaccggga gaagatagag aaggagttgg aggctgtgtg ccaggatgtg 300 ctgagcctgc tggataacta cctgatcaag aattgcagcg agacccagta cgagagcaaa 360 gtgttctacc tgaagatgaa aggggactac taccgctacc tggctgaagt ggccaccgga 420 gagaaaaggg cgacggtggt ggagtcctcc gagaaggcct acagcgaagc ccacgagatc 480 agcaaagagc acatgcagcc cacccacccc atccgattag gcctggctct taactactcc 540 gtcttctact atgagatcca gaacgcccca gagcaagcgt gccacttggc caagaccgcg 600 ttcgacgacg ccatcgccga gcttgacacc ctcaacgagg actcctacaa ggactccacg 660 ctcatcatgc agctcctccg cgacaacctc acgctctgga cgagcgacca gcaggacgac 720 gatggcggcg aaggcaacaa ttaa 744 <210> 5 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Thr Thr Val Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Glu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Tyr Glu Asp Ile Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Leu Cys Thr Gly His Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Ser Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu Glu Ala Val Leu His Cys His 115 120 125 Gln Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Asp Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Glu Ala Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala His Glu Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Lys Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Ala Thr Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu 305 310 315 320 Leu Asn Lys Lys Ala Asp Gly Val Lys Pro Gln Thr Asn Ser Thr Lys 325 330 335 Asn Ser Ala Ala Ala Thr Ser Pro Lys Gly Thr Leu Pro Pro Ala Ala 340 345 350 Leu Glu Ser Ser Asp Ser Ala Asn Thr Thr Ile Glu Asp Glu Asp Ala 355 360 365 Lys Ala Arg Lys Gln Glu Ile Ile Lys Thr Thr Glu Gln Leu Ile Glu 370 375 380 Ala Val Asn Asn Gly Asp Phe Glu Ala Tyr Ala Lys Ile Cys Asp Pro 385 390 395 400 Gly Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly 405 410 415 Met Asp Phe His Arg Phe Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Ala Lys Asn Ser 420 425 430 Lys Pro Ile His Thr Thr Ile Leu Asn Pro His Val His Val Ile Gly 435 440 445 Glu Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile Asp 450 455 460 Gly Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp 465 470 475 480 His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Gln Asn Val His Phe His Cys Ser Gly 485 490 495 Ala Pro Val Ala Pro Leu Gln 500 <210> 6 <211> 1512 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atggccacca cggtgacctg cacccgcttc accgacgagt accagctcta cgaggatatt 60 ggcaaggggg ctttctctgt ggtccgacgc tgtgtcaagc tctgcaccgg ccatgagtat 120 gcagccaaga tcatcaacac caagaagctg tcagccagag atcaccagaa gctggagaga 180 gaggctcgga tctgccgcct tctgaagcat tccaacatcg tgcgtctcca cgacagcatc 240 tccgaggagg gcttccacta cctggtcttc gatctggtca ctggtgggga gctctttgaa 300 gacattgtgg cgagagagta ctacagcgag gctgatgcca gtcactgtat ccagcagatc 360 ctggaggccg ttctccattg tcaccaaatg ggggtcgtcc acagagacct caagccggag 420 aacctgcttc tggccagcaa gtgcaaaggg gctgcagtga agctggcaga cttcggccta 480 gctatcgagg tgcaggggga ccagcaggca tggtttggtt tcgctggcac accaggctac 540 ctgtcccctg aggtccttcg caaagaggcg tatggcaagc ctgtggacat ctgggcatgt 600 ggggtgatcc tgtacatcct gctcgtgggc tacccaccct tctgggacga ggaccagcac 660 aagctgtacc agcagatcaa ggctggtgcc tatgacttcc cgtcccctga gtgggacacc 720 gtcactcctg aagccaaaaa cctcatcaac cagatgctga ccatcaaccc tgccaagcgc 780 atcacagccc atgaggccct gaagcacccg tgggtctgcc aacgctccac ggtagcatcc 840 atgatgcaca gacaggagac tgtggagtgt ctgaaaaagt tcaatgccag gagaaagctc 900 aagggagcca tcctcaccac catgctggcc acacggaatt tctcagcagc caagagttta 960 ctcaacaaga aagcagatgg agtcaagccc cagacgaata gcaccaaaaa cagtgcagcc 1020 gccaccagcc ccaaagggac gcttcctcct gccgccctgg agtcttctga cagtgccaat 1080 accaccatag aggatgaaga cgctaaagcc cggaagcagg agatcattaa gaccacggag 1140 cagctcatcg aggccgtcaa caacggtgac tttgaggcct acgcgaaaat ctgtgaccca 1200 gggctgacct cgtttgagcc tgaagcactg ggcaacctgg ttgaagggat ggacttccac 1260 agattctact tcgagaacct gctggccaag aacagcaagc cgatccacac gaccatcctg 1320 aacccacacg tgcacgtcat tggagaggat gccgcctgca tcgcttacat ccggctcacg 1380 cagtacattg acgggcaggg ccggccccgc accagccagt ctgaggagac ccgcgtgtgg 1440 caccgccgcg acggcaagtg gcagaacgtg cacttccact gctcgggcgc gcctgtggcc 1500 ccgctgcagt ga 1512 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ANO1 segment a <400> 7 gcagcacagc gacaccccct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ANO1 segment a <400> 8 actttgggct ggatgggatc 20 <210> 9 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of R18 peptide <400> 9 ccccactgtg tcccccgaga tctttcgtgg ttagatttag aagcaaatat gtgtttaccc 60 tga 63 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for alpha CaMKII <400> 10 aagagtacca gctcttcgag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for alpha CaMKII <400> 11 acttctgggg agagatatcc a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta CaMKII <400> 12 gacattgtgg cgagagagta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta CaMKII <400> 13 ttgatggtca gcatctggtt 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target region of hANO1 for preparation of shRNA <400> 14 gcttgctgtc atcatcaatg c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target region of 14-3-3 gamma for preparation of shRNA <400> 15 gaacgtgaca gagctgaatg a 21 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> conserved region of ANO1 <400> 16 Glu Lys Tyr Ser Thr Leu Pro 1 5

Claims (16)

1. 약물 후보물질, ANO1 단백질의 N-말단으로부터 110번째 아미노산 잔기(이하 'segment a'라 함)까지를 포함하는 단백질 및 βCaMKII를 접촉시키는 단계로서, 상기 segment a는 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하고, N-말단으로부터 9번째 잔기인 트레오닌(이하 'T9'라 함)은 인산화되지 않은 것인 단계;
   segment a의 T9의 인산화의 수준을 측정하는 단계;
   측정된 T9의 인산화의 수준을 대조군의 인산화 수준과 비교하는 단계; 및
   대조군에 비하여 T9의 인산화의 수준이 감소된 경우, 상기 약물 후보 물질을 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물의 최종 약물 후보 물질인 것으로 결정하는 단계;를 포함하는, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물을 선발하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, segment a를 포함하는 단백질은 ANO1 단백질인 것인 방법.
3. 청구항 1에 있어서, ANO1 단백질의 세포막으로의 이동을 감소시키는 약물은 ANO1 단백질의 세포막으로의 이동의 증가와 연관된 질병을 치료하기 위한 것인 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 약물을 항암제인 것인 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제시키는 물질을 활성 성분으로 포함하고, 상기 물질은 βCAMKII의 발현 또는 활성을 억제시키는 물질인 것인, 췌장암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
10. 삭제
11. 청구항 9에 있어서, 상기 ANO1 단백질의 세포막 이동을 억제하는 물질은 ANO1 단백질의 인산화된 T9에 결합하는 항체 또는 그의 결합활성을 갖는 단편, 또는 ANO1 단백질의 segment a 중 EKYSTLP(서열번호 16)를 포함하는 연속 아미노산 서열을 포함하는 단편으로서 T9은 인산화되어 있지 않은 것인 약학적 조성물.
12. 청구항 9에 있어서, 상기 βCaMKII의 발현을 억제시키는 물질은 상기 βCaMKII 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
13. 청구항 9에 있어서, 상기 βCaMKII의 활성을 억제시키는 물질은 상기 βCaMKII 단백질에 결합하는 항체, 또는 그의 결합 활성을 갖는 단편인 것인 약학적 조성물.
14. 청구항 9에 있어서, 상기 βCaMKII는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
15. 청구항 9에 있어서, 상기 βCaMKII는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
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